CZ2004122A3 - Glykopeptidy - Google Patents

Glykopeptidy Download PDF

Info

Publication number
CZ2004122A3
CZ2004122A3 CZ2004122A CZ2004122A CZ2004122A3 CZ 2004122 A3 CZ2004122 A3 CZ 2004122A3 CZ 2004122 A CZ2004122 A CZ 2004122A CZ 2004122 A CZ2004122 A CZ 2004122A CZ 2004122 A3 CZ2004122 A3 CZ 2004122A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
val
pro
gly
asn
arg
Prior art date
Application number
CZ2004122A
Other languages
English (en)
Inventor
Anna Maria Papini
Maio Chelli
Paolo Rovero
Francesco Lolli
Original Assignee
Universita' Degli Studi Di Firenze
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=11442221&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ2004122(A3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Universita' Degli Studi Di Firenze filed Critical Universita' Degli Studi Di Firenze
Publication of CZ2004122A3 publication Critical patent/CZ2004122A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
    • C07K17/08—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4713—Autoimmune diseases, e.g. Insulin-dependent diabetes mellitus, multiple sclerosis, rheumathoid arthritis, systemic lupus erythematosus; Autoantigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Rehabilitation Therapy (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

Glykopeptidy
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká glykopeptidů vytvořených z 11 až 24 aminokyselin schopných identifikovat protilátky roztroušené sklerózy, takže mohou být použitelné jako diagnostické nástroje pro léčení tohoto patologického stavu.
Dosavadní stav techniky
Roztroušená skleróza (multiple sclerosis, MS) je zánětlivé w demyelinizující onemocnění centrálního systému, které je vysoce zneschopňující, a proto má velký sociální dopad. Způsobuje degradaci bílé hmoty centrálního nervového systému (myelinu), což sebou přináší vážné poškození přenosu nervových signálů.
Příčina vyvolávající toto onemocnění nebyla dosud jasně 15 definována, ale předpokládá se, že důležitým patogenním mechanismem onemocnění je autoimunitní proces zaměřený proti hlavním proteinům myelinu. Poškození myelinu je nejpravděpodobněji důsledkem synergického působení odpovědi T buněk a odpovědi protilátek proti myelinovým proteinům a glykoproteinům. Zvláště vlastní protilátky mohou hrát klíčovou úlohu při aktivaci makrofágů, při demyelinizaci a při blokování vodivosti nervů.
V dřívější studii (A.M. Papini a další, Proceedings of the 10th International Congress of Immunology, Monduzzi Editore, International Proceedíng Division Bologna, Italy (1998), str. 1239 - 1244) byla ukázána možnost MS-specifických protilátek prostřednictvím glykosylovaného peptidu tvořeného sekvencí 21 aminokyseliny oligodendrocytického glykoproteinu myelinu (myelin oligodendrocytic glycoprotein, MOG) (polohy 30 až 50), vzorce Asn31(Glc)hMOG(30-50).
• · · · • · • ·
- 2 Je evidentní zájem o vývoj nových glykosylovaných peptidů schopných fungovat při identifikaci těchto protilátek s vyšší účinností, které jsou použitelné jak pro diagnózu, tak i pro léčení roztroušené sklerózy.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález se týká glykopeptidů o délce 11 až 24 aminokyselin, které obsahují tetrapeptid vzorce (I):
X-Asn(G)-Y-Z (I) io kde:
X = aminokyselina nesoucí na postranním řetězci aminovou nebo karboxylovou skupinu;
Y = Pro, Gly;
G je cukr;
Z = Ala, Val, lle, His.
Podrobný popis vynálezu
Nyní bylo překvapivě zjištěno, a tento poznatek je předmětem předkládaného vynálezu, že krátké glykopeptidy tvořené 11 až 24
2o aminokyselinami obsahující výše uvedený tetrapeptid, mají velmi účinnou úlohu při rozpoznávání protilátek typických pro roztroušenou sklerózu, a jsou proto použitelné při její diagnóze nebo léčení.
Podle předkládaného vynálezu jsou výhodno glykopeptidy vzorce (II):
A-B-X-Asn(G)-Y-Z-C-D (II) kde:
Y a G jsou jak definováno výše;
• · • · · • · · · • · · · · · • · ·
A = 2 až 5 aminokyselin nebo není přítomno;
B a C = trifunkční aminokyseliny tvořící mezi sebou laktamový můstek pomocí příslušných postranních řetězců, nebo nejsou přítomny;
D = 5 až 15 aminokyselin;
X = Glu, Asp, Lys, Arg, Orn, Dap;
Z = Ala, Val, lle, His.
Trifunkční aminokyseliny tvořící mezi sebou laktamový můstek jak definováno výše, znamenají např. pár Dap-Asp nebo Asp-Dap, io Dab-Glu nebo Glu-Dab, Orn-Asp nebo Asp-Orn, a pár vytvoření jinými aminokyselinami, například nepřírodními aminokyselinami, které mají analogické vlastnosti.
Cukr s výhodou znamená mono- a disacharidy typu Glc, GIcNAc, P-D-Glcp-(1->4)-d-GIc (celobióza), atd.
Aminokyseliny, pokud není definováno jinak, znamenají přírodní nebo nepřírodní aminokyseliny.
