CZ20033046A3

CZ20033046A3 - Composition and method for increasing cell density in cell cultures infected with lentivirus

Info

Publication number: CZ20033046A3
Application number: CZ20033046A
Authority: CZ
Inventors: Anne Christine Thomas; Terry Kaleung Ng
Original assignee: Wyeth
Priority date: 2001-05-10
Filing date: 2002-05-03
Publication date: 2004-03-17
Also published as: BG108315A; EP1385540A4; HUP0400283A2; SI1385540T1; NZ529326A; HRP20030974A2; AU2002342568B2; US20020197714A1; ES2369846T3; CN1514734A; EP1385540B1; PL373847A1; WO2002091994A3; NO20034961L; WO2002091994A2; BR0209482A; EP1385540A2; PT1385540E; JP2005508139A; JP4283544B2

Description

Předkládaný vynález se týká nových buněčných kultur. Zvláště je tento vynález zaměřen na nové buněčné kultury infikované lentiviry, jako je virus imunodeficience u koček (FJV, feline immunodeficiency virus), které obsahují vhodná antibiotika ke zvýšení hustoty buněk a zvyšují růst kultury. Tento vynáiez se také týká nových způsobů zvýšení hustoty buněčných kultur za použití určitých antibiotik.

Dosavadní stav techniky

Lentiviry představují třídu virů, které mohou vyvolávat množství různých onemocnění jak u lidí, tak i u zvířat. Těmto onemocněním často předchází několik měsíců nebo i let inkubace. Například patologické stavy spojené s AIDS jsou způsobeny viry lidské imunodeficience (HIV) a jsou výsledkem chronického postupu, vývoje onemocnění, přičemž často vyvolávají tělesnou sešlost (kachexii) a smrt pacienta až několik let po jeho infikování.

Lentiviry již byly také spojeny s různými patologickými stavy takových živočišných druhů, jako jsou lidoopi a opice, stejně jako domestikovaných druhů zvířat jako jsou koně, osli, skot, kozy a ovce, Z nich byla koňská infekční anemie (EIA, equine infectious anemia) charakterizována jako nejzávažnější infekční onemocnění koní, ke kterému celosvětově dochází. Lentiviry ovcí jsou poměrně častými patogeny ve většině částí světa a jako dva převládající typy zahrnují virus Maedi-visna a virus progresivní pneumonie. Virus hovězí (kravské) imunodeficience je důležitou příčinou onemocnění skotu.

Další lentiviry jsou vitálními (živými) indikátory patologických stavů u zvířat, jako jsou kočky. Virus imunodeficience koček, strukturně podobný jako HIV, může působit smrt domácích koček. Lékaři, veterináři a výzkumníci věnují stále více času a prostředků na prevenci a léčbu onemocnění, způsobených těmito viry.

Část výzkumu zahrnuje růstové tkáňové kultury s obsahem buněk, například lymfocytů, které byly infikovány jedním nebo větším počtem lentivírů. Kultury lymfocytů nebo na pevné půdě závislé buňky podobné výstelkovým, epitelovým buňkám, jako jsou kultury buněk z kočičích ledvin, mohou být pěstovány v T-baňkách, válcovitých lahvích, rotačních (kotoučových) baňkách a v bioreaktorech za použití médií, jako jsou minimální esenciální médium (MEM), médium Roswel Park Memoriál Institute (RPMI), MEM modifikované podle Dulbecca (Dulbeco’s MEM, DMEM) a médium AIM V (od firmy Gibco/LTI, Grand Island, NY)., doplněných hovězím sérem až do přibližně 20% a hovězím sérovým albuminem (BSA) až do přibližně 5% koncentrace.

Kultury ve velkém měřítku mohou být pěstovány ve velkých odstředivých tancích (spinnerech), fermentorech a v bioreaktorech za přítomnosti chemikálie chránící proti střihu, zahušťovadla, emulgátorů nebo sloučenin jako methylcelulózy, karboxymethylcelulózy a povrchově aktivních látek, jako je série látek Pluronic, například Pluronic® F-68, vyráběný firmou BASF Corporation of Wyandotte, Michigan.

