CZ2004142A3

CZ2004142A3 - Název neuveden

Info

Publication number: CZ2004142A3
Application number: CZ2004142A
Authority: CZ
Inventors: Balzariniájanám@Ár@Áprof; Deáclercqáerikádesireáaliceáprof; Holýáantonínáprof
Original assignee: Ústaváorganickéáchemieáaábiochemieáaváčr; Regaástichtingáv@Áz@Áw
Priority date: 2001-06-29
Filing date: 2002-06-28
Publication date: 2004-05-12
Also published as: CN1533397A; EP1406911B1; ZA200400236B; KR20040027521A; NO20131091L; HU230519B1; JP2005511490A; PL366852A1; IL159494A; NZ530685A; BRPI0210746B1; AP2004002953A0; AU2002315625B2; NO20035797L; HUP0400345A2; US20050038058A1; CA2452036A1; ES2564144T3; CA2452036C; JP4545434B2

Description

Oblast techniky

Vynález se týká nových derivátů pyrimidinu nesoucích fosfonátovou skupinu, které vykazují antivirové a cytostatické účinky, způsobů jejich přípravy, použití těchto derivátů jako léčiva a farmaceutické kompozice obsahující tyto deriváty jako účinnou látku.

Dosavadní stav techniky

Analogy acyklických nukleotidů, obsahující fosfonátové skupiny, jsou popsány například v amerických patentech číslo 4,659,825, 4,808,716, 4,724,233, 5,142,051, 5,302,585, 5,208,221, 5,352,786, 5,356,886, v evropských dokumentech číslo 269,947, 481,214, 630,381, 369,409, 454,427, 468,119, 434,450, 618,214 a 398,231 a v mezinárodních přihláškách vynálezů číslo WO 95/07920, WO 94/03467 a WO 96/33200. Tyto patenty popisují sloučeniny, v nichž je fosfonátová skupina vázána k purinové nebo pyrimidinové bázi 2-(methoxy)propyl skupinou, 2-(methoxy)ethyl skupinou, 2-methoxy-3-hydroxypropyl skupinou nebo 2-methoxy3-fluorpropyl skupinou, obecně v poloze 1 nebo 9 pyrimidinové nebo purinové báze. Tyto sloučeniny jsou známy jako PMP, PME, HPMP a FPMP puriny nebo pyrimidiny a vykazují antivirové a cytostatické účinky.

Daluge et al. (34th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 4.-7.10.1994) popisuje deriváty carboviru, v nichž purin je substituován v poloze 6 cyklopropylamino, N-cyklopropyl-N-methylamino nebo N-aziridinylovou skupinou.

Cihlař et al. v Antimicriobial Agents and Chemothery 39(1):117-124 (1995) popisuje N⁶-aminohexyl-PMED AP.

Holý et al. v ACS Symp. Ser. 401:57-71 (1989) a v Kem. Ind. 38(10):457-462 (1989) popisuje antivirové účinky některých N⁶ substituovaných analogů nukleotidů.

Další fosfonátem substituované analogy pyrimidinů jsou popsány v publikacích Holý et al.: Collect. Czech. Chem. Commun. 64:242-256 (1999), Eger et al.: J. Med. Chem. 37:30573061 (1994), Wormstadt et al.: J. Heterocyclic Chem. 37:1187-1191 (2000) a Franchetti et al.: Nucleosides & Nucleotides 14 (3-5):607-610 (1995). Poslední tři jmenované publikace popisují 2,4-disubstituované pyrimidiny, mající postranní řetězec obsahující fosfonát vázaný na 6-N substituent.

• · · · • ·

Cílem předloženého vynálezu je poskytnout nové sloučeniny mající antivirové účinky, především proti RNA a DNA virům jako HIV, HBV nebo HSV.

Dalším cílem tohoto vynálezu jsou sloučeniny pro přípravu iontovýměnných nosičů nebo chirálních médií.

Cílem předmětného vynálezu jsou dále meziprodukty a způsoby přípravy takovýchto sloučenin.

Všechny tyto a další cíle budou dále osvětleny v popisu vynálezu.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu jsou sloučeniny obecného vzorce (I),

(I) kde

Ri je H, amino nebo methylsulfanyl;

R₂ je H, methyl, halogen, -N(R₅)₂, hydroxy, chráněná hydroxy skupina nebo skupina obecného vzorce (Ia)

P(O)(Z)₂ (Ia)

R₃ je nezávisle H, methyl, hydroxymethyl, halogenmethyl nebo chráněný hydroxymethyl;

R4 je H nebo halogen;

X je nezávisle atom kyslíku, síry nebo vazba;

Z je nezávisle hydroxy, ester nebo amid;

R₅ je nezávisle H, Ci-Cg alkyl nebo chránící skupina; a * označuje chirální uhlíkový atom;

• 0 • 0 • · · · 0 · · • · 0 · · · 0 · · · • · e e e · · · ·

0 00 0 0 0 · 00000 0 0 000 «00 00000 00 000 ·· * a jejich soli a solváty.

Předmětem předloženého vynálezu je dále způsob přípravy sloučenin obecného vzorce (I),

kde

Ri, R₂, R3, R4, X, Z, R₅ a * mají význam popsaný výše; jehož podstata spočívá v tom, že se (a) sloučeniny obecného vzorce (II),

(Π) kde

Ri a R5 mají význam popsaný výše,

R₂ je H, methyl, halogen, -N(Rs)₂, hydroxy nebo chráněná hydroxy skupina; a X je atom kyslíku nebo síry;

uvedou do reakce se sloučeninou obecného vzorce (III) $

Y-CH₂CH(R₃)-O-CH₂P(O)(Z)₂ (III) kde

Z je ester nebo amid;

* označuje chirální uhlíkový atom;

R₃ je H, methyl, halogenmethyl nebo chráněný hydroxymethyl; a Y je odstupující skupina v dipolárním aprotickém rozpouštědle v přítomnosti báze za vzniku sloučeniny obecného vzorce (I), kde Z je ester nebo amid, (b) jeden nebo oba substituenty Z mohou být převedeny za vzniku sloučeniny obecného vzorce (I), kde alespoň jedna skupina Z je hydroxy.

• · · · · · · · • · · 4 4

4 · · • 4 4 4 4

4· · ·

44444 44 4

Dalším výzankem tohoto vynálezu je způsob přípravy sloučenin obecného vzorce (I), kde

Ri je H, amino nebo methylsulfanyl;

R₂ je -N(R5)2;

R3 je nezávisle H, methyl, hydroxymethyl, halogenmethyl nebo chráněný hydroxymethyl;

R4 je H nebo halogen;

X je atom kyslíku nebo síry;

Z je nezávisle hydroxy, ester nebo amid;

R₅ je nezávisle H, Cj-Cg alkyl nebo chránící skupina; a * označuje chirální atom uhlíku jehož podstata spočívá v tom, že se sloučeniny obecného vzorce (IV),

kde

R₃ je H, methyl, halogenmethyl nebo chráněný hydroxymethyl;

X je atom kyslíku nebo síry; a Z je amid nebo ester;

uvedou do reakce s N(R₅)₂. Jeden nebo oba substituenty Z mohou být převedeny za vzniku sloučeniny obecného vzorce (I), kde alespoň jedna skupina Z je hydroxy.

Dalším předmětem tohoto vynálezu je způsob přípravy sloučenin obecného vzorce (V), n(R₅)₂

H₂N

P(O)(Z)₂ r₃ (V) kde

R₃ je H, methyl, hydroxymethyl, halogenmethyl nebo chráněný hydroxymethyl;

• ·· 9 9 9 9 ·· · • · · 9 9 9 9 · · · • · 9 9 9 9999 • 9 99 9 9 99 99999

9 999 999

99999 99 999 *9 ·

R₅ je nezávisle H, Ci-Cg alkyl nebo chránící skupina; X je atom kyslíku nebo síry;

Z je nezávisle hydroxy, ester nebo amid; a * označuje chirálni uhlíkový atom který spočívá v reakci sloučeniny (IVa)

(IVa) s N(Rj)2 v bezvodém rozpouštědle, alkalickým hydroxidem nebo alkalickým uhličitanem ve vodném roztoku a Z může být převedeno za vzniku sloučeniny obecného vzorce (V), kde jedna nebo obě skupiny Z jsou hydroxy.

Dalším předmětem vynálezu je způsob přípravy sloučeniny obecného vzorce (VI),

P(O)(Z)₂ (VI) kde

Ri je H, amino, methylsulfanyl;

R₃ je H, methyl, hydroxymethyl, halogenmethyl nebo chráněný hydroxymethyl; Z je nezávisle hydroxy, ester nebo amid; a * označuje chirálni uhlíkový atom, který spočívá v reakci sloučeniny obecného vzorce (VII),

(VII) kde

Ri je H, amino nebo methylsulfanyl se sloučeninou obecného vzorce (VIII), *

HOCH₂CH(R₃)OCH₂P(O)(Z) ₂ (VIII) kde

Z je amid nebo ester v přítomnosti báze. Jeden nebo oba substituenty Z mohou být převedeny na hydroxyskupinu.

Dalším předmětem tohoto vynálezu je způsob přípravy sloučenin obecného vzorce

(XIII)

Ri je H, amino nebo methylsulfanyl;

* je chirální uhlíkový atom;

R₂ je H, chlor, hydroxy nebo amino;

R₃ je H, methyl, halogenmethyl nebo hydroxymethyl; a Z je amid nebo ester;

zahrnující (a) reakci sloučeniny obecného vzorce (IX),

kde

Ri je H, amino nebo methylsulfanyl; R₂ je H, chlor nebo amino;

(X) se sloučeninou obecného vzorce (X), kde

R3 je H, methyl, hydroxymethyl, halogenmethyl nebo chráněný hydroxymethyl;

* je chirální uhlíkový atom;

Rg je hydroxy nebo chráněná hydroxy skupina;

nebo R3 a Rg jsou spojeny cyklickou acetalovou nebo ketalovou chránící skupinou v přítomnosti báze bez rozpouštědla nebo v aprotickém rozpouštědle za vzniku sloučeniny obecného vzorce (XI),

kde

Ri je H, amino nebo methylsulfanyl;

* je chirální uhlíkový atom;

R₂ je H, chlor nebo amino; a

R3 je H, methyl, halogenmethyl nebo chráněný hydroxymethyl; a (b) reakci sloučeniny (XI) se sloučeninou obecného vzorce (XII),

Y-CH₂P(O)(OZ)₂ (XII) kde

Y je odstupující skupina;

Z je amid nebo ester v přítomnosti báze v dimethylformamidu nebo tetrahydrofuranu za vzniku sloučeniny obecného vzorce (XIII); a (c) případnou hydrolýzu substituentu Z ve sloučenině (XIII) za vzniku sloučeniny obecného vzorce (VI), kde jeden nebo oba substituenty Z jsou hydroxy skupiny a X je atom kyslíku.

• · • · • · φ · * φ φ φ φ • · · · • φ · « · · ·

Dalším předmětem tohoto vynálezu je způsob přípravy sloučenin obecného vzorce (I), kde

Ri je H, amino nebo methylsulfanyl;

R3 je H, methyl, hydroxymethyl, halogenmethyl nebo chráněný hydroxymethyl;

R4 je halogen;

X je atom kyslíku;

Z je nezávisle hydroxy, ester nebo amid; a * označuje chirální uhlíkový atom; spočívající v reakci sloučeniny obecného vzorce (VI), kde

Ri je H, amino nebo methylsulfanyl;

R₃ je H, methyl, hydroxymethyl, halogenmethyl nebo chráněný hydroxymethyl;

Z je ester; a * označuje chirální uhlíkový atom s elementárním halogenem v inertním rozpouštědle za vzniku sloučeniny obecného vzorce (I). Jeden nebo oba substituenty Z mohou být převedeny na hydroxy skupiny.

Předložený vynález dále zahrnuje farmaceutický přípravek obsahující farmaceuticky přijatelný excipient a sloučeninu podle obecného vzorce (I) jako účinnou látku. Dalším význakem předloženého vynálezu je použití sloučenin podle vzorce (I) při léčbě virových infekcí, zahrnující podání terapeuticky účinného množství této sloučeniny pacientovi potřebujícímu takovouto léčbu. Virovou infekcí může být infekce způsobena virem, který je DNA virem. Virovou infekcí může být infekce způsobena retro virem nebo hepadnavirem.

V tomto popisu, pokud není uvedeno jinak, alkyl znamená rozvětvený, lineární nebo cyklický nasycený uhlovodík a zahrnuje methyl, ethyl, propyl, cyklopropyl, cyklobutyl, isopropyl, η-, sec-, iso- a tert-butyl, pentyl, isopentyl, 1 methylbutyl, 1-ethylpropyl, neopentyl at-pentyl.

Halogen obvykle znamená chlor, ale zahrnuje i brom, fluor nebo jod.

Ri obvykle znamená H nebo amino, ale může být též methylsulfanyl (tzn. methylthio).

R₂ je obecně hydroxy nebo -N(R₅)₂, kde R₅ je nezávisle H nebo C_rC₈ alkyl.

R3 je obvykle H nebo methyl, ale může být i hydroxymethyl (obvykle v (S) konfiguraci, bez obsahu látky v (R) konfiguraci) nebo halogenmethyl, a, pokud se jedná o methyl nebo halogenmethyl, přednostně je v (2R) konfiguraci bez obsahu látky v (2S) konfiguraci. Halogenmethyl je obvykle fluormethyl.

999999 9 9 9 9 9 9 • 9 9 9999 9 · 9

9 99 9 9999

9 99 9 9 99 99999

9 999 999

99999 99 999 99 9

R5 je obecně H, ale může být i nižší (C1-C3) alkyl (jedna nebo obě možnosti).

Jak je popsáno dále, vhodné Z je jakýkoliv ester nebo amid známý pro použití s fosfonáty nukleotidů. Pokud Z je ester, má strukturu OR7. R7 je ve sloučeninách majících antivirovou aktivitu samy o sobě obvykle H (čili Z je hydroxy), ačkoliv jiné R7 esterové skupiny popsané níže jsou vhodné pro použití jako chránící skupiny nebo pro-substituenty v prekurzorech účinných látek.

X je přednostně atom kyslíku.

Z je ester nebo amid, pokud je žádoucí chránit sloučeniny podle tohoto vynálezu proti nežádoucím reakcím nebo když je potřeba in vivo prekurzor sloučeniny podle tohoto vynálezu. Jinak Z je OH.

Estery nebo amidy jsou užitečné jako chráněné meziprodukty v syntéze sloučenin podle tohoto vynálezu, kde Z = OH. V tomto provedení vynálezu nemusí být výběr esteru nebo amidu důležitý, závisí na povaze použité reakce. Je pouze potřeba, aby substituent Z nebyl odstraněn dříve než v kroku, kde je odchránění žádoucí. Pokud toto není zřejmé z teoretických základů, může to být snadno určeno jednoduchými experimenty. Například konkrétně estery jsou používány k chránění hydroxy skupin fosfonátu proti alkylaci.

Když Z slouží jako substituent prekurzoru účinné látky, ester nebo amid je z fosfonátu odstraněn in vivo. Vhodné prekurzorové estery nebo amidáty mohou být vybírány na základě substrátové specifity esteráz a/nebo karboxypeptidáz, jejichž výskyt je předpokládán v buňkách, kde je hydrolýza prekurzoru žádoucí. Tam, kde je specifita těchto enzymů neznámá, bude třeba testovat mnoho analogů nukleotidů podle tohoto vynálezu, než bude nalezena žádoucí substrátová specifícita. Ta se projeví výskytem volného fosfonátu nebo antivirovou aktivitou. Obecně jsou vybírány sloučeniny, které (i) nejsou hydro lyžovány nebo jsou hydro lyžovány velmi pomalu v tenkém střevě, (ii) mohou procházet střevní a buněčnou stěnou a (iii) jsou hydrolyzovány v buněčné cytoplazmě a/nebo v krevním oběhu.Testy na buňkách jednotlivých tkání jsou užívány k identifikaci prekurzorů, které jsou uvolňovány v orgánech citlivých k cílové virové nebo mikrobiální infekci, například pro játra jsou to prekurzory schopné hydrolýzy v játrech. Jiné infekce, například CMV nebo HIV, mohou být léčeny prekurzorem, který je hydrolyzován ve stejné míře a do stejného stupně ve všech tkáních. Vhodné k tomuto účelu jsou běžně v oboru známé zkoušky, včetně testů stability intestinálního lumenu, permeace buněk, stability jaterního homogenátu a stability plazmy. Tyto zkoušky jsou používány ke stanovení charakteristik biologické dostupnosti těchto prekurzorů.

Příklady esterových a amidových skupin v substituentu Z jsou v dokumentech WO 95/07920, WO 98/04569 a EP 481214 Al. Kterákoliv esterová nebo amidová skupina popsaná « · « · 9 9 · * • · · * • 9 9 9 9

9 9 9

99999 99 9 v těchto publikacích (a v pořadí vhodnosti podaném v těchto publikacích) může zde být použita jako skupina Z.

Obvykle jsou oba substituenty Z hydroxyly nebo oba jsou estery a/nebo amidy, tzn. 2 nebo žádná skupina Z je hydroxy. Obecně, pokud žádné Z není OH, pak jedno Z je amid a jedno je ester. Preferovány jsou amidy s v přírodě se vyskytujícími aminokyselinami a estery obsahující fenyl. Volné karboxylové skupiny aminokyselin ve skupinách Z jsou obvykle esterifikovány Ci-C₈ alkyly.

Obecně je Z hydroxy ve sloučeninách užívaných přímo pro antivirové účely, tj. tyto sloučeniny jsou užívány bez jakýchkoliv požadavků na hydrolýzu amidu nebo esteru in vivo.

Chránící skupiny pro hydroxyl zahrnují acetaly, ketaly nebo Ci-C₈ alkyly. Typická chránící skupina pro amino je trityl. Jsou známy i další běžné chránící skupiny (Greene et al.: Protecting Groups in Organic Synthesis, 2^nd Ed. 1991, str. 10-142 a 309-405).

Sloučeniny podle vynálezu je možno použít pro léčení virových onemocnění nebo jako meziprodukty v přípravě takových sloučenin. Příklady virových infekcí, které mohou být léčeny nebo testovány na citlivost vůči sloučeninám podle tohoto vynálezu, zahrnují infekce způsobené DNA nebo RNA viry jako herpesviry (CMV, HSV 1, HSV 2, EBV, varicella zoster virus (VZV), hovězí herpesvirus typ 1, koňský herpesvirus typ 1, HHV-6, papillomaviry (HPV typy 1-55 včetně karcinogenního HPV), flaviviry (včetně viru žluté horečky, africké prasečí horečky a viru japonské encefalitidy), togaviry (včetně viru venezuelské koňské encefalomyelitidy), viry chřipky (typy A-C), retroviry (HIV-1, HIV-2, HTLV-I, HTLV-II, SIV, FeLV, FIV, MoMSV), adenoviry (typy 1-8), poxviry (vaccinia), enteroviry (polioviry typu 1-3, Coxsackie, hepatitis A a ECHO virus), viry gastroenteritidy (Norwalkovy viry, rotaviry), hantaviry (Hantaan virus), polyomavirus, papovaviry, rhinoviry, parainfluenza viry typu 1-4, virus vztekliny, respirační syncyciální virus (RSV), viry žloutenky A, B, C a E a podobně.

Výhodné sloučeniny podle tohoto vynálezu pro léčbu herpes virů, hepadna virů a HIV jsou ty, ve kterých Ri = NH₂, R₂ = NH₂ nebo OH, X = O a R3 = H nebo methyl. Další antivirové účinky sloučenin podle tohoto vynálezu jsou stanovovány rutinními zkouškami antivirové aktivity za použití testů inhibice enzymů, testů na tkáňových kulturách, pokusných zvířatech a podobně, jak je známo odborníkovi v oboru.

Nové sloučeniny podle tohoto vynálezu mohou být používány samy o sobě nebo jako meziprodukty v přípravě polymerů majících širokou škálu diagnostických, terapeutických a průmyslových užití.

Sloučeniny podle tohoto vynálezu jsou vhodné jako meziprodukty v přípravě afinitních absorpčních nosičů nesoucích skupiny mající vlastnosti vhodné k absorpci sloučenin ze • · 9 9 9 9 •9 999« • 9 «

999 99 « znečištěných směsí. Tyto nosiče jsou připravovány a užívány stejným způsobem jako jiné iontovýměnné nosiče obsahující stejné substituenty, např. fosfonáty nebo aminoskupiny. Například fosfonátové skupiny sloučenin podle tohoto vynálezu jsou kovalentně vázány na nerozpustnou matrici a volné Ri aminoskupiny na heterocyklické bázi slouží jako iontovýměnná místa. Nebo naopak, aminoskupina heterocyklické báze je vázána k matrici a volnou fosfonátovou skupinu je pak možno použít k chromatografické absorpci kladně nabitých molekul. Další imobilizovaná uspořádání sloučenin podle tohoto vynálezu jsou užitečná při čištění proteinů, např. enzymů, ke kterým se sloučeniny podle tohoto vynálezu mohou vázat, např. transportních proteinů (viz Cihlař, výše).

