CZ20032343A3

CZ20032343A3 - Protein s aktivitou reduktázy asymetrického ketonu, nukleová kyselina, která ho kóduje, a způsob přípravy proteinu

Info

Publication number: CZ20032343A3
Application number: CZ20032343A
Authority: CZ
Inventors: Keiji Sakamoto; Shinji Kita; Kazuya Tsuzaki; Tadanori Morikawa; Sakayu Shimizu; Michihiko Kataoka
Original assignee: Daiichi Fine Chemical Co., Ltd.
Priority date: 2001-03-02
Filing date: 2002-03-01
Publication date: 2004-02-18
Also published as: EP1371731A4; AU2002234942B2; US7166452B2; KR20030096268A; US20040247583A1; CA2440025A1; EP1371731A1; JPWO2002070714A1; EP1371731B1; DE60237584D1; CA2440025C; CN100445386C; JP4136663B2; CN1610745A; WO2002070714A1; KR100629642B1; ATE480627T1

Description

Mi in.

Protein s aktivitou reduktázy asymetrického ketonu, nukleová kyselina, která ho kóduje, a způsob přípravy proteinu

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká reduktázy asymetrického aminoketonu, nukleové kyseliny kódující tento enzym, mikroorganizmů produkujících enzym a způsobu výroby opticky aktivního aminoalkoholu, kdy se používají tyto mikroorganizmy.

Dosavadní stav techniky d-pseudoefedrin

Farmakologické vasokonstrikce, v terapii jako používá v léčení

Dříve byly obvykle efedriny užívány pro pocení, jako antipyretika a pro tlumení kašle. Jeden z efedrinů, je znám svým protizánětlivým účinkem, účinky 1-efedrinu, jako je například zvýšení krevního tlaku nebo pocení, jsou známy, 1-efedrin je proto užíván sympatomimetikům, 1-efedrin se také bronchiálního astmatu. Způsoby produkce opticky aktivních β-aminoalkoholů, včetně opticky aktivních efedrinů, jsou užitečné při výrobě léčiv a jejich meziproduktů, takže zde existuje potřeba účinného způsobu výroby těchto látek.

Při obvyklém způsobu výroby β-aminoalkoholů s požadovanou optickou aktivitou se užívá postup, kdy se připraví racemický β-aminoalkohol a pak se specifická opticky aktivní forma získá • · • · · · • · · · optickou rezolucí (štěpením) nebo asymetrickou syntézou, kromě dalších postupů.

Avšak jelikož racemický β-aminoalkohol má dva asymetrické atomy uhlíku ve své molekule, pro získání specifické opticky aktivní formy musí být provedeny složité kroky.

Tak například, podle patentového dokumentu Německa (bývalé NDR) č. 13683 (z 27. srpna 1957) byl opticky aktivní fenylacetylkarbinol vyráběn z benzaldehydu pomocí fermentace s použitím kvasinek, tedy erythro-l-2-methylamino-l-fenyl-1propanol (tj . 1-efedrin) mohl být vyráběn redukční kondenzací methylaminu na opticky aktivní fenylacetylkarbinol.

Příprava pseudoefedrinu je možná i dalším postupem (podle patentu USA č. 4,237,304): oxazolin je vytvořen z 1-efedrinu, s použitím acetanhydridu, a pak se oxazolin hydrolyzuje inverzí na threo formu, tj. d-pseudoefedrin.

Jak bylo již uvedeno výše, k výrobě pseudoefedrinu s požadovanou optickou aktivitou z 2-methylamino-l-fenyl-lpropanonu jsou nezbytné kroky, kdy je připraven efedrin v opticky aktivní erythro formě a pak je invertován na threo formu. To vede k problému, že počet kroků roste, celý proces se komplikuje a výtěžky jsou proto nižší.

Navíc, i když při výrobě pseudoefedrinu vzniká jako vedlejší produkt značné množství diastereomerů v průběhu redukce výchozího ketonu, získání diastereomerů pro jejich použití jako suroviny je obtížné, což je ekonomicky nevýhodné.

Na druhé straně, podle způsobu, který byl popsán ve zveřejněné japonské patentové přihlášce HEI 8-98697, je možné vyrábět opticky aktivní 2-amino-l-fenylethanolový derivát z 2-amino-l-fenylethanolové sloučeniny mající ve své molekule jeden asymetrický atom uhlíku, a sice využitím specifických • · · · • · · · mikroorganizmů. Dosavadní stav techniky je však takový, že dosud nebyl popsán žádný účinný způsob výroby β-aminoalkoholů obsahujících dva asymetrické atomy uhlíku.

Podstata vynálezu

Vzhledem k výše uvedeným problémům tkvícím ve stavu techniky, je cílem předkládaného vynálezu poskytnout reduktázu asymetrického aminoketonu, která může účinkovat v produkci, a sice s vysokým výtěžek a vysokou selektivitou, β-aminoalkoholu majícího požadovanou optickou aktivitu, ze enantiomerní směsi α-aminoketonových sloučenin nebo jejich solí.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí proteinu majícího aktivitu reduktázy asymetrického anaminoketonu, nukleové kyseliny kódující tento protein, transformant (transformovaných organizmů) transformovaných touto nukleovou kyselinou, způsobu produkce proteinu s použitím transformant a použití transformant nebo proteinu podle vynálezu.

Dále je předmětem předkládaného vynálezu poskytnout nový mikroorganismus, který účinně konvertuje enantiomerní směs α-aminoketonových sloučenin nebo jejich solí na opticky aktivní β-aminoalkohol.

Původci předkládaného vynálezu prováděli pečlivě a důkladně studie, aby vyřešili zmíněný problém, a tak bylo zjištěno, že pomocí reduktázy asymetrického ketonu izolované ze specifických mikroorganizmů pouze jeden enantiomer z • · · · • · • · · ·

··

- 4 enantiomerní směsi α-aminoketonových sloučenin nebo jejich solí může být redukován za vzniku pouze požadovaného druhu ze čtyřech odpovídajících druhů β-aminoalkoholů, a to s vysokým výtěžkem a vysoce selektivním způsobem. Tu vedlo k realizaci předkládaného vynálezu

Konkrétně protein podle předkládaného vynálezu je protein, který je reduktázou asymetrického aminoketonu, a který účinkuje v produkci d-pseudoefedrinu tím, že působí na 1-2-methylaminopropiofenon a má následující fyzikálně chemické vlastnosti:

substrát: 1-2-methylaminopropiofenon optimální pH: pH 8,1 optimální teplota: 55 °C koenzym: NADP molekulová hmotnost: asi 28500 Da pro homotetramer

Dále, protein podle předkládaného vynálezu je protein mající aminokyselinovou sekvenci, která je zde uvedena v seznamu sekvencí jako SEKV. ID. Č. 1.

A dále, protein podle předkládaného vynálezu je protein odvozený z proteinu obsahujícího aminokyselinovou sekvenci uvedenou zde jako SEKV. ID. Č. 1, obsahující delece, inzerce, substituce nebo adice jedné nebo více aminokyselin, mající aktivitu reduktázy asymetrického aminoketonu, nebo jeho parciální peptid.

Takže předkládaný vynález zahrnuje i sůl proteinu nebo sůl parciálního peptidu z tohoto proteinu.

Nukleová kyselina podle předkládaného vynálezu je nukleová kyselina kódující protein obsahující aminokyselinovou sekvence uvedenou zde v seznamu sekvencí jako SEKV. ID. Č. 1.

Nukleová kyselina podle předkládaného vynálezu je také • · · · • · · · • · · nukleová kyselina obsahující nukleotidovou sekvenci uvedenou v seznamu sekvencí jako SEKV. ID. Č. 2.

Dále, nukleová kyselina podle předkládaného vynálezu je nukleová kyselina, která hybridizuje za stringentních podmínek s nukleovou kyselinou uvedenou zde jako SEKV. ID. Č. 2 a kódující protein mající aktivitu reduktázy asymetrického aminoketonu.

Tedy nukleová kyselina podle předkládaného vynálezu může obsahovat část nukleotidové sekvence uvedené zde jako SEKV. ID. Č. 2.

Vektor podle předkládaného vynálezu může být získán tak, že se nukleové kyseliny podle vynálezu vloží do plazmidů nebo jiného vhodného vektoru.

Také transformanta podle předkládaného vynálezu může být získána tím, že se vektor podle vynálezu vnese do hostitele. Předkládaný vynález dále zahrnuje reduktázu asymetrického aminoketonu vytvořenou s použitím takových transformant, a její parciální peptidy.

Způsob produkce reduktázy asymetrického aminoketonu nebo jejích parciálních peptidů podle předkládaného vynálezu je způsob, který zahrnuje krok kultivace transformant, kdy se transformanty mohou množit, a krok asymetrického aminoketonu nebo jeho purifikace reduktázy parciálních peptidů z transformant, získán v kroku kultivace.

Způsob produkce reduktázy asymetrického aminoketonu nebo jeho parciálního peptidu podle předkládaného vynálezu je způsob, který je charakterizován tím, že zahrnuje krok, kdy se kultivuje alespoň jeden z mikroorganizmů vybraný skupiny, kterou tvoří mikroorganizmy patřící k rodu Morganella, Microbacteríum, Sphingobacterium, Nocardioides, Mucor , • · · ·

Absidia, Aspergillus, Penicillium, Grifola, Eurotium, Ganoderma, Hypocrea, Hel i co stylun, Verticillium, Fusarium, Tritirachium, Mortierella, Armillariella, Cylindrocarpon, Aureobacterium, Xanthomonas, Pseudomonas, Sporobolomyces, Sporidiobolus a Rhodococcus, je schopen redukovat

Klebsiella, Mycobacterium, kdy mikroorganizmus

1-2-methylaminopropiofenon a tak tvořit d-pseudoefedrin, a krok purifikace reduktázy asymetrického aminoketonu nebo jejího parciálního peptidu z mikroorganizmu získaného v kroku kultivace.

Mikroorganizmus podle předkládaného vynálezu je také mikroorganismus patřící k rodu Rhodococcus, který je schopen redukovat 1-2-methylaminopropiofenon a tak tvořit d-pseudoefedrin.

Konkrétně výhodný mikroorganizmus podle Rhodococcus erythropolis kmen MAK-34 (FERM BP-7451).

vynálezu

Způsob produkce opticky aktivního aminoalkoholu podle předkládaného vynálezu je způsob zahrnující krok, kdy protein, jeho parciální peptid nebo jeho sůl působí na enantiomerní směs α-aminoketonu reprezentovaného obecným vzorcem 1;

kde

X mohou být shodné nebo odlišné, přičemž X představuje alespoň jeden člen vybraný ze skupiny, kterou tvoří atom halogenu, nižší alkylová skupina, hydroxylová skupina volitelně chráněná • · » chránící skupinou, nitroskupina a sulfonylová skupina, n představuje celé číslo 0 až 3,

R¹ je nižší alkylová skupina,

R² a R³ mohou být shodné nebo odlišné, a představují alespoň jeden člen vybraný ze skupiny, kterou tvoří atom vodíku a nižší alkylová skupina, a * označuje asymetrický atom uhlíku, nebo jeho soli, za vzniku opticky aktivní β-aminoalkoholové sloučeniny s požadovanou optickou aktivitou reprezentované obecným vzorcem 2:

kde X, n, R¹, R², R³ a jsou shodné s tím, jak byly definovány výše, přičemž výsledná sloučenina má požadovanou optickou aktivitu.

Dále, způsob výroby opticky aktivního aminoalkoholu podle předkládaného vynálezu je způsob zahrnující krok, kdy mikroorganizmus vybraný ze skupiny, kterou tvoří transformant, mikroorganismy patřící do rodu Rhodococcus a Rhodococcus erythropolis MAK-39, působí na enantiomerní směs α-aminoketonu reprezentovaného obecným vzorcem (1):

nebo jeho soli reprezentovaného za vzniku opticky obecným vzorcem (2):

aktivního aminoalkoholu

OH

přičemž výsledná sloučenina má požadovanou optickou aktivitu.

Výhodně, ve způsobu výroby opticky aktivního aminoalkoholu je sloučenina reprezentovaná obecným vzorcem (3)

R¹⁰ /

kde A reprezentuje

strukturální vzorec (Y) nebo (Z):

( Y) kde R⁴ je atom vodíku, alkylová skupina obsahující 1 až 3 atomy uhlíku volitelně mající substituent, uhlovodíkový kruh obsahující 5 až 10 atomů uhlíku svázaný s R⁸ nebo heterocyklická kostra 5 až 8-členného kruhu zahrnující 1 až 3 heteroatomy svázaná s R⁸,

R·

O ;c.

R⁷ kde R₅ je atom vodíku, alkylová skupina obsahující 1 až 3 atomy uhlíku nebo heterocyklická kostra 5 až 8-členného kruhu zahrnující 1 až 3 heteroatomy svázaný s R⁶ nebo R⁹,

R⁶ je atom vodíku, alkylová skupina obsahující 1 až 3 atomy uhlíku volitelně mající substituent, uhlovodíkový kruh obsahující 5 až 10 atomů uhlíku svázaný s Rs nebo heterocyklická kostra 5- až 8-členného kruhu zahrnující 1 až 3 heteroatomy svázaná s R⁵ nebo R⁹, a

R⁷ je atom vodíku nebo alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomům uhlíku volitelně mající substituent,

R⁸ je atom vodíku, karboxylová skupina, alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku volitelně mající substituent, heterocyklická kostra 5- až 8-členného kruhu zahrnující 1 až 3 heteroatomy svázaná s R⁴ nebo uhlovodíkový kruh z 5 až 10 atomů uhlíku svázaný s R⁶,

R⁹ je atom vodíku, alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku volitelně mající substituent, acylová skupina volitelně mající substituent nebo heterocyklická kostra 5- až 8-členného kruh zahrnující 1 až 3 heteroatomy svázaná s R⁵ nebo R⁶, a R¹⁰ je atom vodíku nebo volitelně substituovaná alkylová • ·

- 10 skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, nebo její farmaceuticky přijatelná sůl nebo solvát, dále přidána, aby byl produkován opticky aktivní aminoalkohol.