Při udržování tkáňových kultur s obsahem vírů se vědci snaží v kultuře zničit škodlivé bakterie, aby buňky s obsahem viru mohly růst a rozvíjet se. Současně je průvodním úspěchem maximalizace růstu buněčné kultury. Přijímanou praxí k usnadnění růstu a zničení bakterií byío přidávání antibiotik, obvykle pak jejich kombinace, do buněčné kultury. Například patent US 5 958 423 ustavuje buněčnou kulturu buněk

- 3 Madin-Darby z hovězích ledvin (MDBK), v níž se používá do 30 pig/ml polymixinu B a neomycinu a do 2,5 ng/ml amfotericinu B.

To, co je nyní v oboru potřebné, jsou nová složení buněčných kultur, obsahujících buňky infikované lentiviry. Zvláště potřebné jsou nové buněčné kultury, u nichž může být maximalizován buněčný růst a souběžně může být minimalizována přítomnost škodlivých mikroorganismů, jako jsou bakterie. Potřebné jsou také nové metody pěstování buněčných kultur, v nichž může být jejich hustota zvýšena podporou tkáňového růstu. Dále jsou potřebné i nové přídavné látky, které mohou optimalizovat hustotu buněčných kultur umocněním a zvýšením růstu buněk, obsažených v buněčné kultuře.

Podstata vynálezu

V jednom ztělesnění je předkládaný vynález zaměřen na buněčnou kulturu, obsahující alespoň jedním lentivirem infikované hostitelské buňky a antibiotikum v množství podporujícím růst, sestávající v podstatě z neomycinu nebo jeho biologicky slučitelné sole.

Vynález je také zaměřen na buněčnou kulturu, která obsahuje alespoň jedním lentivirem infikované hostitelské buňky a neomycin nebo jeho biologicky přijatelnou sůl, přičemž neomycin je přítomný v podstatě bez jiného antibiotika v takovém množství, jaké je účinné pro inhibování bakteriálního růstu a zvýšení hustoty buněčné kultury.

Jako část vynálezu je poskytnut způsob zvýšení hustoty buněčné kultury, při němž se buňky infikují lentivirem, což obsahuje přidání antibiotika sestávajícího v podstatě z neomycinu nebo jeho biologicky přijatelné sole, spolu s alespoň jedním doplňkem pro buněčné kultury. Doplňkem pro buněčnou kulturu je s výhodou hovězí sérum.

Následující a další rysy a výhody předkládaného vynálezu budou zřejmější z podrobného popisu upřednostňovaných provedení tohoto vynálezu, uvedeného níže.

Podrobný popis vynálezu

Předkládaný vynález se zaměřuje na buněčné kultury. Ty, jejichž použití je zde zamýšleno, jsou kultury vhodné pro výzkum a studium, které jsou schopnév sobě obsahovat lentiviry a umožnit jim růst. Takové buněčné kultury by tedy měly zahrnovat lymfocyty a jiné druhy buněk, které je možné infikovat jedním nebo větším počtem lentivirů. Další vhodné buněčné kultury by měly zahrnovat kočičí lymfocyty, fibroblastům podobné a výstelkovým buňkám podobné buňky, jako jsou buňky z kočičích ledvin, Crandellovy buňky z kočičích ledvin (Crandell Feline Kidney celíš, tj. CRFK buňky) a buňky kočičích lymfocytů (FL, feline lymphocyte) FL6, FL72 a FL74. Pro použití v tomto vynálezu mohou být upřednostněny T-buněčné lymfocyty, stejně jako na IL-2 nezávislé lymfocyty FetJ a FL6.

Výraz lentiviry, jak je zde používán, zahrnuje veškeré známé i na objevení ještě čekající lentiviry, včetně, ne však výlučně, viru koňské infekční anemie, víru Maedi-visna, viru progresivní pneumonie, viru kozí arthritidy-encefalitidy, víru kočičí imunodeficience (FIV), virů opičí imunodeficience, infikujících takové druhy jako jsou makakové, paviáni a opice Red colobus (african monkey) a viru lidské imunodeficience typu I a II. Výraz lentiviry také zahrnuje analogy, deriváty a peptidové sekvence kterýchkoliv z výše uvedených virů. Pro použití v tomto vynálezu se upřednostňují jiné než lidské lentiviry a zejména virus kočičí imunodeficience (FIV).