Vhodné metody včlenění sloučenin podle tohoto vynálezu do nerozpustných matric, např. polymerních nosičů, jsou známé odborníkovi v oboru. Sloučeniny podle tohoto vynálezu mohou být imobilizovány kovalentním zesítěním pyrimidinových amino nebo hydroxy skupin na nerozpustné matrici. Podobně jsou sloučeniny podle tohoto vynálezu včleněny do nerozpustných nosičů vazbou hydroxylu fosfonátové skupiny nebo hydroxymethylu R3 substituentu k matrici nebo nosiči za použití již známých činidel schopných zprostředkovat kovalentní vazbu. Vhodné metody vazby jsou popsány v Cihlař et al. (viz výše).

Sloučeniny podle tohoto vynálezu mohou být také použity jako siťovadla nebo spacery při přípravě afinitních absorpčních matric (v protikladu k jejich funkci afinitních složek popsaných v předchozích odstavcích). Tyto sloučeniny obsahují množství funkčních skupin vhodných jako vazební místa pro síťování látek. Je běžné vázat afmitní činidla, např. hormony, peptidy, protilátky, enzymy, léčiva a podobné, k nerozpustným substrátům. Tato nerozpustná činidla jsou pak používána známým způsobem k absorpci látek z vyráběných přípravků, diagnostických vzorků a dalších směsí. Podobně jsou imobilizované enzymy používány ke katalytickým reakcím s následnou snadnou separací enzymu od produktu.

V některých provedeních není nutné, aby sloučeniny podle tohoto vynálezu byly vázány na nerozpustné nosiče. Například mohou být používány k vazbě analytů na detekovatelné skupiny při přípravě rozpustných diagnostických činidel.

Způsoby zesítěni za použití substituentů sloučenin podle tohoto vynálezu jsou dobře známé. Například kyselina fosfonová tvoří estery s alkoholy nebo amidy s aminy. Podobně amino, halogen, hydroxy a další reaktivní centra na pyrimidinu jsou také vhodná pro vazbu. Samozřejmě je při přípravě zesítěného činidla vhodné chránit reaktivní skupiny tam, kde je to nezbytné. Sloučeniny podle tohoto vynálezu jsou tedy užívány k zesíťování vazbou fosfonové skupiny na hydroxy nebo amino skupinu vazebného partnera a kovalentně vázány k dalšímu vazebnému partnerovi dalším svým substituentem. Například první vazebný partner, jako např.

steroidní hormon, je esterově vázán k fosfonové skupině sloučeniny podle tohoto vynálezu, a tento konjugát je dále vázán R₃ hydroxymethylem k Sepharose aktivované bromkyanem, takže je vytvořen imobilizovaný steroid. Je známo mnoho jiných postupů konjugace, viz např. Maggio: Enzyme-Immunoassay (CRC, 1988, str. 71-135) a reference zde citované.

Farmaceutické formulace

Sloučeniny podle tohoto vynálezu a jejich fyziologicky přijatelné soli a solváty (dále souhrnně nazývány účinné látky) mohou být podávány v jakékoliv formě odpovídající léčenému stavu. Látky a formulace by přednostně měly být sterilní.

Účinné látky se podávají ve formě farmaceutických formulací pro použití v humánní i veterinární medicíně, které obsahují alespoň jednu účinnou látku, jak je popsána výše, spolu s jedním nebo více vhodnými nosiči a případně s dalšími léčebnými složkami. Nosič(e) musí být „přijatelné“ ve smyslu kompatibility s ostatními složkami formulace a neškodnosti pacientovi.

Formulace jsou obvykle podávány ve formě jednotlivých dávek a mohou být připravovány jakoukoliv metodou známou v oboru farmacie. Obecně jsou formulace připravovány rovnoměrným důkladným smísením účinné látky s kapalnými nosiči nebo jemně rozetřenými pevnými nosiči nebo obojím, a pak, je-li to třeba, tvarováním produktu.

Formulace podle tohoto vynálezu vhodné pro orální užití mohou být podávány jako jednotlivé dávky v podobě kapslí, tobolek nebo tablet obsahujících stanovené množství účinné látky, jako prášek či granule, jako roztok nebo suspenze ve vodném nebo nevodném médiu, nebo jako emulze oleje ve vodě nebo vody v oleji. Účinná látka může být podána také jako bolus, tinktura nebo pasta.

Na zevní infekce oka nebo jiných vnějších tkání, např. úst a pokožky, jsou s výhodou aplikovány topické masti nebo krémy obsahující účinnou látku (látky) v množství např. 0,075 až 20 % hm. (včetně obsahu účinných látek v rozmezí 0,1 až 20 % hm. s přírůstky po 0,1 % hm., např. 0,6 % hm., 0,7 % hm. atd.), výhodněji 0,2 až 15 % hm. a nej výhodněji 0,5 až 10 % hm. Pokud je účinná látka podávána v masti, je formulována s parafmickým nebo s vodou mísitelným základem. V jiných případech může být účinná látka podávána v krému nebo v krémovém základu typu olej ve vodě.

Pokud je to žádoucí, může vodná fáze krémového základu obsahovat například nejméně 30 % hm. vícesytného alkoholu, tzn. alkoholu majícího dvě nebo více hydroxy skupin jako je propylenglykol, butan-l,3-diol, mannitol, sorbitol, glycerol a polyethylenglykol (včetně PEG 400) a jejich směsi. Topické formulace by měly obsahovat látku usnadňující absorpci nebo φ φ φφφφ φ φ • · φ · · · φ φ φ φ φ φ φφφ φ φ · φ φφφφφ φφ φ penetraci účinné látky kůží či jinými oblastmi těla. Příklady takových penetračních činidel zahrnují dimethylsulfoxid a příbuzné látky.

Olejová fáze emulzí podle tohoto vynálezu může být tvořena známým způsobem ze známých složek. Tato fáze může obsahovat jen emulgátor nebo směs nejméně jednoho emulgátoru s tukem nebo olejem nebo s obojím. S výhodou je používán hydrofilní emulgátor spolu s lipofilním emulgátorem, který slouží jako stabilizátor. Je také výhodné použít olej i tuk. Stabilizátory emulzí vhodné pro použití ve formulacích podle tohoto vynálezu zahrnují Tween® 60, Spán® 80, cetostearylalkohol, benzylalkohol, myristylalkohol, glyceryl monostearát a laurylsulfát sodný. Vhodné oleje nebo tuky zahrnují lineární nebo rozvětvené řetězce, alkyl mono- nebo diestery jako např. diisoadipát, isocetyl stearát, propylenglykoldiester kokosových mastných kyselin, isopropyl myristát, decyl oleát, isopropyl palmitát, butyl stearát nebo 2ethylhexyl palmitát. Tyto estery mohou být podle požadovaných vlastností použity samostatně nebo v kombinaci. V jiných případech mohou být použity vysokotající lipidy jako například bílý měkký parafin a/nebo kapalný parafin nebo jiné minerální oleje.

Formulace vhodné pro topické podávání do oka též zahrnují oční kapky, kde je účinná látka rozpuštěna nebo suspendována ve vhodném nosiči, s výhodou ve vodném rozpouštědle. Účinná látka je obvykle podávána v takovýchto formulacích v koncentracích 0,01 až 20 % hm. Formulace vhodné pro nasální užití, kde nosič je pevný, zahrnují hrubý prášek o velikosti částic např. v rozsahu 20 až 500 mikronů (včetně velikostí částic v rozsahu 20 až 500 mikronů po přírůstcích 5 mikronů, jako např. 30 mikronů, 35 mikronů atd.), které jsou podávány prudkým vdechnutím nosem ze zásobníku prášku. Vhodné formulace s kapalným nosičem pro podávání např. jako nosní sprej nebo nosní kapky zahrnují vodné či olejové roztoky účinné látky. Formulace vhodné pro užití jako aerosol mohou být připravovány běžnými metodami a mohou být podávány s dalšími léčivy, jako např. pentamidinem k léčbě pneumocystické pneumonie.

Formulace vhodné pro vaginální užití mohou být podávány jako pesary, tampony, krémy, gely, pasty, pěny nebo spreje, obsahující kromě účinné látky vhodné nosiče.

Formulace vhodné pro parenterální užití zahrnují vodné nebo nevodné sterilní injekční roztoky, které mohou dále obsahovat antioxidanty, pufry, bakteriostatika a další rozpuštěné látky, které udržují roztok isotonický s krví pacienta; a vodné nebo nevodné sterilní suspenze, které mohou obsahovat suspendující a zahušťující činidla. Formulace mohou být připravovány v baleních obsahujících jednu nebo více dávek, např. zatavených ampulích a lahvičkách, a mohou být skladovány v lyofilizované podobě vyžadující pouze přidání kapalného sterilního nosiče, např. vody, před vlastním použitím. Improvizované injekční roztoky a suspenze mohou

být připraveny ze sterilních prášků, granulí a tablet, popsaných výše. Jednotkové formulace nejlépe obsahují denní dávku či část denní dávky účinné látky, jak popsáno výše.

Předmětem tohoto vynálezu jsou dále směsi pro veterinární užití obsahující nejméně jednu účinnou látku (viz výše) spolu s vhodným veterinárním nosičem. Veterinární nosiče jsou látky k podávání formulace a mohou to být pevné, kapalné nebo plynné látky, které jsou samy o sobě inertní či přijatelné ve veterinární praxi a jsou slučitelné s účinnou látkou. Tyto veterinární směsi mohou být podávány orálně, parenterálně nebo jinou vhodnou cestou.

Sloučeniny podle tohoto vynálezu mohou být také užity ve farmaceutických formulacích s kontrolovaným uvolňováním účinné látky, obsahujících alespoň jednu účinnou látku, z nichž je její uvolňování kontrolované a regulované tak, aby umožňovalo méně časté podávání nebo zlepšení farmakokinetiky nebo toxikologického profilu dané látky. Příklady systému s kontrolovaným uvolňováním účinné látky jsou implantát popsaný ve WO 92/14450 nebo US 5,098,443 nebo matrice v US 4,740,365 nebo US 5,141,752. Známo je i mnoho dalších systémů vhodných pro použití se sloučeninami podle tohoto vynálezu.

Použití v léčbě

Vhodné cesty podávání zahrnují orální, rektální, nasální, topickou (včetně okulární, bukální a sublinguální), vaginální a parenterální (včetně subkutánní, intramuskulární, intravitreózní, intravenózní, intradermální, intrathekální a epidurální). Upřednostňovaná cesta podání záleží na stavu pacienta, toxicitě sloučeniny, místě infekce a dalších okolnostech známých lékaři.

Pro každou z výše vyjmenovaných indikací záleží dávka účinné látky na mnoha faktorech včetně stupně onemocnění, infekčního agens, zdaje účinná látka podávána profylakticky či léčebně, na místě infekce, patologii a dalších faktorech podle úvahy lékaře či veterináře. Vhodná dávka je, podle úvahy lékaře, v rozsahu podobném jako u analogických methoxyfosfonátů (viz výše) s tím, že je třeba vzít v úvahu rozdíly účinnosti získané testováním in vitro, obvykle 0,1 až 250 mg na kg tělesné váhy pacienta pro jednotlivou dávku (včetně dávek v rozsahu 0,1 až 400 mg/kg/dávka po přírůstcích 0,5 mg/kg/dávka jako např. 2,5 mg/kg/dávka, 3,0 mg/kg/dávka, 3,5 mg/kg/dávka atd.), s výhodou 0,5 až 50 mg na kg tělesné váhy pro jednotlivou dávku, nejvýhodněji 1 až 300 mg na kg tělesné váhy pro jednotlivou dávku.

Požadovaná dávka je podávána v příslušných intervalech ve formě jednotkových dávek, obvykle s vysokou počáteční dávkou a nižšími, méně často podávanými udržovacími dávkami. Účinné látky mohou být také užívány profylakticky, např. podáváním 1 až 7 dní před virovou

9999 • 9 9 9 9 9 • 9 9 9 • 9 9 9 9

9 9 ·

99999 99 9 infekcí. HPV tumory nebo výrůstky a léze herpesu jsou často léčeny topicky, buď lokální injekcí nebo topickými gely, mastmi atd.

Sloučeniny podle předloženého vynálezu mohou být užívány v kombinaci s jinými terapeutickými činidly pro léčbu nebo profylaxi infekcí nebo stavů popsaných výše. Příklady takovýchto dalších terapeutických činidel zahrnují sloučeniny účinné v léčbě nebo profylaxi virových infekcí, bez omezení na následující výčet: NRTI (nukleosidové inhibitory reverzní transkriptázy), 3'-azido-3'-deoxythymidin (zidovudin, AZT), 2'-deoxy-3'-thiacytidin (3TC), 2',3'-dideoxy-2',3'-didehydrothymidin (D4T), carbovir (karbocyklický 2',3'-dideoxy-2',3'didehydroguanosin), abacavir (ABC), 2',3'-dideoxyinosin (ddl), didanosin, 2',3'dideoxycytidin (ddc, zalcitabin), 3'-azido-2',3'-dideoxyuridin, (E)-5-(2-bromvinyl)-2'deoxyuridin (BVDU), 2-chlor-2'-deoxyadenosin, 2-deoxycoformycin, 5-fluoruracil, 5fluoruridin, 5-fluor-2'-deoxyuridin, 5-trifluormethyl-2'-deoxyuridin, 6-azauridin, 5fluororotová kyselina, methotrexát, triacetyluridine, l-(2'-deoxy-2'-fluor-l-fj-D-arabinosyl)-5jodcytidin (FIAC), tetrahydroimidazo(4,5,l-jk)-(l,4)-benzodiazepin-2(ÍH)-thion (TIBO) nebo jiné nenukleosidové inhibitory reverzní transkriptázy (např. nevirapin, delaviridin, efavirens, daparivin atd.), inhibitory proteáz (např. saquinavir, indinavir, ritonovir, amprenavir atd.), 2'nor-cyklický GMP, 6-methoxypurin arabinosid (ara-M), 6-methoxypurin arabinosid 2 -0valerát, cytosin arabinosid (ara-C), acyklické nukleosidy jako například acyklovir, valacyklovir, penciclovir, famciclovir, ganciclovir, analogy acyklických nukleotidů jako např. HPMPC, PMEA, PMEG, PMPA, PMPDAP, FPMPA, HPMPA a HPMPDAP, (2R,5R)-9-[tetrahydro-5(fosfonomethoxy)-2-furanyl]adenin, (2R,5R)-l-[tetrahydro-5-(fosfonomethoxy)-2furanyljthymin, další antivirotika včetně ribavirinu (adeninarabinosidu), 2-thio-6-azauridinu, tubercidinu, aurintrikarboxylové kyseliny, 3-deazaneoplanocinu, neoplanocinu, rimantidinu, adamantinu a foscarnetu (fosfonoformiátu trisodného).

Způsoby přípravy

Sloučeniny obecného vzorce (I) se připravují alkylací odpovídajících 6hydroxypyrimidinových bází dialkyl 2-chlorethoxymethylfosfonátem (nebo jeho analogy poskytujícími jiné substituenty R₃) v přítomnosti hydridu sodného, uhličitanu česného nebo DBU (l,8-diazabicyklo[5.4.0]undec-7-en) v dipolárním aprotickém rozpouštědle, obvykle dimethylformamidu, případně následované odchráněním např. bromtrimethylsilanem a následnou hydrolýzou. Syntéza produktu obecného vzorce (I) je doprovázena tvorbou různého množství odpovídajícího Nl-izomeru, tzn. 2,4-disubstituovaného l-[29 9 9 9 9 9

99 • 9

9 9 • 99 9 9 (fosfonomethoxy)ethyl]pyrimidin-6-onu. Ten může být odstraněn chromatograficky jakožto neutrální diester před reakcí s bromtrimethylsilanem.

Další způsob přípravy sloučenin obecného vzorce (I) zahrnuje transformaci 2substituováných derivátů 4-chlor-6-[2-(fosfonomethoxy)ethoxy]pyrimidinu (a jejich analogů s jiným R₃) reakcí s primárními nebo sekundárními aminy v bezvodém rozpouštědle (např. ethanolu), alkalickými hydroxidy nebo alkalickými uhličitany ve vodě. Tato reakce může být katalyzována např. 1,3,5-triazolem, imidazolem nebo s výhodou DABCO (diazabicyklooktanem). Chránící skupiny mohou být následně odstraněny například bromtrimethylsilanem a hydrolýzou.

Sloučeniny obecného vzorce (I) mohou být také získány reakcí 2,4-disubstituovaných 6 halogenpyrimidinů se sodným alkoxidem dialkyl 2-hydroxyethylfosfonátu (nebo jeho analogů poskytujících jiné substituenty R₃) následovanou případným odchráněním. Výhoda tohoto postupu spočívá v tvorbě pouze požadovaného 06-izomeru. Výběr vhodného postupu přípravy záleží na dostupnosti výchozího derivátu pyrimidinu.

Sloučeniny obecného vzorce (I) mohou být také získány reakcí 2,4-disubstituovaných 6 (2-hydroxyalkyl)pyrimidinů s dialkyl p-toluensulfonyloxymethylfosfonátem v přítomnosti hydridu sodného. Výchozí látky jsou připraveny reakcí příslušného 6-chlorpyrimidinu s chráněným nebo nechráněným diolem v přítomnosti báze.

Sloučeniny obecného vzorce (I) mohou být dále získány substitucí pyrimidinového kruhu v různých polohách. 5-halogen deriváty mohou být připraveny reakcí s elementárním halogenem nebo výměnnými reakcemi aniontů halogenů.

Je-li substituent Z amid nebo ester, může být převeden na hydroxyl hydrolýzou.

Monoestery lze snadno získat z diesteru nebo směsi di- a monoesterů reakcí s azidem lithným nebo sodným v dimethylformamidu (A. Holý: Synthesis 1998, 381-385 (1998)).

Všechny odkazy jsou ihned doplněny citací.

Vynález je doložen a dále objasněn, nikoliv však jakkoliv limitován, následujícími příklady.

Příklady provedení vynálezu « · · · · ·

H-3404

(a) 2,4-diamino-6-[2-(fosfonomethoxy)ethoxy]pyrimidin a 2.4-diamino-l-[2(fosfonomethoxy)ethyl]pyrimidin-6(lH)-on

Směs 2,4-diamino-6-hydroxypyrimidinu (2,52 g, 20 mmol), uhličitanu česného (3,25 g, 10 mmol) v dimethylformamidu (40 ml) byla míchána 30 min při teplotě 80°C a byl přidán diisopropyl 2-chlorethoxymethylfosfonát (3,5 ml, 23,4 mmol). Směs byla míchána 16 h při teplotě 100°C a roztok oddělen filtrací od solí. Filtrát byl odpařen ve vakuu a odparek byl chromatografován chloroformem na koloně naplněné silikagelem (300 ml). Produkt získaný • 9 * 9 · 9 9 9

9 9 9 • 9 9 9 9

9 9 9 • 9 9 9 9 9 9

9 9 9 elucí byl pak krystalizován ze směsi ethylacetát - petrolether za zisku 1,2 g (17,2%) 2,4diamino-6-[2-(diisopropylfosfonylmethoxy)ethoxy]pyrimidinu, t.t. 159°C. Elementární analýza: pro C13H25N4O5P (348,3) vypočteno 44,83%C, 7,23%H, 16,08%N, 8,89%P; nalezeno 44,99%C, 7,28%H, 16,18%N, 9,03%P. Hmotnostní spektrum: 349,3 (MH⁺)(100), 265,1 (MH⁺2 x iPr)(6), 139 (26), 127,1 (bázeH⁺)(37). *H NMR (CD3SOCD3): 1,24 d, 6H a 1,24 d, 6H, J(CH₃,CH)=6,2 (4xCH₃); 3,74 m, 2H (H-2'); 3,78 d, J(CH₂-P)=8,2 (CH₂-P); 4,22 m, 2H (H-l');

4,59 dh, 2H, J(CH,P)=8,2, J(CH,CH₃)=6,2 (2xCH); 5,02 s, 1H (H-6); 5,85 bs, 2H a 6,00 bs, 2H (2xNH₂). ^,3C NMR (CD3SOCD3): 23,85 d, 7(CH₃,P)=4,6 (2xCH₃); 23,99 d, 7(CH₃,P)=4,1 (2xCH₃); 63,65 (C-1'); 65,02 d, ,/(CII₂-P)== 164,4 (CH₂P); 70,32 d, J(CH,P)=6,0 (2xCH-O); 71,05 d 7(2',P)=l 1,9 (C-2'); 76,35 (C-5); 163,01, 166,15 a 169,92 (C-2, C-4 a C-6).

Tato látka (1,0 g, 2,9 mmol) byla reagována s BrSiMe₃ (4 ml) v acetonitrilu (40 ml) přes noc. Rozpouštědla byla odpařena ve vakuu, odparek kodestilován s acetonitrilem (2x25 ml), pak ke zbytku přidána voda (50 ml). Roztok byl alkalizován koncentrovaným vodným roztokem amoniaku a odpařen ve vakuu. Odparek byl ve vodném roztoku nanesen na kolonu (100 ml) s náplní Dowex 50X8 (H⁺) a kolona byla promyta vodou (3 ml/min), u eluátu byla průběžně měřena UV-absorpce při 254 nm. Po odstranění neutrální UV-absorbující frakce byla kolona eluována 2,5 % vodným roztokem amoniaku a byla odebírána UV-absorbující frakce.

