JPH0630989A - ポリペプチドおよび該ポリペプチドを用いた抗血小板抗体吸着材 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 特定のアミノ酸配列を含有するポリペプチ
ドあるいはこれを修飾したポリペプチドを用いることに
より、抗血小板抗体と結合させてこれを除去する方法お
よび上記ポリペプチドを水不溶性担体に固定化した抗血
小板抗体吸着材を提供する。 【構成】 （１）ＥＴＲＮＶＧＳ，（２）ＥＫＴＥＥ
ＡＥＫＴ，（３）ＥＰＥＱＰＳＲＬのいずれかのアミノ
酸配列から成るペプチド領域を含有するような７０以下
のアミノ酸残基により構成されるポリペプチド（ペプチ
ドおよび該ペプチド領域を含む有機化合物）およびこれ
らのポリペプチドのうち少なくとも１種類を水不溶性担
体に固定化した抗血小板抗体吸着材。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は何らかの原因により血液
中に産生された自己抗体である抗血小板抗体を、特定の
アミノ酸配列を含有しているポリペプチドまたは該ペプ
チド領域を含む修飾ポリペプチド（ポリペプチドと総称
する）を利用して、抗血小板抗体と結合させることを特
徴とする抗血小板抗体の除去方法および該ポリペプチド
を担体に固定化したことを特徴とする抗血小板抗体吸着
材に関するものである。本発明は特に抗血小板抗体の存
在による血小板数の減少に起因して、出血，紫斑などの
諸症状をもたらす特発性血小板減少性紫斑病（以下ＩＴ
Ｐと言う）のような疾患に関する治療において非常に有
用なものである。

【０００２】

【従来の技術】ＩＴＰは自己免疫疾患の一種であり、血
小板寿命の短縮，血小板結合免疫グロブリンである抗血
小板抗体の増加を特徴とし、骨髄では巨核球数は正常あ
るいは増加を示し、他の血液疾患の存在を示唆する所見
を認めない免疫性の血小板減少症のうち膠原病，リンパ
増殖性疾患，薬剤アレルギーなどの原因疾患の認められ
ないものを指す。

【０００３】ＩＴＰは急性型と慢性型に分けられる。急
性型は小児に多く見られ、出血症状は激しいが比較的治
癒はしやすい。発症３週間以前に上気道感染，ウイルス
感染などの先行感染が認められることが多い。感染の回
復期に血小板減少を認めることから、形成された免疫複
合体が血小板膜Ｆｃ受容器に結合し、血小板が非特異的
に破壊される免疫複合病の可能性が強い。一方慢性型は
出血症状は弱いが長期間持続し、成人で特に２０才代の
女性に多く、抗血小板抗体による自己免疫病と考えられ
ているものである。

【０００４】抗血小板抗体による血小板数の減少により
見られる症状には個人差があるが、一般的には血小板数
５００００個／μｌ以上では通常出血症状は見られず、
３００００ないし５００００個／μｌでは外傷時の易出
血性，斑状出血，１００００ないし３００００個／μｌ
では露出部への紫斑の出現，月経過多，１００００個／
μｌ以下では血尿，不正性器出血，鼻出血，歯肉出血が
認められ、頭蓋内出血，消化管出血がしばしば直接の死
因となっている。

【０００５】ＩＴＰの治療に際してはその症状の程度に
応じて副腎皮質ホルモン剤の投与，脾臓の摘出，ステロ
イド系免疫抑制剤の投与などが適用される。しかしこう
した薬物療法や摘脾手術では血小板数が効果的には回復
しないような症例も多く存在している。ＩＴＰをはじめ
種々の自己免疫疾患の発生に関するメカニズムはまだ十
分には解明されておらず、こうした患者に対する治療方
法についても絶対的なものは確立されていないのが現状
であり対策が急がれている。