Zbytek A, pokud je přítomen, a zbytek D, mohou zjevně obsahovat vhodnou alkylovou mezerníkovou skupinu (spacer) pro prodloužení řetězce, přičemž alkylová mezerníková skupina ve smyslu vynálezu znamená ω-aminokyseliny s přímými alkylovými řetězci (H2N-(CH2)n-CO2H, kde n je 2 až 6.
Přítomnost tetrapeptidu vzorce (I) jak je definováno výše, může indukovat skládání do peptidové konformace, která může z tohoto důvodu nabývat „hákovité“ („hook like“) formy (kde tetrapeptid je přítomen v koncové části peptidu) nebo „vlásenkové“ („hairpin like“) formy (kde tetrapeptid je přítomen v centrální části peptidu). Tyto konformace umožňují optimální vazbu vlastních protilátek pacienta; tato vlastnost je nezbytná pro neočekávané vlastnosti peptidu podle vynálezu.
···· ·· ···· ·· · • · ·
-4 Podle vynálezu jsou zvláště výhodné peptidy následujících sekvencí:
1. H-Thr-Pro-Arg-Val-Glu-Arg-Asn(Glc)-Gly-His-Ser-Val-Phe-Leu5 -Ala-Pro-Tyr-Gly-T rp-Met-Val-Lys-OH
2. H-Thr-Pro-Arg-Val-cyklický[Dap-Arg-Asn(Glc)-Gly-His-Asp]-Val-Phe-Leu-Ala-Pro-Tyr-Gly-Trp-Met-Val-Lys-OH
3. H-Thr-Pro-Arg-Val-cyklický[Asp-Arg-Asn(Glc)-Gly-His-Orn]-Val-Phe-Leu-Ala-Pro-Tyr-Gly-Trp-Met-Val-Lys-OH io 4. H-Ala-Lys-Thr-Ala-Lys-Asn(Glc)-Gly-His-Val-Glu-Ala-Ser-Gly-OH
5. H-Glu-Asn(Glc)-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-lle-Val-Thr-Pro-Arg-Thr-Pro-OH
6. H-Asp-Asn(Glc)-Pro-Val-Glu-Ala-Phe-Lys-Gly-lle-Ser-OH
7. H-Thr-Pro-Arg-Val-Glu-Arg-Asn(Glc)-Gly-His-Ser-HN-(CH2)6-CO15 -Val-Phe-Leu-Ala-Pro-Tyr-Gly-Trp-Met-Val-Lys-OH
8. H-Asp-Asn(Glc)-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-lle-Val-(pAla)3-OH
Peptidy definované výše mohou také na C-konci obsahovat skupinu -HN-(CH2)n-CO2H (kde n = 2 až 6), umožňující navázání na pryskyřici, jak je potřebné pro jejich praktické využití při diagnostice nebo léčení.
Peptidy podle vynálezu mohou být připraveny známými metodami syntézy v pevné nebo kapalné fázi.
Metoda syntézy na pevné fázi je zvláště užitečná, známá 25 odborníkům v oboru a je založena na tom, že C-koncový zbytek je kovalentně navázán na vhodném pevném nosiči, např. polystyrenu (Wangova pryskyřice), polystyren-polyoxyethylenu (pryskyřice TentaGel nebo PEG-PS) nebo kopolymerech polyethylenglykolu a polyakrylamidu (pryskyřice PEGA), a následující aminokyseliny se • ·· · · ·· ··*· ·· · ·· · ·· · · · · • · · · · ···· • · · · · ··· · «· · • · · · · · · · · · · · · · ♦ ·· · · ·
- 5 postupně přidávají acylací aminokyselinové skupiny zbytku navázaného na pryskyřici, např. symetrickým anhydridem následující aminokyseliny, která je v případě potřeby vhodně chráněná na postranním řetězci. Po ukončení syntézy se získá surový peptid působením vhodné kyseliny na pryskyřici, např. kyseliny fluorovodíkové nebo kyseliny trifluoroctové, a materiál se oddělí vysrážením v ethyletheru a následnou lyofilizací. Peptid se nakonec čistí pomocí chromatografických technik, jako je například preparativní HPLC. Je také možné ponechat syntetický peptid navázaný na pevném nosiči (např. polystyren-polyoxyethylenovou pryskyřici TentaGel nebo PEG-PS), a provést selektivní odstranění ochranných skupin vedlejších řetězců pomocí vhodného činidla.
Alternativně se může podle známých způsobů provádět navázání peptidu na vhodný nosič tak, aby se vytvořily odpovídající konjugáty použitelné při diagnostice nebo léčení. Výhodné nosiče použitelné pro tento účel jsou například pryskyřice nerozpustné ve vodě a úplně kompatibilní s organickými kyselinami, jako je silikagel, celulóza, polyakrylát, sepharóza a analogy, stejně jako některé pryskyřice normálně používané odborníky v oboru pro přípravu syntetických peptidů, jako je např. Wangova pryskyřice, polystyrenpolyoxyethylen (pryskyřice TentaGel nebo PEG-PS) nebo kopolymery polyethylenglykolu a polyakrylamidu (úplně kompatibilní s vodou) jako je pryskyřice PEGA a stabilnější analogické pryskyřice jako je POEPS (polyoxyethylen-polystyren), POEPOP (polyoxyethylen-polyoxypropylen), stejně jako makroporézní pryskyřice popisované pro svůj význam při glykosylaci peptidů na pevné fázi, jako je SPOCC (PEG substituovaný oxethanem) (Rademann, J; Grotli, M., Meldal, M., a Bock, K., J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 5459 - 5466) nebo jeho deriváty, jako je EXPO3000 (kopolymer s tetrakis-[4-(3-methyl-oxethan-3-ylmethyl)-phenyl]-silanem) (Tornoe, C.W., a Meldal M., Peptides 2000, J. Martinez a J.A. Fehrentz (ed.) EDK, Paris, Francie 2001).
