CZ2003253A3 - Umělé cévní štěpy a způsoby jejich výroby a použití - Google Patents
Umělé cévní štěpy a způsoby jejich výroby a použití Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2003253A3 CZ2003253A3 CZ2003253A CZ2003253A CZ2003253A3 CZ 2003253 A3 CZ2003253 A3 CZ 2003253A3 CZ 2003253 A CZ2003253 A CZ 2003253A CZ 2003253 A CZ2003253 A CZ 2003253A CZ 2003253 A3 CZ2003253 A3 CZ 2003253A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- cells
- smooth muscle
- endothelial
- nucleic acid
- express
- Prior art date
Links
- 230000002792 vascular Effects 0.000 title claims abstract description 114
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 89
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 5
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 claims abstract description 272
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 235
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 137
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims abstract description 49
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 claims abstract description 48
- 101001060252 Homo sapiens Fibulin-5 Proteins 0.000 claims description 132
- 102100028065 Fibulin-5 Human genes 0.000 claims description 131
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 127
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims description 69
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 claims description 68
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 64
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 64
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 64
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 claims description 62
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 55
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 55
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 55
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims description 45
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 claims description 35
- 229920001343 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 claims description 19
- 239000004810 polytetrafluoroethylene Substances 0.000 claims description 19
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 19
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 19
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 18
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 18
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 17
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 17
- 229920000295 expanded polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 claims description 16
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 claims description 15
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 claims description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 14
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 claims description 14
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 13
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 12
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 12
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 claims description 11
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims description 9
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims description 9
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 9
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 9
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims description 9
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 9
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 7
- 210000002358 circulating endothelial cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims description 6
- -1 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 claims description 6
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims description 5
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 claims description 5
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 claims description 5
- 101710170766 Fibulin-5 Proteins 0.000 claims description 5
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 claims description 5
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 5
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 5
- 102100035140 Vitronectin Human genes 0.000 claims description 5
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 claims description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 5
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 229920004934 Dacron® Polymers 0.000 claims description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims description 3
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 claims description 3
- 239000005020 polyethylene terephthalate Substances 0.000 claims description 3
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 claims description 3
- 239000002356 single layer Substances 0.000 claims description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract description 5
- 101710187783 Adherence factor Proteins 0.000 abstract 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 185
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 72
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 67
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 64
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 63
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 48
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 47
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 38
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 32
- 239000000463 material Substances 0.000 description 28
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 21
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 20
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 19
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 18
- 210000005167 vascular cell Anatomy 0.000 description 18
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 16
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 16
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 15
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 13
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 13
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 12
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 11
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 11
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 11
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 11
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 11
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 11
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 10
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 10
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 10
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 10
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 10
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 10
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 9
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 9
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 9
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 9
- 241000894007 species Species 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 8
- 210000001105 femoral artery Anatomy 0.000 description 8
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 8
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 8
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 8
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 7
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 7
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 7
- 239000010802 sludge Substances 0.000 description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 7
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 6
- 108091033411 PCA3 Proteins 0.000 description 6
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 6
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 6
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 6
- 206010001258 Adenoviral infections Diseases 0.000 description 5
- 101000808011 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor A Proteins 0.000 description 5
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 5
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 5
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 5
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 5
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 5
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 5
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 5
- 102000058223 human VEGFA Human genes 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 5
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 5
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 4
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 4
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 4
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 4
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 4
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 4
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 4
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 description 4
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 3
- 102100027211 Albumin Human genes 0.000 description 3
- IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Asp Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 3
- 101100298295 Drosophila melanogaster flfl gene Proteins 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 102100021242 Dymeclin Human genes 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 3
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 3
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 3
- 101000817629 Homo sapiens Dymeclin Proteins 0.000 description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 3
- 102100033571 Tissue-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 3
- 108050006955 Tissue-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 3
- 239000000512 collagen gel Substances 0.000 description 3
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 3
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 3
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 3
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000013425 morphometry Methods 0.000 description 3
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 3
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 3
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 3
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 3
- 230000002537 thrombolytic effect Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- 102000005701 Calcium-Binding Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010045403 Calcium-Binding Proteins Proteins 0.000 description 2
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- 101150029662 E1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 2
- 241000713813 Gibbon ape leukemia virus Species 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 2
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 2
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000009484 Vascular Endothelial Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 2
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 2
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 2
- 230000006727 cell loss Effects 0.000 description 2
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 2
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 2
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 2
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 2
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 2
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- 238000013115 immunohistochemical detection Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 230000033458 reproduction Effects 0.000 description 2
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 2
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 2
- 208000014173 thrombophilia due to thrombin defect Diseases 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 2
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 description 2
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(tritiooxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO[3H])O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C)=C1 IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 0.000 description 1
- QRBLKGHRWFGINE-UGWAGOLRSA-N 2-[2-[2-[[2-[[4-[[2-[[6-amino-2-[3-amino-1-[(2,3-diamino-3-oxopropyl)amino]-3-oxopropyl]-5-methylpyrimidine-4-carbonyl]amino]-3-[(2r,3s,4s,5s,6s)-3-[(2s,3r,4r,5s)-4-carbamoyl-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)- Chemical compound N=1C(C=2SC=C(N=2)C(N)=O)CSC=1CCNC(=O)C(C(C)=O)NC(=O)C(C)C(O)C(C)NC(=O)C(C(O[C@H]1[C@@]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)(C)O[C@H]1[C@@H]([C@](O)([C@@H](O)C(CO)O1)C(N)=O)O)C=1NC=NC=1)NC(=O)C1=NC(C(CC(N)=O)NCC(N)C(N)=O)=NC(N)=C1C QRBLKGHRWFGINE-UGWAGOLRSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- LHEJDBBHZGISGW-UHFFFAOYSA-N 5-fluoro-3-(3-oxo-1h-2-benzofuran-1-yl)-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1C(F)=CNC(=O)N1C1C2=CC=CC=C2C(=O)O1 LHEJDBBHZGISGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 208000010370 Adenoviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010060931 Adenovirus infection Diseases 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N Aspirin Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(O)=O BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000017166 Bambusa arundinacea Nutrition 0.000 description 1
- 235000017491 Bambusa tulda Nutrition 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 102000012545 EGF-like domains Human genes 0.000 description 1
- 108050002150 EGF-like domains Proteins 0.000 description 1
- 108010041308 Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 101100118545 Holotrichia diomphalia EGF-like gene Proteins 0.000 description 1
- 101100268553 Homo sapiens APP gene Proteins 0.000 description 1
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010001831 LDL receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- 102100024640 Low-density lipoprotein receptor Human genes 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- LTQCLFMNABRKSH-UHFFFAOYSA-N Phleomycin Natural products N=1C(C=2SC=C(N=2)C(N)=O)CSC=1CCNC(=O)C(C(O)C)NC(=O)C(C)C(O)C(C)NC(=O)C(C(OC1C(C(O)C(O)C(CO)O1)OC1C(C(OC(N)=O)C(O)C(CO)O1)O)C=1NC=NC=1)NC(=O)C1=NC(C(CC(N)=O)NCC(N)C(N)=O)=NC(N)=C1C LTQCLFMNABRKSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010035235 Phleomycins Proteins 0.000 description 1
- 244000082204 Phyllostachys viridis Species 0.000 description 1
- 235000015334 Phyllostachys viridis Nutrition 0.000 description 1
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 206010046996 Varicose vein Diseases 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 229960001138 acetylsalicylic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 208000011589 adenoviridae infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 230000003872 anastomosis Effects 0.000 description 1
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002583 angiography Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 description 1
- 108010072041 arginyl-glycyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000011425 bamboo Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 229930189065 blasticidin Natural products 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 210000001715 carotid artery Anatomy 0.000 description 1
- 108010015046 cell aggregation factors Proteins 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 230000036978 cell physiology Effects 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- HGAZMNJKRQFZKS-UHFFFAOYSA-N chloroethene;ethenyl acetate Chemical compound ClC=C.CC(=O)OC=C HGAZMNJKRQFZKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 230000002301 combined effect Effects 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000942 confocal micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012303 cytoplasmic staining Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- AAOVKJBEBIDNHE-UHFFFAOYSA-N diazepam Chemical compound N=1CC(=O)N(C)C2=CC=C(Cl)C=C2C=1C1=CC=CC=C1 AAOVKJBEBIDNHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003529 diazepam Drugs 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 229960001123 epoprostenol Drugs 0.000 description 1
- KAQKFAOMNZTLHT-VVUHWYTRSA-N epoprostenol Chemical compound O1C(=CCCCC(O)=O)C[C@@H]2[C@@H](/C=C/[C@@H](O)CCCCC)[C@H](O)C[C@@H]21 KAQKFAOMNZTLHT-VVUHWYTRSA-N 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007491 morphometric analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003562 morphometric effect Effects 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 238000002559 palpation Methods 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002511 phenobarbital sodium Drugs 0.000 description 1
- WRLGYAWRGXKSKG-UHFFFAOYSA-M phenobarbital sodium Chemical compound [Na+].C=1C=CC=CC=1C1(CC)C(=O)NC([O-])=NC1=O WRLGYAWRGXKSKG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000012514 protein characterization Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000002106 pulse oximetry Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000026267 regulation of growth Effects 0.000 description 1
- 239000012779 reinforcing material Substances 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 230000000250 revascularization Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012250 transgenic expression Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 210000000685 uterine artery Anatomy 0.000 description 1
- 208000027185 varicose disease Diseases 0.000 description 1
- 230000006459 vascular development Effects 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002861 ventricular Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
- A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
- A61L27/383—Nerve cells, e.g. dendritic cells, Schwann cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
- A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
- A61L27/3808—Endothelial cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
- A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
- A61L27/3826—Muscle cells, e.g. smooth muscle cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
- A61L27/507—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials for artificial blood vessels
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
- A61F2/00—Filters implantable into blood vessels; Prostheses, i.e. artificial substitutes or replacements for parts of the body; Appliances for connecting them with the body; Devices providing patency to, or preventing collapsing of, tubular structures of the body, e.g. stents
- A61F2/02—Prostheses implantable into the body
- A61F2/04—Hollow or tubular parts of organs, e.g. bladders, tracheae, bronchi or bile ducts
- A61F2/06—Blood vessels
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2799/00—Uses of viruses
- C12N2799/02—Uses of viruses as vector
- C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
- C12N2799/022—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from an adenovirus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Zoology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Botany (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Prostheses (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Description
Oblast techniky
Tento vynález se vztahuje k umělým cévním štěpům. Přesněji se tento vynález vztahuje ke geneticky přeměněným buňkám a způsobům vytváření takových buněk, které jsou vhodné při vytváření zdokonalených umělých cévních štěpů. Tento vynález se dále vztahuje ke způsobům použití umělých cévních štěpů k léčbě cévních chorob.
Dosavadní stav techniky
Cévní choroby:
Cévní choroby jsou hlavní příčinou nemocnosti a úmrtnosti v rozvinutém světě a tudíž ovlivňují velkou část obyvatelstva. Operace pomocí bypassu, využívající žilní, tepenné nebo syntetické trubkové štěpy, je často používána k zmírnění klinických následků těchto chorob tak, že umožní nebo obnoví krevní tok kolem zablokované nebo poškozené krevní cévy. Odhaduje se, že v rozvinutých zemích je provedeno takových zákroků přes jeden milion ročně, a že 30 až 50 % těchto zákroků za 5 až 7 let selže (1 až 4).
Tepenné štěpy:
Tepenné štěpy mají ve srovnání s žilními a syntetickými štěpy dlouhodobě větší míru trvanlivosti (5). Nicméně tepenné štěpy mohou být použity pouze za omezených klinických okolností, jako je, například, aorto-koronámí operace pomocí bypassu. Stále roste požadavek na syntetické štěpy s biologicko-kompatibilním povrchem dlouhé trvanlivosti, které mohou být používány po dosti dlouhá časová období. Potřeba štěpů s malým vnitřním průměrem je zvláště velká u poškození pod stehenní tepnou a u nemocných, kteří mají vrozené slabé cévy, například s křečovými žilami nebo po dřívější operaci pomocí bypassu (2,3). Pro syntetické štěpy získalo popularitu použití polytetrafluorethylenu (PTFE) a dalších materiálů díky bio-kompatibilitě materiálu samotného a díky své trvanlivosti. Modifikace byly popsány v mnoha studiích živočichů a v několika studiích humánních (5 až 10).
Aby se zlepšila funkce a trvanlivost syntetických štěpů, jsou na štěpy před implantací vysévány autologní endoteliální buňky (EC). Endoteliální buňky poskytují nejlepší bio-kompatibilní povrch a mnohé poskytují dlouhotrvající ochranu před trombózou díky své trombolytické kapacitě (11, 12). Navíc může pokrytí EC zabránit neointimální proliferaci a zánětlivé reakci ve štěpu (13). Dodnes, ovšem, nahodilé rozsáhlé studie neprokázaly, že může vysévání EC zlepšit trvanlivost štěpů (8 až 10).
Endoteliální buňky, které jsou vysévány na štěpy před implantací, jsou typicky získávány z krátkých žilních úseků nebo z tukové tkáně. Dalšími zdroji mohou být buňky transgenetických živočichů, které mají lidské vlastnosti nebo autologní EC dotyčného nemocného. Dalším možným zdrojem EC jsou progenitorové buňky izolované z periferní krve nebo z kostní dřeně.
Aby se účinnost umělých cévních štěpů využívaných při léčbě lidských cévních chorob zlepšila, je usilováno o nové postupy na poli návrhu a přípravy umělého štěpu. Dokonalá tvorba endotelu na luminálním povrchu umělého cévního Štěpu je nesmírně protahována a má hlavní dopad na průchodnost štěpu. Proto je hlavním úkolem zlepšit jak pokrytí štěpu, tak buněčnou adhezi k základní hmotě štěpu. Předchozí pokusy, v nichž byly EC vysety na syntetické štěpy, končily neúplnou tvorbou endotelu, stejně jako buněčným odlučováním při vystavení podmínkám krevního toku.
Jedním z nejnovějších postupů zlepšování tvorby endotelu na štěpu je jeho potažení geneticky přeměněnými buňkami, které mají lepší schopnost prollferace (viz, například, US patent č. 5 785 965).
Aby bylo urychleno diferencování progenitorových buněk kostní dřeně a byl poskytnut rychlý a spolehlivý způsob vytváření EC použitelných pň přípravě umělých štěpů, jsou takové buňky typicky přetvářeny cévním endoteliálním růstovým faktorem (VEGF), vektorem exprese, který, pokud je exprimován v buňce, může zlepšit účinnost izolace a růstu EC. Použití specifických EC mitogenů, například VEGF, může tudíž zkrátit časové období od získávání buněk po vysévání, a tak také dovolí použití nižších počátečních hustot vysévání na štěpy, protože rychlá proliferace navozená VEGF povede k rychlejšímu pokrytí štěpu.
Endoteliální buněčná proliferace a migrace jsou navozeny aktivací VEGF receptorů (16). Ačkoliv byly identifikovány a charakterizovány tři VEGF receptory, je to receptor KDR, který hraje klíčovou roli v angiogenní změně, která je tvořena proliferaci a migrací (16, 17).
VEGF nabízí nesporné výhody oproti jiným méně EC-specifickým růstovým faktorům, které mohou zlepšit tvorbu endotelu na štěpu, protože snižuje dopad na další cévní buňky, zvláště na buňky hladkého svalstva (SMC), a jako takový snižuje možnost • · · · · · • · « · · · nepříznivých stimulačních vlivů. VEGF uvolněný z geneticky upravených buněk vysetých na umělý štěp tedy bude z míst anastomózy rekrutovat EC, ale ne SMC.
Ačkoliv jsou geneticky transfektované EC po expresi VEGF, jsou-li srovnávány s nepřeměněnými EC, schopné urychleného růstu, jsou umělé cévní štěpy zahrnující takové přeměněné buňky funkčně omezeny, neboť přeměněné buňky pokrývající luminální povrch štěpu nejsou schopny po implantaci vydržet silový tok.
UP50 je nový protein, o němž se zjistilo, že pokud je použít k pokrytí povrchu, například umělé tkáňové kultury, zvyšuje mimoto schopnost adheze EC (51). Tento protein obsahuje šest vápník vázajících EGF podobných domén, z nichž jedna zahrnuje Arg-Gly-Asp (RGD) motiv. Je známo, že je tento motiv zahrnut ve specifické vazbě integrinů, například těch, které jsou exprimovány na EC, a tak je zapojen do zprostředkovávání adheze EC k buněčné matrix a k dalším buňkám (52). Například je známo, že syntetické peptidy obsahující tuto RGD řadu působí proti vazbě integrinů, a tím potlačují takové procesy, jako je angiogeneze nebo trombóza (53).
Motiv podobný epidermálnímu růstovému faktoru (EGF) je zjištěn v proteinech vně buněčné základní hmoty (ECM) cévní stěny (54) a je zahrnut s vazebným vápníkem v několika ECM proteinech přítomných v cévních stěnách (55). Tento motiv je také přítomný v regulátorech koagulace krve, v receptoru lipoproteinů s malou hustotou, v TGF-p-vazebném proteinu a v Notch a jeho ligandech, které se účastní buněčné diferenciace (56).
Ukázalo se, že embryonálnímu cévnímu EGF-podobná opakování obsahující protein (EVEC), krysí homolog lidské UP50, je exprimován během embryonální angiogeneze. Exprese tohoto proteinu během embryogeneze byla prokázána převážně v tepenných cévách, zejména v cévní SMC vyvíjených tepen. Ukázalo se, že u dospělých myší byla exprese tohoto proteinu regulována sestupně s výjimkou tepen dělohy. V modelu bublinou poškozené krysy byla exprese karotické tepny EVEC regulována vzhůru (57). Tyto objevy naznačují možnou úlohu UP50 v interakcích ECSMC, dozrávání ECM a regulaci růstu. UP50 je tedy nová adhezní molekula, která může být použita jako cévní ligand zprostředkovávající adhezi EC přes jejich integrinové receptory a může také podnítit cévní rozvoj a přestavbu. Ovšem, ještě nebylo usilováno o strategii genetické úpravy EC, aby exprimovaly faktory adheze, schopné podpory tvorby endotelu umělých cévních štěpů. Je to tedy obecně uznávaným požadavkem a bylo by velmi prospěšné mít umělý cévní štěp schopný po • · ··· ·
Δ ·«· · · · · · · · · ·· · ·· · » ·· · · implantaci podpořit krevní tok a přesto nemající výše zmíněná omezení štěpů dřívější techniky.
Podstata vynálezu
Podle jednoho hlediska tohoto vynálezu je poskytnut umělý cévní štěp obsahující umělý trubicový prvek, který má luminální povrch potažený velkým množstvím endoteliálních buněk a/nebo buněk hladkého svalstva geneticky přeměněných tak, aby exprimovaly alespoň jeden růstový faktor proliferující buňky a alespoň jeden faktor buněčné adheze.
Podle dalšího hlediska tohoto vynálezu je poskytnut způsob nahrazení nebo obejití alespoň části cévního systému jedince, způsob zahrnující implantování umělého cévního štěpu do cévního systému jedince, aby bylo vytvořeno plynulé spojení mezi cévním systémem a umělým cévním štěpem, umělý cévní štěp zahrnující syntetický trubicový prvek, který má luminální povrch potažený velkým množstvím endoteliálních buněk a/nebo buněk hladkého svalstva geneticky přeměněných tak, aby exprimovaly alespoň jeden růstový faktor proliferující buňky a alespoň jeden faktor buněčné adheze.
Podle ještě dalšího hlediska tohoto vynálezu je poskytnut způsob výroby umělého cévního štěpu, způsob zahrnující: (a) genetické přeměňování endoteliálních buněk a/nebo buněk hladkého svalstva, aby exprimovaly alespoň jeden růstový faktor proliferující buňky a alespoň jeden faktor buněčné adheze; a (b) vysévání a pěstování endoteliálních buněk a/nebo buněk hladkého svalstva v umělém trubicovém prvku, který má luminální povrch, dokud není dosaženo dostatečného pokrytí luminálního povrchu.
Podle dalších znaků ve vhodných včleněních níže popsaného vynálezu je první část velkého množství endoteliálních buněk a/nebo buněk hladkého svalstva geneticky přeměněna tak, aby exprimovala alespoň jeden růstový faktor proliferující buňky a dále, kde je druhá část velkého množství endoteliálních buněk a/nebo buněk hladkého svalstva geneticky přeměněna tak, aby exprimovala alespoň jeden faktor buněčné adheze.
Podle ještě dalších znaků v popsaných vhodných včleněních je luminální povrch z látky vybrané ze skupiny skládající se z polytetrafluorethylenu (PTFE), expandovaného polytetrafluorethylenu (ePTFE), polyesterových vláken, Dacronu™, sterilizovaných živočišných krevních cév nebo jakéhokoliv umělého výztužného materiálu používaného při zhotovování štěpů.
Podle ještě dalších znaků v popsaných vhodných včleněních je umělý trubicový prvek z vnitřní oblasti příčného řezu, která je v podstatě rovnocenná vnitrní oblasti příčného řezu krevní cévy.
Podle ještě dalších znaků v popsaných vhodných včleněních je vnitřní oblast příčného řezu umělého trubicového prvku v rozsahu asi 7 až 700 mm2
Podle ještě dalších znaků v popsaných vhodných včleněních je velké množství endoteliálních buněk odvozeno ze zdroje vybraného ze skupiny skládající se z části žíly, kostní dřeně, periferních krevních progenitorových buněk a obíhajících endoteliálních buněk.
Podle ještě dalších znaků v popsaných vhodných včleněních je velké množství buněk hladkého svalstva odvozeno ze zdroje vybraného ze skupiny skládající se z lidských povrchových žil z nohy a zbylých vnitřních tepen savců, kostní dřeně a periferních krevních progenitorových buněk.
Podle ještě dalších znaků v popsaných vhodných včleněních je velké množství endoteliálních buněk a/nebo buněk hladkého svalstva odvozeno od příjemce umělého cévního štěpu.
Podle ještě dalších znaků v popsaných vhodných včleněních je velké množství endoteliálních buněk a/nebo buněk hladkého svalstva odvozeno od zárodečných nebo zralých tkání lidského nebo živočišného dárce.
Podle ještě dalších znaků v popsaných vhodných včleněních velké množství endoteliálních buněk tvoří splývavou jednoduchou vrstvu při vnitřním luminálním povrchu.
Podle ještě dalších znaků v popsaných vhodných včleněních je alespoň jeden růstový faktor proliferující buňky vybrán ze skupiny skládající se z VEGF, zásaditého nebo kyselého FGF, HGF a jakéhokoliv dalšího endoteliálního růstového faktoru.
Podle ještě dalších znaků v popsaných vhodných včleněních je alespoň jeden faktor buněčné adheze DANCE, UP50, vitronektin, albumin, kolagen I, kolagen IV, fibronektin a Laminin nebo jakákoliv další molekula schopná podporovat buněčnou adhezi k materiálu štěpu.
Podle ještě dalších znaků v popsaných vhodných včleněních je velké množství endoteliálních buněk a/nebo buněk hladkého svalstva dále geneticky přeměněno, aby exprimovalo alespoň jeden markerový polypeptid.
Podle ještě dalšího hlediska tohoto vynálezu je poskytnut konstrukční systém exprimované kyseliny nukleové obsahující: (a) první konstrukci exprimované kyseliny • * · · · · • ·
nukleové zahrnující první část polynukleotidu kódující růstový faktor proliferující buňky; a (b) druhou konstrukci exprimované kyseliny nukleové zahrnující druhou část polynukleotidu kódující faktor buněčné adheze.
