CZ200372A3

CZ200372A3 - Použití kmenů Parapoxvirus ovis pro výrobu léku k léčení orgánových fibróz

Info

Publication number: CZ200372A3
Application number: CZ200372A
Authority: CZ
Inventors: Claudia Hirth-Dietrich; Tobias Schlapp; Angela Siegling; Andreas Knorr; Olaf Weber; Gudrun Theiss
Original assignee: Bayer Aktiengesellschaft
Priority date: 2000-07-11
Filing date: 2001-07-11
Publication date: 2003-05-14
Also published as: SE0300033L; JP2004502741A; US6632647B2; HRP20030097A2; CN1452496B; LT2003008A; DK200300014A; HUP0303830A3; HK1054330B; HK1054330A1; NO20030081L; EP1303302A2; IL153826A0; NO20030081D0; AU8582701A; SE0300033D0; SI21171A; RU2003104522A; CN1452496A; MXPA03000278A

Description

Oblast techniky !...í.

• • · · e o · • ♦ • · · ·

Předkládaný vynález se týká použití kmenů ;* . 2 • · · · deaktivovaných parapoxvirů při profylaxi a léčbě nemocí u lidí, a sice nemocí, které jsou doprovázeny zvýšeným ukládáním kolagenu, v souvislosti s kterým jak vnitřní orgány, jako například játra, tak i kůže a s ní spojené struktury mohou být ovlivněny. Vynález se týká konkrétně léčení nemocí jako je jaterní fibróza a jaterní cirhóza následkem virové hepatitidy nebo ethanolem indukované jaterní nemoci, a také cystická fibróza.

Předkládaný vynález se týká konkrétně použití izolátů Parapoxvirus ovis, jako je např. kmen D1701, orf-11, Řecký orf kmen 176, Řecký orf kmen 155, Novozélandské (NZ) izoláty, např. NZ2, NZ7 a NZ10, a také přípravek Baypamun®, který je odvozen z kmenu D1701.

Kromě těchto výchozích kmenů se vynález také týká potomstva, které je získáno pasážováním a/nebo adaptací na konkrétní buňky, například WI 38. Kromě kompletních virů se »

vynález také týká částí nebo fragmentů těchto virů. Částí viru se podle vynálezu rozumí genomové nebo subgenomové fragmenty, které jsou exprimovány použitím vhodného vektoru, například viru vakcínie, ve vhodném systému, jako je například fibroblastová buněčná kultura. Fragmenty se podle vynálezu rozumí jakékoliv frakce, které jsou získány biochemickou purifikací, jako například chromatografií, nebo částice, které jsou získány s použitím fyzikálních metodách, jako například rozrušení prostřednictvím ultrazvuku (sonikace).

• * 0 · 0 0 *0 · 0 0 0 0 0 0 0 0 • · 0 0 0 0 0 0 ♦ Φ 0·· ·00· 0 • 0 0 0 · 000 •♦*0 0 00 000 00 0000

Dosavadní stav techniky · *·.*

0 0 0 λ 0

0 • 0 « a

Je známo, že Parapoxvírus může stimulovat nespecifickou imunitní reakci u obratlovců. Přípravek Baypamun®, který je založen na chemicky deaktivovaném kmenu D1701 Parapoxvírus

I · ovis, je používán pro profylaxi, metafylaxi a terapie • 0 ·'. 0 infekčních chorob a pro předcházení stresem indukovaných *.«·.!

nemocí v zvířat.

Zatímco patent DE 3 504 940 (Mayr, Anton) popsal příznivý účinek přípravku Baypamun® v podmínkách jako je například nedostatečnost imunity vyvolaná po silném ozáření, chemoterapií, AIDS, imunosupresí, poškozením souvisejícím se stárnutím a detoxikačním působením, nijak nepopsal okamžitou redukci jaterní fibrózy. DE 3 504 940 také ukázal, že

Baypamun® podporuje účinnost nádorové terapie jako doplňkový přípravek a také chrání novorozené děti před nemocemi zapříčiněnými nedostatečnou mateřskou imunitní obranou.