【０００６】こうした自己免疫疾患の治療方法として、
免疫吸着カラムを用いた血液の体外循環による自己抗体
の吸着除去も種々試みられている。たとえば免疫グロブ
リンと結合性を有するプロテインＡを担体に固定化した
カラムの適用も検討されている。しかしプロテインＡは
高価であり、吸着特異性の点で優れず、さらには副作用
の問題も有しておりあまり有用なものではない。また除
去対象物質に対する抗体の固定化カラムも種々検討され
ているが、安全性，保存安定性の問題，抗体が有効に反
応できるような固定化が困難なこと，滅菌方法が限定さ
れるなどの理由から医用機材として用いるには多くの課
題がある。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は血液中の抗血
小板抗体を認識して結合性を有するような比較的低分子
量のペプチドあるいはそれを修飾した有機化合物により
結合させ除去しようとするものである。また上記ペプチ
ドまたは有機化合物を水不溶性担体に固定化した吸着材
を提供し、さらにはこれを充填したカラムを用いて体外
循環などによる治療に適用しようとするものである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成した本発
明は抗血小板抗体の抗原決定基となりうる特定のアミノ
酸配列を含有しているポリペプチド（ポリペプチドある
いはこれを修飾したポリペプチド）による抗血小板抗体
の除去を要旨とするものである。上記ポリペプチドを水
不溶性担体に固定化することにより抗血小板抗体吸着材
が得られ、これを充填したカラムを用いて体外循環など
による血液浄化治療が可能である。

【０００９】一般にＩＴＰ患者における抗血小板抗体は
血小板膜表面に存在する糖タンパク質の複合体であるＧ
Ｐ２ｂ／３ａ（ＧＰIIｂ／IIIａを示す。以下同）やＧ
Ｐ１ｂ／９に対する抗体であること多いことが知られて
いる。本発明における請求項１記載の３種類のペプチド
領域はＧＰ２ｂの一次構造から種々の方法により抗原決
定基となりうる領域を予測およびスクリーニングするこ
とにより得られたものである。

【００１０】ＧＰ２ｂは分子量約１４０キロダルトンで
あり、ＳＳ結合により分子量１２５キロダルトンのＨ鎖
と分子量２５キロダルトンのＬ鎖から構成されている。
ＧＰ２ｂはそのｃＤＮＡがクローニングされている
（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，８４７６，１９
８７）。１０３９個のアミノ酸残基から構成されてお
り、Ｈ鎖には８７１個，Ｌ鎖には１３７個およびＮ末端
部には３０アミノ酸残基から成るシグナルペプチドが存
在する。ＧＰ２ｂの膜貫通ドメインはＬ鎖内に存在し２
６個の疎水性アミノ酸から成る。

【００１１】ＧＰ２ｂはＧＰ３ａと骨髄中の骨髄巨核球
またはその前駆細胞において複合体を形成する。血小板
膜表面においてＧＰ２ｂとＧＰ３ａは非共有結合により
図１に示すような１：１の複合体を形成している。ＧＰ
２ｂにおける５５８ないし７４７番目のアミノ酸残基の
部分とＧＰ３ａにおける１１４ないし３０３番目のアミ
ノ酸残基の部分とで会合していることが推定されている
（医学のあゆみ，１６０，６８１，１９９２）。ＧＰ２
ｂ／３ａは血小板膜表面上に最も多く存在している糖タ
ンパク質である。

【００１２】ＧＰ２ｂに関するアミノ酸配列中におい
て、１０６ないし１１２番目に相当するＥＴＲＮＶＧＳ
（請求項１の（１）），１４８ないし１５６番目のＥＫ
ＴＥＥＡＥＫＴ（請求項１の（２）），８９６ないし９
０３番目のＥＰＥＱＰＳＲＬ（請求項１の（３））３つ
の領域（特定のアミノ酸配列部分）が抗血小板抗体に対
する免疫原性がエンザイムイムノアッセイ（以下ＥＬＩ
ＳＡ法と言う）により確認された領域である。これらの
領域は図２に示すようにいずれも親水性の比較的強い領
域であり、ＧＰ２ａ分子表面に存在している領域である
ことが推定される。

【００１３】上記の領域は抗血小板抗体との結合に最小
限必要な領域であると考えられる。実際にこうしたペプ
チドを用いて抗血小板抗体を除去することを行なう場合
には、血液中に存在する抗血小板抗体との反応様式に近
い状態を再現する必要がある。また血液中に存在する場
合の構造の安定性や、あるいは担体に固定化する場合に
は水系溶媒に対する溶解性を大きくしたりすることを考
慮する必要があることが多い。