Ta byla odpařena ve vakuu, odparek rozpuštěn ve vodě (20 ml), pH upraveno na 9-10 koncentrovaným vodným roztokem amoniaku a roztok byl nanesen na kolonu (70 ml) s náplní Dowex 1 X 2 (acetát) předem promytou vodou. Eluce vodou poskytla (s retencí) produkt, který byl dále krystalizován z vody za zisku 2,4~diamino-6~[2-(fosfonomethoxy)ethoxy]pyrimidinu (0,60 g, 78,3%), t.t. 279°C (voda). E_Up0,80. Pro C7H13N4O5P (264,2) vypočteno 31,83%C, 4,96%H, 21,21%N, 11,72%P; nalezeno 31,52%C, 5,04%H, 20,96%N, 11,53%P. UV spektrum [Á_max (s_max)] (pH 2): 276 (9100), (pH 7): 265 (7500). Tyto hodnoty souhlasí s UV spektry publikovanými pro 2,4-diamino-6-methoxypyrimidin (X_max 263 a 275). Ή NMR (CD₃SOCD₃, 40°C): 3,58 d, 2H, J(CH₂-P)=8,7 (CH₂-P); 3,741, 2H, J(2',l >4,9 (H-2'); 4,23 t, 2H,

J(1 ',2')=4,9 (H-l'); 5,07 s, 1H, (H-5); 5,86 bs, 2H a 6,01 bs, 2H (2xNH₂). *H NMR (D₂O): 3,69 d, 2H, c/(CH₂-P)=8,7 (CH₂-P); 3,91 m, 2H (H-2'); 4,30 m, 2H (H-l'); 5,45 s, 1H, (H-5). ¹³C NMR (D₂O): 69,30 (C-1'); 70,28 d, J(CH₂-P)=151,3 (CH₂P); 73,35 d J(2',P)=10,3 (C-2');

79,63 (C-5); 165,46,169,35 a 171,08 (C-2, C-4 a C-6). Posun signálu C-1' uhlíku v Oizomerech (diester a volný fosfonát) do nižšího pole (δ 63,65 a 69,30) určuje, že PME skupina je vázána na atom kyslíku na C-6.

Další eluce kolony s náplní silikagelu chloroformem poskytla 1,8 g (26%) amorfního 2,4-diamino-l-[2-(diisopropylfosfonylmethoxy)ethyl]pyrimidin-6(lH)-onu (R_F 0,35, S1), který ·· ·«·· *« 9 99 9

9 9 9 9 99 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 (I ·· · 99 · · • · 9 9 9 9 9 9

9999 9 99 999 99 9 byl sušen ve vakuu nad oxidem fosforečným. T.t. 196-197°C. Zbytek (5,17 mmol) byl reagován s bromtrimethylsilanem (6 ml) v acetonitrilu (60ml) přes noc a zpracován stejně jako O-izomer. Čištění odsolené směsi na koloně s Dowexem 1 (eluce vodou) poskytlo produkt, který byl krystalizován z vody za zisku 0,95 g (65%) 2,4-diamino-l-[2(fosfonomethoxy)ethyl]pyrimidin-(lH)-onu, t.t. 228°C (voda). Eu_P 0,90. Pro C7H13N4O5P.H2O (282,2) vypočteno 29,79%C, 5,36%H, 19,85%N, 10,98%P; nalezeno 29,76%C, 5,22%H, 20,01%N, 10,92%P. Hmotnostní spektrum: 349,2 (MH⁺)(100); 265,1 (MH⁺-2x iPr)(35); 126 (BH⁺)(26). UV spektrum [X_max (s_max)j (pH 2): 264 (18000), (pH 7): 267 (12200). Tyto hodnoty souhlasí s UV spektry publikovanými pro 2,4-diamino-l-methylpyrimidin-6(lH)-on (268 nm). 'H NMR (CD3SOCD3): 3.59 d, 2 H, ,/(CH₂,P)=8.4 (CH₂P); 3.601, 2 H, 7(2’,1’)=6.1 (H-2’);

3.96t, 2 H, J(l’,2’)=6.1 (H-1’); 4.61 s, 1 H (H-5); 5.88 bs, 2 H a 6.61 bs, 2 H (2 χΝΗ₂)?Η NMR (D₂O): 3.48 d, 2 H, J(CH₂,P)=8.4 (CH₂P); 3.761, 2 H, J(l’,2’)=5.2 (H-1’); 4.09 t, 2H, J(2’,l’)=5.2 (H-2’); 5.06 s, 1 H (H-5). ¹³CNMR(D2O): 45.15 (C-l’); 70.41 d, J(CH2-P)=154.7 (CH2P); 74.09 d, J(2’,P)=11.8 (C-2’); 81.05 (C-5); 159.73, 166.79 a 168.04 (C-2, C-4 aC-6). Poloha signálu C-U ve vysokém poli (δ 45,15) ukazuje na N-substituci. Dva signály NH2 skupin (δ 6,61 a 5,88) pozorované v ¹ H NMR v DMSO vylučují substituci v exo-polohách 2NH2 a/nebo 4-NH₂ a jsou v souladu s očekávanou substitucí naN(l).

I

H-3574

Ρ(Ο)(ΟΗ)₂ (a) 2-amino-4-chlor-6-[2-(diisopropylfosfonylmethoxy)ethoxy]pyrimidin a 2-amino-4chlor-l-[2-(diisopropylfosfonylmethoxy)ethyl]pyrimidin-6(lH)-on

2-amino-4-chlor-6-hydroxypyrimidin monohydrát (25 mmol) byl kodestilován s toluenem (3x50 ml) ve vakuu a odparek byl reagován v dimethylformamidu (50 ml) s DBU (3,8 ml) a diisopropyl 2-chlorethoxymethylfosfonátem (7 ml). Směs byla míchána 16 h při teplotě 100°C a těkavé složky odstraněny odpařením při 50°C a 2 kPa. Odparek byl rozpuštěn

999· • 9

9999 9

9

9 9

9

9 9

9

9 • 9 9 • 9 9 • 9 9 9

99999 • · ·

9 v chloroformu (200 ml), přefiltrován a promyt nasyceným roztokem NaCl (100 ml). Vodná fáze po promytí byla extrahována chloroformem (5 x 50 ml), spojené organické fáze byly sušeny síranem hořečnatým a odpařeny. Dělení na koloně se silikagelem (150 ml) nanesením v chloroformu a pak v gradientu chloroformu/ethanolu poskytlo 2-amino-4-chlor-6-[2(diisopropylfosfonylmethoxy)ethoxy]pyrimidin ve výtěžku 27,2%, t.t. 89°C. Pro C₁₃H23C1N₃O₅P (367,77) vypočteno 42,46%C, 6,30%H, 9,64%C1, 11,43%N, 8,42%P; nalezeno 42,34%C, 6,34%H, 9,79%C1, ll,30%N, 8,23%P. Hmotnostní spektrum: 368,3 (MH⁺)(100). *H NMR (CD3SOCD3): 1.22 d, 6 H a 1.23 d, 6 H, J(CH3,CH)=6.1 (CH3); 3.78 d, J(CH2-P)=8.3 (CH2-P); 3.80 m, 2H (H-2’); 4.37 m, 2H (H-l ’); 4.58 m, 2 H (P-OCH); 6.06 s, 1 H (H-5); 7.05 bs, 2 H (NH2). ¹³C NMR (CD3SOCD₃): 23.83 d, 2C, J(CH₃,P)=4.9 a 23.97 d, 2C, J(P,C)=3.9 (CH₃); 65.00 d, J(P,C)= 164.1 (P-C); 65.15 (C-l’); 70.35 d, 2C, J(P,C)=6.7 (P-OC); 70.52 d,

2C, J(P,C)=11.7 (C-2’); 94.46 (C-5); 160.12 (C-2); 162.97 (C-4); 170.56 (C-6).

Další eluce a krystalizace z ethylacetátu-etheru poskytla 2-amino-4-chlor-l-[2(diisopropylfosfonylmethoxy)ethyl]pyrimidin-6(lH)-on ve výtěžku 52,4%, t.t. 95°C. Pro Ci₃H2₃C1N₃O₅P (367,77) vypočteno 42,46%C, 6,30%H, 9,64%C1,11,43%N, 8,42%P; nalezeno 42,28%C, 6,22%H, 9,65%C1, ll,50%N, 8,27%P. Hmotnostní spektrum: 368,4 (MH⁺)(100). ^!lí NMR (CD3SOCD3): 1.20 d, 6 H a 1.22 d, 6 H, J(CH3,CH)=6.1 (CH3); 3.691, 2 H, J(2’,l’)=5.5 (H-2’); 3.76 d, J(CH2-P)=8.1 (CH2-P); 4.061, 2H, J(l’,2’) =5.5 (H-l’); 4.55 m, 2 H (P-OCH); 5.67 s, 1 H (H-5); 7.60 bs, 2 H (NH2). ¹³C NMR (CD3SOCD₃): 23.84 d, 2C, J(CH₃,P)=3.9 a 23.97 d, 2C, J(P,C)=3.9 (CH₃); 40.29 (C-l’); 65.03 d, J(P,C)=164.1 (P-C); 69.01 d, 2C,

J(P,C)=11.7 (C-2’); 70.41 d, 2C, /(P,C)=5.9 (P-OC); 98.28 (C-5); 155.73 (C-2); 157.87 (C-4); 161.48 (C-6).

(b) 2-amino-4-hydroxy-6-[2-(fosfonomethoxy)ethoxy]pyrimidin

Směs 2-amino-4-chlor-6-[2-(diisopropylfosfonylmethoxy)ethoxy]pyrimidinu (5,7 g), DABCO (3,6 g) a uhličitanu draselného (9,0 g) ve vodě (100 ml) byla refluxována 150 min za stálého míchání, pak ochlazena a okyselena přidáním Dowexu 50 X 8 (H⁺). Suspenze byla alkalizována konc. vodným roztokem amoniaku a po 5timinutovém míchání přefiltrována a pevná fáze promyta 50% vodným methanolem (200 ml). Filtrát byl odpařen do sucha, pak byl přidán ethanol (50 ml) a směs byla znovu odpařena do sucha. Odparek poskytl po chromatografii na koloně plněné silikagelem (150 ml) v gradientu chloroform-ethanol krystalický 2-amino-6-[2-(diisopropylfosfonylmethoxy)ethoxy]-4-hydroxypyrimidin, t.t. 154°C ve výtěžku 78%. Pro Ci3H24N3O6P (349,3) vypočteno 44,70%C, 6,92%H, 12,03%N, 8,37%P; nalezeno 44,58%C, 7,02%H, 11,95%N, 8,53%P. ^!HNMR (CD3SOCD₃): 1.24 d, 6 H a 1.23 d, 6 • ·

H, J(CH₃,CH)=6.2 (4xCH₃); 3.74 m, 2 Η (H-2’); 3.76 d, J(CH₂-P)=8.3 (CH₂-P); 4.19 m, 2H (H 1’); 4.59 m, 2 H (P-OCH); 4.75 s, 1 H (H-5); 6.65 bs, 2 Η, 2H (NH₂); 10.45 s, 1H (OH). ¹³C NMR (CD₃SOCD₃): 23.87 d, 2C, J(CH₃,P)=4.9 a 24.01 d, 2C, J(P,C)=3.9 (CH₃); 65.03 d, J(P,C)=164.6 (P-C); 65.04 (C-l’); 70.37 d, 2C, J(P,C)=6.3) (P-OC); 70.87 d, J(P,C)=11.7 (C2’); 79.95 (C-5); 155.68 (C-4); 164.25 (C-2); 171.01 (C-6).

Tento produkt byl reagován s bromtrimethylsilanem (10 ml) v acetonitrilu (80 ml) přes noc, směs odpařena ve vakuu a odparek byl rozpuštěn ve vodě (50 ml). Po 10 min byl přidán konc. vodný roztok amoniaku až do alkalické reakce a směs byla opět odpařena. Odparek byl deionizován na koloně (100 ml) s Dowexem 50 X 8 a UV-absorbující amoniakální eluát byl odpařen do sucha. Poté byl rozpuštěn v minimálním množství horké vody přidáním koncentrovaného vodného roztoku amoniaku a okyselen konc. kyselinou chlorovodíkovou na pH 3-3,5. Sraženina byla oddělena, promyta vodou, ethanolem a vysušena ve vakuu. Výtěžek 0,7 g, t.t. 227°C. Pro C₇Hi₂N₃O₆P (265,16) vypočteno 31,71%C, 4,56%H, 15,85%N, 11,68%P; nalezeno 31,55%C, 4,62%H, 16,15%N, 11,51%P.

Příklad 3 (a) 2,4-diamino-6-(S)-[2-(fosfonomethoxy)propoxy]pyrimidin (H-3560)

Diisopropyl (S)-2-(4-toluensulfonyloxy)propyloxymethylfosfonát (25,7 g, 63 mmol) v DMF (40 ml) byl přidán při 90°C k promíchávané směsi 2,4-diamino-6-hydroxypyrimidinu (60 mmol), DMF (40 ml) a DBU (10,6 ml, 60 mmol). Reakční směs byla míchána při teplotě 100°C 24 hodin a poté odpařena ve vakuu. Odparek byl rozpuštěn v chloroformu (200 ml), přefiltrován a promyt nasyceným roztokem NaCl (lOOml). Vodná fáze byla extrahována chloroformem (5 x 50 ml), spojené organické fáze byly sušeny síranem hořečnatým a pak odpařeny. Dělení na koloně se silikagelem (150 ml) s nanesením v chloroformu a dělením v gradientu chloroform-ethanol poskytlo hlavní produkt (06-izomer) jako olejovitý zbytek, který byl pak přes noc sušen ve vakuu nad oxidem fosforečným. Poté byly přidány acetonitril (80 ml) a bromtrimethylsilan (20 ml) a roztok byl ponechán stát přes noc v uzavřené baňce. Těkavé složky byly odpařeny ve vakuu a odparek byl reagován s vodou (100 ml). Po 10 min byl přidán konc. vodný roztok amoniaku až do alkalické reakce a směs byla odpařena. Odparek byl deionizován na koloně (100 ml) s Dowexem 50 X 8 a UV-absorbující amoniakální eluát byl odpařen do sucha. Tento produkt byl rozpuštěn ve vodě (20 ml), alkalizován konc. vodným roztokem amoniaku a nanesen na kolonu (200 ml) s Dowexem 1 X 2 (acetát) předem promytou vodou. Eluce vodou následovaná lineárním gradientem kyseliny octové (0-0,5M, 1,5 1 každé) • · · · · · • · poskytla hlavní UV absorbující frakci, která byla odpařena, zbytek kodestilován s vodou (3 x 50 ml) a krystalizován z vody. Výtěžek 3,5 g (19,7%), t.t. 281°C. Pro monohydrát C8H15N4O5P.H2O (296,22) vypočteno 32,44%C, 5,78%H, 18,91%N, 10,46%P; nalezeno 32,67%C, 5,86%H, 19,40%N, 10,60%P. Ή NMR (D₂O + NaOD): 1.26 d, 3H, J(3’,2’)=6.4 (H3’); 3.51 dd, 1H, J(CH_b,P)=9.4, J(gem)=12.2 (CH_bP); 3.60 dd, 1H, J(CH_a,P)=9.4, J(gem)=12.2 (CH_aP); 3.92 m, 2H (H-2’); 4.06 dd, 1H, J(l’b,2’)=5.5, J(gem)= =10.5 (H-l’b); 4.14 dd, 1H, J(l’a,2’)=3.7, J(gem)=10.5 (H-l’a); 5.41 s, 1 Η (H-5). ¹³C NMR (D₂O): 15.84 (C-3’); 66.99 d, J(CH₂-P)=149.9 (P-C); 69.68 (C-l’); 75.14 d, J(2’,P)=11.2 (C-2’); 76.84 (C-5); 166.74 (C-2); 162.83 (C-4); 171.05 (C-6).

(b) 2,4-diamino-6-(R)-[2-(fosfonomethoxy)propoxy]pyrimidin (H-3567) (R) enantiomer byl připraven analogicky s příkladem 3 (a) z isopropyl (R)-2-(4toluensulfonyloxy)propyloxymethylfosfonátu (50 mmol), 2,4-diamino-6-hydroxypyrimidinu (60 mmol) a DBU (60 mmol) v DMF (70 ml). Reakční směs byla míchána při 100°C 24 hodin. Následné zpracování proběhlo podle postupu popsaného v příkladu 4. Výtěžek 24%, t.t. vyšší než 290°C. Pro monohydrát C8H15N4O5P.H2O (296,22) vypočteno 32,44%C, 5,78%H, 18,91%N, 10,46%P; nalezeno 32,54%C, 5,90%H, 19,10%N, 10,65%P. 'HNMRa ¹³CNMR spektra jsou shodná se spektry (S)-enantiomeru.

Příklad 4

P(O)(OiC₃H₇)₂

P(O)(OH)₂

H-3408 • « • ·

2,4-diamino-6-[2-(fosfonomethoxy)ethylsulfanyl]pyrimidin

Suspenze 2,4-diamino-6-sulfanylpyrimidinu hemísulfátu (2,616 g, 13,7 mmol) v DMF (40 ml) byla reagována s hydridem sodným (1,0855 g, 27 mmol, 60% disperze v parafinovém oleji) 1 h za stálého míchání, byl přidán diisopropyl 2-chlorethoxymethylfosfonát (9 ml, 17,2 mmol). Směs byla míchána 8 hod při teplotě 80°C, zfiltrována přes celitovou vatu a odpařena ve vakuu. Odparek byl rozpuštěn v chloroformu a přečištěn na koloně se silikagelem (150 ml) ve směsi chloroform-ethanol (49:1) za zisku 2,4-diamino-6-[2(diisopropylfosfonylmethoxy)ethylsulfanyl]pyrimidinu (4,0 g, 80%), t.t. 109°C. Pro C13H25N4O4PS (346,40) vypočteno 42,85%C, 6,91%H, 15,38%N, 8,50%P, 8,80%S; nalezeno 42,48%C, 6,94%H, 15,50%N, 8,63%P, 9,01%S. ^!H NMR (CD3SOCD3): 1.24 d, 6 H a 1.25 d, 6 H, J(CH₃,CH)=6.1 (CH₃); 3.171, 2H, J(l’,2’)=6.6 (H-l’); 3.68 t, 2H, J(2’,l’)=6.6 (H-2’); 3.77 d, J(CIÍ2-P>8.3 (CH₂-P); 4.60 m, 2 H (P-OCH); 5.60 s, 1 H (H-5); 5.95 brs, 2 H a 6.17 brs, 2H (NH₂).

Tato sloučenina byla rozpuštěna v acetonitrilu (50 ml) a reagována s bromtrimethylsilanem (5 ml) přes noc, poté byly těkavé složky odpařeny ve vakuu. Zbytek byl reagován s vodou (100 ml). Po 10 min byl přidán koně. vodný roztok amoniaku až do alkalické reakce a směs byla odpařena. Odparek byl deionizován na koloně (100 ml) s Dowexem 50 X 8 a UV-absorbující amoniakální eluát byl odpařen do sucha. Produkt byl rozpuštěn ve vodě (20 ml), alkalizován konc. vodným roztokem amoniaku a nanesen na kolonu (100 ml) s Dowexem 1 X 2 (acetát), předem promytou vodou. Eluce vodou, následovaná elucí lineárním gradientem kyseliny octové (0-0,5M, 1,5 1 každé) poskytla hlavní UV-absorbující frakci, která byla odpařena, pevný zbytek kodestilován s vodou (3 x 50 ml) a odparek byl krystalizován z vody. Výtěžek 2,8 g (91%) 2,4-diamino-6-[2(fosfonomethoxy)ethylsulfanyl]pyrimidinu, t.t. 246°C. Pro C7H13N4O4PS (280,24) vypočteno 30,00%C, 4,68%H, 19,99%N, 11,05%Ρ, 11,44%S; nalezeno 30,27%C, 4,80%H, 19,74%N, 10,98%P, 1 l,60%S. Ή NMR (D₂O +NaOD): 3.18t, 2H, J(l’,2’)=6.8 (H-l’); 3.56 d, 2H, J(CH₂,P)=8.7; (CH₂P); 3.68 t, 2H, J(2’,l’)=6.8 (H-2’); 5.70 s, 1 H (H-5); 6.32 brs, 2H (2-NH₂); 6.48 brs, 2H (4-NH₂).

• · • · · · • · · · • · · · · « • · · • · ·

0\ /P(O)(OiC₃H₇)₂

N

v nh₂

A.

NH,

XX /P(O)(OiC₃H₇)₂

Xk .P(O)(OH)₂

4-amino-6-[2-(fosfonomethoxy)ethoxy]pyrimidin a 4-amino-l-[2(fosfonomethoxy)ethyl]pyrimidin-6(lH)-on

4-amino-6-hydroxy-2-sulfanylpyrimidin (20 g) ve vroucím ethanolu (300 ml) byl reagován za stálého míchání s Raney-niklem, dokud výchozí látka nezmizela. Suspenze byla za horka zfiltrována, sraženina promyta horkým ethanolem (300 ml) a filtrát odpařen do sucha. Odparek byl rekrystalizován z ethanolu (k zakalení přidán ether) za zisku 4-amino-6hydroxypyrimidinu, t.t. 272°C. Výtěžek 10,0 g (64,4%). Pro C4H5N3O (111,10) vypočteno 43,24%C, 4,54%H, 37,82%N; nalezeno 43,40%C, 4,65%H, 38,01%N. Hmotnostní spektrum:

112 (MH⁺). Ή NMR (CD₃SOCD₃): 4,97 s, 1H (H-5); 6,42 brs, 2 H (NH₂); 7,77 s, 1H (H-2); 11,41 brs, 1H(OH).