Podstata vynálezu

Vezme-li se současný stav znalostí jako výchozí bod, pak bylo velmi překvapivě zjištěno, že podávání deaktivovaných parapoxvirů může redukovat nebo dokonce předcházet jaterní fibróze. Na zvířecích modelech byl tento účinek zjištěn případě jaterní fibrózy vyvolané tetrachlormethanem, který způsobuje toxické poškození jater, a také v případě jaterní fibrózy, která byla vyvolána heterologním sérem a při které nedochází k žádnému zánětu jater. Rozsah terapeutického účinku byl také překvapivý: nadměrná spojená s jaterní fibrózou, je tvorba kolagenu, která je inhibován z 60 % u modelu s tetrachlormethanem, a je téměř úplně inhibována v sérovém • ·

A · • · · · • A • · A modelu. Ve shodě s těmito výsledky dlouhodobých pokusů bylo í *··’ * ♦ A A · pak možné demonstrovat akutním podáváním tetrachlormethanu, že

Baypamun® a přípravek získaný z výše uvedených kmenů .····.

♦ ·

Parapoxvirus ovis inhiboval transformaci jaterních hvězdicovitých buněk (HSC) na buňky myofibroblastového typu · produkující kolagen.

Á · A A

A A

I když jaterní fibróza a/nebo jaterní cirhóza může být · . I ·» A A indukována různými noxami (škodlivinami), jako je například virová infekce a abúzus alkoholu, různý patologické mechanismy vedou nakonec ke shodnému koncovému metabolickému kroku, a sice tvorbě kolagenu. Jak ukázaly výsledky pokusů na neinfekčních zvířecích modelech, podávání deaktivovaného parapoxviru překvapivě zabraňuje ukládání kolagenu nezávisle na škodlivině, která ho indukovala.

Parapoxviry proto otevírají principiálně nové terapeutické možnosti využít jejich účinek na koncovou část metabolické dráhy, která je společná všem nemocím vedoucím k fibróze.

Tyto účinky vedou k předpokladu, že když se použijí přípravky parapoxviru, lze dosáhnout velmi účinné terapie dokonce i v případě viry indukované jaterní fibrózy, protože je známo, že takové přípravky mají další imunostimulační účinky.

Silný antifibrotický účinek přípravku Baypamun® nyní poskytuje možnost využít Baypamun® nebo přípravky založené na NZ2 jako referenční standardy pro hodnocení antifibrotických účinků v testech pro identifikaci antifibrotických látek.

Deaktivované parapoxviry nebo jejich potomstvo, a přípravky získané z výše popsaných kmenů, mají tedy všeobsáhlé spektrum antifibrotické aktivity a jsou proto vhodné nejen pro profylaxi a terapii fibrotických onemocnění » · · · · • · jater, ale také pro fibrotické choroby jiných orgánů, například plic, slinivky, srdce a kůže. Zvláště výhodné je užití izolátů parapoxvirů k profylaxi a léčbě jaterní fibrózy a jaterní cirhózy.

V závislosti na klinickém problému, terapeutické agens založené na parapoxvirů, je podáváno systémově, například intramuskulárně, subkutánně, intraperitoneálně, intravenózně, nebo je podáváno lokálně, přítomen v purifikované a resuspendován ve vhodném rozpouštědle bezprostředně před podáváním, nebo je v jiné vhodné formulaci, nebo je formulován do lékové formy pro perorální podávání odolné k žaludečním šťávám nebo v jiné vhodné lékové formě pro perorální podávání.

V této souvislosti může být potřebné několikeré podání, nebo dlouhodobé léčení podle chronologického schématu, které odpovídá požadavkům klinického problému.

• « • · · • * ♦ • M · ♦ ·· · • 9 «

999 9 • '9 ·« perorálně nebo inhalací, Parapoxvirus je v přípravku lyofilizované formě, a je

Předkládaný vynález se týká použití izolátů parapoxvirů, které byly připraveny z kmenů D1701, orf-11, Řecký orf kmen 176, Řecký orf kmen 155, a Novozélandské (NZ) kmeny, pro výrobu léku, který má preventivní nebo léčivý účinek na orgánové fibrózy u lidí.

