ES2217250T3

ES2217250T3 - Mamifero transgenico, no humano que muestra la patologia de formacion amiloides de la enfermedad de alzheimer.

Info

Publication number: ES2217250T3
Application number: ES91912653T
Authority: ES
Inventors: Barbara Cordell
Original assignee: Scios LLC
Current assignee: Scios LLC
Priority date: 1990-06-15
Filing date: 1991-06-17
Publication date: 2004-11-01
Anticipated expiration: 2011-06-17
Also published as: CA2085127A1; DE69133372D1; ATE260974T1; US5387742A; CA2085127C; JPH06507782A; WO1991019810A1; EP0647268A4; DE69133372T2; EP0647268A1; AU646877B2; EP0647268B1; AU8210291A

Abstract

SECUENCIAS DE DNA SINTETICO O RECOMBINANTE CLONADO RELATIVAS A LA PATOLOGIA DE LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER SE INYECTAN EN OVULOS FERTILIZADOS DE MAMIFEROS (PREFERIBLEMENTE OVULOS DE RATON). LOS OVULOS INYECTADOS SE IMPLANTAN EN HEMBRAS PSEUDO-PREÑADAS Y SE HACEN CRECER A TERMINO PARA SUMINISTRAR RATONES TRANSGENICOS CUYAS CELULAS EXPRESAN PROTEINAS RELACIONADAS CON LA PATOLOGIA DE LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER. LAS SECUENCIAS INYECTADAS SE CONSTRUYEN POSEYENDO SECUENCIAS PROMOTORAS QUE EXPRESEN LA PROTEINA DESEADA EN TEJIDOS ESPECIFICOS DEL MAMIFERO TRANSGENICO (MAS NOTABLEMENTE EN EL TEJIDO NERVIOSO). LAS PROTEINAS QUE SON PREFERIBLEMENTE EXPRESADAS DE FORMA UBICUOA INCLUYEN 1) PROTEINAS PRECURSORAS DEL NUCLEO (BETA)-AMILOIDE; Y 2) PROTEINAS PRECURSORAS RELACIONADAS CON LOS (BETA)-AMILOIDES; Y 3) UN INHIBIDOR DE LA PROTEASA DE SERINA. LOS RATONES TRANSGENICOS SUMINISTRAN MODELOS UTILES PARA ESTUDIAR LOS COMPUESTOS QUE ESTAN SIENDO COMPROBADOS PARA SU UTILIDAD EN EL TRATAMIENTO DE LA ENFERMEDADDE ALZHEIMER, Y PARA ESTUDIAR LAS RELACIONES "IN VIVO" DE ESTAS PROTEINAS ENTRE SI.

Description

Mamífero transgénico, no humano que muestra la patología de formación amiloides de la enfermedad de Alzheimer.

Mamífero no humano transgénico que presenta la patología de formación de amiloides de la enfermedad de Alzheimer.

1. Campo de la invención

La invención se refiere generalmente a modelos animales útiles para probar una hipótesis relacionada con el tratamiento de una enfermedad. Más específicamente, se refiere a mamíferos transgénicos que han tenido incorporados en su genoma segmentos específicos de material genético exógeno que codifican y en tipos celulares específicos sobreexpresarán ubícuamente proteínas \beta-amiloides, sus precursores y las porciones de tales proteínas y precursores.

2. Antecedentes de la invención

El antecedente de la presente invención es doble ya que se refiere a: (1) organismos biológicos que han sido transformados genéticamente; y (2) un estudio de material genético relacionado con la amiloidosis. Ambas áreas se tratan más abajo.

2.1. Transformaciones genéticas

Durante algún tiempo se ha sabido que es posible llevar a cabo la transformación genética de un zigoto (y del embrión y el organismo maduro que resulta de allí) mediante la colocación o inserción de material genético exógeno en el núcleo del zigoto o en cualquier material genético nucleico que por último forme parte del núcleo del zigoto. El genotipo del zigoto y el organismo que resulta del zigoto incluirá el genotipo del material genético exógeno. Adicionalmente, la inclusión de material genético exógeno en el zigoto producirá la expresión del fenotipo del material genético exógeno.

El genotipo del material genético exógeno se expresa tras la división celular del zigoto. No obstante, se producirán la expresión del fenotipo, v.g., la formación de un producto o productos proteicos del material genético exógeno, o alteraciones del fenotipo natural del zigoto o del organismo, en el momento del desarrollo del zigoto o del organismo durante el cual el material genético exógeno concreto es activo. Entre las alteraciones de la expresión del fenotipo se incluyen un aumento o disminución de la expresión del fenotipo o una alteración de la promoción y/o el control de un fenotipo, incluyendo la adición de un nuevo promotor y/o controlador o la suplementación de un promotor y/o controlador del fenotipo existente.

La transformación genética de diferentes tipos de organismos se revela y describe con detalle en la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.873.191, expedida en 10 de Octubre de 1.989, que se incorpora aquí como referencia para describir los métodos de producción de organismos transgénicos. La transformación genética de organismos se puede utilizar como un análisis in vivo de la expresión génica durante la diferenciación y en la eliminación o disminución de las enfermedades genéticas.

La transformación genética de un zigoto (y de los organismos que maduran de allí) se lleva a cabo mediante la adición de material genético exógeno de tal manera que el material genético exógeno se vuelve parte de la porción nucleica del zigoto antes de la división del zigoto. Si el material genético exógeno se añade después de la mitosis o división celular del zigoto, el material genético exógeno debe ser añadido a cada núcleo resultante. No obstante, existe la posibilidad de que el material genético exógeno no pueda ser integrado y se vuelva una parte del material genético del zigoto y del organismo que resulte de allí. Así, el material genético exógeno se puede añadir a cualquier material genético nucleico que forme parte por último del núcleo del zigoto, incluyendo el núcleo del zigoto.

El material genético nucleico del organismo que está siendo transformado debe estar en un estado físico que lo capacite para absorber el material genético exógeno. Existen numerosas rutas para lograr esto. Por ejemplo, el material genético exógeno se puede colocar en el núcleo de una célula germinal primordial que sea diploide, v.g., un espermatogonio u oogonio. Se permite después que la célula germinal primordial madure hasta un gameto, que después se une con otro gameto o fuente de un juego haploide de cromosomas para formar un zigoto.

El material genético exógeno se puede colocar en el núcleo de un huevo maduro. Es preferible que el huevo esté en un estado fertilizado o activado (mediante partenogénesis). Tras la adición del material genético exógeno, se añade un juego haploide complementario de cromosomas (v.g., un célula espermática o cuerpo polar) para posibilitar la formación de un zigoto. Después se deja que el zigoto se desarrolle hasta un organismo por ejemplo implantándolo en una hembra pseudopreñada. Se analiza la integración del material genético exógeno en el organismo resultante. Si se determina integración positiva, el organismo puede ser utilizado para el análisis in vivo de la expresión génica, cuya expresión se cree está relacionada con una enfermedad genética concreta.

Se han realizado intentos para estudiar algunos tipos diferentes de enfermedades genéticas utilizando semejantes animales transgénicos. Los intentos para estudiar la enfermedad de Alzheimer se describen en la solicitud PCT publicada WO89/06689 y en la solicitud PCT WO89/06693, ambas publicadas el 27 de Julio de 1.989, cuyas solicitudes publicadas se incorporan aquí como referencia para describir las secuencias genéticas que codifican la proteína \beta-amiloide del Alzheimer y la incorporación de semejantes secuencias al genoma de los animales transgénicos.

Como se describe con detalle más abajo, se cree que la producción de la proteína \beta-amiloide está relacionada con la enfermedad de Alzheimer. No obstante, un serio obstáculo para la elucidación del mecanismo molecular implicado en la síntesis y el depósito amiloide en un cerebro con enfermedad de Alzheimer ha sido la no disponibilidad de modelos animales satisfactorios para este trastorno únicamente humano. En las solicitudes PCT publicadas WO/8906689 y WO89/06693 se describen secuencias de ADN concretas que se cree que están relacionadas con la producción de amiloide. Estas secuencias concretas se fusionan con vectores virales tumorales recientemente desarrollados, derivados de los virus SV40 y JC para producir constructos. Estos constructos se utilizan para transfectar células y ratones transgénicos para establecer modelos para la sobreexpresión amiloide, que puede estar relacionada con la acumulación amiloide en el cerebro con enfermedad de Alzheimer.

Se pretende que los animales transgénicos producidos según la presente invención proporcionen un medio experimental para elucidar aspectos de la patogénesis molecular de la enfermedad de Alzheimer y sirvan como herramientas para seleccionar fármacos que puedan tener aplicación potencial como agentes terapéuticos para prevenir o limitar la acumulación amiloide.

2.2. La enfermedad de Alzheimer y la proteína \beta-amiloide

Se estima que por encima del 5% de la población de los Estados Unidos mayor de 65 años y por encima del 15% de la población de los Estados Unidos mayor de 85 años están acosados por alguna forma de la enfermedad de Alzheimer (Cross, A.J., Eur J Pharmacol (1982) 82: 77-80; Terry, R.D., et al., Ann Neurol (1983) 14:497506). Se cree que la causa principal para el confinamiento de ancianos en instalaciones de atención a largo plazo es debida a esta enfermedad, y aproximadamente el 65% de las muertes en asilos especializados lo padecen.

Se conocen algunos hechos a cerca de los fenómenos bioquímicos y metabólicos asociados con la presencia de la enfermedad de Alzheimer. Dos cambios morfológicos e histopatológicos observados en cerebros con enfermedad de Alzheimer son las marañas neurofibrilares (NFT) y los depósitos amiloides. Las marañas neurofibrilares están presentes también en otras enfermedades degenerativas, pero la presencia de depósitos amiloides tanto en los espacios interneuronales (placas neuríticas) y en la microvasculatura circundante (placas vasculares) parecen ser características del Alzheimer. De estas, las placas neuríticas parecen ser las más prevalentes (Price, D.L., et al., Drug Developmen Research (1985) 5:59-68). También se han observado placas en cerebros de pacientes con enfermedad de Alzheimer de cierta edad.

La proteína que forma el grueso de estas placas ha sido parcialmente purificada y secuenciada. Se han utilizado cerebros ricos en placas de pacientes con Alzheimer fallecidos como fuente para extraer un polipéptido "núcleo" de 4,2 kd, la proteína núcleo de la placa amiloide (APCP en sus siglas en Inglés), referida aquí como "proteína núcleo \beta-amiloide". Este péptido fue denominado proteína \beta por Glenner, G., et al., [Biochem Biophys Res Commun (1984) 120:885-890]. Se ha determinado la secuencia de aminoácidos del extremo amino [Glenner, G., et al., Biochem Biophys Res Commun (1984) 122:1131- 1135; Masters, C.L., et al., Proc Natl Acad Sci USA (1985) 82:4245-4259] y las secuencias de aminoácidos presentadas por los dos grupos son idénticas excepto que Glenner et al., informan de una glutamina en la posición 11 para el amiloide vascular cerebral de la enfermedad de Alzheimer mientras que Masters et al., informan de un ácido glutámico en la posición 11. Asimismo, los primeros autores refieren que el amiloide vascular cerebral tiene un único extremo amino mientras que los últimos autores refieren que la forma encontrada en núcleos de las placas amiloides tiene un extremo amino "desigual" - esto es, los péptidos aislados de esta fuente parecen haber perdido los aminoácidos 3, 7, u 8 del extremo amino. Ambos grupos han demostrado que se encuentra el mismo péptido en los núcelos de la placa amiloide y en el amiloide vascular de individuos adultos afectados por el síndrome de Down y han informado sobre un ácido glutámico en la posición 11.

Roher, A., et al., Proc Natl Acad Sci USA (1986) 83:2662-2666 también llevaron a cabo estudios adicionales sobre la proteína núcleo \beta-amiloide que mostraron la composición de aminoácidos completa de la proteína \beta, y verificaron que coincidía con las de la proteína desconocida. Sin embargo, las composiciones obtenidas no estaban, evidentemente, de acuerdo con las de Allsop, D., et al., Brain Res (1983) 259:348352; ni de acuerdo con las publicadas por Glenner o Masters (supra).

Wong, C.W., et al., Proc Natl Acad Sci USA (1985) 82:8729-8732 demostraron que un péptido sintético que era homólogo a los diez primeros aminoácidos de la proteína núcleo \beta-amiloide descrita por Masters (supra) era capaz de originar los anticuerpos en ratones y que estos anticuerpos podían ser utilizados para teñir no sólo vasos cerebrales cargados de amiloide, sino también placas neuríticas. Estos resultados fueron confirmados por Allsop, D. et al., Neuroscience Letters (1986) 68:252-256 utilizando anticuerpos monoclonales dirigidos a un péptido sintético correspondiente a los aminoácidos 8-17. De este modo, en general, la proteína de la placa encontrada en diferentes localizaciones del cerebro de pacientes con Alzheimer parece que tiene una inmunorreactividad similar. Es altamente insoluble, como se demuestra por la incapacidad de lograr la solubilización en muchos desnaturalizantes utilizados comúnmente tales como detergentes y agentes caotrópicos (Masters, supra, Allsop, D., et al., (supra)).

Se cree, por analogía con algunas otras proteínas amiloides, que la proteína núcleo \beta-amiloide se puede formar a partir de un precursor en el sistema circulatorio periférico o en el sistema linfático. Existen seis ejemplos conocidos de depósitos amiloides asociados con enfermedad en los que se conoce la naturaleza de la proteína precursora de la proteína amiloide; para la amiloidosis primaria, la fuente es una cadena larga de inmunoglobulina; para la amiloidosis secundaria, el precursor es la proteína A amiloide; para la polineuropatía amiloide familiar y la amiloidosis cardíaca senil, la prealbúmina también conocida como transtireitina o una variante de la misma; para el carcinoma medular de tiroide, un fragmento de procalcitonina; y para la hemorragia cerebral hereditaria, un fragmento gamma traza que se ha demostrado que es la cistatina C. (Ver, v.g., Glenner, G., New England Journal of Medicine (1980) 302:1283; Sletton, K., et al., Biochem J (1981) 195:561; Benditt, et al., FEBS Lett (1971) 19:169; Sletton, K., et al., Eur J Biochem (1974) 41:117; Sletton, K., et al., J. Exp Med (1976) 143:993). Lo anterior es una lista parcial y existen al menos varias referencias adicionales con respecto al fragmento de procalcitonina como precursor del amiloide del carcinoma de tiroide. Alternativamente, o adicionalmente, semejante precursor de la proteína núcleo \beta-amiloide puede ser producido en el cerebro o en otra parte y se deposita específicamente en el cerebro.