• ·

Tento produkt (3,6 g, 33,6 mmol) byl reagován v DMF s NaH (1,36 g, 34 mmol, 60% disperze v parafinovém oleji) 0,5 h za stálého míchání, pak byl přidán diisopropyl 2chlorethoxymethylfosfonát (9,4 ml, 40,5 mmol). Směs byla míchána 8 h při 80°C, přefiltrována přes celitovou vatu a odpařena ve vakuu. Odparek byl rozpuštěn v chloroformu a přečištěn na silikagelu; eluce směsí chloroform-ethanol (97,5:2,5) poskytla 4-amino-6-[2(diisopropylfosfonylmethoxy)ethoxy]pyrimidin, který byl rekrystalizován ze směsi ethylacetát - petrolether. Výtěžek 3,0 g (26,8%), t.t. 112°C. Pro C13H24N3O5P (333,32) bylo vypočteno 46,84%C, 7,26%H, 12,61%N, 9,29%P; nalezeno 46,69%C, 7,38%H, 12,45%N, 9,40%P. 'H NMR (CD3SOCD3): 1.22 d, 6 H a 1.23 d, 6 H, J(CH₃,CH)=6.1 (4xCH₃); 3.78 brt, 2 H, J(2’,l’)=4.5 (H-2’); 3.78 d, 7(CH₂-P)=8.4 (CH₂-P); 4.31 brt, 2H, J(l’,2’)=4.5 (H-l’); 4.59 m, 2 H (P-OCH); 5.67 s, 1 H (H-5); 6.62 bs, 2H (NH₂); 8.07 s, 1H (H-2). ¹³C NMR (CD3SOCD3): 64.42 (C-l’).

Tato látka byla reagována s bromtrimethylsilanem (10 ml) v acetonitrilu (70 ml) za laboratorní teploty přes noc. Po odpaření ve vakuu byl zbytek reagován s vodou (100 ml). Po 10 min byl přidán konc. vodný roztok amoniaku až do alkalické reakce a směs byla opět odpařena. Odparek byl deionizován na koloně (100 ml) plněné Dowexem 50 X 8 a UV-absorbující amoniakální eluát byl odpařen do sucha. Pevná fáze byla rozpuštěna ve vodě (20 ml), alkalizována konc. vodným roztokem amoniaku a nanesena na kolonu (150 ml) s Dowexem 1 X 2 (acetát), předem promytou vodou. Eluce vodou následovaná elucí v lineárním gradientu kyseliny octové (0-1 Μ, 1 1 každé) poskytla hlavní UV-absorbující frakci, která byla odpařena, pevný zbytek kodestilován s vodou (3x50 ml) a zbytek po tomto odpařování byl rekrystalizován z vody. Výtěžek 1,8 g (80%) 4-amino-6-[2(fosfonomethoxy)ethoxy]pyrimidinu, t.t. 254°C. Pro C7H12N3O5P (249.16) vypočteno 33,74%C, 4,85%H, 16,86%N, 12,43%P; nalezeno 34,02%C, 4,80%H, 16,88%N, 12,58%P.

Další eluce surové reakční směsi chloroformem-ethanolem (95:5) na koloně plněné silikagelem poskytla olej ovitý 4-amino-l-[2-(diisopropylfosfonylmethoxy)ethyl]pyrimidin6(lH)-on, který byl sušen ve vakuu. Výtěžek 4,6 g (41,1%). Tento produkt byl reagován s bromtrimethylsilanem (10 ml) v acetonitrilu (70 ml) při teplotě místnosti přes noc. Po odpaření ve vakuu byl zbytek reagován s vodou (100 ml). Po 10 min byl přidán koncentrovaný vodný roztok amoniaku až do alkalické reakce a směs byla opět odpařena. Odparek byl nanesen na kolonu (100 ml) plněnou Dowexem 50 X 8 a eluován vodou. Hlavní UV-absorbující frakce byla vysušena a pevná fáze byla rekrystalizována z 70% vodného ethanolu (ether přidán k zakalení). Výtěžek 2,8 g (91%) 4-amino-l-[2-(fosfonomethoxy)ethyl]pyrimidin-6(lH)-onu, t.t. 233°C. Pro C₇H₁₂N3O₅P (249,16) vypočteno 33,74%C, 4,85%H, 16,86%N, 12,43%P; nalezeno • · · ·

34,02%C, 4,80%H, 16,88%N, 12,58%P. ‘H NMR (CD₃SOCD₃): 3.56 d, 2H, J(CH₂,P)=8.8 (CH₂P); 3.64 t, 2H, J(2’,l’)=4.9 (H-2’); 3.90t, 2H, J(l’,2’)=4.9 (H-l’); 5.06 s, 1 H (H-5); 6.45 brs, 2H (NH₂); 6.90 brs, 2H (P-OH); 7.98 s, 1H (H-2). ¹³C NMR (CD₃SOCD₃): 44.44 (C-l ’).

Příklad 6

CL .P(O)(OH)₂

O. ,P(O)(OiC₃H₇)₂

N(CH₃)₂

H₂N ¹ ,CL P(O)(OiC₃H₇)₂

2-amino-4-dimethylamino-6-[2-(fosfonomethoxy)ethoxy]pyrimidin a 2-amino-4dimethyIamino-l-[2-(fosfonomethoxy)ethyl]pyrimidin-6(lH)-on

2-amino-4-chlor-6-hydroxypyrimidin monohydrát (5,0 g) byl míchán s 30% roztokem dimethylaminu v ethanolu (180 ml) 16 h při 100°C v autoklávu. Krystalický produkt byl oddělen filtrací, promyt vodou, acetonem, ether a vysušen ve vakuu za zisku 2-amino-4dimethylamino-6-hydroxypyrimidinu, t.t. vyšší než 300°C. Výtěžek 4,3 g (81%). Pro C6H10N4O (154,17) vypočteno 46,34%C, 6,54%H, 36,34%N; nalezeno 46,38%C, 6,65%H, 36,68%N. Ή NMR (CD₃SOCD₃): 2,89 s, 6H (N-CH₃); 4,51 s, 1H (H-5); 6,18 brs, 2H (NH₂); 9,75 brs, 1H (OH).

« · · · · ·

Tento produkt (4,0 g, 26 mmol) a uhličitan česný (4,22 g, 13 mmol) byly míchány 1 h v DMF (60 ml) při 100°C a byl přidán diisopropyl 2-chlorethoxymethylfosfonát (8 ml). Směs byla míchána 24 h při 100°C, za horka zfiltrována a odpařena ve vakuu. Odparek byl extrahován horkým chloroformem (100 ml), zfiltrován a přečištěn chromatograficky na koloně se silikagelem (200 ml). Eluce chloroformem poskytla 2-amino-4-dimethylamino-6-[2(diisopropylfosfonylmethoxy)ethoxy]pyrimidine jako hustý olej (4,6 g). Byl reagován s bromtrimethylsilanem (5 ml) v acetonitrilu (50 ml) při teplotě místnosti přes noc. Po odpaření ve vakuu byl zbytek smíchán s vodou (100 ml). Pod 10 min byl přidán konc. vodný roztok amoniaku až do alkalické reakce a směs byla odpařena. Odparek byl deionizován na koloně (100 ml) plněné Dowexem 50 X 8 a UV-absorbující amoniakální eluát byl odpařen do sucha. Odparek byl rozpuštěn ve vodě (20 ml), alkalizován konc. vodným roztokem amoniaku a nanesen na kolonu (150 ml) naplněnou Dowexem 1X2 (acetát), předem promytou vodou. Eluce vodou následovaná elucí v lineárním gradientu kyseliny octové (0-0,4 Μ, 1 1 každé) poskytla hlavní UV-absorbující frakci, která byla odpařena, odparek kodestilován s vodou (3 x 50 ml) a finální odparek byl krystalizován z vody. Výtěžek 1,1 g 2-amino-4-dimethylamino-6[2-(fosfonomethoxy)ethoxy]pyrimidmu, t.t. 168°C. Pro C9H17N4O5P (292,23) vypočteno 36,99%C, 5,86%H, 19,17%N, 10,60%P; nalezeno 37,05%C, 5,80%H, 18,98%N, 10,51%P. *H NMR (DMSO): 6.69 bs, 2H (NH₂); 4.69 s, 1H (H-5); 3.98 t, J=6.0 Hz, 2H (2xH-l’); 3.611, J=6.0 Hz, 2H (2xH-2’); 3.59 d, 2H, J(H,P)=8.3 Hz (P-CH₂); 2.89 s, 6H (N(CH₃)₂). ¹³C NMR (DMSO): 162.37, 161.94 a 154.67 (C-2, C-4 aC-6); 75.79 (C-5); 69.82 d, J(C,P)=10.3 Hz (C2’); 66.76 d, J(C,P)=158.7 Hz (P-CH₂); -40.0 (C-Γ, překryv s DMSO); 36.93 (N(CH₃)₂).

Další eluce na koloně se silikagelem v gradientu chloroform-ethanol poskytla 2-amino4-dimethylamino-l-[2-(diisopropylfosfonylmethoxy)ethyl]pyrimidin-6(lH)-on jako hustý olej (2,0 g), který byl následně reagován s bromtrimethylsilanem (5 ml) v acetonitrilu (50 ml) přes noc a zpracován podle předchozího postupu. Po chromatografii na Dowexu 1 byl z vody krystalizován 2-amino-4-dimethylamino-l-[2-(fosfonomethoxy)ethyl]pyrimidin-6(lH)-on, t.t. 235°C. Pro C9H17N4O5P (292,23) vypočteno 36,99%C, 5,86%H, 19,17%N, 10,60%P; nalezeno 37,15%C, 5,92%H, 19,28%N, 10,66%P. ^!H NMR (DMSO): 6.03 bs, 2H (NH2); 5.20 s, 1H (H5); 4.26 m, 2H (2xH-l’); 3.74 m, 2H (2xH-2’); 3.58 d, 2H, J(H,P)=8.8 Hz (P-CH2); 2.93 s, 6H (N(CH3)2). ¹³C NMR (DMSO): 169.93,164.91 a 161.92 (C-2, C-4 a C-6); 75.02 (C-5); 70.89 d, J(C,P)=11.4 Hz (C-2’); 66.96 d, J(C,P)=160.7 Hz (P-CH2); 64.28 (C-l’); 36.95 (N(CH₃)₂).

2-amino-4-cyklopropylamino-6-[2-(fosfonomethoxy)ethoxy]pyrimidin a 2-amino-4cyklopropyIamino-l-[2-(fosfonomethoxy)ethyl]pyrimidin-6(lH)-on

2-amino-4-chlor-6-hydroxypyrimidin monohydrát (5,0 g) byl refluxován v ethanolu (150 ml) 12 h s cyklopropylaminem. Směs byla odpařena ve vakuu, kodestilována s ethanolem (3 x 50 ml), adsorbována z methanolu na silikagel a nanesena v chloroformu na kolonu naplněnou silikagelem (200 ml). Eluce v gradientu chloroform-ethanol poskytla krystalický produkt, který byl odfiltrován od etheru a vysušen ve vakuu za zisku 2-amino-4cyklopropylamino-6-hydroxypyrimidinu, t.t. 229°C. Výtěžek 3,0 g. Pro C7H10N4O (166,18) vypočteno 50,59%C, 6,07%H, 33,71%N; nalezeno 50,49%C, 6,25%H, 33,61%N. Ή NMR • · · · · · (DMSO): 9.73 brs, 1H (OH); 6.55 bs, 2H (NH); 6.08 brs, 2H (NH₂); 4.66 s, 1H (H-5); 2.30 m, 1H a 0.62 m, 2H a 0.40, m, 2H (C-CH₂, N-CH).

Směs tohoto produktu (3,0 g, 18 mmol) a uhličitanu česného (2,92 g, 9 mmol) v DMF (50 ml) byla míchána 1 h při 100°C, byl přidán diisopropyl 2-chlorethoxymethylfosfonát (6 ml). Reakční směs byla míchána 24 h při 100°C, za horka zfiltrována a odpařena ve vakuu. Odparek byl extrahován horkým chloroformem (100 ml), zfiltrován, zahuštěn ve vakuu a přečištěn chromatografií na koloně naplněné silikagelem (2 x 200 ml). Eluce chloroformem poskytla 2-amino-4-cyklopropylamino-6-[2-(diisopropylfosfonylmethoxy)ethoxy]pyrimidin jako hustý olej (1,8 g). Ten byl dále reagován s bromtrimethylsilanem (5 ml) v acetonitrilu (50 ml) při laboratorní teplotě přes noc. Po odpaření ve vakuu byl odparek smíchán s vodou (100 ml). Po 10 min byl přidán konc. vodný roztok amoniaku až do alkalické reakce a směs byla odpařena. Odparek byl deionizován na koloně (100 ml) plněné Dowexem 50 X 8 a UVabsorbující amoniakální eluát byl odpařen do sucha. Produkt byl ve vodě (20 ml) alkalizován konc. vodným roztokem amoniaku a nanesen na kolonu (150 ml) s Dowexem 1X2 (acetát), předem promytou vodou. Eluce vodou následovaná elucí v lineárním gradientu kyseliny octové (0-0,4 Μ, 1 1 každé) poskytla hlavní UV-absorbující frakci, která byla odpařena, odparek kodestilován s vodou (3 x 50 ml) a krystalizován z vody. Výtěžek 1,0 g 2-amino-4cyklopropylamino-6-[2-(fosfonomethoxy)ethoxy]pyrimidinu, t.t. 244°C. Pro C10H17N4O5P (304,24) vypočteno 39,48%C, 5,63%H, 18,42%N, 10,18%P; nalezeno 39,65%C, 5,70%H, 18,59%N, 10,11%P. 'H NMR (D₂O + NaOD): 0.54 m, 2H a 0.80 m, 2H (C-CH₂); 2.53 m, 1H (N-CH); 3.57 d, 2H, J(CH₂,P)=8.4 (CH₂P); 3.91 m, 2H (H-2’); 4.32 m, 2H (H-l’); 5.61 s, 1 H (H-5).

Další elucí ze silikagelové kolony v gradientu chloroform-ethanol byl získán (po krystalizaci z ethanolu-etheru) žlutý 2-amino-4-cyklopropylamino-l-[2(diisopropylfosfonylmethoxy)ethyl]pyrimidin-6(lH)-on (1,6 g), který byl následně reagován s bromtrimethylsilanem (5 ml) v acetonitrilu (50 ml) přes noc a zpracován jako v předchozím postupu. Při chromatografii na Dowexu 50 byl produkt eluován vodou a vysušen ve vakuu. Odparek po krystalizaci z vody poskytl 2-amino-4-cyklopropylamino-l-[2(fosfonomethoxy)ethyl]pyrimidin-2-on, t.t. vyšší než 290°C. Výtěžek 0,90 g. Pro C10H17N4O5P (304,24) vypočteno 39,48%C, 5,63%H, 18,42%N, 10,18%P; nalezeno 39,70%C, 5,78%H, 18,69%N, 10,32%P. ¹³C NMR (D₂O+NaOD): 173.71,170.07 a 165.53 (C-2, C-4 aC-6); 78.75 (C-5); 73.31 d, J(C,P) = 10.3 Hz (C-2’); 72.19 d, J(C,P) = 149.4 Hz (P-CH₂); 69.14 (C-l’); 25.96 (N-CH); 9.43 (2xCH₂ cyklopropylu).

♦ · · · · · • · • · · • ·«··

P(O)(OiC₃H₇)₂

2-amino-4-methyl-6-[2-(fosfonomethoxy)ethoxy]pyrimidm a 2-amino-4-methyl-l-[2(fosfonomethoxy)ethyI]pyrimidin-6(lH)-on

Diisopropyl 2-chlorethoxymethylfosfonát (15 ml, 62,5 mmol) byl přidán ke směsi 2amino-6-hydroxy-4-methylpyrimidinu (6,25 g, 50 mmol) a uhličitanu česného (11,3 g, 25 mmol) v DMF (70 ml), která byla před tímto přidáním míchána 1 h při 100°C. Reakční směs byla pak míchána 14 h při 100°C, za horka zfiltrována a odpařena ve vakuu. Odparek poskytl po extrakci chloroformem a následném přečištění na koloně (250 ml) naplněné silikagelem 2amino-4-methyl-6-[2-(diisopropylfosfonylmethoxy)ethoxy]pyrimidin, který byl rekrystalizován ze směsi ethylacetát-petrolether. Výtěžek 5,75 g, t.t. 72-73°C. Pro C14H26N3O5P (347,35) vypočteno 48,41%C, 7,54%H, 12,10%N, 8,92%P; nalezeno 48,70%C, 7,60%H, 12,32%N, 9,14%P. *H NMR (CDCb): 5.95 q, 1H, J=0.6 Hz (H-5); 4.90 b, 2H (NH₂); 4.76 dh, 2H, •φφφφφ ·· φ φφφ φφ φ φφφφ φφφ φ φ φφ φ φφφφ φ φ φφ φ φ φφ φφφφφ φ φ φφφ φφφ φφφφφ φφ φφφ φφ φ

J(H,P)=7.6 Hz a J(H,H)=6.2 Hz (2xOCH (iPr)); 4.42 m, 2H (2xH-l’); 3.90 m, 2H (2xH-2’);

3.82 d, 2H, J(H,P)=8.2 Hz (P-CH₂); 2.26 d, 3H, J=0.6 Hz (CH₃); 1.34 d, 6H, J=6.2 Hz a 1.33 d, 6H, >6.2 Hz (4xCH₃ (iPr)). ¹³C NMR (CDC1₃): 170.36,168.27 a 162.48 (C-2, C-4 a C-6); 97.03 (C-5); 71.17 d, J(C,P)=10.8 Hz (C-2’); 71.06 d, J(C,P)=6.8 Hz (OCH (iPr)); 65.99 d, J(C,P)=167.6 Hz (P-CH₂); 64.60 (C-l’); 24.04 d, J(C,P)=3.9 Hz a 23.90 d, J(C,P)= 4.9 Hz (4xCH₃ (iPr)); 23.61 (CH₃).

Tato látka byla reagována s bromtrimethylsilanem (5 ml) v acetonitrilu (50 ml) za laboratorní teploty přes noc a těkavé složky byly pak odpařeny ve vakuu. Odparek byl rozpuštěn ve vodě (100 ml), byl přidán konc. vodný roztok amoniaku až do alkalické reakce a směs byla odpařena. Odparek byl deionizován na koloně (100 ml) s Dowexem 50 X 8 a UVabsorbující amoniakální eluát byl odpařen do sucha. Tento produkt byl rozpuštěn ve vodě (20 ml), alkalizován konc. vodným roztokem amoniaku a nanesen na kolonu (150 ml) s Dowexem

X 2 (acetátová forma), předem promytou vodou. Eluce vodou následovaná elucí v lineárním gradientu kyseliny octové (0-0,4 Μ, 1 1 každá) poskytla hlavní UV-absorbující frakci, která byla odpařena, kodestilována s vodou (3 x 50 ml) a odparek byl rekrystalizován z vody. Výtěžek 3,67 g 2-amino-4-methyl~6-[2-(fosfonomethoxy)ethoxy]pyrimidinu, t.t. 245°C. Pro C₈Hi₄N₃O₅P (263,19) vypočteno 36,51%C, 5,36%H, 15,97%N, 11,77%P; nalezeno 36,65%C, 5,60%H, 15,69%N, 11,92%P. ^JHNMR (D2O+NaOD): 6.13 s, 1H (H-5); 4.39 m, 2H (2xH-l’); 3.92 m, 2H (2xH-2’); 3.57 d, 2H, J(H,P)=8.5 Hz (P-CH2); 2.26 s, 3H (CH3). ¹³C NMR (D2O+NaOD): 173.63, 172.80 a 165.50 (C-2, C-4 a C-6); 98.75 (C-5); 73.09 d, J(C,P)=10.2 Hz (C-2’); 72.06 d, J(C,P)=149.4 Hz (P-CH₂); 68.85 (C-l’); 25.42 (CH₃).

Další eluce ze silikagelové kolony následovaná krystalizací ze směsi ethylacetátpetrolether poskytla 2-amino-4-methyl-l -[2-(diisopropylfosfonylmethoxy)ethyl]pyrimidin6(lH)-on (4,2 g), t.t. 88°C. Pro Ci₄H₂₆N₃O₅P (347,35) vypočteno 48,41%C, 7,54%H, 12,10%N, 8,92%P; nalezeno 48,49%C, 7,62%H, 12,30%N, 9,08%P. *HNMR (CDC1₃): 5.79 q, 1H, J=0.8 Hz (H-5); 5.62 b, 2H (NH₂); 4.72 dh, 2H, J(H,P)=7.6 Hz a J(H,H)=6.2 Hz (2xOCH (iPr)); 4.20 m, 2H (2xH-l’); 3.90 m, 2H (2xH-2’); 3.74 d, 2H, J(H,P)=8.6 Hz (P-CH₂); 2.12 d, 3H, J=0.8 Hz (CH₃); 1.32 d, 6H, J=6.2 Hz a 1.29 d, 6H, J=6.2 Hz (4xCH₃ (iPr)). ¹³C NMR (CDC1₃): 164.33, 162.93 a 156.37 (C-2, C-4 a C-6); 102.22 (C-5); 72.88 d, J(C,P)=11.7 Hz (C-2’); 71.27 d, J(C,P)=6.8 Hz (OCH (iPr)); 66.17 d, J(C,P)=168.1 Hz (P-CH₂); 43.06 (C-l’); 23.97 d, J(C,P)=3.9 Hz a 23.91 d, J(C,P)= 4.9 Hz (2xCH₃ (iPr)); 23.64 (CH₃).