【００１４】本発明のポリペプチドはポリペプチド領域
個々の１個だけでもいし、これらの領域が他のアミノ酸
によって結合したり、また他のアミノ酸以外の化合物で
結合したりしたものでもよく、また上記例示のものを、
末端等を修飾したものでもよい。これらの本発明のポリ
ペプチドの連鎖において、領域およびそれ以外のアミノ
酸を全て総和したアミノ酸の数は７０以下であることが
好ましい。

【００１５】そこで上記に示したペプチド領域の一方の
末端または両末端の領域を延長したり、たとえばリジン
のような水溶性を大きくするようなアミノ酸を数個末端
に結合させたり、システインのようなアミノ酸を末端に
結合させて担体に固定化しやすくするなどすることが好
ましい。こうした点から実際に用いるポリペプチドのア
ミノ酸（残基）数としては７０以下であることが好まし
く、４ないし３０個がさらに好ましいが１０ないし２０
個が合成に関わるコスト，安定性，取扱いやすさなどの
点から最も好ましい。また固定化反応や安定性などを考
慮して、たとえばＮ末端をアミド化したり、末端に適当
な官能基を導入したりして上記ポリペプチドを修飾した
有機化合物（修飾ポリペプチド）を用いることも好まし
い。

【００１６】ポリペプチドの合成については特に限定さ
れないが、液相合成法よりも固相合成法を適用する方が
操作が簡単である。この場合有機溶媒に不溶性である支
持体に合成するペプチドのＣ末端に対応するアミノ酸を
結合させ、Ｎ末端方向にαカルボキシル基以外のαアミ
ノ基などの官能基を保護した対応するアミノ酸を順に縮
合反応により結合させた後、結合した後その保護基を脱
離させる反応を交互に繰返すことによりペプチド鎖を延
長させる。

【００１７】目的とするポリペプチドが得た後、ペプチ
ド鎖を支持体から切断および脱保護基を行なう。これに
はフッ化水素がしばしば用いられるが、安全性，取扱い
やすさの点からトリフルオロメタンスルホン酸（以下Ｔ
ＦＭＳＡと言う）を用いるのが適当である。チオアニソ
ール，１，２−エタンジオールとＴＦＭＳＡ中で反応さ
せ脱保護基を行なった後、トリフルオロ酢酸（以下ＴＦ
Ａと言う）により支持体からの切断を行ないポリペプチ
ドを回収する。これを凍結乾燥することによりクルード
ペプチドが得られる。

【００１８】上記クルードペプチドは逆相系カラムを用
いた高速液体クロマトグラフィ（以下ＨＰＬＣと言う）
に供することにより分取，精製を行なう。ＨＰＬＣ条件
は通常タンパク質の精製に用いる系を基本として最適化
を行なうのがよい。得られたクロマトピークに相当する
画分を分取しこれを凍結乾燥する。得られた精製ペプチ
ド画分についてマススペクトル分析による分子量解析，
アミノ酸組成分析あるいはアミノ酸配列解析などにより
同定を行なう。

【００１９】上記ペプチドあるいは有機化合物を固定化
する場合に用いる水不溶性担体としては特に限定される
ものではないが、血液浄化に用いる場合には血液中成分
と接触した際の補体系や凝固系などへの影響を考慮する
必要性があることから、セルロース，ポリスチレン，ポ
リビニルアルコール，ポリアクリル酸エステルあるいは
これらの誘導体の多孔質担体を用いるのが好ましい。平
均細孔径は２００ないし３００００Åのものが好まし
く、３００ないし１００００Åのものがより好ましい。
また担体の形態としてはビーズ状，繊維状，膜状（中空
糸も含む）などいずれも可能である。

【００２０】またリガンドの導入の際には立体障害を小
さくすることにより吸着効率の向上させ、非特異的吸着
を抑えることを目的として、親水性スペーサーを介して
固定化することがより好ましい。親水性スペーサーとし
てはたとえば両末端をカルボキシル基，アミノ基，アル
デヒド基，エポキシ基などで置換されたポリアルキレン
オキサイドの誘導体を用いるのが好ましく、その重合度
は１０ないし１０００のものが好ましく、１００ないし
５００のものがより好ましい。