Podle ještě dalších znaků v popsaných vhodných včleněních první a druhé konstrukce exprimované kyseliny nukleové déle zahrnují alespoň jeden další segment polynukleotidu kódující markerový polypeptid.
Podle ještě dalšího hlediska tohoto vynálezu je poskytnuta souprava obsahující místo pro napojení alespoň jedné trubičky, tato alespoň jedna trubička zahrnující systém konstrukcí exprimované kyseliny nukleové, systém konstrukce exprimované kyseliny nukleové zahrnující: (a) první konstrukci exprimované kyseliny nukleové zahrnující první polynukleotid kódující růstový faktor proliferující buňky; a (b) druhou konstrukci exprimované kyseliny nukleové zahrnující druhý polynukleotid kódující faktor buněčné adheze.
Podle ještě dalšího hlediska tohoto vynálezu je poskytnuta soustava obsahující místo pro napojení alespoň jedné trubičky, tato alespoň jedna trubička zahrnující konstrukci exprimované kyseliny nukleové, konstrukce exprimované kyseliny nukleové zahrnující: (a) první polynukleotid kódující růstový faktor proliferující buňky; a (b) druhý polynukleotid kódující faktor buněčné adheze.
Podle ještě dalšího hlediska tohoto vynálezu je poskytnut způsob vytvářející geneticky přeměněné endoteliální buňky a/nebo buňky hladkého svalstva, způsob obsahující: (a) získávání endoteliálních buněk a/nebo buněk hladkého svalstva ze zdroje savčí tkáně; a (b) přeměňování endoteliálních buněk, aby byl současně nebo zvlášť exprimován alespoň jeden růstový faktor proliferující buňky a alespoň jeden faktor buněčné adheze.
Podle ještě dalších znaků v popsaných vhodných včleněních konstrukce exprimované kyseliny nukleové dále obsahuje alespoň jednu sekvenci promotoru, která je pro řízení exprese alespoň jednoho z prvního a druhého segmentu polynukleotidu.
Podle ještě dalších znaků v popsaných vhodných včleněních je první segment polynukleotidu transkripčně připojen k druhému segmentu polynukleotidu, přičemž první a druhé segmenty polynukleotidu jsou pod transkripčním řízením samostatné sekvence promotoru z alespoň jedné sekvence promotoru.
Podle ještě dalších znaků v popsaných vhodných včleněních konstrukce kyseliny nukleové dále obsahuje spojovací sekvenci, která byla vsunuta mezi první a druhé segmenty polynukleotidu.
• • · · · · ·
Podle ještě dalších znaků v popsaných vhodných včleněních je spojovací sekvence vybrána ze skupiny obsahující IRES a rozpoznávací místo štěpení proteázy.
Podle ještě dalších znaků v popsaných vhodných včleněních je alespoň jeden promotor funkční v eukaryotických buňkách.
Podle ještě dalších znaků v popsaných vhodných včleněních je alespoň jeden promotor vybrán ze skupiny skládající se z konstitutivního promotoru, inducibilního promotoru a tkáňového specifického promotoru.
Podle ještě dalších znaků v popsaných vhodných včleněních konstrukce exprimované kyseliny nukleové dále obsahuje: (c) první sekvenci promotoru, která je pro řízení exprese prvního segmentu polynukleotidu; a (d) druhou sekvenci promotoru, která je pro řízení exprese druhého segmentu polynukleotidu.
Podle ještě dalších znaků v popsaných vhodných včleněních jsou první promotor a druhý promotor vybrány ze skupiny skládající se z konstitutivního promotoru, inducibilního promotoru a tkáňového specifického promotoru.
Podle ještě dalších znaků v popsaných vhodných včleněních jsou inducibilní promotory ovladatelné stejnou molekulou efektoru.
Podle ještě dalších znaků v popsaných vhodných včleněních konstrukce exprimované kyseliny nukleové dále obsahují alespoň jeden další segment polynukleotidu kódující markerový polypeptid.
Podle ještě dalších znaků v popsaných vhodných včleněních je markerový polypeptid vybrán ze skupiny skládající se ze selektivního polypeptidu a reportérového polypeptidu.
Podle ještě dalších znaků v popsaných vhodných včleněních je alespoň jeden další segment polynukleotidu transkripčně připojen k alespoň jednomu z prvního a druhého segmentu polynukleotidu.
Podle ještě dalších znaků v popsaných vhodných včleněních je alespoň jeden další segment polynukleotidu transkripčně připojen k alespoň jednomu z prvního a druhého segmentu polynukleotidu pomocí spojovacího segmentu.
Podle ještě dalších znaků v popsaných vhodných včleněních je spojovací sekvence vybrána ze skupiny skládající se z IRES a z rozpoznávacího místa štěpení proteázy.
Podle ještě dalších znaků v popsaných vhodných včleněních je alespoň jeden další segment polynukleotidu translačně sloučen s alespoň jedním z prvního a druhého segmentu polynukleotidu.
Podle ještě dalšího hlediska tohoto vynálezu je připravena přeměněná endoteliální buňka a/nebo buňka hladkého svalstva, která je geneticky přeměněna tak, aby exprimovala alespoň jeden růstový faktor proliferující buňky a alespoň jeden faktor buněčné adheze.
Podle ještě dalších znaků v popsaných vhodných včleněních je přeměněná endoteliální buňka a/nebo buňka hladkého svalstva dále geneticky přeměněna tak, aby exprimovala alespoň jeden markerový polypeptid.
Podle ještě dalších znaků v popsaných vhodných včleněních je endoteliální buňka odvozena ze zdroje vybraného ze skupiny skládající se ze segmentu žíly, kostní dřeně, progenitorových buněk periferní krve a cirkulujících endoteliálních buněk.
Podle ještě dalších znaků v popsaných vhodných včleněních je endoteliální buňka nebo buňka hladkého svalstva odvozena ze zdroje vybraného ze skupiny skládající se z embryonálních nebo zralých tkání lidského dárce nebo živočišného zdroje.
Podle ještě dalších znaků v popsaných vhodných včleněních je růstový faktor proliferující buňky vybrán ze skupiny skládající se z VEGF, zásaditého nebo kyselého FGF, HGF a jakéhokoliv dalšího růstového faktoru endoteliální buňky.
Podle ještě dalších znaků v popsaných vhodných včleněních je faktor buněčné adheze DANCE, UP50, vitronektin, albumin, kolagen I, kolagen IV, fibronektin a laminin nebo jakákoliv další molekula schopná podporovat buněčnou adhezi k materiálu štěpu.
Podle ještě dalšího hlediska tohoto vynálezu je poskytnut umělý cévní štěp obsahující umělý trubicový prvek, který má luminální povrch potažený endoteliálními buňkami a buňkami hladkého svalstva, alespoň jedna z endoteliálních buněk a buněk hladkého svalstva je geneticky přeměněná tak, aby exprimovala alespoň jeden růstový faktor proliferující buňky a alespoň jeden faktor buněčné adheze.
Podle ještě dalšího hlediska tohoto vynálezu je poskytnut způsob výroby umělého cévního štěpu, způsob zahrnující: (a) poskytnutí endoteliálních buněk a buněk hladkého svalstva, kdy alespoň jedna z endoteliálních buněk a buněk hladkého svalstva je geneticky přeměněna, aby vyjádřila UP50 a VEGF; a (b) následně nebo souběžně kultivování endoteliálních buněk a buněk hladkého svalstva v umělém trubicovém prvku, který má luminální povrch, dokud není dosaženo dostatečného pokrytí luminálního povrchu endoteliálními buňkami a buňkami hladkého svalstva.
Podle ještě dalšího hlediska tohoto vynálezu je poskytnut umělý cévní štěp obsahující umělý trubicový prvek, který má luminální povrch potažený velkým • ·· · množstvím endoteliálních buněk a vnější povrch potažený velkým množstvím buněk hladkého svalstva.
Podle vhodných včlenění tohoto vynálezu je velké množství endoteliálních buněk geneticky přeměněno, aby exprimovalo alespoň jeden růstový faktor proliferující buňky a alespoň jeden faktor buněčné adheze.
Podle vhodných včlenění tohoto vynálezu je velké množství buněk hladkého svalstva geneticky přeměněno, aby exprimovalo alespoň jeden faktor buněčné adheze.
Tento vynález se úspěšně věnuje nedostatkům současně známých uspořádání tím, že poskytuje umělý cévní štěp a způsob jeho výroby, štěp, který je vhodný na cévní protézu nebo cévní bypass.
Přehled obrázků na vykresch
Vynález je zde popsán pouze pomocí příkladu s odkazem na doprovodné obrázky. Je kladen důraz na to, s určitým odkazem zde na podrobné obrázky, že ukázané detaily jsou pouze příkladem a pro účely vysvětlující diskuze vhodných včlenění tohoto vynálezu, a jsou ukázány, abychom poskytli to, co považujeme za nejvhodnější a snadno srozumitelný popis principů a koncepčních hledisek vynálezu. Proto není učiněn žádný pokus, ukázat konstrukční detaily vynálezu detailněji, než je nezbytné pro základní porozumění vynálezu, popis spojený s obrázky ujasní odborníkům, jak může být několik forem tohoto vynálezu začleněno do praxe.
Na obrázcích:
Obr. 1 je perspektivní pohled na umělý cévní štěp tohoto vynálezu.
Obr. 2 je blokové schéma zobrazující strategii konstruování smíšených biologicko-syntetických cévních štěpů tohoto vynálezu.
Obr. 3a až b jsou diagramy znázorňující adenovirové a retrovirové obrazce pro expresi VEGF-GFP (obrázky 3a a, eventuálně, 3b).
Obr. 4a až d jsou diagramy zobrazující virové vektory exprese pro expresi bílkoviny Urine p50 (UP50). Obrázky 4a a 4b zobrazují adenovirové vektory pro expresi UP50 a, eventuálně, UP50-GFP a obrázky 4c a 4d zobrazují retrovirové vektory pro expresi UP50 a, eventuálně, UP50-GFP.
Obr. 5a až b jsou mikrofotografie zobrazující PTFE (polytetrafluorethylen) štěpy, na něž byly zasety lidské EC infikované rekombinovanými adenovirovými vektory • ·· ·
W· * · · ·· * ···· «· · ·· ·· · · ·· kódujícími jaderný cílový LacZ gen (obrázek 5a) nebo jak VEGF, tak geny zelené fluorescenční bílkoviny (GFP), (obrázek 5b).
Obr. 6a až b jsou mikrofotografie zobrazující PTFE (polytetrafluorethylen) štěpy, na něž byly zasety lidské EC transdukované rekombinovanými retrovirovými vektory kódujícími jaderný cílový LacZ gen (obrázek 6a) nebo jak VEGF, tak geny zelené fluorescenční bílkoviny (GFP), (obrázek 6b).
Obr. 7a až d jsou mikrofotografie zobrazující EC (obrázky 7a až b) a SMC (obrázky 7b až d) infikované Ad.UP50-GFP. Buňky byly zviditelněny buď světlem (obrázky 7a a 7c), nebo fluorescenční (obrázky 7b a 7d) mikroskopií.
Obr. 8a až d jsou mikrofotografie zobrazující EC (obrázky 8a a 8b) a SMC (obrázky 8c a 8d) retrovirové transdukované, aby exprimovaly UP50-GFP. Buňky byly zviditelněny světlem (obrázky 8a a 8c) a fluorescenční (obrázky 8b a 8d) mikroskopií.
Obr. 9a až b jsou fotografie zobrazující RT-PCR analýzu exprese UP50 mRNA v EC a adenovirové infikované SMC, aby exprimovaly UP50 (obrázky 9a a, eventuálně, 9b). Pruhy na obrázku 9a jsou následující: 1. pozitivní srovnávací pokus plazmidu UP50 DNA; 2. negativní srovnávací pokus opačné reakce transkriptázy; 3. negativní srovnávací pokus reakce PCR; 4. Ad.GFP infikované EC; 5. Ad.UP-GFP infikované EC; 6. neinfikované EC. Pruhy na obrázku 9b jsou následující: 1. pozitivní srovnávací pokus plazmidu UP50 cDNA; 2. negativní srovnávací pokus opačné reakce transkriptázy; 3. Ad.GFP infikované SMC; 4. Ad.UP50-GFP infikované SMC; 5. neinfikované SMC.
Obr. 10a až b jsou fotografie zobrazující RT-PCR analýzu exprese UP50 mRNA v retrovirové transdukované EC a SMC (obrázky 10a a, eventuálně, 10b). Pruhy na obrázku 10a jsou následující: 1. retro-GFP transdukované EC, 2. retrovirové infikované EC, aby exprimovaly UP50, 3. pozitivní srovnávací pokus plazmidu UP50 DNA. Pruhy na obrázku 10b jsou následující: 1. markér, 2. netransdukované SMC; 3. retro-GFP transdukované SMC; 4. retro UP50-GFP transdukované SMC.
Obr. 11 je fotografie zobrazující „Western immunoblot“ analýzu exprese bílkoviny UP50 EC a adenovirové infikované SMC, aby exprimovalo UP50. Pruhy jsou následující: 1 - srovnávací pokus neinfikované EC, 2 - Ad-GFP infikované EC, 3 Ad.UPSO infikované EC, 4 - Ad.Angl-GFP infikované EC, 5 - srovnávací pokus neinfikované SMC, 6 - Ad.GFP infikované SMC, 7 - Ad.UP50-GFP infikované SMC, 8 Ad.Angl-GFP infikované SMC, 9 - pozitivní srovnávací pokus stabilního transformantu 293-FLYA exprimujícího UP50-GFP.
tt ·99 · *··· toto ··*· · · · · to · to toto·· toto · ·· ·· ·· ··
Obr. 12 je fotografie zobrazující „Western immunoblot“ analýzu exprese bílkoviny UP50 retrovirově transdukovanými EC a SMC. Pruhy jsou následující: 1 netransdukované EC, 2 - retroGFP transdukované EC, 3 - retroUP50-GFP transdukované EC, 4 - netransdukované SMC, 5 - retroGFP transdukované SMC, 6 retroUP50-GFP transdukované SMC, 7 - srovnávací pokus stabilního transformantu 293-FLYA exprimujícího UP50-GFP.
Obr. 13a až d jsou fluorescenční mikrofotografie zobrazující imunohistochemickou analýzu povrchové exprese UP50 v EC (obrázky 13a a 13b) a SMC (obrázky 13c a 13d) infikované Ad.UP50-GFP (obrázky 13b a 13d) nebo se srovnávacím pokusem plazmidu (obrázky 13a a 13a).
Obr. 14a až c jsou fluorescenční rastrovací konfokální mikrofotografie zobrazující EC infikované Ad.UP50 (obrázek 14a) nebo Ad.UP50-GFP (obrázky 14b a 14c). Obrázky 14b a 14c zobrazují tvoření skvrn UP50 v EC rostoucí v nebo, eventuálně, bez kontaktu buňka-buňka. Zelená a červená fluorescence představují tvoření skvrn GFP a, eventuálně, UP50.
Obr. 15 je fluorescenční mikrofotografie zobrazující imunohistochemickou analýzu bílkoviny UP50 v ECM tvořenou Ad.UP50-GFP infikovanými EC.
Obr. 16a až b zobrazují „Western immunoblot“ analýzu VEGF a expresi bílkoviny UP50 (obrázky 16a a, eventuálně, 16b) kulturami více buněk současně adenovirové infikovanými EC a SMC. Pruhy jsou následující: 1 - Ad.VEGF-GFP infikované EC + Ad.UP50-GFP infikované EC, 2 - AdAngl-GFP infikované EC + Ad.UP50-GFP infikované EC, 3 - Ad.VEGF-GFP infikované EC + Ad.UP50-GFP infikované SMC, 4 Ad.VEGF-GFP infikované EC + Ad.Angl-GFP infikované SMC, 5 - pozitivní srovnávací pokus 293-FLYA stabilního tranfektantu exprimujícího UP50.
Obr. 17a až b zobrazují „Western immunoblot“ analýzu VEGF a expresi bílkoviny UP50 (obrázky 17a a, eventuálně, 17b) kulturami více buněk současně retrovirově infikovanými EC a SMC. Pruhy jsou následující. Obrázek 17a: 1) retroUP50-GFP transdukované EC + retroGFP transdukované EC; 2) retroVEGF-GFP transdukované EC + retroUP50-GFP transdukované EC; 3) retroVEGF-GFP transdukované EC; 4) retroUP50-GFP transdukované EC; 5) retroGFP transdukované EC; 6) srovnávací pokus EC; 7) retroUP50-GFP transdukované SMC + retroVEGF-GFP transdukované EC; 8) retroUP50-GFP transdukované SMC + retroGFP transdukované EC; 9) srovnávací pokus SMC; 10) pozitivní srovnávací pokus nově spojeného VEGF. Obrázek 17b; 1) srovnávací pokus SMC, 2) retroGFP transdukované SMC, 3) retroUP50-GFP • · ··« · ·· ··· · transdukované SMC + retroVEGF-GFP transdukované EC, 4) retroUP50-GFP transdukované SMC + retroGFP transdukované EC, 5) retroUP50-GFP transdukované
SMC, 6) VEGF srovnávací pokus, 7) UP50 srovnávací pokus.
Obr. 18 je statistický diagram proliferace EC infikovanými adenovirovými vektory kódujícími UP50-GFP, VEGF-GFP nebo GFP.
Obr. 19a až c jsou fluorescenční mikrofotografie zobrazující expresi GFP v retroGFP transdukovanými EC (obrázek 19a) a EC transdukovanými retroUP50-GFP a následně infikovanými bud Ad. GFP, nebo Ad.VEGF-GFP (obrázky 19b a, eventuálně, 19c).
Obr. 20a až b jsou fotografie zobrazující „Western immunoblot“ analýzu VEGF a expresi bílkoviny UP50 (obrázky 20a a, eventuálně, 20b) v retro UP50-GFP transdukovaných EC následně infikovanými adenovirovými vektory. Pruhy jsou následující: 1 - pozitivní srovnávací pokus 293-FLYA stabilně exprimující UP50, 2 srovnávací pokus neinfikovaných EC, 3 - Ad.GFP infikované EC, 4 - Ad.VEGF-GFP infikované EC, 5 - EC transdukované retroUP50-GFP, 6 - EC transdukované retroUP50-GFP a infikované Ad.GFP, 7 - EC transdukované retroUP50-GFP a infikované Ad.VEGF-GFP, 8 - pozitivní srovnávací pokus rekombinantu VEGF.
Obr. 21a až h jsou světelné (obrázky 21a, 21c, 21 e a 21 g) nebo fluorescenční (obrázky 21b, 21d, 21f a 21 h) mikrofotografie zobrazující trojrozměrnou angiogenezi in vitro Ad.GFP (obrázky 21a až d) nebo Ad.VEGF-GFP (obrázky 21 e až h) infikovaných EC bez (obrázky 21a, 21b, 21e a 21f) nebo s (obrázky 21c, 21 d, 21g a 21h) přidáním 100 ng/ml VEGF. Reprezentativní stanovení každé experimentální skupiny jsou ukázána.
Obr. 22a až h jsou světelné (obrázky 22a, 22c, 22e a 22g) nebo fluorescenční (obrázky 22b, 22d, 22f a 22h) mikrofotografie zobrazující trojrozměrnou angiogenezi in vitro Ad.GFP (obrázky 22a až d) nebo Ad.UP50-GFP + Ad.GFP (obrázky 22e až h) infikovaných EC bez (obrázky 22a, 22b, 22e a 22f) nebo s (obrázky 22c, 22d, 22g a 22h) 50% současnou kulturou Ad.VEGF-GFP infikovaných EC. Reprezentativní stanovení každé experimentální skupiny jsou ukázána.
Obr. 23 je statistický diagram zobrazující adhezní stanovení Ad.UP50 (vínové pásy), Ad.GFP (modré pásy), nebo neinfikované EC (žluté pásy). Jsou ukázány dvě různé, třikrát vyhotovené, zkoušky.
Obr. 24 je statistický diagram zobrazující adhezi EC k UP50 obsahující ECM. Výsledky jsou ukázány jako upravené hodnoty vnějšího průměru po odečtení pozadí.
• · ···· φφ ·Φ φ« φ φ φ φ φ φ
Obr. 25a až g zobrazují adhezi UP50 opětovně exprimující EC vystavené nepřetržitému smykovému napětí. Náhodně vybraná pole zobrazující srovnávací pokus ne- (obrázky 25a a 25b), retroGFP- (obrázky 25c a 25d) a retroUP50- (obrázky 25e a 25f) infikovaných EC jsou zobrazena před (obrázky 25a, 25c a 25e) a po (obrázky 25b, 25d a 25f) 24 hodinách kývání. Obrázek 25h je statistický diagram zobrazující součet počtu buněk zbývajících po dvacetičtyřech hodinách kývání. Před pokusem byly spočítány dva zdroje z každé skupiny (UP50-GFP, GFP, srovnávací pokus). Výsledky jsou ukázány jako procentuelní množství zbývajících buněk z celkového množství před počátkem kývání.
Obr. 26 je schematické zobrazení v tomto vynálezu použitého uspořádání pro zkoušku buněčné retence za podmínek laminárního toku in vitro.
Obr. 27a až d zobrazují různé složky v tomto vynálezu použitého uspořádání pro zkoušku buněčné retence za podmínek laminárního toku in vitro. Obrázek 27a zobrazuje inkubátor tkáňové kultury obsahující uspořádání toku, obrázek 27b zobrazuje monitory tlaku a toku, obrázek 27c zobrazuje uspořádání pro získání dat a čerpadlo a obrázek 27d zobrazuje zařízení pro endoteliální vysévání.
Obr. 28a až d jsou fluorescenční mikrofotografie zobrazující ePTFE syntetické cévní štěpy oseté retrovirově transdukovanými EC, aby exprimovaly GFP (obrázky 28a a 28b) nebo UP50-GFP (obrázky 28c a 28d) vystavené podmínkám pulsujícího laminárního toku v uspořádání laminárního toku.
Obr. 29 je fotografie zobrazující odhalenou stehenní tepnu ovce, která má na sobě implantovaný ePTFE syntetický cévní štěp osetý geneticky přeměněnými lidskými EC.
Obr. 30a a 30b jsou angiogramy zobrazující operační snímek napojení tepenného PTFE štěpu a průchodnost implantovaných štěpů v levé a pravé stehenní tepně (obrázky 30a a, eventuálně, 30b).
Obr. 31a až f jsou fluorescenční mikrofotografie zobrazující buněčnou retenci na luminálním povrchu in vivo implantovaných štěpů osetých retrovirově transdukovanými EC, aby exprimovaly GFP (obrázky 31a a 31b), VEGF-GFP (obrázky 31c 31 d) nebo UP50-GFP (obrázky 31 e a 31 f). Pro každou podmínku stanovení jsou ukázány dva reprezentativní snímky.
·· 4444
4
4 4« •4 4444
Příklady provedení vynálezu
Toto je vynález umělého cévního štěpu, který může být využit k nahrazení a/nebo obejití poškozených a/nebo uzavřených krevních cév, a jeho způsobů výroby a transplantace. Přesněji je tímto vynálezem způsob výroby syntetických cévních štěpů potažených savčími endoteliálními buňkami, štěpů, které mohou poskytnout schůdnou alternativu současně používaných přírodních a syntetických cévních štěpů.
