NO20131091L

NO20131091L - 6-[2-(fosfonometoksy)alkoksy]pyrimidinderivater med antiviral aktivitet

Info

Publication number: NO20131091L
Application number: NO20131091A
Authority: NO
Inventors: Antonin Holy; Jan Balzarini; Erik De Clercq
Original assignee: Acad Of Science Czech Republic; Rega Stichting
Priority date: 2001-06-29
Filing date: 2013-08-09
Publication date: 2004-02-24
Also published as: ZA200400236B; JP4545434B2; ES2564144T3; HU230519B1; EP1406911B1; BR0210746A; BRPI0210746B1; EP1406911A1; CZ2004142A3; IL159494A; TR200302288T2; CA2452036A1; MXPA04000138A; IL159494A0; NO20035797L; CN1329404C; EA200400117A1; KR100891366B1; PL207187B1; KR20040027521A

Abstract

Nye forløperlegemidler er tilveiebrakt med formel (I) hvor R1, R2, R3, R4, Z, X og * er definert her. Det er også tilveiebrakt antivirale fremgangsmåter for anvendelse, og fremgangsmåter for syntese av forløperlegemidlene med formel (I).

Description

Oppfinnelsens bakgrunn

Oppfinnelsens område

Asykliske nukleotidanaloger som inneholder fosfonatgrupper, er beskrevet f.eks. i US patentskrifter nr. 4 659 825, 4 808 716,4 724 233, 5 142 051, 5 302 585, 5 208 221, 5 352 786 og 5 356 886, i EP patentskrifter med publikasjonsnr. 269 947,481 214, 630 381, 369 409, 454 427,468 119,434 450, 618 214 og 398 231, og i WO 95/07920, WO 94/03467 og WO 96/33200. Læren i disse patentene omfatter forbindelser hvor en fosfonatgruppe er bundet til en definert purin- eller pyrimidinbase, generelt i 1- eller 9-stillingen til henholdsvis pyrimidin- eller purinbasene, ved hjelp av en 2-(metoksy)propylgruppe, en 2-(metoksy)etylgruppe, en 2-metoksy-3-hydroksypropylgruppe eller en 2-metoksy-3-fluorpropylgruppe, kjent henholdsvis som PMP-, PME-, HPMP- og FPMP-purin- eller -pyrimidinforbindelser. Disse forbindelsene oppviser antiviral og cytostatisk aktivitet.

Daluge et al. (34th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 4.-7. okt., 1994) beskriver karbovir-derivater hvor 6-stillingen til purinet er substituert med syklopropylamino, N-syklopropyl-N-metylamino eller N-aziridinyl.

Cihlar et al., "Antimicrobial Agents and Chemotherapy" 39(1):117-124 (1995) beskriver N<6->aminoheksyl-PMEDAP.

Holy et al., "ACS Symp. Ser.", 401:57-71 (1989) og Holy, "Kem. Ind.", 38(10):457-462 (1989) beskriver den antivirale aktivitet av visse N<6->substituerte nukleotidanaloger.

Ytterligere fosfonatsubstituerte pyrimidinanaloger er beskrevet av Holy et al., "Collect. Czech. Chem. Commun.", 64:242-256 (1999), Eger et al., "J. Med. Chem.", 37:3057-3061 (1994), Wormstadt et al., "J. Heterocyclic Chem.", 37:1187-1191 (2000), og Franchetti et al., "Nucleosides & Nucleotides", 14(3-5):607-610 (1995). De sistnevnte tre publikasjonene har en fosfonatholdig sidekjede bundet via en 6-N-substituent på 2,4-disubstituert pyrimidin.

Formål ved oppfinnelsen

Det er et formål ved denne oppfinnelsen å tilveiebringe forbindelser som har antiviral aktivitet, særlig mot RNA- eller DNA-virus, slik som HIV, HBV eller HSV.

Det er et ytterligere formål å tilveiebringe forbindelser som kan anvendes ved fremstillingen av ionebytterharpikser eller kirale medier.

Det er et ytterligere formål å tilveiebringe mellomprodukter og fremgangsmåter for å fremstille slike forbindelser.

Disse og andre formål vil bli mer fullstendig forstått ved videre henvisning til beskrivelsen her.

Oppsummering av oppfinnelsen

I overensstemmelse med oppfinnelsen er det tilveiebrakt nye forbindelser som har formel (I)

hvor

Ri er H, amino eller metylsulfanyl;

R2er H, metyl, halogen, -N(R5)2, hydroksy, beskyttet hydroksy eller en gruppe med formel (Ia)

R3er uavhengig H, metyl, hydroksy metyl, halometyl eller beskyttet hydroksymetyl;

R4er H eller halogen;

X er uavhengig oksygen, svovel eller en binding;

Z er uavhengig hydroksy, en ester eller et amid;

R5er uavhengig H, Ci-Cg-alkyl eller en beskyttelsesgruppe; og

<*>betegner et kiralt karbonatom; og

salter og solvater derav.

Formålene oppnås også ved hjelp av en fremgangsmåte for fremstilling av forbindelser med formel (I)

hvor

Ri, R2, R3, R4, X, Z, R5og<*>er definert ovenfor;

som omfatter å omsette en forbindelse med formel (II)

hvor

Ri og R5er definert ovenfor;

R2er H, metyl, halogen, -N(R5)2, hydroksy eller beskyttet hydroksy; og

X er O eller S;

med en forbindelse med formel (III)

hvor

Z er en ester eller et amid;

<*>betegner et kiralt karbonatom;

R3er H, metyl, halometyl eller beskyttet hydroksymetyl; og

Y er en uttredende gruppe;

i dipolart, aprotisk oppløsningsmiddel i nærvær av en base, hvorved man får en forbindelse med formel (I) hvor Z er ester eller amid; (b) én eller begge Z-grupper omdannes eventuelt, hvorved man får forbindelsen med formel (I) hvor minst én Z er hydroksy.