Popis obrázků

Obr. 1 je SDS-PAGE elektroforetogram reduktázy asymetrického aminoketonu podle předkládaného vynálezu.

Obr. 2 je graf ukazující pH závislost reduktázy asymetrického aminoketonu podle předkládaného vynálezu.

Obr. 3 graf ukazující teplotní závislost reduktázy asymetrického aminoketonu podle předkládaného vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Přiklad nejlepšího provedení vynálezu

V následujícím příkladu jsou podrobně vysvětlena výhodná provedení předkládaného vynálezu.

Když jsou nukleotidy, aminokyseliny, apod. vyjádřeny jejich zkratkami v popisu a výkresech, jsou založeny na doporučení komise pro nomenklaturu IUPAC-IUB nebo mají významy konvenčně užívané v tomto oboru. Optické izomery aminokyselin jsou reprezentovány v jejich 1-formě, není-li uvedeno jinak.

• · · · • · · ·

- 11 Nejdříve bude vysvětlen protein podle předkládaného vynálezu.

Protein podle předkládaného vynálezu je protein, který je reduktázou asymetrického aminoketonu, a který účinkuje v produkci d-pseudoefedrinu tím, že působí na

1-2-methylaminopropiofenon a má následující fyzikálně chemické vlastnosti:

substrát: 1-2-methylaminopropiofenon optimální pH: pH 8,1 optimální teplota: 55 °C koenzym: NADP molekulová hmotnost: asi 28500 Da pro homotetramer přičemž protein nemá pouze tu aktivitu, že produkuje d-pseudoefedrin tím, že působí na 1-2-methylaminopropiofenon, ale také projevuje reduktáovou aktivitu vzhledem k 1-2-dimethylaminopropiofenonu, aminoacetonu a l-amino-2butanonu. Také působí na l-amino-2-propanol za vzniku aminoacetonu.

Když byly zkoumány vlastnosti jiné než fyzikálně chmeické vlastnosti uvedené výše, byly zkoumány vlivy různých kovových iontů nebo inhibitorů, přičemž byla potvrzena inhibice a,a'-dipyridylovou skupinou, o-fenantrolinem a EDTA.

Protein podle vynálezu je získán kultivací mikroorganizmů majících aktivitu redukující asymetrický aminoketon a purifikací získaných buněk.

Způsoby kultivace nejsou nijak omezeny a jakékoliv známé metody mohou být použity, pokud umožňují růst mikroorganizmů používaných podle vynálezu.

Normálně mohou být použita tekutá média obsahující zdroje uhlíku, zdroje dusíku a další živiny. Lze užít jakýkoliv • · · ·

- 12 vhodný zdroj, pokud ho daný mikrooroganizmus je schopen využít. Mohou být použity sacharidy jako je například glukóza, fruktóza, sačharóza, dextrin, škrob a sorbitol, alkoholy, jako je například methanol, ethanol a glycerol, organické kyseliny jako je například kyselina fumarová, kyselina citrónová, kyselina octová a kyselina propionová, a jejich soli, uhlovodíky jako jsou parafíny, a také směsi výše uvedených sloučenin. Jako zdroj dusíku může být použit jakýkoliv zdroj, pokud je mikroorganizmus schopen ho využít. Tak mohou být použity amonné soli anorganických kyselin, jako je například chlorid amonný, síran amonný a fosforečnan amonný, amonné soli organických kyselin, jako je například fumaran amonný a citronan amonný, soli kyseliny dusičné jako dusičnan sodný a dusičnan draselný, dusík-obsahující anorganické nebo organické sloučeniny jako je například hovězí extrakt, kvasinkový extrakt, sladový extrakt a pepton, a také směsi výše uvedených sloučenin. Do médií, která se běžně užívají, se mohou přidat zdroje živin, jako jsou anorganické soli, soli vzácných kovů a vitamíny. Látky urychlující proliferace mikroorganizmů, pufrující látky udržující pH média a další mohou také být přidány ke kultuře, jestliže je to nutné.

Mikroorganizmy se kultivují v podmínkách, které jsou vhodné k jejich růstu. Specificky se kultivace mohou provádět v médiu s pH 3 až 10, výhodně 4 až 9, a teplotou 0 °C až 50 °C, výhodně 20 °C až 40°C. Mikroorganizmy mohou být kultivovány v aerobních nebo anaerobních podmínkách. Kultivační období je výhodně 10 až 150 hodin, a je třeba ho určit přiměřeně v závislosti na každém mikroorganizmu.

Z takto kultivovaných mikroorganizmů je kultivační médium filtrováno nebo stočeno, takže se získají buňky, které jsou pak promyty dobře vodou nebo roztok pufru. Promyté buňky jsou

suspendovány ve vhodném množství roztoku pufru a buňky jsou pak rozrušeny. Způsob rozrušení buněk není nijak omezen, k příkladům vhodných způsobů patří mechanické rozbití v třecí misce, užití homogenizátoru fy. DYNO, užití tzv. francouzského lisu, rozbití užitím ultrazvuku apod. Z takto získaného homogenátu buněk se pevné složky odstraní filtrací nebo centrifugací, a z takto získaného bezbunščného extraktu se izoluje reduktáza asymetrického aminoketonu běžným způsobem izolace enzymů.

Také způsob izolace enzymu není nijak omezen, jakékoliv známé postupy mohou být využity pro tento účel. Například enzym může být purifikován vysolovací sedimentací například filtrací na Sephadexu a je např. iontoměničová pomocí síranu amonného, gelovou dalšími podobnými postupy, jako chromatografie s použitím nosiče, který má diethylaminoethylové skupiny, karboxymethylové skupiny, nebo například hydrofobní chromatografií s použitím nosiče majícího hydrofobní skupiny jako například butylovou skupinu, oktylovou skupinu nebo fenylovou skupinu, pigmentovou gelovou chromatografií, elektroforézou, dialýzou, ultrafiltrací, afinitní chromatografií, vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) apod.

A dále, enzym podle vynálezu může být použit také jako imobilizovaný enzym. Takový způsob také omezen na konkrétní způsob, jakékoliv známé metody mohou být použity, jejichž příklady zahrnují imobilizované enzymy a enzym-produkující buňky, které mohou být imobilizovány navázáním na nosič, jako například kovalentní vazba a adsorpcí, zesítěním (crosslinking), vychytáním apod. Kondenzační činidla jako například glutaraldehyd, diisokyanát hexamethylenu a diisothiokyanát hexamethylenu mohou také být použita, jestliže

je to nutné. Příklady dalších imobilizačních metod zahrnují monomerní gelovatění kdy monomer gelovatí polymerizačni reakcí, prepolymerový způsob, kdy se polymeruje molekula větší než normální monomer, polymeryzační způsob gelovatění polymeru, imobilizace s použitím polyakrylamidu, imobilizace s použitím přírodních polymerů jako je například alginová kyselina, kolagen, želatina, agar a κ-karagenan, a imobilizace s použitím syntetických polymerů, jako jsou například světlem vytvrditelné pryskyřice a urethanové polymery.

Takto purifikovaný enzym je považován za plně purifikovaný, jestliže elektroforézou (např. SDS-PAGE nebo jinou) je potvrzen jako jednoduchý pás.

Výhodně, mikroorganizmus mající aktivitu reduktázy asymetrického aminoketonu je alespoň jeden mikroorganizmus vybraný ze skupiny mikroorganismů patřit k rodu Morganella, Microbacterium, Sphingobacterium, Nocardioides, Mucor, Absidia, Aspergillus, Penicillium,· Grifola, Eurotium, Ganoderma, Hypocrea, Helicostylum, Verticillium, Fusarium, Tritirachium, Mortierella, Armillariella, Cylindrocarpon, Klebsiella, Aureobacterium, Xanthomonas, Pseudomonas, Mycobacterium, Sporobolomyces, Sporidiobolus a Rhodococcus.

Ke specifickým příkladům patří Morganella morganii, Microbacterium arborescens, Sphingobacterium multivorum,

Nocardioides simplex, Mucor ambiguus, Mucor javanicus, Mucor fragilis, Absidia lichtheimi, Aspergillus awainori, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus candídus, Aspergillus oryzae var. oryzae, Aspergillus foetidus var. acidus, Penicillium oxalicum, Grifola frondosa, Eurotium repens, Hypocrea gelatinosa, Helicostylum

Ganoderma nigricans, roseum, lucidum,

Verticillium fungicola var. fungicola, Fusarium

Tritirachium oryzae,

Mortierella isabellina, • · · · · ’

- 15 Armillariella mellea, Cylindrocarpon sclerotigenum, Klebsiella pneumoniae, Aureobacterium esteraromaticum, Xanthomonas sp., Pseudomonas putida, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium diernhoferi, Mycobacterium vaccae, Mycobacterium phlei, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium chlorofenolicum, Sporobolomyces salmonicolor, Sporobolomyces coralliformis, Sporidiobolus johnsoii, Rhodococcus erythropolis a Rhodococcus rhodochrous.

Mikroorganizmus může být kterýkoliv kmen, jako například divoký kmen, variantní kmen nebo rekombinantní kmen připravený technikou jako je například buněčná fúze nebo genová manipulace. Je dostatečné, jestliže alespoň jeden druh mikroorganizmu je použit.

Dále, Rhodococcus erythxopolis kmen MAX-34 je uveden jako nový mikroorganizmus, který je jeden z druhů mikroorganizmů majících aktivitu reduktázy asymetrického aminoketonu podle předkládaný vynález, mající zvláště účinnou aktivitu rduktázy asymetrického aminoketonu. Rhodococcus erythropolis kmen MAK-34 je nový mikroorganizmus, který byl z přírody izolován původci předkládaného vynálezu, a byl uložen ve Sbírce Mezinárodní Patentové Organizace, Národní Institut pro rozvoj vědy a technologie (Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japonsko, 305-8566) 15. únoru 2001 pod přístupovým číslem FERM BP-7451.

Rhodococcus erythropolis kmen MAK-34 má následující mikrobiologické vlastnosti:

Taxonomické charakteristiky (1) Morfologické vlastnosti buněčná forma: tyčinkovíté baktérie velikost buňky: 1,0 x 1,5 až 2,0 pm • · • · · ·

- 16 charakteristický rys: formace tvaru V motilita: spory: (2) Kultivační vlastnosti

Kultivační teplota: 30°C

Tvar kolonií: kruhové, okrajově erozivní, vyčnívající, mírně lesklé, smetanově zbarvené Likvidace želatiny: (3) Fyziologické Vlastnosti

Gramovo barvení: +

Redukce nitrátů: Využití citrátu: +

Ureáza: + oxidáza: kataláza: + chování vůči kyslíku: aerobní 0/F test: pyrazinamidáza: pyrolidonylarylamidáza: alkalická fosfatáza: + β-glukuronidáza: β-galaktosidáza: α-glukosidáza: + N-acetyl-B-glukosaminidáza: esculin (glukosidáza): +

Využitelnost sacharidů laktóza: maltóza: + mannóza: + benzoát: + butan-2,3-diol: + • · · ·

- 17 citrakonát: D-mandelová kyselina: DL-norleucin: + pimelová kyselina: spermin: a (4) Celá nukleotidová sekvence 16S rRNA byl analyzována a byla srovnána proti databázi MicroSeq. Kmeny, které jsou považovány za příbuzné a příslušné rozdíly:

Rhodococcus erythropolis: 0,56 %

Rhodococcus globerulus: 0,76 %

Tsukamurella wratislaviensis: 2,54 %

Rhodococcus fascians: 2,94 %

Předcházející výsledky ukázaly, že Rhodococcus erythropolis má homologii 99,44 % a je nejblíže příbuznou skupinou mikroorganizmů.

Protein podle předkládaného vynálezu je dále také protein obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou zde jako SEKV. ID. Č. 1 a protein odvozený z tohoto proteinu obsahující aminokyselinovu sekvenci, která má deleci, inzerci, substituci nebo adici jedné nebo více aminokyselin, a má aktivitu reduktázy asymetrického aminoketonu.

Způsob přípravy takové delece, inzerce, substituce nebo adice není nijak omezen, jakékoliv známé metody mohou být použity. K příkladům vhodných metod patří metody popsané v následujících publikacích: Japanese Biochemical Society, ed., Sequel to Biochemical Experiment Lecture 1, Gene Study Method II, p. 105 (Susumu Hirose), Tokyo Kagaku Dojin (1986); the Japanese Biochemical Society, ed., New Biochemical » ·

- 18 Experiment Lecture 2, Nucleic Acid III (Recombinant DNA Technique), p.233 (Susumu Hirose) , Tokyo Kagaku Dojin (1992); R. Wu, L. Grossman, ed., Methods in Enzymology, Vol. 154, p. 350 & p. 367, Academie Press, New York (1987) ; R. Wu, L. Grossman, ed., Methods in Enzymology, Vol. 100, p. 467 & p. 468, Academie Press, New York (1983) ; J.A. Wells et al.,

Gene, Vol. 34, p. 315 (1985); T. Grundstroem et al., Nucleic Acids Res., Vol. 13, p. 3305 (1985); J. Taylor et al., Nucleic Acids Res., Vol. 13, p. .8765 (1985); R. Wu ed., Methods in Enzymology, Vol. 155, p. 568, Academie Press, New York (1987); and A. R. Oliphant et al., Gene, Vol. 44, p. 177 (1986). Ke specifickým příkladům patří místněcílená (místně-specifická) mutageneze, Kunkelova metoda a dNTPfaS] metoda (Ecksteinova metoda) využívající syntetický oligonukleotid, nebo další podobné metody, jako například úsekově-specifická mutageneze s použitím kyseliny sírové a kyseliny dusičné atd.

Existují případy, kdy jsou sacharidové řetězce připojeny k mnoha proteinům, přičemž připojení sacharidového řetězce může být regulováno substitucí jedné nebo více aminokyselin. Proto protein podle předkládaného vynálezu zahrnuje i proteiny mající výše zmíněné sacharidové řetězce regulované aminokyselinovou sekvencí uvedenou zde jako SEKV. ID. Č. 1, pokud mají výše uvedenou aktivitu reduktázy asymetrického aminoketonu.