Výhodné je použití Novozélandských (NZ) kmenů, tj. kmenů NZ2, NZ7 a NZ10, pro výrobu léku, který má preventivní nebo léčivý účinek na orgánové fibrózy u lidí, přičemž zvláště výhodný je kmen NZ2. Kromě toho výše popisované parapoxviry mohou být modifikovány pasážováním (přenosy) nebo adaptací na vhodné buňky, a parapoxviry získané pasážováním nebo adaptací mohou být pak použity pro výrobu léku, který má preventivní nebo léčivý účinek na orgánové fibrózy u lidí, přičemž pro • · ·

• · 4 • 4 1 • 4 4 například MDOK. výše uvedených • H· • 4 • 4 4«4« pasážování nebo adaptaci je možné výhodně používat humánní buňky, jako například WI-38, MRC-5, hovězí (bovinní) buňky, jako například BK-K13A47/REG nebo MDBK, a ovčí buňky, jako

Je také možné použití částí nebo fragmentů parapoxvirů pro výrobu léku, který má preventivní nebo léčivý účinek na orgánové fibrózy u lidí. Částí viru se přitom podle vynálezu rozumí genomové nebo subgenomové fragmenty, které jsou exprimovány použitím vhodného vektoru, například viru vakcinie, ve vhodném systému, jako je například fibroblastová buněčná kultura. Fragmenty se podle vynálezu rozumí jakékoliv frakce, které jsou získány biochemickou purifikaci, jako například chromatografií, nebo částice, které jsou získány s použitím fyzikálních metodách, jako například rozrušení prostřednictvím ultrazvuku. Vynález se kromě toho týká použití výše popisovaných kmenů Parapoxvírus ovis nebo jejich modifikací, které jsou z nich získány jak bylo popsáno výše, v kombinaci s jinými činidly pro výrobu léků a léčivých přípravků, které mají preventivní nebo léčivý účinek na orgánové fibrózy u lidí. A dále také použití přípravku Baypamun®, samotného nebo v kombinaci s jinými činidly, pro výrobu léků a léčivých přípravků, které mají preventivní nebo léčivý účinek na orgánové fibrózy u lidí. Výhodně se vynález týká použití výše popsaných kmenů Parapoxvírus ovis nebo jejich modifikací, které jsou z nich získány způsobem, který byl popsán výše, v kombinaci s jiným činidly pro výrobu lékových forem pro ústní podávání, například tobolek odolných působení žaludečních šťáv.

Vynález se kromě toho také týká použití přípravku Baypamun® nebo preparátů NZ2 jakožto referenčních standardů pro hodnocení antifibrotických účinků v testech pro identifikaci látek s antifibrotickým účinkem.

4444 4 4

4

4 4 4

4

4 4

4 4 4

4 • · 4 4 β

4

4 4 •4 4

Kmen ΝΖ-2 Parapoxvirus ovis uvedený zde jako příklad byl uložen 10. Července 2001 v Evropské sbírce buněčných kultur (European Collection Ceel Cultures, Centre for Applied

Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire,

SP4 OJG, Británie) pod číslem ECACC-01071006.

• 4 4 4

4 4 4

4 4

4 4 4

4*4 • 44 4444 *4 4 4

4

9

9444 : t

4 4 4 ti

9444

Příklady provedení vynálezu

4 4

44

Příklad 1

Účinek přípravku Baypamun®, tj. Parapoxvirus ovis kmen D 1701

Metody

Baypamun®, suchá látka, preparát získaný izolací chemicky deaktivovaného kmenu D 1701 Parapoxvirus ovis, byl rozpuštěn ve vodě pro injekce podle pokynů (titr na základě TCID50 (50% infekční dávka v tkáňové kultuře) přibližně 10⁷/ml) .

Roztok Polygelinu, mající stejný obsah proteinu jako roztok přípravku Baypamun® byl podáván zvířatům kontrolní skupiny jako placebo roztok.

0,5 ml roztoku na jedno zvíře a na jednu dávku bylo podáno i.p.. Podávání se provádělo třikrát za týden, ale nikdy 2 dny po sobě.

Baypamun® byl testován na dvou zvířecích modelech, u kterých se lišil původ fibrózy, tj . na modelu s tetrachlormetanem a na modelu s prasečím sérem.

Chronické podávání tetrachlormethanu je standardní způsob pro experimentální vyvolání jaterní fibrózy s následnou

9

9»9

9 ♦ · · · · ·

9 9 9 9 4

4 9 0 • 9 4 9 9

0 9 9

99904 04 « jaterní cirhózou (McLean EK, McLean AEM, Sutton PM. Instant * ’»·*

9 9 cirrhosis. Br. J Exp. Pathol. 1969, 50: 502-506). Je obecně *«í !» uznáváno jako vhodný model pro humánní jaterní fibrózu a ,·*·♦, • 4 jaterní cirhózu. V tomto pokusu byly užity samice

9 laboratorního potkana kmene Sprague-Dawley. Pro zajištění * maximální indukce mikrosomální metabolizmu tetrachlormethanu,

9

9 0 9 byl zvířatům podáván isoniazid v pitné vodě v koncentraci * ;

• · · g/1 týdnem před začátkem podávání. Tetrachlormethan byl podáván perorálně každý pátý den v dávce 0,1 ml/100 g tělesné hmotnosti (tetrachlormethan : minerální olej - 1:1). Po sedmi týdnech podávání byla zvířata utracena a vyšetřena. Léčba s přípravkem Baypamun® byl uskutečněn souběžně s podáváním tetrachlormethanu.