Ved en annen utførelsesform av denne oppfinnelsen er det tilveiebrakt en fremgangsmåte for fremstilling av forbindelser med formel (I) hvor: Ri er H, amino eller metylsulfanyl;

R2er -N(R5)2;

R4er H eller halogen;

X er oksygen eller svovel;

Z er uavhengig hydroksy, en ester eller et amid;

R5er uavhengig H, Ci-Cg-alkyl eller en beskyttelsesgruppe; og

<*>betegner et kiralt karbonatom;

som omfatter å omsette en forbindelse (IV)

hvor

R3er H, metyl, halometyl eller beskyttet hydroksymetyl;

X er O eller S; og

Z er amid eller ester;

med N(R5)2. Én eller begge Z-grupper omdannes eventuelt til forbindelsen med formel (I) hvor minst én Z er hydroksy.

Ved en annen utførelsesform er det tilveiebrakt en fremgangsmåte for fremstilling av forbindelser med formel (V)

hvor

R3er H, metyl, hydroksymetyl, halometyl eller beskyttet hydroksymetyl;

R5er uavhengig H, Ci-Cg-alkyl eller en beskyttelsesgruppe;

X er oksygen eller svovel;

Z er uavhengig hydroksy, en ester eller et amid; og

<*>betegner et kiralt karbonatom;

som omfatter å omsette forbindelse (IVa)

med N(R5)2i vannfritt oppløsningsmiddel, alkalihydroksid eller alkalikarbonat i vandig oppløsning, og Z omdannes eventuelt til forbindelsen med formel (V) hvor 1 eller 2 Z-grupper er hydroksy. Ved en annen utførelsesform er det tilveiebrakt en fremgangsmåte for fremstilling av forbindelser med formel (VI)

hvor

Ri er H, amino eller metylsulfanyl;

R3er H, metyl, hydroksymetyl, halometyl eller beskyttet hydroksymetyl;

Z er uavhengig hydroksy, en ester eller et amid; og

<*>betegner et kiralt karbonatom;

som omfatter å omsette en forbindelse med formel (VII)

hvor

Ri er H, amino eller metylsulfanyl;

med en forbindelse med formel (VIII)

hvor Z er amid eller ester; i nærvær av en base. Eventuelt omdannes én av eller begge Z-gruppene, hvorved det fremstilles en hydroksy gruppe. Ved en annen utførelsesform av denne oppfinnelsen er det tilveiebrakt en fremgangsmåte for fremstilling av forbindelser med formel (XIII)

hvor

Ri er H, amino eller metylsulfanyl;

<*>er et kiralt karbonatom;

R2er H, klor, hydroksy eller amino;

R3er H, metyl, halometyl eller hydroksymetyl; og

Z er amid eller ester;

som omfatter (a) å omsette en forbindelse med formel (IX)

V"-/

hvor

Ri er H, amino eller metylsulfanyl;

R2er H, klor eller amino;

med en forbindelse med formel (X)

hvor

R3er H, metyl, hydroksymetyl, halometyl eller beskyttet hydroksymetyl;

<*>er et kiralt karbonatom;

R6er hydroksy eller beskyttet hydroksy;

eller R3og R6er bundet sammen ved hjelp av en syklisk acetal- eller ketalbeskyttelsesgruppe;

i nærvær av en base uten oppløsningsmiddel eller i nærvær av et aprotisk oppløsningsmiddel, hvorved man får en forbindelse med formel (XI)

hvor

Ri er H, amino eller metylsulfanyl;

<*>er et kiralt karbonatom;

R2er H, klor eller amino; og

R3er H, metyl, halometyl eller beskyttet hydroksymetyl; og (b) å omsette forbindelse (XI) med en forbindelse med formel (XII)

hvor

Y er en uttredende gruppe;

Z er amid eller ester;

i nærvær av en base i dimetylformamid eller tetrahydrofuran, hvorved man får en forbindelse med formel (XIII); og

(c) eventuelt hydrolysere Z-gruppen i forbindelse (XIII),

hvorved man får en forbindelse med formel (VI) hvor 1 eller 2 Z-grupper er hydroksy, og X er et oksygenatom.

R3er H, metyl, hydroksymetyl, halometyl eller beskyttet hydroksymetyl;

R4er halogen;

X er oksygen;

Z er uavhengig hydroksy, en ester eller et amid; og

<*>betegner et kiralt karbonatom;

som omfatter (a) å omsette en forbindelse med formel (VI)

hvor

Ri er H, amino eller metylsulfanyl;

R3er H, metyl, hydroksymetyl, halometyl eller beskyttet hydroksymetyl;

Z er uavhengig en ester; og

<*>betegner et kiralt karbonatom;

med elementært halogen i et inert oppløsningsmiddel, hvorved man får en forbindelse med formel

(I).

Eventuelt omdannes én av eller begge Z-gruppene til hydroksy.

Ytterligere formål ved denne oppfinnelsen oppnås ved hjelp av en fremgangsmåte som omfatter å administrere en terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse med formel (I) til en pasient som trenger slik behandling.

Nærmere beskrivelse av oppfinnelsen

Slik det her er brukt, og med mindre modifisert ved den umiddelbare sammenheng, betyr alkyl forgrenede, normale eller sykliske, mettede hydrokarboner og omfatter metyl, etyl, propyl, syklopropyl, syklobutyl, isopropyl, n-, sek.-, iso- og tert.-butyl, pentyl, isopentyl, 1-metylbutyl, 1-etylpropyl, neopentyl og t-pentyl.

Halogen betyr vanligvis klor, men omfatter brom, fluor eller jod.

Ri er vanligvis H eller amino, men kan også være metylsulfanyl (dvs. metyltio). R2er generelt hydroksy eller -N(R5)2, hvor R5uavhengig er H eller Ci-Cg-alkyl.

R3er vanligvis H eller metyl, men kan være hydroksymetyl (vanligvis (S)-konfigurasjon i det vesentlige fri for (R)-enantiomeren) eller halometyl, og dersom den er metyl eller halometyl, er den fortrinnsvis i (2R)-konfigurasjonen i det vesentlige fri for (2S)-konfigurasjonen. Halometyl er generelt fluormetyl.