Takto získaný protein podle předkládaného vynálezu může být modifikovaný aminokyselinovými zbytky v něm obsaženými, a to chemickými postupy, nebo může být změněn na své deriváty modifikací nebo parciálním štěpením s použitím enzymů jako jsou například peptidázy, např., pepsin, chymotrypsin, papain, bromelain, endopeptidáza a exopeptidáza.

Když je protein vytvořen technikou genové rekombinace, může být exprimován jako fúzni protein a pak může být konvertován/opracován in vivo nebo in vitro na protein mající biologickou aktivitu v podstatě stejnou jako kterákoliv přírodní reduktáza asymetrického aminoketonu. V tomto případě, metody fúze obecně používané v genetickém inženýrství mohou být použity a takový fúzní protein pak může být purifikován afinitní chromatografií nebo podobnou metodou, například tím, že využije jeho fúzovaná část. Modifikace, změny, apod. struktury protein mohou být prováděny, například podle metod popsaných v publikaci: Japanese Biochemical Society, ed., New Biochemical Experiment Lecture 1, Protein VII, Protein Engineering, Tokyo Kagaku Dojin (1993), a také metod popsaných v literatuře citované ve výše uvedené publikaci a metod v podstatě stejných.

Dále, protein podle předkládaného vynálezu se může lišit od přírodního v identitě jednoho nebo více aminokyselinových zbytků, nebo se může lišit od přírodního v poloze jednoho nebo více aminokyselinových zbytků. Předkládaný vynález tedy zahrnuje deleční analogy postrádající jeden nebo více (např. 1 až 80, výhodně 1 až 60, výhodněji 1 až 40, dále výhodně 1 až 20, a zejména 1 až 10) aminokyselinových zbytků typických pro přírodní reduktázu asymetrického aminoketonu, substituční analogy mající jeden nebo více (např. 1 až 80, výhodně 1 až 60, výhodněji 1 až 40, dále výhodně 1 až 20, zejména 1 až 10) zvláštních aminokyselinových zbytků substituovaných jinými zbytky, a adiční analogy mající jeden nebo více (např. 1 až 80, výhodně 1 až 60, výhodněji 1 až 40, dále výhodně 1 až 20, a zejména 1 až 10) přidaných aminokyselinových zbytků. Proteiny mající doménovou strukturu, která je charakteristická pro přírodní reduktázu asymetrického aminoketonu jsou zahrnuty v předkládaném vynálezu. A také ty mající stejnou

- 20 kvalitu aktivity reduktázy asymetrického aminoketonu.

Předkládaný vynález zahrnuje všechny mutanty, jako například mutanty uvedené výše, pokud si udržují doménovou strukturu, která je charakteristikou přírodní reduktázy asymetrického aminoketonu. Předkládaný vynález také zahrnuje proteiny mající primární strukturní konformaci v podstatě ekvivalentní se strukturou přírodní reduktázy asymetrického aminoketonu nebo její části a mající biologickou aktivitu v podstatě ekvivalentní s aktivitou přírodní reduktázy asymetrického aminoketonu. Dále, předkládaný vynález zahrnuje přirozeně se vyskytující mutanty. Taková reduktáza asymetrického aminoketonu podle předkládaného vynálezu může být ižolována/purifikována postupem, který bude vysvětlen pozděj i.

Na druhé straně předkládaný vynález zahrnuje i DNA sekvence kódující výše uvedené polypeptidy, polypeptidy mající všechny nebo část charakteristických vlastností přírodní reduktázy asymetrického aminoketonu, a DNA sekvence kódující jejich analogy nebo deriváty. Nukleotidová sekvence reduktázy asymetrického aminoketonu může být modifikovaná (např. adicí, delecí, substitucí apod.) a tudíž i modifikované sekvence jsou zahrnuty v předkládaném vynálezu.

Nukleová kyselina podle předkládaného vynálezu bude nyní podrobněji vysvětlena.

Nukleová kyselina podle předkládaného vynálezu je nukleová kyselina kódující protein obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou zde v seznamu sekvencí jako SEKV. ID. Č. 1.

Protože existuje velké množství nukleotidových sekvencí (kodonů) kódujících jednu aminokyselinu, existuje také množství nukleových kyselin kódujících protein obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou jako SEKV. ID. Č. 1. Takové

- 21 nukleové kyseliny jsou také zahrnuty mezi nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu. Tedy termín kódující protein znamená sekvence mající nukleotidovou sekvenci kódující jeden ze dvou komplementárních řetězců DNA, jestliže DNA má dva podle předkládaného kyseliny obsahující řetězce, přičemž nukleová kyselina vynálezu také zahrnuje nukleové nukleotidovou sekvenci přímo kódující aminokyselinovou sekvenci uvedenou jako SEKV. ID. Č. 1. nebo nukleovou kyselinu obsahující nukleotidovou sekvenci k ní komplementární.

Nukleová kyselina podle předkládaného vynálezu je také nukleová kyselina obsahující nukleotidovou sekvenci uvedenou zde v seznamu sekvencí jako SEKV. ID. Č. 2.

Nukleotidová sekvence uvedená jako SEKV. ID. Č. 2 je nukleotidová sekvence DNA získaná extrakcí genomové DNA z výše uvedených mikroorganizmů a pak připravená pomocí PCR (polymerázové řetězové reakce) s použitím syntetických oligonukleotidových primerů navržených podle aminokyselinové sekvence reduktázy asymetrického aminoketonu.

Ačkoliv způsob extrakce genomové DNA z výše uvedeného mikroorganizmu není nijak konkrétně omezen, například buňky z mikrooganizmu získané kultivací (např. Rhodococcus erythropolis kmen MAK-34) byly rozrušeny, chromozómová DNA byla izolována obvyklým způsob, RNA byla pak rozštěpena a odstraněna a byla provedena deproteinizace, aby byla získána purifikovaná DNA. Tyto operace byly popsány např. v publikaci Plant Biotechnology Experiment Manual, Noson-Bunkasha, p. 252. Kterýkoliv mikroorganizmus schopný produkce reduktázy asymetrického aminoketonu patřící k rodu Rhodococcus může být vhodně použit jak zdroj DNA.

Pro přípravu oligonukleotidových primerů použitých ve výše zmíněné PCR mohou být užity jakékoliv známé metody, • · · · • · · · · ·

- 22 erythropolis v peptidhydrolázou, přičemž syntetický oligonukleotidový primer je připraven podle aminokyselinové sekvence reduktázy asymetrického aminoketonu.

Například syntetický oligonukleotidový primer může být připraven podle aminokyselinové sekvence purifikované reduktázy asymetrického aminoketonu získané z výše uvedeného mikroorganizmu schopného produkovat reduktázu asymetrického aminoketonu. Obecně, degenerovaný primer je připraven podle aminokyselinové sekvence. Primery mohou být snadno připraveny metodami známými v oboru. Například mohou být syntetizovány s využitím fosfodiesterové, fosfotriesterové nebo fosforamiditové chemie například s použitím automatického DNA syntetizátoru. Specificky, reduktáza asymetrického aminoketonu je purifikována z buněk získaných kultivací Rhodococcus médiu a je segmentována je to nutné, aby byla získána Z takto získané výhodně připraví primer. S použitím tohoto kde genomová DNA reduktázy PCR reakce mohou nebo metodami v mohou být užity živném jestliže informace o aminokyselinové sekvenci enzymu informace o aminokyselinové sekvenci se syntetický oligonukleotidový primeru se provede PCR, asymterického ketonu je použita jako templát být prováděny v oboru známými metodami, podstatě stejnými nebo změněnými. Například metody popsané v publikacích R. Saiki, et al., Science, Vol. 230, pp. 1350 (1985); R. Saiki, et al., Science, Vol. 239, pp. 487 (1988); and Henry A. Erlich, PCR Technology, Stockton

Press. Reakce mohou být prováděny například tak, že se využijí komerčně dostupné soupravy a činidla.

Výsledné amplifikované DNA fragmenty jsou sekvencovány, aby se potvrdilo, že obsahují sekvence homologní k aminokyselinové sekvenci purifikovaného enzymu, a jsou značeny izotopem, aby mohly být použity jako sonda pro následující

- 23 experimenty apod. Nukleotidová sekvence mohou být určena užitím dideoxy metody sekvencování jako je například M13 dideoxy postup, například postup podle Maxama-Gilberta apod. Sekvencování se může provádět s použitím komerčně dostupných souprav pro sekvencování, jako je například sekvencovací souprava Taq Dye Primer Cycle Sequencing Kit, a s využitím automatického sekvenátoru, jako je například fluorescenční DNA sekvenátor, apod. Pro značení sondy, například radioizotopem, jsou komerčně dostupné soupravy pro značení, například může být použita značící souprava s náhodným primerem DNA (Boehringer Mannhaim) .

Gen reduktázy asymetrického ketonu podle předkládaného vynálezu může být klonován například následujícím způsobem. Specificky, například metody genetického inženýrství mohou být prováděny metodami popsanými v publikacích T. Maniatis et al., Molecular Cloning, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.T. (1989); the Japanese Biochemical Society, ed., Sequel to Biochemical Experiment Lecture 1, Gene Study Method II, Tokyo Kagaku Dojin (1986); the Japanese Biochemical Society, ed., New Biochemical Experiment Lecture 2, Nucleic Acid ÍII (Recombinant DNA Technique), Tokyo Kagaku Dojin (1992); R. Wu et al., ed., Methods in Enzymology, Vol. 68, Academie Press, New York (1980); R. Wu et al., ed. , Methods in Enzymology, Vol. 1006101, Academie Press, New York (1983); R. Wu et al., ed., Methods in Enzymology, Vol. 153, 159 & 155, Academie Press, New York (1987) atd.., metodami popsanými v literatuře citovaná ve výše uvedených publikacích, metodami s nimi v podstatě stejnými nebo modifikovanými. Tyto metody mohou být známé původní metody nebo metody změněné a zlepšené ve shodě s předmětem předkládaného vynálezu.

Nukleová kyselina podle předkládaného vynálezu je dále nukleová kyselina, která hybridizuje za stringentních podmínek s nukleovou kyselinou obsahující nukleotidovou sekvenci uvedenou jako SEKV. ID. Č. 2 a kódující protein mající aktivitu reduktázy asymetrického aminoketonu. Termín hybridizace za stringentních podmínek v předkládaném vynálezu znamená, že dva DNA fragmenty hybridizují navzájem v podmínkách hybridizace popsaných v publikaci J. Sambrook, et al., Expression of cloned genes in E. coli, Molecular Cloning: A laboratory manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, 9.47-9.62 and 11.45-11.61.

Konkrétně stringentní podmínky se týkají provádění hybridizace v 6,0 x SSC v přibližně 45 °C. Pro výběr stringence je možné volit např. koncentraci soli v kroku promývání, například v rozsahu od nízké stringence při přibližně 2,0 x SSC a 50°C do vysoké stringence v přibližně 6,0 x SCC a 50°C. Dále, teplota v kroku promývání může být od teploty místnosti, přibližně 22 °C, v podmínkách nízké stringence, až přibližně 65 °C v podmínkách vysoké stringence.

Dále, nukleová kyselina podle předkládaného vynálezu je nukleová kyselina obsahující část nukleotidové sekvence uvedené v seznamu sekvencí jako SEKV. ID. Č. 2.

A dále bude vysvětlen vektor podle předkládaného vynálezu.

Vektor podle předkládaného vynálezu je vektor obsahující výše uvedenou nukleovou kyselinu.

Zde může být užit pro integraci nukleové kyseliny kterýkoliv plazmid, obecně používaný v genetickém inženýrství, pokud může exprimovat protein kódovaný nukleovou kyselinou v hostitelské buňce (např. prokaryotický buněčný hostitel, jako je například Escherichia coli nebo Bacillus subtilis, nebo

eukaryotický buněčný hostitel, jako například kvasinky). Do takové sekvence mohou být zavedeny kodony vhodné pro expresi ve vybrané hostitelské buňce nebo mohou být poskytnuta místa pro restrikční enzymy. Plazmid také může obsahovat regulační sekvence, enhancerové sekvence apod. pro usnadnění exprese požadovaného genu, dále linkery, adaptéry apod. použitelné pro vazbu požadovaného genu, a také sekvence regulující rezistenci k antibiotikům nebo regulátorům metabolismu, které jsou pak použitelné pro selekce buněk.

Příklady promotorů v plazmidu zahrnují tryptofanový (trp) promotor, laktózový (lac) promotor, tryptofan/laktózový (tac) promotor, lipoproteinový (lpp) promotor a PL promotor fága λ v plazmidech pro použití v Escherichia coli jako jejich hostiteli a promotory GALl a GAL10 v plazmidech pro použití v kvasinkách jako jejich hostiteli.

Příklady plazmidů pro použití v Escherichia coli jako hostiteli zahrnují pBR322, pUC18, pUC19, pUC118, pVC119, pSP64, pSP65, pTZ-18R/-18U, pTZ-19R/-19U, pGEM-3, pGEM-4, pGEM-3Z, pGEM-4Z, pGEM-5Zf(-) a pBluescript KS™ (Stratagene).

Příklady plazmidů vhodných pro expresi v Escherichia coli zahrnují pAS, pKK223 (Pharmacia), pMC1403, pMC931 a pKC30.

Příklady plazmidů pro použití v kvasinkách jako hostiteli zahrnují vektory typu Yip, typu Yep, typu Yrp, typu Ycp a vektor pGPD-2.

Když je hostitelskou buňkou Escherichia coli, příklady hostitelských buněk zahrnují buňky pocházející z Escherichia coli kmen K12, konkrétně např. NM533, XL1-BLUE, C600, DH1, HB101, JM109, apod.