Tento produkt byl analogickým způsobem reagován s bromtrimethylsilanem (5 ml) v acetonitrilu (50 ml) za vzniku, po chromatografii deionizované reakční směsi na Dowexu 1 X a krystalizací z vody, 2-amino-4-methyl-l-[2-(fosfonomethoxy)ethyl]pyrimidin-6(lH)-onu.

• · · · · · • · • * · • · · · • · · ····

Výtěžek 2,3 g, t.t. 283°C. Pro C₈Hi4N₃O₅P (263,19) vypočteno 36,51%C, 5,36%H, 15,97%N, 11,77%P; nalezeno 36,40%C, 5,23%H, 15,77%N, 12,00%P. *HNMR (D₂O+NaOD): 5.77 s, 1H (H-5); 4.18 t, 2H, J=5.3 Hz (2xH-l’); 3.821, 2H, J=5.3 Hz (2xH-2’); 3.50 d, 2H, J(H,P)=8.7 Hz (P-CH₂); 2.12 s, 3H (CH₃). ¹³C NMR (D₂O+NaOD): 169.48, 168.32 a 160.25 (C-2, C-4 a C-6); 102.40 (C-5); 73.17 (C-2’); 72.55 d, J(C,P)=142.0 Hz (P-CH₂); 45.60 (C-l’); 25.43 (CH₃).

P(O)(OiC₃H₇)₂

P(O)(OH)₂

4-amino-2-methylsulfanyl-6-[2-(fosfonomethoxy)ethoxy]pyrimidin

Diethyl 2-hydroxyethylfosfonát (5,3 g, 25 mmol) v DMF (40 ml) byl reagován při 0°C s hydridem sodným (1,0 g, 60% disperze v parafinovém oleji) a po 1 h míchání při 0°C byl ·

• 9 9999 • 9 9 9 9

9 9 9

9 9 9 9

9 9 9

9999 9 99

9 9 9

9 99999

9 9

9 v jedné dávce přidán 4-amino-6-chlor-2-methylsulfanylpyrimidin (3,5 g, 20 mmol). Směs byla míchána 16 h při 100°C, odpařena do sucha ve vakuu a extrahována horkým chloroformem (300 ml). Extrakt byl odpařen ve vakuu a odparek byl reagován s bromtrimethylsilanem (10 ml) v acetonitrílu (50 ml) za laboratorní teploty přes noc. Směs byla odpařena do sucha ve vakuu a odparek byl deionizován na koloně (100 ml) naplněné Dowexem 50 X 8 a UV-absorbující amoniakální eluát byl odpařen do sucha. Tento produkt byl rozpuštěn ve vodě (20 ml) přidáním konc. vodného roztoku amoniaku a okyselen kys. chlorovodíkovou na pH 3-3,5. Sraženina byla oddělena, promyta vodou, ethanolem a vysušena ve vakuu. Výtěžek 0,8 g 4-amino-2methylsulfanyl-6-[2-(fosfonomethoxy)ethoxy]pyrimidinu, t.t. 210-211°C. Pro CgHuNRJsPS (263,19) vypočteno 32,54%C, 4,78%H, 14,23%N, 10,49%P, 10,86%S; nalezeno 32,42%C, 4,93%H, 14,07%N, 10,62%P, ll,04%S. ¹HNMR(D2O): 5.68 s, 1H (H-5); 4.36 m, 2H (2xH1’); 3.94 m, 2H (2xH-2’); 3.72 d, 2H, J(H,P)=8.5 Hz (P-CH2); 2.48 s, 3H (SCH3). ¹³C NMR (D2O): 173.70, 172.13 a 167.93 (C-2, C-4 a C-6); 84.82 (C-5); 73.53 d, J(C,P)=10.7 Hz (C-2’); 70.01 d, J(C,P)=156.3 Hz (P-CH₂); 69.20 (C-l ’); 16.02 (SCH₃).

• · · · ♦ · ·· · · · · · ··· • · · · · ···· • · ··· ····»··· • · ··· · · · ····· ·· · · · · · ·

Příklad 10 /\^O^P(O)(OiC₃H₇)₂ ^_χ^Ο_χ^Ρ(Ο)(ΟΗ)₂

σ

h kK 'NT ^/XZ°\/^P(^O)(^OiC3^H7)² A A\ /O\ /P(O)(OH)2 H2N ν o H2N |\| ^x0 ^{X Z x}

H-3444

2-amino-4,6-bis[2-(fosfonomethoxy)ethoxy]pyrimidin a 2-amino-4-[2(fosfonomethoxy)ethoxy]-l-[2-(fosfonomethoxy)ethyl]pyrimidin-6(lH)-on

Směs 2-amino-4,6-dihydroxypyrimidinu (12,7 g, 0,1 mol) a uhličitanu česného (27,8 g, 85 mmol) v DMF (200 ml) byla míchána 1 h při 100°C, byl přidán diisopropyl 2chlorethoxymethylfosfonát (30 ml). Směs byla míchána 16 h při 100°C, za horka zfiltrována a odpařena ve vakuu. Odparek byl přečištěn chromatografií na koloně (200 ml) naplněné silikagelem za zisku 2,8 g olejovité látky, která byla pak reagována s bromtrimethylsilanem (7 ml) v acetonitrilu (50 ml) přes noc. Odparek byl rozpuštěn ve vodě (100 ml), byl přidán konc. vodný roztok amoniaku až do alkalické reakce a směs byla odpařena. Odparek byl deionizován • 0 0000 00 0 0 9 0 0

9 0 9

0 0 0 0

0 0 0

0000 0 00

00 ta

0 ·0

0 0 0 ·

0 0 0 0000 0 0 0 0

000 00 9 na koloně (100 ml) naplněné Dowexem 50 X 8 a UV-absorbující amoniakální eluát byl odpařen do sucha. Tento produkt byl pak kodestilován s ethanolem a filtrován z ethanolu. Výtěžek 1,4 g 2-amino-4,6-bis[2-(fosfonomethoxy)ethoxy]pyrimidinu, t.t. 127°C. Pro C10H19N3O10P2 (403,22) vypočteno 29,79%C, 4,75%H, 10,42%N, 15,36%P; nalezeno 29,90%C, 4,87%H, 10,24%N, 15,64%P. ^!H NMR (DMSO): 6.55 b, 2H (NH2); 5.36 s, 1H (H-5); 4.29 m, 2H (2xH1’); 3.76 m, 2H (2xH-2’); 3.58 d, 2H, J(H,P)=8.6 Hz (P-CH2). ¹³C NMR (DMSO): 171.30 (C4, C-6), 162.76 (C-2); 78.60 (C-5); 70.70 d, J(C,P)=11.7Hz (C-2’); 66.86 d, J(C,P)=160.2 Hz (P-CH2); 64.81 (C-l’).

Další eluce ze silikagelové kolony poskytla hustý olej (4,8 g), který byl reagován s bromtrimethylsilanem (10 ml) v acetonitrilu (70 ml) přes noc, směs pak byla odpařena ve vakuu. Odparek byl nanesen na Dowex 50 X 8 (H⁺) v koloně (150 ml) a kolona byla eluována vodou. Po vymytí anorganických kyselin eluoval s retencí produkt. Produktová frakce byla odpařena a odparek rozmíchán ve směsi ethanol-aceton (1:1, 100 ml). Žlutavý produkt byl odfiltrován, promyt etherem a vysušen. Výtěžek 1,8 g 2-amino-4-[2-(fosfonomethoxy)ethoxy]l-[2-(fosfonomethoxy)ethyl]pyrimidin-6(lH)-onu, t.t. 108°C. Pro C10H19N3O10P2 (403,22) vypočteno 29,79%C, 4,75%H, 10,42%N, 15,36%P; nalezeno 29,90%C, 4,87%H, 10,24%N, 15,64%P.

• · • ·

Příklad 11

HOCH₂CH₂OH

NaH nebo tBuOK

1. BrSiMe₃

2. H₂O

H₂N

OH

°\/^P(0)(0H)2

O^PÍOXOÍPr), (a) 2,4-diamino-6-[2-(fosfonomethoxy)ethoxy]pyrimidin

Hydrid sodný (60% suspenze v parafinovém oleji) (2,4 g, 60 mmol) byl opatrně po částech přidán k čerstvě předestilovanému ethylenglykolu (50 ml) za vyloučení vlhkosti až do rozpuštění. 2,4-diamino-6-chlorpyrimidin (2,89 g, 20 mmol) byl pak přidán v jediné dávce a směs byla míchána 6 h při 80°C. Reakční směs byla ochlazena, zředěna vodou (200 ml) a nanesena na kolonu (200 ml) naplněnou Dowexem 50 X 8 v kyselém cyklu. Kolona byla promyta vodou (1 1) a nosič byl suspendován ve vodě (300 ml). Tato suspenze byla alkalizována konc. vodným roztokem amoniaku, filtrována a pevná fáze byla promyta vroucí vodou (1 1). Spojené filtráty byly odpařeny do sucha a odparek byl krystalizován z vody za zisku 2,4-diamino-6-(2-hydroxyethoxy)pyrimidinu, t.t. 190°C. Výtěžek 2,3 g (79,4%). Pro C₆H₁₀N4O2 (170,18) vypočteno 42,34%C, 5,92%H, 30,37%N; nalezeno 42,09%C, 5,89%H, 30,63%N. Hmotnostní spektrum: 171,3 (MH⁺). 'H NMR (CD3SOCD3):3,67 br q, 2H, J(CH₂,CH₂)~J(CH₂,OH)=4,8 (O-CH₂); 4,101,2H, J(CH₂,CH₂)=5,0 (O-CH₂); 4,791, 1H, J(OH,CH₂)=4,5 (OH); 5,05 s, 1H (H-5); 5,89 br s, 2H a 6,01 br s, 2H (NH₂).

Tato látka (4,25 g, 25 mmol) a diisopropyl p-toluensulfonyloxymethylfosfonát (8,75 g, 25 mmol) byly reagovány s 60% hydridem sodným (3,5 g, 3,5 ekvivalentu) v DMF (50 ml). Směs byla míchána za teploty místnosti 3 dny, pak byla po kapkách přidána kyselina octová (4 ml). Rozpouštědlo bylo odtaženo ve vakuu a odparek byl extrahován chloroformem. Produkt reakce byl přečištěn kolonovou chromatografií na silikagelu a rekrystalizován ze směsi φ φ φ φ φ φ φ φ φ ethylacetát-petrolether. Výtěžek 6,45 g (74%) 2,4-diamino-6-[2(diisopropylfosfonylmethoxy)ethoxy]pyrimidinu, t.t. 159°C. Pro C13H25N4O5P (348,3) vypočteno 44,83%C, 7,23%H, 16,08%N, 8,89%P; nalezeno 44,86%C, 7,15%H, 16,21%N, 9,05%P. Hmotnostní spektrum: 349,3 (MH⁺). Ή NMR spektrum (CD3SOCD3) je identické se spektrem popsaným v příkladu 1.

Převedení této sloučeniny na 2,4-diamino-6-[2-(fosfonomethoxy)ethoxy]pyrimidin bylo provedeno způsobem popsaným v příkladu 1 a podle NMR a hmotnostních spekter poskytlo sloučeninu identickou s výsledkem v příkladu 1.

(b) 2,4-diamino-6-[2-(fosfonomethoxy)ethoxy]pyrimidin

Reakce byla provedena stejným způsobem jako v oddílu (a), jen hydrid sodný byl nahrazen stejným molárním množstvím tert-butoxidu draselného. Výtěžek 2,4-diamino-6-(2hydroxyethoxy)pyrimidinu byl 81%. Další postup zůstal nezměněn.

Příklad 12

1.TsOCH₂P(O)(OiPr)₂/NaH

Tr...(C₆H₅)₃C Ts ... p-toluensulfonyl iPr... isopropyl (a) 2,4-diamino-6-[(RS)-3-hydroxy-2-(fosfonomethoxy)propoxy]pyrimidin

4-hydroxymethyl-2,2-dimethyl-l,3-dioxolan (13,2 g, 0,1 mol) byl rozpuštěn v čerstvě předestilovaném tetrahydrofuranu (100 ml) a po kapkách přidán do suspenze hydridu sodného (0,2 mol) v tetrahydrofuranu (400 ml). Směs pak byla míchána až do rozpuštění a byl přidán

2,4-diamino-6-chlorpyrimidin (14,46 g, 0,1 mol). Reakční směs byla refluxována 12 h za stálého míchání v atmosféře argonu a pak neutralizována kyselinou octovou. Suspenze byla zfiltrována, promyta tetrahydrofuranem a filtrát byl odpařen do sucha ve vakuu. Přečištění v • « 9 9 · 9 9 9 9 • · «9 9 · 9 9 99999 • 9 999 999

99999 99 999 99 9 chloroformu na koloně (300 ml) naplněné silikagelem a krystalizace ze směsi ethylacetátpetrolether poskytly 2,4-diamino-6-[2,2-dimethyl-l,3-dioxolanyl-4-methoxy]pyrimidin, t.t. 128°C. Výtěžek 16,0 g (66,6%). Pro C₁₀H,6N₄O3 (240,3) vypočteno 49,99%C, 6,71%H, 23,32%N; nalezeno 49,95%C, 6,84%H, 23,05%N. Hmotnostní spektrum: 241,3 (MH⁺). 'li NMR (CD3SOCD3): 1.27 s, 3 H a 1.33 s, 3 H (CH₃); 3.68 dd, 1H, J(3’b,2’)=6.2, J(gem)=8.3 (H-3’b); 4.02 dd, 1H, J(3’a,2’)=6.6, J(gem)=8.3 (H-3’a); 4.19 m, 2H (H-l’a); 4.10 dd, 1H, J(l’b,2’)=6.0, J(gem)=11.0 (H-l’b); 4.13 dd, 1H, J(l’a,2’)=5.0, J(gem)=11.0 (H-l’a); 4.30 m, 1H (H-2’); 5.06 s, 1H (H-5); 5.94 br s, 2H a 6.06 br s, 2H (NH₂). ¹³C NMR (CD3SOCD3):

25.75 a26.94 (CH₃); 65.72 (C-3’); 66.22 (C-l’); 74.00 (C-2’); 76.58 (C-5); 109.06 (CTr); 163.23 a 166.38 a 170.11 (C-6, C-2, C-4).

Tato látka (14,4 g, 60 mmol) byla ponechána stát přes noc při teplotě místnosti v 0,25 M kyselině sírové (250 ml). Směs byla neutralizována nasyceným roztokem hydroxidu barnatého, zfiltrována a filtrát odpařen do sucha. Odparek po rekrystalizaci z 90% ethanolu s přídavkem etheru (do zakalení) poskytl 2,4-diamino-6-[2,3-(dihydroxy)propoxy]pyrimidin, t.t. 160°C. Výtěžek 10,0 g (83,3%). Pro C7H12N4O3 (200,2) vypočteno 42,00%C, 6,04%H, 27,99%N; nalezeno 41,84%C, 6,24%H, 28,06%N. Hmotnostní spektrum: 201,2 (MH⁺). *H NMR (CD3SOCD3): 3.40 d, 2H, J(3’,2’)=5.4 (H-3’); 3.72 m, 1H (H-2’); 4.01 dd, 1H, J(l’b,2’)=6.2, J(gem)=T0.9 (H-l’b); 4.10 dd, 1H, J(l’a,2’)=4.4, J(gem)=10.9 (H-l’a); 4.73 br s, 1H a 5.02 br s, 1H (OH); 5.09 s, 1H (H-5); 5.99 br s , 2H a 6.07 br s, 2H (NH₂). ¹³C NMR (CD3SOCD3): 63.14 (C-3’); 67.16 (C-l’); 70.28 (C-2’); 76.64 (C-5); 163.19 a 166.27 (C-2, C-4); 170.62 (C6)·

Směs této sloučeniny (8,0 g, 40 mmol), tritylchloridu (36,4 g, 131 mmol) a 4dimethylaminopyridinu (2 g) v pyridinu (160 ml) byla míchána 15 h při 50°C a za stálého míchání pomalu nalita do vody (2 1). Suspenze byla míchána 1 h, dekantována a po míchání s dalším podílem vody (2 1) byla zfiltrována a promyta vodou. Sraženina byla rozpuštěna v chloroformu (600 ml), sušena síranem hořečnatým, chloroform odpařen a sraženina ještě kodestilována s toluenem (3 x 100 ml) ve vakuu. Výsledná hmota byla rozpuštěna v minimálním objemu etheru a po kapkách přidána za prudkého míchání do petroletheru (1 1). Sraženina byla zfiltrována, promyta petroletherem a vysušena. Výtěžek 33,4 g (91,5%) 6-[2hydroxy-3-(trityloxy)propoxy]-2,4-bis(tritylamino)pyrimidinu, t.t. 138°C. Pro C64H₅4N₄O₂(911,1) vypočteno 6,15%N; nalezeno 5,96%N. Tento tritylový derivát (27,3 g, 30 mmol) a diisopropyl p-toluensulfonyloxymethylfosfonát (15,75 g, 45 mmol) byly reagovány v tetrahydrofuranu (300 ml) s 60% hydridem sodným (5,4 g, 3,5 ekvivalentu). Směs byla míchána 3 dny za teploty místnosti a neutralizována kyselinou octovou. Rozpouštědlo bylo • · · · • · · · · · · · ····· • · ··· ···

9· · ·· ··· · · · odtaženo ve vakuu, odparek rozpuštěn v ethylacetátu (800 ml) a extrahován vodou (3 x 200 ml). Organická fáze byla odpařena do sucha a odparek refluxován 30 min v 80% vodném roztoku kyseliny octové (300 ml), ochlazen a odpařen ve vakuu. Byla přidána voda (300 ml) a směs byla extrahována etherem (4 x 100 ml). Vodná fáze byla zbavena těkavých složek ve vakuu a nanesena na kolonu (200 ml) naplněnou Dowexem 50 X 8 v kyselé formě. Kolona byla promývána vodou až do poklesu kyselosti a UV-absorbance a pak eluována 2,5% vodným roztokem amoniaku. UV-absorbující amoniakální eluát byl jímán, odpařen do sucha ve vakuu, odparek kodestilován s ethanolem (3 x 100 ml) a sušen nad oxidem fosforečným ve vakuu přes noc. Pak byly přidány acetonitril (100 ml) a bromtrimethylsilan (30 ml) a směs byla ponechána stát přes noc s vyloučením vlhkosti. Po odpaření těkavých složek ve vakuu byla ke zbytku přidána voda (200 ml) a konc. vodný roztok amoniaku až do alkalické reakce. Roztok byl odpařen do sucha a odparek deionizován na koloně (200 ml) naplněné Dowexem 50 X 8 za stejných podmínek. UV-absorbující amoniakální eluát byl odpařen ve vakuu, odparek byl rozpuštěn v minimálním množství vody a alkalizován amoniakem na pH 10. Tento roztok byl nanesen na kolonu (200 ml) s Dowexem 1X2 (acetátová forma), předem promytou vodou. Kolona byla promývána vodou do poklesu UV absorbance eluátu a pak lineárním gradientem kyseliny octové (0-0,3 M, 1,5 1 každé). Hlavní UV-absorbující frakce byla jímána, odpařena ve vakuu a odparek kodestilován s vodou (2 x 100 ml). Krystalizace odparku z vody poskytla 2,4diamino-6-[(RS)-3-hydroxy-2-(fosfonomethoxy)propoxy]pyrimidin ve formě monohydrátu. Výtěžek 3,8 g (40,6%), bílé jehličky, t.t. 213°C. Pro QHis^OňP-H/O (312,2) vypočteno 30,78%C, 5,49%H, 17,94%N, 9,92%P; nalezeno 30,98%C, 5,52%H, 17,99%N, 9,82%P. Hmotnostní spektrum: 295,0 (MH⁺). *HNMR (D2O + NaOD): 3.48 dd, 1H, J(P,CHb)=9.8, J(gem)=12.1 (P-CHb); 3.59 dd, 1H, J(P,CHa)=8.9, J(gem)=12.1 (P-CHa); 3.61 dd, 1H, J(3’b,2’)=6.8, J(gem)=12.9 (H-3’b); 3.70 m, 1H (H-2’); 3.71 dd, 1H, J(3’a,2’)=3.6, J(gem)=T2.9 (H-3’a);4.11 dd, 1H, J(l’b,2’)=5.0, J(gem)=10.7 (H-l’b); 4.14 dd, 1H, J(l’a,2’)=4.6, J(gem)=10.7 (H-l’a); 5.36 s, 1H (H-5); ^I3C NMR (D2O + NaOD): 60.62 (C-3’); 65.58 (C-l’); 68.03 d, J(P,C)=149.4 (P-C); 76.63 (C-5); 79.89 d, J(P,C)=10.7 (C-2’); 162.63 a 166.54 (C-2, C-4); 170.78 (C-6).