Se ha descrito que existe una proteína que contiene la secuencia de la proteína núcleo \beta-amiloide (referida como A4) en el marco de una proteína más grande (Kang, J., et al., Nature (1987) 325:733-736). Esta proteína, que es un precursor potencial in vivo de la proteína núcleo \beta-amiloide, fue pronosticada a partir de la secuencia de un clon de ADNc aislado de una genoteca de ADNc de tejido cerebral fetal humano y consta de 695 restos aminoácido (referida como A695) donde el extremo amino de la proteína núcleo \beta-amiloide comienza en la posición 597. Por analogía con las series antes descritas, puede ser que semejante precursor o un fragmento del mismo circule en el suero a un nivel más alto diferenciable en víctimas de la enfermedad de Alzheimer respecto a individuos no afectados. Alternativamente o adicionalmente, semejantes diferencias pueden ser detectadas en el fluido cerebroespinal.

Parece como si hubiera diversas proteínas precursoras además de A695, que fue descrita por Kang et al. Una de tales proteínas precursoras es descrita en la solicitud de los Estados Unidos co-pendiente con el Número de Serie 361.912, presentada el 6 de Junio de 1.989, por investigadores de la misma organización investigadora que los autores de la presente invención (A751). Otros han caracterizado una proteína precursora amiloide adicional (ver Kitaguchi et al., Nature 331:530- 532 (1988), que es ligeramente más grande, de 770 amino ácidos. Se señala que estas proteínas A751 y A770 contienen un inserto de aproximadamente 57 aminoácidos detrás de A695. Esta secuencia inserto de 57 aminoácidos es altamente homóloga a varios inhibidores de tipo Kunitz que son específicos para algunos inhibidores de serina proteasas. Están presentes 19 aminoácidos adicionales adyacentes al inserto de 57 aminoácidos en la forma A770.

Como se ha indicado mediante las publicaciones anteriores y otras numerosas publicaciones no citadas, el material genético que codifica la producción de las proteínas precursoras \beta-amiloides es el sujeto de un intenso estudio. No obstante, hasta el presente, no existe información verificable directa disponible sobre el mecanismo específico que regula la producción y el depósito de proteína amiloide en el cerebro con enfermedad de Alzheimer. Se sabe que el material genético que codifica la producción de la proteína precursora \beta-amiloide está en el cromosoma 21. Adicionalmente, numerosos estudios sugieren que existen interacciones complejas que implican al material genético de este cromosoma. Se cree que tales interacciones implican la producción de proteínas precursoras, proteasas e inhibidores de proteasa. Adicionalmente, se cree que en individuos que padecen la enfermedad de Alzheimer estas interacciones están de algún modo sesgadas de manera que se produce y/o deposita un contenido inusualmente alto de proteína núcleo \beta-amiloide en el cerebro. La elevada concentración de proteína núcleo \beta-amiloide podría ser el resultado de una variedad de actividades bioquímicas incluyendo la sobreproducción de semejantes proteínas y/o la incapacidad para escindir un número suficiente de tales proteínas una vez escindidas.

Los animales transgénicos de la presente invención proporcionarán una nueva percepción con respecto a cómo y donde se producen estas interacciones y de este modo proporcionan modelos más útiles para probar la eficacia de ciertos fármacos para prevenir o reducir la acumulación de proteína núcleo \beta-amiloide en el cerebro. Los mamíferos no humanos transgénicos de la presente invención incluyen material genético recombinante que consta de segmentos específicos de proteínas precursora \beta-amiloides cuyos segmentos se fusionan con promotores específicos capaces de expresar la proteína en tejidos específicos tales como tejidos nerviosos generalmente y/o en tipos específicos de tejido nervioso, v.g., en el cerebro.

3. Compendio de la invención

La presente invención proporciona un medio para elucidar los mecanismos moleculares implicados en la síntesis y, de modo más importante, inhibir la síntesis y el depósito de proteína \beta-amiloide (de manera más importante, en el cerebro) inhibiendo la producción y/o incrementando la escisión tras la producción. Se inyectan secuencias de ADN recombinante o sintético clonado relacionadas con la patología de la enfermedad de Alzheimer en huevos de mamífero fertilizados (preferiblemente huevos de ratón). Los huevos inyectados se implantan en hembras pseudopreñadas y se desarrollan a término para proporcionar ratones transgénicos cuyas células expresan las proteínas relacionadas con la patología de la enfermedad de Alzheimer. Las secuencias inyectadas son constructos que tienen secuencias promotoras conectadas de manera que expresan la proteína deseada en tejidos específicos de los mamíferos transgénicos.

Se cree que las proteínas núcleo \beta-amiloides A99 y A42 (como se ha definido aquí) se expresan primero en forma de las proteínas precursoras A695 y/o A751. Las proteínas precursoras se pueden someter a la acción de una enzima proteasa lo que permite la formación de proteínas núcleo \beta-amiloides, que, cuando se producen en cantidades suficientes, permiten la formación de placas asociadas con la enfermedad de Alzheimer.

En relación con la presente invención las secuencias de nucleótidos que codifican la producción de proteínas precursoras \beta-amiloides y proteínas núcleo \beta-amiloides específicas están conectadas a secuencias promotoras específicas. Las secuencias promotoras se eligen cuidadosamente de manera que algunas secuencias expresen la secuencia de nucleótidos a la que están ancladas en todos los tipos de tejidos mientras que otras secuencias promotoras sólo expresan el nucleótido al que están ancladas cuando el promotor está presente en tipos específicos de células de un tipo específico de tejido v.g., tejido nervioso. Produciendo semejante ratón transgénico, se puede obtener información adicional con respecto a donde y cuándo se producen (y a veces se degradan) y depositan las proteínas núcleo \beta-amiloides en un cerebro con enfermedad de Alzheimer. Utilizando esta información adicional referente al mecanismo y la localización de la producción (y posible degradación) y depósito de proteínas núcleo \beta-amiloides, se pueden probar más eficazmente agentes terapéuticos con respecto a su capacidad para prevenir la producción y/o el depósito de tales proteínas y aliviar o prevenir de este modo la enfermedad de Alzheimer.

Los mamíferos transgénicos de esta invención proporcionan modelos útiles para estudiar las relaciones in vivo de las proteínas entre sí y con otros compuestos que se van a someter a ensayo en cuanto a su utilidad para tratar la enfermedad de Alzheimer.

3.1. Objetos, características y ventajas

Un objeto primordial de esta invención es proporcionar un mamífero transgénico no humano cuyas células incluyan una secuencia de ADN recombinante que codifique la expresión específica del tipo celular de proteínas \beta-amiloides cuyos mamíferos se pueden utilizar para el estudio de la etiología de la enfermedad de Alzheimer y de la eficacia de los fármacos en el tratamiento de la enfermedad.

Una ventaja de la presente invención es que proporciona un medio in vivo para estudiar los efectos de la expresión de diferentes proteínas en diferentes tejidos (v.g., tejido nervioso incluyendo los tipos específicos de tejidos nerviosos y tejido no nervioso) con relación a la síntesis de proteína \beta-amiloide y la formación de placas asociadas con la enfermedad de Alzheimer.

La presente invención proporciona un mamífero transgénico no humano cuyas células contienen la secuencia de ADN recombinante o sintético clonado cuya secuencia comprende:

una secuencia promotora específica de tejido nervioso que es un promotor de la enolasa específico neuronal; y

una secuencia codificadora que codifica la proteína precursora \beta-amiloide A751 y donde la secuencia promotora y la secuencia codificadora asociadas operativamente entre sí, son incorporadas establemente en el genoma del mamífero no humano y se expresan para formar depósitos de proteína \beta-amiloide en el cerebro del mamífero no humano.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para producir un zigoto transformado genéticamente capaz de desarrollarse en un mamífero transgénico no humano caracterizado por tener una pluralidad de células que contienen una secuencia de ADN recombinante o sintético clonada, comprendiendo la secuencia:

una secuencia promotora específica de tejido nervioso que es un promotor de la enolasa específico neuronal asociado operablemente con una secuencia codificadora que codifica la proteína precursora \beta-amiloide A751 cuyo método comprende la etapa de:

introducir la secuencia promotora y la secuencia codificadora en un pronúcleo de un zigoto de mamífero mediante microinyección, siendo dicho zigoto susceptible de desarrollo en un mamífero, obteniéndose de ese modo un zigoto transformado genéticamente;

donde dichas secuencia promotora y secuencia codificadora se seleccionan de manera que la secuencia codificadora no está activada de tal manera y grado que evitaría el desarrollo normal del embrión a término;

donde la proteína precursora \beta-amiloide se expresa para formar depósitos de proteína \beta-amiloide en el cerebro del mamífero no humano.

Una característica de los mamíferos transgénicos de la invención es que proporcionan medios prognósticos y diagnósticos para el estudio de la enfermedad de Alzheimer y para determinar la eficacia de las drogas farmacéuticas en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer en un sujeto de prueba. Inicialmente, los ratones transgénicos se utilizan como patrones para identificar uno o más compuestos cantidato capaces de metabolizar la proteína \beta-amiloide (o evitar su formación) que está asociada con una predisposición a la enfermedad de Alzheimer.

Entre otros objetos, ventajas y características de la presente invención se incluye proporcionar mamíferos no humanos transgénicos que proporcionen información concerniente al mecanismo y a la localización de la producción y disposición de la proteína núcleo \beta-amiloide así como proporcionen modelos in vivo para probar fármacos capaces de interferir con o de evitar semejantes producción y/o disposición.

Este y otros objetos, características y ventajas de la invención se volverán más completamente evidentes cuando se lea la siguiente descripción detallada de la invención junto con las figuras adjuntas.

4. Breve descripción de los dibujos

La Figura 1, que incluye 1-1, 1-2, 1-3 y 1-4, muestra la secuencia de bases de un clon de ADNc, denominado \lambdaAPCP168i4, que codifica los aminoácidos 1-751 de la proteína precursora \beta-amiloide. El inserto de 168 pb, que distingue este clon de la secuencia de Kang. et al. está subrayado.

La Figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos de A99.

La Figura 3 muestra la secuencia de aminoácidos de A42 que corresponde a la proteína núcleo \beta-amiloide.

La Figura 4 muestra la estrategia de construcción del promotor NSE conectado a A42 y A99.

La Figura 5 muestra la estrategia de construcción del promotor NSE conectado a A695 y A751.

La Figura 6 muestra la estrategia de construcción del promotor MT conectado a A42 y A99.

La Figura 7 muestra el esquema de construcción para un vector de expresión en células de mamíferos para la expresión de MT-A751 y MT-A695.

La Figura 8 incluye 8-1 y 8-2 y muestra la afinidad del péptido codificado por el inserto \lambdaAPCP168i4 de 168 pb por una superfamilia de proteínas, muchos de cuyosmiembros manifiestan actividad inhibidora de las serina protea-
sas.

La Figura 9 muestra la secuencia promotora NSE y un Esquema de Amplificación de la PCR para NSE.

La Figura 10 muestra un esquema de construcción para un vector de expresión en células de mamífero para la expresión/selección \beta-amiloide de constructos núcleo \beta-amiloide.

La Figura 11A muestra un diagrama esquemático del transgen NSE-A751.

La Figura 11B muestra una hibridación de Southern de ADN recogido de ratones de tipo salvaje y transgénicos.

La Figura 12 (A, B, C y D) muestra la tinción con inmunoperoxidasa de cerebro humano y de ratón.

La Figura 13 (A, B, C, D y E) son fotomicrografías de depósitos imunorreactivos en cerebros de NSE-A751.

5. Descripción detallada de las realizaciones preferidas

Antes de describir los presentes ratones transgénicos y los procedimientos para elaborar y utilizar semejantes fármacos de ensayo, se debe entender que esta invención no está limitada a los procedimientos y materiales concretos descritos ya que tales métodos y materiales pueden por supuesto variar. También se debe entender que la terminología utilizada aquí tiene el propósito de describir sólo reivindicaciones concretas, y no se pretende que sea limitante puesto que el alcance de la presente invención únicamente estará limitado por las reivindicaciones adjuntas.

Se debe observar que según se utilizan en esta memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una", "el" o "la" incluyen los referentes plurales a no ser que el contexto dicte claramente lo contrario. Así, por ejemplo, en la referencia a "un clon" o "una secuencia" se incluyen mezclas de clones o secuencias del tipo descrito, en la referencia a "una proteína amiloide" se incluyen la referencia a mezclas de semejantes proteínas del tipo descrito, y en la referencia a "el ratón transgénico" se incluyen diferentes especies de semejantes ratones etcétera.

5.1. Definiciones

Los términos "proteína núcleo" y "proteína núcleo \beta-amiloide" significan una proteína de 99 aminoácidos como se muestra en la Figura 2 y fragmentos de la misma tales como la secuencia de 42 aminoácidos como se muestra en la Figura 3. Semejantes proteínas son también referidas aquí como A99 y A42. Masters, C.L., et al., Proc Natl Acad Sci USA (1985) 82:4245-4249, referidos aquí como "Masters et al." describen una proteína núcleo de 42 aminoácidos.

"A99" es un símbolo que representa los 99 aminoácidos C-terminales del precursor \beta-amiloide y se considera una "proteína núcleo".

"A42" hace referencia a una proteína núcleo del precursor \beta-amiloide. El extremo N es el extremo N del núcleo de 42 aminoácidos y contiene por consiguiente el dominio del núcleo completo. Según se utiliza a lo largo de esta aplicación, el término A42 corresponde a la secuencia núcleo de 42 aminoácidos de la proteína precursora \beta-amiloide.

La "proteína relacionada \beta-amiloide" se define aquí como: (1) una proteína de 751 aminoácidos como se muestra en la Figura 1; (2) una proteína de 695 aminoácidos como se muestra en la Figura 1 menos los 57 aminoácidos subrayados; (3) la secuencia de 57 aminoácidos subrayada en la Figura 1; y (4) análogos de cualquiera de (1)-(3) y fragmentos de los mismos incluyendo, pero no limitados a, A99 y A42. Como ejemplo, este término se utiliza para hacer referencia a la proteína descrita por Kang, J. et al., Nature (1987) 325:733-736, referida aquí como "Kang, et al." que contiene la proteína núcleo \beta-amiloide en su estructura en el aminoácido 597 de una proteína de 695 aminoácidos.

En la "proteína precursora \beta-amiloide" se incluye un subgrupo de las "proteínas relacionadas \beta-amiloides" definidas antes. Semejantes proteínas precursoras fueron descritas primero por "Kang et al." y son producidas naturalmente en forma de proteínas precursoras más grandes de la "proteína núcleo \beta-amiloide"; la secuencia de 751 aminoácidos es el ejemplo más notable de una proteína precursora utilizada en relación con la invención.

El "péptido núcleo \beta-amiloide inmunogénico" o el "péptido \beta-amiloide relacionado inmunogénico" hace referencia a péptidos cuyas secuencias de aminoácidos coinciden con las de alguna región de la proteína núcleo \beta-amiloide o de la proteína precursora \beta-amiloide, y que son capaces de provocar una respuesta con anticuerpos en un animal inmunizado. Los ejemplos de tales proteínas son descritos con detalle por Kitaguchi et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 166, Núm. 3, Feb. 14, 1990.