V postupech genetického inženýrství užívaných při realizaci předkládaného vynálezu se užívají restrikční enzymy,

reverzní transkriptáza, enzymy modifikující DNA, Dnáza pro přizpůsobení DNA fragmentů do struktury vhodné ke klonování, a DNA polymeráza, terminální nukeotidyltransferáza, DNA ligáza apod., kteréžto enzymy jsou odborníkům známé a jsou v oboru zcela všeobecně užívány. Příklady restrikčních enzymů byly popsány např. v R.J.ROberts, Nucleic Acids Res., Vol. 13, rl65 (1985); S. Linn et al., ed., Nucleases, p. 109, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York, 1982. Příklady reverzní transkriptázy zahrnují transkriptázu pocházející z Moloneyho viru myší leukémie (MMLV) a z viru ptačí myeloblastózy (AMV), a Rnáza H může být použita výhodně pro deleční mutanty. Příklady DNA polymeráz zahrnují DNA polymerázu z Escherichia coli, z ní odvozený Klenowův fragment, DNA polymerázu fága T4 Escherichia coli, DNA polymerázu fága T7 Escherichia coli a tepelně rezistentní bakteriální DNA polymerázu.

Příkladem terminální nukleotidyltransferázy která přidává deoxynukleotid (dNMP) na 3'-OH popsali R. Wu et al. ed., Methods in Enzymology p. 96, Akademie Press, New York (1983).

je TdTáza, konec, jak , Vol. 100,

Příklady DNA modifikujících enzymů/Dnázy zahrnují exonukleázu a endonukleázu. Specifické příklady zahrnují fosfodiesterázu hadího jedu, fosfodiesterázu ze sleziny, DNA exonukleázu I z Escherichia coli, DNA exonukleázu III z Escherichia coli, DNA exonukleázu VII z Escherichia coli, exonukleázu λ, Dnázu I, nukleázu SI a nukleázu z Micrococcus.

Příklady DNA ligázy zahrnují DNA ligázu z Escherichia coli a T9 DNA ligázu.

Příklady vektoru vhodného ke konstrukci DNA knihovny klonováním DNA genu zahrnují plazmidy, fág λ, kozmidy, fág Pl, F faktor a YAC. Konkrétně jsou výhodné vektory odvozené z fága • ·

- 27 λ, specifické příklady zahrnují Charon 4A, Charon 21A, XgtlO, Xgtll, XDASHII, XFIXII, ÁEMBL3 a λΖΑΡΙΙ™ (Stratagene).

Tím, že se vektor podle předkládaného vynálezu vnese do hostitelských buněk, jako například buněk uvedených výše, připraví se z mikroorganismu nebo zvířecí buňky transformant, který může produkovat reduktázu asymetrického aminoketonu podle předkládaného vynálezu. Předkládaný vynález tedy také zahrnuje takové transformanty.

Způsob transformace není nijak omezen a mohou být použity jakékoliv známé metody, jejichž příklady zahrnují způsob, kdy je buněčný protoplast, připravený vhodným enzymem štěpícím buněčnou stěnu, přiveden do kontaktu s DNA v přítomnosti chloridu vápenatého, polyethylenglykolu apod., nebo metodou užívající fosforečnan vápenatý, lipofektin, nebo elektroporaci (viz např., E. Neumann et al., EMBO J, Vol. 1, pp. 841 (1982), mikroinjekce nebo implantace pomocí „genového děla.

Protein podle předkládaného vynálezu může být s použitím transformant také vytvořen jako rekombinantní protein. Předkládaný vynález zahrnuje také způsoby výroby takového rekombinantního proteinu.

Když je protein podle předkládaného vynálezu získán jako inkluzní tělísko, je potom podroben solubilizačnímu kroku, např. zpracování v přítomnosti denaturačního činidla, jako například hydrochloridu guanidinu nebo močoviny, a jestliže je to nutné, redukčního činidla, jako je například 2-merkaptoethanol nebo dithiothreitol, aby byl protein purifikován jako účinná forma enzymu. Enzym-produkující buňky mohou také být použity tak jak jsou jakožto enzym.

Příkladem transformanty použité pro produkci rekombinantního proteinu je Escherichia coli (JM109) MAK-EX41 • ·

- 28 (BP-7452) obsahující vektor (pKK223-3) mající vložený gen pro reduktáza asymetrického aminoketonu. MAK-EX41 byl uložen ve sbírce národního ústavu biologických věd a humánních technologií (NIBH), Národní Institut moderní vědy a technologie, Ministerstvo hospodářství, obchodu a průmyslu, (Central 6, 1-1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, 305-8566 Japonsko) 15. února 2001 (původní datum uložení) v souladu s Budapešťskou smlouvou jako položka č. BP-7452.

Dále bude vysvětlen způsob produkce opticky aktivního aminoalkoholu podle předkládaného vynálezu.

Způsob produkce opticky aktivního aminoalkoholu podle předkládaného vynálezu je způsob zahrnující krok, kdy protein působí na enantiomerní směs α-aminoketonu reprezentovaného obecným vzorcem 1:

kde

X mohou být shodné nebo odlišné, přičemž X představuje alespoň jeden člen vybraný ze skupiny, kterou tvoří atom halogenu, nižší alkylová skupina, hydroxylová skupina volitelně chráněná chránící skupinou, nitroskupina a sulfonylová skupina, n představuje celé číslo 0 až 3,

R¹ je nižší alkylová skupina,

R² a R³ mohou být shodné nebo odlišné, a představují alespoň jeden člen vybraný ze skupiny, kterou tvoří atom vodíku a nižší alkylová skupina, a

- 29 označuje asymetrický atom uhlíku, nebo jeho soli, za vzniku opticky aktivní β-aminoalkoholové sloučeniny reprezentované obecným vzorcem 2:

definovány výše, optickou aktivitu.

přičemž jsou výsledná shodné s sloučenina tím, jak byly má požadovanou

Nejdříve bude vysvětlena α-aminoketonová sloučenina reprezentovaná obecným vzorcem (1) podle předkládaného vynálezu. Jde o enantiomerní směs α-aminoketonové sloučeniny obecného vzorce (1) nebo její soli, kde X mohou být shodné nebo odlišné, přičemž X představuje alespoň jeden člen vybraný ze skupiny, kterou tvoří atom halogenu, nižší alkylová skupina, hydroxylová skupina volitelně chráněná chránící skupinou, nitroskupina a sulfonylová skupina, n představuje celé číslo 0 až 3, R¹ je nižší alkylová skupina, R² a R³ mohou být shodné nebo odlišné, a představují alespoň jeden člen vybraný ze skupiny, kterou tvoří atom vodíku a nižší alkylová skupina, a označuje asymetrický atom uhlíku.

Dále je podrobněji vysvětlen substituent X v α-aminoketonové sloučenině. Příklady atomu halogenu zahrnují atom fluoru, atom chloru, atom bromu a atom jodu.

Nižší alkylová skupina je výhodně alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, jako je methylová skupina,

- 30 ethylová skupina, propylová skupina, isopropylová skupina, butylová skupina, isobutylová skupina, s-butylová skupina, t-butylová skupina, pentylová skupina, isopentylová skupina, hexylová skupina apod. Tyto skupiny mohou mí buďto přímý řetězec nebo rozvětvenou strukturu a mohou jako substituent obsahovat atom halogenu jako je například atom fluoru nebo chloru, hydroxylovou skupinu, alkylovou skupinu, aminoskupinu nebo alkoxyskupinu.

Příkladem chránící skupiny hydroxylové skupiny volitelně chráněné chránící skupinou je kromě jiných např. skupina, která může být odstraněna působením vody, skupina, která může být odstraněna hydrogenaci, skupina, která může být odstraněna Lewisovou kyselinou jakožto katalyzátorem nebo thiomočovinou apod. Specifické příklady chránící skupiny zahrnují acylovou skupinu volitelně substituovanou, alkoxyalkylovou skupinu volitelně substituovanou, alkoxyalkylovou skupinu, nižší alkylovou skupinu volitelně substituovanou, benzylovou skupinu, p-methoxybenzylovou skupinu, 2,2,2-trichlorethoxykarbonylovou skupinu, allyloxykarbonylovou skupinu a tritylovou skupinu.

K příkladům acylových skupin patří acetylová skupina, chloracetylová skupina, dichloracetylová skupina, pivaloylová skupina, benzoylová skupina, p-nitrobenzoylová skupina apod.. Tato skupina může mít navíc substituent jako je například skupina, alkylová skupina, alkoxyskupina, atom halogenu apod. Příklad silylové skupiny zahrnuje trimethylsilylovou skupinu, t-butyldimethylsilylovou skupinu, triarylsilylovou skupinu apod., která může mít substituent jako je například alkylová skupina, arylová skupina, hydroxylová skupina, alkoxyskupina, nitroskupina, atom halogenu apod. Příklad alkoxyalkylové skupiny zahrnuje hydroxylová nitroskupina,

- 31 methoxymethylovou skupinu, 2-methoxy-ethoxymethylovou skupinu apod. K nižším alkylovým skupinám patří alkylové skupiny obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, jako je např. methylová, ethylová, propylová, isopropylová, butylová, isobutylová, s-butylová, t-butylová, pentylová, isopentylová a hexylová skupina. Tyto skupiny mohou mít buďto přímou nebo rozvětvenou strukturu a mohou obsahovat substituent jako je například atom halogenu, např. fluoru a chloru, hydroxylová skupina, alkylová skupina, aminoskupina nebo alkoxyskupina.

R skupinu skupiny obsahující 1 methylová, ethylová,

X může být také nitroskupina nebo sulfonylová skupina, zejména jako specifický příklad methylsulfonylová skupina.

Počet n skupin X je celé číslo 0 až 3, výhodně je to 0.

¹ v obecném vzorci (1) představuje nižší alkylovou Takové nižší alkylové skupiny jsou výhodně alkylové až 6 atomů uhlíku: jsou to např. propylová, isopropylová, butylová, isobutylová, s-butylová, t-butylová, pentylová, isopentylová a hexylová skupina, apod. Tyto skupiny mohou být buďto s přímým řetězcem nebo mohou mít rozvětvenou strukturu.

a R³ představují atom vodíku nebo nižší alkylovou skupinu. Nižší alkylové skupiny jsou výhodně alkylové skupiny obsahující 1 až 6 atomů uhlíku: jsou to např. methylová, ethylová, propylová, isopropylová, butylová, isobutylová, st-butylová, pentylová, butylová, skupina, isopentylová a hexylová apod. Tyto skupiny mohou mít buďto přímou nebo rozvětvenou strukturu.

Příklady solí α-aminoketonové sloučeniny zahrnují soli anorganických kyselin jako je například hydrochlorid, síran, dusičnan, fosforečnan a uhličitan, a také soli organických kyselin jako je například acetát a citrát.

• ·

- 32 α-aminoketonová sloučenina může být snadno syntetizována užitím halogenace α-uhlíku odpovídajícího 1-fenylketonového a substitucí atomu halogenu, aminoskupinou (viz patentový derivátu (např. bromací) například nahrazení bromu dokument bývalé NDR , 11, 322, 12. března 1956, citován výše)

Dále, způsob výroby opticky aktivního aminoalkoholu podle předkládaného vynálezu je způsob zahrnující krok, kdy mikroorganizmus vybraný ze skupiny, kterou tvoří transformant, mikroorganismy patřící do rodu Rhodococcus a Rhodococcus erythropolis MAK-39, působí na enantiomerní směs z α-aminoketonu reprezentovaného obecným vzorcem (1):

za vzniku opticky aktivního aminoalkoholu reprezentovaného z

obecným vzorcem (2):

přičemž výsledná sloučenina má požadovanou optickou aktivitu.

Protein podle předkládaného vynálezu je protein, který je reduktázou asymetrického aminoketonu, a který účinkuje v produkci d-pseudoefedrinu tím, že působí na 1-2methylaminopropiofenon a má následující fyzikálně chemické vlastnosti:

• · · · · · · · ·· ····

• · · · · · •·· ··· ·· »* substrát: 1-2-methylaminopropiofenon optimální pH: pH 8,1 optimální teplota: 55 °C koenzym: NADP molekulová hmotnost: asi 28500 Da pro homotetramer

A protein podle předkládaného vynálezu je také protein mající aminokyselinovou sekvenci, která je zde uvedena v seznamu sekvencí jako SEKV. ID. Č. 1, a dále protein podle předkládaného vynálezu je protein odvozený z proteinu obsahujícího uvedenou aminokyselinovou sekvenci obsahující delece, inzerce, substituce nebo adice jedné nebo více aminokyselin.

Ve způsob produkce opticky aktivního aminoalkoholu podle předkládaného vynálezu, transformant, mikroorganizmus patřící k rodu Rhodococcus nebo Rhodococcus erythropolis kmen MAK-39 (FERM BP-7451) může být přímo přidán místo proteinu do reakce, aby produkoval opticky aktivní aminoalkohol.

Opticky aktivní aminoalkohol reprezentovaný obecným vzorcem (2) podle předkládaného vynálezu bude nyní podrobněji vysvětlen.

X, n, R¹, R², R³ a * v obecném vzorci (2) mají stejný význam jak byl vysvětlen v obecném vzorci

Příkladem (i:

β-aminoalkoholu majícího (IS,2S)-aminoalkohol.

požadovanou optickou aktivitu je

Příkladem podmínek, probíhat, je třepaná za kterých může uvedená reakce tekutá kultura transformovaného mikroorganizmu v tekutém médiu, kterýžto mikroorganizmus je sebrán, k takto získaným buňkám se přidá vodný roztok aminoketonu (0,1 až 10%) a reakce se ponechá probíhat několik hodin až 1 den při teplotě 10 °C až 40°C, přičemž pH se nastaví na 6 až 8. Po dokončení reakce jsou buňky separovány a • · · ·

- 34 izoluje se produkt v reakčním roztoku, přičemž se získá opticky aktivní aminoalkohol. Zde se stejným způsobem mohou použít zpracované buňky (usušené buňky, imobilizované buňky apod.) transformovaného mikroorganismu nebo zmobilizovaný enzym apod.