【００２１】上記のリガンドに用いるポリペプチドは比
較的安定で低分子量の物質であり、たとえば酵素や抗体
のようなタンパク質を固定化する場合と比較してその固
定化反応条件は制約が少なくなることも有利な要因の一
つである。したがって固定化方法については特に限定さ
れるものではないが、酵素や抗体を固定化する場合にし
ばしば用いられるシッフ塩基反応，エポキシ反応，カル
ボジイミド試薬などを用いた縮合反応などによる固定化
方法を適用することが好ましい。

【００２２】

【実施例】本発明におけるポリペプチドの水不溶性担体
への導入方法は上記に述べたものを基本とすれば特に限
定されるものではない。以下に実施例を用いて本発明を
説明する。

【００２３】＜実施例１＞ ＥＴＲＮＶＧＳのセルロー
スへの固定化 （１）ペプチドの合成 ＥＴＲＮＶＧＳの配列を有するペプチドの合成をペプチ
ドシンセサイザーＭｏｄｅｌ４３０Ａ（アプライドバイ
オシステムズ社製）を用いて固相合成法により行なっ
た。Ｃ末端のセリンの結合した支持体であるＰＡＭセリ
ン（ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ））０．５ｍｍｏ
ｌ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、Ｎ末
端の方向に順に上記ペプチドシンセサイザーに掲載され
ている合成プログラムにより脱保護基反応および縮合反
応を繰返してペプチド鎖を延長した。すなわちＴＦＡお
よびジクロロメタン（以下ＤＣＣと言う）により保護基
であるｔ−ブトキシカルボニル基の除去を行ない、ジク
ロロメタン（以下ＤＣＭと言う）で洗浄し、ジイソプロ
ピルエチルアミンおよびＤＣＣで中和した後、ジメチル
ホルムアミド（以下ＤＭＦと言う）で洗浄し、ＤＭＦで
縮合反応を行ない、ＤＣＭで洗浄する操作を繰返した。
アミノ酸はｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｇｌｙ，ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−
Ｖａｌ，ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｓｎ，ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ａ
ｒｇ（Ｔｏｓ），ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ），
ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）（いずれもアプラ
イドバイオシステムズ社製）の２．０ｍｍｏｌのカート
リッジを用いた。

【００２４】（２）脱保護基，ペプチド鎖の切断 上記の反応が終了した支持体１ｇにチオアニソール１ｍ
ｌ，１，２−エタンジオール０．５ｍｌを加えて１０分
間攪拌した後、氷水で冷やしながらＴＦＡ１０ｍｌを加
えて１０分間攪拌した。さらにＴＦＭＳＡ１ｍｌを加え
て室温で３０分間攪拌した。これにあらかじめ冷やして
おいたジエチルエーテルを沈殿が現れなくなるまで加え
て攪拌し、ミディアム孔のガラスフィルターを用いてジ
エチルエーテルで共洗いしながら濾過し、ＴＦＡを加え
てペプチドを溶解してエーテル中に補集した。エーテル
中のペプチドをファイン孔のガラスフィルターで濾過
し、ガラスフィルター上のペプチドを２Ｎ酢酸に溶解し
て、凍結乾燥を行ないクルードペプチドを得た。

【００２５】（３）ペプチドの精製 上記クルードペプチドを再度２Ｎ酢酸に溶解して、０．
２μｍのメンブレンフィルターで濾過した溶液をＨＰＬ
Ｃに供した。ＨＰＬＣはＭｏｄｅｌ１３０Ａシステム
（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、カラムは
逆相系のＡｑｕａｐｏｒｅ Ｐｒｅｐ−１０，Ｃ８（ア
プライドバイオシステムズ社製）を用いた。移動相は
０．１％ＴＦＡを含む水をＡ液，０．１％ＴＦＡを含む
７０％アセトニトリル／水（ｖ／ｖ）をＢ液として、Ａ
液からＢ液への濃度直線勾配により溶出した。クロマト
ピークはほぼ単一なものが得られ、相当画分を分取し
た。分取を数回繰返し、これを凍結乾燥することにより
精製ペプチドを得た。得られたペプチドはＢＩＯＩＯＮ
２０マスアナライザー（アプライドバイオシステムズ社
製）により解析して目的ペプチドが得られていることを
確認した。