La "predisposición genética a la enfermedad de Alzheimer" hace referencia a una mutación genética o alteración identificable encontrada en los genomas de individuos con la enfermedad de Alzheimer, o aquellos individuos destinados a desarrollar la enfermedad de Alzheimer, pero no en individuos normales (sin enfermedad).

"A4i" según se utiliza aquí hace referencia a la secuencia de 57 aminoácidos subrayada en la Figura 1. "A4i" puede ser un polipéptido correspondiente al inhibidor de la serina proteasa novedoso codificado por el polinucleótico derivado del bacteriofago \lambdaAPCP168i4. El polipéptido A4i no está necesariamente derivado físicamente del producto de expresión de este bacteriófago, pero puede ser generado de cualquier manera, incluyendo síntesis peptídica, técnicas de ADN recombinante o combinaciones de las mismas. "Correspondiente" significa homóloga o sustancialmente equivalente a la secuencia designada.

El "material genético" es un material que contiene una o varias secuencias de ADN cualesquiera ya sea purificadas o en estado nativo tal como un fragmento de un cromosoma o un cromosoma completo, ya sean secuencias de ADN de origen natural o preparadas sintéticamente o parcialmente sintéticamente, secuencias de ADN que constituyen uno o varios genes y quimeras génicas, v.g., creadas ligando diferentes secuencias de ADN. En el material genético no se incluyen las secuencias de ADN incorporadas a o portadas por un plásmido, un virus o un fago.

El "material genético exógeno" es un material genético no obtenido de o que no forma naturalmente parte de las células germinales específicas o gametos que forman el zigoto concreto que está siendo transformado genéticamente.

La "secuencia de ADN" es una secuencia lineal que consta de cualquier combinación de los cuatro monómeros del ADN, es decir, los nucleótidos de adenina, guanina, citosina y timina, que codifica la información genética, tal como un código para un aminoácido, un promotor, un control o un producto génico. Una secuencia de ADN específica es la que tiene una función específica conocida, v.g., codifica un polipéptido concreto, un rasgo genético concreto o afecta a la expresión de un fenotipo concreto.

Un "gen" es la unidad independientemente funcional, más pequeña de material genético que codifica un producto proteico o controla o afecta a la transcripción y comprende al menos una secuencia de ADN.

El "genotipo" es la constitución genética de un organismo.

El "fenotipo" es una colección de rasgos morfológicos, fisiológicos y bioquímicos poseídos por una célula u organismo que resulta de la interacción del genotipo y el medio ambiente.

La "expresión fenotípica" es la expresión del código de una o varias secuencias de ADN que ocasiona la formación de un producto, v.g., un polipéptido o una proteína, o altera la expresión del fenotipo natural de los zigotos o de los organismos.

El "zigoto" es una célula diploide que tiene el potencial para el desarrollo de un organismo completo. El zigoto puede producirse por partenogénesis, transplante nuclear, la fusión de dos gametos mediante fertilización natural o artificial o cualquier otro método que cree una célula diploide que tenga el potencial para desarrollarse en un organismo completo. El origen del zigoto puede ser a partir de cualquier reino animal o vegetal.

La "partenogénesis" es cualquier técnica que permite el desarrollo de un gameto femenino o masculino en una célula y su desarrollo en un organismo, cuya técnica es diferente del desarrollo natural de gametos femeninos y masculinos.

5.2. Visión de conjunto de la descripción y organización

Con el fin de exponer y describir esta invención de una manera organizada, se describen los aspectos particulares de la invención en diferentes secciones. La definición de términos se ha dado antes en la Sección 5.1.

En la siguiente Sección 5.3. se describen las diferentes secuencias de ADN que expresan diferentes proteínas, proteínas precursoras e inhibidores, así como secuencias promotoras que se fusionan con estas secuencias con el fin de obtener la expresión de la proteína en tejidos concretos. Estas secuencias se describen en parte mediante depósitos biológicos realizados en relación con esta descripción y mediante la referencia a las figuras adjuntas.

En la sección 5.4. de la exposición se describen los protocolos mediante los cuales fue posible confirmar que la secuencia descrita en la sección 5.3 podría ser expresada para producir proteínas.

En la sección 5.5. se describen ocho diferentes constructos de promotor/secuencia A4 y, con referencia a las Figuras 4-7, se describe la síntesis de los constructos.

En la sección 5.6. se describen los métodos para producir el ratón transgénico de la invención utilizando las secuencias de ADN, los constructos y otra información descrita en las secciones anteriores.

Los diferentes métodos y materiales utilizados en relación con los diferentes aspectos de la invención se describen en la Sección 5.7.

Siguen los Ejemplos Detallados, las Reivindicaciones y el Resumen.

5.3. Secuencias de ADN

Con el fin de describir el ratón transgénico de la presente invención, es necesario describir algunas secuencias de ADN. Por ejemplo, es importante describir la secuencia de ADN que codifica la proteína precursora \beta-amiloide que comprende la secuencia de nucleótidos y la correspondiente, la secuencia de aminoácidos deducida mostrada en la Figura 1. Esta secuencia de ADN codifica una proteína de aproximadamente 82.610 dalton que contiene la proteína núcleo \beta-amiloide relacionada.

Como primera etapa para producir el ratón transgénico de la presente invención, la secuencia de ADNc de la proteína \beta-amiloide, mostrada en la Figura 1, puede ser obtenida de cualquier manera conocida por los expertos en la técnica. Un método para obtener A751 es aislándola del bacteriófago que contiene el clon de ADNc \lambdaAPCP168i4. Este clon de ADNc de fibroblasto humano conocido como \lambdaAPCP168i4 fue consignado en la ATCC el 1 de Julio, de 1987 y tiene el Núm. de acceso 40347.

El inserto de 168 pares de bases (subrayado en la Figura 1) interrumpe el codón para Val_{289} de la secuencia de Kang et al., produciendo la pérdida de este aminoácido de la proteína \lambdaAPCP168i4. El inserto de 168 pares de bases, junto con los tres pares de bases ganados a partir del codón Val_{289} interrumpido, codifican 57 nuevos aminoácidos, que están subrayados en la Figura 1. Aguas abajo de esta inserción, en el codón 653 de la Figura 1, se ubica el aspartato amino-terminal de la proteína núcleo \beta-amiloide descrita por Masters et al.

Una característica única de los ratones transgénicos de la presente invención tiene que ver con la inclusión de promotores específicos celulares al frente de la secuencia que codifica A751.

La capacidad de los ratones transgénicos para expresar selectivamente estos péptidos concretos (en tipos específicos de células), incluyendo cualquier fragmento de los mismos, distingue los presentes ratones transgénicos de otros.

Las secuencias de ADN recombinante y/o sintético clonadas se utilizan a propósito de la presente invención. Entre las secuencias concretas que son codificadas para la producción de una proteína replegada, biológicamente activa se incluyen:

Nombre A4	Descripción	Secuencia en la Fig.
A42	dominio del núcleo \beta-amiloide	3
A99	cola carboxi \beta-amiloide	2
A695	proteína precursora \beta-amiloide	1
A751	precursor más inhibidor	1
A4i	inhibidor de la proteasa	1

A4i está subrayado en la Figura 1 y los ratones que incorporan una secuencia que expresa A4i generalmente o en células específicas son parte de la presente invención (esto es, a pesar de los promotores específicos celulares) puesto que la proteína A4i puede por sí misma ser un compuesto valioso para prevenir o reducir los efectos de la enfermedad de Alzheimer. Los animales transgénicos que contienen las secuencias que expresan A4i no eran conocidos hasta ahora.

5.4 Producción de proteínas

Los clones de ADNc que incluyen las secuencias codificadoras pueden ser expresados para obtener una cualquiera de A42, A99, A695, A751 y A4i. Las secuencias se insertan primero en un vector de expresión adecuado para la replicación y para confirmar la producción de proteína.

Brevemente, se construyó un vector de expresión en E. coli denominado pAPCP118-3 para la expresión de una proteína de fusión que constaba de 655 a 751 restos aminoácido mostrada en la Figura 1. La construcción de pAPCP118-3 se completó ensamblando los tres fragmentos siguientes: (1) una cadena principal plasmídica (que constaba de las funciones de replicación de pBR322, un gen de resistencia a la ampicilina, el promotor del triptófano y un operador, un sitio de unión al ribosoma, un ADN que codifica los siete codones amino terminales del gen estructural de la \beta-galactosidasa seguido de seis restos treonina, y señales para la terminación de la transcripción); (2) un fragmento EcoRI-HaeII que codifica los restos aminoácido 655-728 de la secuencia de la Figura 1; y (3) un fragmento sintético que codifica los restos aminoácido 729-751 de la secuencia de la Figura 1, seguido de un codón de terminación.

El vector resultante se utilizó para transformar E. coli W3110 y se indujo la expresión de la proteína de fusión reduciendo la concentración de triptófano seguido de la adición de ácido 3-\beta-indolacrílico. La proteína resultante puede ser purificada utilizando técnicas de purificación convencionales y el material purificado resultante es asequible para el uso en la producción de anticuerpos para análisis de diagnóstico.

La secuencia codificadora completa de la proteína precursora \beta-amiloide mostrada en la Figura 1 fue subclonada en dos fragmentos del clon \lambdaAPCP168i4 consignado y preparada para la inserción en vectores de expresión de virus vaccinia pSC11 o pUV1. Brevemente, un fragmento EcoRI de 1,06 kilobases (kb), que abarca los restos aminoácido 655-751 de la proteína ilustrada en la Figura 1, fue clonado en el plásmido digerido con EcoRI pGEM-3® (asequible de Promega Biotec) para crear un vector intermedio denominado p4BI. Con posterioridad p4BI fue digerido con HindIII para eliminar la mayor parte de la secuencia no codificadora 3' de la secuencia relacionada \beta-amiloide. El vector resultante p4WRI fue digerido con EcoRI y tratado con fosfatasa alcalina de intestino de ternera antes de la ligadura con el fragmento EcoRI de 2088 pb derivado de \lambdaAPCP168i4 para formar p4T4B. Este plásmido fue digerido con SmaI y XmnI para generar un fragmento de 2678 pb que abarcaba la proteína completa que codifica la secuencia mostrada en la Figura 1.

El gen que codifica este fragmento SmaI-XmnI fue insertado en uno de los dos vectores virales vaccinia bien conocidos, pSC11 y pUV1, para la posterior expresión de la proteína precursora \beta-amiloide en células de riñón de mono CV-1 utilizando un sistema de expresión transitoria eucariótico como describen Cochran, M.A., et al., Proc Natl Acad Sci USA (1985) 82:19-23. Más comúnmente, estos vectores se utilizan para la producción de proteínas y anticuerpos in vivo en animales después de que sus secuencias han sido insertadas en el genoma del virus vaccinina.

De un modo similar, se pueden utilizar vectores de mamíferos para la expresión de la proteína núcleo \beta-amiloide o de las proteínas precursoras \beta-amiloides descritas aquí. Un vector de mamífero útil que utiliza la \beta-actina humana como promotor se muestra en la Figura 10. Los detalles con respecto a la descripción del vector mostrado en la Figura 10 son los siguientes:

Los pares de bases 1-4.300 son el fragmento EcoRI-AluI de 4,3 kb del producto aislado del gen de la \beta-actina humana p14T\beta-17 (Leavitt et al., Mol. Cell. Biol. (1984) 4:1961-1969).

Para los detalles de la secuenciación del promotor, ver Ng et al., Mol. Cell. Biol. (1985) 5:2720-2732. Se indican el sitio de la protección terminal, la región no traducida 5' y las posiciones IVS 1. No hay un codón ATG presente en 5'UT ni en la región poliligadora del sitio de empalme 3' respecto del sitio BamHI.

Los pares de bases 4.300-4.320 están derivados en parte del poliligador pSP64 (Melton et al., Nucl. Acids Res. (1984) 12:7035-7056).

Los pares de bases 4.320-6.600 están derivados de pcDV (Okavama & Berg, Mol. Cell. Biol. (1983) 3:280-289) y contiene el gen Amp^{R} y el origen bacteriano de pBR322 más la señal de poliadenilación tardía de SV40.

Los pares de bases 6.600-10.000 son el fragmento PvuII-EcoRI de pSV2-neo (Southern-Berg, J. Mol. App. Genet. (1982) 1:327-341) conteniendo el gen neo bacteriano conectado al promotor ori más el temprano de SV40. La dirección de la transcripción es la indicada. El vector puede ser utilizado para la eficiente expresión de la proteína en células CHO.

Un ejemplo de otro vector potencialmente útil es el plásmido phGH-SV (10) (un plásmido descrito en EPA 217.822, publicada el 15 de Abril de 1.987, e incorporada aquí como referencia) que contiene una cadena principal plasmídica pUC8, elementos promotores y reguladores del gen hMT-IIa, el promotor de ADN de SV-40 y elementos intensificadores, y las porciones codificadoras del gen hGH y secuencias reguladoras 3'. Este plásmido puede ser digerido con BamHI y SmaI y tratado con ligadores BamHI para suprimir la secuencia que codifica la proteína de la hormona del crecimiento humana y dejando las secuencias no codificadoras 3' y los elementos reguladores anclados a la cadena principal plasmídica. Esta porción de ADN de aproximadamente 5.100 pares de bases es purificada en gel y ligada a conectores BamHI.

La digestión con BamHI, la repurificación del fragmento de ADN y la posterior ligadura producen un plásmido denominado pMTSV40 poliA Bam que contiene los elementos estructurales y reguladores que componen un vector de expresión en células de mamífero. Tras la digestión con BamHI de pMTSV40 poliA BamHI y la reparación en presencia de ADN polimerasa I y los cuatro dNTP, este vector está disponible para la inserción del fragmento de restricción SmaI-XmnI de \sim2.678 pb del plásmido p4T4B. El vector puede ser utilizado después para la expresión eficiente de la proteína en células CHO.

5.5. Constructos de fusión promotor/secuencia A4

Se prepararon ocho diferentes constructos de fusión fusionando uno o dos promotores diferentes a secuencias de ADN diferentes que codifican las proteínas precursoras \beta-amiloides. Las secuencias promotoras utilizadas fueron la de la metalotioneína-I (MT) de ratón y la de la enolasa específica neural de rata (NSE). Estos promotores u otros promotores útiles conocidos por los expertos en la técnica pueden ser conectados a diferentes secuencias A4 del tipo descrito antes.

Aunque no se desea estar ligado a ninguna teoría concreta referente a la patología de la enfermedad de Alzheimer, se postula que la razón de la cantidad de A751 respecto a la cantidad de los precursores A695 que son únicos para el sistema nervioso central puede estar en un estado de desequilibrio, ocasionando la patología del Alzheimer. Este desequilibrio (resultante de la sobre- o sub-expresión de un precursor) podría crear las condiciones para que el amiloide se forme en abundancia y cree las placas. Basándose en esta teoría, los constructos fueron diseñados para expresar cualquiera de los precursores de la proteína \beta-amiloide A751 o A695.