R5er generelt H, men kan også være lavere (Ci-C3)-alkyl (ett av eller begge tilfeller).

Slik det videre er beskrevet nedenfor, er Z passende enhver ester eller ethvert amid som hittil har vært kjent for bruk med nukleotidfosfonater. Når Z er en ester, har den formelen OR7. R7er vanligvis H (dvs. Z er hydroksy) i forbindelser som har antiviral aktivitet per se, selv om andre R7-estergrupper beskrevet nedenunder, er egnet for anvendelse som beskyttelsesgrupper eller som forløpergrupper for forløperlegemiddel-utførelsesformer.

X er fortrinnsvis O.

Z er en ester eller et amid når det er ønsket å beskytte forbindelsene ifølge denne oppfinnelsen mot uønskede reaksjoner, eller når formålet er å tilveiebringe et in vivo forløperlegemiddel for forbindelsen. Ellers er Z OH.

Esterne eller amidene er anvendbare som beskyttede mellomprodukter ved syntesen av forbindelser ifølge denne oppfinnelsen hvor Z = OH. Ved denne utførelsesformen behøver ikke utvelgelsen av ester eller amid å være av betydning, avhengig av typen av reaksjonen som er involvert. Alt som trengs, er at Z-substituenten ikke fjernes før det trinnet i syntesen hvor dette er ønsket, og dersom dette ikke er åpenbart av teoretiske grunner, kan det lett bestemmes ved hjelp av elementære forsøk. For eksempel anvendes estere særlig for å beskytte fosfonathydroksygruppene mot alkylering.

Når Z tjener som en for løper legemiddelgruppe, fjernes esteren eller amidet in vivo fra fosfonatet. Egnede forløperlegemiddelestere eller -amidater velges eventuelt basert på substratspesifisiteten til esteraser og/eller karboksypeptidaser som forventes å bli funnet i celler hvor forstadiumhydrolyse er ønsket. I den grad spesifisiteten til disse enzymer er ukjent, vil man skreene mange nukleotidanaloger ifølge denne oppfinnelsen inntil den ønskede substratspesifisitet er funnet. Dette vil være åpenbart ut fra fremkomsten av fritt fosfonat eller antiviral aktivitet. Man velger generelt forbindelser som (i) ikke hydrolyseres eller hydrolyseres forholdsvis sakte i den øvre del av tarmkanalen, (ii) er tarm- og cellepermeable og (iii) hydrolyseres i cellecytoplasmaet og/eller det systemiske blodomløp. Skreeninger med celler fra bestemte vev brukes for å identifisere forløpere som frigjøres i organer som er mottakelige for en målrettet virus- eller mikrobeinfeksjon, feks. i tilfellet med lever, forløperlegemidler som kan hydrolyseres i leveren. Andre infeksjoner, feks. CMV eller HIV, behandles eventuelt med en forløper som hydrolyseres ved i det vesentlige den samme hastighet og til den i det vesentlige samme grad i alle vev. Analyser som er kjent innenfor teknikken, er egnet for disse formål, inkludert analyser for tarmhulromstabilitet, cellepermeasjon, leverhomogenatstabilitet og plasmastabilitet. Disse analysene brukes for å bestemme forløpernes biotilgjengelighetskarakter-istika.

Typiske eksempler på ester- og amidsubstituentgruppe Z finnes i WO 95/07920, WO 98/04569 og EP 481214 Al. Enhver ester- eller amidslekt eller -art beskrevet i disse publikasjonene (og i den foretrukne rekkefølge angitt i slike publikasjoner) kan anvendes som gruppe Z her.

Vanligvis er begge Z hydroksyl eller begge er ester og/eller amid, dvs. vanligvis er 2 eller ingen Z-grupper hydroksy. Generelt er, når ingen Z er OH, én Z amid og én er ester. Amider med naturlig forekommende aminosyrer og estere med fenyl er foretrukket. Den eller de frie karboksylgruppene i aminosyre Z-grupper er generelt forestret med Q-Cg-alkyl.

Generelt er Z hydroksy i forbindelser som skal anvendes direkte for antivirale formål, dvs. slike forbindelser anvendes uten noe krav til hydrolyse in vivo av esteren eller amidet.

Beskyttelsesgrupper for hydroksyl omfatter acetaler, ketaler eller Ci-Cg-alkyl. En typisk beskyttelsesgruppe for amino er trityl. Andre vanlige beskyttelsesgrupper er kjent (Greene et al., "Protecting Groups in Organic Synthesis, 2. utg. 1991, s. 10-142 og 309-405).

Anvendbarhet

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan anvendes til behandling av virus, eller som mellomprodukter ved fremstillingen av slike forbindelser. Eksempelvise virusinfeksjoner som skal behandles eller som det skal testes med hensyn på ømfintlighet overfor forbindelser ifølge denne oppfinnelsen for, omfatter infeksjoner forårsaket av DNA- eller RNA-virus, slik som herpesvirus (CMV, HSV 1, HSV 2, EBV, varicella zoster-virus [VZV], bovid herpesvirus type 1, heste-herpesvirus type 1, HHV-6, papillomavirus (HPV-typer 1-55, inkludert karsinogent HP V), flavivirus (inkludert gulfebervirus, afrikansk svinefebervirus og japansk encefalittvirus), togavirus (inkludert venezuelansk heste-encefalomyelittvirus), influensavirus (typene A-C), retrovirus (HIV-1, HIV-2, HTLV-I, HTLV-II, SIV, FeLV, FIV, MoMSV), adenovirus (typene 1-8), koppevirus (vaccinia-virus), enterovirus (poliovirus typene 1-3, Coxsackie, hepatitt A-virus og ECHO-virus), gastroenterittvirus (Norwalk-virus, rotavirus), hantavirus (Hantaan-virus), polyomavirus, papovavirus, rhinovirus, parainfluensa-virustypene 1-4, rabiesvirus, respiratorisk syncytialvirus (RSV), hepatittvirusene A, B, C og E, og lignende.