【００２６】（４）ペプチドの免疫原性 得られたペプチドの免疫原性を赤血球凝集反応により確
認した。Ａｌｓｅｖｅｒ液保存ヒツジ赤血球（セダレー
ン社製）を２．５％濃度（ｖ／ｖ）になるようにＰＢＳ
（ｐＨ７．２）に浮遊させた。浮遊液１０ｍｌに０．０
０５％タンニン酸溶液を加えて３７℃で１５分間攪拌し
て反応させ、上記ＰＢＳで１５００ｒｐｍ，１０分の遠
心分離により洗浄した後１０ｍｌの生理食塩水に再度浮
遊させた。一方上記精製ペプチドを２ｍｇ／ｍｌになる
ように０．１５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．４）に溶解
し、上記浮遊液に当量混合した。３７℃で１５分間攪拌
処理を行ない、上記ＰＢＳで２回洗浄後に再度同じＰＢ
Ｓに浮遊させた。９６穴マイクロプレートに０．０１Ｍ
のＥＤＴＡ添加ベロナール緩衝液２５μｌずつを入れ、
等量のＩＴＰ患者（５種類）の血清を加えて混合し、２
倍系列で段階希釈を行なう。上記赤血球浮遊液を１滴ず
つ添加して混合し、３７℃で２時間反応させた後凝集性
を確認した。結果は後記の表１に示す通りであり、凝集
性の確認された最大希釈倍率を表示した。表１におい
て、Ｎ．Ｄ．は反応しなかったものを示す。

【００２７】

【表１】

【００２８】（５）ペプチドのセルロースへの固定化 上記ペプチドを多孔質セルロースへの固定化を行なっ
た。セルロースにはセルロファインシリーズＧＣＬ−１
０００ｍ（チッソ製）を用いた。過ヨウ素酸ナトリウム
３．５ｇを１Ｎ硫酸３００ｍｌに溶解して、ＧＣＬ−１
０００ｍ１００ｇを添加し、室温で２０時間攪拌により
反応させた。反応生成物を回収し、十分に洗浄して［ア
ルデヒド］−［セルロース］を得た。アルデヒド含量は
オキシム法により定量を行ない０．６０ｍｅｑ／ｇであ
った。

【００２９】次に分子量５０００の両末端にアミノ基を
有するポリアルキレンオキサイド（以下ＰＥＯアミンと
言う）１５ｇをｐＨ９．５の炭酸緩衝液３００ｍｌに溶
解し、上記［アルデヒド］−［セルロース］を加えて室
温で２４時間攪拌により反応させた。反応生成物を回収
し、十分に洗浄して［ＰＥＯアミン］−［セルロース］
を得た。アミノ基含量は塩酸による電位差滴定をＣＯＭ
ＴＩＴＥ１０１（平沼産業製）を用いて行ない、０．５
２ｍｅｑ／ｇであった。

【００３０】上記［ＰＥＯアミン］−［セルロース］を
ｐＨ９．５の炭酸緩衝液３００ｍｌに懸濁し、２５％グ
ルタルアルデヒド溶液３０ｍｌを加えて室温で２４時間
攪拌により反応させた。反応生成物を回収し、十分に洗
浄して［ＰＥＯアルデヒド］−［セルロース］を得た。
アルデヒド含量はオキシム法により定量を行ない０．４
７ｍｅｑ／ｇであった。

【００３１】一方上記精製ペプチド２５ｍｇをｐＨ９．
５の炭酸緩衝液５０ｍｌに溶解し、上記［ＰＥＯアルデ
ヒド］−［セルロース］５ｇを加えて、室温で２４時間
攪拌により反応させた。反応生成物を回収し、十分に洗
浄して［ペプチド］−［セルロース］を得た。ペプチド
固定化率は反応残液中の窒素含量をマイクロケルダール
法により定量することにより算出し、８４％が固定化さ
れていた。上記［ペプチド］−［セルロース］をｐＨ
９．０の炭酸緩衝液５０ｍｌに懸濁して水素化ホウ素ナ
トリウム１ｇを加えて、室温で２０時間攪拌により反応
させた。反応生成物を回収し、十分に洗浄して目的であ
る吸着材を得た。

