CZ20033273A3 - Use of polyclonal immunoglobulins as vaccine - Google Patents

Description

Použití polyklonálních imunoglobuiinů óMl

Oblast techniky

Předložený vynález se týká použití polyklonálních imunoglobulonových preparátů.

Dosavadní stav techniky

Vyšší organizmy se vyznačují imunním systémem, který je chráněn před potenciálně nebezpečnými látkami nebo mikroorganizmy. Pokud nějaká látka (antigen) pronikne do těla, je identifikována jako „cizí“ a s pomocí imunního systému eliminována. Také „degenerované“ buňky vlastní tělu jsou obvykle imunním systémem rozpoznány a staženy z oběhu.

Adaptivní imunní systém člověka sestává ze dvou podstatných komponent, z humorální a z celulární imunity. Adaptivní imunní odpověď spočívá ve klonální selekci B- a T-lymfocytů a v principu umožňuje rozpoznání libovolného antigenu a rovněž výstavbu imunologické paměti. Tyto znaky adaptivního imunního systému se s užitkem obecně využívají při očkování.

Každá B-buňka produkuje protilátku s určitou vazební specifikou. Tyto protilátky se jako specifické receptory nacházejí také v membráně B-buňky, která je produkuje. Humorální imunní odpověď vůči antigenům rozpoznaným jako cizí spočívá v selektivní aktivaci takových B-buněk, které produkují takové protilátky, které se mohou vázat na epitop daného antigenu. Pro různorodost protilátek sehrává změna uspořádání DNA v průběhu diferenciace B-buněk rozhodující roli.

V lidském seru se nachází velké množství protilátek nejrůznějších specifik, isotypů a podtříd. Celková koncentrace všech imunoglobuiinů ·· · · ·· · ··· ··· · · · ···· • ··· 9 9 9 9 · ··· • 9 9 9 9 ^99

9999 99 99 999 99 9 v seru činí 15 až 20 mg/ml; to znamená, že v krvi trvale cirkuluje asi 100 g imunoglobulinu o nejrůznějších specifikách. Není možné udat přesný počet všech protilátek s nejrozdílnějšími specifikami, repertoár různých klonů B-buněk u člověka činí asi 10⁹. Určité protilátky mohou obecně vázat různé, navzájem podobné antigeny, i když s rozdílnou afinitou a aviditou.

Imunní systém musí s pomocí endogenních regulačních mechanizmů udržovat homeostázu z hlediska rozdělení a závažnosti těchto různých specifik. Základním mechanizmem pro to je „idiotypická síť‘(Ann. Immunol. 125 C : 373 až 89 (1994)). Proti každému idiotypu protilátky, která určuje jeho vazební specifiku, existuje anti-idiotypická protilátka, která se váže na idiotyp první protilátky ve smyslu rozpoznání antigenu. Podle tohoto modelu vysvětlení odpovídají vzájemné účinky mezi receptory specifickými pro idiotyp a lymfocyty za regulaci imunního systému. K těmto vzájemným účinkům evidentně skutečně dochází, protože bylo ukázáno, že v průběhu imunní odpovědi vznikají také antiidiotypické protilátky proti protilátkám indukovaným primárně imunní odpovědí. Protože proti každé protilátce existuje anti-idiotypická protilátka, nejsou lymfocyty vůči idiotypům protilátek v zásadě tolerantní (William E. Paul, vydavatel, Fundamental Immunology, 3. vydání, Raven Press Ltd., New York, 1993, strany 887 až 902).