Alternativamente, la patología del Alzheimer puede resultar del catabolismo inadecuado o incompleto de la cola carboxilada de la proteína precursora \beta-amiloide (secuencias A99) que se libera cuando A695 y A751 se transforman en proteínas extracelulares solubles (ver Weidemann, A., et al., Cell. (1989) 57:115-126). Basándose en esta teoría, los constructos fueron diseñados para expresar la cola carboxilada (A99) o la proteína núcleo \beta-amiloide (A-42). Todos los constructos fueron diseñados para permitir la expresión del constructo ya sea específica de los tejidos neurales (NSE) o expresada ubícuamente en todos los tipos de tejidos (promotores MT).

Los siguientes constructos de fusión son ejemplos de constructos:

Promotor	Secuencia A4	Figura
NSE	dominio núcleo A42	4
NSE	cola carboxilada A99	4
NSE	A751	5
NSE	A695	5
NSE	A4i
MT	A751	6
MT	A695	6
MT	dominio núcleo A42	7
MT	cola carboxilada A99	7
MT	A4i

Como se ha indicado antes, las Figuras 4-7 y 10 detallan las estrategias de clonación utilizadas para producir los diferentes constructos de fusión. Se debe observar que los plásmidos de la \beta-actina A42 y de la \beta-actina A-99 sirven como fuente para las secuencias A42 y A99, respectivamente, para las construcciones. Se mantuvo la fidelidad de codificación completa en los constructos A42 y A99; cada uno estuvo seguido simplemente por un codón de iniciación de metionina.

Los vectores de la \beta-actina A751 y de la \beta-actina A695 se utilizaron para preparar los otros constructos de los promotores NSE. Todas las construcciones plasmídicas fueron confirmadas mediante análisis de mapeo de restricción. Todos los constructos fueron confirmados definitivamente mediante análisis de la secuencia de ADN de las uniones de clonación.

El promotor MT-I utilizado para los constructos de fusión fue derivado utilizando oligonucleótidos sintéticos. El promotor MT-1 es secuenciado y descrito con detalle por Swanson, L.W. et al., Novel Developmental Specificity in the Nervous Systems of Transgenic Animals Expressing Growth Hormone Fusion Genes, Nature (1985) 317:363-366, incorporada aquí como referencia para describir el promotor MT-I. La región promotora MT-I abarca 373 pares de bases y puede ser construida mediante síntesis y ligadura de oligómeros de ADN. Se utilizan cinco pares de oligómeros de 70-80 nucleótidos de longitud. El fragmento de 373 pares de bases resultante puede ser clonado y secuenciado. El promotor MT-I puede ser también aislado amplificando selectivamente esta región del genoma de ratón utilizando el método de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El fragmento amplificado puede ser clonado y caracterizado mediante análisis de la secuencia de ADN.

El promotor MT-I es secuenciado y descrito con detalle por Swanson, L.W. et al., Novel Developmental Specificity in the Nervous Systems of Transgenic Animals Expressing Growth Hormone Fusion Genes, Nature (1985) 317:363-366, incorporada aquí como referencia para describir el promotor MT-I.

También se pueden utilizar dos enfoques diferentes para aislar el promotor de la enolasa específico de neurona de rata (NSE). La secuencia de nucleótidos de la región promotora ha sido publicada. Por consiguiente, es posible diseñar oligonucleótidos sintéticos para el uso en la PCR y para rastrear bancos genómicos. Se utilizaron cebadores oligonucleotídicos para amplificar selectivamente la región de interés utilizando la PCR y ADN genómico de rata. Se aisló y clonó un fragmento de 1,15 kilopares de bases. El mismo oligonucleótido ha sido empleado como sonda para rastrear bancos genómicos de rata.

Se demostró la funcionalidad del promotor MT-I evaluando la expresión transitoria de un constructo que portaba el gen informador CAT (esto es, el gen informador de la cloramfenicol acetiltransferasa), tras la transfección del ADN a células CHO.

También se puede aislar el promotor NSE a partir de un clon genómico purificado de una genoteca de rata búfalo utilizando sondas oligonucleotídicas diseñadas a partir de la secuencia publicada del promotor (Sakimura et al., Gene (1987) 60:103-113) que se incorpora aquí como referencia para describir semejante promotor.

Se preparó un fragmento de la región promotora de 2,3 kilobases incluyendo un intrón de 1,2 kilobases en la región 5' no traducida a partir de un clon de 11 kb utilizando la reacción de amplificación del gen de la polimerasa. La estrategia para la PCR y los cebadores oligonucleotídicos utilizados se describen en la Figura 9. El cebador 3'-terminal para el fragmento promotor NSE más las sustituciones de 2 nucleótidos albergadas en el intrón crean un sitio NcoI con fines de clonación, así como introduce el codón de iniciación de la metionina para las secuencias A4. Se indica que la amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa es referida por tener una baja tasa de error.

5.6. Organismos transgénicos

Todos los organismos transgénicos de la invención incluyen en una pluralidad de sus células una secuencia de ADN recombinante o sintética que se cree que tiene que ver con la patogénesis de la Enfermedad de Alzheimer. Más específicamente, los organismos transgénicos contienen secuencias específicas de material genético exógeno, tales como las secuencias descritas antes con detalle que contienen una secuencia promotora específica del tejido y una secuencia que codifica para la producción de una proteína precursora \beta-amiloide. Puesto que es posible producir los organismos transgénicos de la invención utilizando una o más de las secuencias antes descritas, se dará una descripción general de la producción de los organismos transgénicos remitiéndose generalmente al material genético exógeno. Esta descripción general puede ser adaptada por los expertos en la técnica con el fin de incorporar las secuencias de ADN específicas antes descritas a los organismos y obtener la expresión de esas secuencias utilizando los métodos y materiales descritos más abajo. Para más detalles concernientes a la producción de organismos transgénicos, y específicamente ratones transgénicos, remitirse a la Patente de los Estados Unidos 4.873.191, expedida el 10 de Octubre de 1.989 (incorporada aquí como referencia para describir los métodos para producir ratones transgénicos), y a las numerosas publicaciones científicas referidas y citadas allí.

El material genético exógeno puede ser colocado en pronúcleos masculino o femenino del zigoto. Más preferiblemente, se coloca en el pronúcleo masculino tan pronto como sea posible una vez que el espermatozoo entra en el huevo. En otras palabras, justo después de la formación del pronúcleo masculino cuando los pronúcleos están claramente definidos y están bien separados, estando localizado cada uno próximo a la membrana del zigoto. El pronúcleo masculino de un huevo de ratón fertilizado es el lugar prerido para la adición del material genético exógeno de la presente invención.

Se prefiere sumamente añadir el material genético exógeno al complemento del ADN masculino del zigoto antes de que sea transformado por el núcleo del huevo o el pronúcleo femenino del zigoto. Se cree que el núcleo del huevo o el pronúcleo femenino libera moléculas que afectan al complemento de ADN masculino, quizás remplazando las protaminas del ADN masculino por histonas, facilitando de ese modo la combinación de los complementos de ADN femenino y masculino para formar el zigoto diploide.

De este modo, se prefiere añadir el material genético exógeno al complemento masculino de ADN o cualquier otro complemento de ADN antes de resultar afectado por el pronúcleo femenino. Por ejemplo, el material genético exógeno se añade al pronúcleo masculino temprano, tan pronto como sea posible tras la formación del pronúcleo masculino, que es cuando los pronúcleos masculino y femenino están bien separados y están localizados ambos próximos a la membrana celular. Alternativamente, el material genético exógeno podría ser añadido al núcleo del espermatozoo una vez que ha sido inducido a experimentar descondensación. El espermatozoo que contiene el material genético exógeno podría ser añadido después al huevo o el espermatozoo descondensado podría ser añadido al huevo añadiendo el material genético exógeno tan pronto como fuera posible después de eso.

Para los fines de esta invención un zigoto es esencialmente la formación de una célula diploide que es suceptible de desarrollar un organismo completo. Generalmente, el zigoto constará de un huevo que contiene un núcleo formado, ya sea naturalmente o artificialmente, mediante la fusión de dos núcleos haploides a partir de uno o varios gametos. Así, los núcleos del gameto deben ser aquellos que sean naturalmente compatibles, esto es, aquellos que produzcan un zigoto viable susceptible de experimentar diferenciación y desarrollo hasta un organismo funcional. Generalmente, se prefiere un zigoto euploide. Si se obtiene un zigoto aneuploide, el número de cromosomas no deberá variar en más de uno con respecto al número euploide del organismo que haya originado cualquier gameto.

Además de consideraciones biológicas similares, las físicas también gobiernan la cantidad de material genético exógeno que puede ser añadido al núcleo del zigoto o al material genético que forma parte del núcleo del zigoto. Si no se elimina material genético, la cantidad de material genético exógeno que se va a añadir está limitada por la cantidad que puede ser absorbida sin ser físicamente disrruptiva. Generalmente, el volumen de material genético exógeno insertado no excederá de aproximadamente 10 picolitros. Los efectos físicos de la adición no deben ser tan importantes como para destruir físicamente la viabilidad del zigoto. El límite biológico del número y de la variedad de secuencias de ADN variará dependiendo del zigoto concreto y de las funciones del material genético exógeno y resultarán rápidamente evidentes para los expertos en la técnica, puesto que el material genético, incluyendo el material genético exógeno, del zigoto resultante debe ser susceptible biológicamente de iniciar y mantener la diferenciación y el desarrollo del zigoto en un organismo funcional.

El número de copias de las secuencias de ADN que se añaden al zigoto depende de la cantidad total de material genético exógeno añadido y será la cantidad que permita que la transformación genética se produzca. Teóricamente sólo se requiere una copia; no obstante, generalmente, se utilizan numerosas copias, por ejemplo, de 1.000 a 20.000 copias de un gen, con el fin de asegurar que una copia sea funcional. Por lo que se refiere a la presente invención, existe generalmente la ventaja de tener más de una copia que funcione de cada una de las secuencias de ADN exógeno insertadas para intensificar la expresión genotípica de las secuencias de ADN exógeno (esto es, para obtener la expresión ubícua de las proteínas precursoras \beta-amiloides relacionadas y las proteínas del inhibidor de la proteasa).

Se puede utilizar cualquier técnica que permita la adición del material genético exógeno al material genético nucleico con tal que no sea destructivo para la célula, la membrana nuclear u otras estructuras celulares o genéticas existentes. El material genético exógeno se inserta preferentemente en el material genético nucleico mediante microinyección. La microinyección de células y estructuras celulares es conocida y utilizada en la técnica.

Los mamíferos transgénicos producidos según la presente invención incluirán material genético exógeno. El material genético exógeno será una secuencia de ADN que ocasione la producción de la proteína precursora \beta-amiloide A751. Adicionalmente, la secuencia se anclará a un promotor de enolasa específico neuronal que permita la expresión de la proteína relacionada \beta-amiloide específicamente en tejido nervioso.

5.7. Métodos y materiales

La mayoría de las técnicas que se utilizan para transformar células, construir vectores, extraer ARN mensajero, preparar ADNc, y similares son practicadas ampliamente en la técnica, y la mayoría de los practicantes están familiarizados con los materiales recurso normalizados así como con las condiciones y los procedimientos específicos. No obstante, por conveniencia, los siguientes párrafos pueden servir como pauta.

5.7.a. Huéspedes y secuencias de control

Se pueden utilizar sistemas tanto procarióticos como eucarióticos para expresar el núcleo \beta-amiloide y las secuencias \beta-amiloides relacionadas; los huéspedes procarióticos son, por supuesto, los más convenientes para los procedimientos de clonación. Los procariotas están representados muy frecuentemente por diversas cepas de E. coli; no obstante, también se pueden utilizar otras cepas microbianas. Las cepas de E. coli pueden secretar el núcleo \beta-amiloide y las proteínas precursoras \beta-amiloides al periplasma cuando los genes que codifican estas proteínas están fusionados con los péptidos señal apropiados, y ciertas cepas de E. coli, por ejemplo, una cepa mutante de lipoproteína tal como JE5505 (Kanamari, T. Gene (1988) 66:295-300), excretará las proteínas quiméricas directamente al medio de cultivo.

Se utilizan vectores plasmidicos que contienen sitios de replicación, marcadores seleccionables y secuencias de control derivadas de una especie compatible con el huésped; por ejemplo, E. coli es típicamente transformada utilizando derivados de pBR322, un plásmido derivado de una especie de E. coli por Bolivar, et al., Gene (1977) 2:95. pBR322 contiene los genes para la resistencia a la ampicilina y la tetraciclina, y así proporciona marcadores seleccionables múltiples que pueden ser retenidos o destruidos al construir el vector deseado. Entre las secuencias de control procarióticas utilizadas comúnmente que se definen aquí por incluir promotores para la iniciación de la transcripción, opcionalmente con un operador, junto con las secuencias del sitio de unión al ribosoma, se incluyen promotores utilizados comúnmente tales como los sistemas promotores de la \beta-lactamasa (penicilinasa) y de la lactosa (lac) (Chang., et al., Nature (1977) 198:1056) y el sistema promotor del triptófano (trp) (Goeddel, et al. Nucleic Acid Res (1980) 8:4057) y el promotor P_{L} derivado de lambda y el sitio de unión al ribosoma del gen N (Shimatake, et al., Nature (1981) 292:128).

Entre otras secuencias de control procarióticas se incluyen las secuencias señal con secreción directa de una proteína al periplasma. Entre los péptidos señal bacterianos comúnmente utilizados se incluyen los péptidos señal ompA (Kikuchi, et al., Nucleic Acid Res (1981) 9:5671-5678) y phoA (Beck y Bremer, Nucleic Acid Res (1980) 8:3011-3024) que se pueden fusionar con la secuencia del inhibidor de la proteasa de la invención.

Además de las bacterias, también se pueden utilizar como huéspedes microbios eucarióticos, tales como lavaduras. Las cepas de laboratorio de Saccharomyces cerevisiae, la levadura panadera, son muy utilizadas aunque son comúnmente asequibles otras diversas cepas o especies. Se pueden utilizar vectores en los que se emplean, por ejemplo, el origen de replicación de 2 m de Broach. J.R., Meth Enz (1983) 101:307, u otros orígenes de replicación compatibles de lavaduras (ver, por ejemplo, Stinchcomb, et al., Nature (1979) 282:39, Tschumper, G., et al., Gene (1980) 10:157 y Clarke, L., et al., Meth Enz (1983) 101:300). En las secuencias de control para los vectores de levaduras se incluyen promotores para la síntesis de enzimas glicolíticas (Hess, et al., J Adv Enzyme Reg (1968) 7:149; Holland, et al., Biochemistry (1978) 17:4900). Entre los promotores adicionales conocidos en la técnica se incluye el promotor para la 3-fosfogliceratoquinasa (Hitzeman, et al., J Biol Chem (1980) 255:2073). Otros promotores, que tienen la ventaja adicional de la transcripción controlada por las condiciones de crecimiento y/o los antecedentes genéticos son las regiones promotoras para la alcohol deshidrogenasa 2, el isocitocromo C, la fosfatasa ácida, las enzimas degradativas asociadas con el metabolismo del nitrógeno, el sistema del factor alfa y las enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. También se cree que son deseables secuencias de terminación en el extremo 3' de las secuencias codificadoras. Tales terminadores se encuentran en la región no traducida 3' siguiente a las secuencias codificadoras en los genes derivados de levaduras.