Způsoby a účinnost tohoto vynálezu mohou být lépe pochopeny s odkazem na obrázky a doprovodné popisy. Dříve, než vysvětlíme alespoň jedno včlenění vynálezu podrobně, je třeba chápat, že použití tohoto vynálezu není omezeno na podrobnosti konstrukce a sestavení složek zveřejněných v následujícím popisu nebo znázorněných na obrázcích. Tento vynález je způsobilý dalších včlenění nebo uskutečnění nebo provedení různými cestami. Také je třeba chápat, že zde použitá frazeologie a terminologie je pro účel popisu a neměla by být považována za mezní.
Avšak umělé štěpy jsou velice využívány při obvyklých postupech chirurgických bypassů. Jedním z omezení, která současně dostupné umělé cévní štěpy, stejně jako některé přírodní štěpy, souží, je nedostatek trvanlivosti po delší časová období. Ačkoliv použití endoteliálních buněk kvalitu potažených umělých štěpů velmi zvyšuje, zlepšením provedení obecně, a zejména zlepšením trombolytické aktivity takové štěpy za působení sil krevního toku typicky trpí ztrátou buněčného potažení, protože potažené buňky nemohou vydržet smykové síly, jimiž na ně působí tekoucí krev.
Byly učiněny různé pokusy, aby se trvanlivost štěpu zvětšila. US patent č. 5 785 965 popisuje umělý štěp, který byl oset geneticky přeměněnými endoteliálními buňkami, aby vyjádřily VEGF. Ačkoliv takové buňky vykazují lepší vlastnosti vysévání na štěp, jak je ukázáno v kapitole „Příklady“, štěpy oseté endoteliálními buňkami exprimujícími VEGF nemohou trvale vydržet síly, jimiž na ně působí tekoucí krev.
Při experimentování s postupy osévání štěpů zjistili současní vynálezci, že geneticky přeměněná populace endoteliálních buněk a/nebo buněk hladkého svalstva, které společně exprimují faktor buněčné adheze, jako je UP50 s buněčným růstovým faktorem, například s VEGF, nebo směs dvou podskupin geneticky přeměněných endoteliálních buněk a/nebo buněk hladkého svalstva, jedna exprimující faktor buněčné adheze a druhá buněčný růstový faktor, jsou výhodné pro vysévání na umělé cévní štěpy.
• flfl · ·· ····
Expres© faktoru buněčné adheze v buňkách vysévaných na štěp, jak je zřejmé z předložených výsledků v kapitole „Příklady“, nezpomaluje proliferaci buněk, ale velmi zvyšuje adhezi takových buněk k luminálnímu povrchu substrátu umělého štěpu, a jako taková velice zvyšuje trvanlivost cévního štěpu. Navíc, jak je jasně ukázáno v kapitole „Příklady“, společná exprese faktoru buněčné adheze a buněčného proliferačního faktoru vede k úplnému potažení luminálního povrchu štěpu endoteliálními buňkami, které jsou schopny vydržet síly, jimiž v nich působí tok krve.
V ostrém kontrastu k dosavadním cévním štěpům, které jsou předběžně upraveny tak, že zahrnují faktor buněčné adheze, například fibronektin (35 až 37 a 39), exprese faktoru buněčné adheze, například UP50, z buněk vysetých na Štěp, společně s expresí faktoru proliferace buněk, například VEGF, z těchto nebo z jiných buněk, podstatně zlepšuje adhezi buňky k buňce a buňky ke štěpu, a jako taková podstatně zlepšuje trvanlivost štěpu.
Protože, navíc, faktor(y) buněčné adheze exprimovaný vysetými buňkami tohoto vynálezu tvoří část extracelulární matrix, která řídí interakce buňky k buňce a buňky ke štěpu, je po implantaci minimalizováno uvolnění takových faktorů do oběhu. V ostrém kontrastu, včlenění těchto faktorů do materiálu cévního štěpu, jak je provedeno u nynějších cévních štěpů, může vést po implantaci k uvolnění těchto faktorů do oběhu a k rychlému zředění těchto faktorů, což vede ke ztrátě aktivity.
Toto uvolnění mobilizovaných faktorů adheze štěpu muže vést také k trombóze, protože tyto faktory mohou aktivovat koagulační systém a/nebo způsobit místní zánět, proces, který podstatně zkracuje životnost štěpu a představuje vážné zdravotní riziko pro nemocného.
Tak je podle jednoho hlediska tohoto vynálezu, a jak je přesněji ukázáno na obrázku 1, poskytnut umělý cévní štěp, o němž je dále pojednáváno jako o štěpu 10.
Štěp 10 obsahuje syntetický trubicový prvek 12, který má luminální povrch 14. Nejlépe má syntetický trubicový prvek 12 vnitřní oblast příčného řezu asi 7 až 700 mm2 nebo jakoukoliv oblast příčného řezu nebo průměr, který je v podstatě ekvivalentní vnitřní oblasti příčného řezu nebo průměru krevní cévy.
Luminální povrch 14 je vyroben z látky zahrnující, například, polytetrafluorethylen (PTFE), expandovaný polytetrafluorethylen (ePTFE), polyesterová vlákna, Dacron™ nebo zpracované krevní cévy pocházející ze živočicha nebo z člověka.
4· 4*44 44 444* 44 444· • 4 · · 4 4 4 4 4 • 4 · *44 444
444 4*4 4444 4
ΙΑ · 4 4 4444 4444 ΧΜ 44 4 44 44 44 44
Luminální povrch 14 nejlépe zahrnuje textury, například dolíky a/nebo výstupky, nebo jakékoliv textury, které mohou napomáhat/zlepšovat vysévání buněk na jejich povrch.
Luminální povrch 14, jak je popsáno dále, je potažen množstvím buněk 16 včetně endoteliálních buněk a/nebo buněk hladkého svalstva, jejichž alespoň část je geneticky upravena, aby exprimovaly alespoň jeden růstový faktor proliferující buňky a alespoň jeden faktor buněčné adheze.
Jinak může být luminální povrch 14 potažen endoteliálními buňkami a dle volby buňkami hladkého svalstva, které jsou geneticky přeměněny, aby exprimovaly alespoň jeden růstový faktor proliferující buňky a alespoň jeden faktor buněčné adheze, zatímco vnější povrch 15 trubicového prvku 12 může být potažen přeměněnými nebo nepřeměněnými buňkami hladkého svalstva. Takové provedení může podstatně zlepšit trvanlivost a přijetí štěpu.
Podle vhodných včlenění tohoto vynálezu je růstový faktor proliferující buňky, například, VEGF (přírůstkové číslo GenBank AB021221), kyselý nebo zásaditý FGF (přírůstková čísla GenBank S67291 a, eventuálně, M27968) nebo HGF (přírůstkové číslo GenBank D14012), přičemž faktor buněčné adheze je, například, UP50 (SEQ ID NO:1), DANCE (přírůstkové číslo GenBank AF112152), vitronektin (přírůstkové číslo GenBank NM000638), albumin (přírůstkové číslo GenBank NM000477), kolagen I (přírůstkové číslo GenBank J00114), kolagen IV (přírůstkové číslo GenBankM 15524), fibronektin (přírůstkové číslo GenBank X02761) nebo laminin (přírůstkové číslo GenBank NM005560) nebo jakákoliv další molekula schopná podpořit adhezi buněk endoteliálních/hladkého svalstva k materiálu štěpu. Odkazy 34 až 45 v kapitole odkazů dále poskytují důkazy podporující použitelnost výše zmíněných faktorů proliferujících buňky a faktorů buněčné adheze ve štěpech tohoto vynálezu.
Pro výrobu štěpu 10 tohoto vynálezu jsou buňky 16 vysety/kultivovány na prvku 12 dokud není dosaženo dostatečného stupně potažení luminálního povrchu 14. Buňky 16 jsou, pravděpodobně, kultivovány za podmínek napomáhajících tvorbě plynulé jednoduché vrstvy na povrchu 14.
V případech, kdy jsou použity jak endoteliální buňky, tak buňky hladkého svalstva, je vhodné následné vysévání na luminální povrch 14. V takovém případě jsou přeměněné nebo nepřeměněné buňky hladkého svalstva nejlépe vysévány před vyséváním přeměněných endoteliálních buněk.
9 ·99·
9999
Π 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
Jinak může být štěp 10 oset přeměněnými buňkami hladkého svalstva a následně implantován do těla, čímž umožní cirkulujícím endoteliálním buňkám potáhnout (endotelializovat) luminální povrch 14.
Bude oceněno, že mohou být buňky 16 přeměněny jak růstovým faktorem proiiferujícím buňky, tak faktorem buněčné adheze, nebo opačně může být první část takových buněk přeměněna růstovým faktorem proiiferujícím buňky, zatímco druhá část těchto buněk je přeměněna faktorem buněčné adheze.
Endoteliální buňky a buňky hladkého svalstva použité v tomto vynálezu mohou být odvozeny z různých zdrojů savčí tkáně.
Podle vhodného včlenění tohoto vynálezu jsou endoteliální buňky připraveny, například, z části žíly, progenitorových buněk kostní dřeně, kmenových buněk periferní krve nebo z cirkulujících endoteliálních buněk.
Podle dalšího vhodného včlenění tohoto vynálezu jsou buňky hladkého svalstva připraveny, například, z povrchových žil z nohy, zbylých vnitřních savčích tepen, progenitorových buněk kostní dřeně a kmenových buněk periferní krve.
V každém případě jsou buňky použité v tomto vynálezu typicky regenerovány z tkání uvažovaného příjemce štěpu 10 nebo syngenetického dárce.
Za předpokladu, že jsou učiněna taková opatření před nebo po výrobě štěpu 10, abychom se vyhnuli odmítnutí buněk, může být pro přípravu takových buněk eventuelně použita xenogenetická tkáň. Pro předejití nebo zmírnění odmítnutí jsou v oboru známy početné způsoby, proto zde nepodáváme podrobnější vysvětlení.
Jak je dále popsáno v kapitole „Příklady“, společná exprese faktoru buněčné adheze s buněčným růstovým faktorem umožňuje buňkám 16 štěpu 10 tohoto vynálezu vydržet síly toku, které by podle dosavadní techniky umělých cévních štěpů normálně vedly ke ztrátě buněk z luminálního povrchu.
Tak může být, na rozdíl od dosavadní techniky syntetických štěpů, štěp 10 tohoto vynálezu úspěšně využit při obvyklých cévních operačních postupech, které mají za cíl náhradu nebo překlenutí poškozené nebo ucpané krevní cévy. V takových obvyklých postupech je štěp 10 implantován do cévního systému jedince tak, aby vytvořil spojení mezi cévním systémem a štěpem 10.
Jak je výše zmíněno, přeměněné endoteliální a/nebo buňky hladkého svalstva exprimují podle poznatků tohoto vynálezu alespoň jeden růstový faktor proliferující buňky a alespoň jeden faktor buněčné adheze.
•A AAAA
AA AAAA • * AAA AAA
AAA AAA AA
Takové faktory mohou být exprimovány z exogenních sekvencí polynukleotidů zavedených do buněk, nebo jinak mohou být takové faktory endogenní faktory přirozeně exprimované buňkou, tehdy je buňka přeměněna sekvencemi usměrněnými při způsobení přeexprese endogenních faktorů.
Výraz „přeexprese“, jak je zde použit, znamená stupně exprese, které přesahují stupně běžně se v buňce nacházející. Přeexprese může být ovlivněna uvedením dalších reprodukcí endogenního genu do buňky, tím vzrůstá množství reprodukcí endogenního genu nebo genů exprimovaných v buňce, nebo uvedením prvků zesilovače transkripce pomocí obvyklých postupů zavedení genu, prvků, které zvyšují transkripci nebo translaci endogenních genů.
Exogenních sekvence polynukleotidů jsou nejlépe zahrnuty v jedné nebo více konstrukcích kyseliny nukleové, které jsou použity, aby geneticky přeměnily buňky.
Výraz „geneticky přeměnit“, jak je zde použit, znamená uvedení exogenních sekvencí polynukleotidů do buňky. Takové sekvence se mohou včlenit do genomu buňky, nebo jinak mohou tyto exogenní sekvence existovat v jádře nebo cytoplazmě buňky přechodným způsobem.
Podle dalšího vhodného hlediska tohoto vynálezu je poskytnuta konstrukce exprese kyseliny nukleové vhodná pro vytváření buněk 16 tohoto vynálezu. Konstrukce zahrnuje první úsek polynukleotidů kódující růstový faktor proliferující buňky a druhý úsek polynukleotidů kódující faktor buněčné adheze.
Konstrukce podle tohoto hlediska tohoto vynálezu také zahrnuje jednu nebo více sekvencí promotoru pro řízení exprese prvního a druhého úseku polynukleotidů v přeměněných buňkách. Tímto promotorem může být jakýkoliv funkční savčí promotor, který je buď konstitutivní, specifický tkáňový nebo inducibilní.
Jak je popsáno dále v kapitole „Příklady“, růstový faktor proliferující buňky a faktor buněčné adheze jsou nejlépe exprimovány různým časovým modelem.
Jako taková zahrnuje konstrukce dvě promotorové sekvence, z nichž je každá pro řízení exprese jediného úseku polynukleotidů. Nejlépe jsou takové promotory inducibilní promotory ovladatelné stejnou molekulou efektoru. Nejlépe jsou tyto promotorové sekvence vybrány tak, aby byl jeden promotor molekulou efektoru ovladatelný nahoru, zatímco druhý promotor je stejným efektorem ovladatelný dolů.
Příklady vhodných inducibilních promotorů zahrnují, například chemicky (molekulou efektoru) indukované promotory, jako jsou promotory použité genovými
I ·* ····
4« ··»<
«««· systémy exprese Tet-On (TM) a Tet.Off (TM) komerčně dostupné od firmy Clontech, nebo indukované promotory smykového napětí, například popsané v (46 až 50).
Aniž by to odporovalo výše zmíněnému, bude lépe, když bude samotná promotorová sekvence také využita konstrukcí tohoto vynálezu za předpokladu, že první a druhé úseky polynukleotidu jsou transkripčně spojeny a za předpokladu, že je zahrnuto vnitřní vstupní místo ribozomu (IRES) pro řízení translace druhé části polycistronní transkribované zprávy.
Dva polynukleotidové úseky konstrukce mohou být podle tohoto hlediska tohoto vynálezu také translačně sloučeny, pokud je mezi nimi zajištěno štěpné místo proteázy, které umožňuje štěpení a oddělení těchto dvou polypeptidů v exprimujících buňkách.
Dále bude oceněno, že každý ze dvou úseků polynukleotidu může být zahrnut v samostatné konstrukci kyseliny nukleové, které mohou být společně uvedeny do buněk.
Tak je ještě podle dalšího hlediska tohoto vynálezu poskytnut konstrukční systém exprese nukleové kyseliny vhodný při výrobě buněk 16 tohoto vynálezu. Konstrukční systém tohoto hlediska tohoto vynálezu zahrnuje konstrukci exprese první nukleové kyseliny, včetně prvního úseku polynukleotidu kódujícího růstový faktor proliferující buňky, a konstrukci exprese druhé nukleové kyseliny, včetně druhého úseku polynukleotidu kódujícího faktor buněčné adheze.
Konstrukce nebo konstrukční systém tohoto vynálezu nejlépe také zahrnuje další úseky polynukleotidů kódující markerové geny, selekční markerové geny a podobně, aby byla umožněna selekce přeměněných buněk a/nebo monitorování exprese růstového faktoru proliferujícího buňky a/nebo faktoru buněčné adheze. Příklady vhodných referenčních genů jsou například beta-galaktosidáza, luciferáza, GFP a podobně. Příklady selekčních markérů zahrnují geny rezistentní na antibiotika a podobně.
Bude oceněno, že k monitorování exprese růstového faktoru proliferujícího buňky a/nebo faktoru buněčné adheze, může být poskytnut reportérový gen v transkripčním nebo translačním spojení s úsekem polynukleotidu kódujícím faktor nebo může být umístěn pod kontrolu promotorové sekvence, která je identická sekvenci řídící transkripci faktoru.
Bude oceněno, že úseky polynukleotidů kódující růstový faktor proliferující buňky a/nebo faktor buněčné adheze mohou být podvázány do komerčně dostupného systému exprese vektoru, který je vhodný k přeměnění savčích buněk a pro řízení exprese těchto faktorů v přeměněných buňkách. Bude oceněno, že takové komerčně φφ φφφφ φφ φφφφ
ΦΦ φφφφ φ φ φ φφφ φφφ φ φφφ φφ φ φφ φ
φ φ
φ φ dostupné systémy vektorů mohou být snadno modifikovány pomocí běžně používaných rekombinačních metod, aby přemístily, rozmnožily nebo změnily stávající promotor nebo sekvence zesilovače transkripce a/nebo uvedly jakékoliv další sekvence polynukleotidu.
Vhodné savčí vektory exprese zahrnují, například, pcDNA3, pcDNA3.1(+/-), pZeoSV2(+/-), pSecTag2, pDisplay, pEF/myc/cyto, pCMV/myc/cyto, pCR3.1, které jsou dostupné od firmy Invitrogen, pCI, které je dostupné od firmyPromega, pBK-RSV a pBK-CMV, které jsou dostupné od firmy Stratagene, pTRES, které je dostupné od firmy Clontech a jejich deriváty.
Jak je zmíněno výše, přeměněné buňky tohoto vynálezu mohou také zahrnovat exogenní sekvence polynukleotidů řízené na přeexprimování endogenně kódujících faktorů.
Tak je ještě podle dalšího hlediska tohoto vynálezu poskytnuta konstrukce nukleové kyseliny nebo konstrukční systém, který slouží k řízení exprese endogenně kódujících faktorů vzhůru. Taková konstrukce nebo více konstrukcí mohou zahrnovat transkripční regulační sekvence, které jsou-li poskytnuty v cis endogenním sekvencím kódujícím faktor proliferující buňky a/nebo faktor buněčné adheze, mohou z nich řídit transkripci vzhůru.
Jinak může taková konstrukce nebo více konstrukcí kódovat translační řídící sekvence, které jsou-li poskytnuty v trans endogenním sekvencím kódujícím faktor proliferující buňky a/nebo faktor buněčné adheze, mohou z nich řídit translaci vzhůru.
Standardní metody vpravení genu mohou být využity k dosazení cis působících transkripčních řídících sekvencí do genomu endoteliálních buněk nebo buněk hladkého svalstva. Viz, například, přehled metodiky vpravení genu v patentech Spojených států čísel 5 487 992, 5 464 764, 5 387 742, 5 360 735, 5 347 075, 5 298 422, 5 288 846, 5 221 788, 5 175 385, 5 185 384, 5 185 383, 4 736 866, stejně jako v pracích: Burke a Olson, Methods in Enzymology, 194:251 až 270, 1991; Capecchi, Science 244:1288 až 1292, 1989; Davies et al., Nucleic Acids Research, 20 (11) 2693 až 2698, 1992; Dickinson et al., Human Molecular Genetics, 2(8):1292 až 1302, 1993; Duff a Lincoln, „Insertion of a patogenic mutation into a yeast artificial chromosome containing the human APP gene and expression in ES celíš“, Research Advances in Alzheimer’s Disease and Related Disorders, 1995; Huxley et al., Genomics, 9:742 až 750, 1991; Jakobovits et al., Nátuře, 362:255 až 261, 1993; Lamb et al., Nátuře Genetics, 5: 22 až 29, 1993; Pearson a Choi, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 1993, 90:10 578 až 82;
·· · · • · · ·
Rothstein, Methods in Enzymology, 194: až 301, 1991; Schedl et al., Nátuře, 362: 258 až 261, 1993; Strauss et al., Science, 259:1904 až 1907, 1993, WO 94/23 049, WO 93/14 200, WO 94/06 908 a WO 94/28 123 poskytují také informace.
Konstrukce kyseliny nukleové tohoto vynálezu mohou být do endoteliálních buněk nebo buněk hladkého svalstva dosazeny pomocí jakéhokoliv běžného způsobu savčí přeměny. Takové způsoby zahrnují, například, přímé metody absorpce DNA a přeměnu prostřednictvím viru nebo lipozomu (další podrobnosti viz, například, „Methods in Enzymology“ sv. 1 až 317, Academie Press).
Tak poskytuje tento vynález zdokonalený umělý cévní štěp, který je uvnitř potažen geneticky přeměněnými buňkami včetně endoteliálních buněk a/nebo buněk hladkého svalstva exprimujícími buněčný růstový faktor a faktor buněčné adheze. Exprese faktoru buněčné adheze vedle buněčného růstového faktoru umožňuje přeměněným buňkám lnout větší silou k luminálnímu povrchu umělého cévního štěpu, čímž poskytuje trvalé potažení buňkami, které může po delší časová období vydržet síly toku, které na umělý cévní štěp po implantaci působí.
Další účely, výhody a nové znaky tohoto vynálezu budou běžnému odborníku zřejmé po prostudování následujících příkladů, které nejsou míněny jako mezní. Dále, každé z různých hledisek a včlenění tohoto vynálezu, která jsou načrtnuta výše a nárokována v části nároků dále, je experimentálně doloženo v následujících příkladech.
Nyní odkazujeme na následující příklady, které společně s příklady uvedenými výše dokreslují tento vynález nevymezujícím způsobem.
Obecně zde použitá terminologie a laboratorní postupy v tomto vynálezu použité zahrnují molekulární, biochemické, mikrobiologické a rekombinační metody DNA. Tyto metody jsou v literatuře důkladně vysvětleny. Viz, například, „Molecular Cloning: A laboratory Manual“ sambrook et al., (1989); „Current Protocols in Molecular Biology“ svazky I až III Ausubel, R. M., vyd. (1994); Ausbel et al., „Current Protocols in Molecular Biology“, John Wiley a synové, New York (1988); Watson et al., „Recombinant DNA“, Scientific American Books, New York; Birren et al. (vyd.) „Genome Analysis: A Laboratory Manual Series“, sv. 1 až 4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1988); metodiky zveřejněné v US patentech čísel 4 666 828; 4 683 202; 4 801 531; 5 192 659 a 5 272 057; Cell Biology: A Laboratory Handbook“, svazky I až III Cellis, J.
E., vyd. (1994); Current Protocols in Immunology“ svazky I až III Coligan J. E., vyd. (1994); Stites et al. (vyd), Basic and Clinical Immunology“ (8. vydání), Appleton a ·· ···· ·· ···· ·· ···· ·· ··· ··· · • 9 · · · · ··· ··· ··♦· · · · · c · · eo · · «< · ·
Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell a Shiigi (vyd.), „Selected Methods in Cellular Immunology“, W. H. Freeman a spol., New York (1980); dostupné imunoanalýzy jsou obsáhle popsány v patentové a vědecké literatuře, viz, například, US patenty čísel 3 791 932; 3 839 153; 3 850 752; 30850 578; 3 853 987; 3 867 517; 3 879 262; 3 901 654; 3 935 074; 3 984 533; 3 996 345; 4 034 074; 4 098 876; 4 879 219; 5 011 771 a 5 281 521; „Oligonucleotide Synthesis“ Gait, M. J., vyd.(1984); „Nucleic Acid Hybridization“ Hames, B. D. a Higgins S. J., vyd. (1985); „Transcription and Translation“ Hames, B. D. a Higgins S. J., vyd. (1984); „Animal Cell Culture“ Freshney, R. I., vyd. (1986); Immobilized Celíš and Enzymes“ IRL Press, (1986); „A Practicaí Guide to Molecular Cloning“ Perbal, B., (1984) a „Methods in Enzymology“ sv. 1 až 317, Academie Press; „PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications“, Academie Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., „Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual“ CSHL Press (1996); které jsou všechny zahrnuty odkazem jako by zde byly plně zveřejněny. Další obecné odkazy jsou poskytnuty od počátku do konce tohoto spisu. Domníváme se, že postupy v něm uvedené jsou v oboru dobře známé a jsou poskytnuty pro potřebu čtenáře. Veškeré informace ve spisu obsažené jsou zde začleněny odkazem .