Podávání heterologního séra, například prasečího séra, v případě laboratorní potkana je podobné způsobu, který se podle odborné literatury často používá pro vyvolání jaterní fibrózy s následnou cirhózou, přičemž tímto způsobem se, na rozdíl od jiných modelů, způsobí jen minimální poškození a zánět buněk jaterního parenchymu (Bhunchet, E. and Wake, K. (1992): Role of mesenchymal cell populations in porcine seruminduced rat liver fibrosis. Hepatology 16: 1452-1473). Samicím laboratorního potkana Sprague Dawley bylo podáváno 2 x týdně sterilní prasečí sérum (Sigma) v dávce 0,5 ml/zvíře, přičemž kontrolní zvířata dostával sterilní fyziologický roztok (2 x týdně, 0,5 ml/zvíře, i.p.). Léčení přípravkem Baypamun® bylo uskutečněno souběžně s podáváním prasečího séra, ale nikdy ne ve stejný den. Po sedmi týdnech léčby byla zvířata utracena a játra byla vyjmuta pro stanovení obsahu kolagenu.

Pro histologické vyšetření jaterní tkáně byly vyříznuty standardizované příčné válce (přibližně 10 x 2 mm) z tkáně pravého předního jaterního laloku. Zmražené sekce byly obarveny 0,1% roztokem červeni Picrosirius pro detekci ♦ · · · · · ·

a · • · · · · · ♦ · • a • ·

9 99 9 jizvového kolagenu tvořícího se při jaterní fibróze. · *»·* »· · · » ·

Pro zesílení kontrastního barvení bylo užito obarvení **

Fast Green. Rozsah jaterní fibrózy byl určován v každém řezu • 9 9 9 jako procentní frakce celkové měřené oblasti reprezentované . .

oblastí obarvenou červení Picrosirius. Parametry .

• t·· videomikroskopické detekce barvení byly standardizovány a *....· udržovány konstantní v průběhu celého pokusu. 64 čtverců ve ; . ; standardizované 31 mm² mřížce bylo měřeno při koncovém zvětšení 50x.

Pro kvantifikaci rozsahu transformace jaternich hvězdicovitých buněk (HSC buněk, označovaných také Ito buňky nebo buňky akumulující vitamín A) následkem akutního podávání tetrachlormethanu laboratorním potkanů, byly imunohistochemicky detekovány buňky hladkého svalstva pozitivní na α-aktin. Oblast hladkého svalstva pozitivní na α-aktin byla zjištěna, při konečném zvětšení 200x, v každém řezu v každém případě v 16 centrilobulárním poli 248x180 pm. Transformace HSC na buňky podobné myofibroblastům produkující kolagen a produkující růstový faktor je velmi důležitým krokem v indukci jaterní fibrózy. Transformované HSC jsou proto časným indikátorem fibrogenní aktivity v játrech.

Pro poloautomatickou morfometrii byl užit přístroj Leica Quantimed SOOMC (Leica, Německo).

Pro stanovení OH-prolinu bylo pro každý případ 50 až 100 mg jaterní tkáně usušeno a vařeno po dobu přibližně 17 hodin s 6N HCI. Poté co byla kyselina odpařena ve vakuové sušící peci, byl zbytek rozpuštěn v 5 ml destilované vody a tento roztok byl filtrován. 200 μΐ filtrovaného roztoku bylo inkubováno při teplotě místnosti po dobu 25 minut s 200 μΐ ethanolu a 200 μΐ oxidačního roztok (7% vodný roztok hydrátu chloraminu T, naředěn 1:4 s acetát-citrátovým pufrem pH 6,0).