Imunní systém tedy sestává z lymfocytových klonů, které se stimulují případně regulují pomocí imunoglobulinů, které jsou produkovány jinými klony v rámci sítě. Pod pojmem konektivita se rozumí stupeň zesítění imunního systému. Imunní systém s nízkou konektivitou obsahuje relativně mnoho imunních buněčných klonů, které nejsou ovlivňovány idiotypickými / anti-idiotypickými vzájemnými účinky. Pod tímto druhem vzájemných účinků se nerozumí jenom přímé vzájemné účinky, to znamená vzájemné účinky mezi dvěma vazebními místy protilátek. Rozumí se tím především účinky, které vznikají nepřímo řadou interakcí protilátek. Přitom jsou involvovány nejenom B-buňky a protilátky, nýbrž také T-buňky s jejich receptory (Immunol. Rev. (1988) 101: str. 191 až 215)

Celá imunní síť má určitou „vnitřní strukturu“, ve které se Blymfocyty zařazují do různých kategorií, to znamená, že produkují imunoglobuliny s různými základními vlastnostmi (Immunol. Rev. (1989) 110: str. 37 až 61):

protilátky, které vykazují afinitu k téměř všem imunoglobulinům (tedy také s auto-afinitou, to znamená, že reagují také samy se sebou, „sticky antibodies“) zrcadlové protilátky jsou protilátky, které mají afinitu k idiotypu určité protilátky protilátky, které mají slabou afinitu k „sticky antibodies“.

Čím vyšší je konektivita sítě, tím větší je rozmanitost vzájemně zesíťujících imunoglobulinů. Všechny tyto protilátky jsou v určité rovnováze. Posun rovnováhy se může projevit patologickými jevy (onemocnění autoimunního systému, alergie, rakovina, náchylnost k inkfekčním onemocněním). V této souvislosti je třeba chápat výskyt patologických jevů zčásti jako neregulovanou expanzi autoreaktivních klonů, která je způsobena defektní nebo sníženou konektivitou.

Záznamy dat ukazují, že pozitivní účinek terapeutického použití vyšších dávek polyklonálního imunoglobulinu (IVIG) při onemocnění imunního systému se odvozuje od obnovy nebo zlepšení konektivity imunního systému (Immunological Reviews (1989) 110 :135 až 149; Scand. J. Immunol. (2000) 51:408 až 414; Immunology Today (1994)

15:341 až 342; Dermatol. Clin. (2000) 18:447 až 457).

• · · · · · · • · · · · · · · • · · · · · • ····· · · · • · · · · • · · · · · · · · · ·

V US-PS 5 562 902 a US-PS 5 965 130 se popisuje použití IVIG k terapii rakoviny.

Jedno z prvních použití poolovaného imunoglobulinu je zabránění infekčním onemocněním. Imunoglobulin použitý tímto způsobem může při intravenozním podání vést k anafylaktickému šoku a podává se proto intramuskulárně v omezeném množství (několik mililitrů, což odpovídá několika stovkám miligramů imunoglobulinu).

Rovněž bylo pozorováno, že profylaktická dávka imunoglobulinu ze sera vedla k zabránění hepatitis, rovněž četnost různých onemocnění pokožky mezi ošetřenou populací klesla (Int. J. Dermatol. (2000) 39 :

628 až 631).

Na základě rozdílných experimentálních pozorování ke způsobu účinku poolovaného sérového globulinu byly vypracovány různé teorie:

ovlivnění fagocytozy interakcí receptorů Fc - Fc (Ann. Intern. Med. (1991)115:294 až 307) regulace idiotypické / anti-idiotypické sítě, potlačení určitých idiotypů (Int. J. Artif. Organs (1993) 16, Suppl. 5:189 až 195) potlačení produkce protilátek (Clin. Exp. Immunol. (1986) 65 : 409 až 415) vzájemné působení imunoglobulin - zytokin (Immunol. Rev. (1994) 139: 5 až 19) neutralizace superantigenů a toxinů (New Engl. J. Med. (1991) 324:1633 až 1639) ovlivnění komplementního systému (J. Neuroimmunol. (1996) :227 až 229 urychlení látkové výměny imunoglobulinu (Immunol. Today (1997)18:592 až 598) • φφφ • · φφφφ φ φ '

J·· neutralizace bakterií, hub a virů (Goodman and Golmans The Pharmacological Basis ofTherapeutics, McDraw-Hill, New York (1996). 1291 až 1308).