Foretrukne forbindelser ifølge denne oppfinnelsen for behandlingen av herpesvirus, hepadnavirus og HIV er de hvor Ri = NH2, R2= NH2eller OH, X = O og R3= H eller metyl. Andre antivirale aktiviteter av forbindelser ifølge denne oppfinnelsen bestemmes ved hjelp av rutineanalyse av antiviral aktivitet ved å anvende enzyminhiberingsanalyser, vevskulturanalyser, dyremodellanalyser og lignende, slik det vil bli forstått av fagfolk innen teknikken.

De nye forbindelsene ifølge denne oppfinnelsen er også anvendbare per se eller som mellomprodukter ved fremstillingen av polymerer som har et bredt spekter av diagnostiske, terapeutiske og industrielle utnyttelser.

Forbindelsene ifølge denne oppfinnelsen er egnet som mellomprodukter for å fremstille affinitetsabsorpsjonsmedier som bærer substituentgrupper med egenskaper som kan anvendes til å absorbere forbindelser fra urene blandinger. Disse fremstilles og brukes på den samme måte som andre ionebyttermedier som inneholder de samme substituentene, feks. fosfonat eller amino. For eksempel er fosfonatgruppen i forbindelsene her kovalent bundet til oppløselig matriks, og frie Ri-aminosubstituenter på den heterosykliske basis tjener som ionebytterseter. Alternativt er den heterosykliske basis-aminogruppe bundet til matriksen, og den frie fosfonatgruppen kan så anvendes i den kromatografiske absorpsjon av positivt ladede molekyler. Andre immobiliserte utførelsesformer av forbindelsene her er anvendbare ved rensing av proteiner, feks. enzymer som forbindelsene ifølge denne oppfinnelsen kan binde seg til, feks. transportproteiner (se Cihlar, supra).

Egnede metoder for inkorporering av forbindelsene ifølge denne oppfinnelsen i uoppløselige matrikser, slik som polymerharpiker, vil lett være åpenbare for fagfolk innenfor teknikken. Forbindelsene her kan immobiliseres ved hjelp av kovalent kryssbinding av pyrimidinamino- eller -hydroksygruppene til en uoppløselig matriks. Likeledes inkorporeres forbindelser ifølge denne oppfinnelsen i uoppløselige harpikser ved binding av hydroksy til fosfonatgruppen, eller en hydroksymetyl R3-gruppe til matriksen eller harpiksen ved å anvende kovalente bindingsmidler som er tidligere kjent. Egnede bindingsmetoder er beskrevet i Cihlar ( supra).

Forbindelsene ifølge denne oppfinnelsen er også anvendbare som kryss-linkere eller mellomledd i fremstilling av affinitetsabsorpsjonsmatrikser (i motsetning til å virke som affinitetsrester per se, som angitt i avsnittene ovenfor). Forbindelsene her inneholder flere funksjonelle grupper som er egnet som sete for kryssbinding av ønskede stoffer. Det er vanlig å binde affinitetsreagenser, slik som hormoner, peptider, antistoffer, enzymer, legemidler og lignende, til uoppløselige substrater. Disse uoppløseliggjorte reagensene anvendes på kjent måte til å absorbere stoffer fra fremstilte preparater, diagnostiske prøver og andre urene blandinger. Likeledes brukes immobiliserte enzymer til å utføre katalytiske omdannelser med lettvint separasjon av enzym fra produkt.

Ved noen utførelsesformer er det nødvendig at forbindelsene ifølge denne oppfinnelsen er kryssbundet til uoppløselige materialer. F.eks. kan de anvendes til å binde analytter til påvisbare grupper ved fremstilling av oppløselige diagnostiske reagenser.

Fremgangsmåter for kryssbinding under anvendelse av substituentgruppene som finnes i forbindelsene ifølge denne oppfinnelsen, er godt kjent innenfor teknikken. For eksempel brukes fosfonsyren til å danne estere med alkoholer eller amider med aminer. Likeledes er amino-, halogen-, hydroksy- og andre reaktive seter som finnes på pyrimidinet, egnet. Selvsagt vil det bli brukt beskyttelse av reaktive grupper når det er nødvendig mens det kryssbundne reagens settes sammen. Generelt brukes forbindelsene ifølge oppfinnelsen ved å binde dem gjennom fos-fonsyre til hydroksy- eller aminogruppene i bindingspartneren, og kovalent bundet til den andre bindingspartneren gjennom en annen substituent på forbindelsen ifølge denne oppfinnelsen. For eksempel forestres en første bindingspartner, slik som et steroidhormon, til fosfonsyren ifølge denne oppfinnelsen, og så kryssbindes dette konjugatet gjennom Ro-hydroksymetyl til cyan-bromidaktivert Sepharose, hvorved det immobiliserte steroid fås. Andre kjemiske fremgangsmåter for konjugasjon er velkjent. Se feks. Maggio, "Enzyme-Immunoassay" (CRC, 1988, s. 71-135) og referanser som er angitt der.

Farmasøytiske preparater

Forbindelsene ifølge denne oppfinnelsen og deres fysiologisk akseptable salter og solvater (heretter kollektivt henvist til som de aktive bestanddelene) formuleres for administrering ved hjelp av hvilken som helst vei som er passende for den tilstand som skal behandles. Forbindelsene og preparatene vil fortrinnsvis være sterile.

De aktive bestanddelene plasseres i farmasøytiske preparater. Preparatene, både for veterinærmedisinsk og for humanbruk, omfatter minst én aktiv bestanddel som definert ovenfor, sammen med én eller flere akseptable bærere for denne, og eventuelt andre terapeutiske bestanddeler. Bæreren eller bærerne må være "akseptable" i den betydning at de er kompatible med de øvrige bestanddelene i preparatet, og ikke er skadelige for mottakeren.