Buněčné kultury podle tohoto vynálezu mohou být kultivovány za použití metod známých v oboru. Hostitelské buňky jako lymfocyty mohou

- 5 být například za použití obecně přijímaných postupů chronicky infikovány jedním nebo více z následujících lentivirů a poté jsou pěstovány ve vhodných médiích. Médiem je s výhodou v podstatě kapalné médium. Ještě lépe se média nejprve poskytují jako média, která v podstatě neobsahují sérum, Hostitelské buňky mohou být například suspendovány v kapalných médiích. Hustota buněk pěstované buněčné kultury se může lišit v závislosti na konkrétních hostitelských buňkách, médiu a růstové komoře, ale může se pohybovat v rozmezí přibližně od 1 x 10⁴ do 1 x 10⁶ vhodných buněk na 1 ml buněčné kultury (včetně médií). Ještě lépe je buněčná hustota v rozmezí přibližně od 2 x 10⁵ do 5 x 10^s buněk na mililitr.

Jako další část vynálezu obsahují buněčné kultury vhodné antibiotikum, které je účinné pro inhibování růstu bakterií v kultuře, přičemž souběžně zvyšuje růst buněk a tím i hustotu buněčné kultury. Pro použití v tomto vynálezu se upřednostňuje antibiotikum neomycin, který může zahrnovat veškeré biologicky slučitelné sole a deriváty takové látky, jako sulfát neomycinu. Výrazem biologicky slučitelný se myslí to, že sůl nebo derivát neomycinu nemá na buňky v pdstatě žádné záporné biologické účinky.

Množství neomycinu, přidaného do buněčné kultury, se může lišit podle potřeby určené zkušeným odborníkem, ale typicky se neomycin přidává v takovém množství, které zvýší hustotu buněčné kultury. Obvykle se upřednostňuje množství neomycinu v rozmezí přibližně od 5 gg/ml buněčné kultury do 60 μς/ιτιΙ buněčné kultury (včetně média). V ještě upřednostňovanějším provedení se neomycin přidává do buněčné kultury v množství přibližně od 30 gg/ml do 60 pig/ml.

Neomycin se ke zvýšení buněčného růstu a hustoty s výhodou používá bez zahrnutí dalších takových antibiotik, jako jsou například

polymixin B a gentamycin. Polymixin B může být odvozen z poiymixinu B1 a poiymixinu B2, které jsou produkovány růstem Bacillus polymyxa (Prazmowski) Migula (čeleď Bacillaceae). Nyní bylo zjištěno, že začlenění neomycinu a polymyxinu B do buněčné kultury může v mnoha případech vyvolat významné menší zvýšení hustoty buněk ve srovnání s použitím samotného neomycinu.

Další složky buněčné kultury podle předkládaného vynálezu budou typicky zahrnovat alespoň jeden doplněk kultury. Doplněk kultury může být hovězího původu, jako hovězí séra, a může zahrnovat hovězí sérum a hovězí sérový albumin (BSA). Doplněk kultury může být začleněn v množstvích přibližně od 0,1 do 10 % objemu konečné buněčné kultury.

Použití neomycinu, jak je zde popsáno, může zvýšit hustotu buněk přibližně alespoň o 20 % a lépe alespoň o 33 a 1/3 % oproti shodné buněčné kultuře lentivirem infikovaných hostitelských buněk, neobsahující žádné antibiotikum. Hustota buněk může být stanovena všeobecně přijímanými metodami, včetně vyloučení na základě barvení trypanovou modří za použití hemacytometru.

Následující příklad je poskytován pouze pro dokreslení upřednostňovaného aspektu tohoto vynálezu, ale nemá být vykládán jako omezení rozsahu vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad

V tomto příkladu byly buňky Fet-J, chronicky infikované virem kočičí imunodeficience (FIV), pěstovány v médiu bez obsahu séra, jako je modifikované DMEM.F12 médium nebo jako jsou média AIM V, přičemž médium bylo doplněno 2,5 mg/ml látky ALBUMAX®, která je

odvozena od BSA. Buňky byly pěstovány v suspenzi v Erlenmeyerových baňkách na rotační třepačce při rychlosti otáčení 150 otáček za minutu (RPM).