Ačkoliv mechanismus působení dávek imunoglobulinu takového druhu není možné vždy jednoznačně připsat pouze jednomu efektu, přesto je možné pozorovat, že všichni uživatelé používají k terapii velká množství imunoglobulinu a vycházejí z jediného přímého účinku podaného imunoglobulinu. Množství, která se obvykle používají, sahají od několika stovek miligramů až do několika gramů imunoglobulinu na kg tělesné hmotnosti a na den, přičemž ošetřování se většinou provádí déle než jeden den (Dermatol. Clin (2000) 18:447 až 457).

Poolovaný, polyklonální imunoglobulin (jako příkladně intravenozní imunoglobulin, IVIG nebo imunní sérový globulin) se preparuje frakcionací poolovaného sera, pocházejícího od tisíců dárců. Dosud používané vysoké dávky k terapii mnoha imunologicky podmíněných nemocí vede pravidelně k nedostatkům v zásobování těmito preparáty.

Ve WO 92/15885 se popisuje výroba přípravku obsahujícího monoklonální anti-idiotypické protilátky k ošetřování infekce HIV.

Vhodné monoklonální protilátky se podle tohoto dokumentu vyberou na základě jejich určité specificity k polyklonálním protilátkám a formulují se do jedné očkovací látky. Polyklonální protilátky samotné se v popsaných přípravcích nepoužívají. Rovněž se v tomto dokumentu pro odborníky nepojednává náhrada monoklonálních protilátek polyklonálními protilátkami.

Podle WO 91/114651 A1 se používají anti-idiotypické protilátky jako imunogenní podoba („mimic“) určitého antigenu. Přitom se popisují jak monoklonální tak i polyklonální protilátky, WO 91/114651 A1 však • i · * · · · · • · · <

» « » ·· · · zveřejňuje pouze použití specifických anti-idiotypických protilátek k výrobě vakciny a nikoliv polyklonálních protilátek o rozdílných specifikách.

Úkolem předloženého vynálezu je proto dát k dispozici nové a účinné terapeutické možnosti pro onemocnění tohoto druhu, s nimiž by se odstranila i úzká místa.

Podstata vynálezu

Tento úkol se podle vynálezu řeší tak, že se zcela novým druhem a způsobem použijí polyklonální imunoglobuliny, a to k imunizaci. K tomu se podle vynálezu použijí pouze nepatrná množství (ve srovnání s pasivní imunizací nebo jinými oblastmi použití imunoglobulinů, obzvláště IVIG podle stavu techniky) takového materiálu, a to právě množství, které se používá pro jiné aktivní imunizace.

Imunizací se vyvolá imunní odpověď, která obnoví konektivitu imunního systému. „Sticky antibodies“ přítomné v polyklonálních imunoglobulinech případně protilátky, které mají slabou afinitu k „Sticky antibodies“ vyvolají imunní odpověď, která představuje posílení těchto typů protilátek. Rovněž se mohou při autologovém použití indukovat imunizací anti-idiotypické protilátky proti patologickým auto-protilátkám přítomným v polyklonálních imunoglobulinech. To může vést k oslabení produkce patologických protilátek.

Podle toho se předložený vynález týká použití přípravku polyklonálního imunoglobulinu k výrobě formulace očkovací látky, obsahující protilátky o rozdílných specifikách k imunizaci individuí stejného typu, z něhož pocházejí imunoglobuliny. Příkladně se podle vynálezu předpokládá použití preparátů humánního imunoglobulinu na • Jfc · · · · · · • / ·· · lidech, zatímco hovězí nebo prasečí imunoglobuliny se použijí k ošetřování skotu případně prasat.

Jako polyklonální protilátky se použijí protilátky rozdílných specifik, s výhodou většího počtu specifik, které byly nalezeny v lidském seru případně v poolovaných frakcích imunoglobulinu lidské krevní plasmy.