Preparatene presenteres passende i enhets doseringsform og kan fremstilles ved hjelp av hvilken som helst av metodene som er godt kjent innenfor farmasien. Generelt fremstilles preparatene ved jevnt og intimt å bringe den aktive bestanddel i forbindelse med flytende bærere eller fint oppdelte faste bærere eller begge deler, og så om nødvendig forme produktet.

Preparater ifølge foreliggende oppfinnelse som er egnet for oral administrering, kan presenteres som atskilte enheter, slik som kapsler, kapsler med pulver eller tabletter som hver inneholder en forutbestemt mengde av den aktive bestanddel; som et pulver eller granulater; som oppløsning eller en suspensjon i en vandig væske eller en ikke-vandig væske; eller som en flytende olje-i-vann-emulsjon eller en flytende vann-i-olje-emulsjon. Den aktive bestanddel kan også presenteres som en bolus, en medisin blandet med søtstoff eller pasta.

For utvendige infeksjoner i øyet eller andre utvendige vev, feks. munn og hud, appliseres preparatene fortrinnsvis som en topisk salve eller krem som inneholder den eller de aktive bestanddelene i en mengde på feks. 0,075 til 20 vekt% (inkludert én eller flere aktive bestanddeler i et område mellom 0,1 og 20% i trinn på 0,1 vekt%, slik som 0,6 vekt%, 0,7 vekt%, etc), vanligvis 0,2 til 15 vekt%, og mest vanlig 0,5 til 10 vekt%. Når de formuleres i en salve, kan de aktive bestanddelene anvendes enten med en paraffinisk eller en vannblandbar salvebasis. Alternativt kan de aktive bestanddelene formuleres i en krem med en olje-i-vann-krembasis.

Om ønsket, kan vannfasen i kremen omfatte feks. minst 30 vekt% av en flerbasisk alkohol, dvs. en alkohol som har to eller flere hydroksygrupper, slik som propylenglykol, butan-1,3-diol, mannitol, sorbitol, glyserol og polyetylenglykol (inkludert PEG 400) og blandinger derav. De topiske preparatene kan om ønsket omfatte en forbindelse som øker absorpsjon eller penetrasjon av den aktive bestanddel gjennom huden eller andre angrepne områder. Eksempler på slike dermale penetrasjonsfremmere omfatter dimetylsulfoksid og beslektede analoger.

Oljefasen i emulsjonene ifølge denne oppfinnelsen kan dannes fra kjente bestanddeler på en kjent måte. Denne fasen kan omfatte et emulgeringsmiddel alene eller en blanding av minst ett emulgeringsmiddel og et fett eller en olje, eller med både et fett og en olje. Fortrinnsvis er et hydrofilt emulgeringsmiddel inkludert sammen med et lipofilt emulgeringsmiddel som virker som et stabiliseringsmiddel. Det er også foretrukket å inkludere både en olje og et fett. Emulsjonsstabiliseringsmidler som er egnet for anvendelse i preparatet ifølge foreliggende oppfinnelse, omfatter Tween 60, Span 80, cetostearylalkohol, benzylalkohol, myristylalkohol, glyserylmonostearat og natriumlaurylsulfat. Egnede oljer eller fettstoffer omfatter rettkjedede eller forgrenede, en- eller tobasiske alkylestere, slik som diisoadipat, isocetylstearat, propylenglykoldiester av kokosnøttfettsyrer, isopropylmyristat, decyloleat, isopropylpalmitat, butylstearat eller 2-etylheksylpalmitat. Disse kan anvendes alene eller i kombinasjon avhengig av egenskapene som trengs. Alternativt kan det anvendes lipider med høyt smeltepunkt, slik som hvit vaselin og/eller flytende paraffin eller andre mineraloljer.

Preparater som er egnet for topisk administrering til øyet, omfatter også øyedråper hvor den aktive bestanddel er oppløst eller oppslemmet i en egnet bærer, spesielt et vandig opp- løsningsmiddel for den aktive bestanddel. Den aktive bestanddel er vanligvis til stede i slike preparater i en konsentrasjon på 0,01 til 20 vekt%.

Preparater egnet for nasal administrering hvor bæreren er et fast stoff, omfatter et grovt pulver med en partikkelstørrelse f.eks. i området 20 til 500 um (inkludert partikkelstørrelser i området mellom 20 og 500 um i sprang på 5 um, slik som 30 um, 35 um, etc), som administreres ved hyppig inhalasjon gjennom nesegangen fra en beholder med pulveret. Egnede preparater hvor bæreren er en væske, for administrering som f.eks. en nesespray eller som nesedråper, omfatter vann, eller oljeoppløsninger av den aktive bestanddel. Preparater egnet for aerosoladministrering, kan fremstilles i henhold til vanlige metoder og kan avleveres med andre terapeutiske midler, slik som pentamidin for behandling av pneumocystis pneumonia.

Preparater egnet for vaginal administrering, kan presenteres som pessarer, tamponger, kremer, geler, pastaer, skum eller spraypreparater som inneholder slike bærere som er kjent innenfor teknikken for å være passende, i tillegg til den aktive bestanddel.

Preparater egnet for parenteral administrering, omfatter vandige og ikke-vandige, sterile injeksjonsoppløsninger som kan inneholde antioksidanter, bufferstoffer, bakteriostater og oppløste stoffer som gjør preparatet isotonisk med blodet hos den påtenkte mottaker; og vandige og ikke-vandige, sterile suspensjoner som kan omfatte oppslemningsmidler og fortykningsmidler. Preparatene kan presenteres i endose- eller flerdosebeholdere, f.eks. lukkede ampuller og småfiasker, og kan lagres i en frysetørket (lyofilisert) tilstand som bare krever tilsetningen av den sterile, flytende bærer, f.eks. vann for injeksjoner, umiddelbart før bruk. Improviserte injeksjonsoppløsninger og suspensjoner kan fremstilles fra sterile pulvere, granulater og tabletter av den typen som er beskrevet tidligere. Foretrukne enhetsdoseringspreparater er de som inneholder en daglig dose eller daglig enhetsdeldose som beskrevet ovenfor, eller en passende fraksjon derav, av en aktiv bestanddel.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre veterinærpreparater som omfatter minst én aktiv bestanddel som definert ovenfor, sammen med en veterinærmedisinsk bærer for den. Veterinærmedisinske bærere er materialer for administrering av preparatet og kan være faste, flytende eller gassformede materialer som ellers er inerte eller akseptable innenfor veterinærmedisinen, og som er kompatible med den aktive bestanddel. Disse veterinærmedisinske preparatene kan administreres oralt, parenteralt eller ved hjelp av hvilken som helst annen ønsket vei.