Pro účely vynálezu se nyní poskytují následující ilustrativní a neomezující příklady popisující přípravu některých peptidů podle vynálezu.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Syntéza lineárního peptidu
Příprava H-Thr-Pro-Arg-Val-Glu-Arq-Asn(Glc)-Gly-His-Ser-Val-Phe-Leu-Ala-Pro-T yr-Gly-T rp-Met-Val-Lys-QH io Pryskyřice Fmoc-Lys(Boc)-NovaSyn (0,5 g, 0,11 mmol/g) byla ponechána nabobtnat v DMF 1 h při teplotě laboratoře a byla naplněna do skleněné kolony (150 x 15 mm) poloautomatického syntezátoru s kontinuálním průtokem. Po odstranění ochranné aminové skupiny přítomné na pryskyřici 20% roztokem piperidinu v DMF byl na kolonu pro navázání každé aminokyseliny nanesen roztok obsahující Fmocaminokyselinu (2,5 ekv., 0,137 mmol) rozpuštěnou v DMF (1,3 ml), a jako aktivační činidlo HOBt (2,5 ekv., 0,137 mmol), TBTU (2,5 ekv., 0,137 mmol) a NMM (3,75 ekv., 0,205 mmol).
V uvedeném pořadí byly použity následující aminokyseliny:
1) Fmoc-Val-OH
2) Fmoc-Met-OH
3) Fmoc-Trp(Boc)-OH
4) Fmoc-Gly-OH
5) Fmoc-Tyr(tBu)-OH
6) Fmoc-Pro-OH·
7) Fmoc-Ala-OH·
8) Fmoc-Leu-OH ···· 9 9 ··· · 9 · 9
9) Fmoc-Phe-OH
10) Fmoc-Val-OH
11) Fmoc-Ser(tBu)-OH
12) Fmoc-His(Trt)-OH
5 13) Fmoc-Gly-OH
14) Fmoc-Asn(Glc)-OH(A/a-Fmoc-A/v'-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-3- -D-glukopyranosyl)-L-Asn-OPfp)
15) Fmoc-Arg(Pmc)-OH
16) Fmoc-Glu(OtBu)-OH
10 17) Fmoc-Val-OH
18) Fmoc-Arg(Pmc)-OH
19) Fmoc-Pro-OH
20) Fmoc-Thr(tBu)-OH
Po ukončení syntézy byly odstraněny ochranné skupiny
15 pryskyřice 20% piperidinem v DMF, pryskyřice byla zfiltrována,
promyta DMF, DCM a etherem, a potom sušena ve vakuu. Surový
peptid byl získán smísením pryskyřice se směsí
TFA/fenol/anísol/ethandithiol (94 : 2 : 2 : 2) (10 ml), a udržováním
směsi za míchání 30 min při 0 °C a při teplotě laboratoře 1,5 h.
20 Pryskyřice byla zfiltrována a promyta TFA a filtrát byl zakoncentrován
na poloviční objem ve vakuu. Peptid byl vysrážen smísením s chladným etherem. Získaná sraženina byla lyofilizována za získání 112 mg surového peptidu.
Deacetylace byla dosažena přikapáváním roztoku NaOMe 0,1M 25 v MeOH, pro dosažení pH = 12, k roztoku peptidu v bezvodém MeOH (15 ml) udržovanému za míchání v atmosféře dusíku. Roztok NaOMe byl připraven přidáním kovového sodíku (270 mg v ligroinu (petrolether), 117 mmol) k destilovanému MeOH (11 ml) v atmosféře • · • · · · • · · · · · * · ® • ♦ · · · ······· • · · · · · ···
- Q _ ··· · ·* ·· dusíku. Po 1 h byl ke směsi přidán suchý led, až do neutralizace. Roztok byl zakoncentrován za získání surového peptidu, který byl čištěn semipreparativní HPLC (HPLC čistota vyšší než 97 %).
Charakterizace: ESI-MS: nalezeno: [M+3H]3+ m/z = 869,9, [M+2H]2+ m/z = 1304,2; vypočteno: PM monoisotopická = 2605,38.
Použitím stejné metody byly připraveny jiné lineární peptidy, přičemž potřebné aminokyseliny byly použity v odpovídajícím pořadí.