Ačkoliv je vynález popsán ve spojení s jeho určitými včleněními, je jasné, že odborníkům budou zřejmé mnohé možnosti, modifikace a obměny. Máme, tudíž, v úmyslu zahrnout všechny takové možnosti, modifikace a obměny, které zapadají do smyslu a širokého rámce připojených nároků. Veškeré publikace, patenty, patentové přihlášky a souvislosti určené jejich přírůstkovým číslem, zmíněné v této specifikaci, jsou zde ve své celistvosti začleněny odkazem do specifikace, ve stejném rozsahu, jako by každá jednotlivá publikace, patent, patentová přihláška nebo souvislost určená svým přírůstkovým číslem byla specificky a jednotlivě uvedena jako zde začleněná odkazem. Dále, citace nebo určení jakéhokoliv odkazu v této přihlášce nebude chápáno jako připuštění, že takový odkaz je dostupný jako dosavadní stav techniky k tomuto vynálezu.
Příklad 1
Strategie výroby cévních štěpů
Abychom mohli ukázat výhody zdokonalených syntetických cévních štěpů (obrázek 1) tohoto vynálezu, bylo nezbytné vytvořit strategii genetické přeměny cévních • · φ · · · buněk a provést pokusy, jejichž cílem bylo dokázat realizovatelnost přístupu zde zveřejněného. Proto tedy popisuje blokové schéma ukázané na obrázku 2 provedené pokusy, abychom ukázali kapacitu způsobů tohoto vynálezu vyrobit cévní štěpy mající větší trvanlivost.
Příklad 2
Konstrukce virových vektorů pro genetickou přeměnu cévních buněk
Pro přenos genu do cévních buněk byly použity dva typy virových vektorů; prvním je velmi účinný rekombinanovaný adenovirový systém vedoucí k maximální transgenové expresi. Rekombinanované adenovirové přípravky mají tu výhodu, že jsou méně komplexní, než přípravky jiných vektorů, například skupinové adeno vektory (AAV) a vektory založené na lentovirech (21, 22) a na rozdíl od jiných virových vektorových systémů, mohou být adenovirové vektory použity následně po osévání štěpů, protože dělení buněk není podstatné pro transgenovou expresi. Druhý použitý vektor byl retrovirový vektor pseudotypovaný GALV glykoproteinem. Takové pseudotypované vektory mají velkou afinitu lidským a ovčím EC a SMC (23) a, na rozdíl od adenovirových vektorů, transdukce s retrovirovými vektory vede k stabilní transgenové expresi a transmisi genové exprese v dceřiných buňkách.
Proto byly pro výrobu geneticky upravených cévních buněk připraveny virové vektory, které příliš exprimují proendotelializační faktory, jež mají být použity k vysévání na cévní štěpy, jak je popsáno dále.
Materiály a metody:
Vytváření rekombinanovaných adenovirových vektorů kódujících LacZ gen: Rekombinanované adenovirové vektory pro expresi bakteriálního na jádro cíleného genu β-galaktosidázy byly tvořeny v několika krocích, které se skládají z běžného prokaryotického klonování a homologického rekombinačního postupu v buněčné řadě 293. Fragment A 3700bp HindlII-BamHI obsahující bakteriální gen β-galaktosidázy (LacZ) (Clontech, CA, USA) byl vložen do plazmidu pCA3 kvůli konstitutivní expresi za řízení CMV přímého počátečního promotoru. Výsledný plazmid byl společně transfektován s plazmidem pJM17 do 293 buněk, které konstitutivně exprimují adenovirový gen E1. Plazmid pJM17 obsahuje adenovirový genom vyřazující oblast E3 a zahrnující vložení (pBRX) v oblasti E1 viru. Homologická rekombinace mezi pCA3 kódující β-galaktosidázu a pJM17 následující transfekci zaměnila oblast E1 pJM17 za • · • · · · • · • · · · kazetu exprese CMV- β-galaktosidázy z pCA3. Tvorba plaku se objevila 2 až 4 týdny po společné transfekci, po níž byly jednotlivé plaky izolovány a virové extrakty z nich byly rozšířeny infikováním 293 buněk. Titr každého kmenu virů byl stanoven stanovením plaku v 293 buňkách a byly získány virové titry ~1O10 pfu/ml. Byla potvrzena exprese β-galaktosidázy metodou X-gal zbarvování.
Vytváření rekombinanovaných bicistronních adenovirových vektorů kódujících VEGF a GFP geny: Rekombinanované adenovirové vektory kódující VEGF1155 a GFP geny byly tvořeny běžným prokaryotickým klonováním do vektorů, které se mohou replikovat ve více hostitelských druzích, následovaným homologickou rekombinací v 293 buňkách. Fragment 600 bp BamHI obsahující lidskou VEGF165 cDNA (přírůstkové číslo Genbank AB021 221), včetně signální sekvence pro sekreci (laskavý dar Dr. J. Abrahama, Scios Nova, Mountain View, CA), byl vpraven do místa Bglll vektoru pQBI-CMV5-GFP, který se může replikovat ve více hostitelských druzích, (QBI, Kanada), čímž vytvořil vektor CMV5-VEGFi65-IRES-EGFP, který se může replikovat ve více hostitelských druzích, (obrázek 3a). Plazmid exprese pQBI-CMV5-GFP obsahuje levou větev (16 %) genomu Ad5 s vypuštěním v oblasti E1 obsahující vložku hCMV5. Vektor CMV5-VEGFi65-IRES-EGFP, který se může replikovat ve více hostitelských druzích, byl transfektován společně s plazmidem pJM17 do 293 buněk konstitutivně exprimujících E1 gen. Plazmid pJM17 obsahuje adenovirový genom vyřazující oblast E3 a zahrnující vložku (pBRX) v oblasti E1 viru. Homologická rekombinace mezi CMV5-IRES-VEGFi65-GFP a pJM17 následující transfekci zaměnila oblast E1 vložku pBRX za kazetu exprese z CMV5-IRES-VEGF165-GFP. Tvorba plaku se objevila 2 až 4 týdny po společné transfekci, po níž byly jednotlivé plaky izolovány a virové extrakty z nich byly rozšířeny infikováním 293 buněk. Titr každého kmenu virů byl stanoven stanovením plaku v 293 buňkách a byly získány virové titry ~101° pfu/ml. Transgenová exprese byla potvrzena analýzou „Western immunoblotting“ infikovaného buňkami upraveného substrátu.
Vytváření pseudotypovaných retrovirových vektorů kódujících lidské VEGF a GFP: Rekombinanované retrovirové vektory kódující GFP a VEGF16s geny byly tvořeny klonováním do plazmidu pLXSN (# K1060-B Clontech, USA) ve dvou krocích. V prvním kroku byl vpraven fragment 600 bp BamHI kódující VEGF165 (přírůstkové číslo Genbank AB021 221) do místa BamHI plazmidu plRES2-EGFP (# K6029-1 Clontech). Za druhé byl klonován 2,0 kB fragment EcoRI-Munl obsahující VEGF165, IRES a EGFP do restrikčního místa EcoRí v pLXSN, výsledkem byl vektor LXSN- VEGF165-IRES-EGFP • · ···· · · ·«· · • · · · · · · · • · · · · · « · (obrázek 3b). Pro výrobu retrovirových vektorů byly ekotropní obalové buňky 293E3 přechodně transfektovány LXSN- VEGF165- EGFP. Po čtyřicetiosmi hodinách byl sebrán kal z přitékajících kultur G418 rezistentních buněk producentů, přefiltrován (0,45 pm) a použit k transdukci PA317 amfotropních obalových buněk. Transdukované PA317 buňky byly pěstovány za selekce G418 (300 mg/ml) a po čtyřicetiosmi hodinách byl sebrán kal a použit k transdukci TEFLYGA obalových buněk, které exprimují GALV vnější obal glykoproteinu, aby tvořil pseudotypovaný virus schopný transdukce EC a SMC s velkou účinností. Po selekci G418 (300 mg/ml) transdukovaných TEFLYGA buněk byly sebrané jednotlivé shluky prověřeny kvůli expresi EGFP a VEGFi65- Virové titry každého shluku byly stanoveny TE671 buněčnou transdukci a bylo zjištěno, že jsou v rozsahu od 105 do 106 pfu/ml. Byly vybrány shluky tvořící nejvyšší titr a čerstvě sebrané kaly byly použity k transdukci.
Vytváření rekombinanovaných adenovirových vektorů kódujících gen UP50: Rekombinanovaný adenovirový vektor exprimující lidský gen UP50 (získaný od Y. Shaula, Weizmann Institute) byl vytvořen podře popisu výše. Fragment 1361 bp Bglll obsahující lidskou UP50 cDNA (SEQ ID NO:1) byl vpraven do plazmidu pCA3. Plazmid pCA3 obsahující transgen byl společně transfektován s plazmidem pJM17 do 293 buněk. Homologická rekombinace mezi plazmidem exprese a pJM17 následující transfekci zaměnila oblast E1 za kazetu exprese plazmidu pCA3, čímž vytvořila vektor CMV5-UP50, který se může replikovat ve více hostitelských druzích, (obrázek 4a). Tvorba plaku se objevila 2 až 4 týdny po společné transfekci. Jednotlivé plaky byly izolovány a virové extrakty byly rozšířeny infekcí 293 buněk. Byly získány titry virových kmenů ~1011 pfu/ml. Transgenová exprese byla potvrzena „Western immunoblotting“ analýzou infikovaného buňkami upraveného substrátu.
Vytváření rekombinanovaných adenovirových vektorů kódujících jak UP50, tak GFP geny: Rekombinanovaný adenovirový vektor společně exprimující lidský gen UP50 a gen GFP byl vytvořen pomocí upraveného AdEasy zápisu (28). Fragment 1361 bp Bglll z UP50 cDNA byl za řízení promotoru CMV vpraven do místa Bglll vektoru pAdTrack-CMV, který se může replikovat ve více hostitelských druzích. Vektor, který se může replikovat ve více hostitelských druzích, kóduje GFP za řízení dalšího promotoru CMV po proudu k transgenu. Vložku obsahující vektor, který se může replikovat ve více hostitelských druzích, byl linearizován pomocí Pmel vyluhování a vyčištěn soupravou gelové extrakce Qiaquick (Qiagen, Německo). Kompetentní buňky BJ5183 byly transfektovány společně s vložku obsahujícím vektorem, který se může replikovat ve • · · 99» více hostitelských druzích, a pAdEasy-1 elektroporací a pomocí PCR a restrikční analýzou diagramu byly vybrány pozitivní klony obsahující adenovirový vektor kódující UP50-GFP (obrázek 4b). Rekombinované adenovirové plazmidy byly linearizovány PacI vyluhováním, vyčištěny a transfektovány do 293 buněk za použití Lipofectaminu 2000 (Gibco BRL, USA). Sedm dní po transfekci došlo k cytopatickému jevu a bylo zjištěno, že 100 % buněk exprimovalo GFP. Byly získány buňky a virové extrakty byly dále amplifikovány do 293 buněk. Stanovením mnohonásobným zředěním v 293 buňkách byl určen titr každého virového kmene a byly získány titry ~1011 pfu/ml. „Western immunoblotting“ analýzou infikovaného buňkami upraveného substrátu byla potvrzena exprese transgenu.
Konstrukce retrovirových vektorů pro expresi UP50 nebo společnou expresi UP50 a EGFP: Vpravením lidského fragmentu UP50 cDNA 1361 bp Bglll do BamHl místa plazmidu pLXSN (# K1060-B Clontech, USA) za řízení Mo-MULV 5' dlouhého konečného opakování (LTR) byl zkonstruován rekombinanovaný retrovirový vektor LXSN-UP50 kódující lidský gen UP50 (obrázek 4c).
Bicistronní rekombinanovaný retrovirový vektor kódující jak UP50, tak EGFP geny byl klonován do plazmidu pLXSN ve dvou krocích; za prvé, fragment 1400 bp IRES-EGFP EcoRI-Hpal odstraněný z plRES2-EGFP (Clontech, # 6029-1) byl vpraven do EcoRI-Hpal vylouhovaný pLXSN pro konstrukci řídícího plazmidu pLXSN-IRES-EGFP. Druhý krok se skládal z konstrukce pLXSN-UP50-IRES-EGFP (obrázek 4d) klonováním lidského UP50 EcoRI fragmentu (1361 bp) do místa EcoRI z pLXSN-IRES-EGFP. Genová exprese je v těchto konstrukcích řízena Mo-MULV 5‘ dlouhým konečným opakováním (LTR).
Vytváření pseudotypovaných rekombinanovaných retrovirových vektorů kódujících UP50: Pro výrobu retrovirového vektoru byl vektor pLXSN-UP50-EGFP nebo pLXSN-UP50 transfektován do 293FLYA obalových buněk za použití Lipofectaminu (Gibco BRL, USA). Po čtyřicetiosmi hodinách byl sebrán kal z přitékajících kultur virových buněk producentů, přefiltrován (0,45 pm) a přidán k 293FLY10A nebo 293 FLYGALV obalovým buňkám. Transdukované buňky byly pěstovány za selekce G418 (400 pg/ml) a jednotlivé shluky byly sebrány a prověřeny kvůli expresi EGFP pomocí inverzního fluorescenčního mikroskopu a byly prověřeny kvůli expresi UP50 „Western immunoblotting“ analýzou transdukovaného buňkami upraveného substrátu. Virové titry každého shluku byly stanoveny TE671 buněčnou transdukcí a byly získány titry 106 ffu/ml. Byl čerstvě sebrán kal ze shluků s nejvyššími titry pro transdukci EC a SMC.
• · · · • · · · • · · · • fc
Výsledky:
Tvoření virového vektoru: Vektory uvedené v tabulce 1 byly použity k transferu genů UP50 a VEGF165 do EC a SMC. Obrázky 3a, 4a a 4b adenovirové VEGFi65-GFP, UP50 a UP50-GFP vektory exprese, které byl vytvořeny a obrázky 3b, 4c a 4d zobrazují retrovirové VEGF165-GFP UP50 a UP50-GFP konstrukce exprese podle tohoto vynálezu.
Tabulka 1
| Virový systém | Řada obalových buněk | Kódovaný(é) gen(y) | Označení | Titr |
| Adenovirus | GFP | Ad. GFP | 1010 pfu/ml | |
| Adenovirus | VEGF-IRES-GFP | Ad.VEGF-GFP | 1010 pfu/ml | |
| Adenovirus | UP50-GFP | Ad.UP50-GFP | 5x1010 pfu/ml | |
| Adenovirus | UP50 | Ad.UP50 | nevyřešený | |
| Pseudotypovaný retrovirus | TEFLYGA | GFP | RetroGFP | 1Otíffu |
| Pseudotypovaný retrovirus | TEFLYGA | VEGF-IRES-GPF | RetroVEGF- GFP | 5x10bffu |
| Pseudotypovaný retrovirus | 293FLYGA | UP50-IRES-GPF | RetroUP50- GFP | 1Obffu |
| Pseudotypovaný retrovirus | 293FLY10A | UP50-IRES-GPF | RetroUPSO- GFP | 1O6ffu |
| Pseudotypovaný retrovirus | 293FLYGA | UP50 | RetroUP50 | 1Otíffu |
Příklad 3
Exprese proendotelializačních faktorů v cévních buňkách využitá k osévání umělých cévních štěpů
Stále roste potřeba syntetických štěpů, které mají biokompatibilní povrchy a vysokou trvalou míru průchodnosti. Použití syntetických PTFE štěpů získalo popularitu díky biokompatibilitě samotné a díky své trvanlivosti. Trvanlivost a funkčnost • · • · β ·· ·
syntetických štěpů může být zvýšena potažením luminálních povrchů EC. Takové buňky tvoří optimální biokompatibilní povrch, poskytují dlouhodobou ochranu před trombózou díky své trombolitické kapacitě (11, 12) a předcházejí neointimální proliferaci a zánětlivé reakci v syntetických štěpech (13).
Efektním přístupem k optimalizaci endotelializace osetých umělých štěpů je použití geneticky upravených cévních buněk přeexprimujících proendotelializační faktory. Proto byly cévní buňky geneticky upraveny, aby přeexprimovaly tyto faktory, jak je popsáno dále, aby bylo zrychleno osévání cévních štěpů a maximalizována poimplantační proliferace vysévaných buněk, což vede k maximálnímu potažení syntetických cévních luminálních povrchů cévními buňkami.
Tkáňová kultura primárních lidských cévních buněk:
Materiály a metody:
Lidské EC (HSVEC) z povrchové žíly v noze byly získány vyluhováním kolagenázou z 5 cm dlouhých částí lidské povrchové žíly v noze, jak bylo dříve popsáno (29). Izolované HSVEC byly pěstovány na želetinou potažených miskách obsahujících substrát M199 (Gibco BRL, USA) s přídavkem 20% shromážděného lidského séra, 2 mM L-glutaminu (Biological Industries, Izrael), 100 jedn./ml penicilinu (Biological Industries, Izrael) a 0,1 mg/ml streptomycinu (Biological Industries, Izrael), 100 yg/ml heparinu (Sigma, USA) a 2 ng/ml bFGF (laskavě obdržen od prof. Neufelda). Buňky z částí 3 až 9 byly sebrány, aby se zajistila fenotypická stabilita, která byla monitorována imunohistochemickou detekcí von Willebrandova faktoru (Zymed, USA). Lidské SMC (HSVSMC) z povrchové žíly v noze byly pěstovány explantovaným produktem z lidských povrchových žil v noze a levých vnitřních savčích tepen (HLSMC). Buňky byly pěstovány v „Dulbecco’s Modified Eagles“ substrátu (DMEM) (Gibco BRL, USA) s přídavkem 10% shromážděného lidského séra, 2 mM L-glutaminu, 100 jedn./ml penicilinu, 0,1 mg/ml streptomycinu a 2 ng/ml bFGF. SMC byly identifikovány imunohistochemickou analýzou za použití specifických protilátek proti a-aktinu hladkého svalstva (Zymed, USA).
Tkáňová kultura buněčných řad:
Řady obalových buněk 293-FLYA, 293-FLY10A, 293-FLYGALV a TEFLYGA (získané od Dr. F. L. Cosset-Liona, Francie) byly pěstovány v DMEM s přídavkem 10% FCS (Biological Industries, Izrael), 2 mM L-glutaminu, 100 jedn./ml penicilinu, 0,1 mg/ml streptomycinu, 6 yg/ml blasticidinu (Sigma, USA) a 6 yg/ml phleomycinu (Sigma, USA).
• · · · · · · ···· «···
Zí.Z · · < · · ·· « · « ·
Řady obalových buněk PA317, 293E3 (získané od Dr. J. Exelroda, Haddasa, Jeruzalém) byly pěstovány v DMEM s přídavkem 10% FCS, 2 mM L-glutaminu, 100 jedn./ml penicilinu a 0,1 mg/ml streptomycinu.
Infikování EC a cévních SMC rekombinovanými adenovirovými vektory:
Materiály a metody:
Endoteliální buňky a SMC byly infikovány rekombinovanými adenovirovými vektory následovně: buňky byly vysévány při 70% splývání na fibronektinem (Sigma, USA) předem potažené misky (4,5 pg/ml) 20 hodin před infekcí a kultivovány na úplný substrát (M20). V den infikování byl kultivovaný substrát zaměněn za čerstvý substrát M199 bez séra a za několikanásobného infikování (MOI) 3000 (t. j. za použití 3000 virových částic na buňku) byl přidán rekombinovaný virus. Buňky byly s jemným nakláněním každých 20 minut po 90 minut inkubovány, potom byl virus obsahující substrát zaměněn za úplný substrát (M20). Rychlost infikování byla monitorována znázorněním GFP exprese pomocí inverzního fluorescenčního mikroskopu (TE200 Nikon, Japonsko) vybaveného fluorescenčním GFP filtrem (GFP-LP, Nikon).
Transdukce EC a SMC rekombinovanými retrovirovými vektory:
Materiály a metody:
Transdukce EC a SMC retrovirovými vektory byla učiněna následovně: EC nebo SMC (část 4 až 9) byly vysévány ze zdroje 105 buněk/35mm jamku do misek potažených (4,5 pg/ml) fibronektinem a po 24 hodin pěstovány na úplný substrát. Buňky byly hodinu před transdukcí předem upraveny záměnou kultivovaného substrátu za substrát M199 bez séra obsahující 0,1 mg/ml DEAE-dextran (Sigma, USA). Po předchozí úpravě byly buňky třikrát vymyty solným roztokem fosfátového pufru (PBS). Transdukce byla provedena čtyřhodinovou inkubací buněk s čerstvě sebraným a odfiltrovaným (0,45 pl) kalem od virus tvořících obalových buněk. Na konci inkubace byl virus obsahující substrát zaměněn za substrát M20.
Příklad 4
Vysévání EC na PTFE štěpy
Materiály a metody:
Lidské EC byly za 50% až 60% splývání vysévány 20 hodin před transdukcí. Buňky byly transdukovány, jak bylo popsáno dříve, retrovirovými vektory kódujícími GFP nebo UP50-GFP a následně po selekci (300 pg/ml), aby byla získán a populace «· Φ··· φ · • · · · φ · φ φ homogenních buněk, byly použity k vysévání na štěpy. Buňky byly vysévány (2 x 105 buněk/cm2) na fibronektinem (4,5 pg/ml) předem potažené PTFE štěpy. Proces vysévání byl prováděn ve vodorovně rotujícím zařízení, při 45 otáčkách/hodinu, po 4 hodiny při 37 °C, po čemž byly oseté štěpy umístěny do substrátu M199 obsahujícím 200 jednotek/ml penicilinu a 0,2 mg/ml streptomycinu. Účinnost osetí štěpu byla vyhodnocena detekcí GFP produkce vysévaných buněk fluorescenční mikroskopií.
Výsledky:
Exprese Lac Z a VEGF-GFP v lidských EC přeměněných virovými vektory a vysévaných na syntetické cévní štěpy: Bylo zjištěno, že PTFE štěpy oseté lidskými EC infikovanými Ad.LacZ exprimují β-galaktosidázu (obrázek 5a), jak bylo stanoveno pomocí X-gal kolorimetrií. Bylo zjištěno, že štěpy oseté lidskými EC infikovanými Ad.VEGF-GFP exprimují transgen, jak bylo stanoveno pomocí detekce GFP exprimujících buněk fluorescenční mikroskopií (obrázek 5b). Transgenová exprese byla analyzována 24 hodin po infekci.
Bylo zjištěno, že PTFE štěpy s lidskými EC infikovanými retrovirovým vektorem TGA, kódujícím na jádro cílené LacZ (laskavý dar F. Cosseta), exprimují β-galaktosidázu (obrázek 6a), jak bylo stanoveno pomocí X-gal kolorimetrií. Bylo zjištěno, že Štěpy s lidskými EC infikovanými retroVEGF-GFP, exprimují transgen, jak bylo stanoveno pomocí detekce GFP exprimujících buněk fluorescenční mikroskopií (obrázek 6b). Transgenová exprese byla analyzována 24 hodin po infikování.
Tyto výsledky tedy ukázaly kapacitu adenovirových a retrovirových vektorů tohoto vynálezu řídit expresi transgenů, například proendotelializační faktor VEGF, v primárních lidských EC vysetých na umělý štěp.