Foreliggende forbindelser anvendes eventuelt i farmasøytiske preparater med kontrollert frigjørelse som inneholder som aktiv bestanddel én eller flere aktive forbindelser hvor frigjørelsen av den aktive bestanddel er kontrollert og regulert slik at mindre hyppig dosering muliggjøres, eller for å forbedre farmakokinetikken eller toksisitetsprofilen til en bestemt forbindelse. Generelt administreres forbindelsene fra systemer med regulert frigjørelse, slik som implantatet ifølge WO 92/14450 eller US patentskrift nr. 5 098 443, eller matriksene ifølge US patentskrift nr. 4 740 365 eller US patentskrift nr. 5 141 752. Mange andre er kjente og er egnet for bruk her.

Terapeutisk administrering

Egnede administreringsveier omfatter oral, rektal, nasal, topisk (inkludert okular, bukkal og sublingual), vaginal og parenteral (inkludert subkutan, intramuskulær, intravitrøs, intravenøs, intradermal, intratekal og epidural). Den foretrukne administreringsvei vil avhenge av pasientens tilstand, forbindelsens toksisitet og infeksjonsstedet, blant andre vurderinger som er kjent for legen.

For hver av de ovenfor angitte terapeutiske indikasjoner vil den nødvendige mengde av en aktiv bestanddel (som definert ovenfor) avhenge av en rekke faktorer, inkludert alvorligheten av tilstanden som skal behandles, den infeksiøse agens, hvorvidt anvendelsen er profylaktisk eller for å behandle en akutt infeksjon, infeksjonsstedet eller patologistedet, eller andre faktorer, til syvende og sist opp til vurderingen til den behandlende lege eller veterinær. Generelt vil imidlertid en egnet dose for vurdering av legen være i området til analoge metoksyfosfonater (se ovenfor), idet det tas i betraktning forskjeller i styrke ved in vtfrø-testing, generelt 0,1 til 250 mg pr. kilogram kroppsvekt til mottaker pr. dose (inkludert aktiv(e) bestanddel(er) i et område mellom 0,1 mg og 400 mg/kg/dose i sprang på 0,5 mg/kg/dose, slik som 2,5 mg/kg/dose, 3,0 mg/kg/dose, 3,5 mg/kg/dose, etc), vanligvis i området 0,5 til 50 mg pr. kilogram kroppsvekt pr. dose, og mest vanlig i området 1 til 300 mg pr. kilogram kroppsvekt pr. dose.

Den ønskede dose administreres ved passende intervaller i enhetsdoseringsformer, vanligvis med en forholdsvis høyere igangsettelsesdose og mindre, mindre hyppige oppretthold-elsesdoser. Forbindelsene anvendes også profylaktisk, feks. ved administrering på ca. fra 1 til 7 dager før virusinfeksjon. HPV-tumorer eller svulster og herpeslesjoner behandles ofte topisk, enten ved hjelp av lokal injeksjon eller ved hjelp av topiske geler, salver eller lignende.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen anvendes eventuelt i kombinasjon med andre terapeutiske midler for behandling eller profylakse av infeksjoner med tilstandene som er angitt ovenfor. Eksempler på slike ytterligere terapeutiske midler omfatter midler som er effektive for behandlingen eller profylaksen av virusinfeksjoner. Disse omfatter, men er ikke begrenset til, NRTI-ene, 3'-azido-3'-deoksytymidin (zidovudin, AZT), 2'-deoksy-3'-tiacytidin (3TC), 2',3'-dideoksy-2',3'-didehydrotymidin (D4T), carbovir (karbosykliske 2',3'-dideoksy-2',3'-didehydro-guanosin), abacavir (ABC), 2',3'-dideoksyinosin (ddl), didanosin, 2',3'-dideoksycytidin (ddc, zalcitabin), 3'-azido-2',3'-dideoksyuridin, (E)-5-(2-bromvinyl)-2'-deoksyuridin (BVDU), 2-klor-2'-deoksyadenosin, 2-deoksykoformycin, 5-fluoruracil, 5-fluoruridin, 5-fluor-2'-deoksyuridin, 5-trifluormetyl-2'-deoksyuridin, 6-azauridin, 5-fluororotinsyre, metotreksat, triacetyluridin, l-(2'-deoksy-2'-fluor-l-p-D-arabinosyl)-5-jodcytidin (FIAC), tetrahydroimidazo(4,5,l-jk)-( 1,4)-benzodiazepin-2(lH)-tion (TIBO) eller andre ikke-nukleosid-reverstranskriptaseinhibitorer (f.eks. nevirapin, delaviridin, efavirens, daparivin, etc), proteaseinhibitorer (feks. saquinavir, indinavir, ritonovir, amprenavir og lignende), 2'-nor-syklisk GMP, 6-metoksypurinarabinosid (ara-M), 6-metoksypurinarabinosid 2'-0-valerat, cytosinarabinosid (ara-C), asykliske nukleosider, slik som acyclovir, valacyclovir, penciclovir, famciclovir, ganciclovir, asykliske nukleotidanaloger, slik som HPMPC, PMEA, PMEG, PMPA, PMPDAP, FPMPA, HPMPA og HPMPDAP, (2R,5R)-9-[tetrahydro-5-(fosfonometoksy)-2-furanyl]adenin, (2R,5R)-1 -[tetrahydro-5-(fosfonometoksy)-2-furanyl]tymin, andre antivirale midler, inkludert ribavirin (adeninarabinosid), 2-tio-6-azauridin, tubercidin, aurintrikarboksylsyre, 3-deazaneoplanocin, neoplanocin, rimantidin, adamantin og foscarnet (trinatriumfosfonoformiat).