Polyspecifické protilátky se podle stavu techniky podávají jako preparáty imunoglobulinu, přičemž imunogenita není ani žádoucí ani nebyla nalezena. Bylo překvapivé, že polyspecifické protiiátky, které byly formulovány na očkovací látku podle vynálezu vykazovaly výhodné účinky jako imunogeny k aktivaci imunní odpovědi. Přes nespecifické imunogeny bylo možné prokazatelně zvýšit reaktivitu vůči určitým nežádoucím antigenům bez nežádoucích vedlejších účinků. Tato reaktivita působí především proti allogením antigenům, jako jsou tumorové antigeny, které jako takové nejsou tělem rozpoznávány jako cizí.

V jedné formulaci očkovací látky podle vynálezu, která obsahuje humánní polyspecifické protilátky je obvykle k dispozici pro ošetření pacienta asi 5 pg až 10 mg imunoglobulinu v objemu od 0,01 až do 1 ml. Výhodné množství imunoglobulinu činí asi 10 až 1000 μg, nejvýhodněji 50 až 750 pg.

Očkovací látka je vhodná jak k profylaxi, tak i k terapii onemocnění, přičemž primární obraz nemoci je v souvislosti s tumorovými, infekčními a autoimunními onemocněními.

Předložený vynález vylučuje případně snižuje výše uvedené nevýhody podle stavu techniky, přičemž se preparáty imunoglobulinu

8.

• · · • ··· použijí v malém množství a takových způsobem, že v organizmu příjemce indukují imunní odpověď. Přitom je překvapivé, že je možné dosáhnout imunizace polyspecifickými imunoglobuliny bez nežádoucích vedlejších účinků, obzvláště když se přes nespecifickou aktivaci imunní odpovědi výrazně zvýší specifická vazební aktivita tumorových buněk.

Podle předloženého vynálezu se přitom může k aktivní imunizaci použít polyklonální imunoglobulinový pool (příkladně MG nebo jiné formulace gama-globulinu).

Imunoglobulinové přípravky se přitom k aktivní imunizaci podávají v množství typickém pro organizmus příjemce. Rovněž průběh podávání odpovídá formě obvyklé pro aktivní imunizaci (příkladně subkutánně, intradermálně a intramuskulárně), výhodné jsou formy podávání subkutánní a intradermální.

S výhodou se jako polyklonální přípravek imunoglobulinu použije autologový přípravek imunoglobulinu k aktivní imunizaci stejného individua, ze kterého přípravek pochází. Autologové podávání přípravku polyklonálního imunoglobulinu, to znamená podávání přípravku polyklonálního imunoglobulinu individuu, z jehož tělesných tekutin obsahujících imunoglobuliny pochází polyklonální imunoglobulin je proto obzvláště výhodnou formou provedení předloženého vynálezu. Další výhodou této autologové formy provedení předloženého vynálezu je skutečnost, že se může vyloučit infekce imunoglobulinového přípravku z jiných individuí (příkladně viry hepatitis C nebo HIV), k jaké může dojít v případě poolovaných přípravků. Jako individuum se podle předloženého vynálezu rozumí jednotlivé lidské nebo zvířecí organizmy, které mají tělesné tekutiny nebo tkáně, které obsahují protilátky.

S výhodou se výroba podle vynálezu provádí samozřejmě na obratlovcích, obzvláště lidech.

·· · ·

9.·’ • · · • ···

S výhodou se k přípravkům polyklonálních imunoglobulinů přidává jeden nebo několik adjuvans. Jako adjuvancia se rozumí látky, které mohou pro daný imunogen kvalitativně a/nebo kvantitativně zlepšit imunní odpověď. Polyklonální imunogiobulin podle předloženého vynálezu se podává ve formě, která umožní vyvolat imunní odpověď.