Ve způsobu výroby opticky aktivního aminoalkoholu podle předkládaného vynálezu, sloučenina reprezentovaná obecným vzorcem (3)

·” ( 3 } kde A reprezentuje strukturní vzorec (Y) nebo (Z):

R⁴

O

C.

... (γ) kde R⁴ je atom vodíku, alkylová skupina obsahující 1 až 3 atomy uhlíku volitelně mající substituent, uhlovodíkový kruh obsahující 5 až 10 atomů uhlíku svázaný s R® nebo heterocyklická kostra 5 až 8-členného kruhu zahrnující 1 až 3 heteroatomy svázané s R®,

kde R⁵ je atom vodíku, alkylová skupina obsahující 1 až 3 atomy uhlíku nebo heterocyklická kostra 5 až 8-členného kruhu zahrnující 1 až 3 heteroatomy svázaný s R⁶ nebo R⁹, R⁶ je atom vodíku, alkylová skupina obsahující 1 až 3 atomy uhlíku volitelně mající substituent, uhlovodíkový kruh obsahující 5 až 10 atomů uhlíku svázaný s R⁸ nebo heterocyklická kostra 5- až 8-členného kruhu zahrnující 1 až 3 heteroatomy svázaná s R⁵ nebo R⁹, a R⁷ je atom vodíku nebo alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomům uhlíku volitelně mající substituent,

R⁸ je atom vodíku, karboxylová skupina, alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku volitelně mající substituent, heterocyklická kostra 5- až 8-členného kruhu zahrnující 1 až 3 heteroatomy svázaná s R⁴ nebo uhlovodíkový kruh z 5 až 10 atomů uhlíku svázaný s R₆, R⁹ je atom vodíku, alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku volitelně mající substituent, acylová skupina volitelně mající substituent nebo heterocyklická kostra 5- až 8-členného kruh zahrnující 1 až 3 heteroatomy svázaná s R⁵ nebo R⁶, a R¹⁰ je atom vodíku nebo volitelně substituovaná alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, nebo její farmaceuticky přijatelná sůl nebo solvát, může být dále přidána, aby byl produkován opticky aktivní aminoalkohol, přičemž opticky aktivní aminoalkohol je produkován s vyšší účinností.

V obecném vzorci (3), alkylová skupina obsahující 1 až 3 atomy uhlíku je buďto přímá nebo rozvětvená, k jejím specifickým příkladům patří methylová skupina, ethylová skupina, n-propylová skupina a isopropylová skupina. Alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku je buďto přímá nebo rozvětvená, k jejím specifickým příkladům patří methylová skupina, ethylová skupina, n-propylová skupina, isopropylová skupina, n-butylová skupina, i-butylová skupina, s-butylová skupina, t-butylová skupina, pentylová skupina a hexylová skupina. K příkladům uhlovodíkového kruhu s 5 až 10 atomy uhlíku patří cyklopentylový, cyklohexylový, cykloheptylový, cyklooktylový, cyklononylový a cyklodekanylový kruh.

V heterocyklické kostře 5- až 8-členného kruhu obsahujícího 1 až 3 heteroatomy příklady heteroatomů zahrnují atom dusíku, kyslíku a síry, výhodně atom dusíku a kyslíku, příklady heterocyklické kostry 5- až 8-členného kruh zahrnují pyrolidinový, piperidinový, imidazolidinový, piperazinový, tetrahydrofuranový, tetrahydropyranový, tetrahydrothíofenový a morfolinový kruh.

K příkladům alkyloxykarbonylové skupiny obsahující 1 až 6 atomů uhlíku patří methyloxykarbonylová skupina, thyloxykarbonylová skupina, isopropyloxykarbonylová skupina, isobutyloxykarbonylová skupina a t-butyloxykarbonylová skupina. K příkladům acylové skupiny patří formylová skupina, acetylová skupina, propionylová skupina, butyrylová skupina, isobutyrylová skupina, pivaloylová skupina, benzoylová skupina a valerylová skupina. Pokud jde o alkylovou skupinu obsahující 1 až 3 atomy uhlíku nebo 1 až 6 atomů uhlíku, alkyloxykarbonylovou skupinu obsahující 1 až 6 atomů uhlíku nebo acylovou skupinu, které mají substituenty, pak druh, poloha a počet substituentů nejsou nijak konkrétně omezeny, a k příkladům substituentů patří atom halogenu, jako například fluor a chlor, hydroxylová skupina, alkylová skupina, karboxylová skupina, aminoskupina, alkoxyskupina, nitroskupina a arylová skupina. K příkladům farmaceuticky přijatelných solí patří soli anorganických kyselin, jako například hydrochlorid, síran, dusičnan, fosforečnan, uhličitan, a soli organických kyselin, jako například acetát a citrát, anorganické alkalické soli Na, K, Mg, Ca, amonné soli apod., a také organické • »

- 37 alkalické soli triethylaminu, cyklohexylaminu apod.

K příkladům sloučeniny reprezentované obecným vzorcem (3) patří l-acetylamino-2-hydroxypropan, l-methylamino-2hydroxypropan, l-amino-2-oxopropan, l-amino-2-hydroxycyklopentan, l-amino-2,3-dihydroxypropan, 1-threonin, 4-amino3-hydroxybutanová kyselina, l-amino-2-oxocyklohexan, morfolin, 3-hydroxypyrolidin, 3-hydroxypiperidin, 2-aminomethyltetrahydrofuran, 1-(2-hydroxypropyl)amino-2-hydroxypropan, 1-t-butyloxykarbonylamino-2-hydroxypropan, 2-amino-3-hydroxybutan, DL-serin, l-amino-2-hydroxypropan, l-amino-2-hydroxybutan a l-amino-2-hydroxycyklohexan. A z nich sloučeniny mající asymetrický uhlík mohou být buďto opticky aktivní látka nebo racemická látka, není-li zvláště uvedeno jinak. Přidání některého z těchto induktorů aktivity do média indukuje aktivitu mikroorganizmu, přičemž následná produkce opticky aktivního β-aminoalkoholu probíhá s vyšší účinností než v případě bez přidání induktoru. Induktory aktivity mohou být použity jednotlivě nebo jako směs dvou nebo více induktorů. Množství přidaného induktoru aktivity je výhodně 0,01 až 10 % (hmot.) vzhledem k médiu.

Jak bylo vysvětleno v předcházejícím textu, genetická struktura kódující přírodní reduktázu asymetrického aminoketonu, jako například přírodní reduktázu asymetrického aminoketonu pocházející z Rhodoccocus erythropolis, nebo protein mající aktivitu v podstatě s ní rovnocennou, je objasněna, takže lze očekávat dramatický rozvoj v použití například hostitelských buněk transformovaných DNA obsahující nukleotidovou sekvenci kódující protein, způsoby produkce proteinu s použitím hostitelské buňky a produkce opticky aktivního aminoalkoholu s využitím proteinu a hostitelské buňky, a také samotná reduktáza asymetrického aminoketonu může • ·

- 38 být změněna, aby se zvýšila její enzymatická aktivita.

V následující části je předkládaný vynález vysvětlen podrobněji pomocí specifických příkladů, které nijak neomezují rozsah předkládaného vynálezu.

Příklad 1

Purifikace reduktázy asymetrického aminoketonu

Rhodococcus erythropolis MAK-34 byl zaočkován do zkumavky obsahující 5 ml média s pH 7,0 obsahující 1% glukózu, 0,3% hydrogenfosforečnan draselný, 0,2% heptahydrát síranu hořečnatého, 1,5% pepton, 0,2% chlorid sodný a 0,1% kvasinkový extrakt a byl za třepání kultivován v 28 °C po dobu 3 dnů a pak byl inokulován do 500 ml média stejného složení a kultivace při třepání probíhala ve 28°C po dobu 3 dnů. Takto získaná prekultura byla inokulována do 50 litrů média s přídavkem 0,1% l-amino-2-hydroxypropanu (ke stejnému složení jak je popsáno výše) a kultivace probíhala ve 28 °C po dobu 2 dnů.

Takto získané kultivační médium bylo stočeno centrifugou, čímž se získalo 3785 g buněk (čerstvá hmotnost) . K 1 kg buněk bylo přidáno 1000 ml pufru lOmM Tris-HCl (pH 8,5) obsahujícího 10% glycerol, lmM chlorid nikelnatý a lmM kyselinu nikotinovou. Výsledná směs byla rozrušena ultrazvukem, po dobu 90 až 100 minut, a pak byla stočena ultracentrifugou (33000 rpm po dobu 60 minut), čímž bylo získáno 759 ml bezbuněčného extraktu. Tento bezbuněčný extrakt byl dialyzován s výše uvedeným roztokem pufru. Takto získaných 770 ml roztoku enzymu bylo naneseno na kolonu DEAE-Sephacell (5,6 x 20 cm) a bylo eluováno lineárním koncentračním gradientem (0,15 až 0,8 M) chloridu sodného. Takto eluovaných 173 ml enzymaticky účinné frakce bylo dialyzováno s výše uvedeným roztokem pufr. Získaných 173 ml roztoku enzymu bylo naneseno na kolonu Mono Q HR 10/10 (1,0 x 10 cm) a bylo opět eluováno lineárním koncentračním gradient (0 až 0,6 M) chloridu sodného. Elucí získaných 28 ml enzymaticky aktivní frakce bylo dialyzováno s výše uvedeným pufrem bez kyseliny nikotinové. Získaných 28 ml roztoku enzymu bylo naneseno na kolonu HiTrap Blue (1 ml) a kolona byla promyta 10 mM TrisHCl pufrem (pH 8,5) obsahujícím 10% glycerol, 1 mM chlorid nikelnatý, 2 mM kyselinu nikotinovou a l,0M chlorid sodný a 0,024% NADP⁺, čímž bylo získáno 8,7 ml eluované enzymaticky aktivní frakce. Získaných 8,7 ml roztoku enzymu, s přídavkem 1,2M síranu amonného, bylo naneseno na kolonu Fenyl Superose HR 5/5 (0,5 x 5 cm) a bylo eluováno lineárním koncentračním gradientem (1,2 až 0 M) síranu amonného. Eluované 2,12 ml enzymaticky aktivní frakce byly ultrafiltrovány na Amiconu YM10. Takto získaných 150 μΐ koncentrátu enzymu bylo naneseno na kolonu Superose 12 HR 10/30 (1, 0 x 30 cm) a bylo eluováno lOmM Tris-HCl pufrem (pH 8,5) obsahujícím 10% glycerol, lmM chlorid nikelnatý, lmM kyselinu nikotinovou a 0,15M chlorid sodný. Tak eluovaný 1,95 ml enzymaticky aktivní frakce byl dialyzován s lOmM Tris-HCl pufrem (pH 8,5) obsahujícím 10% glycerol, lmM chlorid nikelnatý, lmM kyselinu nikotinovou a 0,15M chlorid sodný, čímž byl získán roztok purifikovaného enzymu obsahující 293 pg purifikovaného enzymu.

Vlastnosti takto purifikované reduktázy asymetrického aminoketonu jsou následující:

• ·

- 40 1. Substrátová specifita a enzymatická aktivita μΐ IM Tris-Hcl pufru (pH 8,0), 25 μΐ 16mM NADP+ a 215 μΐ purifikovaného roztoku enzymu byly udržováno při 43 °C, a byl přidán 1 μΐ l-amino-2-hydroxypropanu, římž byl připraven aminoaceton. Zvýšení nebo snížení množství NADPH doprovázející reakci bylo měřenou jako změna absorbance ve 340 nm. Pro měření aktivita enzymu byla enzymatická aktivita, která 1 μπιοί l-amino-2-hydroxypropanu oxiduje za 1 minutu v následujících podmínkách definována jako 1 jednotka (U). Výsledek ukázal, že celková aktivita byla 126 mU, specifická aktivita byla 432 mU/mg a výtěžek aktivity byl 0,22 %.

Obdobně bylo potvrzeno, že enzym působí na 1-2-methylaminopropiofenon, 1-2-dimethylaminopropiofenon a l-amino-2butanon.

2. Molekulová hmotnost

Byla stanovena přibližně 105,000 když byla měřena s použitím gelové filtrace, a přibližně 28500, když byla měřena s použitím elektroforézy na SDS-polyakrylamidovém gelu (viz obr. 1) . To ukazuje, že enzym je tetramerní protein mající čtyři podjednotky, z nichž každá má molekulovou hmotnost přibližně 28500.

3. Optimální pH μΐ purifikovaného roztoku enzymu, 420 μΐ vody, 20 μΐ IM Tris-Hcl pufru roztok a 50 μΐ 16 mM vodného roztoku NADP+ bylo smícháno a inkubováno ve 45 °C a byly přidány 2 μΐ l-amino-2-propanolu, aby zreagovaly. S použitím spektrofotometru byla určena aktivita výpočtem s časové změny absorbance při 340 nm (Obr. 2). Výsledek ukázal, že optimální • ·

- 41 pH bylo přibližně 8,1.

4. Optimální teplota μΐ purifikovaného roztoku enzymu, 420 μΐ vody, 20 μΐ O,1M pufru PIPES (pH 7,5) a 50 μΐ 16 mM vodného roztoku NADP+ bylo smícháno a inkubováno při různých teplotách, a byly přidány 2 μΐ l-amino-2-propanolu, aby zreagovaly. S použitím spektrofotometru byla určena aktivita výpočtem s časové změny absorbance při 340 nm (Obr. 3) . Výsledek ukázal, že optimální teplota byla 55 °C.

5. Vliv inhibitoru a iontu kovu

Enzymová aktivita byla inhibována a,a-dipyridylem v lmM koncentraci, o-fenantrolinem v 1 mM koncentraci a EDTA v 1 mM koncentraci.

Příklad 2

Klonování genu pro reduktázu asymetrického aminoketonu

Exprese v Escherichia coli

1. Stanovení parciální aminokyselinové sekvence purifikovaného enzymu nmol lyofilizované reduktázy asymetrického aminoketonu (jako podjednotky s molekulovou hmotností přibližně 28500) byl • ·

- 42 rozpuštěn v 50 μΐ 50mM Tris-Hcl pufru (pH 8,6) obsahujícím 8M močovinu a byl denaturován po dobu 1 hodinový ve 37 °C.