« · * « • lil

Pak bylo přidáno 400 μΐ Ehrlichova činidla (12 g 4-dimethylaminobenzaldehydu ve 20 ml ethanolu + 2,74 ml koncentrované kyseliny sírové ve 20 ml ethanolu) . Po inkubaci ve 35°C po dobu 3 hodin byla měřena absorpce v 573 nm. Vodný roztok OH-prolinu (Sigma) byl použit pro standardní řadu. Obsah OH-prolinu ve vzorkách jater byly vypočten v mg na g suché hmotnost jater.

Pro sledování tvorby volných reaktivních kyslíkových radikálů byla měřena koncentrace redukovaného a-tokoferolu (α-TOC), což je agens zachycující volné radikály, v játrech, zatímco v séru byla sledována aktivita enzymu

7-ethoxyresorufindeethylázy (EROD), což je enzym citlivý na volné radikály. Oba parametry se charakteristicky snižují ve spojení s otravou tetrachlormethanem a umožňují stanovit závažnost oxidačního poškození tkání.

Stav jater zvířat byl určen měřením některého ze standardních parametrů séra jako je:

alaninaminotransferáza (ALT), alkalická fosfatáza (AP), aspartátaminotransferáza (AST), γ-glutamyltransferáza (GGT), glutamátdehydrogenáza (GLDH), a celkový bilirubin (TBIL).

Výsledky

Léčení podáváním přípravku Baypamun® významně snížilo rozsah fibrotické degenerace jater laboratorních potkanů ošetřených tetrachlormethanem (viz Obr. 1). Kromě toho mohla být pozorována téměř kompletní inhibice HSC transformace (viz Obr. 2). Počet proliferujicích neparenchymatických buněk v játrech zvířat ošetřených přípravkem Baypamun® byl značně redukován (viz Obr. 3). Neparenchymální buňky zahrnují HSC a Kupfférový buňky, které se podobně účastní fibrogeneze.

Sérové indikátory hepatocelulárního poškození, jako například ALTA, AP, AST, GGT, GLDH a TBIL, (viz tabulka 1), ukázaly tendenci normalizaci.

Stejný pokles koncentrace EROD a α-tokoferolu v kontrolní skupině a skupině ošetřené přípravkem Baypamun® poskytl důkaz přítomnosti toxických volných kyslíkových radikálů v důsledku otravy tetrachlormethanem u obou skupin (viz tabulky 1 a 2). Možnost antifibrotického účinku přípravku Baypamun® v důsledku detoxifikačního účinku může proto být vyloučena.

V sérovém modelu projevuje Baypamun® téměř kompletní potlačení fibrózy (Obr. 4). U laboratorních potkanů ošetřených přípravkem Baypamun® jak obsah hydroxyprolinu tak i oblast barvitelná červení sirius v játrech jsou prakticky na úrovni pozorované u zdravých kontrolních zvířat, zatímco oba tyto parametry jsou zvýšeny několikrát u kontrolních potkanů, kterým bylo podáváno sérum. Ve skupině léčené přípravkem Baypamun zvýšení obsahu kolagenu, které je indukováno podáváním prasečího séra, představovalo pouze 10 % odpovídající hodnoty v kontrolní skupině.

Příklad 2

Parapoxvirus ovis kmen NZ 2

Metody

Virus NZ2 byl replikován v tankových zásobníkách. Pro tento účel byly buňky BK klonu 3A byly pěstovány po dobu 3 až 5 dnů na miskách pro tkáňové kultury (37 °C) v EMEM 2 g + 10% FCS až do okamžiku, než buněčný „trávník dosáhl 90 až 100%

A A

AAAA • A AAAA A « « A • · A A · · « a • » · * · ♦ · · A • · ··* AA* »··* A AA AAA «· AAAA konfluence. Čtyři misky tkáňové kultury byly použity jako inokulum pro každý kultivační tankový zásobník, který byl naplněn médiem (EMEM 2 g + 10% FCS) o objemu 2,5 1 (litrů). Po inkubaci ve 37 °C po dobu 3 až 5 dnů (90 až 100% konfluence buněčného trávníku) bylo médium nahrazeno novým EMEM 2 g bez přidání séra a kultury byl infikovány virem NZ2 (MOI 0,001 až 0,01).

Po té, co bylo dosaženo 100% CPE (inkubace ve 37° C přibližně 7 až 8 dnů), byl virus sklizen. Virová suspenze byla rozdělena na alikvotní části do sterilních vaků pro mmédia a zmražena v -80 °C. Suspenze byla následně ponechána rozmrazit ve 37° C v inkubační místnosti a byla zbavena buněk filtrací přes hluboké lože (velikost pórů 5 pm) . Po tomto kroku byla virová suspenze koncentrována 20 až 40krát prostřednictvím ultrafiltrace (hranice 100 kD) . Alternativně virus může být koncentrován ultracentrifugací (Ti45, 30 000 ot./min. (rpm), °C, 60 minut) .