Příklad 2 ío Syntéza cyklického peptidu
Příprava H-Thr-Pro-Arg-Val-cyklickvíDap-Arg-Asn(Glc)-Gly-His-Asp]-Val-Phe-Leu-Ala-Pro-Tvr-Glv-Trp-Met-Val-Lys-QH
Pryskyřice TentaGel SPHB-Lys(Boc)-Fmoc (1,00 g, 0,22 mmol/g) byla zpracována jak se popisuje v příkladu 1. Pro každou vazebnou reakci byly použity 4 ekv. Fmoc-aminokyselin (0,88 mmol) rozpuštěné v DMF (1,3 ml) a jako aktivační činidla HOBt (4 ekv., 0,88 mmol) a TBTU (4 ekv., 0,88 mmol) a NMM (6 ekv., 1,68 mmol). Byly použity následující aminokyseliny v uvedeném pořadí:
1) Fmoc-Val-OH
2) Fmoc-Met-OH
3) Fmoc-Trp(Boc)-OH
4) Fmoc-Gly-OH
5) Fmoc-Tyr(tBu)-OH
6) Fmoc-Pro-OH
7) Fmoc-Ala-OH
8) Fmoc-Leu-OH
9) Fmoc-Phe-OH
- 9 10) Fmoc-Val-OH
11) Fmoc-Asp(OAII)-OH
12) Fmoc-His(Trt)-OH
13) Fmoc-Gly-OH
14) Fmoc-Asn(Glc)-OPfp
15) Fmoc-Arg(Pmc)-OH
16) Fmoc-Dap(Alloc)-OH
17) Fmoc-Val-OH
18) Fmoc-Arg(Pmc)-OH io 19) Fmoc-Pro-OH
20) Fmoc-Thr(tBu)-OH
Po ukončení syntézy byly selektivně odstraněny allylové ochranné skupiny postranních řetězců Dap a Asp působením roztoku Pd(PPh3)4 (3 ekv.) v 7,5 ml CHCI3/AcOH/ NMM 37 : 2 : 1 v atmosféře argonu. Reakční směs byla míchána použitím mechanického rameně 3 h při teplotě laboratoře. Pryskyřice byla potom zfiltrována a promyta třikrát roztokem 0,5% DIPEA v DMF, třikrát roztokem 0,05% diethylkarbamátu sodného v DMF, třikrát DMF a třikrát DCM.
Pro následující cyklizační reakci byla pryskyřice ponechána nabobtnat v baňce v DMF 1 h. Potom byl přidán NMM (4 ekv.) a po 10 min PyBOP (4 ekv.). Reakční směs byla míchána použitím mechanického ramene tři dny při teplotě laboratoře. Pryskyřice byla zfiltrována a promyta několikrát DMF, DCM a Et2O a nakonec sušena ve vakuu.
Potom byly z pryskyřice odstraněny ochranné skupiny Fmoc použitím 20% piperidinu v DMF a potom byl peptid uvolněn a izolován použitím přesně stejného postupu jak bylo popsáno v příkladu 1.
• · · · ·· ··« · • 0 • 90 09
Příklad 3
Syntéza peptidu navázaného na pryskyřici
Příprava H-Thr-Pro-Arg-Val-Glu-Arg-Asn(Glc)-Gly-His-Ser-Val-Phe-Leu-Ala-Pro-Tyr-Gly-Trp-Met-Val-Lys-fgAlah-PEG-PS
Základní pryskyřice PEG-PS v aminové formě (1 g, 0,09 ekv.) byla ponechána nabobtnat v DMF 1 h při laboratorní teplotě a byla naplněna do skleněné kolony (150 x 15 mm) z poloautomatického syntezátoru s kontinuálním průtokem. Pro navázání první aminokyseliny byl na kolonu nanesen roztok obsahující Fmoc-pAla-OH io (4 ekv., 0,36 mmol) rozpuštěný v DMF (1,5 ml), a jako aktivační činidla HOBt (4 ekv., 0,36 mmol), TBTU (4 ekv., 0,36 mmol) a NMM (6 ekv., 0,54 mmol). Reakce byla ponechána probíhat 1 h a potom po příslušném promytí následovalo odstranění ochranných skupin z aminových skupin působením 20% piperidinu v DMF. Vazebný cyklus pro pAla byl opakován ještě dvakrát a potom stejným způsobem pokračovalo navázání zbytku Fmoc-Lys(Boc)-OH. Potom pokračovala konstrukce celé peptidové sekvence použitím přesně stejného postupu jak bylo uvedeno v příkladu 1. Po konečném zpracování použitím piperidinu byl konstrukt pryskyřice-peptid zbaven ochranných skupin působením směsi TFA/fenol/anisol/ethandithiol (94 : 2 : 2 : 2) (10 ml), za míchání 30 min při 0 °C a při laboratorní teplotě 1,5 h, pečlivě promyt a sušen za sníženého tlaku.
Příklad 4
Konjugace peptidu na pryskyřici
Volný peptid, přímý nebo cyklický, připravený jak se popisuje v příkladech 1, popř. 2, byl konjugován na sepharózovou pryskyřici předaktivovanou CNBr, použitím obvyklých reakčních protokolů doporučovaných výrobci pro získávání konjugátu pryskyřice-peptid.
Takto získaný produkt je použitelný např. pro přípravu destiček pro • · ·
- 11 φφ · • φ φφφ φφφφ • φ φ · ♦ diagnózu nebo léčení pacientů postižených roztroušenou sklerózou (viz následující text).
Předkládaný vynález se také týká kitu obsahujícího glykopeptidy podle vynálezu a použitelného pro diagnostické účely.