(b) 2,4-diamino-6-[(S)-3-hydroxy-2-(fosfonomethoxy)propoxy]pyrimidin (S)-2,2-dimethyl-4-hydroxymethyl-l,3-dioxolan (40 g, 0,3 mol) čerstvě připravený z l,2:5,6-diisopropyliden-D-mannitolu a předestilovaný ve vakuu byl po kapkách přidán do suspenze hydridu sodného (0,3 mol) v tetrahydrofuranu (600 ml). Směs byla míchána 30 min a byl přidán 2,4-diamino-6-chlorpyrimidin (36,2 g, 0,25 mol). Reakční směs byla 12 h

0 0 0 0 • 0 000 000 • 0000 00 000 0 0 · refluxována za stálého míchání v atmosféře argonu a neutralizována kyselinou octovou. Suspenze byla zfiltrována, sraženina promyta tetrahydrofuranem a filtrát odpařen do sucha ve vakuu. Přečištění v chloroformu na koloně (600 ml) se silikagelem a krystalizace ze směsi ethylacetát - petrolether poskytly 2,4-diamino-6-(S)-(2,2-dimethyl-l,3-dioxolan-4ylmethoxy)pyrimidin. Výtěžek 46,0 g (76,6%). Tato sloučenina (43,3 g, 0,18 mol) byla ponechána stát v 0,25 M kyselině sírové (800 ml) přes noc za teploty místnosti. Směs byla neutralizována nasyceným roztokem hydroxidu barnatého, zfiltrována a filtrát odpařen do sucha. Odparek po rekrystalizaci z 90% ethanolu s přídavkem etheru (do zakalení) poskytl 2,4diamino-6-(S)-(2,3-dihydroxypropoxy)pyrimidin, t.t. 149°C. Výtěžek 32,0 g (89%). Pro C7H12N4O3 (200,2) vypočteno 42,00%C, 6,04%H, 27,99%N; nalezeno 41,94%C, 6,35%H, 27,75%N. Hmotnostní spektrum: 201,2 (MH⁺). NMR spektra byla identická se spektry racemické sloučeniny.

Směs této sloučeniny (32,0 g, 0,16 mmol), tritylchloridu (140 g, 0,5 mol) a 4dimethylaminopyridinu (3 g) v pyridinu (500 ml) byla míchána 24 h při 80°C a za stálého míchání pomalu nalita do vody (5 1). Suspenze byla míchána 1 h, dekantována a po míchání s dalším podílem vody (2 1) byla zfiltrována a promyta vodou. Sraženina byla rozpuštěna v chloroformu (2 1), vysušena síranem hořečnatým, odpařena a kodestilována s toluenem (3 x 200 ml) ve vakuu. Výsledná hmota byla rozpuštěna v minimálním množství etheru a za prudkého míchání přikapána do petroletheru (2,5 1). Sraženina byla zfiltrována, promyta petroletherem a sušena vzduchem přes noc. Sušení ve vakuu poskytlo 99,5 g (69%) 6-(S)-[2hydroxy-3-(trityloxy)propoxy]-2,4-bis(tritylamino)pyrimidin. Pro C64H54N4O2 (911,1) vypočteno 6,15%N; nalezeno 5,96%N. Tento tritylový derivát (99,5 g, 0,11 mol) a diisopropyl p-toluensulfonyloxymethylfosfonát (42 g, 0,12 mol) byly reagovány s 60% hydridem sodným (14,4 g, 0,36 mol) v čerstvě vysušeném tetrahydrofuranu (600 ml). Směs byla míchána 3 dny za laboratorní teploty, přefiltrována přes celitovou vatu a k filtrátu byl přidán ethanol (20 ml). Rozpouštědla byla odtažena ve vakuu, odparek refluxován 30 min v 80% vodném roztoku kyseliny octové (500 ml) a ponechán stát za laboratorní teploty přes noc. Krystalický produkt byl odfiltrován, promyt 80% kyselinou octovou a filtrát byl odpařen ve vakuu. Byla přidána voda (700 ml) a směs byla extrahována etherem (4 x 200 ml). Vodná fáze byla zahuštěna ve vakuu a nanesena na kolonu (250 ml) s Dowexem 50 X 8 v kyselé formě. Kolona byla promyta 20% vodným roztokem methanolu až do poklesu kyselosti a UV-absorbance a pak eluována 2,5% amoniakem v 20% vodném roztoku methanolu. UV-absorbující amoniakální eluát byl jímán, odpařen do sucha ve vakuu, odparek kodestilován s ethanolem (3 x 100 ml) a sušen nad oxidem fosforečným ve vakuu přes noc. Byl přidán acetonitril (200 ml) a bromtrimethylsilan • · · · · ·

• · · · • · · ···· • · · • · · (50 ml) a směs byla ponechána stát přes noc s vyloučením vlhkosti. Po odtažení těkavých složek ve vakuu byla přidána voda (300 ml) a konc. vodný roztok amoniaku až do alkalické reakce. Tento roztok byl odpařen do sucha a odparek deionizován na koloně (250 ml) naplněné Dowexem 50 X 8 za stejných podmínek. UV-absorbující amoniakální eluát byl odpařen ve vakuu, odparek byl rozpuštěn v minimálním množství vody a pH amoniakem upraveno na 10. Tento roztok byl nanesen na kolonu (250 ml) s Dowexem 1X2 (acetátová forma), předem promytou vodou. Kolona byla promývána vodou do poklesu UV-absorbance eluátu a pak lineárním gradientem kyseliny octové (0-0,3 M, 2 1 každé). Hlavní UV-absorbující frakce byla odpařena ve vakuu a odparek byl kodestilován s vodou (2 x 100 ml). Rekrystalizace z vody poskytla 2,4-diamino-6-[(S)-3-hydroxy-2-(fosfonomethoxy)propoxy]pyrimidin ve formě monohydrátu. Výtěžek 13,8 g (40%), bílé jehličky. Pro C8Hi₅N₄O6P.H₂O (312,2) vypočteno 30,78%C, 5,49%H, 17,94%N, 9,92%P; nalezeno 31,00%C, 5,70%H, 17,79%N, 9,75%P. Hmotnostní spektrum: 295,0 (MH⁺). NMR spektra byla identická se spektry racemické sloučeniny.

•9 ···<

Příklad 13

9 • · ·

9···

Tr...(C₆H₅)₃C

Ts ... p-toluensulfonyl iPr... isopropyl

·♦ ···· ·· · ·· <

• · · ···· ··· • · ·· · · · · · • · · · · · · · ····· • · · · · · · · ···· · ·· ··· ·· ·

2-amino-4-hydroxy-6-[2-(fosfonomethoxy)ethoxy]pyrimidin

4-hydroxymethyl-2,2-dimethyl-l,3-dioxolan (15 ml, 0,12 mol) byl přikapán v rozmezí 30 min do promíchávané suspenze hydridu sodného (60% disperze v parafinovém oleji, 4,8 g, 0,12 mol) v tetrahydrofuranu (250 ml). Po hodinovém míchání za teploty místnosti byl přidán 2-amino-4,6-dichlorpyrimidin (16,4 g, 0,1 mol) a směs byla udržována při teplotě refluxu do úplného zreagování výchozích látek (tenkovrstvá chromatografie na silikagelu, systém methanol-chloroform, 1:9). Směs byla ochlazena, neutralizována přidáním kyseliny octové, zfiltrována přes celit, promyta tetrahydrofuranem a odpařena ve vakuu. Odparek byl dvakrát dekantován etherem (vždy 100 ml), rozpuštěn v chloroformu (100 ml) a přefiltrován přes krátkou kolonu se silikagelem (promývání 1 1 chloroformu). Filtrát byl odpařen ve vakuu a odparek byl rozpuštěn v horkém ethylacetátu; opatrně byl k horkému roztoku přidán stejný objem etheru a pak petrolether až do zakalení. Produkt byl krystalizován v chladničce, zfiltrován, promyt směsí ether/petrolether (1:1) a sušen ve vakuu. Výtěžek 20,5 g (79%) 2amino-4-chlor-6-[2,2-dimethyl-l,3-dioxolan-4-ylmethoxy]pyrimidinu, t.t. 152°C. Pro C10H14CIN3O3 (259,7) vypočteno 46,25%C, 5,43%H, 13,65%C1,16,18%N; nalezeno 46,45%C, 5,46%H, 13,90%Cl, 15,95%N. Ή NMR (CD3SOCD3): 1.28 s, 3 H a 1.33 s, 3 H (CH₃); 3.71 dd, 1H, J(3’b,2’) =6.1, J(gem)=8.4 (H-3’b); 4.05 dd, 1H, J(3’a,2’)=6.6, J(gem)=8.4 (H-3’a); 4.22 dd, 1H, J(1 ’b,2’)=6.3, J(gem)=11.2 (H-l’b); 4.28 dd, 1H, J(l’a,2’)=4.5, J(gem)=11.2 (H-l’a); 4.35 m, 1H (H-2’); 6.10 s, 1H (H-5); 7.08 br s, 2H (NH₂). ¹³C NMR (CD3SOCD3): 25.48 a 26.76 (CH₃); 65.82 a 66.84 (C-l’, C-3’); 73.35 (C-2’); 94.48 (C-5); 109.05 (C‘Pr); 160.21 (C2); 162.95 (C-4); 170.48 (C-6).

Směs této sloučeniny (13 g, 50 mmol), DABCO (12 g) a uhličitanu draselného (21,5 g) ve vodě (300 ml) byla míchána 3 hodiny při teplotě refluxu. Po ochlazení na teplotu místnosti byl po částech přidán Dowex 50X8 (kyselá forma) za stálého míchání až do dosažení pH zhruba 6 pro rozklad uhličitanu a neutralizaci DABCO. Suspenze byla mírně alkalizována přídavkem koncentrovaného vodného roztoku amoniaku, zfiltrována, promyta vodou a filtrát byl odpařen ve vakuu. Dowex byl resuspendován v zředěném (1:20) vodném amoniaku (300 ml), zfiltrován a promyt vroucí vodou (4 x 200 ml). Filtrát a kapalné fáze po promývání byly odpařeny ve vakuu. Oba odparky byly sušeny kodestilací s ethanolem a extrahovány chloroformem. Semikrystalická pevná látka byla odfiltrována, promyta chloroformem a adsorbována z methanolického roztoku na silikagel (50 ml). Tento materiál byl nanesen v chloroformu na krátkou kolonku (150 ml) a produkt byl eluován směsí chloroform-methanol (9:1). Krystalizace z ethanolu s přídavkem etheru (k zakalení) poskytla 2-amino-4-hydroxy-6[(2,2-dimethyl-l,3-dioxolan-4-yl)methoxy]pyrimidin, t.t. 258°C. Výtěžek 8,2 g (68%). Pro ·· ·ΦΦ· ·Φ • · · · · • · · · • · · · · φ · φ φ φφφφ φ φφ • Φ φ φ · φ φ · φ φ φ φ φ φφφφ φφφ φ ·Φ φ

C10H15N3O4 (241,2) vypočteno 46,25%C, 5,43%Η, 13,65%C1, 16,18%N; nalezeno 46,45%C, 5,46%Η, 13,90%Cl, 15,95%Ν. Hmotnostní spektrum: 242 (ΜΗ⁺). Ή NMR (CD3SOCD3): 1.27 s, 3 Η a 1.32 s, 3 Η (CH3); 3.67 dd, 1H, J(3’b,2’) =6.2, J(gem)=8.4 (H-3’b); 4.02 dd, 1H, J(3’a,2’)=6.6, J(gem)=8.4 (H-3’a); 4.05 dd, 1H, J(1 ’b,2’)=6.1, J(gem)=11.0 (H-l’b); 4.10 dd, 1H, J(l’a,2’)=4.6, J(gem)=11.0 (H-l’a); 4.30 qd, 1H, J(1 ’a,2’)=4.6, J(2’,l’)~ J(2’,3’)=6.3 (H2’); 4.78 s, 1H (H-5); 6.67 br s, 2H (NH2), 10.47 br s, 1H (NH). ¹³C NMR (CD3SOCD₃): 25.54 a 26.78 (CH₃); 65.83 (C-3’); 66.70 (C-l’,); 73.63 (C-2’); 79.99 (C-5); 108.94 (C_iPr); 164.25 a 155.69 (C-2, C-6).

Příklad 14

2-amino-6-[2-(diisopropylfosfonylmethoxy)ethoxy]-4-hydroxypyrimidin

Směs 2-amino-4-chlor-6-[2-(diisopropylfosfonylmethoxy)ethoxy]pyrimidinu (5,7 g), DABCO (3,6 g) a uhličitanu draselného (9,0 g) ve vodě (100 ml) byla refluxována 150 min za stálého míchání, ochlazena a okyselena přidáním Dowexu 50X8 (H⁺ forma). Suspenze byla alkalizována koncentrovaným vodným roztokem amoniaku, po 5 min míchání zfiltrována a Dowex byl promyt 50% vodným roztokem methanolu (200 ml). Filtrát byl odpařen do sucha, byl přidán ethanol (50 ml) a směs byla odpařena do sucha. Odparek po chromatografií v gradientu chloroform-ethanol na koloně (150 ml) se silikagelem poskytl krystalický 2-amino6-[2-(diisopropylfosfonylmethoxy)ethoxy]-4-hydroxypyrimidin, t.t. 154°C, v 78% výtěžku. Pro C13H24N3O6P (349,3) vypočteno 44,70%C, 6,92%H, 12,03%N, 8,37%P, nalezeno 44,58%C, 7,02%H, 11,95%N, 8,53%P. *H NMR (CD3SOCD3): 1.24 d, 6 H a 1.23 d, 6 H, J(CH3,CH)=6.2 (4xCH3); 3.74 m, 2 Η (H-2’); 3.76 d, J(CH2-P)=8.3 (CH2-P); 4.19 m, 2H (H-l’); 4.59 m, 2 H (P-OCH); 4.75 s, 1 H (H-5); 6.65 bs, 2 Η, 2H (NH2); 10.45 s, 1H (OH). ¹³C NMR (CD3SOCD3): 23.87 d, 2C, J(CH3,P)=4.9 a 24.01 d, 2C, J(P,C)=3.9 (CH₃); 65.03 d, J(P,C)=164.6 (P-C); 65.04 (C-l’); 70.37 d, 2C, J(P,C)=6.3) (P-OC); 70.87 d, J(P,C)=11.7 (C2’); 79.95 (C-5); 155.68 (C-4); 164.25 (C-2); 171.01 (C-6).

Tento produkt byl reagován s bromtrimethylsilanem (10 ml) v acetonitrilu (80 ml) přes noc, odpařen ve vakuu a odparek byl rozmíchán ve vodě (50 ml). Po 10 minutách byl přidán koncentrovaný vodný roztok amoniaku až do alkalické reakce a směs byla odpařena. Odparek byl deionizován na koloně (100 ml) s Dowexem 50 X 8 a UV-absorbující amoniakální eluát byl odpařen do sucha. Odparek byl rozpuštěn v minimálním množství horké vody přidáním koncentrovaného vodného roztoku amoniaku a okyselen koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou na pH 3-3,5. Sraženina byla odfiltrována, promyta vodou, ethanolem a ···« ·· ©

999 • · 9 9 9 • · · · «9 9 9 9

9 9 9

9999 9 99

9 9 9 • 99999

9 9

9 vysušena ve vakuu za zisku 2-amino-6-[2-(diisopropylfosfonylmethoxy)ethoxy]-4hydroxypyrimidinu. Výtěžek 0,7 g, t.t. 227°C. Pro C7H12N3O6P (265,16) vypočteno 31,71%C, 4,56%H, 15,85%N, 11,68%P; nalezeno 31,55%C, 4,62%H, 16,15%N, 11,51%P.

Příklad 15

R₄ = halogen

2,4-diamino-5-brom-6-[2-(fosfonomethoxy)ethoxy]pyrimidin

2,4-diamino-6-[2-(diisopropylfosfonylmethoxy)ethoxy]pyrimidin (4,3 g, 12,3 mmol) v dimethylformamidu (40 ml) byl 3 h míchán v roztoku bromu v tetrachlormethanu (0,3 M, 50 ml) za teploty místnosti, směs byla alkalizována triethylaminem a odpařena. Surový produkt byl přečištěn na koloně (150 ml) se silikagelem v systému chloroform-ethanol a krystalizován ze směsi ethylacetát - petrolether. Výtěžek 3,9 g (11,9 mmol) diesteru byl reagován s bromtrimethylsilanem (20 ml) v acetonitrilu (50 ml) přes noc, směs odpařena ve vakuu a rozložena směsí amoniak-voda. Po deionizaci na Dowexu 50 v 100 ml koloně byl výsledný amoniakální eluát přečištěn chromatografií na Dowexu 1 X 2 v 100 ml koloně v gradientu kyseliny octové (0-0,5 Μ, 11 každé). Hlavní frakce byla odpařena a krystalizována z vody za

zisku 3,1 g (84%) požadované sloučeniny, t.t. 218°C. Pro CyH^BrNziOsP (343,07) vypočteno 24,51%C, 3,53%H, 23,29%Br, 16,33%N, 9,03%P; nalezeno 24,56%C, 3,55%H, 23,51%Br, 16,07%N, 8,89%P.

Tato reakce byla zopakována s 2-amino-6-[2-(diisopropylfosfonylmethoxy)ethoxy]-4hydroxypyrimidinem za vzniku 5-halogen analogu.

Příklad 16

Antivirové účinky sloučenin podle tohoto vynálezu byly stanoveny v souladu s obecnými postupy popsanými v J. Balzarini et al.: „9-(2-fosfonylmethoxyethyl)adenine (PMEA) effectively inhibits retrovirus replication in vitro and simial immunodeficiency virus infection in rhesus monkeys“, AIDS 5:21-28, 1991 a J. Balzarini et al.: „Differential antiherpesvirus and antiretrovirus effects of the (S) and (R) enantiomers of acyclic nucleoside phosphonates: potent and selective in vitro and in vivo antiretrovirus activities of (R)-9-(2phosphonomethoxypropyl)-2,6-diaminopurine“, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 37:332-338, 1993.

Výsledky jsou shrnuty v tabulce la, kde je vyšší účinnost udána menší absolutní hodnotou.

Příklad 17

Viry. Původ virů MSV, HIV typu 1 (HIV-l)(kmeny IIIb a Ba-L), HIV-2 (kmen ROD) a FIV (kmen Petaluma) byl již popsán dříve (Balzarini et al.: AIDS 5:21-28, 1991; De Clercq et al.: Proč. Soc. Exp. Biol. Med. 137:590-594, 1971; Egberink et al.: Proč. Nati. Acad. Sci. 87:3087-3091, 1990; Hartmann et al.: Antiviral Chem. Chemother. 5:13-19, 1994; Popovic et al.: Science 224: 497-500, 1984). HIV-I(IIIb) aHIV-2(ROD) zásoby byly získány ze supernatantů buněčných kultur MT-4 infikovaných viry. HIV-l_BaL byl rozmnožen v lidském primárním M/M, jehož supernatant byl jímán, filtrován a uchováván při -80°C. Charakteristiky virových kultur použitých v této práci byly 2,1 x 10⁸ HIV-RNA genomů/ml (to odpovídá 35 ng antigenu p 24) a 5000 infekčních dávek pro tkáňové kultury 50% per ml (TCID₅o/ml), jak bylo stanoveno virovou titrací dalších primárních M/M kultur. Izolace a charakterizace klinických HIV-1 izolátů LIS, L6S a L6S/PMEA již byla popsána (Thormar et al.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93:3283-3287, 1995; Van Laethem et al.: AIDS 15:553-561, 2001). HIV-1/L1S klinický izolát byl odebrán z pacienta neléčeného NRTI (nukleosidové inhibitory reverzní transkriptázy) • ·

nebo ANP a kultivován bez selekčního tlaku jakéhokoliv léčiva. Proto neobsahoval žádné obvyklé mutace, charakteristické pro pacienty léčené NRTI nebo ANP. HIV-1/L6S je klinický izolát z léčeného pacienta, kultivovaný bez selekčního tlaku jakéhokoliv léčiva. Jak je obvyklé v případě pacientů léčených NRTI, obsahoval S68G, K70T, V75I, F77L, F116Y a Q151M mutace v reverzní transkriptáze. HIV-1/L6S/PMEA je klinický izolát HIV-1/L6S, který byl izolován po kultivaci viru 11 ti pasážemi v přítomnosti vzrůstající koncentrace PMEA (adefovir). Získal tím navíc k mutacím vyjmenovaným pro HIV-1/L6S ještě mutaci K65R v reverzní transkriptáze, charakteristickou pro PMEA.

Radioaktivně značené chemikálie. [Methyl-³H]thymidin (specifická aktivita 42

Π o

Ci/mmol), [5- Hjuridin (specifická aktivita 26 Ci/mmol) a [4,5- Hjleucin (specifická aktivita 52 Ci/mmol) byly dodány Amersham Pharmacia Biotech (Buckinghamshire, Velká Británie).