También es posible, por supuesto, expresar genes que codifican polipeptidos en cultivos de células huésped eucarióticas derivadas de organismos multicelulares. Ver, por ejemplo, Axel, et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 4.399.216. Estos sistemas tienen la ventaja adicional de la capacidad para empalmar intrones y de este modo pueden ser utilizados directamente para expresar fragmentos genómicos. Entre las líneas de células huésped útiles se incluyen células VERO y HeLa, y células de ovario de hámster Chino (CHO). En los vectores de expresión para tales células se incluyen promotores y secuencias de control compatibles con células de mamífero tales como, por ejemplo, los promotores temprano y tardío de Virus de Simio 40 (SV 40) (Fiers, et al., Nature (1978) 273:113), comúnmente utilizados, u otros promotores virales tales como los derivados de virus del polioma, adenovirus 2, virus del papiloma bovino, o virus del sarcoma aviar. También se puede utilizar el promotor controlable, hMTII (Karin, M., et al., Nature (1982) 299:797-802). Los aspectos generales de las transformaciones de los sistemas huésped de células de mamífero han sido descritos por Axel (supra). También parece ahora, que las regiones "intensificadoras" son importantes para optimizar la expresión; estas son, generalmente, secuencias encontradas aguas arriba y aguas abajo de la región promotora en las regiones de ADN no codificadoras. Se pueden obtener orígenes de replicación, si se necesitaran, de fuentes virales. No obstante, la integración en el cromosoma es un mecanismo común para la replicación de ADN en eucariotas.

5.7.b. Transformaciones

Dependiendo de la célula huésped utilizada, la transformación se realiza utilizando técnicas normalizadas apropiadas para tales células. Se puede utilizar el tratamiento con calcio empleando cloruro de calcio, descrito por Cohen, S.N., Proc Natl Acad Sci (USA) (1972) 69:2110, o el método con RbCl_{2} descrito por Maniatis, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982) Cold Spring Harbor Press, pág. 254 y Hanahan, D., J Mol Biol (1983) 166:557-580 para procariotas u otras células que contengan barreras de pared celular sustanciales. Para las células de mamífero sin semejantes paredes celulares, se puede utilizar el método de precipitación con fosfato de calcio de Graham y van der Eb, Virology (1978) 52:546, opcionalmente según lo modificó Wigler, M., et al., Cell (1979) 16:777-785. Se pueden llevar a cabo transformaciones en levaduras según el método de Beggs, J.D., Nature (1978) 275:104-109 o de Hinnen, A., et al., Proc Natl Acad Sci (USA) (1978) 75:1929.

5.7.c. Construcción del vector

En la construcción de vectores adecuados que contienen las secuencias codificadoras y de control deseadas se emplean técnicas de ligadura y restricción normalizadas que son bien conocidas en la técnica. Los plásmidos aislados, las secuencias de ADN, o los oligonucleótidos sintéticos se escinden, confeccionan, y se vuelven a ligar de la forma deseada.

Las secuencias de ADN que forman los vectores son asequibles de diversas fuentes. Los vectores de la estructura principal y los sistemas de control se encuentran generalmente en vectores "huésped" asequibles que se emplean para el grueso de las secuencias en construcción. Para la secuencia codificadora pertinente, la construcción inicial puede ser, y usualmente es, cuestión de recuperar las secuencias apropiadas de las genotecas de ADNc o genómico. No obstante, una vez que se ha descrito la secuencia es posible sintetizar la secuencia génica completa in vivo partiendo de los derivados nucleotídicos individuales. La secuencia génica completa para los genes de longitud clasificable por tamaño, v.g., 500-1.000 pb se puede preparar sintetizando oligonucleóticos complemetarios solapantes individuales y rellenando porciones no solapantes de hebra sencilla utilizando ADN polimerasa en presencia de desoxirribonucleótidos trifosfato. Este enfoque ha sido utilizado con éxito en la construcción de varios genes de secuencia conocida. Ver, por ejemplo, Edge, M.D., Nature (1981) 292:756; Nambair, K.P., et al., Sience (1984) 223:1299; Jay, Ernest, J Biol Chem (1984) 259:6311.

Los oligonucleótidos sintéticos se preparan o bien mediante el método del fosfotriéster descrito por Edge, et al., Nature (supra) y Duckworth, et al., Nucleic Acid Res (1981) 9:1691 o el método de la fosforamidita descrito por Becauge, S.L., y Caruthers, M.H., Tet Lett (1981) 22:1859 y Matteucci, M.D., y Caruthers, M.H., J Am Chem Soc (1981) 103:3185 y se pueden preparar utilizando sintetizadores oligonucleotídicos automatizados asequibles comercialmente. El tratamiento con quinasa de hebras sencillas antes del recocido o para el marcaje se logra utilizando un exceso, v.g., aproximadamente 10 unidades de polinucleótido quinasa respecto a 1 nmol de sustrato en presencia de Tris 50 mM, pH 7,6, MgCl_{2} 10 mM, ditiotreitol 5 mM, ATP 1-2 mM, 1,7 pmoles de ATP-\gammaP32 (2,9 mCi/mmol), espermidina 0,1 mM, EDTA 0,1 mM.

Una vez que los componentes de los vectores deseados son asequibles de este modo, se pueden escindir y ligar utilizando procedimientos de restricción y ligadura normalizados.

La escisión de sitio específico del ADN se realiza mediante tratamiento con una enzima (o enzimas) de restricción adecuada que son generalmente conocidas en la técnica, y cuyos detalles son especificados por el fabricante de estas enzimas de restrucción asequibles comercialmente. Ver, por ejemplo, el Catálogo de Productos de New England Biolabs. En general, se escinde aproximadamente 1 mg de plásmido o secuencia de ADN por una unidad de enzima en aproximadamente 20 ml de solución tampón; en los presentes ejemplos, típicamente, se utiliza un exceso de enzima de restricción para asegurar la digestión completa del sustrato de ADN. Se puede trabajar con tiempos de incubación de aproximadamente una hora a dos horas a aproximadamente 37ºC, aunque se pueden tolerar variaciones. Tras cada incubación, la proteína se elimina mediante extracción con fenol/cloroformo, y puede estar seguido de extracción con éter, y recuperación del ácido nucleico de las fracciones acuosas y precipitación con etanol. Si se desea, la separación por tamaño de los fragmentos escindidos se puede realizar mediante electroforésis en gel de poliacrilamida o gel de agarosa utilizando técnicas normalizadas. Una descripción general de las separaciones por tamaño se encuentra en Methods in Enzymology (1980) 65:499-560.

Los extremos de los fragmentos escindidos mediante restricción se pueden volver romos mediante tratamiento con un fragmento grande de ADN polimerasa I (Klenow) de E. coli en presencia de los cuatro desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs) utilizando tiempos de incubación de aproximadamente 15 a 25 minutos de 20 a 25ºC en tampón Tris 50 mM pH 7,6, NaCl 50 mM, MgCl_{2} 6 mM, DTT 6 mM y dNTP 0,1-1,0 mM. El fragmento de Klenow rellena los salientes de hebra sencilla 5' pero vuelve a estropear las hebras sencillas 3' salientes, incluso aunque estén presentes los cuatro dNTP. Si se desea se puede realizar una reparación selectiva suministrando sólo uno de los dNTP o uno seleccionado dentro de las limitaciones dictadas por la naturaleza del saliente. Después del tratamiento con Klenow, la mezcla se extrae con fenol/cloroformo y se hace precipitar con etanol. El tratamiento en las condiciones apropiadas con nucleasa S1 o BAL-31 produce la hidrólisis de una porción de hebra sencilla.

Las ligaduras se realizan en volúmenes de 15-50 ml en las siguientes condiciones y temperaturas normalizadas: por ejemplo, Tris-HCl 20 mM pH 7,5, MgCl_{2} 10 mM, DTT 10 mM, 33 \mug/ml de BSA, NaCl 10 mM-50 mM, y o bien ATP 40 \muM, 0,01-0,02 (Weiss) unidades de ADN ligasa de T4 a 0ºC (para la ligadura de "extremo cohesivo") o bien ATP 1 mM, 0,3-0,6 (Weiss) unidades de ADN ligasa de T4 a 14ºC (para la ligadura de "extremos romos"). Las ligaduras de "extremo cohesivo" intermoleculares se realizan usualmente a concentraciones de ADN totales de 33-100 \mug/ml (concentración de extremo total 5-100 nM). Las ligaduras de extremo romo intermoleculares se realizan a una concentración de extremos total 1 mM.

En la construcción del vector en la que se emplean "fragmentos vectores", el fragmento vector se trata comúnmente con fosfatasa alcalina bacteriana (BAP) o fosfatasa alcalina intestinal de ternera (CIP) con el fin de eliminar el fosfato 5' y prevenir la auto-ligadura del vector. Las digestiones se realizan a pH 8 en Tris-HCl aproximadamente 10 mM, EDTA 1 mM utilizando alrededor de 1 unidad de BAP o CIP por mg de vector a 60' durante aproximadamente 1 hora. Con el fin de recuperar los fragmentos de ácido nucleico, la preparación se extrae con fenol/cloroformo y se precipita con etanol. Alternativamente, la religadura se puede evitar en vectores que han sido doblemente digeridos mediante la digestión adicional con enzimas de restricción y separación de los fragmentos no buscados.

Para las porciones de los vectores derivados de ADNc o ADN genómico que requieren modificaciones de la secuencia se puede utilizar mutagénesis dirigida por un cebador de sitio específico (Zoller, M.J., y Smith, M. Nucleic Acid Res (1982) 10:6487-6500 y Adelman, J.P., et al., DNA (1983) 2:183-193). Esto se realiza utilizando un oligonucleótido sintético cebador complementario a un ADN de fago de hebra sencilla que va a ser sometido a mutagénesis excepto para un desemparejamiento limitado, representando la mutación deseada. Brevemente, el oligonucleótido sintético se utiliza como cebador para dirigir la síntesis de una hebra complementaria al fago, y el ADN de hebra parcial o totalmente sencilla resultante se transforma en una bacteria huésped que soporta el fago. Los cultivos de la bacteria transformada se cultivan en placa sobre agar, permitiendo la formación de placa a partir de células sencillas que albergan el fago.

Teóricamente, el 50% de las nuevas placas contendrán el fago que tiene, como hebra sencilla, la forma mutada; el 50% tendrá la secuencia original. Las placas resultantes se lavan tras la hibridación con un cebador sintético tratado con quinasa a una temperatura de lavado que permita la unión de un emparejamiento exacto, pero a la que los desemparejamientos con la hebra original son suficientes para evitar la unión. Las placas que hibridan con la sonda se seleccionan, se cultivan, y se recupera el ADN.

5.7.d. Verificación de la construcción

En las construcciones mostradas más abajo, las ligaduras correctas para la construcción de plásmidos se confirman transformando primero la cepa MC1061 de E. coli obtenida del Dr. M. Casadaban (Casadaban, M., et al., J Mol Biol (1980) 138:179-207) u otro huésped adecuado con la mezcla de ligadura. Los transformantes acertados se seleccionan por la resistencia a la ampicilina, la tetraciclina u otro antibiótico o utilizando otros marcadores dependiendo del modo de construcción del plásmido, como es conocido en la técnica. Los plásmidos para los transformantes se preparan después según el método de Clewell, D.B., et al., Proc Natl Acad Sci (USA) (1969) 62:1159, opcionalmente tras la amplificación con cloramfenicol (Clewell, D.B., J Bacteriol (1972) 110:667). Se utilizan comúnmente varias minipreparaciones de ADN, v.g., Holmes, D.S., et al., Anal Biochem (1981) 114:193-197 y Birnboin, H.C., et al., Nucleic Acid Res (1979) 7:1513-1523. El ADN aislado se analiza mediante restricción y/o se secuencia mediante el método de nucleótidos didesoxi de Sanger, F., et al., Proc Natl Acad Sci (USA) (1977) 74:5463 como describen adicionalmente Messing, et al., Nucleic Acid Res (1981) 9:309, o mediante el método de Maxam, et al., Methods in Enzimology@ (1980) 65:499.

6.0 Ejemplos

Los siguientes ejemplos se exponen para proporcionar a aquellos con un conocimiento práctico normal en la técnica una revelación y descripción completa de cómo elaborar las secuencias de ADN, los constructos de fusión, las proteínas y los mamíferos transgénicos de la invención y no se pretende que limiten el alcance de lo que los autores de la invención consideran su invención. Se han realizado esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a los números utilizados (v.g., cantidades, temperatura, etc.) pero se deberá contar con algunos errores y desviaciones experimentales. A no ser que se indique de otro modo, las partes son partes en peso, la temperatura está en grados C, y la presión es la atmosférica o está próxima a ella.

6.1 Ejemplo 1

Expresión de la proteína \beta-amiloide relacionada (1-751) en células de mamífero cultivadas

Para facilitar la expresión de la proteína precursora \beta-amiloide en células de mamífero, se construye un plásmido de manera que el segmento codificador de la proteína se fusione a un promotor regulado potente derivado del gen de la metalotioneína II humano (hMTII). Este procedimiento se realiza en dos etapas. Primero se deriva un vector de expresión pMTSV40 poliA Bam a partir del vector phGH-SV(10) mediante digestión de phGH-SV(10) con las enzimas de restricción BamHI y SmaI, seguido de incubación con ADN polimerasa I (fragmento de Klenow) con el fin de crear moléculas con extremos romos. Los extremos romos se ligan con posterioridad a los ligadores BamHI, se cortan con BamHI, y se vuelven a ligar para permitir la recircularización. En esta etapa se elimina toda la secuencia genómica de la hormona de crecimiento humana de phGH-SV(10) excepto para la mayoría de la región 3' no traducida del ARNm y las secuencias genómicas que codifican la supuesta parada transcripcional 3' y las señales de maduración. Para el constructo de expresión en células de mamífero pMTSV40 poliA Bam es digerido con BamHI, después se incuba con los cuatro nocleótidos trifosfato y con ADN polimerasa I para crear extremos romos. Este fragmento se liga con posterioridad con el fragmento SmaI-XmnI de 2.678 pb purificado derivado de p4T4B. Las moléculas recombinantes son introducidas en MC1061 mediante transformación.