Podle výhodného provedení vynálezu obsahuje výše uvedený kit následující součásti:
- mikrotitrační destička;
- pufrační roztok pro adhezi peptidu na destičku;
- modifikovaný peptid podle vynálezu (lyofilizovaný);
- pufr FCS (10% FCS, 9 g/l NaCI, Tween 20 0,05 %);
- koncentrovaný promývací roztok (20x koncentrovaný);
- pozitivní kontrolní sérum;
- negativní kontrolní sérum;
- protilátka reagující s protilátkou roztroušené sklerózy [konjugát
- (AP konjugovaný s anti-lgm)];
- substrát (p-nitrofenylfosát, dvojsodná sůl);
- substrátový pufr (1 M diethanolaminový pufr, pH 9,8);
- ukončovací roztok (1 M hydrát sodný).
Ve výhodném provedení může být pufrační roztok pro adhezi 2o peptidu na destičku a modifikovaný peptid podle vynálezu již přímo součástí destičky.
Diagnostické použití
Pro diagnostické použití byly glykopeptidy podle vynálezu zředěny a absorbovány na vazebnou plastickou hmotu v jamkách mikrotitračních destiček (systémy ELISA). Potom byly přidávány vzorky séra nebo plasmy pacientů v řadách odlišných koncentrací (řady • » * · • · « · · · • · · · · · * · · • · ·· · · · · ***** ·· ···· ··*
-12- * ...» ...
ředění). Protilátka specifická pro navázané produkty podle vynálezu se navázala na peptid absorbovaný na plastické hmotě. Způsobem známým odborníkům v oboru, metodou ELISA (Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay), se molekuly vlastní protilátky navázané na glykopeptid potom prokážou navázáním příslušných sekundárních protilátek přidaných na destičky ELISA, které rozpoznávají konstantní fragment imunoglobulinu. Tyto sekundární protilátky konjugované s vhodnými enzymy mohou být zviditelněny kolorimetrickou reakcí: získaná absorbance je úměrná množství specificky navázané vlastní protilátky. Kvantitativně se výsledek vyjádří jako titr protilátky definovaný jako převrácená hodnota faktoru ředění, při kterém se již nepozoruje žádná další reakce.
Titr protilátky, jak bylo definováno výše, byl měřen u různých pacientů postižených roztroušenou sklerózou; glykoproteiny podle vynálezu přitom vykázaly vyšší titry protilátky ve srovnáni s titry měřenými se známými glykopeptidy.
Terapeutické použití
Peptidy podle vynálezu ve volné formě nebo navázané na vhodné pryskyřice se mohou použít pro léčení pacientů postižených roztroušenou sklerózou, přičemž díky jejich vysoké specificitě pro rozpoznávanou protilátku mohou být použity pro neutralizaci a/nebo selektivní odstraňování vlastních protilátek.

Claims (5)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Glykopeptidy tvořené 11 až 24 aminokyselinami obsahující tetrapeptid vzorce (I)
    5 X-Asn(G)-Y-Z (I) kde:
    X = aminokyselina nesoucí na postranním řetězci aminovou nebo karboxylovou skupinu;
    Y = Pro, Gly;
    io G = cukr;
    Z = Ala, Val, lle, His.
  2. 2. Glykopeptidy podle nároku 1, kde aminokyseliny jsou v přírodě se vyskytující aminokyseliny, nebo aminokyseliny, které se
    15 v přírodě nevyskytují.
  3. 3. Glykopeptidy podle nároků 1 a 2, vzorce (II):
    A-B-X-Asn(G)-Y-Z-C-D (II) kde:
    20 Y a G jsou jak definováno výše;
    A je skupina 2 až 5 aminokyselin nebo není přítomno;
    B a C jsou trifunkční aminokyseliny schopné vytvořit mezi sebou iaktamový můstek prostřednictvím případných postranních řetězců, nebo nejsou přítomny;
    25 D znamená skupinu 5-15 aminokyselin;
    - 14 •φ φφφφ φφφφ ·· · φ φ φ φ φφφ φ φφ φ φφφφ • φφφ φφφφ φφφ φ · · » φ · φ · * φφφφ φφ ·
    X je aminokyselina zvolená ze skupiny: Glu, Asp, Lys, Arg, Orn, Dap;
    Z je aminokyselina zvolená ze skupiny: Ala, Val, lle, His.
    5 4. Glykopeptidy podle nároku 3, kde B a C znamenají páry: DapAsp nebo Asp-Dap, Dab-Glu nebo Glu-Dab, Orn-Asp nebo AspOrn a páry tvořené jinými aminokyselinami s analogickými vlastnostmi.
    io 5. Glykopeptidy podle nároků 1 až 4, kde cukr je zvolen ze skupiny mono- a disacharidů jako je β-D-glukopyranosyl (Glc), 2-acetylglukosamin (GIcNAc), celobióza a analogy.
    6. Glykopeptidy podle nároku 5, kde cukr je β-D-glukopyranosyl
    15 (Glc).