Příklad 5
Infikování progenitorové buňky kostní dřeně VEGF kódujícími vektory
Materiály a metody:
Progenitorové buňky kostní dřeně jsou získány dle dřívějšího popisu (17, 30) a infikovány rekombinovanými adenovirovými vektory kódujícími VEGF-GFP. Diferenciace je monitorována v infikovaných buňkách morfologickou analýzou a pomocí imunohistochemické detekce von Willebrandova faktoru.
··» ···««··»
Ji · · * · * ♦ · n · · ·
Příklad 6
Řízení genové exprese po vysévání
Materiály a metody:
Efektorem ovladatelný systém exprese je využit, aby řídil expresi transgenu, například VEGF a UP50, v EC. Například tetracyklin je použit k řízení VEGF exprese směrem dolů a UP50 exprese směrem nahoru tak, že exprimuje tyto proteiny za regulačního řízení promotorů, které jsou řízeny směrem nahoru nebo naopak dolů tetracyklinem. V takovém systému exprimují vyseté buňky jeden protein, například VEGF, v prvním týdnu, když je proliferace buněk třeba, zatímco použití tetracyklinu jeden týden po operaci řídí expresi VEGF směrem dolů a UP50 expresi směrem nahoru, čímž zvyšuje adhezi buněk ke štěpu. (31).
Analýza rekombinované proteinové exprese: Hladiny proteinu VEGF jsou vyhodnoceny pomocí ELISA za dobu dvacetčtyři hodin v osetém kalu upraveného štěpu. Podobné metody byly použity k měření hladin proteinu UP50.
Příklad 7
Kvantitativní morfometrie endoteliální buňky
Materiály a metody:
Na konci inkubační doby jsou štěpy podélně rozříznuty, vyšetřeny pod fluorescenčním mikroskopem, vyfotografovány a obrazy zpracovány obrazovým analytickým zařízením (Image pro Plus, Media cybernetics USA).
Příklad 8
Měření t-PA a urokinázy
Materiály a metody:
Hladina a aktivita t-PA jsou měřeny v kalu sebraném z osetých štěpů. Hladiny t-PA a urokinázy jsou testovány pomocí ELISA, zatímco aktivita t-PA je měřena podle dřívějšího popisu (32).
·· ···* ·· · · ····
Příklad 9
Opětovné získání buněk ze štěpů
Materiály a metody:
Buňky jsou opětovně získány z PTFE štěpů louhováním EDTA-trypsinem. Buňky jsou po louhování spočteny a znovu umístěny do nádoby s tkáňovou kulturou předem potaženou fibronektinem, aby byla stanovena životaschopnost. Je zaznamenáván čas od pokrytí k úplnému splynutí. V buňkách transdukovaných pseudotypovanými retrovirovými vektory je monitorována exprese VEGF a UP50 pomocí ELISA a jiných metod popsaných v tomto vynálezu.
Příklad 10
Detekce transgenové exprese v geneticky upravených cévních buňkách
Materiály a metody:
RT-PCR analýza UP50 mRNA transkripce: Celková RNA byla izolována z EC a SMC 48 hodin po transformaci pomocí UP50-kóduj ících adenovirových a retrovirových vektorů za použití izolační soupravy PURESCRIPT RNA (Gentra systems, USA) a byla spočítána koncentrace RNA z absorbance při 260 nm.
Pro syntézu cDNA byl smíchán 1 pg RNA s 500 ng libovolných hexamerů, směs byla zahřívána 10 minut při 70 °C a pak ochlazena na led. Reakční směs obsahovala 0,4 mM dNTPs, 5 jednotek AMV-reverzní transkriptázy (RT) (Promega), 5 mM DTT, 32 jednotek RNAse-out (Gibco BRL) a k předehřáté RNA byl přidán RT pufr (Promega). Reakční směs byla 2 hodiny inkubována při 38 °C a následně 15 minut při 95 °C. PCR reakce byla prováděna v objemu 50 μΙ s 7 pl reakční směsi, 20 pmoly sense primeru: 5‘-GAAGATCTTGACATGCCAGGAATAAAAAGGATACTC-3‘ (SEQ ID NO:2), 20 pmoly antisense primeru:
5‘-GAAGATCTTCAGAATGGGTACTGCGACACATATATCCGCAGTCG-3‘ (SEQ ID NO:3), 240 mmoly dNTPs, 1U Ex-Tag DNA polymerázou (Takara, Japonsko) a reakčním pufrem poskytnutým výrobcem. PCR reakce byly prováděna inkubací 2 minuty při 94 °C následované 10 cykly: 94 °C/30 sekund -> 50 °C/30 sekund -> 72 °C/60 sekund. Toto bylo následováno 21 cykly: 94 °C/30 sekund -> 60 °C/30 sekund -> 72 °C/60 sekund + 5 sekund/cyklus -> 72 °C/10 min. Produkty RT-PCR byly anylyzovány elektroforézou v 1 % gelu agarózy.
·· ·♦·· • · ···*
„Western immunoblot“ analýza exprese UP50 a VEGF proteinů:
Exprese UP50 a VEGF proteinů adenovirově nebo retrovirově přeměněnými EC a SMC byla zjištěna „Western immunoblot“ analýzou substrátu upraveného přeměněnými buňkami. Kultivační substrát byl 24 hodin po přeměně zaměněn za bezsérový substrát a buňky byly kultivovány po dalších 24 hodin. Vzorky substrátu upraveného přeměněnými buňkami (CM) (30 μΙ) byly separovány v 10% SDS gelu polyakrylamidu elektroforézou za redukčních podmínek. Separovaný protein byl elektroblotován na nitrocelulózovou membránu (Schleicher & Schuell). Skvrny byly při pokojové teplotě po jednu hodinu blokovány inkubačním tlumícím roztokem (TBS obsahující 0,1 % sbíraného mléka a 0,3 % Tween-20 (TBST) za jemného třepání. Potom byly při pokojové teplotě po dvě hodiny skvrny inkubovány primární protilátkou rozpuštěnou v tlumícím roztoku. Ke zjištění UP50 byla použita spřízněná čištěná polyklonální králičí anti-UP50 protilátka (#9855, vyrobená na zakázku, Sigma, Izrael) (1 : 5000) a polyklonální králičí anti-VEGFi65 protilátka (#SC 152 Santa Cruz, USA) (1 : 700) byla použita ke zjištění VEGF.
Po inkubaci primární protilátkou byly skvrny po dobu jedné hodiny při pkojové teplotě třikrát vymývány TBST a inkubovány protikráličí peroxidázou konjugovanou sekundární protilátkou (Sigma, USA) zředěnou TBST. Po třech vymytích TBST byl vyvoláním skvrn pomocí ECI činidel (Sigma, USA) a vystavením rentgenovému filmu zobrazen specifický protein.
Imunohistochemická analýza exprese UP50: Adenovirově infikované EC a SMC byly vysévány na komorová mikroskopická sklíčka (Lab-Tek, USA) předem potažená fibronektinem (4,5 pg/ml) a kultivovány po 24 hodin. Buňky byly inkubací při pokojové teplotě po 20 minut v 4% paraformaldehydu následovanou dvěma promytími PBS zajištěny 48 hodin po adenovirovém infikování. Buňky pak byly denaturovány zahříváním mikroskopických sklíček 5 minut v mikrovlně troubě v 1mm EDTA pH 8,0. Vzorky byly blokovány pomocí tlumícího roztoku dodávaným se soupravou Histostain Plus (Zymed, USA) podle návodu výrobce. Po blokování byly buňky po jednu hodinu při pokojové teplotě inkubovány se spřízněnou čištěnou anti-UP50 (1 : 50). Vzorky byly třikrát promývány PBS-T (PBS obsahující 0,3% Tween-20) a inkubovány rhodaminem konjugovanou kozí protikráličí IgG protilátkou (#SC 2091, Santa Cruz, USA) zředěnou 1 : 400 in PBS-T po dobu jedné hodiny. Buňky byly třikrát promývány v PBS-T a pokryty podpůrným substrátem (H-1000, Vector laboratories, USA). Vzorky pak byly zobrazeny ·· AAAA • · • A · A pomocí fluorescenční skenovací konfokální (MRC-1024, BíoRad) mikroskopické detekce GFP a rhodaminu v buňkách.
Pro imunohistochemickou analýzu UP50 v ECM byly indukovány endoteliální buňky infikované rekombinovaným adenovirovým vektorem kódujícím UP50 gen, aby byly vytvořeny přidáním dextranu k vegetačnímu substrátu ECM. Po denudaci vrstvy EC pomocí 20mM roztoku Na-tOH, byly ECM podrobeny imunologickému barvení založeném na rhodaminu pomocí anti-UP50 protilátky.
Výsledky:
Anlýza exprese UP50 v EC SMC: Infikování EC a SMC rekombinovaným adenovirem kódujícím UP50-GFP mělo za výsledek transgenovou expresi (obrázky 7b a, eventuálně, 7d), jak bylo zjištěno zobrazením GFP. Transdukce EC a SMC retrovirovým vektorem kódujícím UP50-GFP podobně zjistila tvorbu proteinu GFP (obrázky 8b a 8d).
Transkripce UP50 mRNA byla zjištěna RT-PCR analýzou v Ad.UP50-GFP infikovaných EC a SMC (obrázky 9a a 9b, v tomto pořadí) a v EC a SMC geneticky upravených retrovirovým vektorem kódujícím UP50-GFP (obrázky 10a a, eventuálně, 10b).
Exprese proteinu UP50 (60 kD) byla stanovena analýzou „Western immunoblotting“ následující infikování EC a SMC adenovirovými (obrázek 11) a retrovirovými (obrázek 12) vektory kódujícími UP50-GFP.
Protein UP50 byl stanoven v Ad.UP50 infikovaných EC a SMC, jak bylo zjištěno imunohistochemií (obrázky 13b a, eventuálně, 13d). Cytoplazmatické zabarvování bylo stanoveno v Ad.UP50-GFP infikovaných buňkách, zatímco žádné zabarvování nemohlo být stanoveno v Ad.GFP infikovaných buňkách, čímž prokázalo velkou úroveň cytoplazmatické exprese UP50. K analýze umístění dílčích buněk UP50 v infikovaných EC byla použita konfokální mikroskopie. Exprese proteinu UP50 byla stanovena v Ad.UP50-GFP infikovaných endoteliálních buňkách v cytoplazmě a v buněčné membráně (obrázky 14b a14c) a byla stanovena jako vláknité struktury ve splývavých buňkách (obrázek 14b). Cytoplazmatické vláknitá exprese UP50 v nesplývavých buňkách znamená, že UP50 může být spojena s buněčným skeletem a může mít úlohu v interakcích buňka - buňka nebo buňka - ECM.
Přítomnost proteinu UP50 v ECM vytvořených EC infikovanými adenovirovým vektorem kódujícím UP50-GFP byla stanovena imunohistochemickou analýzou (obrázek 15).
·· 4444 • · · 4
·· 4444
Tyto výsledky tedy ukazují, že retrovirové a adenovirové vektory exprese tohoto vynálezu jsou schopné indukovat expresi faktoru buněčné adheze UP50 v cévních buňkách. Proto byly EC a SMC tyto konstrukce exprimující použity ve funkční analýze, která se snažila dokázat schopnost cévních buněk exprimujících UP50 vytvářet zdokonalené syntetické cévní štěpy, jsou-li na ně vysety.
Příklad 11
Exprese proteinů UP50 a VEGF společnou kulturou adenovirové infikovaných EC a SMC
Materiály a metody:
Společné kultury adenovirové infikovaných EC nebo směsných kultur adenovirové infikovaných EC a SMC byly po infikování 24 hodin kultivovány v substrátu s přídavkem séra a byly dále kultivovány v substrátu bez séra po dalších 24 hodin. Kalové proteiny byly elektroforeticky separovány v 10% SDS polyakrylamidovém gelu a separované proteiny byly přeneseny elektroblotem na nitrocelulózové membrány. Skvrny byly inkubovány s protilátkami anti-VEGF a anti-UP50. Po vystavení peroxidázou konjugované sekundární protilátce byly skvrny vyvolány ECL činidly a vystaveny rentgenovému filmu.
Výsledky:
Společné kultury infikovaných Ad.UP50-GFP a buď EC, nebo SMC infikovaných Ad.UP50-GFP prokázaly expresi podobných hladin VEGF a UP50 (obrázky 16a a, eventuálně, 16b).
Tyto výsledky dokázaly schopnost způsobu tohoto vynálezu vytvářet společně EC mitogeny VEGF a EC faktor adheze UP50 a dále vytvářet tyto proteiny společnými kulturami geneticky upravených EC a SMC. Tak poskytuje tento vynález zlepšený způsob vysévání endotelu na umělé cévní štěpy.
„Western immunoblotting“ analýza exprese proteinu VEGF a UP50 společnými kulturami retrovirové infikovaných EC a SMC:
Materiály a metody:
Společné kultury EC infikované různými retroviry nebo směsnými kulturami infikovaných EC a SMC byly po infikování kultivovány 24 hodin v substrátu s přídavkem séra a poté byly buňky kultivovány v substrátu bez séra po dalších 24 hodin. Vzorky vegetačního substrátu (30 μΙ) byly separovány na 10% SDS polyakrylamidovém gelu a ·· ····
přeneseny elektroblotem na nitrocelulózovou membránu. Skvrny byly inkubovány buď s protilátkami anti-VEGF, nebo anti-UP50. Po vystavení peroxidázou konjugované sekundární protilátce byly skvrny vyvolány ECL činidly a vystaveny rentgenovému filmu.
Výsledky:
Analýza společných kultur SMC a EC retrovirově infikovaných, aby exprimovaly UP50 nebo VEGF prokázala společnou expresi UP50 a VEGF proteinu, jak určila „Western immunoblotting“ analýza (obrázky 17a a 17b).
Tyto výsledky a výsledky popsané dříve používající adenovirové vektory tedy dokázaly, že vektory virové exprese tohoto vynálezu mohou účinně řídit expresi VEGF a UP50 proteinů. Tyto výsledky dále dokazují, že jak VEGF, tak UP50 mohou být přeexprimovány ve společné kultuře cévních buněk geneticky upravených buď retrovirovými, nebo adenovirovými vektory. Tak je použití adenovirových a retrovirových vektorů exprese tohoto vynálezu a použití směsných kultur geneticky upravených cévních buněk exprimujících jak mitogenní, tak adhezi indukující molekuly velmi vhodné k výrobě syntetických cévních štěpů majících dlouhodobou trvanlivost a průchodnost.
Příklad 12
Funkční analýza přeexprimovaného rekombinovaného VEGF a UP50 v cévních buňkách
Rozbory proliferace EC:
Materiály a metody:
Endoteliální buňky (části 5 až 11) byly vysévány při 30% splývání (104 buněk/jamku) do misek se 24 jamkami předem potažených 4,5 yg/ml fibronektinem 24 hodin před infikováním adenoviry. Buňky byly infikovány Ad.UP50-GFP, Ad. GFP nebo Ad.VEGFi65-GFP. Po devadesáti minutovému vystavení adenovirovým vektorům při 37 °C byl přidán sérum obsahující substrát a 16 až 18 hodin později byl substrát nahrazen substrátem M199 obsahujícím 2% lidské sérum a 2 ng/ml bFGF. Rozbory byly vyhotoveny třikrát a proliferace byly měřena pomocí XTT kolorimetrického stanovení sedmý den po infikování.
Výsledky:
Infikování vytvořilo téměř 100 % buněk exprimujících transgen, jak bylo zjištěno cytoplazmickou GFP expresí. Výsledky jsou prezentovány jako relativní hodnoty vzhledem k neinfikovaným buňkám. Jak je ukázáno na obrázku 18, nemá transgenová ·· ···· • · ···· 'yr-j · · · « · · · ···» přeexprese UP50 žádný inhibující nebo proliferační vliv na rychlost růstu buněk. Ačkoliv byly hodnoty změřené ve skupinách infikovaných adenoviry (Ad. GFP, Ad.UP50-GFP) trochu vyšší než neinfikovaná kontrolní skupina, vliv exprese UP50 nebyl významný. Nebyl žádný významný rozdíl mezi EC infikovanými Ad. GFP a EC infikovanými Ad.UP50-GFP. Infikování Ad.VEGF16s-GFP indukovalo ve srovnání s jinými infikovanými EC skupinami významnou proliferaci.
Adheze EC k ECM vytvořená pomocí UP50 přeexprimující EC:
Materiály a metody:
Indukce tvorby ECM pomocí EC: EC byly vysévány do misek se čtyřicetiosmi jamkami (104 buněk/jamku) předem potažených fibronektinem 24 hodin před infikováním. Buňky byly infikovány Ad.UP50-GFP nebo Ad. GFP, jak bylo popsáno dříve. Po infikování byly buňky po sedm dní pěstovány v substrátu M20 doplněném 4% dextranem 42 000 (Sigma USA). Po tomto období infikování byl pěstovaný substrát z infikovaných buněk odsát a matrix tvořící buňky byly obnaženy přidáním 20 mM NH4OH po přibližně 5 minut. Po buněčné lyži byly ECM potažené buňky třikrát promyty PBS a uloženy v PBS při 4 °C.
Stanovení adheze extracelulární matrix bylo učiněno následovně: EC byly odděleny inkubací v 10 mM EDTA roztoku, matrix byla vymyta substrátem M199 a inkubována v CM z Ad.UP50-GFP nebo Ad. GFP infikovaných nebo, po případě, z neinfikovaných EC po 15 minut. Po této inkubaci byly EC vysety do ECM potažených jamek (2x104 buněk na jamku). Buňky vyseté na ECM vytvořenou Ad.UP50-GFP infikovanými EC byly inkubovány v CM sebrané z Ad.GFP infikovaných buněk a kontrolní skupina buněk vysetých na ECM vytvořené neinfikovanými buňkami byla inkubována neinfikovaným buňkami upraveným substrátem. Buňky byly infikovány po dalších 30 minut, aby byla umožněna adheze buněk a pak byly promyty PBS. Kvantitativní analýza zbývajících adherentních buněk byly udělána pomocí XTT kolorimetrického stanovení.
Podobné pokusy byly učiněny za použití ECM vytvořené z retroUp50-GFP transdukovaných EC.
Účinky UP50 na buněčnou fyziologii a společné kultury: Předpokládalo se, že byla společná exprese UP50 a VEGF realizovatelná. Proto byly společné kultury infikovaných EC, aby exprimovaly buď VEGF, nebo UP50, testovány na úroveň exprese obou proteinů následující míšení Ad.VEGF-GFP buněk infikovaných pomocí Ad.UP50-GFP infikovaných EC, jak je popsáno dále.
φφ φφφφ • · φφφφ ··· ·φ·φ φφφφ · · · φ» φφ φφ
Endoteliální buňky transdukované retrovirovým vektorem kódujícím UP50-GFP, GFP nebo kontrolní netransdukované buňky byly infikovány 48 hodin před adenovirovým infikováním. Infikování bylo provedeno Ad.VEGF-GFP nebo Ad, GFP. Buňky byly po 24 hodin inkubovány v substrátu obsahujícím virus, po čemž byl substrát zaměněn za bezsérový substrát a buňky byly inkubovány po dalších 48 hodin. Vzorky kultivačního media (30 μ!) byly separovány v 10% gelu polyakrylamidu, separované proteiny byly elektroblotem přeneseny na nitrocelulózovou membránu a skvrny byly inkubovány bud anti-VEGF, nebo anti-UP50 protilátkami. Po vystavení vlivu peroxidázou konjugované sekundární protilátky byly skvrny vyvolány ECL činidly a exponovány na rentgenový film.
Výsledky:
Analýza UP50 a VEGF exprese EC geneticky upravenými následně retrovirovými a adenovirovými vektory: Endoteliální buňky retrovirově transdukované, aby exprimovaly UP50-GFP a následně infikované adenovirovým vektorem kódujícím VEGF-GFP ukázaly vyšší úroveň GFP exprese, než buňky infikované retrovirovým vektorem kódujícím pouze UP50-GFP, jak bylo stanoveno fluorescenční mikroskopií (obrázky 19b a, eventuálně, 19a).
„Western immunoblotting“ analýza EC retrovirově transdukovaných, aby exprimovaly UP50 a následně infikovaných adenovirovým vektorem kódujícím VEGF geny ukázaly, že takové buňky mohou společně exprimovat VEGF a UP50 proteiny (obrázky 20a a, eventuálně, 20b).
Tyto výsledky tak ukázaly, že následná retrovirová transdukce a adenovirové infikování EC, aby společně exprimovaly jak EC mitogenní, tak, případně, adhezi idukující proteiny VEGF a UP50, je velmi vhodná k přípravě syntetických cévních štěpů majících dlouhou trvanlivost a průchodnost. Použitelnost takových zdvojených virových genetických modifikací EC je také podporována vzrůstající hladinou GFP jimi vytvořených, jak bylo pojednáno dříve.
Vliv UP50 na růst EC v trojrozměrné kultuře kolagenu - in vitro angiogeneze: Osévání syntetických cévních štěpů EC přeexprimujícími mitogenní a proadhezní faktory VEGF a, případně, UP50, je velmi žádoucí pro přípravu syntetických cévních štěpů s dlouhou trvanlivostí a průchodností. Proto byly kombinované vlivy těchto faktorů na indukci proliferace EC prověřovány následovně.
Materiály a metody:
·· ···· ·* *·«· • · 9 99 9 ··· · * · · ···· • · · ·· 9 9 9 9 9 9
In vitro angiogeneze v kolagenových gelech byla kvantitativně vyjádřena pomocí adenovirem infikovaných EC sféroidů. Příprava EC sféroidů byla provedena, jak popsáno dříve (33). Endoteliální buňky byly suspendovány v kultivačním substrátu obsahujícím 0,25% (hmotn./obj.) karboxymethylcelulózu a kultivovány po 24 hodin v miskách ošetřených netkáňovou kulturou s 96 jamkami s kulatým dnem (Nunc, Dánsko) při 37 °C, 5% CO2, v této době suspendované buňky vytvořily jediný sféroid na jamku, definované velikosti a čísla buňky (-750 buněk/sféroid). Takto vyrobené sféroidy pak byly vsazeny do kolagenových gelů. Kolagenový kmenový roztok byl před použitím připraven smícháním osmi objemových množství kyselého kolagenového extraktu z krysího ocasu (vyváženém na 2 mg/ml, 4 °C) a jednoho objemového množství 10x M199 (Gibco BRL, USA). Přidáním 0,34 N NaOH bylo pH upraveno na 7,4. Aby se předešlo usazování sféroidů před polymerizací kolagenového gelu, bylo 1 objemové množství kolagenového kmenového roztoku smícháno s 1 objemovým množstvím substrátu M199 pokojové teploty obsahujícího 40% lidské sérum a 0,5% (hmotn./obj.) karboxymethylcelulózy. Sféroidy obsahující gely byly rychle přeneseny do předehřátých dvacetičtyř jamkových misek a ponechány polymerizovat. Gely byly inkubovány při 37 °C 5% CO2 a mikrofotografií pomocí digitálního videa (DXM1200 Nikon, Japonsko) byla zaznamenávána proliferace EC v gelech. Byl analyzován růst alespoň 40 sféroidů z každé skupiny.