Se hacen crecer células de ovario de hámster Chino (CHO)-K1 en un medio compuesto de una mezcla 1:1 de medio F12 y medio DME con suero fetal de ternera al 10%. Las células competentes fueron transformadas simultáneamente con el vector de expresión recombinante y pSU2:NEO (Southern, P., et al., J Mol Appl Genet (1982) 1:327-341). pSV2:NEO contiene un gen funcional que confiere resistencia al análogo de neomicina G418. En la transformación, se aplican 500 ng de pSV2:NEO y 5 \mug del vector recombinante a un plato de 60 mm de células CHO en forma de producto co-precipitado de fosfato de calcio-ADN como describen Graham, F.L. y Van der Eb, A.J. Virology (1973) 52:456-467. El crecimiento de las células en el antibiótico G418 como describen Southern et al. rendirá una reserva de células CHO transfectadas establemente conteniendo el ADN del vector de expresión con la capacidad de expresar el ARNm y la proteína \beta-amiloide relacionada.

6.2 Ejemplo 2

Expresión del precursor \beta-amiloide en células de mamífero

En el Ejemplo 1 se ha esbozado la construcción de un sistema de expresión para la proteína precursora \beta-amiloide (1-751) dirigida por el promotor humano. Se preparó un constructo casi idéntico utilizando el fragmento SmaI-XmnI de 2.548 pb purificado derivado de p4T4B del que se habían suprimido 116 pb de la región 5' no traducida. Este fragmento fue insertado en el sitio SalI tras el promotor humano en un plásmido que albergaba el marcador seleccionable para la neomicina para la expresión en células de mamífero y el gen de resistencia a la ampicilina para la selección de los transformantes bacterianos. Este vector, pHbAPr-1-neo, ha sido descrito por Gunning, el al., (Proc Nat'l Acad Sci USA (1987) 84:4831-4835) y ha sido modificado para eliminar el sitio EcoRI del cuerpo del vector original y para sustituir la región poliligadora original por un nuevo poliligador que contiene un sitio EcoRI además de los sitios de clonación SalI, HindIII, y BamHI presentes originalmente. El vector modificado es referido como pAXneoR. El vector pAXneoR fue linealizado con SalI, los extremos se rellenaron utilizando el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa para crear moléculas de extremos romos. El fragmento \beta-amiloide SmaI-XmnI de 2.548 pb fue sometido a ligadura de extremos romos en el vector utilizando ligasa de T4. Las moléculas recombinantes fueron introducidas en E. coli MC1061 mediante transformación y se amplificó un clon que desplegaba la orientación apropiada. Se elaboró una construcción similar utilizando las secuencias \beta-amiloides 695 descritas por Kang et al. (supra) que coloca la proteína \beta-amiloide 695 bajo el control del promotor huma-
no.

Se introdujeron 600 \mug de ADN total de pAXneo/\beta-amiloide 751 o pAXneo/\beta-amiloide 695 o una mezcla de igual masa de ambos constructos plasmídicos en 10^{7} células CHO mediante electroporación (Neumann, J Membrane Biol (1972) 10:279-290; Zimmerman, Biophys J (1973) 13:1005-1013) utilizando un BTX Transfector 100, cubetas de ordenación estériles Bio-Rad, y un portacubetas construido por encargo. Las células resistentes a G418 que recibieron el ADN exógeno se seleccionaron mediante protocolos normalizados (Southern, 1982, supra) utilizando 500 \mug/ml de G418 de Gibco.

La reserva de células transfectadas positivamente resistentes a G418 de cada una de las tres transfecciones fue caracterizada con respecto a la expresión de la proteína precursora \beta-amiloide. Se incubaron aproximadamente 2 x 10^{6} células de cada reserva conteniendo 5 ml de medio sin suero a 37ºC durante 48 horas. El medio acondicionado se eliminó y se hizo precipitar la proteína mediante la adición de ácido tricloroacético hasta una concentración final del 10%. Las células fueron cosechadas rascando, se lavaron en solución salina tamponada con fosfato y se volvieron a suspender en 50 \mul de tampón para una concentración de 30 veces. Se cargaron 25 \mul de cada muestra en un gel de poliacrilamida al 12,5% (Laemmli, Nature (1970) 277:680-685). El precursor \beta-amiloide fue detectado mediante análisis de hibridación Western (Towbin, Proc Nat'l Acad Sci USA (1979) 76:4350-4354) utilizando anticuerpos policlonales específicos de \beta-amiloide generados por virus vaccinia recombinantes que albergan el ADNc de \beta-amiloide 751 utilizando procedimientos normalizados. Típicamente, se ha encontrado que la mayoría de los precursores \beta-amiloides de aproximadamente 110.000 daltons están relacionados en el medio de cultivo y se asocian con la célula cantidades muy pequeñas de la proteína. Este resultado está de acuerdo con la hipótesis de Allsop, et al., (Proc Natl Acad Sci USA (1988) 85:2790-2794) que propone que la proteína \beta-amiloide es una prohormona secretada. El peso molecular aparente de 110.000 daltons de la proteína \beta-amiloide expresada recombinantemente es similar al observado por otros (Dyrks, T., et al., EMBO J (1988) 7(4):949-957) utilizando sistemas de transcripción/traducción in vitro y utilizando células en cultivo (Weidelmann, A., et al., Cell 57, 115-126 (1989).

6.3 Ejemplo 3

Análisis para distinguir las variantes genéticas de las especies de ARNm de proteínas \beta-amiloides relacionadas

Aquí se demuestra la capacidad para distinguir entre las variantes genéticas de las especies de ARNm de proteínas precursoras \beta-amiloides utilizando sondas oligonucleotídicas. Este análisis de diagnóstico puede distinguir entre dos variantes genéticas íntimamente relacionadas de proteínas precursoras \beta-amiloides o sus ARNm, y cuantificar los niveles relativos de expresión de estas proteínas o ARNm.

El ARN celular o el ARN citoplásmico total fue preparado a partir de células humanas en cultivo o de tejido cerebral humano (cerebro con Alzheimer o cerebro normal) con o sin eliminación de los núcleos (citoplásmicos o totales, respectivamente) mediante el método de tiocianato de guanidina/CsCl como describen Maniatis et al. El ARN fue fraccionado mediante cromatografía de celulosa con oligo-dT, se sometió a electroforesis sobre un gel de agarosa-formaldehído, y fue transferido mediante hibridación a nitrocelulosa (todo como describen Maniatis et al.). Los filtros se cocieron, se pre-hibridaron y se hibridaron con las sondas indicadas conforme a protocolos normalizados.

Las sondas oligonucleotídicas fueron marcadas en sus extremos con dCTP-[P^{32}] mediante incubación con transferasa terminal conforme a las sugerencias del fabricante y como describen Ponte et al. Nature 331, 525.527 (11 de Febrero de 1988) que se incorpora aquí como referencia para describir semejante marcaje en el extremo. Se sometió a radiomarcaje con CTP-[P^{32}] un inserto de actina mediante traslado de cortes. Tras la hibridación, los filtros que hibridaban con los oligonucleótidos se lavaron con 1 x SSC a 55ºC. El filtro hibridado con actina fue lavado a 0,1 x SSC a 55ºC. Los filtros se expusieron después a una película de rayos X para producir el autorradiograma mostrado. La sonda inserto detecta el ARNm de la proteína del precursor \beta-amiloide descrito en la Figura 1 en todas las muestras examinadas. La sonda de empalme detecta el ARNm \beta-amiloide relacionado descrito por Kang et al., en todas las células excepto HeLa y MRC5. La sonda de actina es un control que se espera que hibride con el abundante ARN en todas las células.

6.4. Ejemplo 4

Construcción de los plásmidos de expresión transgénicos NSE-A42 y A99

Las secuencias de A42 y A99 fueron derivadas de los plásmidos de expresión de la \beta-actina A42 y A99 descritos en la solicitud de patente de los Estados Unidos con el número de serie 07/408.767. Específicamente, los plásmidos de la \beta-actina A42 y A99 fueron digeridos con NcoI y EcoRI liberando la región promotora de la \beta-actina así como la región del promotor neo de SV2. Además, mediante digestión con EcoRI, se eliminaron cinco aminoácidos de A42 o A99 que pueden ser reemplazados utilizando un poliligador sintético. El plásmido A42 o A99 suprimido para los promotores de la \beta-actina y neo de SV2 se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa. Se sintetizó un poliligador oligonucleotídico sintético que genera múltiples sitios de clonación así como los cinco aminoácidos para A42 y A99 y se ligó al fragmento plasmídico A42 o A99 generado antes mediante digestión con NcoI y EcoRI. La adición del poliligador suprime el sitio NcoI en el plásmido original y mueve este sitio al interior del poliligador, y reemplaza el sitio EcoRI dentro de las secuencias A42 o A99. Tras la ligadura del poliligador al fragmento plasmídico A42 o A99, se preparó el ADN plasmídico. El nuevo plásmido se escindió primero con BglII y NcoI. Estos dos sitios fueron sintetizados en la región poliligadora recién añadida. Es en el sitio generado mediante digestión con BglII-NcoI en el que se añadirá el promotor NSE.

El promotor NSE fue aislado de un banco genómico de rata. Se seleccionó un fragmento EcoRI genómico de 11 kb utilizando hibridación con oligonucleótidos diseñados a partir de la secuencia de la región promotora NSE conocida. El fragmento promotor NSE de EcoRI genómico de 11 kb se clonó en un plásmido pUC y fue a partir de este fragmento genómico que se aisló la región promotora deseada utilizando amplificación mediante PCR como se esboza en la Fig. 9. Se produjo una porción grande de la región promotora que contenía un intrón en la región no traducida 5' del gen NSE mediante amplificación con PCR utilizando cebadores oligonucleotídicos con sitios de restricción BglII y NcoI en los extremos 5' y 3', respectivamente. El fragmento promotor NSE se purificó mediante electroforesis en gel y después se clonó en la región poliligadora del plásmido A42 o A99 generado antes. Se utilizaron técnicas recombinantes moleculares normalizadas para digerir, ligar y aislar los fragmentos. La secuenciación del ADN documentó la fidelidad de los plásmidos de expresión NSE-A42 y NSE-A99.

6.5 Ejemplo 5

Construcción de los plásmidos de expresión transgénicos NSE-A695 y NSE-A751

El plásmido NSE-A99 elaborado en el Ejemplo 4 se utilizó para preparar los plásmidos de expresión NSE-A695 y NSE-A751 eliminando las secuencias A99 y remplazándolas por cualquiera de las secuencias A695 o A751. Para eliminar las secuencias A99 del plásmido NSE-A99, el plásmido fue digerido con NcoI seguido de digestión con nucleasa de judía mung. El tratamiento con nucleasa de judía mung genera un extremo romo en el sitio NcoI para fines de clonación adicionales. El plásmido fue digerido a continuación con HindIII. Este sitio está dentro de la región poliligadora 3' hacia las secuencias A99 ocasionando la liberación del fragmento que codifica A99. El plásmido restante que contenía el promotor NSE, las secuencias plasmídicas, el sitio de adición poli A, y parte de la región poliligadora fue purificado mediante electroforesis en gel. A continuación, se prepararon los fragmentos A695 y A751 para la clonación en el plásmido NSE con A99 suprimido. Las secuencias A695 y A751 estuvieron derivadas de los plásmidos de expresión de la \beta-actina A695 y de la \beta-actina A751. Para eliminar las secuencias 695 y 751, los plásmidos fueron digeridos con NruI y HindIII. El sitio NruI está inmediatamente 5' respecto al codón de iniciación de metionina de 695 y 751. El sitio HindIII está localizado en la región poliligadora 3' con respecto al codón de terminación 695 y 751. El fragmento NruI-HindIII que contenía las secuencias A695 y A751 fue clonado en el plásmido NSE con A-99 suprimido tratado con NcoI-HindIII de extremos romos. Se documentó que los plásmidos finales, NSE-A695 y NSE-A751, eran correctos mediante secuenciación del ADN de las uniones de clonación. Se probó que estos plásmidos expresaban la proteína 695 y 751 tras la transfección en células de mamíferos.

6.6 Ejemplo 6

Preparación de los plásmidos de expresión transgénicos de la metalotioneína A42 y de la metalotioneína A99

Se preparó un promotor de ratón de la metalotioneína I sintético diseñado a partir de la secuencia publicada utilizando síntesis y ligadura de oligonucleótidos. El promotor de la metalotioneína o MT sintético fue clonado en pUC19. Para preparar los plásmidos de expresión transgénicos MT-A99 y MT-A42, las secuencias A42 y A99 fueron aisladas a partir de los plásmidos de expresión A42 y A99 de la \beta-actina, respectivamente. Las secuencias A42 y A99 fueron separadas mediante corte del plásmido de expresión de la \beta-actina utilizando digestión con SalI y BamHI para A42 y SalI y HindIII para A99. El sitio de SalI común para A42 y A99 está 5' con respecto a la metionina de iniciación de A42 y A99. El sitio BamHI y los sitios HindIII están contenidos ambos en la región poliligadora 3' con respecto a las secuencias codificadoras A42 y A99. El fragmento SalI-BamHI para A42 y el fragmento SalI-BamHI para A99 fueron purificados mediante electroforésis en gel. El fragmento del promotor MT sintético fue aislado mediante digestión del plásmido pUC con EcoRI y SalI. El fragmento del promotor MT EcoRI-SalI fue ligado al fragmento SalI-BamHI A42. De un modo similar, el fragmento del promotor MT EcoRI-SalI fue ligado al fragmento SalI-HindIII de A99. Los fragmentos de promotor MT-A42 y promotor MT-A99 fueron clonados después en la cadena principal plasmídica para un plásmido de expresión completo. La cadena principal plasmídica utilizada es el vector de la \beta-actina parental del cual estaba derivado el plásmido pAXneoR modificado. El vector plasmídico fue preparado para la clonación mediante digestión con EcoRI y BamHI para la inserción del fragmento RI-BamHI-MT-A42 o la cadena principal plasmídica fue digerida con EcoRI y HindIII para la inserción del fragmento EcoRI-HindIII-MT-A99. Se utilizaron metodologías normalizadas para la manipulación del ADN recombinante para crear los plásmidos. Se verificó que los plásmidos de expresión transgénicos MT-A42 y MT-A99 tenían la secuencia correcta mediante análisis de la secuencia de
ADN.

6.7 Ejemplo 7

Construcción de los plásmidos de expresión transgénicos MT-A751 y MT-A695

Se construyó un plásmido promotor utilizando el fragmento MT-1 sintético descrito antes. Este plásmido también contiene la región de terminación de SV40 que posee un intrón. Entre el promotor y las secuencias de terminación de SV40, existe un sitio XbaI. El plásmido se cortó y este sitio XbaI se trató después con nucleasa de judía mung para crear un extremo romo. Es en el sitio XbaI de extremo romo del plásmido MT en el que se insertarán las secuencias 751 y 695. Las secuencias codificadoras completas 695 y 751 estaban derivadas de los plásmidos de expresión de la \beta-actina 695 y de la \beta-actina 751. Para obtener este fragmento los plásmidos de expresión de la \beta-actina fueron digeridos con NruI y HindIII. El sitio NruI está inmediatamente 5' con respecto a la metionina iniciadora de A695 y A751. El sitio HindIII se localiza 3' principalmente con respecto al codón de terminación de A695 y A751 dentro de la región poliligadora del plásmido. La digestión con NruI crea un extremo romo. La digestión con HindIII crea un extremo cohesivo que se rellena con Klenow para elaborar un fragmento de extremos romos en ambos extremos 3' y 5' de 695 y 751. El fragmento de extremos romos 695 y el 751 fueron clonados en el plásmido de SV40-metalotioneína con el sitio XbaI de extremo romo. Se documentó que la secuencia de los plásmidos MT-A695 y MT-A751 era correcta en las uniones de clonación mediante análisis de la secuencia de ADN.