Syntesemetoder

Forbindelser som faller innenfor formel (I), syntetiseres ved å alkylere den tilsvarende 6-hydroksypyrimidinbase med dialkyl-2-kloretoksymetylfosfonat (eller dens analoger som gir andre R3-grupper) i nærvær av NaH, CS2CO3eller DBU (l,8-diazabisyklo[5.4.0]undek-7-en) i dipolart, aprotisk oppløsningsmiddel, vanligvis DMF, eventuelt etterfulgt av avbeskyttelse, f.eks. med bromtrimetylsilan og etterfølgende hydrolyse. Produktet med formel (I) ledsages av dannelse av varierende mengder av den tilsvarende Nl-isomer, dvs. 2,4-disubstituert l-[2-(fosfonometoksy)etyl]pyrimidin-6-on. Det kan fjernes ved hjelp av kromatografi som den nøytrale diester før bromtrimetylsilanbehandlingen.

En annen fremgangsmåte for fremstilling av forbindelser med formel (I) omfatter omdannelsen av 2-substituerte 4-klor-6-[2-(fosfonometoksy)etoksy]pyrimidinderivater (og deres R3-analoger) ved omsetning med primære eller sekundære aminer i vannfrie oppløsningsmidler (f.eks. etanol), alkalihydroksid eller alkalikarbonat i vann. Denne reaksjonen kan katalyseres f.eks. ved hjelp av 1,3,5-triazol, imidazol eller med fordel med DABCO (diazabisyklooktan). Beskyttelsesgruppene fjernes så eventuelt, f.eks. ved bromtrimetylsilanbehandling og hydrolyse.

Forbindelser med formel (I) kan også fås ved omsetning av 2,4-disubstituerte 6-halogenpyirmidiner med natriumalkoksid av dialkyl-2-hydroksyetylfosfonat (eller dets analoger som gir andre R3-grupper), etterfulgt av eventuell avbeskyttelse. Fordelen ved denne fremgangsmåten består i dannelsen av bare den påkrevde 06-isomer. Utvelgelsen av den egnede synteseprosedyre avhenger av tilgjengeligheten av det heterosykliske pyrimidinderivat som anvendes som et utgangsmateriale.

Forbindelser med formel (I) kan også fås ved omsetning av 2,4-disubstituerte 6-(2-hydroksyalkyl)pyrimidiner med dialkyl-p-toluensulfonyloksymetylfosfonat i nærvær av NaH. Utgangsmaterialene fremstilles ved behandling av det passende 6-klorpyrimidin med en beskyttet eller ubeskyttet diol i nærvær av en base.

Forbindelser med formel (I) kan videre fås ved substitusjon av forskjellige stillinger i pyrimidinringen. 5-halogenderivatene kan således fås ved omsetninger med elementært halogen eller ved hjelp av halogenanionbytterreaksjoner.

Z-gruppeamider eller -estere omdannes til hydroksyl ved hjelp av hydrolyse.

Monoestere er lett tilgjengelige fra diesteren eller en blanding av di- og monoestere ved behandling med litium eller natriumazid i DMF (A. Holy, "Synthesis 1998", 381-385

(1998)).

Oppfinnelsen vil bli mer fullstendig forstått ved henvisning til de etterfølgende eksempler.

Eksempel 1

( a) 2, 4- diamino- 6-[ 2-( fosfonometoksv) etoksvlpyrimidin og 2, 4- diamino- 142-( fosfonometoksy)-etyl1pyrimidin- 6( lFr)- on

En blanding av 2,4-diamino-6-hydroksypyrimidin (2,52 g, 20 mmol), cesiumkarbonat (3,25 g, 10 mmol) i dimetylformamid (40 ml) ble omrørt i 30 minutter ved 80 °C, og diisopropyl-2-kloretoksymetylfosfonat (3,5 ml, 23,4 mmol) ble tilsatt. Blandingen ble omrørt i 16 timer ved 100 °C og filtrert fra salter. Filtratet ble tatt ned under vakuum og resten kromatografert på silikagelkolonne (300 ml) med kloroform. Elueringen ga produkt som ble krystallisert fra etylacetat-petroleter, hvorved man fikk 1,2 g (17,2%) 2,4-diamino-6-[2-(diisopropylfosfonyl-metoksy)etoksy]pyrimidin, smp. 159 °C. For C13H25N4O5P (348,3) beregnet 44,83% C, 7,23% H, 16,08% N, 8,89% P; funnet 44,99% C, 7,28% H, 16,18% N, 9,03% P. Massespektrum: 349,3 (MH<+>)(100), 265,1 (MH<+>- 2 x iPr)(6); 139 (26); 127,1 (baseH<+>)(37).<!>H NMR (CD3SOCD3): 1,24 d, 6 H og 1,24 d, 6 H, J(CH3,CH)=6,2 (4xCH3); 3,74 m, 2 H (H-2'); 3,78 d, J(CH2-P)=8,2 (CH2-P); 4,22 m, 2 H (H-l'); 4,59 dh, 2 H, J(CH,P)=8,2, J(CH,CH3)=6,2 (2xCH); 5,02 s, 1 H (H- 6) ; 5,85 bs, 2 H og 6,00 bs, 2 H (2xNH2).<13>C NMR (CD3SOCD3): 23,85 d, J(CH3,P)=4,6 (2xCH3); 23,99 d, J(CH3,P)=4,1 (2xCH3); 63,65 (C-l'); 65,02 d, J(CH2-P)=164,4 (CH2P); 70,32 d, J(CH,P)=6,0 (2xCH-0); 71,05 d, J(2',P)=11,9 (C-2'); 76,35 (C-5); 163,01, 166,15 og 169,92 (C-2, C-4 og C-6).