    7. Glykopeptidy podle nároků 1 až 6, následujících vzorců:
    H-Thr-Pro-Arg-Val-Glu-Arg-Asn(Glc)-Gly-His-Ser-Val-Phe-Leu-Ala-Pro-Tyr-Gly-Trp-Met-Val-Lys-OH
    20 H-Thr-Pro-Arg-Val-cyklický[Dap-Arg-Asn(Glc)-Gly-His-Asp]-Val-Phe-Leu-Ala-Pro-Tyr-Gly-Trp-Met-Vai-Lys-OH
    H-Thr-Pro-Arg-Val-cyklický[Asp-Arg-Asn(Glc)-Gly-His-Orn]-Val-Phe-Leu-Ala-Pro-Tyr-Gly-Trp-Met-Val-Lys-OH
    H-Ala-Lys-Thr-Ala-Lys-Asn(Glc)-Gly-His-Val-Glu-Ala-Ser-Gly-OH
    25 H-Glu-Asn(Glc)-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-lle~Val-Thr-Pro-Arg-Thr-Pro-OH
    H-Asp-Asn(Glc)-Pro-Vai-Glu-Ala- Phe-Lys-Gly-lle-Ser-OH
    - 15 99 9999
    99 9
    99 9 99 9 999
    9 9 «9 9 9999
    9 9 99 9 999 99999
    99 9999 999
    9999 99 99 99 9
    H-Thr-Pro-Arg-Val-Glu-Arg-Asn(Glc)-Gly-His-Ser-HN-(CH2)6-CO-Val-Phe-Leu-Ala-Pro-Tyr-Gly-Trp-Met-Val-Lys-OH
    H-Asp-Asn(Glc)-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-lle-Val-(pAla)3-OH
    8. Glykopeptidy podle nároků 1 až 7, obsahující alkylovou mezerníkovou skupinu v jiných než koncových polohách.
    9. Glykopeptidy podle nároku 8, kde uvedená alkylová io mezerníková skupina je skupina vzorce -HN-(CH2)n-CO2-, kde n je mezi 2 a 6.
    10. Glykopeptidy podle nároků 1 až 9, obsahující další C-koncovou skupinu -HN-(CH2)n-CO2H, kde n je mezi 2 a 6.
    11. Způsob přípravy glykopeptidů podle nároků 1 až 10 na pevné fázi, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:
    a) C-koncový zbytek se kovalentně naváže na vhodný pevný
    20 nosič;
    b) postupně se přidávají následující aminokyseliny acylací aminové skupiny zbytku navázaného na pryskyřici;
    c) surový peptid se izoluje působením vhodné kyseliny na pryskyřici;
    2s d) peptid se čistí použitím chromatografických technik; a
    e) peptid se popřípadě naváže na vhodný pevný nosič.
    - 16 00 0*00 0 0 ·
    0 0 0 0 0 0
    0 0 0 0
    00 00
    00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 000 0 0 0
    00 0
    12. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, ž e pevný nosič ze stupně (a) se zvolí ze skupiny silikagel, celulóza, polyakrylát, sepharóza a analogy, polystyren jako je Wangova pryskyřice, polystyren-polyoxyethylen jako je
    5 pryskyřice TentaGel nebo PEG-PS, kopolymery polyethyleneglykolu a polyakrylamidu jako jsou pryskyřice PEGA, POEPS, tedy polyoxyethylen-polystyren, POEPOP, tedy polyoxyethylen-polyoxypropylen, a SPOCC, tedy PEG substituovaný oxethanem, nebo jejich deriváty.
    13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, ž e pevný nosič ve stupni (e), pokud je přítomen, se zvolí ze skupiny silikagel, celulóza, polyakrylát a sepharóza.
    15 14. Konjugáty tvořené pryskyřicí, nerozpustnou ve vodě, a úplně kompatibilní s organickými kapalinami a glykopeptidem podle nároků 1 - 10.
    15. Konjugáty podle nároku 14, ve kterých je pryskyřice zvolena ze
    20 skupiny sepharóza, celulóza a silikagel.
    16. Destičky pro diagnózu, vyznačující se tím, ž e obsahují glykopeptidy podle některého z nároků 1 až 10.
    25 17. Diagnostické metody, vyznačující se tím, že využívají volné glykopeptidy podle nároku 1 až 10.
    18. Diagnostické metody, vyznačující se tím, že využívají konjugáty podle nároků 14 a 15.
    φφ φφφφ φφ ·
    - 17 • φ · · φ - φ · · φ φ · φφφφ φφφφ
    19. Kit pro diagnózu roztroušené sklerózy, vyznačující se tím, že obsahuje:
    - mikrotitrační destičku;
    5 - pufrační roztok pro adhezi peptidu na destičku;
    - modifikovaný peptid podle nároků 1-10 (lyofilizovaný);
    - pufr FCS (10% FCS, 9 g/l NaCI, Tween 20 0,05%);
    - koncentrovaný promývací roztok (20x koncentrovaný);
    - pozitivní kontrolní sérum;
    w - negativní kontrolní sérum;
    - protilátku reagující s protilátkou roztroušené sklerózy [konjugát
    - (AP konjugovaný s anti-lgm)];
    - substrát (p-nitrofenylfosfát, dvojsodná sůl);
    - substrátový pufr (1M diethanolaminový pufr, pH 9,8);
    15 - zastavovací roztok (1M hydrát sodný).
    20. Kit podle nároku 19, vyznačující se tím, že pufrační roztok pro adhezi peptidu na destičku a modifikovaný peptid jsou přímo obsaženy na mikrotitrační destičce.