Výsledky:
Bylo zjištěno, že sféroidy Ad.-GFP nebo Ad.UP50-GFP infikované EC (obrázky 21b a, eventuálně, 21f) mají nízkou základní růstovou aktivitu, která byla silně stimulována přidáním exogenního VEGF (obrázky 21 d a, eventuálně, 21 h). Bylo zjištěno, že sféroidy Ad.UP50-GFP infikované EC (obrázek 21f) mají vyšší základní růstovou aktivitu než sféroidy Ad.-GFP infikované EC (obrázek 21b). Bylo zjištěno, že sféroidy Ad.-GFP a Ad.-GFP + Ad.UP50-GFP infikované EC (obrázky 22b a, eventuálně, 22f) mají nízkou základní růstovou aktivitu, která byla stimulována v 50% společných kulturách s Ad.GFP a Ad.VEGF infikovaných EC (obrázky 22d a, eventuálně, 22h). Nejvyšší hladiny růstu byly pozorovány ve společné kultuře Ad.UP50-GFP a Ad.VEGF-GFP infikovaných EC (obrázek 22h). Můžeme proto usoudit, že společná přeexprese UP50 s VEGF vede k synergickému vzrůstání růstu EC ve srovnání s růstem sprostředkovaným pouze VEGF.
Tyto výsledky tedy ukazují, že doprovodná společná přeexprese UP50 s VEGF v
EC je velmi vhodná k výrobě syntetických cévních štěpů s dlouhou trvanlivostí a ·· «··· «* totolt ·« ···· • · ··· ··· · • · · ·♦· · · · ··· to···*···* ·· * ·· ·♦ ·· »· průchodností, protože EC exprimující takovou kombinaci faktorů vykazují velice zvýšenou proliferační kapacitu.
Příklad 13
Vliv přeexprese UP50 na adhezi EC k syntetickým štěpům in vitro
Syntetické cévní štěpy oseté EC mající zvýšenou charakteristiku adheze jsou velmi žádoucí, protože hlavním problémem dosavadní techniky EC osetých štěpů je, že štěpy účinně nezadrží vyseté buňky. Tedy účinnost přeexprimování EC proadhezivního faktoru UP50, aby zvýšil adhezivitu EC byla zkoumána podle popisu dále.
Vliv přeexprese UP50 na adhezi in vitro kultivovaných EC po trypsinizaci: Materiály a metody:
Biologická aktivita UP50 v Ad.UP50-GFP infikovaných EC byla zkoušena rychlostí buněčné retence po trypsinizaci. Endoteliální buňky byly vysety při 70% až 80% splývání (6 až 7,5x104 buněk/jamku) do 12jamkových misek, 24 hodin před adenovirovým infikováním. Buňky byly infikovány (3x103 pfu na buňku), jak bylo popsáno dříve, Ad.UP50-GFP nebo Ad.GFP a neinfikované buňky sloužily jako kontrolní. Po infikování byly buňky pěstovány čtyři dny v M20 substrátu. Buňky byly promyty PBS a stanovení adheze bylo provedeno trypsinizaci buněk pomocí 0,0025% trypsinu obsahujícím 0,001% EDTA. Po třech minutách inkubace při pokojové teplotě byl trypsin neutralizován přidáním kompletního substrátu (M20). Buňky byly třikrát promyty PBS a pak byl substrát M20 (300 μΙ) přidán k buňkám. Kvantitativní množství zbývajících adherenčních buněk , jako procento kontrolních netrypsinizovaných buněk, bylo určeno pomocí kolorimetrického XTTstanovení.
Výsledky:
Exprese UP50 následující rekombinační adenovirové infikování významně zvýšila retenci buněk (60 %) ve srovnání s Ad.GFP infikovanými buňkami (40 %) nebo kontrolními, neinfikovanýi buňkami (20 %) (obrázek 23).
Vliv přeexprese UP50 na adhezi buněk k ECM:
Materiály a metody:
EC byly odděleny roztokem 10mM EDTA, promyty substrátem M199 obsahujícím 0,1% BSA (Sigma, USA), 10mM HEPES a inkubovány s CM z Ad.UP50-GFP nebo Ad.GFP infikovaných nebo, eventuálně, neinfikovaných EC, po 15 minut. Po inkubaci byly buňky vysety na ECM potažené jamky (2x104 buněk na jamku). Buňky vyseté na
4444 « * < · a · • * 444 ·
ECM vytvořené Ad.UP50-GFP infikovanými EC, byly inkubovány v CM z Ad.UP50-GFP infikovaných buněk. Buňky vyseté na ECM vytvořené Ad. GFP infikovanými buňkami byly inkubovány s CM sebraným z Ad. GFP infikovaných buněk a kontrolní skupina buněk vysetá na ECM vytvořené neinfikovanými buňkami byla inkubována s neinfikovaným buňkami upraveným substrátem. Buňky byly inkubovány po dalších 30 minut, aby byly umožněna adheze buněk, pak byly promyty PBS. Kvantitativní množství zbývajících adherenčních buněk bylo určeno pomocí kolorimetrického XTT stanovení.
Výsledky:
Vystavení vylučovaným UP50 a ECM vázaným UP50, dříve ukázané (obrázek 15), mělo za následek >30 % vyšší adhezi EC ve srovnání s kontrolní skupinou (obrázek 24).
Vliv přeexprese UP50 na retencí EC za plynulého smykového napětí: Adhezi podporující aktivita UP50 na EC byla zkoušena buněčnou retencí za plynulého smykového napětí způsobenou třepáním kultivačních misek na kývavém stole, jak je popsáno dále.
Materiály a metody:
Lidské EC z povrchové žíly na noze (část 80 až 11) byly vysety (105 buněk na 35 mm jamku (a pěstovány v M20 až do 60% až 80% splývání. Buňky byly infikovány Ad.UP50-GFP nebo Ad.GFP (MOI 3000), jak bylo popsáno dříve a neinfikované buňky byly použity jako kontrolní. Buňky byly pěstovány po dalších 30 hodin, aby byla zaručena transgenová exprese před tím, než budou vystaveny smykovému napětí. Před pokusem byly 2 jamky z každé skupiny (Ad.UP50-GFP, Ad.GFP, kontrolní) sklizeny a buňky byly spočítány. Aby byly buňky zcela pokryty, bylo během kývání přidáno do každé jamky 5 ml substrátu M20. Misky byly umístěny na kývavý stůl do CO2 inkubátoru a inkubovány za intenzivního kývání (přibližně 140 cyklů/minutu) po dobu 20 až 24 hodin. Po kývání byly buňky pětkrát vymyty PBS. Buňky byly získány pomocí trypsin-EDTA a byly spočítány hemacytometrem. Stanovení bylo samostatně paralelně provedeno s buňkami transdukovanými retrovirovými vektory.
Výsledky:
Výsledky předložené na obrázku 25a až g (morfometrie) a obrázku 25h (sčítání buněk) ukazují, že přeexprese UP50 retrovirovou transdukcí indukuje zvýšenou adherenci EC vystavených stálému smykovému napětí. Bylo shledáno, že v UP50 exprimujících buňkách 98 % buněk zůstává lnout k misce ve srovnání s GFP ·· ···· • fl «·«>· flfl ····
II* ··· ··«· » • · ♦ ···· ···· • · · fl* flfl · · ·· exprimujícími (72 % +1 %) a netransdukovanými EC (69 + 2 %). Podobné výsledky byly získány s EC adenovirově infikovanými, aby exprimovaly UP50 (údaje nejsou ukázány).
Příklad 14
Adheze syntetického cévního štěpu osetého geneticky upravenými cévními buňkami vystaveného podmínkám toku
Syntetický cévní štěp může být oset cévními buňkami geneticky upravenými, aby exprimovaly EC mitogenní faktory k přípravě štěpů majících dlouhodobou trvanlivost a průchodnost. Podle tohoto vynálezu je osévání cévních štěpů prováděno EC adhezi podporujícími faktory, aby byly vytvořeny cévní štěpy, jejichž dlouhodobá trvanlivost a průchodnost je dále zlepšována. Tak bylo osévání štěpů těmito buňkami a jejich zkoušení za podmínek pulzujícího toku provedeno podle popisu dále.
Retence lidských EC na ePTFE štěpech za pulzujícího toku
Materiály a metody:
Osévání štěpů: EC retrovirově transdukované, aby exprimovaly UP50-GFP byly vysévány (2 x 105 buněk/1 cm2) na fibronektinem (4,5 mg/ml) předem potažené ePTFE štěpy. Vysévací postup byl prováděn po 4 hodiny při 37 °C ve vodorovně rotujícím zařízení rotujícím při čtyřicetipěti otáčkách za hodinu. Osévané štěpy byly pak po 20 hodin kultivovány v substrátu M199 doplněného antibiotiky.
Popis zařízení pro tok: Soustava toku, schematicky popsaná na obrázku 26, se skládá z pulzující krevní pumpy (přístroj Harvardu #1421, USA), flexibilních tygonových hadiček, kompenzačních tanků a syntetických štěpů, jak je zobrazeno na obrázku 27. Tlaková soustava byla monitorována pomocí tlakového monitoru (#742 Mennen Medical, Německo). Tok štěpy byl monitorován pomocí soustavy toku podle Dopplera (#T106 Transonic Systems lne., USA). Jak tok, tak tlak byly monitorovány a zaznamenávány přímo. Údaje o toku a tlaku byly analyzovány soustavou pro získávání údajů, která přímo poskytuje spočítané smykové síly uvnitř štěpů. Štěpy z ePTFE, které byly pro tok použity byly 5 až 12 cm dlouhé a měly průměr 6 mm (GORE Co. USA).
Podmínky toku: Oseté štěpy byly vystaveny podmínkám lamínárního toku. Tok byl upraven tak, aby dosahoval fyziologického krevního tlaku 120/75 (znamená 90 mm Hg) po 45 minut při rychlosti toku 150 až 200 ml/min. za použití 60 cyklů pumpy na minutu. Štěpy byly vyhodnoceny pomocí mikroskopické dokumentace a morfometrické analýzy. V druhé fázi pokusů byly štěpy vystaveny celkem po 30 minut proměnlivým ·· *»·· •Φ ··«· ·· ···· podmínkám toku. Po vystavení podmínkám toku byla stanovena retence počtu GFP exprimujících buněk tak, že byly štěpy podélně rozříznuty a pořízeny fluorescenční mikrosnímky náhodně vybraných polí luminálních povrchů.
Výsledky:
Téměř úplné pokrytí štěpů bylo detekováno fluorescenční mikroskopií retroGFP a retro UP50-GFP transdukovaných buněk (obrázky 28a a, případně, 28b) před vystavením působení podmínek pulsujícího laminárního toku, ačkoliv po vystavení působení podmínek pulsujícího laminárního toku byly štěpy, které byly potaženy EC retrovirově transdukovanými, aby exprimovaly UP50-GFP vykázaly větší retenci buněk ve srovnání se štěpy potaženými EC retrovirově transdukovanými, aby exprimovaly GFP, jež byly vystaveny stejným podmínkám toku (obrázky 28b a, případně, 28d). Tato zjištění zvýšené buněčné adherence po UP50 genovém transferu podporují způsob, který je popsaný tímto vynálezem používající oseté štěpy s buňkami přeexprimujícími UP50 pro zvýšení buněčného pokrytí za podmínek toku.
Příklad 15
Retence geneticky modifikovaných EC vysetých na umělé cévní štěpy za podmínek toku in vivo
Krátkodobá implantace ePTFE štěpů potažených geneticky upravenými lidskými EC v ovčích tepnách: Jako reálný model pro testování adheze geneticky upravených lidských EC, aby exprimovaly proendotelializační faktory, vysetých na syntetické cévní štěpy, byly štěpy oseté lidskými EC přeexprimujícími takové faktory testovány in vivo na ovčích tepnách následovně.
Materiály a metody:
Štěpy z ePTFE s malým vnitřním průměrem (6 mm) byly osety lidskými EC, které byly geneticky upraveny retrovirovou transdukcí, aby přeexprimovaly GFP, UP50-GFP nebo VEGF165-GFP 36 hodin před implantací. Dospělé ovce byly na lačno (12 hodin) premedikovány 10 mg diazepamu podaného nitrosvalově a 500 až 600 mg intravenózně podaného fenobarbitalu sodného a byly intubovány. Anestézie byla udržována inhalací 1% až 2% izofluranu. Před operací byl podán aspirin (600 mg). Monitorovací soustava zahrnovala během pokusu měření krevního tlaku pulzní oxymetrii a EKG. Intravenózně byl podán heparin (300 jedn./kg) kvůli systémové antikoagulaci po expozici a přípravě cév pro implantaci štěpu. Krevní vzorky byly během • · • · postupu odebírány každých 30 minut, aby byla zhodnocena účinnost heparinizace měřením dílčího času 3. koagulačního faktoru (PTT).
Oseté štěpy byly implantovány zkušeným kardiochirurgem koncem ke straně proximálně a distálně do stehenních tepen ovce, jak je zobrazeno na obrázku 29. Štěpy byly před získáváním vystaveny dvě hodiny krevnímu toku.
Oseté štěpy byly pak implantovány bilaterálně koncem ke straně do stehenních tepen ovce. Na jedné straně stehenní tepny byly na implantovaný štěp vysety retroGFP transdukované EC a na druhou stranu implantovaného štěpu byly vysety retroUP50-GFP transdukované EC (stehenní tepny). Ve stehenní tepně byl na jedné straně implantovaný štěp oset retroVEGFies-GFP transdukovanými EC a na druhé straně byl implantovaný štěpý oset retroUP5Q-GFP transdukovanými EC. Průchodnost implantovaných štěpů byla vyhodnocována 30 minut po vystavení implantovaných štěpů krevnímu toku a před sklízením štěpu přímým pohmatem, měření týkající se toku byla prováděna Dopplerovým měřícím přístrojem toku (Transonic Animal Research Flowmeter, NY, USA) a provedením selektivní angiografie (obrázek 30).
Rychlosti toku stehenními štěpy byly podobné na obou stranách (~50 ml/min., 38% stehenní krevní tok). Tok karotickými štěpy, který byl větší na počátku pokusu, se bilaterálně snížil ke konci dvou hodin díky trombóze na místě anastomózy (sekundární oproti chirurgickým komplikacím). Stehenní a karotické štěpy byly sklízeny dvě hodiny po implantaci. Oba štěpy pak byly sklizeny a buněčná retence na luminálních površích štěpů byla analyzována fluorescenční mikroskopií. Po odstranění štěpu byly ovce utraceny intravenózně podaným chloridem draselným.
Veškeré pokusy byly dělány podle zákonů Technion ITT, Haifa, Izrael, které se týkají péče o zvířata a experimentování s nimi.
Výsledky:
Štěpy oseté buňkami přeexprimujícími buď UP50-GFP, nebo VEGF-GFP, když je srovnáváme s buňkami přeexprimujícími pouze GFP, jasně vykázaly větší počet buněk lnoucích ke štěpům po vystavení krevnímu toku in vivo, jak bylo stanoveno zobrazením GFP exprese fluorescenční mikroskopií (obrázek 31). Štěpy oseté buňkami přeexprimujícími UP50 vykázaly větší počet adherentních buněk, než štěpy oseté buňkami přeexprimujícími GFP nebo VEGF.
Tyto výsledky, ve spojení s výsledky získanými ze stanovení adheze in vitro provedených buď za statických podmínek, nebo za podmínek toku, jak je popsáno výše, přesvědčivě dokazují, že genetické modifikace EC, aby přeexprimovaly adhezi EC • 9 · ♦ · ···· · · ··· 9 9 9 9 99 podporující faktor UP50, vede k velice zvýšené adhezi těchto buněk. Proto je použití těchto geneticky upravených buněk k vysévání na syntetické cévní štěpy velmi výhodné pro vytváření štěpů majících dlouhodobou trvanlivost a průchodnost.
Dlouhodobá implantace umělých cévních štěpů osetých geneticky upravenými autologními EC u ovcí:
Materiály a metody:
Endoteliální buňky sklizené z krátkých žilních segmentů zadní končetiny dárcovské ovce jsou rozšiřovány v laboratoři a geneticky upravovány virovými vektory. Geneticky upravované buňky jsou vysévány na štěpy, které jsou implantovány koncem ke konci proximálně a distálně do stehenních tepen autologní dárcovské ovce. Štěp osetý geneticky upravenými buňkami je implantován na jednu stranu stehenní tepny, zatímco štěp osetý buňkami exprimujícími pouze markerový gen je implantován na druhou stranu stehenní tepny. Jsou prováděny krátkodobé a dlouhodobé pokusy (3, 7, 30 dní), aby umožnily zjištění buněčné adherence a místní trombózy a zánětu. Dlouhodobá trvanlivost a průchodnost štěpu bude vyhodnocena 7., 30. a 180. den (n = 5 pro VEGF a n = 5 pro UP50) externími měřeními toku pomocí Dopplerova měřícího přístroje toku (Transonic Animal Research Flowmeter, NY, USA). Na konci sledovaného období jsou štěpy odstraněny a průřezovým morfometrickým měřením jsou stanoveny neointimální útvary a adherence vysetých buněk je zkoušena detekcí exprese markerového genu.
Ačkoliv byl vynález popsán ve spojení s jeho jednotlivými včleněními, je zřejmé, že odborníkům budou patrné mnohé alternativy, modifikace a variace. Máme, tedy, v úmyslu pojmout veškeré takové alternativy, modifikace a variace, které jsou v duchu a širokém měřítku připojených nároků. Veškeré publikace, patenty, patentové přihlášky a postupy tam zveřejněné a/nebo určené přístupovým číslem Genbank zmíněného v této specifikaci jsou zde začleněny ve své celistvosti odkazem na specifikaci, ve stejném rozsahu, jako by každá jednotlivá publikace, patent, patentová přihláška a postup byly specificky a jednotlivě uváděny, že jsou zde začleněny odkazem. Citace nebo identifikace jakéhokoliv odkazu v této přihlášce nebudou, navíc, chápány jako připuštění, že je takový odkaz dostupný jako dosavadní stav techniky k tomuto vynálezu.
Průmyslová využitelnost
Tento vynález umělého cévního štěpu, může být využit k nahrazení a/nebo obejití poškozených a/nebo uzavřených krevních cév. Syntetické cévní štěpy potažené savčími endoteliálními buňkami mohou poskytnout schůdnou alternativu současně používaných přírodních a syntetických cévních štěpů.
• ··» tttt /1*7 · · · · © · ···
4/ ··· ····« ·· · · · ·· ·»
Citované odkazy (další odkazy jsou citovány v textu)
1. VA Study Group 141. Comparative evaluation of prosthetic, reversed, and in šitu vein bypass grafts in distal popliteal and tibial-peroneal revascularization. Arch Surg 1988; 123:434 až 8.
2. Londrey GL, Ramsey DE, Hodgson KJ, Barkmeier LD, Sumer DS. Infrapopliteal bypass for severe ischemia: comparison of autogenous vein, composite, and prosthetic grafts. J Vasc J 1991; 13:631 až 6.
3. Darling RC, Linton RR. Durability of femoropopliteal reconstructions. Am J Surgery 1972; 123:472 až 79.
4. Rutherford RB, Nishikimi N. Graft tbrombosis and thromboembolic complications. In Rutherford RB vyd. Vascular Surgery. Philadelphia, Pa: WB Saunders Co; 1989:501 až 510.
5. Eickhoff JH, Broome A, Ericsson BF, et al. Four years results of a prospective, randomized clinical trial comparing PTFE and modified human umbilical for below knee femoropopliteal bypass. J Vasc Surg 1987;6:506 až 511.
6. Meinhart J, Deutsch M, Zilia P. Eight years of clinical endothelial cell transplantation. Closing the gap between prosthetic grafts and vein grafts. ASAIO 1 999;43 :M5 15 až 21.
7. Falk J, Townsend LE, Vogel LM, Boyer M, et al. Improved adherence of genetically modified endothelial celíš to smáli diameter expanded PTFE grafts in canine model. J Vasc Surg 1998;27:902 až 8.
8. Magometschnigg H, Kadletz M, Vodrazka M, et al. Prospective clinical study with in vitro endothelial cell lining of expanded potytetraflouruethylene grafts in crural repeat reconstruction. J Vasc Surg 1992; 15:527 až 35.
9. Noishiki Y, Tomizawa Y, Yamane Y, Matsumoto A. Autocrine angiogenic vascular prosthesis with bone marrow transplantation. Nátuře Medicine 1996;2:90 až 93.
10. Clowes AW. Improving the interface between biomaterials and the blood - the gene therapy approach. Circulation 1996;93:1319až 1320.
·· ····
• · • * ·
11. Dichek DA, Anderson J, Kelly AB, Hanson SR, Harker LA. Enhanced in vivo antithrombotic effects of endothelial cells expressing recombinant plasminogen activators transduced with retroviral vectors. Circulation 1996;93 :301 až 309.
12. Gillis-Haegerstrand C, Frebelius S, Haegerstrand A, Swedenberg J. Cultured human endothelial cells seeded on expanded PTFE support thrombin mediated activation of protein C. J Vasc Surg 1996;24:226 až 34.
13. Pasic M, Muller-Glauser W, Odermatt B, Lachat M, Seifert B, Turína M. Seeding with omental cells prevents latě neointimal hyperplasia in small-diameter grafts. Circulation 1995 ;92 :2605 až 2616.
14. Edelman ER. Vascular tissue engineering. Circ Res 1999;85:11 157.
15. Leung DW, Cachians G, Kuang WJ, Goeddel DV, Ferrara N: Vascular endothelial growth factor is a secreted angiogenic factor. Science 1989;246: 1306 až 1309.
16. Hanahan D. Signaling vascular morphogenesis and maintenance. Science 1 997;277 :48 až 50.
17. Huang XL. et al., Biochem Biophys Res Commun. 1999, 264: 133
18. Sapienza P, di Marzo L, Cucina A, et al. Release of PDGF-BB and bFGF by human endothelial cells seeded on ePTFE vascular grafts. J Surg Res 1998;75:24 až 9.
19. Van Belle E, Tio FO, Couffinhal T.Maillard L, Passeri J, Isner JM. Stent endothelializatjon. Circulation 1997 ;95 :438 až 448.
20. Folkman J: Therapeutic angiogenesis in ischémie limbs (komentář; poznámky) Circulation 1998;97:1 108 až 1110
1. Anderson WF. Human gene therapy. Nátuře 392;25 až 30.
22. Mulligan RC: The basic science of gene therapy. Science 260:926 až 932, 1993.
23. Cosset F-L, Russell SJ. Targeting retrovirus entry. Gene therapy 1996;3 :946 až 956.
24. Nakamura T, Ruiz-Lozano P, Lindner V, et al. DÁNCE, a nove! secreted RGD protein expressed in developing, atherosclerotic, and balloon injured arteries. JBC 1999; 274,:22 476 až 22 483.
···· ·· ····
25. Huber TS, Welling TH, Sarkar R, Messina LM, Stanley JC. Effects of retroviralmediated t-PA gene transfer and expression on adherence and proliferation of canine endothelíal celíš seeded onto ePTFE. J Vasc Surg 1995,22:795 až 803.
26. Dunn PF, Newman KD, Jones M, Yamada I, Shayani V, Vírmani R, Dichek DA. Seeding of vascular grafts with genetically modified endothelíal celíš; secretjon of recombinant T-PA results in decreased seeded cell retention in vitro and in vivo. Circulation 1996,93:1439 až 1446.
27. Zilla P, Greisler HP (vyd.). Tissue engineering of vascular prosthetic grafts. RG Landes Company, Austin, Texas, USA 1999.