• A »

» • A

Titr viru přítomný v suspenzí, jak byl dosažen koncentrací, byl určován prostřednictvím titrace na 3A buňkách BK klonu. Po té, co byl virový titr upraven na 6,0 s použitím EMEM média bez FCS, virus byl deaktivován zahříváním na 58 °C po dobu 2 hodin. Deaktivace byla kontrolována prostřednictvím kontroly deaktivace prováděné na 3A buňkách BK klonu.

Parapoxvirus ovis kmen NZ2 byl zkoumán na modelu, který již byl využit v příkladu 1, a sice jaterní fibróze laboratorního potkana indukované prasečím sérem:

Samice ošetřeny i.p. (Sigma)/zvíře, fyziologickým laboratorního potkana Sprague Dawley byly x týdně 0,5 ml sterilního prasečí séra kontrolní zvířata byla ošetřena sterilním roztokem (2 x týdenní, 0,5 ml/zvíře i.p.). Kmen • A · *

NZ2 byl podáván i.p. 3 x týdně v dávkách 1,5 χ 10⁵ a 5,0 χ 10⁵TCIDso/zvíře, v daném pořadí (podávaný objem: 0,5 ml/zvíře). Pro nižší dávku byla výchozí látka naředěna médiem pro tkáňové kultury (Eagleho minimální základní médium, Sigma). Kontrolní zvířata byla ošetřena médiem pro tkáňové kultury. Zatímco léčba s kmenem NZ2 probíhala paralelně s podáváním séra, nepodávaly se nikdy současně tentýž den. Po 7 týdnech léčení byla zvířata utracena a játra byla vyjmuta, a jaterní fibróza pak byla kvantifikován jak morfometricky tak i stanovením obsahu OH-prolinu. Metody již byly popsány v příkladu 1.

*	• 9 A •
•	•
•	•
•	A
•	•
•
•	A
•	•
•	A
•	A
	•
•	A
•	A
	A ·

Výsledky

Výsledky stanovení kolagenu jsou ukázány na obr. 5. Překvapivě, podávání kmenu NZ 2 bylo schopné potlačit rozvoj jaterní fibrózy: ve srovnání se zdravými zvířaty sérem ošetřená kontrolní zvířata projevují významné zvýšení obsahu OH-prolinu a kolagenu barvitelného červení Sirius. Toto zvýšení je redukováno NZ 2, a sice způsobem závislým na dávce. Rozsah účinku je také překvapivý: dávka 5 χ 10⁵ TCID₅o redukuje zvyšování obsahu kolagenu v játrech na méně než 10% kontrolní hodnoty. Kvalitativní hodnocení histologických preparátů ukázalo, že podíl zvířat majících kolagenová septa je redukován na 93 % (14/15) až 33 % (5/15) ve skupině 1,5 χ 10⁵

TCID50 a dokonce až na 0 % ve skupině 5,0 χ 10⁵ TCID₅₀.

Příklad 3

Antifibrotický účinek PPVO po perorálním podávání

PPVO byl formulován jako suchý lyofilizát v tobolkách odolných žaludční šťávě (Elanco, Indianapolis, USA).

· ·♦·♦ • 4

4

4 4 » 4 4

4 4

4 4 • 4 44 • 4 4 4 • 4 4

Čtyři skupiny, každá z nich po šesti experimentálních zvířatech, byly ošetřeny následujícím způsobem: Jedna kontrolní skupina (skupina 1) dostávala jen tobolky (bez PPVO) odolné žaludeční šťáv, které byly podávány perorálně, přičemž být dodatečně injikován i.p sterilní roztok chloridu sodného 0,5 ml /zvíře). V skupině 2 byla tobolka odolná žaludeční šťávě (bez PPVO) podávána perorálně spolu s 0,5 ml tetrachlormetanu/zvířete, s i.p. injekcí 0,5 ml fyziologického roztoku chloridu sodného. Ve skupině 3 byla zvířatům podávána perorálně tobolka odolná žaludeční šťávě (bez PPVO) spolu s 0,5 ml tetrachlormethanu/zvířete. Kromě toho zvířata skupiny 3 dostala i.p. injekcí PPVO D1701 (dávka: 5 χ 10⁶ TCIDso/zvíře) v 0,5 ml vody pro injekci. Skupina 4 dostala perorálně PPVO D1701 (dávka: 5 χ 10⁶ TCIDso/zvíře, formulovaná v tobolce odolné žaludeční šťávě) spolu s 0,5 ml tetrachlormethanu. Zvířata ve skupině 4 také dostala i.p. injekci 0,5 ml sterilního fyziologického roztoku.