    Zastupuje:
  4. 4 4 ···· 44 · • 4 4 *44
    4 9 9 4 4 9
    4 · · 4 ·
    4 4 4*4
    44 44 94
    Výpis sekvencí <110> Universita degli Studí di Firenze <120> Glycopeptides, their preparation and use in the diagnosis or therapeutic treatment of multiple sclerosis <130> 2784 PTWO <140> PCT/EP 02/06767 <141> 2002-06-19 <150> FI2001A000114 <151> 2001-06-22 <160> 8 <170> Patentln versíon 3.1 <210> 1 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>
    <223> glycopeptide <220>
    <221> CARBOHYD <222> (7)..(7) <223> the carbohydrate is beta-D-glucopyranosyl <400> 1
    Thr Pro Arg Val Glu Arg Asn Gly His Ser Val Phe Leu Ala Pro Tyr 15 10 15
    Gly Trp Met Val Lys 20 <210> 2 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>
    <223> GLYCOPEPTIDE <220>
    <221> CARBOHYD <222> (7)..(7) <223> the carbohydrate is beta-D-glucopyranosyl <220>
    <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is diamino propanoic acid
    9999 >oTo oV ·· 4999 99 9
    Μ 9 99 9 999 • 9 99 9 9999
  5. 9 9 · 9 · 999 9999
    99 «99» »99
    999 » 99 99 99 9 <400> 2
    Thr Pro Arq Val Xaa Arg Asn Gly His Asp Val Phe Leu Ala Pro Tyr 15 10 15
    Gly Trp Met Val Lys 20 <210> <211> <212> <213> 3 21 PRT Artificial Sequence <220> <223> glycopeptide <220> <221> <222> <223> CARBOHYD the carbohydrate is beta-D-gluccpyranosyl <220> <221> <222> <223> MISC FEATURE (10) . . (10) Xaa is Orn <400> 3 Thr Pro Arg Val Asp Arg Asn 1 5 Gly His Xaa Val Phe Leu Ala 10 Gly Trp Met Val Lys 20 <210> <211> <212> <213> 4 13 PRT Artificial Sequence <220> <223> glycopeptide <220> <221> <222> <223> CARBOHYD (6)..(6) the carbohydrate is beta-D-gluccpyranosyl <400> 4
    Ala Ser Gly
    Ala Lys Thr Ala Lys Asn Gly His Val G i 5 1
    1 5 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> glycopeptide
    • 444 ··
    4·· »♦ ···· »· · • · » · ♦ » * · · · « · * • · ♦ » · « *··« • · · · o · · ·· ·» ·· · <220>
    <221> CARBOHYD <222> (2)..(2) <223> the carbohydrate is beta-D-glucopyranosyl <400> 5
    Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr 15 10 15
    Pro <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> glycopeptide <220> <221> CARBOHYD <222> (2) .. (2) <223> the carbohydrate is beta-D-glucopyranosyl <400> 6 Asp Asn Pro Val Glu Ala Phe Lys Gly Ile Ser 1 5 10 <210> 7 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> glycopeptide <220> <221> CARBOHYD <222> (7) . . (7) <223> the carbohydrate is beta-D-glucopyranosyl <220> <221> MISC FEATURE <222> (11) . · dl) <223> Xaa is 7-aminoheptanoic acid <400> 7
    Thr Pro Arg Val Glu Arg Asn Gly His Ser Xaa Val Phe
CZ2004122A 2001-06-22 2002-06-19 Glykopeptidy CZ2004122A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IT2001FI000114A ITFI20010114A1 (it) 2001-06-22 2001-06-22 Glicopeptidi,loro preparazione e loro uso nella diagnosi o nel trattamento terapeutico della sclerosi multipla

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ2004122A3 true CZ2004122A3 (cs) 2004-07-14

Family

ID=11442221

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2004122A CZ2004122A3 (cs) 2001-06-22 2002-06-19 Glykopeptidy

Country Status (15)

Country Link
US (1) US7037893B2 (cs)
EP (1) EP1406927B1 (cs)
AT (1) ATE393785T1 (cs)
AU (1) AU2002316989B2 (cs)
CA (1) CA2451347C (cs)
CZ (1) CZ2004122A3 (cs)
DE (1) DE60226324T2 (cs)
DK (1) DK1406927T3 (cs)
ES (1) ES2305258T3 (cs)
HU (1) HUP0400262A3 (cs)
IL (2) IL159479A0 (cs)
IT (1) ITFI20010114A1 (cs)
PL (1) PL207174B1 (cs)
PT (1) PT1406927E (cs)
WO (1) WO2003000733A2 (cs)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ITFI20010114A1 (it) 2001-06-22 2002-12-22 Univ Firenze Glicopeptidi,loro preparazione e loro uso nella diagnosi o nel trattamento terapeutico della sclerosi multipla
ITFI20010144A1 (it) * 2001-07-25 2003-01-25 Univ Firenze Colonne per immunoassorbimento per sottrazione di autoanticorpi dal sangue con tecniche di plasmafiltrazione selettiva
EP1529216B1 (en) 2002-08-02 2007-10-24 Glycominds Ltd. Method for diagnosing multiple sclerosis
US7572592B2 (en) 2005-01-31 2009-08-11 Glycominds Ltd Method for diagnosing multiple sclerosis
US8216791B2 (en) 2005-01-31 2012-07-10 Glycominds Ltd. Method for diagnosing multiple sclerosis
WO2008127642A1 (en) * 2007-04-11 2008-10-23 Enteron Limited Partnership Myelin specific ige unencumbered by corresponding blocking antibodies as a causative factor in multiple sclerosis
CA2683865A1 (en) * 2007-04-12 2008-10-23 Apitope International Nv Biomarkers for multiple sclerosis
ATE514711T1 (de) 2007-10-16 2011-07-15 Toscana Biomarkers S R L Galactosylierte peptide, deren zubereitung und verwendung zur diagnose von autoimmunerkrankungen
US20100203569A1 (en) 2009-02-12 2010-08-12 Glycominks LTD Method for Evaluating Risk in Multiple Sclerosis
ITFI20120164A1 (it) 2012-06-05 2013-12-06 Azienda Ospedaliera Universitaria S Enese 50 Nuovi peptidi glicosilati.