K posílení této imunní odpovědi se proto může přípravek imunoglobulinu podávat s adjuvancii, jak je v imunologii obvyklé.

Jako příklady pro adjuvancia, aniž by však byly omezením, lze zmínit: adjuvancia obsahující hliník, obzvláště hydroxid hlinitý, deriváty liposacharidu, Bacillus Calmette Guerin (BCG), saponiny a jejich deriváty (příkladně QS-21), přípravky liposomů. V jedné výhodné formě provedení předloženého vynálezu obsahuje podle zpracování přípravek protilátky jako očkovací formulaci přídavek látky, vybrané ze skupiny adjuvancii, obzvláště adjuvancia obsahující hliník, deriváty lipopolysacharidů, Bacillus Calmette Guerin, liposomy nebo QS-21 (další výhodná adjuvancia popisuje m.j. Singh a spol., Nat. Biotechnol.

(1999), strany 1075 až 1081), imunostimulující buňky, obzvláště dendritické buňky, nebo jiné buňky prezentující antigeny, aktivní agencie, s výhodou cytokiny, obzvláště stimulující faktor granulocyty makrofágy a/nebo přídavek pomocných látek pro formulaci, obzvláště pufrovací látky, stabilizátory nebo látky pro zlepšení rozpouštění, nebo směsi těchto látek.

V patentových spisech US 5 965 130, rovněž v US 5 562 902 a EP 0 750 514 - A jsou sice uvedena menší množství (při subkutánním podání 4 mg až 20 mg na kilogram tělesné hmotnosti, tato množství ovšem stále ještě nejsou v rozmezí, které se obvykle používá pro aktivní imunizaci. Typické množství pro aktivní imunizaci činí asi 100

1(5 ^v ·· · nanogramů na kilogram tělesné hmotnosti až 100 mikrogramů na kilogram tělesné hmotnosti pro imunizaci.

Ve výše uvedených US-patentových spisech je uveden jeden příklad, ve kterém prokazuje efekt množství 200 mikrogramů imunoglobulinu podaného subkutánně. Tento příklad je potud zavádějící, jestliže zde přípravek imunoglobulinu nepochází ze stejného druhu, na který se očkuje (humánní imunoglobulin byl očkován na myš) a použité množství na myš bylo tak asi 1 miligram na kilogram tělesné hmotnosti.

S výhodou se předpokládá množství přípravku polyklonálního imunoglobulinu ve formulaci očkovací látky k imunizaci méně jak 200 mikrogramů na kilogram tělesné hmotnosti, s výhodou méně jak 20 mikrogramů na kilogram tělesné hmotnosti, obzvláště méně jak 5 mikrogramů na kilogram tělesné hmotnosti. Může ale také stačit množství imunoglobulinu 200 nanogramů až 1 mikrogram na kilogram tělesné hmotnosti k imunizaci. Obvykle se dávka projeden druh sjednocuje a je založena na střední tělesné hmotnosti daného druhu.

Izolací imunglobulinů z lidských nebo zvířecích tělesných kapalin, které obsahují imunoglobulin (příkladně lidské sérum nebo plazma) se může provádět dostatečně známými metodami. Přitom se mohou použít srážecí metody, chromatografické metody (příkladně iontoměničová, hydrofobní interakční chromatografie nebo afinitní chromatografie se specifickými imunoglobulinovými ligandy jako je anti-lgG nebo anti-IgM nebo protein G a podobně) nebo jiné metody nebo kombinace různých metod. Konečně je pro izolaci imunoglobulinů podle vynálezu z jednoho individua nutné, aby byl požadovaný imunoglobulin v podstatě oddělen od jiných nežádoucích látek z těla. Výhodná je čistota 90 %, obzvláště výhodná je čistota 98 %, vždy vztaženo na celkový obsah proteinu.