Po 48 hodinách byla vyjmut játra a centrilobulární oblast pozitivní na α-aktin hladkého svalstva (α-SMA) byla určována histochemicky, pro každé zvíře jak procento celkové oblasti měřené na reprezentativních tkáňových řezech (Johnson. SJ, Hines JE, Buřt AD. Phenotypic modulation of perisinusoidal cells following acute liver injury: a quantitative analysis. Int. J Exp. Path. 1992, 73: 765-772). Tato hodnota je míra transformace jaterních retikulárních buněk.

Dvě experimentální série byly provedeny podle výše uvedeného popisu. Experimentální výsledky první experimentální série jsou uvedeny v tabulce 3 a výsledky 2. experimentální série jsou uvedeny v tabulce 4.

V experimentální sérii 1, proporce a-SMA-pozitivní centrilobulární oblasti v jaterní tkáni zvířat, která dostala PPVO D1701 i.p. podáním (skupina 3), byl nevysvětlitelně (a

4 9 9

4449 • 4

4 I v rozporu se zbývající experimentální zkušeností) vyšší než u zvířat, která nedostala žádné PPVO. Z tohoto důvodu byla experimentální série 2 uskutečněna jako opakovaný experiment.

Překvapivě v obou experimentálních sériích byla souhlasně pozorována přibližně 50% inhibice transformace při srovnání s kontrolní skupinou (pro každý případ skupina 2), následující po perorálním podání PPVO D1701 (v každém případě skupina 4). Ve 2. experimentální sérii byla inhibice následující po perorálním podání PPVO D1701 podobného rozsahu, jaká byla pozorována po peritoneálním podávání PPVO D1701 (skupina 3).

Z těchto údajů je možné dedukovat, že PPVO také vykazuje antifibrotický účinek po perorálním podávání.

4«

I

4 transformace (skupina 4)

Tabulka 1

Vliv přípravku Baypamun® na sérové parametry jaterního stavu a indikátory intoxikace
	ALT U/l	AST U/l	AP U/l	GGT U/l	GLDH U/l	TBIL pmol/l	EROD nmol g x minut
Kontrola	49, 1	45,7	162,8	0,8	12,5	1,6	0, 30
SEM	3,7	8,7	14,76	0,2	7,9	0,2	0, 02
Tetrachlormethan	95, 6	92,4	392,7	6,1	37,1	2,9	0,15
SEM	14,7	14,1	43,0	1,3	14,8	0,3	0, 01
Ct+ Baypamun®	72,0	65, 9	329,5	4,5	18,2	1,9	0, 17
SEM	9,9	9,1	26, 9	0,8	4,0	0,2	0, 03

ALT: alaninaminotransferáza • · ♦ * 0 0 • 0 00 » 0 0 » 0

0 • 0 «00 • 0

0·· • · 0 00

AST: aspartátaminotransferáza

AP: alkalická fosfatáza

GGT: y-glutamyltransferáza

GLDH: glutamátdehydrogenáza

TBIL: celkový bilirubin

EROD: 7-ethoxyresorufindeethyláza

Tabulka 2

Vliv přípravku Baypamun® na α-tokoferol v játrech
	α-tokoferol (nmol/ g tkáně)
Kontrola	73,1
SEM	2,2
Tetrachlořmethan	35,7
SEM	2,3
Ct + Baypamun®	38,5
SEM	6,1

Tabulka 3

Vliv PPVO, podávaného intraperitoneálně nebo perorálnš, na transformaci jaterních hvězdicovitých buněk po podání fibrogenní dávky tetrachlormethanu (Experimentální série 1)

Fibróza	Podávání	Dávka	a-SMA (%)
Skupina 1	Prázdná tobolka perorálně + voda pro	—---	0,28