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU5671196A (en) * 1996-03-28 1997-10-17 Immulogic Pharmaceutical Corporation Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptides and uses thereof
NZ507901A (en) 1998-05-05 2003-06-30 Corixa Corp Isolated myelin basic protein (MBP) for treating mutliple sclerosis
ATE357247T1 (de) 1998-08-26 2007-04-15 Univ California Inhibitoren von autoantikörpern
ITFI20010114A1 (it) 2001-06-22 2002-12-22 Univ Firenze Glicopeptidi,loro preparazione e loro uso nella diagnosi o nel trattamento terapeutico della sclerosi multipla
ITRM20010408A1 (it) * 2001-07-10 2003-01-10 Univ Napoli Federico Ii Mini-anticorpo umano citotossico per cellule tumorali che esprimono il recettore erbb2.

Also Published As

Publication number Publication date
IL159479A (en) 2010-12-30
HUP0400262A3 (en) 2008-05-28
WO2003000733A2 (en) 2003-01-03
HUP0400262A2 (hu) 2004-08-30
ATE393785T1 (de) 2008-05-15
PL207174B1 (pl) 2010-11-30
AU2002316989B2 (en) 2006-10-26
ES2305258T3 (es) 2008-11-01
PL368158A1 (en) 2005-03-21
CA2451347A1 (en) 2003-01-03
IL159479A0 (en) 2004-06-01
CA2451347C (en) 2011-07-19
EP1406927A2 (en) 2004-04-14
EP1406927B1 (en) 2008-04-30
PT1406927E (pt) 2008-07-31
DK1406927T3 (da) 2008-08-18
DE60226324T2 (de) 2009-07-09
ITFI20010114A1 (it) 2002-12-22
DE60226324D1 (de) 2008-06-12
WO2003000733A3 (en) 2003-11-13
US20040235713A1 (en) 2004-11-25
US7037893B2 (en) 2006-05-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Dziadek et al. Synthesis and Structural Model of an α (2, 6)‐Sialyl‐T Glycosylated MUC1 Eicosapeptide under Physiological Conditions
KR102397271B1 (ko) Amg 416의 제조 방법
US6030790A (en) Antibodies that bind peptides from the hPTH sequence (1-37)
JP5731109B2 (ja) 疎水性ペプチドに対する抗体の製造方法
GB1570375A (en) Synthetic antigenically active polypeptide and a process for its preparation
KR101920947B1 (ko) 시알릴 당쇄를 갖는 당펩티드의 제조방법, 당해 제조방법에 사용하는 시알릴 당쇄 부가 아미노산 유도체 및 당해 당펩티드
CZ2004122A3 (cs) Glykopeptidy
AU2002316989A1 (en) Glycopeptides, their preparation and use in the diagnosis or therapeutic treatment of multiple sclerosis
RU2520240C2 (ru) Способ получения гликопротеина и способ скрининга
CA2126132A1 (en) Peptide synthesis on chitosan
CN100357313C (zh) 非靶位点胺基被保护的肽,其制备方法以及使用该肽制备特异性地结合的peg肽的方法
Otvos et al. Development of chemically modified peptides
US4327075A (en) Synthetic antigenically-active polypeptide and a process for its preparation
Teruya et al. Fmoc‐based chemical synthesis and selective binding to supercoiled DNA of the p53 C‐terminal segment and its phosphorylated and acetylated derivatives
JP3741495B2 (ja) 新規複合糖ペプチドおよびその製造法
Sidorova et al. Synthesis and properties of a new conformational antigen which models an extracellular region of β1-adrenoreceptor
CA2828688C (en) Method for preparing multiple antigen glycopeptide carbohydrate conjugates
CN114539358B (zh) 一种多肽及制备方法与应用
RU2356576C1 (ru) СИНТЕТИЧЕСКИЙ АНТИГЕН, ОБЛАДАЮЩИЙ СПОСОБНОСТЬЮ СВЯЗЫВАТЬ АУТОАНТИТЕЛА К β1-АДРЕНОРЕЦЕПТОРУ
EP2050761A1 (en) Galactosylated peptides, their preparation and use in autoimmune diseases diagnosis
WO2010111910A1 (zh) 一种合成肽及其应用
EP0535804A1 (en) Peptide compounds
ENGLEBRETSEN SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS ON A BEADED CELLULOSE SUPPORT
KR20170135713A (ko) 높은 항체결합용량과 온화한 용출 조건을 가진 항체정제용 흡착 리간드 및 그 용도
JPH0630989A (ja) ポリペプチドおよび該ポリペプチドを用いた抗血小板抗体吸着材