Přidáno bylo 50 μΐ 50mM Tric-HCl (pH 8,6), aby bylo dosaženo 4M koncentrace močoviny. Pak bylo provedeno štěpení přidáním 0,5 μΐ (0,006 nmol, E/S = 1/167) 12 nmol/ml lysylendopeptidázy (Wako Pure Chemicals) po dobu 6 hodin ve 30 °C. získané štěpené peptidy byly odebrány kolonu s reverzní fází (Amersham Pharmacia Biotech) a jejich aminokyselinové sekvence byly analyzovány pomocí zařízení pro sekvencování proteinů

ABI 476A. Byly získány následující výsledky:

1) MENSIEGRSVWTGGSK (N-koncový fragment) (SEKV. ID. Č. 3)

2) RLGEMTSEDMDSVFGVNVK (SEKV. ID. Č. 4)

3) AAQMGFIRTAAIELAPK (SEKV. ID. Č. 5)

4) XXILAVQAMMPXL (SEKV. ID. Č. 6)

5) XITINAVLPGNVITEGLDGLGQEYLDQM (SEKV. ID. Č. 7)

Podmínky sběru výše uvedených peptidů byly následující:

Systém: SMART systém

Kolona: μΚΡΟ C2/C18 SC2.1/10

Průtoková rychlost: 100 μΐ/minuta

Eluent: A: 0,1% TFA

B: 0,1% TFA/80% CH₃CN

Eluční podmínky: gradientová eluce 0-15 minut (100% A) -> 15-75 minut (100%A -> 100% B)

Teplota kolony: teplota místnosti

Vlnová délka detekce: 219 nm a 280 nm.

• ·

- 43 2. Příprava genomové DNA

Buňky (MAK-34) ve fázi pozdního logaritmickém růstu byly sebrány centrifugaci. Takto získané buňky byly suspendovány v TES pufru (5mM Tris, lmM EDTA a 2,5% sacharóza, pH 8,0). Tato suspenze, s přídavkem EDTA, vody, lysozymu a Proteinázy K, byla pomalu míchána po dobu 2,5 hodiny ve 37 °C. Pak byl přidán roztok SDS a takto lyžovaný vzorek byl míchán a postupně byl deproteinizován fenolem, fenol/chloroformem a chloroformem. Byla přidána 1/10 objemu 3M acetátu sodného a 2,5x objem ethanolu a DNA byla natočena na skleněnou tyčinku. Postupně pak byla promyta 70%, 80% a 90% ethanolem a na vzduchu usušená DNA byla rozpuštěna v TE pufru (lOmM Tris a lmM EDTA, pH 7,8). Vzorek ošetřený Rnázou byl postupně extrahován fenolem, fenol/chloroformem a chloroformem, aby se odstranily proteiny. Byla přidána 1/10 objemu 3M acetátu sodného a 2,5x objem ethanolu a DNA tak byla precipitována. Precipitovaná DNA byla promyta 70% ethanolem, osušena na vzduchu a rozpuštěna v TE pufru, čímž byl získán roztok genomové DNA (36 ng/μΐ).

3. Amplifikace genu pro reduktázu asymetrického aminoketonu

Na základě aminokyselinové sekvence vnitřních peptidů reduktázy asymetrického ketonu (SEKV. ID. Č. 3 až 7), byl syntetizován sense primer MAK-sensel (SEKV. ID. Č. 8) odpovídající sense vláknu N-koncové aminokyselinové sekvence a antisense primer MAK-antil (SEKV. ID. Č. 9) odpovídající antisense sekvence vnitřního peptidů, přičemž tyto primery mají následující nukleotidové sekvence. Každý z MAK-sensel a MAK-antil je degenerovaný primer, kde v nukleotidové sekvenci y je T nebo C, s je C nebo G, h je T, C nebo, r je nebo G, m je C nebo, w je nebo T, n je, C, G nebo T.

MAK-sensel:

Met Phe Asn Ser Ile Glu Gly Arg (část SEKV. ID. Č. 3) ATG TTy AAy wsn ATh GAr GGn mG (SEKV. ID. Č. 8)

MAK-antil:

Met Gin Asp Leu Tyr Glu Gin Gly Leu (část SEKV. ID. Č. 7) CAT yTG rTC nAr rTA yTC yTG nCC nA (SEKV. ID. Č. 9)

S použitím genomové DNA reduktázy asymetrického ketonu jako templátu byla provedena PCR v následujících podmínkách. PCR amplifikace byla prováděna způsobem popsaným v publikacích popsán v R. Sakai, et al., Science, vol. 230, pp. 1350 (1985), R. Sakai, et al., Science, Vol. 239, pp. 487 (1988), PCR

Technology, Stockton Press (1989) nebo podobným způsobem. PCR amplifikací byl získán DNA fragment přibližné velikosti 0,6 k.

PCR podmínky byly následující: chromozómová DNA (36 ng/μΐ)	5	μΐ
sense primer (49 μΜ)	3	μΐ
antisense primer (41 μΜ)	3	μΐ
dNTP (2,5 mM každý)	9	μΐ
ExTaq polymeráza (TAKARA)	o,	3 μΐ
ExTaq polymerázový pufr roztok	5	μΐ
h₂o	29	·,7 μΐ

celkový objem μΐ

Teplotní režim PCR byl následující:

°C/4 minuty, 94 °C/1 minuta, 50 °C/1 minuta a 72 °C/1,5 minuty: 35 cyklů, nakonec 72 °C/10 minut.

- 45 Nukleotidová sekvence získaná amplifikaci DNA fragmentu byla určena a pak konvertována do aminokyselinové sekvence, přičemž místo totožné se parciální aminokyselinovou sekvencí

vnitřního nalezeno.	peptidu	reduktázy asymetrického	ketonu byla
Pro	určení	nukleotidové sekvence	úseku, jehož
nukleotidová sekvence zůstala neznámá, když	se zjišťovala

nukleotidová sekvence, byla provedena inverzní PCR. Nepřímá PCR byla prováděna způsobem popsaným v publikaci: H. Ochman, et al., Genetics, Vol. 120, pp. 621 (1988) a obdobným způsobem.

Nejdříve byl roztok genomové DNA podroben štěpení restrikčním enzymem (BglII), pak extrahován fenol/chloroformem a precipitován ethanolem. Takto získaný DNA fragment byl ošetřen T4 DNA ligázou (TAKARA), aby došlo k self-ligaci (spojení konců fragmentu). Výsledný produkt byl extrahován fenol/chloroformem a precipitován ethanolem. S takto získanou cirkulární DNA jako templátem byla provedena PCR v dále popsaných podmínkách s použitím sense primeru (IPCR-S1) a antisense primeru (IPCR-Al), které byly navrženy pro část mající známou nukleotidovou sekvenci. PCR amplifikace poskytla amplifikovaný DNA fragment velikosti přibližně 2 kb.

IPCR-Al (pro „upstream úsek)

AATACCCGGACCATTCCCAAGCCGAT (SEKV. ID Č. 10)

IPCR-S1 (pro „downstream úsek)

TCGAAACTTCTGGGCGTGGAAGGGTT (SEKV. ID. Č. 11)

4» 4Π·9 V « »· »«« • · · «··· « « « • · · · · « · ·

4« * · · · · « « ··· · · ···· ·· 4 ··· ··· ·» ·»

PCR podmínky byly následující:

Kruhová DNA (500 ng) sense primer (100 μΜ) 0,5 μΐ antisense primer (100 μΜ) 0,5 μΐ dNTP (2,5 mM každý) 4 μΐ

ExTaq polymeráza (TAKARA) 0,5 μΐ

ExTaq polymerázový pufr roztok 5 μΐ HzO_39,5 μΐ celkový objem 50 μΐ

Teplotní režim PCR byl následující:

°C/9 minut, 99 °C/1 minuta, 60 °C/1 minuta a 72°C/4 minuty: 30 cyklů, pak 72 °C/10 minut.

Nukleotidová sekvence takto získaného DNA fragmentu byla určena, čímž byl potvrzen ORF obsahující 780 bp včetně již dříve určené nukleotidové sekvence. Tento byl konvertován do aminokyselinové sekvence a nakonec bylo zjištěno, že obsahuje gen reduktázy asymetrického ketonu v plné délce (SEKV. ID. Č. 1) .

4. Exprese genu reduktázy asymetrického aminoketonu v Escherichia coli

Na základě nukleotidové sekvence genu reduktázy asymetrického ketonu objasněné v předcházejícím textu byly navrženy primery mající přidaná rozpoznávací místa pro restrikční enzymy. Tyto sekvence byly následující:

• · • · · · • · ·

- 47 ExS

GATGAATTCCA7\ATGTTC7\ACTCCATTGA (SEKV. ID. Č. 12) EcoRI start kodon

EsA

TGAAGCTTTCGTCGCTTGTCTTACAGTTC (SEKV. ID. Č. 13)

HindlII stop kodon

S použitím těchto primerů byla provedena PCR s genomovou DNA použitou jako templát za následujících podmínek. Výsledkem bylo získání amplifikovaného DNA fragmentu přibližně velikosti 0,8 kb.

PCR podmínky byly následující:
Genomová DNA (36 ng/μΐ)	5 μΐ (180 ng)
sense primer (100 μΜ)	0,5 μΐ
antisense primer (100 μΜ)	0,5 μΐ
dNTP (2,5 mM každý)	8 μΐ
LA-Taq polymeráza (TAKARA)	0,3 μΐ
LA-Taq polymerázový pufr roztok	5 μΐ
Mg₂ +	5 μΐ
H₂O 5 μΐ	29,7 μΐ
celkový objem	50 μΐ
Teplotní režim PCR byl následující
94 °C/4 minuty, 94 °C/1 minuta, 60	°C/1 minuta

minuty: 25 cyklů, pak 72 °C/10 minut.

- 48 Protože takto získaný PCR produkt měl na obou koncích místa pro restrikční enzymy EcoRI a HindlII, v daném pořadí, byl purifikován pomocí soupravy QIA Quick PCR Purification Kit (QIAGEN) a pak byl štěpen restrikčními enzymy (EcoRI a HindlII). Pak byl podroben elektroforéze na agarózovém gelu, pás byl vyříznut a purifikován pomocí soupravy GFX PCR DNA a Gel Band Purification. Takto získaný fragment byl ligován (Ligační soupravou od firmy TAKARA) s plazmidem pKK223-3, který byl také štěpen restrikčními enzymy (EcoRI a HindlII), čímž byl zkonstruován expresní vektor. Následně byl tento vektor transformován do kompetentních buněk E. coli JM 109 způsobem, který byl popsán v publikaci J. Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA. Takto získané transformanty byly selektovány PCR na koloniích z ampicilinrezistentních kmenů. Transformace byla ve shodě s postupem užívajícím chlorid vápenatý.

Tento rekombinantní kmen Escherichia coli MAK-EX41 byl kultivován za třepání v 500 ml směsi 1% tryptonu, 0,5% kvasinkového extraktu, 0,5% chloridu sodného, 100 pg/ml ampicilinu a lmM IPTG po dobu 16 hodin ve 37 °C. Takto získané buňky byly promyty vodou a pak podrobeny působení ultrazvuku, aby se odstranil nerozpustný materiál, čímž bylo připraveno 10 ml surový enzymového extraktu. K 0,1 ml tohoto surového enzymového extraktu byl přimíchán 1 mg hydrochloridu 2methylamino-l-fenylpropanonu, voda, 0,02 ml IM Tris-HCl pufru (pH 7,5), 10 mg glukózy, 0,1 mg glukózodehydrogenázy a 0,1 mg

NADP+, čímž byl připraven 1 ml reakčního roztoku, který pak byl reagován po dobu 24 hodin ve 37 °C. Po reakci byl nerozpustný materiál odstraněn z reakční směsi a supernatant byl podroben HPLC analýze (kolona gBondapakfenyl, od firmy Waters Corporation, průměr 4 mm, délka 300 mm, eluent 0,05M

- 49 fosfátový pufr (obsahující 7% z acetonitril), pH 6,5, průtoková rychlost 0,8 ml/minuta a detekce v UV o vlnové délce 220 nm) , následně bylo potvrzeno, že bylo takto připraveno 0,5 mg pseudoefedrinu.

Dále bylo potvrzeno, že všechny takto získané pseudoefedriny byly d-pseudoefedriny jako výsledek HPLC analýzy (kolona SUMICHIRAL AGP, Sumika Chemical Analyses Service Co., Ltd., průměr 4 mm, délka 150mm, eluent 0,03M pufr fosforečnanu sodného s pH 7, průtoková rychlost 0,5 ml/min a detekce v UV o vlnové délce 220 nm).

Escherichia coli MAX-EX41 obsahující vektor s vloženým výše uvedeným genem reduktázy asymterického ketonu byl uložen byl uložen ve Sbírce Mezinárodní Patentové Organizace, Národní Institut pro rozvoj vědy a technologie (Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japonsko, 305-8566) 15. únoru 2001 pod přístupovým číslem FERM BP-7452.

Příklad 3

Příprava d-(1S,2S)-pseudoefedrinu

Každý z mikroorganizmů uvedených dále v tabulce 1 byl inokulován do 50 ml média obsahující 1% glukózu, 0,5% pepton 0,3% kvasinkový extrakt a pak kultivován za třepání po dobu 48 hodin při 30 °C. Po stočení a oddělení buněk od kultivačního média byly bakteriální buňky přeneseny do zkumavky, byl přidán 1 ml 0,1 M fosfátového pufru (pH 7,0) a buňky v něm byly resuspendovány. Pak bylo přidán 1 mg hydrochloridu dl-2• · · · · · · • · · · · • · · ♦ · · • · · · · ·· · ··· ··«

- 50 methylamino-l-fenyl-l-propanonu a reakce byl ponechána probíhat po dobu 24 hodin za třepání ve 37 °C. Po reakci byl reakční roztok stočen, aby byly odstraněny bakteriální buňky a supernatant byl podroben HPLC, aby se získal opticky aktivní pseudoefedrin (kolona pBondapakphenyl od firmy Waters Corporation, průměr 4 mm, délka 300 mm, eluent - 0,05 M fosfátový pufr (obsahující 7% acetonitril), pH 5,0, průtoková rychlost 0,8 ml/min, a detekce v (JV o vlnové délce 220 nm.