• · 0

0 0 • · ·

Intaktní	injekci i.p.		± 0,04
Skupina 2 Tetrachlormethan	Prázdná tobolka perorálně + voda pro injekci i.p.		2,76 ± 0,79
Skupina 3 Tetrachlormethan	PPVO ve vodě pro injekci i.p. + prázdná tobolka perorálně	5 χ 10⁶ TCID50 na 1 zvířete	5,05 ± 2,00
Skupina 4 Tetrachlormethan	PPVO v tobolce perorálně + voda pro injekci i.p.	5 χ 10⁶ TCID₅₀ na 1 zvířete	1,46 ± 0,34

»·· 0 ► 0 • 0 »0 00

Tabulka 4

Vliv PPVO, podávaného intraperitoneálně nebo perorálně, na transformaci jaterních hvězdicovitých buněk po podání fibrogenní dávky tetrachlormethanu (Experimentální série 2)

Fibróza	Podávání	Dávka	a-SMA (%)
Skupina 1 Intaktní	Prázdná tobolka perorálně + voda pro injekci i.p.		0,20 ± 0,04
Skupina 2 Tetrachlormethan	Prázdná tobolka perorálně + voda pro injekci i.p.		3,18 + 0,56
Skupina 3 Tetrachlormethan	PPVO ve vodě pro injekci i.p. + prázdná tobolka perorálně	5 χ 10⁶ TCID50 na 1 zvířete	1,22 ± 0,35
Skupina 4 Tetrachlormethan	PPVO v tobolce perorálně + voda pro injekci i.p.	5 χ 10⁶ TCID50 na 1 zvířete	1,55 ± 0,34

• 9 ··*·

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

Použití izolátů parapoxviru pro výrobu léků k prevenci nebo léčení orgánových fibróz u lidí.

9999 9 9

9 9 «999
2. Použití izolátů parapoxvirů kmenů D1701, orf-11, Řecký orf J* . ;

9« 99 kmen 17 6, Řecký orf kmen 155 a Novozélandských (NZ) kmenů pro výrobu léků k prevenci nebo léčení orgánových fibróz u lidí.
3. Použití izolátů parapoxvirů podle nároků 1 až 2, kdy Novozélandské kmeny, která jsou použity pro výrobu léků k prevenci nebo léčení orgánových fibróz u lidí, jsou kmeny NZ2, NZ7 a NZ10.
4. Použití parapoxvirů podle nároků 1 až 3, kdy jsou pro výrobu léků k prevenci nebo léčení orgánových fibróz u lidí použity parapoxviry, který byly modifikované pasážováním nebo adaptací na vhodné buňky.
5. Použití parapoxvirů podle nároků 1 až 3, kdy jsou pro výrobu léků k prevenci nebo léčení orgánových fibróz u lidí použity parapoxviry, které byly modifikované pasážováním nebo adaptací na vhodné buňky, přičemž buňky použité pro pasážování nebo adaptaci jsou humánní buňky, například WI-38 nebo MRC-5, bovinní buňky, například BK-K13A47/REG nebo MDBK, a ovčí buňky, například MDOK.

ΦΦ φφφφ • φ · • · φ « φφ φ
6. Použití částí nebo fragmentů virů podle nároků 1 až 5 pro · *··*

ΦΦΦ Φ výrobu léků k prevenci nebo léčení orgánových fibróz *.í

Φ u lidí, kdy části jsou genomové nebo subgenomové fragmenty, .····.

Φ Φ které jsou exprimovány pomocí vhodných vektorů, například **** • Φ virů vakcinie, ve vhodných systémech, například · f ibroblastové buněčné kultuře, a fragmenty jsou frakce,

ΦΦΦΦ které jsou získány prostřednictvím biochemické purifikace, ,· ;

• φ Φ například chromatografií, exprimovaných nebo fyzikálně rozrušených virových částic.
7. Použití jednoho z izolátů podle nároků 1 až 6 v kombinaci s jinými léčivy pro výrobu léků a farmaceutických přípravků k prevenci nebo léčení orgánových fibróz u lidí.
8. Použití Parapoxvirus ovis D 1701, samotného nebo v kombinaci s jinými léčivy, pro výrobu léků a farmaceutických přípravků k prevenci nebo léčení orgánových fibróz u lidí.
9. Použití Parapoxvirus ovis D 1701 nebo preparátů NZ2 jako referenčního standardu pro hodnocení antifibrotických účinků v testech pro identifikaci antifibrotických látek.
10. Použití Parapoxvirus ovis D 1701 podle nároku 8, kdy léky a farmaceutické přípravky jsou vhodné pro perorální podávání.