φ φ φ φ • φ φ φ φ φ φ φ φφφ φ φ φφ φ· φ φ

φ > -φ φφφφ • 1 r · · > φ φ * -* * · φ

Důležité pro předložený vynález je přitom také, aby pň výrobním procesu pro polyklonální imunoglobulin byla v zásadě zachována rozmanitost imunoglobulinu. Obzvláště by s výhodou neměl být ve výrobním procesu pro určitá imunoglobulinová specifika zahrnut krok zahuštování nebo obohacování (jak je zmíněno v J. Immunol. (1985)

135 :1091 až 1096).

Imunoglobulinový přípravek se ve smyslu předloženého vynálezu skládá převážně z IgG, IgM a IgA, je ale také možné použít pouze určité třídy imunoglobulinu (příkladně pouze IgM nebo IgA nebo jen IgG) nebo určité kombinace tříd imunoglobulinu.

Pojmy „imunoglobulin“ nebo „protilátka“ ve smyslu předloženého vynálezu zahrnují proto také fragmenty nebo deriváty získaných protilátek. Jako příklady, na něž se však nelze omezit, lze zmínit: F(ab)2'- fragmenty, F(ab)'- fragmenty, které se mohou vyrábět známými biochemickými metodami (příkladně enzymatickým štěpením). Pojem „derivát“ přitom zahrnuje příkladně deriváty protilátek, které se mohou vyrábět známými biochemickými metodami. Obzvláště tento pojem zahrnuje také produkty, které se mohou vyrábět chemickou vazbou protilátek nebo fragmentů protilátek s molekulami, které mohou posilovat imunní odpověď (jako příkladně tetanus-toxoid, pseudomonáz-exotoxin, deriváty lipidu A, GM-CSF, IL-2, IL-12, C3d).

Jako zdroje polyklonálního imunoglobulinu se mohou používat pooly kapalin, které obsahují imunoglobuliny z různých individuí, mohou se ale použít také kapaliny obsahující imunoglobuliny z jednotlivých individuí.

Podle toho se týká výhodná forma provedení předloženého vynálezu použití přípravku polyklonálního imunoglobulinu v přírodní formě, to znamená imunoglobuliny, které se vyrobí bez použití • · · · ·« · ·· • ♦ ♦ · · · ·· · • · · · · ♦ · • ♦·· * · · · CA • · · * · 12 ♦ ··· ·· ·· ··♦ ·*-**99 zahuštování nebo obohacování pro určitá imunoglobulinová specifika a svým složením tak odpovídají přírodnímu repertoáru imunoglobulinů, které jsou k dispozici případně cirkulují v daném organizmu v určitých tělesných tekutinách (krev, lymfa, kolostrum atd.)

Proto se předložený vynález podle dalšího aspektu týká použití imunoglobulinů podle vynálezu k výrobě očkovací formulace, obsahující protilátky rozdílných specifik, k ošetřování rakoviny, k ošetřování onemocnění autoimunity, k zamezení (předcházení) nebo ošetřování alergií a k ošetřování náchylnosti k virovým, bakteriálním infekcím nebo infekcím z hub, vždy imunizací.

Předmětem předloženého způsobu je také způsob profylaxe nebo ošetřování individuí, u kterých je formulace vyrobená podle vynálezu obohacena na účinné množství, s výhodou několik mikrogramů až sto mikrogramů na kilogram tělesné hmotnosti u individua, ze kterého byla tělesná kapalina odebrána. Tento způsob ošetřování je použitelný především u onemocnění autoimunity, jako je příkladně systemický Lupus erathematosus, Autoimmun Thyroiditis, systemický Vaskulitis, syndrom Guillain Barre a anti-faktor VIII:C - onemocnění autoimunity, při alergiích nebo při rakovině.

Ošetřování zdravých individuí podle vynálezu se může provádět k prevenci infekcí (jako jsou příkladně různá onemocnění pokožky).

Ošetřování obecně se může provádět jak s terapeutickým účelem tak i s účelem profylaxe.