Absolutní konfigurace a optická čistota byly měřeny pomocí HPLC (kolona Sumichiral AGP od firmy Sumika Chemical Analyses Service, průměr 4 mm, délka 150 mm, 0,03 M fosfátový pufr, pH 7,0, průtoková rychlost 0,5 ml/minuta, a detekce v UV při vlnové délce 220 nm) . Takto byl selektivně získán pouze d-pseudoefedrin, jak je ukázáno v tabulce 1 a 2.

Optická čistota a množství takto připravených dpseudoefedrinů jsou ukázány v tabulkách 1 a 2. Vytvořené množství je vždy uvedeno jako množství konvertovaného hydrochloridu.

- 51 Tabulka 1

Mikroorganizmus	Optické	aktivita	(%)		Vyrobené množství
rod	IFO	d-efedrin	1-efedrin	d-pseudo- efedrin	1-pseudo- efedrin	(mg/ml)
Microbacterium arborescens	3750	0	0	100	0	0,16
Klebsiella pneumoniae	3319	0	0	100	0	0,30
Aureobacteri um esteraromaticum	3751	0	0	100	0	0,14
Xanthomonas sp.	3084	0	0	100	0	0,049
Pseudomonas putida	14796	0	0	100	0	0,10
Mycobacterium smegmatis	IAM 12065	0	0	100	0	0,24
Mycobacterium diernhoferi	14797	0	0	100	0	0,25
Mycobacterium vaccae	14118	0	0	100	0	0,28
Mortierella isabellina	8308	0	0	100	0	0,15
Cylindrocarpon sclerotigenum	31855	0	0	100	0	0, 09
Sporádiobolus johnsonii	6903	0	0	100	0	0,07
Rhodococcus erythropolis	MAK-34	0	0	100	0	0,30

Tabulka 2

Mikroorganizmus	Produko- vané množství (mg/ml)	Optická čistota (%) d-pseudoefedrinu
rod	IFO
Nocardioides simplex	12069	0,35	99,0
Mycobacterium phlei	13160	0,27	95, 6
Mucor ambiguus	6742	0,07	93,0
Mucor javanicus	4570	0,04	95, 0
Mucor fragilis	6449	0,17	90,0
Absidia lichtheimi	4009	0,04	93, 0
Aspergillus awamori	4033	0,18	93,0
Aspergillus niger	4416	0, 11	90,0
Aspergillus oryzae	4177	0,18	91,0
Aspergillus candidus	5468	0,07	94,0
Aspergillus oryzae	IAM 2630	0,08	92,0
Aspergillus oryzae var. Oryzae	6215	0,05	95,0
Penicillium oxalicum	5748	0,06	94,0
Grifola frondosa	30522	0, 08	92,0
Eurotium repens	4884	0,08	92,0
Ganoderma lucidum	8346	0,05	92,2
Hypocrea gelatinosa	9165	0,27	92,2
Helicostylum nigricans	8091	0,27	93,2
Aspergillus foetidus var. acidus	4121	0,43	91, 9
Verticillium fungicola var. Fungicola	6624	0,10	92,7
Fusarium roseum	7189	0,40	89,6
Tritirachium oxyzae	7544	0,34	92,0
Armillariella mellea	31616	0,28	91,0
Sporobolomyces salmonicolor	1038	0,14	95,0
Sporobolomyces coralliformis	1032	0,2	95,0

- 53 Příklad 4

Mikroorganismus Morganella morganil IFO 3848 byl inokulován do média obsahujícího 1% glukózu, 0,5% pepton a 0,3% kvasinkový extrakt a dále kultivován v protřepávané aerobní kultuře po dobu 48 hodin ve 30 °C. Po té bylo 5 ml kultivačního roztoku stočeno, aby byly získány bakteriální buňky, buňky pak byly usušeny na vzduchu. Takto získané bakteriální buňky byly resuspendovány v 1 ml 0,05 M Tris-HCl pufru (pH 7,5). K této suspenzi usušených bakteriálních buněk bylo přidáno 50 mg glukózy, 0,2 mg glukózodehydrogenázy, 0,6 mg NADP, 0,6 mg NAD a 10 mg hydrochloridu dl-2methylamino-l-fenyl-l-propanonu a inkubovalo se za třepání v 300 ot./min. (rpm) při 28 °C. Reakce se nechala probíhat 48 hodin a množství produktu a optická aktivita pseudoefedrinu byly stanoveny pomocí HPLC podobně jako v příkladu 3.

Ukázalo se, že byl selektivně získán hydrochlorid d-pseudoefedrinu v množství 0,79 mg/ml se 100% optickou čistotou.

Příklad 5

Vliv přidání induktoru (1) l-amino-2-hydroxypropanon byl přidán k médiu 1 (viz tabulka 3) tak, aby bylo dosaženo koncentrace 5 g/1, a 5 ml výsledné směsi bylo přeneseno do zkumavky, uzavřeno silikonovou zátkou a sterilizováno v autoklávu při 121 °C po • · · · · •· · *·· · · ·

- 54 dobu 30 minut. Rhodococcus erythropolis MAK-34 byl inokulován do každého z médií a také do média bez přidaného induktoru, a pak byly pěstovány za třepání při 300 ot./min. (rpm) po dobu 48 hodin ve 30 °C. 0,5 ml kultury bylo centrifugováno 20 minut při 10000 g a z bakteriálních buněk získaných po odstranění supernatantu byla přidáním vody připravena uniformní suspenze.

K ní byla přidána voda, pufr a 10 mg hydrochloridu dl-2methylaminopropiofenonu do celkového objemu 1 ml, který byl přelit do zkumavky a třepán ve 30 °C při 150 ot./min. (rpm) po dobu 12 hodin, aby proběhla reakce. Po té byly buňky odstraněny centrifugací a supernatant byl analyzován na HPLC, aby bylo stanoveno množství vytvořeného pseudoefedrinu (kolona pBondapakphenyl od firmy Waters lne., průměr 4 mm, délka 300 mm, eluent - 0,05M fosfátový pufr obsahující 7% acetonitril, pH 6,5, průtoková rychlost 0,8 ml/min, detekce v UV o vlnové délce UV 220 nm).

Jak ukazují výsledky, produkovaná množství pseudoefedrinu při použití induktoru při kultivaci byla výrazně vyšší než při kultivaci bez přídavku induktoru, jak je ukázáno v tabulce 4.

Tabulka 3

Složení média 1	Složení média 2	Složení média 3	Složení média 4
Sacharóza 1% Kukuřičný výluh 0,5% Dihydrogenfosforečnan draselný 0,1% Hydrogenfosforečnan draselný 0,3% Kyselina p-aminobenzoová 0,01 % pH 7,0	Glukóza 0,1% Trypton 0,5% kvasinkový extrakt 0,5% Hydrogenfosforečnan draselný pH 7,0	Glukóza 0,1% Bactopepton 0,5% kvasinkový extrakt 0,3% pH 7,0	Rozpustný škrob 1% Glukóza 0,5% Nz amin typu A 0,3% Trypton 0,5% kvasinkový extrakt 0,2% Hydrogenfosforečnan draselný 0,1% Síran hořečnatý x 7H₂0 0,05%

- 55 Tabulka 4

	Mikroorganizmus	Číslo	Médium	Produkované množství bez přídavku	Produkované množství s přídavkem
(mg)	induktoru
(mg)
1	Rhodococcus erythropolis	MAK-34	1	0,0180	1,260
2	Mycobacterium chlorophenolicum	IFO- 15527	3	0,0320	0,770
3	Mycobacterium smegmatis	IFO- 12065	3	0,0480	0,210
4	Nocardioides simplex	IFO- 12069	2	0	0,190
5	Klebsiela pneumonie	IFO- 3319	2	0,0180	0,066
6	Absidia lichtheimi	IFO- 4409	4	0,0035	0,220
Ί	Aspergillus awamori	IFO- 4033	4	0,00048	1, 170
8	Aspergillus candidus	IFO- 5468	4	0,0092	0,018
9	Aspergillus candidus	IFO- 5337	4	0,0310	1,260
10	Hypocrea gelatinosa	IFO- 9165	4	0,0058	0, 640
11	Hel i cos tyl um nigricans	IFO- 8091	4	0,0067	0,520
12	Tritirachium oryzea	IFO- 7544	4	0,0047	0,078
13	Armilariealla mellea	IFO- 31616	4	0,0042	0,460

- 56 Příklad 6

Vliv přidání induktoru (2)

Kultivace a reakce byly prováděny stejně jako v příkladu 5 kromě toho, že byly použity mikroorganizmy a média uvedená v tabulce 4 místo mikroorganizmu z příkladu 5. Buňky byly získány z kultivační média centrifugací nebo filtraci (č. 3 a č. 6 až 13) . Výsledkem bylo, že produkce d-pseudoefedrinu v případě kultury s přidaným l-amino-2-hydroxypropanem byla významně větší než v případě kultury bez přidání induktoru, jak je ukázáno v tabulce 4.

Příklad 7

Vliv přidání induktoru 3

Kultury a reakce byly prováděny jak v příkladu 5 kromě toho, že l-amino-2-hydroxypropanon z příkladu 5 byl nahrazen l-amino-2-hydroxybutanem. Buňky byly získány z kultivační média centrifugací nebo filtraci. Výsledkem bylo, že produkce d-pseudoefedrinu v případě kultury s přidaným induktorem byla významně větší než v případě kultury bez přidání induktoru, jak je ukázáno v tabulce 5.

- 57 Tabulka 5

Číslo	Mikroorganizmus	Číslo	médium	Produkované množství bez přídavku (mg)	Produkované množství s přídavkem induktoru (mg)
(14)	Rhodococcus erythropolis	MAK- 34	1	0,0180	0, 65
(15)	Mycobacterium smegmatis	IAM- 12065	3	0,0480	0,17

Příklad 8

Vliv přidáni induktoru 4

Kultury a reakce byly prováděny jako v přikladu 5 kromě toho, že l-amino-2-hydroxypropanon z přikladu 5 byl nahrazen l-amino-2-hydroxycyklohexanem. Buňky byly odebrány centrifugaci nebo filtraci kultivačního média. Výsledkem bylo, že produkce d-pseudoefedrinu v případě kultury s přidaným induktorem byla významně větší než v případě kultury bez přidání induktoru, jak je ukázáno v tabulce 6.

Tabulka 6

Číslo	Mikroorganizmus	Číslo	Médium	Produkované množství bez přídavku (mg)	Produkované množství s přídavkem induktoru (mg)
(16)	Rhodococcus erythropolis	MAK- 39	1	0,0180	0,23
(17)	Mycobacterium smegmatis	IAM- 12065	3	0,0480	0,13

• •99

- 58 Příklad 9

Vliv přidání induktoru 5

Rhodococcus erythropolis MAK-34 byl inokulován do 5 ml média (pH 7,0) obsahujícího 1,0% sacharózu, 0,5% kukuřičný výluh, 0,1% hydrogenfosforečnan draselný, 0,3% dihydrogenfosforečnan draselný a 0,01% p-aminobenzovou kyselinu a 0,1 % některého z induktorů, a byl kultivován za třepání ve 30 °C po dobu 48 hodin. Bakteriální buňky byly získány centrifugací a ve zkumavce byly resuspendovány po přidání 1 ml 0,2 M fosfátového pufru. K suspenzi bylo přidáno 10 mg hydrochloridu dl-2-methylaminopropiofenonu a 20 mg glukózy a reakce byla ponechána probíhat za třepání ve 30 °C po dobu 16 hodin. Po reakci byl reakční roztok stočen, aby se odstranily buňky, a supernatant byl podroben HPLC (kolona pBondapakphenyl od firmy Waters Corporation, průměr 4 mm, délka 300 mm, eluent 0,05 fosfátový pufr (obsahující 7% ácetonitril), pH 6,5, průtoková rychlost 0,8 ml/min, detekce v UV o vlnové délce 220 nm) , čímž byl získán opticky aktivní pseudoefedrin. Produkce byla významně vyšší, když byl přidán induktor, jak ukazují výsledky shrnuté v tabulce 7.

- 59 Tabulka 7

Čilo	Název sloučeniny	Produkované množství (mg)
(18)	l-acetylamino-2-hydroxypropan	3, 00
(19)	l-methylamino-2-hydroxypropan	2,83
(20)	l-amino-2-oxopropan	1, 97
(21)	l-amino-2-hydroxycyklopentan	1, 93
(22)	l-amino-2,3-dihydroxypropan	1,55
(23)	1-threonin	1,12
(29)	9-amino-3-hydroxybutanová kyselina	0, 97
(25)	l-amino-2-oxocyklohexan	0,26
(26)	morfolin	0,11
(27)	3-hydroxypyrolidin	0,11
(28)	3-hdroxypiperidin	0,10
(29)	2-aminomethyltetrahydrofuran	0,10
(30)	1-(2-hydroxypropyl)amino-2-hydroxypropan	0, 05
(31)	l-t-butyloxykarbonylamino-2-hydroxypropan	0,05
(32)	2-amino-3-hydroxybutan	0,05
(33)	DL-serin	0,04
	nepřidán žádný	0,02

Průmyslová využitelnost vynálezu

Jak bylo vysvětleno v předcházejícím popisu reduktázy asymetrického aminoketonu, protein, nukleová kyselina a mikroorganizmus podle předkládaného vynálezu mohou poskytovat reduktázu asymetrického aminoketonu, která může produkovat, a to s vysokým výtěžek a vysokou selektivitou, β-aminoalkohol mající požadovanou optickou aktivitu z enantiomerní směsi

- 60 α-aminoketonové sloučeniny nebo její soli. Vynález také posytuje protein mající aktivitu reduktázy asymetrického aminoketonu, nukleovou kyselinu kódující protein, transformant transformovaný nukleovou kyselinou, způsob produkce proteinu s použitím transformant a použití transformant nebo proteinu. A dále, nový mikroorganizmus, který účinně konvertuje enantiomerní směs α-aminoketonové sloučeniny nebo její soli na opticky aktivní β-aminoalkohol.