Buňky byly pěstovány až do hustoty 3 x 10⁵ živých buněk/ml. Hustoty buněk byly stanovovány vyloučením na základě barvení trypanovou modří v hemacytometru. Stanovení exprese Gp 120 bylo prováděno enzymovým imunoabsorbčním stanovením (ELISA) za použití monoklonáíních protilátek vůči Gp 120 z FIV. Antibiotika určená pro doplnění FIV zahrnovala gentamycin, neomycin a polymixin B. Média byla doplněna (vyztužena) odpovídajícími antibiotiky v koncentraci 30 pg/ml. Hustoty buněk byly stanovovány po 24 hodinách výše popsanou metodou. Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 1.

Tabulka 1

pokusná skupina	koncentr. antibiotika (pg/ml)	den 0 buněk/ ml	den1	den 2	den 3	den 4	den 5
kontrola	N/A	3,0x10⁵	3,6x10⁵	5,5x10⁵	1,0x10⁵	1,2x10⁵	1,2x10⁵
gentamycin	30 iig/mí	3,0x10⁵	2,4x1Q⁵	3,2x10⁵	6,5x10⁵	1,1x10⁵	1,1 x10⁵
neomycin	30 pg/ml	3,0x10⁵	4,7x10⁵	7,8x10⁵	1,2x10⁵	1,3x10⁵	1,8x1Q⁵
polymixin B	30 pg/ml	3,0x10⁵	2,9x10⁵	4,6x10⁵	5,8x10⁵	6,6x10⁵	Θ,ϋχΙΟ⁵
polymixin B + neomycin	30 pg/ml +30 pg/ml	3,0x10⁵	2,9x10⁵	5,0x10⁵	7,0x10⁵	7,7x10⁵	7,8x10⁵

Výsledky uvedené v Tabulce 1 ukazují, že suspenze buněčné kultury doplněné neomycinem vykázaly nejlepší celkový růst a zvýšení hustoty buněk. Gentamycin neměl žádný významný účinek, denní hustoty buněk byly v podstatě stejné jako u kontrol. Kultury doplněné

- 8 polymixinem B nebo kombinací neomycinu a polymixinu ve skutečnosti snižovaly hustotu buněk ve srovnání s kulturami, v nichž nebyla žádná antibiotiky použita a byly tedy mnohem méně husté než kultury, do nichž byl přidán samotný neomycin.

Ačkoliv byl tento vynález popsán s odkazem na jeho konkrétní provedení, bude zřejmé, že je možné udělat mnoho změn a modifikací, aniž by byly překročeny rozsah nebo podstata předloženého vynálezu. V souhlasu s tím nemá být tento vynález považován za omezený výše uvedeným popisem, neboť je omezen pouze rozsahem připojených patentových nároků.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Buněčná kultura, která obsahuje alespoň jedním lentivirem infikované hostitelské buňky a antibiotikum v množství podporujícím růst, sestávající v podstatě z neomycinu, nebo jeho biologicky kompatibilní sole či derivátu.
2. Buněčná kultura podle nároku 1, v níž je uvedený neomycin přítomný v množství přibližně do 60 mikrogramů/ml zmíněné kultury.
3. Buněčná kultura podle nároku 1, v níž jsou uvedené hostitelské buňky infikovány alespoň jedním lentivirem, zvoleným ze skupiny, sestávající z viru koňské infekční anemie, viru Maedi-visna, viru progresivní pneumonie, viru kozí arthritidy-encefaIitidy, viru kočičí imunodeficience, viru opičí imunodeficience a viru lidské ímunodeficience typu I a typu II.
4. Buněčná kultura podle nároku 3, v níž je uvedený virus zvolen ze skupiny, sestávající z viru kočičí imunodeficience, viru opičí Ímunodeficience a viru lidské imunodeficience typu I a typu II.
5. Buněčná kultura podle nároku 4, v níž je uvedeným virem virus kočičí imunodeficience.
6. Buněčná kultura podle nároku 1, v níž uvedené hostitelské buňky jsou alespoň jedním členem, zvoleným ze skupiny, sestávající z lymfocytů.
7. Buněčná kultura podle nároku 6, v níž jsou zmíněnými lymfocyty T-buněčné lymfocyty.
8. Buněčná kultura podle nároku 7, v níž jsou zmíněné lymfocyty zvoleny ze skupiny, sestávající z lymfocytů FetJ nezávislých na interleukinu 2 a z lymfocytů FL6.
9. Buněčná kultura podle nároku 1, v níž je uvedený neomycin přítomný v množství přibližně od 5 mikrogramů/ml.
10. B uněčná kultura podle nároku 9, v níž je uvedené množství neomycinu účinné ke zvýšení hustoty zmíněné buněčné kultury.
11. Buněčná kultura podle nároku 10, v níž je uvedené množství neomycinu účinné k inhibování bakteriálního růstu zmíněné buněčné kultury.
12. Buněčná kultura podle nároku 11, v níž je uvedený neomycin přítomný v množství přibližně od 20 mikrogramů/ml.
13. Buněčná kultura podle nároku 12, v níž je uvedený neomycin přítomný v množství přibližně od 30 mikrogramů/ml.
14. Buněčná kultura podle nároku 5, přičemž uvedená buněčná kultura je přítomna v médiích neobsahujících sérum.
15. Buněčná kultura podle nároku 12, přičemž buňky uvedené kultury jsou pěstovány v hustotě v rozmezí od přibližně 1 x 1 O⁵ do 5 x 10⁵ živých buněk/ml buněčné kultury.
16. Buněčná kultura podle nároku 15, přičemž buňky uvedené kultury jsou pěstovány v hustotě přibližně 3 x 10⁵ živých buněk/ml buněčné kultury.