Testované sloučeniny. V této studii byly použity následující sloučeniny: 1, 2,4diamino-6-[2-(fosfonomethoxy)ethoxy]pyrimidin; 2, 2,4-diamino-6-[2(fosfonomethoxy)ethylsulfanyl]pyrimidin; 3, 4-amino-6-[2-(fosfonomethoxy)ethoxy]pyrimidin; 4, 2-amino-4-hydroxy-6-[2-(fosfonomethoxy)ethoxy]pyrimidin; 5, 2-amino-4-hydroxy-6-[2(fosfonomethoxy)ethylsulfanyl]pyrimidin; 6, 2-amino-4-dimethylamino-6-[2(fosfonomethoxy)ethoxy]pyrimidin; 7, 2-amino-4-cyklopropylamino-6-[2(fosfonomethoxy)ethoxy]pyrimidin; 8, 4-amino-2-methylsulfanyl-6-[2(fosfonomethoxy)ethoxy]pyrimidin; 9, 2-amino-4-methyl-6-[2(fosfonomethoxy)ethoxy]pyrimidin; 10, 2,4-diamino-6-(S)-[2(fosfonomethoxy)propoxy]pyrimidin; 11, 2,4-diamino-6-(R)-[2(fosfonomethoxy)propoxy]pyrimidin; PMEA, 9-[2-(fosfonomethoxy)ethyl]adenin; (R)-PMPA; (R)-9-[2-(fosfonomethoxy)propyl]adenin.

Antivirové testy in vitro. Aktivita proti HIV-1- a HIV-2-indukované cytopaticitě byla zkoumána na buněčných kulturách MT-4 v pátém dni po infekci a založena na stanovení životaschopnosti buněk barvením trypanovou modří, nebo na buněčných kulturách CEM ve čtvrtém až pátém dni po infekci a založena na mikroskopickém pozorování virově indukované tvorby obrovských buněk. HIV-1 a HIV-2 byly k buněčným kulturám přidávány v množství 100 CCID₅₀.

Jednojaderné buňky periferní krve (PBMC) ze zdravých dárců byly izolovány hustotní centrifugací (Lymphoprep; Nycomed Pharma, AS Diagnostics, Oslo, Norsko) a 3 dny stimulovány fytohemaglutinem (PHA) (sigma Chemical Co., Bornem, Belgie). Aktivované buňky byly promyty PBS a nakaženy virovou infekcí podle postupu popsaného v protokolech klinických zkoušek AIDS. Krátce, PBMC (2 x 10⁵/200 jamek) byly naočkovány v přítomnosti • 9

9 ·· 9 9 · 9 · · · • · 9 · · · ·· ····· . · 9·· 9··

9··· · ·· ··· ·· * postupně ředěných testovaných sloučenin a infikovány HIV ze zásob v množství 1000 CCID50 na ml. Ve čtvrtém dni po infekci bylo odebráno 125 μΐ supernatantu z infikovaných kultur a přidáno 150 μΐ nového média obsahujícího testované sloučeniny v příslušné koncentraci.

V sedmém dni po naočkování buněk byl detekován antigen p24 v supernatantu kultur testem s enzymem vázaným na imunosorbentu (NEN, Paříž, Francie).

Lidské primární makrofágy (M/M) byly připraveny a čištěny následovně. Jednojaderné buňky periferní krve (PBMC), získané ze zdravých HIV-1-negativních dárců, byly rozděleny na Ficollově gradientu a naočkovány na 48-jamkové destičky v hustotě 1,8 x 10⁶ buněk/jamka v 1 ml RPMI 1640 činidla obsahujícího 20% tepelně inaktivovaného fetálního bovinního séra neobsahujícího endotoxiny ani mykoplasmu (Hyclone Laboratories, lne., Logan, UT), 4 mM Lglutaminu (Life Technologies), 50 U/ml penicilinu a 50pg/ml streptomycinu (Life Technologies) - dále nazýváno úplným médiem. Pět dní po naočkování a kultivaci PBMC buněk při 37°C ve vlhké atmosféře obohacené 5% CO₂ byly adherentní buňky opatrně odstraněny opakovaným promýváním teplým RPMI-1640. Výsledná mono vrstva adherentní ch buněk byla inkubována v úplném médiu. Buňky pěstované za těchto podmínek jsou z více než 97% lidské primární mikrofágy M/M jak bylo stanoveno cytofluorimetrickou analýzou. Makrofágy byly 30 minut vystaveny působení sloučenin, pak byly vystaveny působení 300 TCIDso/ml linie HIV-lsaL- Dvě hodiny po virové nákaze byly M/M promyty, aby se odstranilo virové inokulum, bylo přidáno úplné médium obsahující odpovídající koncentrace sloučenin a M/M buňky byly pak kultivovány po celou dobu trvání experimentu. Každá koncentrace sloučeniny byla testována paralelně třikrát, zatímco pozitivní kontroly byly testovány v šesti paralelních pokusech. Sloučeniny byly při každé výměně média znovu vráceny. Supernatanty byly odebrány 14. den po infekci pro stanovení produkce viru analýzou HIV-1 antigenu p24.

Pro testy anti-FIV bylo naočkováno 10⁵ CrFK buněk na 24-jamkové destičky pro tkáňové kultury. Buňky byly kultivovány s 2 ml kultivačního média obsahujícího 2,5% fetálního telecího séra na jamku v přítomnosti různých účinných látek. Byly vždy prováděny tři paralelní testy. Po jednohodinové inkubaci při 37°C byly buňky infikovány FIV. Virus byl ponechán v kontaktu s kulturami 1 den, poté bylo médium odstraněno a nahrazeno novým médiem obsahujícím odpovídající koncentraci účinné látky. Po 6 dnech byla zjišťována přítomnost FIV antigenu p24 testem zachycení antigenu.

Inhibiční účinek testovaných sloučenin na MSV-indukovanou transformaci buněčných kultur C3H/3T3 fibroblastů myšího embrya byl zjišťován mikroskopicky v šestém dni po infekci. MSV byl k buněčným kulturám přidán v 75 jednotkách tvořících ložiska. Podrobný postup hodnocení antiretrovirové aktivity byl popsán dříve (Balzarini et al.: AIDS 5:21-28, • ·

9 9 • ·

1991; Balzarini et al.: Antimicrob. Agents Chemother. 37:332-338, 1993; De Clercq et al.:

Proč. Soc. Exp. Biol. Med. 137:590-594, 1971).

Anti-MSV aktivita in vivo. Inhibiční účinek sloučenin na iniciaci tvorby MSVindukovaného tumoru a četnost přežití myší naočkovaných MS V byly stanovovány podle již dříve popsaného postupu (Balzarini et al.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86:332-336, 1989; Balzarini et al.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88:4961-4965, 1991; Balzarini et al.: Antimicrob. Agents Chemother. 37:332-338, 1993). Krátce, 2 až 3 dny staré NMRI myši byly subkutánně na levé zadní noze infikovány MS V a léčeny intraperitoneálně jednou dávkou testované sloučeniny 4 h před virovou infekcí (1. den), následovanou jednotlivými dávkami testované sloučeniny 2., 3., 4., a 5. den. Dávky účinné látky byly 50, 20, 8, 4, a/nebo 2 mg/kg/den pro tenofovir ((R)-PMPA), adefovir (PMEA), 1 (PMEO-2,4-di-NH₂-Pym), 2 (PMES-2,4-di-NH₂Pym) a 11 ((R)-PMPO-2,4-di-NH₂-Pym). Ani pro nejvyšší dávku testovaných sloučenin nebyla pozorována žádná toxicita. Vzhled a růst MSV-indukovaných tumorů v místě naočkování viru, stejně jako přežití myší do 30 dnů po infekci, byly zaznamenávány denně.

Cytostatický a antimetabolický účinek fosfonátů acyklických nukleosidů in vitro. Postupy zkoumání inhibice růstu CEM buněk testovanými sloučeninami byly již popsány dříve (Balzarini et al.: AIDS 5:21-28, 1991). 50% cytostatická koncentrace (CC50) je definována jako koncentrace sloučeniny, která snížila počet živých buněk na 50%. K měření toxicity testovaných sloučenin vůči buňkám MT-4 bylo 5 χ 10⁴ MT-4 buněk inkubováno v jamkách 96jamkových mikrodestiček v přítomnosti nebo nepřítomnosti testovaných sloučenin 5 dní při teplotě 37°C. Hodnota CC50 pak byla vypočtena z počtu živých buněk spočítaných pod mikroskopem metodou vyloučení trypanové modři.

Π -3 o

Inkorporace [methyl- Hjthymidinu, [ Hjuridinu a [ Hjleucinu do frakce CEM buněk nerozpustných v methanolu byla také měřena na mikrodestičkách. Do každé jamky bylo přidáno 10⁵ CEM buněk, 5,9 pmol (0,25 pCi) [methyl-³H]thymidinu, 38 pmol (1,0 pCi) [³H]uridinu a 19 pmol (1,0 pCi) [4,5-³H]leucinu a určené množství testované sloučeniny.

Buňky byly ponechány množit 20 h při 37°C ve vlhké atmosféře s kontrolovaným obsahem CO₂. Po skončení této inkubační doby byl obsah jamek (200 μΐ) nanesen na 25 mm filtry ze skleněného vlákna (typA/G; Gelman Instrument Co., Ann Arbor, MI) upevněné na dávkovači vzorků Millipore 3025. Filtry byly dvakrát promyty studeným PBS (fosfátem pufrovaný fyziologický roztok), dvakrát studenou 10% trichloroctovou kyselinou, dvakrát studenou 5% trichloroctovou kyselinou, jednou studeným ethanolem a jednou studeným etherem. Filtry pak byly sušeny 10 min při 60°C a jejich radioaktivita měřena scintilátorem na bázi toluenu.

·« ····

Anti-HIV-1 aktivita fosfonátových analogů acyklických pyrimidinových nukleosidú v buněčných kulturách CEM. Podmínkou pro silný antiretrovirový účinek je přítomnost aminoskupiny na uhlíku C-2 pyrimidinového kruhu společně s aminoskupinou na uhlíku C-4 (tj. sloučeniny 1,2,11) nebo hydroxylovou skupinou na C-4 (tj. sloučenina 4) (tabulka 1). Tyto 6-PMEO a 6-PMPO substituované pyrimidinové struktury dávají anti-HIV účinek s EC50 pohybujícím se mezi 0,80 a 2,0 pg/ml. Nepřítomnost aminoskupiny na C-2 (tj. sloučeniny 3, 8) nebo přítomnost dimethylamino, methyl nebo cyklopropylamino skupiny na C4 (tj. sloučeniny 6, 9, 7) má za následek úplné zmizení antiretrovirového účinku (tabulka 1). Thioetherové deriváty byly zcela pravidelně 5 až 1 Okřát méně účinné než odpovídající etherové deriváty (srv. sloučeninu 2 se sloučeninou 1) nebo úplně neúčinné (sloučenina 5). Je zajímavé, že antiretro virová aktivita nových pyrimidinových ANP vykazovala patrnou enantiospecificitu účinku proti HIV-1. (R)-6-PMPO derivát pyrimidinu 11 byl zjevně silnějším inhibitorem těchto virů než odpovídající (S)-6-PMPO derivát pyrimidinu 10 (tabulka 1). Zbytková antivirová aktivita zaznamenaná pro (S)-enantiomer může pocházet z kontaminace (R)-enantiomerem pocházejícím z chirální výchozí látky (1-2%).

Pro většinu sloučenin byla zaznamenána malá, pokud vůbec nějaká, cytotoxicita při koncentraci 100 pg/ml, s nápadnou výjimkou sloučeniny 4 (CC50: 2,5 pg/ml pro CEM buňky). Pro 6-PMEO-2,4-di-NH2 derivát pyrimidinu (1), který vykazoval nejvyšší antivirovou aktivitu, byla naměřena CC50 11 pg/ml pro CEM buňky, zatímco jeho thioetherový analog 2 a (R)- 6PMPO-2,4-di-NH₂ derivát pyrimidinu 11 měly hodnoty CC50 kolem 60 pg/ml (tabulka 1). Je zajímavé, že 5-brom-derivát sloučeniny 1 byl účinný proti HIV-1 v buněčných kulturách CEM v koncentraci 2,5 pg/ml a netoxický při 100 pg/ml. Sloučeniny 1, 2 ani 11 neinhibovaly inkorporaci [³H]dThd, [³H]Urd a [³H]leu do TCA-nerozpustného CEM buněčného materiálu při 12tihodinové inkubační době a koncentraci 200 pg/ml. Ani PMEA a (R)-PMPA neinhibovaly syntézu makromolekul v této koncentraci (data neuvedena).

Antiretrovirová aktivita fosfonátových analogů acyklických pyrimidinových nukleosidú v některých systémech virus/buňka. Byla hodnocena inhibiční aktivita 6-PMEO derivátů 1 a 4, 6-PME thioetheru (6-PMES) 2 a (R)-6-PMPO derivátu 11 proti některým retrovirovým modelům in vitro (tabulka 2). Zpravidla hodnoty antivirové aktivity testovaných sloučenin nalezené pro HIV-Í(IIIb) v CEM buněčných kulturách (tabulka 1) byly blízké hodnotám antivirové aktivity nalezeným pro HIV-2(ROD) v buňkách CEM, HIV-1 a HIV-2 v MT-4 buněčných kulturách a FIV v kočičích Crandellových ledvinových buňkách. Tak hodnoty EC50 sloučeniny 1 pro HIV byly v rozmezí 0,29 až 0,80 pg/ml a hodnoty sloučeniny 11 v rozmezí 1,3 až 3,0 pg/ml. Tyto hodnoty byly blízké hodnotám pozorovaným pro referenční » · · · · · sloučeniny PMEA (adefovir)(EC₅₀: 0,96-2,0 pg/ml) a (R)-PMPA (tenofovir)(EC₅₀: 0,36-0,52 pg/ml). Když byly 6-PMEO a 6-(R)-PMPO deriváty hodnoceny v aktivitě proti HIV-1 v primárních buňkách (HIV-I(IIIb) v PBL a HIV-l(Ba-L) v monocytech/makrofázích M/M), byla jejich antiretrovirová účinnost ještě zřetelnější. Sloučeniny 1 a 11 inhibovaly virus v PBL při EC50 0,07, resp. 0,12 pg/ml, ve srovnání s 1,9 a 0,33 pg/ml pro referenční sloučeniny PMEA a (R)-PMPA. 6-PMEO a (R)-6-PMPO deriváty měly ještě silnější inhibiční účinek vůči HIV-l(Ba-L) v M/M, stejně jako referenční PMEA a (R)-PMPA. Bylo pravidlem, že sloučeniny vykazovaly nižší cytotoxicitu v MT-4 ve srovnání s CEM buňkami a nebyly toxické v M/M v koncentraci 100 pg/ml.

Protože bylo již dříve prokázáno, že PMEA a (R)-PMPA vykazují významný inhibiční účinek proti viru myšího Moloneyova sarkomu (MSV) jak v buněčných kulturách, tak v novorozených myších, byla u nových 6-PMEO a (R)-6-PMPO derivátů hodnocena také in vitro aktivita vůči MS V. Sloučeniny 1,11 a 4 byly silně inhibující proti MSV-indukované transformaci buněk C3H. Hodnoty EC50 byly nízké: 0,05 až 0,15 pg/ml (tabulka 2).

Vliv přírodních nukleosidů a nukleových bází na anti-HIV aktivitu fosfonátových analogů acyklických pyrimidinových nukleosidů v buněčné kultuře. Je známo, že anti-HIV aktivita analogů pyrimidinových nukleosidů jako např. 3'-azido-3'-deoxythymidinu (AZT, zidovudin) a 2',3'-dideoxycytidinu (ddC, zalcitabin) může být ovlivněna (např. snížena) v přítomnosti přírodních nukleosidů jako dThd a dCyd (Balzarini et al.: Textbook of AIDS Medicine, kap. 49, Broder S., Merigan T.C. a Bolognesi D., eds. Wiliams & Wilkins, Baltimore, Maryland, str. 751-772, 1994; Balzarini et al.: Antimicrob. Agents Chemother. 37:332-338, 1993). Pro určení, zda přítomnost přírodních nukleosidů a nukleových bází může ovlivnit anti-HIV aktivitu nových 6-PMEO a (R)-6-PMPO derivátů pyrimidinu, byl zkoumán efekt subtoxických koncentrací pyrimidinových nukleosidů thymidinu (dThd) a 2'deoxycytidinu (dCyd), purinových nukleosidů adenosinu (Ado) a guanosinu (Guo) a nukleové báze adeninu (Ade) (tabulka 3). Žádný z přírodních nukleosidů a nukleových bází neměl měřitelný vliv na anti-HIV-1 aktivitu testovaných sloučenin v kulturách buněk CEM. Ve všech případech byla antiretrovirová aktivita sloučenin plně zachována, stejně jako v případě referenčních sloučenin PMEA, (R)-PMPA a PMEG (tabulka 3).

Účinnost fosfonátových analogů acyklických pyrimidinových nukleosidů proti tvorbě MSV-indukovaných tumorů v novorozených NMRI myších. Byl zkoumán inhibiční účinek 6-PMEO derivátu 1 a jeho thioetherového analogu 2 a (R)-6-PMPO derivátu 11 na tvorbu MSV-indukovaných tumorů a s tím spojenou úmrtnost novorozených NMRI myší (tabulka 4). PMEA (adefovir) a (R)-PMPA (tenofovir) byly používány jako referenční ·· ···· sloučeniny. Z nových 6-PMEO a (R)-6-PMP0 derivátů se ukázala být nejúčinnější v prevenci tvorby MSV-indukováných tumorů a úmrtnosti novorozených NMRI myší sloučenina 1 (tabulka 4). Nejméně 80% myší bylo chráněno před tvorbou tumoru dávkami 50 a 20 mg/kg a zbylé myši, u kterých se tumor vyvinul, přežily více než 30 dní po infekci. Při tak nízké dávce, jako jsou 2 mg/kg, dokázala sloučenina 1 předcházet tvorbě tumoru u 5% myší a 15% dovolila dlouhodobě přežít. Sloučenina 1 má srovnatelnou schopnost předcházet tvorbě tumorů a s tím spojené úmrtnosti zvířat jako PMEA a (R)-PMPA (tabulka 4). Naproti tomu odpovídající thioetherový derivát 2 nedokázal předcházet tvorbě tumorů v žádné z testovaných dávek a umožnil dlouhodobě přežít 20% myší v dávkách 8-50 mg/kg. Schopnost (R)-6-PMPO derivátu 11 předcházet tvorbě tumorů a s tím spojené úmrtnosti byla uprostřed mezi pozorovanými schopnostmi sloučenin 1 a 2. Všechny účinné látky zpožďovaly tvorbu MS V-induko váných tumorů v závislosti na dávce. Sloučenina 1 měla inhibiění účinky srovnatelné s účinky (R)PMPA a PMEA. Sloučenina 11 byla horší než sloučenina 1 a sloučenina 2 vykazovala patrné zpoždění tvorby tumoru jen v dávce 50 mg/kg. Stejně jako tomu je u tvorby tumoru, zpoždění úmrtí zvířat je rovněž závislé na dávce a sloučenina 1 je přinejmenším stejně efektivní jako referenční sloučeniny PMEA a (R)-PMPA.

Citlivost mutantních kmenů HIV-1 k fosfonátovým analogům acyklických pyrimidinových nukleosidů v buněčných kulturách CEM. Byla zkoumána inhibiční aktivita sloučenin 1, 2 a 11 vůči kmenům HIV-1 (IIIb) obsahujícím mutace specifické pro nenukleosidový inhibitor reverzní transkriptázy (NNRTI): L100I, K103N, Y181C, Y188H v RT. Všechny tři sloučeniny si podržely plnou aktivitu proti těmto mutantním virovým kmenům (data neuvedena). U stejných sloučenin byl zjišťován inhibiční účinek na klinické izoláty HIV-1/L1S, HIV-1/L6S a HIV-1/L6S/PMEA (tabulka 5). PMEA a (R)-PMPA byly užity jako referenční látky. Sloučenina 1 si udržela výraznou antivirovou aktivitu proti těmto třem virovým kmenům. Sloučeniny 2 a především 11 vykazovaly zřetelně sníženou aktivitu proti izolátu HIV-1/L6S/PMEA, stejně jako PMEA a (R)-PMPA. Tedy, multi-NRTI rezistentní mutace (S68G, K70T, V75I, F77L, Fl 16Y a Q151M) a mutace K65R charakteristická pro PMEA přítomné v HIV-1/L6S/PMEA neovlivnily významně antivirovou účinnost sloučeniny 1 a PMEA (cca 3,6 až 4,5krát zvýšená EC50), zatímco výrazněji snížily citlivost k jiným ANP (tabulka 5).