【００３２】（６）ペプチド固定化吸着材の吸着性能評
価 上記吸着材における上記のＩＴＰ患者の血清を用いて抗
血小板抗体の吸着性能を評価した。上記吸着材を１ｍｌ
バイヤル中に採取し、上記ＩＴＰ患者の血清（５種類）
３ｍｌを加えて３７℃で３０分間振盪しながらインキュ
ベートした。懸濁液を３０００ｒｐｍで１０分間遠心分
離を行ない、上清の抗血小板抗体量をＥＬＩＳＡ法によ
り定量した（Ａｃｔａ．ｈａｅｍａｔ．，６６，２５
１，１９８１）。結果は表２に示す通りであり、インキ
ュベート前の血清での値から算出した吸着率［％］で示
した。またアルブミンの非特異的吸着に関しても、アル
ブミンＢーテストワコー（和光純薬工業製）を用いて定
量した。結果は表３に示す通りであり、表２と同様に吸
着率［％］で示した。

【００３３】

【表２】

【００３４】

【表３】

【００３５】＜実施例２＞ ＥＫＴＥＥＡＥＫＴのセル
ロースへの固定化 ＥＫＴＥＥＡＥＫＴの配列を有するペプチドの合成に関
してもＰＡＭトレオニン（ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｔｈｒ（Ｂ
ｚｌ））（アプライドバイオシステムズ社製）およびｔ
−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ），ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−
Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ），ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｌａ，ｔ−Ｂ
ｏｃ−Ｌ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）（いずれもアプライドバイ
オシステムズ社製）を用いて実施例１と同様にして実施
した。合成の終了した支持体の脱保護基，ペプチド鎖の
切断，逆相系ＨＰＬＣによる精製および同定についても
実施例１と同様にして行なった。

【００３６】得られた精製ペプチドの免疫原性について
も実施例１と同様にして確認した。結果は表１に示す通
りで、凝集性の確認された最大希釈倍率を表示した。上
記ペプチドに関しても実施例１と同様にしてセルロース
への固定化を行なった。すなわち上記精製ペプチド２５
ｍｇをｐＨ９．５の炭酸緩衝液５０ｍｌに溶解し、実施
例１で得た［ＰＥＯアルデヒド］−［セルロース］５ｇ
を加えて、室温で２４時間攪拌により反応させた。反応
生成物を回収し、十分に洗浄して［ペプチド］−［セル
ロース］を得た。ペプチド固定化率は実施例１と同様に
して求め、８０％が固定化されていた。上記［ペプチ
ド］−［セルロース］をｐＨ９．０の炭酸緩衝液５０ｍ
ｌに懸濁して水素化ホウ素ナトリウム１ｇを加えて、室
温で２０時間攪拌により反応させた。反応生成物を回収
し、十分に洗浄して目的である吸着材を得た。得られた
吸着材の性能評価に関しても実施例１と同様にして行な
った。すなわち５人のＩＴＰ患者の血清における抗血小
板抗体およびアルブミンの吸着性能を評価した。それぞ
れの吸着率を表２および表３に示した。

【００３７】＜実施例３＞ ＥＰＥＱＰＳＲＬのセルロ
ースへの固定化 ＥＰＥＱＰＳＲＬの配列を有するペプチドの合成に関し
てもＰＡＭロイシン（ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ）（アプ
ライドバイオシステムズ社製）およびｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−
Ａｒｇ（Ｔｏｓ），ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｓｅｒ（Ｂｚ
ｌ），ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏ，ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｇｌ
ｎ，ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）（いずれもア
プライドバイオシステムズ社製）を用いて実施例１と同
様にして実施した。合成の終了した支持体の脱保護基，
ペプチド鎖の切断，逆相系ＨＰＬＣによる精製および同
定についても実施例１と同様にして行なった。