• · » ·

Seznam sekvencí <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 259 <212> PRT <213> Rhodococcus erythropolis <400> 1

Met Phe Asn Ser IIe Glu Gly Arg Ser Val Val Val Thr Gly Gly Ser 15 10 15

Lys Qly IIe Qly Leu Gly Met Val Arg Val Phe Ala Arg Ala Qly Ala 20 25 30

Asn Val Leu Met Thr Ala Arg Asp Ala Leu Thr Leu Glu Arg Ala Ala 35 40 45

Glu Gly Leu Asn Gly Leu Pro Gly Ala Val Ser Thr • 50 55 60

Leu Gin Val Asp • · · ·· ·· ·· • · · · · ··· • » · · · ····

- 62 Val Thr Asn Pro Asp Ser Leu Ala Gly Met Ala Glu Val Ala Ala Glu 65 70 75 80

Arg His Gly Gly Ile Asp Val Leu Cys Ala Asn Ala Gly IIe Phe Pro 85 90 95

Ser Lys Arg Leu Gly Glu Met Thr Ser Glu Asp Met Asp Ser Val Phe 100 105 110

Gly Val Asn Val Lys Gly Thr Ile His Ala Val Gin Ala Cys Met Pro 115 120 125

Trp Leu Glu Thr Ser Gly Arg Gly Arg Val Val Val Thr Ser Ser Ile 130 135 140

Thr Gly Pro Val Thr Gly Tyr Pro Gly Trp Ser His Tyr Gly Ala Ser

145 150 155 160

Lys Ala Ala Gin Met Gly Phe IIe Arg Thr Ala Ala Ite Glu Leu Ala

165 170 175

Pro Lys Arg Ile Thr Ile Asn Ala Val Leu Pro Gly Asn Val Ile Thr 180 185 190

Glu Gly Leu Asp Gly Leu Gly Gin Glu Tyr Leu Asp Gin Met Ala Ser 195 200 205

Ser Val Pro Ala Gly Ser Leu Gly Ser Val Glu Asp Ile Ala Asn Ala 210 215 220

Ala Leu Phe Phe Ala Leu Asp Glu Ala Ala Tyr Ile Thr Gly Gin Ser

225 230 235 240

Leu Ile Val Asp Gly Gly Gin Val Leu Pro Glu Ser Ala Met Ala Leu

245 250 255

Gly .Glu Leu

- 63 <210> 2 <211> 780 <212> DNA <213> Rhodococcus erythropolis <400> 2 atgttcaact ccattgaagg tcgttcggtc gtcgtcaccg gcggtagcaa gggcatcggc ttgggaatgg tccgggtatt cgcgcgcgca ggggccaatg tgctcatgac cgcgcgagac gctctgactc tcgaacgtgc cgcggagggt ttgaatggtc ttcctggcgc ggtotccaca cttcaagtcg acgtcacgaa tcctgactcc ttggccggta tggcagaagt tgcggccgag cgacacggag gaatcgacgt gttgtgcgcg aacgotggga tcttcccgtc gaagcggttg ggagagatga cctcggagga catggacagc gtattcggcg tcaacgtcaa ggggaccatc oacgcčgtgc aagcgtgcat gccgtggctc gaaacttctg ggcgtggaag ggttgtcgtg acatcgtcga tcaccggacc cgtaaccggt tatccgggtt ggtcgcacta cggggcaagc aaggctgogc agatgggctt catccgaact gctgccattg agttggcacc gaagaggatc aogatcaacg ccgtcttgcc cggcaacgtg atcaccgagg-ggctcgacgg tttgggacag gaatatctcg accaaatggo gtccagcgtc ccggccggca gtctgggcag cgtcgaggat atcgccaatg ccgcactgtt ctttgcactg gacgaagccg cgtacatcac cggtcagtcg ttgatcgtag atggtggaca ggttcttccg gagtcggcga tggcgctcgg cgaactgtaa <210> 3 <211> 17 <212> PR7 <213> Rhodococcus erythropolis <400> 3

Met Phe Asn Ser tle Glu Gly Arg Ser Val Val Val Thr Gly Gly Ser 15 10 15

Lys <210> 4 <211> 19 <212> PR7 <213> Rhodococcus erythropolis

- 64 <400> 4

Arg Leu Gly Slu Met Thr Ser Glu Asp Met Asp Ser Val Phe Gly Val 15 10 15

Asn Val Lys <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Rhodococcus erythropolis <400 5

Ala Ala Gin Met Gly Phe lle Arg Thr Ala Ala lle Glu Leu Ala Pro 15 10 15

Lys <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Rhodococcus erythropolis <400 6

Xaa Xaa ile Leu Ala Val Gin Ala Met Met Pra Xaa Leu 1 5 10 <210> 7 <211> 28 <212> PRT <213> Rhodococcus erythropolis

- 65 <400> 7

Xaa IIe Thr IIe Asn Ala Val Leu Pro Gly Asn Val lle Thr Glu Gly 15 10 15

Leu Asp Gly Leu Gly Gin Glu Tyr Leu Asp Gin Met 20 25 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: Syntetický polynukleotid, degenerovaný primer <400> 8 atgttyaayw snathgargg nmg ²³ <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: Syntetický polynukleotid, degenerovaný primer <400> 9 catytgrtcn arrtaytoyt gnccna 26 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: Syntetický polynukleotid <400> 10 aatacccgga ccattcccaa gccgat <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence:Syntetický polynukleotid <400> 11 togaaaottc tgggcgtgga agggtt 26 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence:Syntetický polynukleotid <400> 12 gatgaattcc aaatgttcaa ctecattga 29 <210> 13 <211> 29 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence:Syntetický polynukleotid <400> 13 tgaagotttc gtcgcttgtc ttaoagttc

-ZJÝJ

Claims

PATENTOVÉ

NÁROKY

1. Protein, který je reduktáza asymetrického aminoketonu, a který produkuje d-pseudoefedrin tím, že působí na 1-2-methylaminopropiofenon, a má následující fyzikálně chemické vlastnosti:

substrát: 1-2-methylaminopropiofenon optimální pH: pH 8,1 optimální teplota: 55 °C koenzym: NADP molekulová hmotnost: asi 28500 Da pro homotetramer.
2. Protein obsahující aminokyselinovou sekvenci, která je zde uvedena v seznamu sekvencí jako SEKV. ID. Č. 1.
3. Protein odvozený z proteinu obsahujícího aminokyselinovou sekvenci uvedenou jako SEKV. ID. Č. 1, obsahující delece, inzerce, substituce nebo adice jedné nebo více aminokyselin, mající aktivitu reduktázy asymetrického aminoketonu, nebo jeho parciální peptid.
4. Sůl proteinu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 nebo sůl parciálního peptidu tohoto proteinu.
5. Nukleová kyselina kódující protein obsahující aminokyselinovou sekvence uvedenou v seznamu sekvencí jako SEKV. ID. Č. 1.
6. Nukleová kyselina obsahující nukleotidovou sekvenci uvedenou v seznamu sekvencí jako SEKV. ID. Č. 2.
7. Nukleová kyselina, která hybridizuje za stringentních podmínek s nukleovou kyselinou podle nároku 5, a kóduje protein mající aktivitu reduktázy asymetrického aminoketonu.
8. Nukleová kyselina obsahující část nukleotidové sekvence uvedené jako SEKV. ID. Č. 2.
9. Vektor obsahující nukleovou kyselinu podle kteréhokoliv z nároků 5 až 8.
10. Transformant obsahující vektor podle nároku 9.
11. Protein získaný exprimováním v transformantu podle nároku 10 nebo jeho parciální peptid.
12. Způsob výroby reduktázy asymetrického aminoketonu nebo jejího parciálního peptidu vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:

kultivace transformant podle nároku 10 v médiu, ve kterém se transformanty mohou množit, a purifikace reduktázy asymetrického aminoketonu nebo jejího parciálního peptidu z transformant získaných v kroku kultivace.

• · · ··· ·· «·
13. Způsob výroby reduktázy asymetrického aminoketonu nebo jejího parciálního peptidu vyznačující se tím, že zahrnuje krok kultivace alespoň jednoho mikroorganizmu vybraného ze skupiny obsahující mikroorganizmy patřící k rodu Morganella, Microbacterium, Sphingobacterium, Nocardioides, Mucor, Absidia, Aspergillus , Penicillium, Grifola, Eurotium, Ganoderma, Hypocrea, Hel i costylům, Verticillium, Fusarium, Tritirachium, Mortierella, Armillariella, Cylindrocarpon, Klebsiella, Aureobacterium, Xanthomonas, Pseudomonas, Mycobacterium, Sporobolomyces, Sporidiobolus a Rhodococcus, přičemž mikroorganizmus je schopen redukovat 1-2methylaminopropiofenon za vzniku d-pseudoefedrinu, a a krok purifikace proteinu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 nebo jeho parciálního peptidu z mikroorganizmu získaného v kroku kultivace.
14. Mikroorganizmus patřící k rodu Rhodococcus, který je schopen redukovat 1-2-methylaminopropiofenon a tak tvořit d-pseudoefedrin.
15. Mikroorganizmus podle nároku 14, kde mikroorganismus je Rhodococcus erythropolis kmen MAK-34 (FERM BP-7451).
16. Způsob výroby opticky aktivního aminoalkoholu vyznačující se tím, že zahrnuje krok, kdy se působí proteinem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, jeho parciálním peptidem nebo solí na enantiomerní směs a-aminoketonové sloučeniny reprezentované obecným vzorcem (1):

kde

X mohou být shodné nebo odlišné, přičemž X představuje alespoň jeden člen vybraný ze skupiny, kterou tvoří atom halogenu, nižší alkylová skupina, hydroxylová skupina volitelně chráněná chránící skupinou, nitroskupina a sulfonylová skupina, n představuje celé číslo 0 až 3, R¹ je nižší alkylová skupina, R²a R³ mohou být shodné nebo odlišné a představují alespoň jeden člen vybraný ze skupiny, kterou tvoří atom vodíku a nižší alkylová skupina, a označuje asymetrický atom uhlíku, nebo jeho soli, takže vzniká opticky aktivní β-aminoalkoholová sloučenina reprezentovaná obecným vzorcem (2):

OH kde X, n, R¹, R², R³ a jsou shodné s tím, jak byly definovány výše, přičemž výsledná sloučenina má požadovanou optickou aktivitu.
17. Způsob výroby opticky aktivního aminoalkoholu vyznačující se tím, že zahrnuje krok, kdy se působí mikroorganizmem, který je vybraný ze skupiny, kterou tvoří transformant podle nároku 10, mikroorganizmus podle nároku 14 a mikroorganizmus podle nároku 15, na enantiomerní směs • · · · α-aminoketonu reprezentovaného obecným vzorcem (1):

kde X mohou být shodné nebo odlišné, přičemž X představuje alespoň jeden člen vybraný ze skupiny, kterou tvoří atom halogenu, nižší alkylová skupina, hydroxylová skupina volitelně chráněná chránící skupinou, nitroskupina a sulfonylová skupina, n představuje celé číslo 0 až 3, R¹ je nižší alkylová skupina, R² a R³ mohou být shodné nebo odlišné, a představují alespoň jeden člen vybraný ze skupiny, kterou tvoří atom vodíku a nižší alkylová skupina, a označuje asymetrický atom uhlíku, nebo jeho soli, za vzniku opticky aktivní β-aminoalkoholové sloučeniny reprezentované obecným vzorcem (2):

definovány výše, optickou aktivitu.

přičemž jsou shodné s tím, jak byly výsledná sloučenina má požadovanou
18. Způsob výroby opticky aktivního aminoalkoholu podle nároku 17 vyznačující se tím, že se dále přidá sloučenina reprezentovaná obecným vzorcem (3)

R¹⁰ ’·* ( 3 ) kde Ά reprezentuje strukturální vzorec (Y) nebo (Z)

O kde R⁴ je atom vodíku, alkylová skupina obsahující 1 až 3 atomy uhlíku volitelně mající substituent, uhlovodíkový kruh obsahující 5 až 10 atomů uhlíku svázaný s R⁸ nebo heterocyklická kostra 5 až 8-členného kruhu zahrnující 1 až 3 heteroatomy svázaná s R⁸,

R°

O ;c (Z)

R⁷ kde R5 je atom vodíku, alkylová skupina obsahující 1 až 3 atomy uhlíku nebo heterocyklická kostra 5 až 8-členného kruhu zahrnující 1 až 3 heteroatomy svázaný s R⁶ nebo R⁹, R⁶ je atom vodíku, alkylová skupina obsahující 1 až 3 atomy uhlíku volitelně mající substituent, uhlovodíkový kruh obsahující 5 až 10 atomů uhlíku svázaný s Rg nebo heterocyklická kostra 5až 8-členného kruhu zahrnující 1 až 3 heteroatomy svázaná s R⁵nebo R⁹, a R⁷ je atom vodíku nebo alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomům uhlíku volitelně mající substituent, R⁸ je atom vodíku, karboxylová skupina, alkylová skupina obsahující 1 až

6 atomů uhlíku volitelně mající substituent, heterocyklická kostra 5- až 8-členného kruhu zahrnující 1 až 3 heteroatomy svázaná s R⁴ nebo uhlovodíkový kruh z 5 až 10 atomů uhlíku svázaný s R⁶, R⁹ je atom vodíku, alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku volitelně mající substituent, acylová skupina volitelně mající substituent nebo heterocyklická kostra 5- až 8-členného kruh zahrnující 1 až 3 heteroatomy svázaná s R⁵ nebo R⁶, a R¹⁰ je atom vodíku nebo volitelně substituovaná alkylová skupina obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, nebo její farmaceuticky přijatelná sůl nebo solvát, aby byl produkován opticky aktivní aminoalkohol.