28. He TC. et al., Proč Nati Acad Sci USA 1998, 95:2509
29. Flugelman MY. et al., Circulation Research 1992, 70:348
30. Asahara T. et al., EMBO J. 1999, 18:3964
31. Agha-Mohammadi S. a Lotze MT. J Clinical Investigations 2000, 105:1177
32. Dichek DA. et al., Blood 1991, 77:533
33. Korff T. et al. J Cell Biol. 1998 143:1341
34. Steele JG, Johnson G, Norris WD, Underwood PA. Adhesion and growth of cultured human endothelíal celíš on perfluorosulphonate: role of vitronectin and fibronectin in cell attachment. Biomaterials 1991 Aug; 12(6):531 až 9.
35. Y. Marois, M.F. Sigot-Luizard a R. Guidoin, Endothelíal cell behavior on vascular prosthetic grafts: effect of polymer chemistry, surface structure, and surface treatment. Asaio J. 45 4 (1999),str. 272 až 280.
36. G.W. Bos, N.M. Scharenborg, A.A. Poot, G.H. Engbers, J.G. Terlingen, T. Beugeling, W.G. Van Aken and J. Feijen, Adherence and proliferation of endothelíal celíš on surface-immobilized albumin-heparin conjugate. Tissue Eng. 43 (1998),str. 267 až 279.
37. G.W. Bos, N.M. Scharenborg, A.A. Poot, G.H. Engbers, T. Beugeling, W.G. van Aken and J. Feijen, Proliferation of endothelíal celíš on surface-immobilized albumin conjugate loaded with basic fibroblast growth factor. J Biomed. Mater. Res. 44 3 (1999),str. 330 až 340.
• · · 4
4 · ·· * «· ·*« :
•· 9 44 44 44
38. Η. Μ. Carr, R. Vobra, H. Sharma, J.V. Smyth, OB. Rooney, P.D. Dodd and M.G. Walker, Endothelial cell seeding kinetics under chronic flow in prosthetic grafts. Ann. Vasc. Surg. 10 5 (1996), str. 469 až 475.
39. R. Vohra, GJ. Thomson, H.M. Carr, H. Sharma and M.G. Walker, Comparison of different vascular prostheses and matrices in relation to endothelial seeding. Br. J Surg. 784(1991), str. 417 až 420.
40. G.B. Koveker, L.M. Graham, W.E. Burkel, R. Seli, T.W. Wakefield, K. Dietrich and J.C. Stanley, Extracellular matrix preparation of expanded polytetrafluoroethylene grafts seeded with endothelial cells: influence on early platelet deposition, cellular growth, and luminal prostacyclin release. Surgery 109 3 část I (1991), str. 313 až 319.
41. J.E. Hasson, D.H. Wiebe, J.B. Sharetkin, P A. D‘Amore and W.M. Abbott, Use of tritiated thymidine as a markér to compare the effects of matrix proteins on adult human vascular endothelial cell attachment: implications for seeding of vascular prostheses. Surgery 100 5 (1986), str. 884 až 892.
42. R.B. Patterson, J.D. Keller, E.B. Silberstein and R.F. Kempczinski, A comparison between fibronectin and Matrigel pretreated ePTFE vascular grafts. Ann. Vasc. Surg. 3 2(1989), str. 160 až 166.
43. H.M. Carr, R. Vohra, M. Welch, O B. Rooney, H. Sharma and M.G. Walker, Fibronectin binding to gelatin-impregnated Dacron (Gelseal) prostheses. Artz Organs 16 4 (1992), str. 342 až 345.
44. A. Sank, K. Rostami, F. Weaver, D. Ertl, A. Yellin, M. Nimni a T.L. Tuan, New evidence and new hope concerning endothelial seeding of vascular grafts. Am. J. Surg. 164 3(1992), str. 199 až 204.
45. GJ. Thomson, R.K. Vohra, M.H. Carr a M.G. Walker, Adult human endothelial cell seeding using expanded polytetrafluoroethylene vascular grafls: a comparison of four substrates. Surgery 109 1 (1991), str. 20 až 27.
46. Braddock M, Schwachtgen JL, Houston P, Dickson MC, Lee MJ, Campbell CJ. Fluid Shear Stress Modulation of Gene Expression in Endothelial Cells. News Physiol Sci. 1998 říjen; 13:241 až 246.
47. Morimoto M, Kume N, Miyamoto S, Ueno Y, Kataoka H, Minami M, Hayashida K, Hashimoto N, Kita T. Lysophosphatidylcholine induces early growth response factor-1 • · · · · · ·· · · • · · · · ·
expression and activates the core promotér of pdgf-a chain in vascular endothelial cells. Arterioscler Thromb - Vasc Biol. 2001 květen;21 (5):771 až 6.
48. Ogasawara A, Arakawa T, Kaneda T, Takuma T, Sáto T,
Kaneko H, Kumegawa M, Hakeda Y. Fluid Shear Stress-induced
Cyclooxygenase-2 Expression Is Mediated by C/EBP beta, cAMP-response Element-binding Protein, and AP-1 in Osteoblastic MC3T3-E1 Cells. J Biol Chem. 2001 březen 9;276(10):7048 až 54.
49. Lin K, Hsu PP, Chen BP, Yuan S, Usami S, Shyy JY, Li YS, Chien S. Free in PMC. Molecular mechanism of endothelial growth arrest by laminar shear stress. Proč Nati Acad Sci USA. 2000 srpen 15;97(17):9385 až 9.
50. Houston P, White BP, Campbell CJ, Braddock M. Delivery and expression of fluid shear stress-inducible promoters to the vessel wall: applications for cardiovascular gene therapy. Hum Gene Ther. 1999 prosinec 10; 10(18):3031 až 44.
51. Nakamura T. et al., J Biol Chem. 1999, 274:22 476.
52. Shattil, SJ., a Ginsberg, MH. J. Clin. Invest. 1997, IOO:S91.
53. Hyneš, RO., Cell 1992, 69:11.
54. Doolittle RF. et al., Nátuře 1984, 307:558.
55. Selander-Sunnerhagen, M. etal., J. Biol. Chem. 1992, 267:19 642.
56. Apella E. et al. FEBS Lett 1988 231:1.
57. Kowal RC. et al., Circ Res. 1999, 84:1166.
Claims (64)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Umělý cévní štěp, vyznačující se tím, že obsahuje syntetický trubicový prvek, který má luminální povrch potažený velkým množstvím endoteliálních buněk a/nebo buněk hladkého svalstva geneticky přeměněných tak, aby exprimovaly alespoň jeden růstový faktor proliferující buňky a alespoň jeden faktor buněčné adheze.
- 2. Umělý cévní štěp podle nároku 1, vyznačující se tím, že v něm první část uvedeného množství endoteliálních buněk a/nebo buněk hladkého svalstva je geneticky přeměněna, aby exprimovala uvedený alespoň jeden růstový faktor proliferující buňky a dále, kde druhá část uvedeného množství endoteliálních buněk a/nebo buněk hladkého svalstva je geneticky přeměněna, aby exprimovala uvedený alespoň jeden faktor buněčné adheze.
- 3. Umělý cévní štěp podle nároku 1, vyznačující se tím, že v něm uvedený luminální povrch je z látky vybrané ze skupiny skládající se z polytetrafluorethylenu (PTFE), expandovaného polytetrafluorethylenu (ePTFE), polyesterových vláken, Dacronu™ a sterilizovaných živočišných krevních cév.
- 4. Umělý cévní štěp podle nároku 1, vyznačující se tím, že v něm uvedený syntetický trubicový prvek je z vnitřní oblasti příčného řezu, která je v podstatě rovnocenná vnitřní oblasti příčného řezu krevní cévy.
- 5. Umělý cévní štěp podle nároku 4, vyznačující se tím, že v něm uvedená vnitřní oblast příčného řezu uvedeného syntetického trubicového prvku je v rozsahu asi od 7 do 700 mm2
- 6. Umělý cévní štěp podle nároku 1, vyznačující se tím, že v něm uvedené velké množství endoteliálních buněk je odvozeno ze zdroje vybraného ze skupiny skládající se z části žíly, progenitorových buněk kostní dřeně, kmenových buněk periferní krve a obíhajících endoteliálních buněk.·· · ·
- 7. Umělý cévní štěp podle nároku 1, vyznačující se tím, že v něm uvedené velké množství endoteliálních buněk a/nebo buněk hladkého svalstva je odvozeno od příjemce umělého cévního štěpu.
- 8. Umělý cévní štěp podle nároku 1, vyznačující se tím, že v něm uvedené velké množství endoteliálních buněk a/nebo buněk hladkého svalstva je odvozeno od lidského nebo živočišného dárce.
- 9. Umělý cévní štěp podle nároku 1, vyznačující se tím, že v něm uvedené velké množství endoteliálních buněk tvoří splývavou jednoduchou vrstvu při uvedeném vnitřním luminálním povrchu.
- 10. Umělý cévní štěp podle nároku 1, vyznačující se tím, že v něm uvedený alespoň jeden růstový faktor proliferující buňky je vybrán ze skupiny skládající se z VEGF, kyselého nebo zásaditého FGF a HGF.
- 11. Umělý cévní štěp podle nároku 1, vyznačující se tím, že v něm uvedený alespoň jeden faktor buněčné adheze je UP50, DANCE, vitronektin, albumin, kolagen I, kolagen IV, fibronektin a Laminin.
- 12. Umělý cévní štěp podle nároku 1, vyznačující se tím, že v něm uvedené velké množství endoteliálních buněk a/nebo buněk hladkého svalstva je dále geneticky přeměněno, aby exprimovalo alespoň jeden markerový polypeptid.
- 13. Přeměněná endoteliální buňka nebo buňka hladkého svalstva, vyznačující se tím, že je geneticky přeměněna, aby exprimovala alespoň jeden růstový faktor proliferující buňky a alespoň jeden faktor buněčné adheze.
- 14. Přeměněná endoteliální buňka nebo buňka hladkého svalstva podle nároku 13, vyznačující se tím, že je geneticky přeměněna, aby exprimovala alespoň jeden markerový polypeptid.
- 15. Přeměněná endoteliální buňka nebo buňka hladkého svalstva podle nároku 13, vyznačující se tím, že v něm uvedená endoteliální buňka je odvozena ze zdroje vybraného ze skupiny skládající se z části žíly a progenitorových buněk kostní dřeně, kmenových buněk periferní krve a obíhajících endoteliálních buněk.
- 16. Přeměněná endoteliální buňka nebo buňka hladkého svalstva podle nároku 13, vyznačující se tím, že v něm uvedená endoteliální buňka nebo buňka hladkého svalstva je odvozena ze zdroje vybraného ze skupiny skládající se z lidského dárce a živočišného zdroje.
- 17. Přeměněná endoteliální buňka nebo buňka hladkého svalstva podle nároku 13, vyznačující se tím, že v něm uvedený růstový faktor proliferující buňky je vybrán ze skupiny skládající se z VEGF, kyselého nebo zásaditého FGF a HGF.
- 18. Přeměněná endoteliální buňka nebo buňka hladkého svalstva podle nároku 13, vyznačující se tím, že v něm uvedený faktor buněčné adheze je UP50, DANCE, vitronektin, albumin, kolagen I, kolagen IV, fibronektin a Laminin.
- 19. Způsob výroby umělého cévního štěpu, vyznačující se tím, že způsob obsahuje:(a) genetické přeměňování endoteliálních buněk a/nebo buněk hladkého svalstva, aby exprimovaly alespoň jeden růstový faktor proliferující buňky a alespoň jeden faktor buněčné adheze; a (b) kultivaci uvedených endoteliálních buněk a/nebo buněk hladkého svalstva v syntetickém trubicovém prvku, který má luminální povrch, dokud není dosaženo dostatečného potažení uvedeného luminálního povrchu uvedenými endoteliálními buňkami a/nebo buňkami hladkého svalstva.
- 20. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že jeho krok (a) je způsobený genetickým přeměňováním první části uvedených endoteliálních buněk a/nebo buněk hladkého svalstva, aby exprimovaly uvedený alespoň jeden růstový faktor proliferující buňky a genetickým přeměňováním druhé části uvedených endoteliálních buněk a/nebo buněk hladkého svalstva, aby exprimovaly uvedený alespoň jeden faktor buněčné adheze.
- 21. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že jeho uvedený krok (a) předchází uvedenému kroku (b).• A AAAA • AAA55 · · · AAAA AAAA A AA AA A A
- 22. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že jeho uvedený krok (b) předchází uvedenému kroku (a).
- 23. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že uvedené endoteliální buňky jsou odvozeny ze zdroje vybraného ze skupiny skládající se z části žíly a progenitorových buněk kostní dřeně, kmenových buněk periferní krve a obíhajících endoteliálních buněk.
- 24. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že dále obsahuje podrobení uvedeného luminálního povrchu uvedeného umělého štěpu silám toku.
- 25. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že uvedený umělý štěp je používán při operaci pomocí bypassu.
- 26. Konstrukce exprese nukleové kyseliny, která se vyznačuje tím, že obsahuje:(a) první segment polynukleotidů kódující růstový faktor proliferující buňky; a (b) druhý segment polynukleotidů kódující faktor buněčné adheze.
- 27. Konstrukce exprese nukleové kyseliny podle nároku 26, vyznačující se tím, že dále obsahuje alespoň jednu sekvenci promotoru, která je pro řízení exprese alespoň jednoho z uvedeného prvního a alespoň jednoho z uvedeného druhého segmentu polynukleotidů.
- 28. Konstrukce nukleové kyseliny podle nároku 27, vyznačující se tím, že uvedený první segment polynukleotidů je transkripčně spojený s uvedeným druhým segmentem polynukleotidů, zatímco uvedený první a uvedený druhý segment polynukleotidů jsou pod transkripčním řízením jediné promotorové sekvence uvedené alespoň jedné promotorové sekvence.
- 29. Konstrukce nukleové kyseliny podle nároku 28, vyznačující se tím, že dále obsahuje spojovací sekvenci, která je umístěná mezi uvedený první a uvedený druhý segment polynukleotidů.φ • Φ ·Φ·Φ • ΦΦΦ φ φ φφφφ
- 30. Konstrukce nukleové kyseliny podle nároku 29, vyznačující se tím, že uvedená spojovací sekvence je vybrána ze skupiny skládající se z IRES a rozpoznávacího místa štěpení proteázy.
- 31. Konstrukce exprese nukleové kyseliny podle nároku 26, vyznačující se tím, že uvedený alespoň jeden promotor je funkční v eukaryotických buňkách.
- 32. Konstrukce exprese nukleové kyseliny podle nároku 26, vyznačující se tím, že uvedený alespoň jeden promotor je vybrán ze skupiny skládající se z konstitutivního promotoru, inducibilního promotoru a tkáňového specifického promotoru.
- 33. Konstrukce exprese nukleové kyseliny podle nároku 26, vyznačující se tím, že dále obsahuje:(c) první sekvenci promotoru, která je pro řízení exprese uvedeného prvního segmentu polynukleotidu; a (d) druhou sekvenci promotoru, která je pro řízení exprese uvedeného druhého segmentu polynukleotidu.
- 34. Konstrukce exprese nukleové kyseliny podle nároku 33, vyznačující se tím, že její uvedený první promotor a uvedený druhý promotor jsou vybrány ze skupiny skládající se z konstitutivního promotoru, inducibilního promotoru a tkáňového specifického promotoru.
- 35. Konstrukce exprese nukleové kyseliny podle nároku 34, vyznačující se tím, že její uvedený inducibilní promotor je řiditelný stejnou molekulou efektoru.
- 36. Konstrukce exprese nukleové kyseliny podle nároku 26, vyznačující se tím, že dále obsahuje alespoň jeden další segmentu polynukleotidu kódující markerový polypeptid.
- 37. Konstrukce exprese nukleové kyseliny podle nároku 36, vyznačující se tím, že uvedený markerový polypeptid je vybrán ze skupiny skládající se ze selekčního polypeptidu a reportérového polypeptidu.·· ·♦·· ·· ····
- 38. Konstrukce exprese nukleové kyseliny podle nároku 36, vyznačující se tím, že uvedený alespoň jeden další segment polynukleotidu je transkripčně spojený s uvedeným alespoň jedním z uvedeného prvního a uvedeného druhého segmentu polynukleotidu.
- 39. Konstrukce nukleové kyseliny podle nároku 36, vyznačující se tím, že uvedený alespoň jeden další segment polynukleotidu je transkripčně spojený s uvedeným alespoň jedním z uvedeného prvního a uvedeného druhého segmentu polynukleotidu pomocí spojovacího segmentu.
- 40. Konstrukce nukleové kyseliny podle nároku 39, vyznačující se tím, že uvedená spojovací sekvence je vybrána ze skupiny skládající se z IRES a rozpoznávacího místa štěpení proteázy.
- 41. Konstrukce nukleové kyseliny podle nároku 36, vyznačující se tím, že uvedený alespoň jeden další segment polynukleotidu je translačně spojený s uvedeným alespoň jedním z uvedeného prvního a uvedeného druhého segmentu polynukleotidu.
- 42. Systém konstrukce exprese nukleové kyseliny, vyznačující se tím, že obsahuje:(a) první konstrukci exprese nukleové kyseliny včetně prvního segmentu polynukleotidu kódujícího růstový faktor proliferující buňky; a (b) druhou konstrukci exprese nukleové kyseliny včetně druhého segmentu polynukleotidu kódujícího faktor buněčné adheze.
- 43. Systém konstrukce exprese nukleové kyseliny podle nároku 42, vyznačující se tím, že alespoň jedna z uvedené první a uvedené druhé konstrukce exprese nukleové kyseliny dále zahrnuje alespoň jeden další segment polynukleotidu kódující markerový polypeptid.
- 44. Systém konstrukce exprese nukleové kyseliny podle nároku 42, vyznačující se tím, že dále obsahuje alespoň jednu sekvenci promotoru pro řízení exprese alespoň jednoho z uvedeného prvního a uvedeného druhého segmentu polynukleotidu.fc • fc fcfcfcfc • · fcfcfcfc
- 45. Systém konstrukce exprese nukleové kyseliny podle nároku 42, vyznačující se tím, že uvedená sekvence promotoru je funkční v eukaryotických buňkách.
- 46. Systém konstrukce exprese nukleové kyseliny podle nároku 42, vyznačující se tím, že uvedená alespoň jedna sekvence promotoru je vybrána ze skupiny skládající se z konstitutivního promotoru, inducibilního promotoru a tkáňového specifického promotoru.
- 47. Systém konstrukce exprese nukleové kyseliny podle nároku 43, vyznačující se tím, že uvedený markerový polypeptid je vybrán ze skupiny skládající se ze selekčního polypeptidu a reportérového polypeptidu.
- 48. Systém konstrukce exprese nukleové kyseliny podle nároku 43, vyznačující se tím, že uvedený alespoň jednen segment polynukleotidu je transkripčně spojen s alespoň jedním z uvedeného prvního a uvedeného druhého segmentu polynukleotidu.
- 49. Souprava obsahující místo pro zapojení alespoň jedné trubičky, vyznačující se tím, že uvedená alespoň jedna trubička zahrnuje systém konstrukcí exprese kyseliny nukleové, uvedený systém konstrukce exprese kyseliny nukleové zahrnuje:(a) první konstrukci exprese kyseliny nukleové zahrnující první polynukleotid kódující růstový faktor proliferující buňky; a (b) druhou konstrukci exprese kyseliny nukleové zahrnující druhý polynukleotid kódující faktor buněčné adheze.
- 50. Souprava obsahující místo pro zapojení alespoň jedné trubičky, vyznačující se tím, že uvedená alespoň jedna trubička zahrnuje konstrukci exprese kyseliny nukleové, uvedená konstrukce exprese kyseliny nukleové zahrnuje:(a) první polynukleotid kódující růstový faktor proliferující buňky; a (b) druhý polynukleotid kódující faktor buněčné adheze.
- 51. Způsob výroby geneticky přeměněných endoteliálních buněk a/nebo buněk hladkého svalstva, vyznačující se tím, že způsob obsahuje:(a) získání endoteliálních buněk a/nebo buněk hladkého svalstva ze zdroje savčí tkáně; a ·· ···· ·· ····59 · ·· * ·· ·*· * · • · · ·· »· ·· · » (b) přeměňování endoteliálních buněk a/nebo buněk hladkého svalstva, aby byl exprimován alespoň jeden růstový faktor proliferující buňky a alespoň jeden faktor buněčné adheze.
- 52. Způsob nahrazení nebo obejití alespoň části cévního systému jedince, vyznačuící se tím, že způsob obsahuje implantování umělého cévního štěpu do cévního systému jedince tak, aby bylo vytvořeno plynulé spojení mezi cévním systémem a uvedeným umělým cévním štěpem, uvedený umělý cévní štěp zahrnuje syntetický trubicový prvek mající luminální povrch, který je potažený velkým množstvím endoteliálních buněk a/nebo buněk hladkého svalstva geneticky přeměněnými tak, aby exprimovaly alespoň jeden růstový faktor proliferující buňky a alespoň jeden faktor buněčné adheze.
- 53. Způsob podle nároku 52, vyznačující se tím, že v něm první část uvedeného velkého množství endoteliálních buněk a/nebo buněk hladkého svalstva je geneticky přeměněna, aby exprimovala uvedený alespoň jeden růstový faktor proliferující buňky a dále, v něm druhá část uvedeného velkého množství endoteliálních buněk a/nebo buněk hladkého svalstva je geneticky přeměněna, aby exprimovala uvedený alespoň jeden faktor buněčné adheze.
- 54. Umělý cévní štěp podle nároku 52, vyznačující se tím, že v něm uvedený syntetický trubicový prvek je z vnitřní oblasti příčného řezu, která je v podstatě rovnocenná vnitřní oblasti příčného řezu krevní cévy.
- 55. . Umělý cévní štěp podle nároku 54, vyznačující se tím, že v něm uvedená vnitřní oblast příčného řezu uvedeného syntetického trubicového prvku je v rozsahu asi od 7 do 700 mm2.
- 56. Umělý cévní štěp, vyznačující se tím, že obsahuje syntetický trubicový prvek mající luminální povrch, který je potažený endoteliálními buňkami a buňkami hladkého svalstva, alespoň jedna z uvedených endoteliálních buněk a buněk hladkého svalstva je geneticky přeměněna tak, aby exprimovala alespoň jeden růstový faktor proliferující buňky a alespoň jeden faktor buněčné adheze.·· *·*· ·· .... .. .... • · · · · · · · .• · · · · · · · .• · · · . · ..... • · · ...» · · · · ·· · ·· ·· ·· ··
- 57. Umělý cévní štěp, vyznačující se tím, že obsahuje syntetický trubicový prvek mající luminální povrch, který je potažený velkým množstvím endoteliálních buněk geneticky přeměněných tak, aby exprimovaly UP50 a VEGF.
- 58. Umělý cévní štěp, vyznačující se tím, že obsahuje syntetický trubicový prvek mající luminální povrch, který je potažený velkým množstvím buněk hladkého svalstva geneticky přeměněných tak, aby exprimovaly UP50 a VEGF.
- 59. Umělý cévní štěp, vyznačující se tím, že obsahuje syntetický trubicový prvek mající luminální povrch, který je potažený velkým množstvím endoteliálních buněk a/nebo buněk hladkého svalstva geneticky přeměněných tak, aby exprimovaly UP50 a růstový faktor proliferující buňky vybraný ze skupiny skládající se z kyselého nebo zásaditého FGF a HGF.