Podle dalšího aspektu se předložený vynález týká také očkovací látky obsahující humánní, polyspecifické protilátky k podávání lidem, které se získají formulací polyklonálních, polyspecifických přípravků • · • · · • ···

9 » 9 9 ·

.13.

imunoglobulinů do formulace očkovací látky. S výhodou se tato očkovací látka podle vynálezu získá formulací poolu imunoglobulinů. S výhodou obsahuje tato očkovací látka také další jedno nebo několik adjuvans. Podle jedné obzvláště výhodné formy provedení obsahuje očkovací látka podle vynálezu imunoglobuliny v množství v rozmezí 5 pg až 10 mg.

Vynález bude blíže vysvětlen s pomocí následujících příkladů, na něž by však neměl býti omezen.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Výroba přípravku imunoglobulinů k aktivní imunizaci

0,83 ml suspenze Alu-Gelu (Alu-Gel S firmy Serva, 2 %-ní susupenze; stupeň kvality: adjuvans k přípravě vakcín) se za sterilních podmínek smísí s 5 ml roztoku imunoglobulinů opice Rhesus (Sigma, USA, I4385, zředěného na 2,5 mg/ml v 1 mM fosfátovém pufru, pH 6,0, 0,86 % NaCI) a jemně se třepe jednu hodinu při teplotě místnosti. Suspenze se sterilně plní po 0,5 ml alikvotech do napichovacích lahviček.

Příklad 2

Zvýšení vazební aktivity anti-tumorových buněk imunního sera

Opice Rhesus se čtyřikrát imunizují vždy 0,5 ml očkovací látky vyrobené podle příkladu 1 (dny 0,15,29 a 60). Opičí sera (pre- a imunní sera) se testují v buněčném ELISA na vazební schopnost na humánní tumorové buňky.

14.

«· 99 99 • 9 9 9 9 9

9 9 9 9

999 · 9 9

9 9 9

9999 99 99

Zkoumá se, zda se v opičím imunním seru nechají prokázat imunoglobuliny, které se váží na humánní rakovinné buňky. K tomu se použije buněčná linie rakoviny žaludku KATO-III. Toto šetření se s pomocí buněčného testu ELISA provádí následovně:

Pohárky mikrotitrační destičky se inkubují přes noc při teplotě 4 °C vždy 100 μΙ buněčné suspenze testované buněčné linie o koncentraci 2 x 10⁶ buněk/ml media v mediu A .Po odsátí zbytku se destička inkubuje vždy 50 μΙ fixačního roztoku na pohárek po dobu 5 minut při teplotě místnosti. Po odsátí zbytku se pipetuje vždy 200 μΙ blokačního pufru B a destičky se inkubují po dobu 1 hodiny při teplotě 37 °C. Po dvojím promytí vždy 200 μΙ promývacího pufru B se inkubuje 100 μΙ aiikvotu testovaných opičích ser pň zředění 1:10 až 1 :100 000 zřeďovacím pufrem B po dobu 1 hodiny při teplotě 37 °C.

Po dvojím promytí destičky vždy 100 μΙ ledového promývacího pufru B se přidá vždy 100 μΙ antihumánní -Ig-protilátky konjugované peroxidázou (Zymed) ve zředění 1:1000 ve zřeďovacím pufru A a inkubuje se po dobu 45 minut při teplotě 37 °C. Destička se promyje třikrát vždy 100 μΙ ledového promývacího pufru B. Vazba protilátky se prokáže přídavkem vždy 100 μΙ specifického substrátu a barevná reakce se přeruší po asi 5 minutách přídavkem vždy 50 μΙ přerušovacího roztoku. Vyhodnocení se provádí měřením optické hustoty (OD) při 490 nm (vlnová délka referenčního měření je 620 nm).

Výsledky (zředění 1 :100, uvedeny v Tabulce 1)

Ukazuje se výrazný přírůstek vazební schopnosti v průběhu imunizace.