【００３８】得られた精製ペプチドの免疫原性について
も実施例１と同様にして行なった。結果は表１に示す通
りで、凝集性の確認された最大希釈倍率を表示した。上
記ペプチドに関しても実施例１と同様にしてセルロース
への固定化を行なった。すなわち上記精製ペプチド２５
ｍｇをｐＨ９．５の炭酸緩衝液５０ｍｌに溶解し、実施
例１で得た［ＰＥＯアルデヒド］−［セルロース］５ｇ
を加えて、室温で２４時間攪拌により反応させた。反応
生成物を回収し、十分に洗浄して［ペプチド］−［セル
ロース］を得た。ペプチド固定化率は実施例１と同様に
して求め、８８％が固定化されていた。上記［ペプチ
ド］−［セルロース］をｐＨ９．０の炭酸緩衝液５０ｍ
ｌに懸濁して水素化ホウ素ナトリウム１ｇを加えて、室
温で２０時間攪拌により反応させた。反応生成物を回収
し、十分に洗浄して目的である吸着材を得た。得られた
吸着材の性能評価に関しても実施例１と同様にして行な
った。すなわち５人のＩＴＰ患者の血清における抗血小
板抗体およびアルブミンの吸着性能を評価した。それぞ
れの吸着率を表２および表３に示した。

【００３９】

【比較例】

＜比較例１＞ ＬＤＳＹＹＱのセルロースへの固定化 図１における３０１ないし３０６番目の領域に相当する
ＬＤＳＹＹＱの配列を有するペプチドの合成に関して、
ＰＡＭグルタミン（ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｇｌｎ）（アプラ
イドバイオシステムズ社製）およびｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｔ
ｙｒ（Ｂｒ−Ｚ），ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）
ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ），ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ
−Ｌｅｕ・Ｈ₂Ｏ（いずれもアプライドバイオシステム
ズ社製）を用いて実施例１と同様にして実施した。この
ペプチド領域も親水性の比較的大きな領域である。合成
の終了した支持体の脱保護基，ペプチド鎖の切断，逆相
系ＨＰＬＣによる精製および同定についても実施例１と
同様にして行なった。

【００４０】得られた精製ペプチドの免疫原性について
も実施例１と同様にして行なった。結果は表１に示す通
りで、凝集性の確認された最大希釈倍率を表示した。上
記ペプチドに関しても実施例１と同様にしてセルロース
への固定化を行なった。すなわち上記精製ペプチド２５
ｍｇをｐＨ９．５の炭酸緩衝液５０ｍｌに溶解し、実施
例１で得た［ＰＥＯアルデヒド］−［セルロース］５ｇ
を加えて、室温で２４時間攪拌により反応させた。反応
生成物を回収し、十分に洗浄して［ペプチド］−［セル
ロース］を得た。ペプチド固定化率は実施例１と同様に
して求め、８５％が固定化されていた。上記［ペプチ
ド］−［セルロース］をｐＨ９．０の炭酸緩衝液５０ｍ
ｌに懸濁して水素化ホウ素ナトリウム１ｇを加えて、室
温で２０時間攪拌により反応させた。反応生成物を回収
し、十分に洗浄して目的である吸着材を得た。得られた
吸着材の性能評価に関しても実施例１と同様にして行な
った。すなわち５人のＩＴＰ患者の血清における抗血小
板抗体およびアルブミンの吸着性能を評価した。それぞ
れの吸着率を表２および表３に示した。

【００４１】

【発明の効果】本発明により血液中の抗血小板抗体と効
果的に結合させることが可能であり、重症なＩＴＰ患者
の治療に適用が可能である。本発明における抗血小板抗
体吸着材を用いた血液浄化療法は副作用もなく安全であ
り、保存による安定性の面でも優れている。またオート
クレーブ処理による蒸気滅菌を行なってもリガンドとし
ての活性が低下することがほとんどない点も医療機材と
して有利である。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ＧＰ２ｂ／ＧＰ３ａの複合体の模式
図。

【図２】図２は、ＧＰ２ｂの親水性プロフィールを示す
図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 田中 昌和 滋賀県大津市堅田二丁目１番１号 東洋紡 績株式会社総合研究所内

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記のいずれかの特定アミノ酸配列のう
   ち少なくとも１種類を連鎖の中に含有し、かつ連鎖のう
   ちアミノ酸の総和が７０以下であることを特徴とするポ
   リペプチド。 （１）Glu Thr Arg Asn Val Gly Ser （２）Glu Lys Thr Glu Glu Ala Glu Lys Thr （３）Glu Pro Glu Gln Pro Ser Arg Leu
2. 【請求項２】 請求項１記載のポリペプチドの少なくと
   も１種類を水不溶性担体に固定化したことを特徴とする
   抗血小板抗体吸着材。