- 60. Způsob výroby umělého cévního štěpu, vyznačující se tím, že tento způsob obsahuje:(a) genetické přeměňování endoteliálních buněk a/nebo buněk hladkého svalstva, aby exprimovaly UP50 a VEGF; a (b) kultivování uvedených endoteliálních buněk a/nebo buněk hladkého svalstva v syntetickém trubicovém prvku majícím luminální povrch, dokud není dosaženo dostatečného potažení uvedeného luminálního povrchu uvedenými endoteliálními buňkami a/nebo buňkami hladkého svalstva.
- 61. Způsob výroby umělého cévního štěpu, vyznačující se tím, že tento způsob obsahuje:(a) poskytnutí endoteliálních buněk a buněk hladkého svalstva, alespoň jedna z uvedených endoteliálních buněk a buněk hladkého svalstva je geneticky přeměněna tak, aby exprimovala UP50 a VEGF; a (b) následné nebo současné kultivování uvedených endoteliálních buněk a uvedených buněk hladkého svalstva v syntetickém trubicovém prvku majícím luminální povrch, dokud není dosaženo dostatečného potažení uvedeného luminálního povrchu uvedenými endoteliálními buňkami a buňkami hladkého svalstva.·· φ»·· ** φφφφ •Φ φφφφ
- 62. Umělý cévní štěp, vyznačující se tím, že obsahuje syntetický trubicový prvek mající luminální povrch, který je potažený velkým množstvím endoteliálních buněk a vnější povrch potažený velkým množstvím buněk hladkého svalstva.
- 63. Umělý cévní štěp podle nároku 62, vyznačující se tím, že uvedené velké množství endoteliálních buněk je geneticky přeměněno, aby exprimovalo alespoň jeden růstový faktor proliferující buňky a alespoň jeden faktor buněčné adheze.
- 64. Umělý cévní štěp podle nároku 62, vyznačující se tím, že uvedené velké množství buněk hladkého svalstva je geneticky přeměněno, aby exprimovalo alespoň jeden faktor buněčné adheze.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US62022700A | 2000-07-20 | 2000-07-20 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2003253A3 true CZ2003253A3 (cs) | 2003-05-14 |
Family
ID=24485086
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2003253A CZ2003253A3 (cs) | 2000-07-20 | 2001-07-20 | Umělé cévní štěpy a způsoby jejich výroby a použití |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US7364725B1 (cs) |
| EP (1) | EP1301146B1 (cs) |
| JP (1) | JP5067822B2 (cs) |
| AT (1) | ATE469615T1 (cs) |
| AU (1) | AU2001278664A1 (cs) |
| CA (1) | CA2416548A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ2003253A3 (cs) |
| DE (1) | DE60142290D1 (cs) |
| HU (1) | HUP0300810A2 (cs) |
| IL (1) | IL153946A0 (cs) |
| PL (1) | PL362561A1 (cs) |
| WO (1) | WO2002007646A2 (cs) |
| ZA (1) | ZA200300635B (cs) |
Families Citing this family (32)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6485723B1 (en) | 1995-02-10 | 2002-11-26 | Purdue Research Foundation | Enhanced submucosal tissue graft constructs |
| AU2001245734A1 (en) * | 2000-03-15 | 2001-09-24 | Orbus Medical Technologies Inc. | Coating that promotes endothelial cell adherence |
| US7175658B1 (en) | 2000-07-20 | 2007-02-13 | Multi-Gene Vascular Systems Ltd. | Artificial vascular grafts, their construction and use |
| HUP0300810A2 (hu) | 2000-07-20 | 2003-08-28 | M.G.V.S. Ltd. | Mesterséges értranszplantátum, valamint ennek létrehozása és alkalmazása |
| US20050209687A1 (en) * | 2002-02-19 | 2005-09-22 | Bioartis, Inc. | Artificial vessel scaffold and artifical organs therefrom |
| US9492267B2 (en) | 2002-05-02 | 2016-11-15 | Cook Biotech Incorporated | Cell-seeded extracellular matrix grafts |
| CN1665527A (zh) * | 2002-05-02 | 2005-09-07 | 普渡研究基金会 | 血管化增强的移植构造物 |
| WO2003092381A1 (en) | 2002-05-02 | 2003-11-13 | Purdue Research Foundation | Vascularization enhanced graft constructs |
| EP1503652A4 (en) | 2002-05-02 | 2006-02-08 | Purdue Research Foundation | HYBRID GRAFTS WITH IMPROVED VASCULARIZATION |
| TW200605910A (en) | 2004-04-30 | 2006-02-16 | Orbus Medical Technologies Inc | Medical device with coating for capturing genetically-altered cells and methods for using same |
| WO2006017275A1 (en) | 2004-07-13 | 2006-02-16 | The University Of Tennessee Research Foundation | Adhesive composition for carrying therapeutic agents as delivery vehicle on coatings applied to vascular grafts |
| WO2007088418A1 (en) * | 2006-01-31 | 2007-08-09 | Multi Gene Vascular Systems, Inc. | Drug-eluting intravascular prostheses and methods of use |
| JP5839814B2 (ja) * | 2010-03-17 | 2016-01-06 | グンゼ株式会社 | Ｄａｎｃｅタンパク質含有徐放基材及び該徐放基材の製造方法 |
| EP2575913B1 (en) | 2010-05-25 | 2018-07-25 | Cook Biotech Incorporated | Methods, substrates, and systems useful for cell seeding of medical grafts |
| US9663564B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-05-30 | The Regents Of The University Of California | Vectors and methods to treat ischemia |
| US20140065110A1 (en) | 2012-08-31 | 2014-03-06 | The Regents Of The University Of California | Genetically modified msc and therapeutic methods |
| CA2889981A1 (en) | 2012-10-29 | 2014-05-08 | Ariste Medical, Inc. | Polymer coating compositions and coated products |
| US9878071B2 (en) | 2013-10-16 | 2018-01-30 | Purdue Research Foundation | Collagen compositions and methods of use |
| AU2015249769A1 (en) | 2014-04-22 | 2016-11-10 | Ariste Medical, Llc. | Methods and processes for application of drug delivery polymeric coatings |
| EP3185922B1 (en) | 2014-08-27 | 2025-04-02 | Purdue Research Foundation | Collagen-based therapeutic delivery systems |
| US20190030125A1 (en) * | 2014-12-07 | 2019-01-31 | Vessl Therapeutics Ltd | Use of fibulin-5 for the treatment of keloid scars |
| WO2016140716A1 (en) | 2015-03-02 | 2016-09-09 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Injectable microtissue systems, devices, and methods |
| US11919941B2 (en) | 2015-04-21 | 2024-03-05 | Purdue Research Foundation | Cell-collagen-silica composites and methods of making and using the same |
| PL3325444T3 (pl) | 2015-07-20 | 2021-12-06 | Acadia Pharmaceuticals Inc. | Sposoby wytwarzania N-(4-fluorobenzylo)-N-(1-metylopiperydyn-4-ylo)-N'-(4-(2-metylopropyloksy)fenylometylo)karbamidu oraz jego soli winianowej i postaci polimorficznej C |
| CN106075585B (zh) * | 2016-07-08 | 2019-06-21 | 福建师范大学 | 一种基于人工肌腱支架材料的组织工程化人工肌腱移植物的制备方法 |
| US11439731B2 (en) | 2016-09-14 | 2022-09-13 | Revotek Co., Ltd. | Artificial tissue progenitor and method for preparing the same |
| CN109735434B (zh) * | 2016-09-14 | 2022-09-23 | 四川蓝光英诺生物科技股份有限公司 | 人工组织前体及制备其的方法 |
| CA3052266A1 (en) | 2017-01-31 | 2018-08-09 | Geniphys, Llc | Methods and compositions for matrix preparation |
| US11739291B2 (en) | 2017-04-25 | 2023-08-29 | Purdue Research Foundation | 3-dimensional (3D) tissue-engineered muscle for tissue restoration |
| US20210290821A1 (en) * | 2018-07-27 | 2021-09-23 | Washington University | Cell-embedded vascular graft for transplantation |
| EP4096635A4 (en) | 2020-01-27 | 2024-02-21 | GeniPhys, Inc. | BIOLOGICAL FILLER FOR TISSUE RESTORATION AND REGENERATION |
| CN114457003A (zh) * | 2020-11-10 | 2022-05-10 | 维思尔治疗有限公司 | 预调节血管细胞用于转导的方法、转导方法和保存转导的细胞的方法 |
Family Cites Families (80)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL154600B (nl) | 1971-02-10 | 1977-09-15 | Organon Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen. |
| NL154598B (nl) | 1970-11-10 | 1977-09-15 | Organon Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking. |
| NL154599B (nl) | 1970-12-28 | 1977-09-15 | Organon Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen, alsmede testverpakking. |
| US3901654A (en) | 1971-06-21 | 1975-08-26 | Biological Developments | Receptor assays of biologically active compounds employing biologically specific receptors |
| US3853987A (en) | 1971-09-01 | 1974-12-10 | W Dreyer | Immunological reagent and radioimmuno assay |
| US3867517A (en) | 1971-12-21 | 1975-02-18 | Abbott Lab | Direct radioimmunoassay for antigens and their antibodies |
| NL171930C (nl) | 1972-05-11 | 1983-06-01 | Akzo Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van haptenen, alsmede testverpakkingen. |
| US3850578A (en) | 1973-03-12 | 1974-11-26 | H Mcconnell | Process for assaying for biologically active molecules |
| US3935074A (en) | 1973-12-17 | 1976-01-27 | Syva Company | Antibody steric hindrance immunoassay with two antibodies |
| US3996345A (en) | 1974-08-12 | 1976-12-07 | Syva Company | Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays |
| US4034074A (en) | 1974-09-19 | 1977-07-05 | The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University | Universal reagent 2-site immunoradiometric assay using labelled anti (IgG) |
| US3984533A (en) | 1975-11-13 | 1976-10-05 | General Electric Company | Electrophoretic method of detecting antigen-antibody reaction |
| US4098876A (en) | 1976-10-26 | 1978-07-04 | Corning Glass Works | Reverse sandwich immunoassay |
| US4879219A (en) | 1980-09-19 | 1989-11-07 | General Hospital Corporation | Immunoassay utilizing monoclonal high affinity IgM antibodies |
| US5011771A (en) | 1984-04-12 | 1991-04-30 | The General Hospital Corporation | Multiepitopic immunometric assay |
| US4736866B1 (en) | 1984-06-22 | 1988-04-12 | Transgenic non-human mammals | |
| US4666828A (en) | 1984-08-15 | 1987-05-19 | The General Hospital Corporation | Test for Huntington's disease |
| US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| US4801531A (en) | 1985-04-17 | 1989-01-31 | Biotechnology Research Partners, Ltd. | Apo AI/CIII genomic polymorphisms predictive of atherosclerosis |
| ES2004281A6 (es) | 1986-04-04 | 1988-12-16 | Univ Jefferson | Una superficie protesica implantable para implantacion en un paciente humano |
| DE3854823T2 (de) | 1987-05-01 | 1996-05-23 | Stratagene Inc | Mutagenesetest durch Verwendung von nicht menschlichen Lebewesen, die Test-DNS-Sequenzen enthalten |
| US5175385A (en) | 1987-09-03 | 1992-12-29 | Ohio University/Edison Animal Biotechnolgy Center | Virus-resistant transgenic mice |
| US6001350A (en) | 1987-12-11 | 1999-12-14 | Somatix Therapy Corp | Genetic modification of endothelial cells |
| US5674722A (en) * | 1987-12-11 | 1997-10-07 | Somatix Therapy Corporation | Genetic modification of endothelial cells |
| US5221778A (en) | 1988-08-24 | 1993-06-22 | Yale University | Multiplex gene regulation |
| US5272057A (en) | 1988-10-14 | 1993-12-21 | Georgetown University | Method of detecting a predisposition to cancer by the use of restriction fragment length polymorphism of the gene for human poly (ADP-ribose) polymerase |
| US5175384A (en) | 1988-12-05 | 1992-12-29 | Genpharm International | Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice |
| US5175383A (en) | 1989-02-17 | 1992-12-29 | President And Fellows Of Harvard College | Animal model for benign prostatic disease |
| US5272263A (en) * | 1989-04-28 | 1993-12-21 | Biogen, Inc. | DNA sequences encoding vascular cell adhesion molecules (VCAMS) |
| US5464764A (en) * | 1989-08-22 | 1995-11-07 | University Of Utah Research Foundation | Positive-negative selection methods and vectors |
| US5192659A (en) | 1989-08-25 | 1993-03-09 | Genetype Ag | Intron sequence analysis method for detection of adjacent and remote locus alleles as haplotypes |
| US5498238A (en) | 1990-06-15 | 1996-03-12 | Cortrak Medical, Inc. | Simultaneous angioplasty and phoretic drug delivery |
| ES2217250T3 (es) | 1990-06-15 | 2004-11-01 | Scios Inc. | Mamifero transgenico, no humano que muestra la patologia de formacion amiloides de la enfermedad de alzheimer. |
| US5288846A (en) | 1990-10-19 | 1994-02-22 | The General Hospital Corporation | Cell specific gene regulators |
| WO1992011895A1 (en) | 1990-12-28 | 1992-07-23 | Boston Scientific Corporation | Balloon drug delivery system |
| US5298422A (en) | 1991-11-06 | 1994-03-29 | Baylor College Of Medicine | Myogenic vector systems |
| US5925564A (en) | 1991-11-06 | 1999-07-20 | Baylor College Of Medicine | Expression vector systems and method of use |
| AU671093B2 (en) | 1992-01-07 | 1996-08-15 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Transgenic animal models for alzheimer's disease |
| US5360735A (en) | 1992-01-08 | 1994-11-01 | Synaptic Pharmaceutical Corporation | DNA encoding a human 5-HT1F receptor, vectors, and host cells |
| US5599352A (en) | 1992-03-19 | 1997-02-04 | Medtronic, Inc. | Method of making a drug eluting stent |
| US5281521A (en) | 1992-07-20 | 1994-01-25 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Modified avidin-biotin technique |
| EP0663952A4 (en) | 1992-09-11 | 1997-06-11 | Univ California | Transgenic non-human animals having targeted lymphocyte transduction genes. |
| US5634901A (en) | 1992-11-02 | 1997-06-03 | Localmed, Inc. | Method of using a catheter sleeve |
| WO1994023049A2 (en) | 1993-04-02 | 1994-10-13 | The Johns Hopkins University | The introduction and expression of large genomic sequences in transgenic animals |
| US6664107B1 (en) | 1993-05-26 | 2003-12-16 | Ontario Cancer Institute, University Health Network | CD45 disrupted nucleic acid |
| EP1118325B2 (en) | 1993-07-29 | 2010-01-06 | The United States of America, represented by the Secretary, Department of Health and Human Services | Use of Paclitaxel and its derivatives in the manufacture of a medicament for treating restenosis. |
| US5736360A (en) * | 1993-09-10 | 1998-04-07 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Endothelial cell tropic compositions and methods of making and using the same |
| AU2195095A (en) * | 1994-03-24 | 1995-10-09 | University Of Washington | Devices and methods for implanting transduced cells |
| US5700346A (en) * | 1994-07-19 | 1997-12-23 | Edwards; Peter S. | Automated slide staining system |
| US6425881B1 (en) | 1994-10-05 | 2002-07-30 | Nitrosystems, Inc. | Therapeutic mixture useful in inhibiting lesion formation after vascular injury |
| AU699821B2 (en) | 1994-10-17 | 1998-12-17 | Kabushikikaisha Igaki Iryo Sekkei | Stent for liberating drug |
| US20020026037A1 (en) * | 1995-06-06 | 2002-02-28 | Jing-Shan Hu | Vascular endothelial growth factor 3 antibodies |
| WO1997023256A1 (en) | 1995-12-22 | 1997-07-03 | Localmed, Inc. | Localized intravascular delivery of growth factors for promotion of angiogenesis |
| US5785965A (en) * | 1996-05-15 | 1998-07-28 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior Univ. | VEGF gene transfer into endothelial cells for vascular prosthesis |
| ATE343400T1 (de) * | 1996-09-24 | 2006-11-15 | Merck & Co Inc | Verbindungen zur hemmung der angiogenese durch gentherapie |
| WO1998044938A1 (en) * | 1997-04-10 | 1998-10-15 | University Of Southern California | Modified proteins which bind extracellular matrix components |
| WO1998056312A1 (en) | 1997-06-13 | 1998-12-17 | Scimed Life Systems, Inc. | Stents having multiple layers of biodegradable polymeric composition |
| US5872234A (en) | 1997-06-27 | 1999-02-16 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Human extracellular matrix proteins |
| US5899935A (en) | 1997-08-04 | 1999-05-04 | Schneider (Usa) Inc. | Balloon expandable braided stent with restraint |
| US6077987A (en) | 1997-09-04 | 2000-06-20 | North Shore-Long Island Jewish Research Institute | Genetic engineering of cells to enhance healing and tissue regeneration |
| SG117417A1 (en) * | 1998-02-06 | 2005-12-29 | Collateral Therpeutics Inc | Variants of the angiogenic factor vascular endothelial cell growth factor: vegf |
| US6364856B1 (en) | 1998-04-14 | 2002-04-02 | Boston Scientific Corporation | Medical device with sponge coating for controlled drug release |
| US6846647B1 (en) | 1998-04-28 | 2005-01-25 | Ono Pharmaceutical Co., Ltd. | Polypeptides suppressing smooth muscle cell proliferation, the encoding cDNA, and related methods |
| US6010573A (en) * | 1998-07-01 | 2000-01-04 | Virginia Commonwealth University | Apparatus and method for endothelial cell seeding/transfection of intravascular stents |
| EP1568375A1 (en) | 1998-10-26 | 2005-08-31 | Ludwig Institute For Cancer Research | Use of VEGF-C or VEGF-D gene or protein to prevent restenosis |
| US6328762B1 (en) * | 1999-04-27 | 2001-12-11 | Sulzer Biologics, Inc. | Prosthetic grafts |
| US6554857B1 (en) | 1999-07-20 | 2003-04-29 | Medtronic, Inc | Transmural concentric multilayer ingrowth matrix within well-defined porosity |
| US6589534B1 (en) * | 1999-09-30 | 2003-07-08 | Yeda Research And Development Co., Ltd. | Hepatitis B virus binding proteins and uses thereof |
| US6716242B1 (en) | 1999-10-13 | 2004-04-06 | Peter A. Altman | Pulmonary vein stent and method for use |
| US20030229393A1 (en) | 2001-03-15 | 2003-12-11 | Kutryk Michael J. B. | Medical device with coating that promotes cell adherence and differentiation |
| US7175658B1 (en) * | 2000-07-20 | 2007-02-13 | Multi-Gene Vascular Systems Ltd. | Artificial vascular grafts, their construction and use |
| HUP0300810A2 (hu) * | 2000-07-20 | 2003-08-28 | M.G.V.S. Ltd. | Mesterséges értranszplantátum, valamint ennek létrehozása és alkalmazása |
| US6939376B2 (en) | 2001-11-05 | 2005-09-06 | Sun Biomedical, Ltd. | Drug-delivery endovascular stent and method for treating restenosis |
| AU2003228382A1 (en) | 2002-03-27 | 2003-10-13 | University Of Utah Research Foundation | Elastin prevents occlusion of body vessels by vascular smooth muscle cells |
| US20040126788A1 (en) | 2002-08-13 | 2004-07-01 | Schiemann William P. | Fibulin-5 and uses thereof |
| US6918929B2 (en) | 2003-01-24 | 2005-07-19 | Medtronic Vascular, Inc. | Drug-polymer coated stent with pegylated styrenic block copolymers |
| US7906616B2 (en) | 2004-03-29 | 2011-03-15 | Kansai Medical University | Truncated DANCE, DANCE complex and method of using these |
| WO2005099695A1 (en) | 2004-04-19 | 2005-10-27 | Novartis Ag | Drug delivery systems for the prevention and treatment of vascular diseases |
| WO2006082763A1 (ja) | 2005-02-07 | 2006-08-10 | Kyoto University | Ｄａｎｃｅまたはその発現を増強する因子による弾性線維再生の方法 |
| WO2007088418A1 (en) | 2006-01-31 | 2007-08-09 | Multi Gene Vascular Systems, Inc. | Drug-eluting intravascular prostheses and methods of use |
-
2000
- 2000-07-20 HU HU0300810A patent/HUP0300810A2/hu unknown
-
2001
- 2001-07-20 PL PL01362561A patent/PL362561A1/xx unknown
- 2001-07-20 DE DE60142290T patent/DE60142290D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-07-20 CZ CZ2003253A patent/CZ2003253A3/cs unknown
- 2001-07-20 JP JP2002513384A patent/JP5067822B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2001-07-20 AU AU2001278664A patent/AU2001278664A1/en not_active Abandoned
- 2001-07-20 AT AT01956749T patent/ATE469615T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-07-20 WO PCT/IL2001/000670 patent/WO2002007646A2/en not_active Ceased
- 2001-07-20 IL IL15394601A patent/IL153946A0/xx unknown
- 2001-07-20 CA CA002416548A patent/CA2416548A1/en not_active Abandoned
- 2001-07-20 EP EP01956749A patent/EP1301146B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2002
- 2002-06-04 US US10/163,387 patent/US7364725B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2003
- 2003-01-23 ZA ZA200300635A patent/ZA200300635B/en unknown
-
2006
- 2006-01-31 US US11/344,870 patent/US7563278B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2008
- 2008-03-13 US US12/075,657 patent/US8022195B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2009
- 2009-06-02 US US12/455,521 patent/US8088160B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1301146B1 (en) | 2010-06-02 |
| JP2004506418A (ja) | 2004-03-04 |
| EP1301146A2 (en) | 2003-04-16 |
| CA2416548A1 (en) | 2002-01-31 |
| US7563278B2 (en) | 2009-07-21 |
| US7364725B1 (en) | 2008-04-29 |
| IL153946A0 (en) | 2003-07-31 |
| US20060275338A1 (en) | 2006-12-07 |
| WO2002007646A2 (en) | 2002-01-31 |
| AU2001278664A1 (en) | 2002-02-05 |
| US20090263452A1 (en) | 2009-10-22 |
| WO2002007646A3 (en) | 2002-06-13 |
| US8088160B2 (en) | 2012-01-03 |
| EP1301146A4 (en) | 2008-11-19 |
| ZA200300635B (en) | 2004-04-22 |
| JP5067822B2 (ja) | 2012-11-07 |
| HUP0300810A2 (hu) | 2003-08-28 |
| ATE469615T1 (de) | 2010-06-15 |
| US20080269472A1 (en) | 2008-10-30 |
| DE60142290D1 (de) | 2010-07-15 |
| PL362561A1 (en) | 2004-11-02 |
| US8022195B2 (en) | 2011-09-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1301146B1 (en) | Artificial vascular grafts and methods of producing and using same | |
| US7147846B2 (en) | Prosthetic grafts | |
| US5785965A (en) | VEGF gene transfer into endothelial cells for vascular prosthesis | |
| EP0892644B1 (en) | In vivo gene transfer methods for wound healing | |
| US7887581B2 (en) | Methods of hemodialysis utilizing grafts coated with cells expressing human fibulin-5 | |
| EP1307582B1 (en) | Nucleic acid constructs, vascular cells transformed therewith, pharmaceutical compositions and methods utilizing same for inducing angiogenesis | |
| WO2007088418A9 (en) | Drug-eluting intravascular prostheses and methods of use | |
| Moulson et al. | Clusterin (Apo J) regulates vascular smooth muscle cell differentiation in vitro | |
| CA2326053A1 (en) | Use of scatter factor to enhance angiogenesis | |
| WO1997026268A2 (en) | A process for inhibiting smooth muscle cell proliferation and motility | |
| JP2005052001A (ja) | 遺伝子治療剤 |