-1117. Buněčná kultura, obsahující alespoň jedním lentivirem infikované hostitelské buňky a neomycin, přičemž uvedený neomycin je přítomný v podstatě bez jiného antibiotika v množství, které je účinné k inhibování bakteriálního růstu a ke zvýšení hustoty zmíněné buněčné kultury.
18. Buněčná kultura podle nároku 17, přičemž uvedená buněčná kultura neobsahuje v podstatě žádný gentamycin nebo polymixin B.
19. Buněčná kultura podle nároku 17, přičemž uvedený neomycin je přítomný ve zmíněné kultuře v množství v rozmezí přibližně od 5 mikrogramů/ml do 60 mikrogramů/ml zníněné buněčné kultury.
20. Buněčná kultura podle nároku 19, přičemž uvedený neomycin je přítomný ve zmíněné kultuře v množství přibližně alespoň 20 mikrogramů/ml.
21. Buněčná kultura podle nároku 20, přičemž uvedený neomycin je přítomný ve zmíněné kultuře v množství přibližně alespoň 30 mikrogramů/ml.
22. Buněčná kultura podle nároku 17, přičemž uvedený lentivirus je alespoň jedním členem, zvoleným ze skupiny sestávající z viru koňské infekční anemie, viru Maedi-visna, viru progresivní pneumonie, viru kozí arthritidy-encefal itidy, viru kočičí imunodeficience, viru opičí imunodeficience a viru lidské imunodeficience typu I a typu II.
23. Buněčná kultura podle nároku 22, v níž je uvedený virus zvolen ze skupiny, sestávající z viru kočičí imunodeficience, viru opičí imunodeficience a viru lidské imunodeficience typu I a typu II.

• · * • · · »

- 12
24. Buněčná kultura podle nároku 23, v níž je uvedeným virem virus kočičí imunodeficience.
25. Buněčná kultura podle nároku 17, v níž uvedené hostitelské buňky jsou alespoň jedním členem, zvoleným ze skupiny, sestávající z lymfocytů.
26. Buněčná kultura podle nároku 25, v níž jsou zmíněnými hostitelskými buňkami T-buněčné lymfocyty.
27. Buněčná kultura podle nároku 26, v níž jsou zmíněné hostitelské buňky zvoleny ze skupiny, sestávající z lymfocytů FetJ nezávislých na interieukinu 2 a z lymfocytů FL6.
28. Buněčná kultura podle nároku 17, přičemž buňky uvedené kultury jsou pěstovány v hustotě v rozmezí od přibližné 1 x 10⁵ do 5 x 10⁵ živých buněk/ml buněčné kultury.
29. Buněčná kultura podle nároku 28, přičemž buňky uvedené kultury jsou pěstovány v hustotě přibližně 3 x 10⁵ živých buněk/ml buněčné kultury.
30. Způsob zvýšení hustoty buněčné kultury, jejíž buňky byly infikovány lentivirem, vyznačující se tím, že se k uvedené buněčné kultuře přidá antibiotikum, sestávající v podstatě z neomycinu.
31. Způsob podle nároku 30, vyznačující se tím, že uvedený neomycin se přidá v množství přibližně od 5 mikrogramů do 60 mikrogramů zmíněné buněčné kultury.