En la Figura 11A se muestra un diagrama esquemático del transgen NSE-A751. El promotor NSE de 2,3 kb y la región 5' no traducida asociada se indica mediante el recuadro con trama. El intrón dentro del ADN de NSE se indica mediante líneas. Las secuencias A751 están representadas por el recuadro oscuro. La región 3' no traducida tardía de SV40 que contiene las señales de poliadenilación se indica mediante un recuadro abierto. Las líneas discontínuas definen secuencias plasmídicas. Se indican los sitios de restricción de las endonucleasas, así como las sondas (1-4) utilizadas para la transferencia Southern y los análisis de PCR mediante transcriptasa inversa.

6.8 Ejemplo 8

Recolección e inyección de huevos 6.8.a Procedimiento

Se recolectaron ova fertilizados de los oviductos de ratones hembra JU emparejados previamente con machos. Los ova fueron recogidos en una fase pronuclear temprana en la que los pronúcleos masculino y femenino se separan y son distinguibles en el citoplasma. Los ova recolectados fueron separados de células y materiales circundantes, se lavaron apropiadamente y se almacenaron según procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Los zigotos se almacenaron preferiblemente en un porta con una concavidad conteniendo medio de cultivo con una capa superior con aceite de parafina en una atmósfera con el 5% de dióxido de carbono, el 5% de oxígeno, y el 90% de nitrógeno (los porcentajes están basados en el volumen) a 37ºC.

Se obtuvo un constructo de fusión de NSE con el intrón de 5' conectado a A751 según el procedimiento descrito antes y mostrado en la Figura 9. Cualquiera de los constructos de fusión anteriormente mencionados puede ser clonado e incluido en un ovum fertilizado de la manera descrita aquí. Por consiguiente, lo siguiente es una descripción específica con respecto a A751 pero es un procedimiento generalizado aplicable con cualquiera de los constructos de fusión anteriormente descritos.

En primer lugar, los constructos de fusión fueron clonados como se muestra esquemáticamente en la Figura 10. Tras la clonación, los constructos de fusión se extrajeron del huésped, se purificaron y se digirieron con la nucleasa apropiada con el fin de elimina tantas secuencias bacterianas no deseadas como fue posible. Los plásmidos extraídos se purifican mediante centrifugación en gradiente de densidad de cloruro de cesio-bromuro de etidio seguido de extracción con bromuro de etidio y diálisis del ADN plasmídico. Tras llevar a cabo semejantes procedimientos de extracción y purificación de cualquiera de las secuencias clonadas, es posible obtener plásmidos relativamente purificados conteniendo los constructos de fusión deseados.

Los plásmidos purificados se trataron después con la endonucleasa apropiada (se utilizaron SalI y NdeI obtener fragmentos lineales de NSE-A751 o NSE-A695). Utilizando electroforesis en gel los fragmentos deseados se aislaron mediante el uso de cuentas de vidrio Gene Clean (vendidas por Bio 101, San Diego, California) seguido de filtración a través de una membrana de 0,22 \mu.

Los ADN purificados obtenidos fueron microinyectados utilizando pipetas de inyección con un diámetro externo de aproximadamente 1 \mum. Semejantes pipetas pueden ser preparadas a partir de tubo de vidrio Pyrex como se describe en Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74:5657-5661 (1971). Se retiraron aproximadamente diez picolitros de la solución que contenía los constructors de fusión (que son aproximadamente 20.000 secuencias de ADN) en una pipeta de inyección. El zigoto se situó en una pipeta de retención que tenía un diámetro externo de aproximadamente 60 a 70 microlitros, cuya pipeta se podía preparar también según el procedimiento de la publicación citada antes. El zigoto se situó en la pipeta de retención de manera que el pronúcleo masculino fue inyectado con los constructos de fusión presentes en la pipeta de inyección.

Todos los zigotos fueron microinyectados, después se colocaron en tubos de cultivo donde se permitió su desarrollo durante cinco días. Las condiciones adecuadas para el desarrollo de preimplantación se describen en Biol. Reprod. 8:420-426 (1973). Los ova que se desarrollaban hasta mórula o blastocitos se trasplantaron a los úteros de madres de ratón adoptivas JU híbridas F_{1}, que estaban en el día 3 de seudoembarazo. Estas madres adoptivas llevaron a término los embriones implantados.

Se utilizaron técnicas de inyección del tipo descrito antes y del tipo conocido por los expertos en la técnica con en fin de inyectar embriones con diferentes productos conjugados de la invención como se muestra más abajo en la Tabla 1, donde los experimentos 1-5 se llevaron a cabo utilizando diferentes productos conjugados sobre diferentes números de embriones de ratón. Los resultados esperados y reales de estos experimentos se tabulan en la Tabla 1 que muestra el número de huevos de ratón inyectados, el número de crías vivas que resultaban de la implantación de esos huevos y el número de crías que volvían a ser transgénicas realmente, esto es, que volvían realmente a incorporar los ADN foráneos que fueron inyectados en los embriones.

1

Los ratones transgénicos obtenidos mediante los experimentos 1-5 como se muestra en la Tabla 1 anterior son útiles para determinar la eficacia de un fármaco en la disminución de la cantidad de placas formadas como resultado de la enfermedad de Alzheimer. Los ratones transgénicos de uno cualquiera de los experimentos se puede utilizar comparándolo con los ratones de control que no son transgénicos o se pueden comparar varias combinaciones de los ratones transgénicos entre sí y/o con los controles determinando el objeto la eficacia de uno o más fármacos para disminuir la cantidad de placas formadas y relacionando de este modo la disminución de las placas con la eficacia del fármaco en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

Ejemplo 9 Determinación del número de copias del transgen

Para los siguientes ejemplos, los resultados se describen para los embriones y ratones inyectados con ADN NSE-A751.

Como se ha indicado en la Tabla 1, 9 de 44 ratones que se desarrollaban a partir de los embriones inyectados con ADN NSE-A751 portaban el transgen. La crianza de estos ratones producía el establecimiento de 8 líneas; el transgen de un fundador no era heredado por la progenie. Se seleccionaron tres linajes para la caracterización adicional, incluyendo el fundador 10 (F10), el fundador 11 (F11) y el fundador 24 (F24). (Tabla 2). El número de copias de los transgenes fue estimado mediante comparación del gen de ratón b-APP de copia sencilla endógeno utilizando hibridación mediante transferencia Southern con una sonda oligonucleotídica común a b-APP de ratón y a b-A751 humano (Figura 11B). Se digirieron 40 mg de ADN cola con BglII y se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 0,8%. Se prepararon transferencias Southern y se hibridaron con una sonda oligonucleotídica (Figura 11A, sonda #1; 5'-GGATGTGTACTGTTTCTTCTTCA-3') radiomarcada con P^{32} mediante quinasa de T4.

Las transferencias se hibridaron a 60ºC en 6 X SET (1X SET=NaCl 0,15 M, Tris-HCl 30 mM pH,0, EDTA 2 mM) con 5 x solución de Denhart y se lavaron a 608,8C durante 40 minutos en 6 X SSC (1X SSC = NaCl 0,15 M, citrato Na 0,15 M). Las líneas F10, F11, y F24 tenían aproximadamente 1, 4, y 8 copias de NSE:b-A751 por genoma haploide, respectivamente.

6.8.b. Análisis Ejemplo 10 Expresión del ARN de los transgenes heredados

Se estudió la expresión de los transgenes heredados en tres linajes. Se aislaron 2 mg de ARN de cerebro total de los animales de control positivos y de tipo salvaje, sometidos a transcripción inversa con oligo dT12-18, y un subfragmento de ADN específico amplificado mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La región fue dividida en 2 alícuotas.

Se diseñaron cebadores oligonucleotídicos para la PCR de manera que sólo podían ser amplificados los transcritos derivados del transgen, es decir, un cebador hibridaba con la región de NSE 5' no traducida (5'-CACCG
CCACCGGCTGAGTCTGCAGTCCTCG-3') y el otro con el dominio codificador 5' de b-APP (5'-TCTTGCACTGCT
TGCGGCCCCGCTTGCACC-3'). Para dar cuenta del ADN genómico contaminante o de los transcritos no transformados, el cebador de la PCR NSE correspondía al sitio localizado aguas arriba del intrón. Se amplificó un fragmento de 373 pares de bases a partir del ADN sometido a transcripción inversa preparado a partir de cada animal transgénico, pero no es amplificó a partir del ARN sometido a transcripción inversa aislado de los ratones de tipo salvaje. Como control, la segunda alícuota del ARN sometido a transcripción inversa se amplificó con el cebador para la secuencia señal (5'-TTGGCACTGCTCCTGCTGGCCGCCTGGACG-3') secretora de b-APP nativa y el cebador de b-APP del dominio que codifica 5' descrito antes. En estas reacciones, las muestras sometidas a transcripción inversa tanto de tipo salvaje como transgénicas producían el fragmento de ARN de 307 pares de bases que representaba la amplificación a partir del ARN b-APP endógeno.

El ADN se sometió a electroforesis sobre geles de agarosa al 2%, visualizado mediante tinción con bromuro de etidio, y después se sometió a transferencia Southern y se hibridó con una sonda oligonucleotídica de la secuencia de fusión NSE-A751 (5'-AGATCCCAGCCACCGATGCTGCCCGGTTTG-3').

Las transferencias se hibridaron a 65ºC en 6 X SET y se lavaron a 65ºC durante 40 minutos en 4 X SSC. Cuando los productos de la reacción de la PCR fueron hibridados con la sonda oligonucleotídica que formaba puentes en la unión entre las secuencias NSE y b-A751, únicamente los productos derivados de los cerebros transgénicos hibridaban con la sonda, demostrando la autenticidad del producto de la PCR de 373 pb.

Ejemplo 11 Análisis mediante transferencia Western

Se determinaron los cambios en la expresión de las proteínas en cerebros de animales transgénicos NSE:b-A751 mediante análisis de transferencia Western. Los productos homogeneizados de proteínas se elaboraron a partir del cerebro completo según los métodos de Shivers, B.D., et al., EMBO J (1988) 7:1365-1370. Se sometieron a electroforesis 50 mg de cada muestra sobre un gel de poliacrilamida-DSS al 7,5% y se transfirieron a membranas. Se desarrollaron transferencias Western utilizando una dilución 1/500 de antisuero policlonal originado contra A695 humano en toda su longitud por el virus vaccinia recombinante y proteína A-I^{125}. Se observaron varias bandas de aproximadamente 120 kD correspondientes al tamaño medio referido de isoformas b-APP de cerebro de mamífero en los controles y en cada producto homogeneizado de proteína transgénica. Se observaron niveles ligeramente crecientes de b-APP en las muestras de NSE-A751 respecto a las muestras de tipo salvaje sugiriendo elevados niveles de expresión de A751 en los cerebros transgénicos. Fue difícil determinar una evaluación exacta de los niveles neuronales de expresión de A751 endógeno, no obstante, debido a la expresión neural y glial combinada de b-APP endógeno. Por consiguiente, se examinaron los niveles neuronales de la expresión de A751 endógeno mediante inmunocitoquímica de la expresión de NSR-A751.

Ejemplo 12 Análisis histológico de los cerebros de ratones transgénicos con anticuerpo monoclonal 4.1

Se utilizó anticuerpo monoclonal 4.1 para los análisis histológicos de los cerebros de los ratones transgénicos. Este anticuerpo reconoce un epítopo que fue mapeado para los 10 restos N-terminales de la proteína \beta-amiloide y tiene alta afinidad y especificidad para las placas neuríticas. Cualquier inmunoreactividad fue eliminada preincubando el anticuerpo monoclonal con el inmunógeno peptídico sintético antes de la tinción. Brevemente, se preparó un péptido sintético correspondiente a los restos 1-28 de la proteína \beta-amiloide y se auto-agregó mediante congelación y descongelación. El agregado peptídico se mezcló con seralbúmina bovina metilada y coadyuvante para inmunizar y reforzar al ratón. Se generaron los hibridomas de las células del bazo sensibilizadas. Los clones que secretan los anticuerpos anti-péptido fueron expandidos y sunclonados mediante dilución limitante. Los cerebros de los ratones transgénicos NSE-A751, los ratones de tipo salvaje, y se analizaron los animales homozigotos y hemizigotos de tres líneas transgénicas (Tabla 2). Los cerebros se separaron y se mezclaron con paraformaldehído, se embebieron en parafina y se hicieron secciones de cerebro medio coronal. Las secciones se retiraron de la parafina, se rehidrataron, se trataron durante 30 minutos con H_{2}O_{2} al 0,3%, después con ácido fórmico al 80% durante aproximadamente 2 minutos. Las secciones se incubaron después a 37ºC durante 30 minutos con una dilución 1/20 de medio acondicionado del hibridoma que secreta el anticuerpo 4.1. Se utilizó un estuche con peroxidasa de rábano picante avidin-biotinilada anti-ratón (ABC) según las sugerencias del fabricante (Vector Burlingame, CA), y la peroxidasa de rábano picante se visualizó con 3,3'-diaminobenzidina. Las secciones se contratiñeron con hematoxilina y eosina. Para la tinción de b-APP en toda su longitud, se utilizó una dilución 1/400 de antisuero generado contra b-APP695 humano expresado mediante vaccinia recombinante y un estuche ABC anti-conejo. Las secciones se contratiñeron con hematoxilina y eosina. Se obtuvieron secciones de cerebro humano de individuos diagnosticados clínicamente con la enfermedad de Alzheimer. Se prepararon secciones humanas y se tiñeron idénticamente que las secciones de tejido de ratón excepto que se trataron con ácido fórmico al 98% durante 10 minutos. Para los experimentos de competición, el diluyente del anticuerpo se preincubó a 4ºC durante 12 horas, después a 37ºC durante 30 minutos con 250 mg/ml de péptido sintético \beta-amiloide 1-28 antes de la aplicación. Como se muestra en la Figura 12A y 12B, el anticuerpo tiñe selectivamente las placas neuríticas de la sección de tejido humano y la inmunorreactividad se elimina preincubando el anticuerpo monoclonal con el inmunógeno peptídico sintético antes de teñir.

Se tiñeron en paralelo secciones de cerebro transgénico y de tipo salvaje con el anticuerpo 4.1. Se observó una mayor cantidad de reactividad inmunoperoxidasa en las neuronas y a lo largo del neurópilo de las células transgénicas en comparación con los cerebros de los ratones de tipo salvaje.