Tabulka la

Antivirová aktivita (EC50 pg/ml)

CMV VZV

Kód slouče- niny

HSV-1 (KOS)

HSV-2 (G)

HSV-1 TK- VMW 1837

AD- 169

Davis

TK+ OKA

TK+ YS

TK- 07/1

TK- YS/R

MSV

HIV-1

HIV-2

H-3404

6.5

24

9.6

>50

1.2

1.1

2.5

1.6

0.035±

0.8±

0.43±

0.002

0

0.32

H-3408

29

>80

48

>50

7.5

7

20

15

1.70

5.5±

3.0±

2.1

1.4

H-3415

>80

>50

>40

>100

H-3418

>16

>50

12.6±

>100

7.6

H-3427

>400

>50

139±

>100

11

H-3435

240

>80

240

>50

>20

>50

>40

>100

H-3444

240

>400

240

>50

4.26±

56.7±

80±

0.75

37.9

34.6

H-3445

>400

>50

107±

>100

10

H-3453

>400

>50

89.4±

>100

37.6

H-3560

>80

>50

6.1

51

33

H-3567

16

48

9.6

>50

3.8

5.9

6.3

5.7

0.05

1.9

1.3

H-3574

9.6

14

16

1.1

0.9

0.6

0.08

>0.8

·· ··♦·

Tabulka 1. Antiretrovirová a cytostatická aktivita fosfonátů acyklických pyrimidinových nukleosidů v CEM buněčných kulturách infikovaných HIV-1

Číslo sloučenin y	Pyrimidinový analog čeho	Ri	P-2	Y	z	EC₅₀ ^a (Mg/ml) HIV-1 (CEM)	cc₅₀ ^b (Mg/ml) (CEM)
1	PMEDAP	nh₂	nh₂	0	H	0.80	11
2	PMEDAP	nh₂	nh₂	s	H	5.5	64
3	PMEA	H	nh₂	0	H	>100	>100
4	PMEG	nh₂	OH	0	H	2.2	2.5
5	PMEG	nh₂	OH	s	H	>100	>100
6	PMEDAP	nh₂	N(CH₃)₂	0	H	>100	>100
7	PMEDAP	nh₂	NH-CP^C	0	H	>100	>100
8	PMEA	sch₃	nh₂	0	H	>100	>100
9	PME-6-Me- MAP	nh₂	ch₂	0	H	>100	>100
10	(SýPMPDAP	nh₂	nh₂	0	ch₃	51	>100
11	(Á)-PMPDAP	nh₂	nh₂	0	ch₃	1.8	62

Referenční látky

PMEA
(adefovir)	0.96	16
(7?)-
PMPA	0.36	125

(tenofovir ) _ ^a50% účinná koncentrace = koncentrace sloučeniny nutná k 50% inhibici cytopaticity indukované HIV 1 (IIIb) v CEM buněčných kulturách ^b50% cytostatická koncentrace = koncentrace sloučeniny nutná k 50% inhibici buněčného dělení CEM buněk ^cCP = cyklopropyl.

·· ♦··· • ·

9999

9 • ·9

9 9 9

9 · ·«·· • · · ·· *

Tabulka 2. Antiretrovirová aktivita 6-PMEO a (7ř)-6-PMPO derivátů v různých typech buněk sloučeninv (Mg/ml)

	HIV-1 (ΠΙβ) (CEM)	HIV-2 (ROD) (CEM)	HIV-1 (ΠΙβ) (MT-4)	HIV- 2 (RO D) (MT- 4)	HIV-1 (in_B) (PBL)	HIV-1 (BaL) (M/M)	FIV (CrFK)	MSV (C3H)
1	0.9±0.4	0.66±0.19	0.34±0.03	0.29	0.07±0.02	0.002±0.001	0.25±0.01	0.16±0.04
2	4.6±3.1	3.0M.4	2.5±0.3	2.9			0.97±0.40	1.7±0.9
11	1.9±0.5	1.3±0.4	3.0±0.4	1.6±	0.12±0.01	0.005±0.0	0.66±0.14	0.05±0.01
				0.6
4	1.4±0.7	1.4±1.2	1.9±0.4	2.1				0.08±0.03
PMEA	0.96±0.24	1.9±1.1	1.3±1.1	1.9	0.55±0.41	0.006	0.46±0.19	0.62±0.27
(/?)- PMPA	0.36±0.24	0.43±0.41	0.46±0.006	0.52	0.09±0.03	0.003±0.001	0.13	1.4±0.9

Číslo slouče- niny	_rr b,c,d ^cc50 (Mg/ml)
	CEM	MT-4	PBL	M/M	CrFK	C3H
1	ll±2.0	46±7.4	2.2±0.8	>100	11	>40 (200)
2	64±9.8	>100			42	>40 (200)
11	62±25	>100	9.6±2.5	>100	>100	>40 (200)
4	2.5±0.2	10±2.2				>16
PMEA	16±9.1	28±12	1.7±0.4	>100	18	>40 (200)
(A)-PMPA	125±26	72±12	>100	>100	>100	>200

^a 50% účinná koncentrace = koncentrace sloučeniny nutná k 50% inhibici cytopaticity indukované HIV v CEM a MT-4 buňkách (tvorba obrovských buněk) nebo produkce antigenu p24 v PBL a M/M nebo transformace C3H buněk indukované MSV ^b50% cytostatická koncentrace = koncentrace sloučeniny nutná k 50% inhibici buněčného dělení CEM buněk nebo k 50% snížení životaschopnosti buněk (MT-4, PBL, M/M) ^c Minimální koncentrace s inhibičními účinky nebo koncentrace sloučeniny nutná k mikroskopicky viditelným změnám morfologie buněk. Symbol > znamená, že nebyla nalezena viditelná toxicita při dané koncentraci. Hodnoty v závorkách ukazují koncentraci sloučeniny, při níž byla pozorována morfologická toxicita.

^d Data jsou průměrem (± SD) 2 až 4 samostatných experimentů. Data bez hodnoty SD jsou výsledkem jednoho experimentu ve dvou provedeních.

• · · · ·· ··· ···· • · · · · · ·· · ·· · · • · · · · ··· ···· · ·· ··· ·· ·

Tabulka 3. Vliv přírodních nukleosidů a nukleových bází na antivirovou aktivitu 6-PMEO a (R)-PMPO derivátů

Číslo slouče- niny			,,_r a,b ^ec50 (pg/ml)
Po přidání uvedených sloučenin
		dThd	dCyd	Ado	Guo	Ade
	Bez přidání	(10 μΜ)	(1 mM)	(400 μΜ)	(10 μΜ)	(100 μΜ)
1	0.77±0.25	0.35±0.07	0.55±0.35	0.63±0.29	0.65±0.21	0.26±0.16
2	1.9±0.75	1.4±0.21	2.H1.7	4.4±2.8	1.9±0.49	3.3±3.2
11	1.2±0.25	0.83±0.35	l.l±0.51	1.5±0.70	0.77±0.38	0.35±0.17
4	1.4±0.71	1.0±0.3	2.4±1.9	1.4±0.93	1.9±0.92	1.7±1.2
PMEA	0.94±0.24	1.4±0.4	2.1±0.19	1.6±0.4	1.0±0.8	1.9±1.3
(A)-	0.57±0.26	0.43±0.0	0.53±0.26	0.46±0.23	0.43±0.0	1.6±1.6
PMPA
PMEG	>0.05	>0.25	>0.25	>0.05	>0.05	>0.05

^a50% účinná koncentrace = koncentrace sloučeniny nutná k 50% inhibici cytopaticity indukované HIV1 (1¾) v CEM buněčných kulturách ^b Data jsou průměrem (± SD) 2 až 3 samostatných experimentů.

Tabulka 4. Anti-MSV aktivita fosfonátů acyklických pyrimidinových nukleosidů v novorozených NMRI myších

		Celkový počet		Procento
		myší	Procento myší, u	myší, které
	Dávka	použitých v	nichž se nevyvinul	přežily více
Sloučenina	(mg/kg)^a	experimentu	tumor	než 30 dní

(PMEO-2,4-di-NH₂-Pym)

18 20

ΈΓ

100

2 (PMES-2,4-di-NH₂-Pym)	50 20 8 2	10 10 10 8	0 0 0 0	20 20 20 0
11	20	10	20	40^C
(PMPO-2,4-di-NH₂-Pym)	8 2	20 18	15 0	40 5
PMEA	100	10	ioo³	d
	20	29	89	94
	8	30	44	77
	4	20	5	35
(Á)-PMPA	50	10	100	100
	20	28	92	100
	8	27	65	83
	2	28	0	31

^a Uvedená dávka účinné látky byla podána 2 h před infekcí MSV, pak byly podány 4 další denní dávky během 4 následujících dní po infekci. Průměrná doba do vývinu tumoru u kontrolní skupiny myší infikovaných MSV byla 4,5 dne a průměrná doba do úmrtí zvířat v kontrolní skupině byla 12,3 dne. ^bPři uvedené dávce (50 mg/kg) uhynulo 16% myší předčasně (<24 dní) pravděpodobně kvůli toxicitě účinné látky bez známek tvorby tumoru. Předčasná úmrtí nebyla brána v úvahu při výpočtu procenta přeživších myší.

^c Při uvedené dávce (20 mg/kg) uhynulo 50% myší předčasně (<6 dní) pravděpodobně kvůli toxicitě účinné látky bez známek tvorby tumoru. Předčasná úmrtí nebyla brána v úvahu při výpočtu procenta přeživších myší.

^d Všechny myši uhynuly před 6. dnem pravděpodobně kvůli toxicitě účinné látky. Žádná z nich nevykazovala známky tvorby tumoru.

Tabulka 5. Inhibiční aktivita fosfonátů acyklických pyrimidinových nukleosidů vůči klinickým izolátům HIV-1

Číslo sloučeniny	a -násobek rezistence
	b HIV-1/LIS	C HIV-1/L6S	d HIV-1/L6S/PMEA
1	0.8	1.5	3.6
2	2.1	1.4	14
11	1.9	3.5	30
PMEA	2.0	2.7	7.3
(R)-PMPA	2.3	11	54

^a Násobek rezistence měřený proti laboratornímu kmenu HIV-1/III_B v CEM buněčných kulturách. ^b Klinický izolát odebraný z pacienta nesetkavšího se s NRTI nebo ANP a neobsahující v RT mutace specifické pro NRTI nebo ANP.

^c Klinický izolát odebraný z léčeného pacitenta. RT obsahuje S68G, K70T, V75I, F77L, F116Y a Q151M mutace.

^d HIV-1/L6S izolát kultivovaný v přítomnosti PMEA a obsahující mutaci K65R navíc k jiným NRTIspecifickým mutacím vyjmenovaným v bodě c.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Sloučeniny obecného vzorce (I), (I) kde

Ri je H, amino nebo methylsulfanyl;

R₂ je H, methyl, halogen, -N(Rs)2, hydroxy, chráněná hydroxy skupina nebo skupina obecného vzorce (Ia) *

O

R₃

P(O)(Z)₂ (Ia)

Ráje nezávisle H, methyl, hydroxymethyl, halogenmethyl nebo chráněný hydroxymethyl;

R4 je H nebo halogen;

X je nezávisle atom kyslíku, síry nebo vazba;

Z je nezávisle hydroxy, ester nebo amid;

R₅ je nezávisle H, Ci-C₈ alkyl nebo chránící skupina; a * označuje chirální uhlíkový atom;

a jejich soli a solváty.
2. Sloučeniny podle nároku 1, kde R] a R₂ jsou amino, R3 je atom vodíku a X je atom kyslíku.
3. Sloučeniny podle nároku 1, kde Ri a R₂ jsou současně amino, R3 je methyl, X je atom kyslíku a konfigurace na uhlíku nesoucím R3 je (R).
4. Sloučeniny podle nároku 1, kde Ri a R₂ jsou současně amino, R3 je hydroxymethyl, X je atom kyslíku a konfigurace na uhlíku nesoucím R3 je (R).
5. Sloučeniny podle nároku 1, kde Ri a R₂ jsou současně amino, R₃ je atom vodíku a X je atom síry.
6. Sloučeniny podle nároku 1, kde Ri je amino, R₂ je hydroxy, R₃ je atom vodíku a X je atom kyslíku.
7. Sloučenina podle nároku 1, vyznačující se tím, že je krystalická.
8. Sloučenina podle nároku 1, vyznačující se tím, že je čistým enantiomerem na chirálním uhlíku.
9. Sloučenina podle nároku 8, vyznačující se tím, že je v konfiguraci (R).
10. Sloučenina podle nároku 8, vyznačující se tím, že je v konfiguraci (S).
11. 2,4-diamino-6-[2-(fosfonomethoxy)ethoxy]pyrimidin.
12. 2,4-diamino-6-[(R)-2-(fosfonomethoxy)propoxy]pyrimidin.
13. 2-amino-4-hydroxy-6-[2-(fosfonomethoxy)ethoxy]pyrimidin.
14. 2,4-diamino-6-[(S)-3-hydroxy-2-(fosfonomethoxy)propoxy]pyrimidin.
15. 2.4-diamino-6-[(RS)-3-hydroxy-2-(fosfonomethoxy)propoxy]pyrimidin.
16. 2-amino-4-hydroxy-6-[(R)-2-(fosfonomethoxy)propoxy]pyrimidin.
17. 2-amino-4-hydroxy-6-[(RS)-3-hydroxy-2-(fosfonomethoxy)propoxy]pyrimidin.
18. 2-amino-4-hydroxy-6-[(S)-3-hydroxy-2-(fosfonomethoxy)propoxy]pyrimidin.
19. 2,4-diammo-5-brom-6-[2-(fosfonomethoxy)ethoxy]pyrimidin.

• · · · • » · • · ·· * ··
20. 2-amino-5-brom-4-hydroxy-6-[2-(fosfonomethoxy)ethoxy]pyrimidin.
21. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje farmaceuticky přijatelný excipient a sloučeninu podle nároku 1.
22. Způsob přípravy sloučeniny obecného vzorce (I),

O^^P(O)(Z)₂ (I) kde

Ri je H, amino nebo methylsulfanyl;

R₂ je H, methyl, halogen, -N(Rs)₂, hydroxy, chráněná hydroxy skupina nebo skupina obecného vzorce (la) r₃

P(O)(Z)₂ (la)

R₃ je nezávisle H, methyl, hydroxymethyl, halogenmethyl nebo chráněný hydroxymethyl;

R4 je H nebo halogen;

X je nezávisle atom kyslíku, síry nebo vazba;

Z je nezávisle hydroxy, ester nebo amid;

R5 je nezávisle H, Ci-C₈ alkyl nebo chránící skupina; a * označuje chirální uhlíkový atom;

vyznačující se tím, že se sloučeniny obecného vzorce (II),

R₂ kde

R₂ je H, methyl, halogen, -N(R₅)₂, hydroxy nebo chráněná hydroxy skupina; a X je atom kyslíku nebo síry;

uvedou do reakce se sloučeninou obecného vzorce (III), $

Y-CH₂CH(R₃)-O-CH₂P(O)(Z)₂ (III)

Z je ester nebo amid;

* označuje chirální uhlíkový atom;

R₃ je H, methyl, halogenmethyl nebo chráněný hydroxymethyl; a Y je odstupující skupina v dipolárním aprotickém rozpouštědle v přítomnosti báze.
23. Způsob podle nároku 22 zahrnující dále izolaci získané sloučeniny obecného vzorce (I).
24. Způsob podle nároku 22, kde Z je ester nebo amid, zahrnující následnou hydrolýzu jednoho nebo obou substituentů Z za vzniku sloučeniny obecného vzorce (I), kde alespoň jeden substituent Z je hydroxy.
25. Způsob podle nároku 22, kde Z je (OR4)₂ a R4 je isopropyl.
26. Způsob podle nároku 22, kde R3 je methyl a Y je p-toluensulfonyloxy.
27. Způsob přípravy sloučenin obecného vzorce (I), kde (I)

Ri je H, amino nebo methylsulfanyl;

R2 je -N(Rs)2,

R3 je nezávisle H, methyl, hydroxymethyl, halogenmethyl nebo chráněný hydroxymethyl;

R4 je H nebo halogen;

X je nezávisle atom kyslíku nebo síry;

Z je nezávisle hydroxy, ester nebo amid;

R5 je nezávisle H, Cj-Cg alkyl nebo chránící skupina; a * označuje chirálni uhlíkový atom;

vyznačující se tím, že se sloučeniny obecného vzorce (IV), (IV) kde

R3 je H, methyl, halogenmethyl nebo chráněný hydroxymethyl;

X je atom kyslíku nebo síry; a Z je amid nebo ester;

uvedou do reakce s N(Rs)2.
28. Způsob podle nároku 27 zahrnující dále hydrolýzu jednoho nebo obou substituentů Z za vzniku sloučeniny obecného vzorce (I), kde jeden nebo oba substituenty Z jsou hydroxy.
29. Způsob přípravy sloučenin obecného vzorce (V), n(R₅)₂

H₂N

P(O)(Z)₂ r₃ (V) kde

R3 je H, methyl, hydroxymethyl, halogenmethyl nebo chráněný hydroxymethyl; R5 je nezávisle H, Ci-Q alkyl nebo chránící skupina;

X je atom kyslíku nebo síry;

Z je nezávisle hydroxy, ester nebo amid; a * označuje chirální uhlíkový atom vyznačující se tím, že sloučeniny (IVa)

P(O)(Z)₂

R3 (IVa) se uvedou do reakce s N(Rs)2 v bezvodém rozpouštědle, alkalickým hydroxidem nebo alkalickým uhličitanem ve vodném roztoku.
30. Způsob přípravy sloučenin obecného vzorce (VI), (VI)

Ri je H, amino nebo methylsulfanyl;

R3 je H, methyl, hydroxymethyl, halogenmethyl nebo chráněný hydroxymethyl; Z je nezávisle hydroxy, ester nebo amid; a * označuje chirální uhlíkový atom vyznačující se tím, že se sloučeniny obecného vzorce (VII), (VII) ·· ·*·· ·· • · · · · · • · · · • · · · · • · · · ····· · · · • · · • · · · • · ···· • · · ·· · kde

Ri je H, amino nebo methylsulfanyl se uvedou do reakce se sloučeninou obecného vzorce (VIII), *

HOCH₂CH(R₃)OCH₂P(O)(Z) 2 (VIII) kde

Z je amid nebo ester v přítomnosti báze.
31. Způsob podle nároku 30 zahrnující dále hydrolýzu substituentu Z za vzniku sloučeniny obecného vzorce (VI), kde jeden nebo oba substituenty Z jsou hydroxy.
32. Způsob přípravy sloučenin obecného vzorce (XIII) (ΧΠΙ)

Ri je H, amino nebo methylsulfanyl;

* je chirální uhlíkový atom;

R₂ je H, chlor, hydroxy nebo amino;

R₃ je H, methyl, halogenmethyl nebo hydroxymethyl; a Z je amid nebo ester;

vyznačující se tím, že se (a) sloučeniny obecného vzorce (IX), (IX) • φ φ φ φφφ φ φφφφ • φ φ φ φ φ

Ri je Η, amino nebo methylsulfanyl;

R₂ je H, chlor nebo amino;

uvede do reakce se sloučeninou obecného vzorce (X), (X) kde

R3 je H, methyl, hydroxymethyl, halogenmethyl nebo chráněný hydroxymethyl;

* je chirální uhlíkový atom;

R₆ je hydroxy nebo chráněná hydroxy skupina;

nebo R₃ a Re jsou spojeny cyklickou acetalovou nebo ketalovou chránící skupinou; v přítomnosti báze bez rozpouštědla nebo v přítomnosti aprotického rozpouštědla za vzniku sloučeniny obecného vzorce (XI), kde

Ri je H, amino nebo methylsulfanyl;

* je chirální uhlíkový atom;

R₂ je H, chlor nebo amino; a

R₃ je H, methyl, halogenmethyl nebo chráněný hydroxymethyl; a poté (b) sloučeniny (XI) uvedou do reakce se sloučeninou obecného vzorce (XII),

Y-CH₂P(O)(OZ)₂ (XII) kde

Y je odstupující skupina; Z je amid nebo ester ·> 0000

00 0 0 9

0 9 0 0 9 0 · 0 ·

9 9 99 0 9 · · 9009

0 0 099 900

00909 09 9·· 00 0 v přítomnosti báze v dimethylformamidu nebo tetrahydrofuranu za vzniku sloučeniny obecného vzorce (XIII).
33. Způsob podle nároku 32 zahrnující dále hydrolýzu alespoň jednoho substituentu Z za vzniku sloučeniny obecného vzorce (XIII), kde jeden nebo oba substituenty Z jsou hydroxy.
34. Způsob přípravy sloučenin obecného vzorce (I),

O^/P(O)(Z)₂ (I) kde

Ri je H, amino nebo methylsulfanyl;

R3 je H, methyl, hydroxymethyl, halogenmethyl nebo chráněný hydroxymethyl; R4 je halogen;

X je atom kyslíku;

Z je nezávisle hydroxy, ester nebo amid; a * označuje chirální uhlíkový atom;

vyznačující se tím, že se sloučeniny obecného vzorce (VI),

P(O)(Z)₂ (VI) kde

Ri je H, amino nebo methylsulfanyl;

R₃ je H, methyl, hydroxymethyl, halogenmethyl nebo chráněný hydroxymethyl;

• · • · · • ·· · · • · ··· · · · ···· · ·· ··· ·· ·

Z je ester; a * označuje chirální uhlíkový atom uvedou do reakce s elementárním halogenem v inertním rozpouštědle za vzniku sloučeniny obecného vzorce (I).
35. Způsob podle nároku 34 zahrnující dále hydrolýzu jednoho nebo obou substituentů Z za vzniku sloučeniny obecného vzorce (I), kde jeden nebo oba substituenty Z jsou hydroxy.
36. Sloučeniny podle nároku 1 pro použití při léčení virových infekcí, zahrnující podání terapeuticky účinného množství sloučeniny obecného vzorce (I) pacientovi potřebujícímu takovouto léčbu.
37. Sloučeniny podle nároku 1 pro použití při léčení virových infekcí, kde virus je DNA virus.
38. Sloučeniny podle nároku 1, pro použití při léčení virových infekcí, kde virus je retrovirus nebo hepadnavirus.