Tabulka 1

Promývací pufr A:

Promývací pufr B

Blokační pufr A

Blokační pufr B

Zřeďovací pufr A

Zřeďovací pufr B

Vzorek	MOD
Preserum	250
15. den	323
29. den	845
60. den	1224

% chlorid sodný

0,2% Triton X-100 deficitní v PBS

0,05 % Tween 20 deficitní v PBS % fetální telecí sérum (inaktivované teplem) % albumin hovězího sera 0,1 % NaN₃ deficitní v PBS % fetální telecí sérum (inaktivované teplem) deficitní v PBS deficitní v PBS

Barevný pufr

24.3 mM kyseliny citrónové

51.4 mM Na₂HPO₄ pH-hodnota: 5,0 ♦ 999 9

9

9999 99

9 9

9 9 9999

Substrát

Přerušovací roztok mg o-fenylendiamin-dihydrochlorid 100 ml barevného pufru 20 μΙ H₂O₂ (30 %)v

N H₂SO₄

Claims (13)

1. Patentové nároky

   1. Použití přípravku polyklonálního imunoglobulinu k výrobě formulace očkovací látky, obsahující protilátky o rozdílných specifikách k imunizaci individuí stejného typu, z něhož pocházejí imunoglobuliny.
2. 2. Použití podle nároku 1, vyznačující se tím, že přípravek polyklonálního imunoglobulinu je autologový přípravek imunoglobulinu k imunizaci stejného individua, ze kterého formulace pochází.
3. 3. Použití podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se k přípravku polyklonálního imunoglobulinu přimísí jedno nebo několik imunologických adjuvans.
4. 4. Použití podle některého z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že se k předpokládá množství přípravku polyklonálního imunoglobulinu ve formulaci v množství méně jak 200 mikrogramů na kilogram tělesné hmotnosti k imunizaci, s výhodou méně jak 20 mikrogramů na kilogram tělesné hmotnosti k imunizaci, obzvláště méně jak 5 mikrogramů na kilogram tělesné hmotnosti k imunizaci.
5. 5. Použití podle některého z nároků 1 až 4, vyznačující se t í m, že se přípravek polyklonálního imunoglobulinu předpokládá ve formulaci v přírodní formě.
6. 6. Použití podle některého z nároků 1 až 5 k výrobě formulace očkovací látky, obsahující protilátky rozdílných specifik, k zamezení nebo ošetřování rakoviny imunizací.

   ·· · ·· • · · · · · • « · · · « ·♦· · · · • · * · ···· ·« ··

   I · is.
7. 7. Použití podle některého z nároků 1 až 5 k výrobě formulace očkovací látky, obsahující protilátky rozdílných specifik, k zamezení nebo ošetřování onemocnění imunity pomocí imunizace.
8. 8. Použití podle některého z nároků 1 až 5 k výrobě formulace očkovací látky, obsahující protilátky rozdílných specifik, k zamezení nebo ošetřování alergií pomocí imunizace.
9. 9. Použití podle některého z nároků 1 až 5 k výrobě formulace očkovací látky, obsahující protilátky rozdílných specifik, k zamezení nebo ošetřování náchylnosti k infekcím proti virovým a bakteriálním infekcím nebo infekcím z hub pomocí imunizace.
10. 10. Očkovací látka, obsahující humánní, polyspecifické protilátky k podávání lidem, která se získá formulací přípravku polyklonálního, polyspecifického humánního imunoglobulinu na formulaci očkovací látky.
11. 11. Očkovací látka podle nároku 10, která se získá formulací imunoglobulinového poolu.
12. 12. Očkovací látka podle nároku 10 nebo 11, vyznačující se tím, že obsahuje jeden nebo několik adjuvans.
13. 13. Očkovací látka podle některého z nároků 10 až 12, vyznačující se tím, že imunoglobulin je obsažen v množství v rozsahu 5 pg až 10 mg.