Las Figura 12C muestra un ejemplo del aumento de la tinción neuronal en la capa de células piramidales del hipocampo de un animal con el linaje del fundador 10 NSE-A751 (Figura 12C). También se observó tinción significativa de procesos neuríticos. El aumento del proceso neuronal arborizante fue muy evidente en el estrato que flanqueaba la capa celular piramidal de las regiones CA-1 y CA-3 de los hipocampos transgénicos. También se observó el aumento de tinción de los procesos neuríticos en las capas corticales más profundas de los cerebros transgénicos. La tinción neuronal y de los procesos se completó totalmente antes de la incubación del anticuerpo con el péptido b-amiloide sintético de 28 restos y se rebajó mediante tratamiento con ácido fórmico. Adicionalmente, como se muestra en la Figura 12D, la tinción neurítica de los cerebros transgénicos se detectó utilizando anticuerpos generados contra b-APP en toda su longitud indicando que el material inmunorreactivo del proceso neuronal es b-APP en toda su longitud.

También se observaron depósitos inmunorreactivos extracelulares en secciones de cerebro de las tres líneas transgénicas teñidas con el anticuerpo monoclonal 4.1 (Figura 13A-D). Estos depósitos no se observan en los animales de tipo salvaje estudiados. Los depósitos varían en tamaño, forma, y frecuencia. En la Figura 13A-E se muestran depósitos compactos de 10-30 mm de diámetro. Se observaron depósitos muy frecuentemente en el córtex y el hipocampo si bien se observaron ocasionalmente en el tálamo y en el cuerpo estriado. Los depósitos tienden a producirse en grupos. Se observó una media de 5 depósitos en una única sección de cerebro completo del fundador 10 u 11 NSE-b-A751, no obstante, se han observado quince depósitos con un tamaño de 10-50 mm en una sola sección. También se observaron depósitos extracelulares inmunorreactivos amorfos o granulares en secciones de cerebros transgénicos teñidos con el anticuerpo monoclonal 4.1 y no en las secciones de cerebro de control. La Figura 13e muestra un ejemplo de inmunorreactividad amiloide difusa en el hipocampo de un animal de la línea del fundador 11 NSE-b-A751. La detección de depósitos extracelulares en secciones de tejido de los animales transgénicos requirió tratamiento con ácido fórmico. La tinción de las estructuras fue completada por el péptido \beta-amiloide como se observa en la Figura 14e. Los depósitos se teñían de forma variable con los anticuerpos producidos contra b-APP en toda su longitud. Los cerebros de los fundadores 10 y 11 con NSE-A751 presentaban un mayor número de depósitos compactos que el fundador 24 con NSE-b-A751 (Tabla 2) incluso aunque el fundador 24 tiene más copias del transgen NSE-bA751.

TABLA 2 Compendio de los ratones empleados para la inmunohistología

2

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \+ \begin{minipage}[t]{140mm}  ^{1} meses;  ^{2} haploide;
 ^{3} >5 mm de tamaño, (-) (+/++/+++) relativo a la abundancia de
depósitos, esto es, +, <5; ++, 5-10; +++, >10
depósitos por sección como un promdio de múltiples secciones
teñidas. M y H indican ratones macho y hembra, respecticamente; AA y
Aa representan animales homozigotos y hemizigotos, respectivamente;
n.a. indica no aplicable.; *NSE-A751 F10 #31 murió
espontáneamente por causas
desconocidas.\end{minipage} \cr}

Aquellos ratones que albergan los genes exógenos pueden ser criados hasta 1) documentar que el ADN de NSE-751 o NSE-695 es incorporado establemente al genoma, 2) crear una línea pura, 3) caracterizar el ARNm y la expresión de las proteínas, 4) investigar por último las posibles consecuencias patológicas de la expresión del ADN foráneo, y 5) someter a ensayo los potenciales compuestos terapéuticos.

Se puede utilizar una variedad de procedimientos analíticos para identificar y caracterizar los animales transgénicos producidos conforme a los protocolos anteriormente descritos. Esto es, por supuesto, necesario para identificar qué animales transgénicos incluyen las secuencias insertadas tales como NSE-A-99, NSE-A-42, MT-A-99 y MT-A-42. Estos insertos, así como kis insertos A4i, pueden ser detectados utilizando reactivos oligonucleotídicos para la PCR y la transferencia Southern y anticuerpos para la transferencia Western racionales y específicos idénticos. Se harán evidentes para los expertos en la técnica una variedad de técnicas diferentes y combinaciones de técnicas tras leer esta descripción.

Se han desarrollado métodos de transferencia Western para identificar el precursor A751 o A695 en cerebro de roedores. Como ejemplo, se llevó a cabo una transferencia Western utilizando antisuero para A695 (producido utilizando el sistema del virus vaccinia recombinante) que se había hecho reaccionar con producto homogeneizado de cerebro total. Se reconoció una única proteína de 120 kd que es el peso molecular pronosticado del precursor. La membrana a la que se transfiere la proteína para la transferencia influye en grado sumo en la transferencia de la proteína. Para proteínas mayores de 30 kd, es óptimo el difluoruro de polivinileno (PVDF), mientras, por debajo de 30 kd, la nitrocelulosa es más eficaz. Se pueden utilizar otros antisueros asequibles desarrollados para las regiones del precursor amiloide, en concreto, sueros para el dominio inhibidor de Kunitz y para el dominio del núcleo en los análisis de transferencia Western de proteína de cerebro total. Adicionalmente, utilizando procedimientos conocidos en la técnica, es posible aislar anticuerpos monoclonales para el precursor. Los ratones han sido inmunizados con un virus vaccinia recombinante que expresa A751 y se demostró que producían anticuerpos para esta proteína.

La Figura 11B muestra una transferencia Southern de ADN de ratones de tipo salvaje y transgénicos. Calles 1 y 2, tipo salvaje (WT); calles 3 y 4, fundador 10 con NSE-A751 (F10); calles 5 y 6, fundador 11 con NSE-A751 (F11); calles 7 y 8, fundador 24 con NSE-A751 (F24). La flecha indica el gen b-APP de ratón endógeno. Los puntos indican b-APP exógeno.

La Figura 12 (A, B, C y D) muestran la tinción con inmunoperoxidasa de cerebro humano y de ratón. Las Figuras 12A y 12B muestran una sección de tejido con enfermedad de Alzheimer humana del hipocampo caudal teñido con anticuerpo 4.1 sin preincubación (12A) y con preincubación (12B) con el inmunógeno peptídico sintético \beta-amiloide. La Figura 12C muestra la capa celular piramidal de la región del hipocampo CA-1 de NSE-A751 F10 (#334) teñida con el anticuerpo 4.1. La Figura 12D muestra la misma región de ratón de tipo salvaje (#3) teñida con el anticuerpo 4.1. La aplicación es de 500X.

La Figura 13 (A, B, C, D y E) son fotomicrografías de depósitos inmunorreactivos en cerebros con NSE-A751. La Figura 13A es un depósito compacto en córtex parietal frontal de F11 (#0); La Figura 13B es un depósito compacto en el tálamo de F11 (#236); La Figura 13C muestra un depósito compacto en el campo CA-2 del hipocampo de F11 (#0); la Figura 13D muestra los grupos de depósitos en el córtex parietal frontal de F10 (#168); la Figura 13E muestra depósitos amorfos en estrato del hipocampo molecular de F11 (#236).

7. Usos de la invención

Los mamíferos transgénicos de la presente invención son útiles para determinar la eficacia de las drogas farmacéuticas con respecto a su capacidad para reducir el número de placas que se forman en el cerebro del animal. Más específicamente, los mamíferos son útiles para someter a ensayo la eficacia de semejantes fármacos para prevenir la formación o reducir la cantidad de las placas \beta-amiloides formadas así como para eliminar o reducir las placas ya formadas.

Los métodos para producir los animales transgénicos de la invención se han descrito antes. Una vez producida, el fármaco que se va a someter a ensayo se administra a un animal o grupo de animales de control que no sean los animales transgénicos de la invención y simultáneamente a los animales transgénicos de la invención. El fármaco se administra preferiblemente de forma continua a lo largo de un período de tiempo que normalmente es suficiente para efectuar el depósito de los depósitos proteicos amiloides en el cerebro del animal. Tras la administración del fármaco durante un período de tiempo suficiente se sacrifican el animal o animales de control junto con el animal o los animales transgénicos. Se realiza el examen del cerebro de los animales. Comparando la cantidad de depósitos en el animal o los animales de control con la cantidad de depósitos en el mamífero o los mamíferos transgénicos de la invención se puede realizar una determinación con respecto a la eficacia del fármaco para controlar la cantidad relativa de depósitos amiloides.

Ya que los animales transgénicos de la invención se pueden utilizar para someter a ensayo la eficacia de los fármacos con respecto a la prevención de los depósitos amiloides los animales son herramientas de investigación valiosas con respecto a la capacitación de los investigadores para someter a ensayo la eficacia de tales fármacos para tratar enfermedades asociadas con depósitos amiloides tales como la enfermedad de Alzheimer. No obstante, se debe señalar que existen seis casos conocidos de depósitos amiloides asociados con enfermedades en los que se conoce la naturaleza de la proteína precursora de la proteína amiloide; para la amiloidosis primaria, la fuente es una cadena ligera de inmunoglobulina; para la amiloidosis secundaria, el precursor es la proteína A amiloide; para la polineuropatía amiloide familiar y la amiloidosis cardíaca senil, la prealbúmina también conocida como transtireitina o una variante de la misma; para el carcinoma medular de tiroides, un fragmento de precalcitonina; y para la hemorragia cerebral hereditaria, un fragmento gamma traza que se ha demostrado que es la cistatina C. (ver, v.g., Glenner, G. New England Journal of Medicine (1980) 302:1283; Sletton, K., et al., Biochem J (1981) 195:561; Benditt, et al., FEBD Lett (1971) 19:169; Sletton, K., et al., Eur J Biochem (1974) 41:117; Sletton, K., et al., J Exp Med (1976) 143:993). Lo anterior es una lista parcial y existen al menos varias referencias adicionales en cuanto al fragmento de procalcitonina como precursor para el amiloide del carcinoma de tiroide. Alternativamente, o adicionalmente, se puede producir semejante precursor de la proteína núcleo \beta-amiloide en el cerebro o en otra parte y se deposita específicamente en el cerebro.

Los animales transgénicos y específicamente los mamíferos transgénicos de la presente invención se pueden utilizar para determinar la eficacia de una variedad de fármacos en el tratamiento de una variedad de enfermedades (incluyendo aquellas indicadas antes) cuyas enfermedades están asociadas con depósitos \beta-amiloides en el cerebro. Se pueden utilizar protocolos de ensayo de fármacos comparativos conocidos por los expertos en la técnica en relación con los animales transgénicos de la invención con el fin de someter a ensayo fármacos.

Las marañas neurofibrilares intraneuronales están presentes también en otras enfermedades neurodegenerativas, pero la presencia de depósitos amiloides tanto en los espacios interneuronales (placas neuríticas) como en la microvasculatura cincundante (placas vasculares) parece ser característico del Alzheimer. De estas, las placas neuríticas parecen ser las más prevalentes (Price, D.L., et al., Drug Development Reseach (1985) 5:59-68). También se han observado placas en los cerebros de pacientes con Síndrome de Dawn de cierta edad que desarrollan la enfermedad de Alzheimer. Los animales transgénicos de la presente invención pueden ser utilizados en relación con la determinación de la eficacia de todos los tipos de fármacos utilizados en relación con el tratamiento de las enfermedades asociadas con los depósitos amiloides, esto es, en Enfermedad de Alzheimer, (Dutch) la hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis, y el síndrome de Down.

Si bien se han descrito las realizaciones preferidas para elaborar y utilizar la invención, se apreciará que se pueden hacer cambios y modificaciones sin apartarse de la invención.

8. Consignas

Los siguientes cultivos han sido consignados en el American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA con el fin de patentarlos. Los fagos bacteriófagos \lambdaSM2, \lambdaSM2W9, y \lambdaAPCP168i4 y el plásmido pNSE-\beta-APP751 se consignaron bajo las condiciones especificadas por el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional de las Consignas de Microorganismos (Tratado de Budapest).

Cultivo	Núm. de Acceso	Fecha de Consigna
\lambdaSM2	40279	13 Noviembre 1986
SM2W4	40299	29 Diciembre 1986
SM2W3	40300	29 Diciembre 1986
\lambdaSM2W9	40304	29 Enero 1987
\lambdaACPC168i4	40347	1 Julio 1987
pNSE-\beta-APP751	75012	22 Mayo 1991

No se debe considerar la disponibilidad de las cepas consignadas como una licencia para poner en práctica la invención contraviniendo los derechos garantizados por la autoridad de cualquier gobierno conforme a sus leyes de patentes.

Claims

1. Un mamífero no humano transgénico cuyas células contienen la secuencia de ADN recombinante o sintética clonada cuya secuencia comprende:

una secuencia promotora específica de tejido nervioso que es el promotor de la enolasa específico neuronal; y

una secuencia codificadora que codifica la proteína precursora \beta-amiloide A751 y donde el promotor y la secuencia codificadora están asociados operativamente entre sí, se incorporan establemente al genoma del mamífero no humano y son expresados para formar depósitos de proteína \beta-amiloide en el cerebro de mamíferos no humanos.

2. Un mamífero según la reivindicación 1 que es un ratón.

3. Un método para producir un zigoto no humano transformado genéticamente susceptible de desarrollo en un mamífero no humano transgénico caracterizado por tener una pluralidad de células que tienen una secuencia de ADN recombinante o sintético clonada, comprendiendo la secuencia:

una secuencia promotora específica de tejido nervioso que es el promotor de la enolasa específico neuronal asociado operablemente con una secuencia codificadora que codifica la proteína precursora \beta-amiloide A751 cuyo método comprende la etapa de:

introducir la secuencia promotora y la secuencia codificadora en un pronúcleo de un zigoto de mamífero mediante microinyección, siendo susceptible dicho zigoto de desarrollo en un mamífero, obteniéndose un zigoto transformado genéticamente;

donde dichas secuencia promotora y secuencia codificadora se seleccionan de manera que la secuencia codificadora no sea activada de tal manera y grado que evite el desarrollo normal del embrión a término; y

donde la proteína precursora \beta-amiloide es expresada para formar depósitos de proteína \beta-amiloide en el cerebro del mamífero no humano.

4. Un método según la reivindicación 3, donde se microinyectan al menos 1.000 copias del gen en el pronúcleo y el volumen de material genético inyectado no excede de aproximadamente 10 picolitros.

5. Un método según la reivindicación 3 ó 4, donde la secuencia promotora y la secuencia codificadora se introducen en el pronúcleo masculino de un huevo que tiene pronúcleos femenino y masculino separados.

6. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 ó 5 en la que se permite que el zigoto se desarrolle in vitro hasta la fase de mórula o blastocito.