Denne forbindelsen (1,0 g, 2,9 mmol) ble behandlet med BrSiMe3(4 ml) i acetonitril (40 ml) over natten. Oppløsningsmidlene ble strippet ned under vakuum, resten samdestillert med acetonitril (2x25 ml), og vann (50 ml) ble tilsatt til resten. Oppløsningen ble gjort alkalisk med konsentrert, vandig ammoniakk og inndampet under vakuum. Resten ble tilført i vandig oppløsning på en kolonne (100 ml) Dowex 50 X 8 (H+<->form), og kolonnen ble eluert med vann (3 ml/min); elueringen ble fulgt ved hjelp av kontinuerlig måling av UV-absorpsjon i eluatet ved 254 nm. Etter fjerning av den nøytrale UV-absorberende fraksjon ble kolonnen eluert med 2,5% vandig ammoniakk, og den UV-absorberende fraksjon ble samlet opp. Den ble tatt ned under vakuum, på nytt oppløst i vann (20 ml), brakt til pH 9-10 ved hjelp av konsentrert, vandig ammoniakk og tilført på en kolonne (70 ml) Dowex 1X2 (acetatform) grundig forvasket med vann. Eluering med vann ga (med retensjon) produkt som ble krystallisert fra vann, hvorved man fikk 2,4-diamino-6-[2-(fosfonometoksy)etoksy]pyrimidin (0,60 g, 78,3%), smp. 279 °C (vann). EUp 0,80. For C7H13N4O5P (264,2) beregnet 31,83% C, 4,96% H, 21,21% N, 11,72% P; funnet 31,52% C, 5,04% H, 20,96% N, 11,53% P. UV-spektrum [A^ks(emaks)] (pH 2): 276 (9100), (pH 7) : 265 (7500). Disse data er i overensstemmelse med UV-spektrene publisert for 2,4-diamino-6-metoksypyrimidin (hhv. A.maks263 og 275).<*>H NMR (CD3SOCD3,40 °C): 3,58 d, 2 H, J(CH2,P)=8,7 (CH2P); 3,741,2 H,/(2',l')=4,9 (H-2'); 4,23 t, 2 H,/(l',2')=4,9 (H-l'); 5,07 s, 1 H (H-5); 5,86 bs, 2 H og 6,01 bs, 2 H (2 x NH2).<!>H NMR (D20): 3,69 d, 2 H, J(CH2,P)=8,7 (CH2P); 3,91 m, 2 H (H-2'); 4,30 m, 2 H (H-l<*>); 5,45 s, 1 H (H-5).<13>C NMR (D20): 69,30 (C-l'); 70,28 d, J(CH2-P)=151,3 (CH2P); 73,35 d, J(2',P)=10,3 (C-2'); 79,63 (C-5); 165,46, 169,35 og 171,08 (C-2, C-4 og C-6). Lavfelts posisjon for C-l'-karbonsignalet i O-isomerene (diester og fritt fosfonat) (hhv. 5 63,65 og 69,30) indikerer at PME-gruppen er bundet til oksygenatomet i C-6.

Videre eluering av silikagelkolonnen med kloroform ga 1,8 g (26%) av amorft 2,4-diamino-l-[2-(diisopropylfosfonylmetoksy)etyl]pyrimidin-6(lH)-on (Rf 0,35, Sl) som ble tørket under vakuum over P2Os. Smp. 196-197 °C. Resten (5,17 mmol) ble behandlet med bromtrimetylsilan (6 ml) i acetonitril (60 ml) over natten og opparbeidet som beskrevet for O-isomeren. Rensing av den avsaltede blanding på Dowex 1-kolonne (eluering med vann) ga produkt som ble krystallisert fra vann, hvorved man fikk 0,95 g (65%) 2,4-diamino-l-[2-(fosfonometoksy)etyl]pyrimidin-(lH)-on, smp. 228 °C (vann). EUp 0,90. For C7Hi3N405P.H20

(282,2) beregnet 29,79% C, 5,36% H, 19,85% N, 10,98% P; funnet 29,76% C, 5,22% H, 20,01% N, 10,92% P. Massespektrum: 349,2 (MH<+>)(100); 265,1 (MH<+->2x iPr)(35); 126 (BH<+>) (26). UV-spektrum [A,maics (Smaks)] (pH 2): 264 (18000), (pH 7): 267 (12200). A^aks-verdien stemmer overens med verdien publisert for 2,4-diamino-l-metylpyrimidin-6(lH)-on (268 nm).<!>H NMR (CD3SOCD3): 3,59 d, 2 H, J(CH2,P)=8,4 (CH2P); 3,601, 2 H, J(2',l')=6,l (H-2'); 3,96 t, 2 H

J(l',2')=6,l (H-l'); 4,61 s, 1 H (H-5); 5,88 bs, 2 H og 6,61 bs, 2 H (2 x NH2).<*>H NMR (D20): 3,48 d, 2 H, J(CH2P)=8,4 (CH2P); 3,761,2 H, J(l',2')=5,2 (H-l'); 4,091,2 H, J(2',l')=5,2 (H-2'); 5,06 s, 1 H (H-5).<13>C NMR (D20): 45,15 (C-l'); 70,41 d, J(CH2-P)=154,7 (CH2P); 74,09 d, J(2',P)=11,8 (C-2'); 81,05 (C-5); 159,73, 166,79 og 168,04 (C-2, C-4 og C-6). Oppfeltsstillingen til C-T (8 45,15) indikerer N-substitusjon. To signaler for NH2-grupper (8 6,61 og 5,88) som observeres i<!>H NMR-spektrum i DMSO, utelukker substitusjonen i ekso-stillingene 2-NH2og/eller 4-NH2og er i overensstemmelse med den forventede substitusjon i N(l).

Eksempel 2

( a) 2- amino- 4- klor- 6- r2-( diisopropvlfosfonylmetoksv) etoksvlpvrimidin og 2- amino- 4- klor- l-[ 2-( diisopropvlfosfonvlmetoksv) etyllpvrimidin- 6( 1 H)- on

2-amino-4-klor-6-hydroksypyrimidin-monohydrat (25 mmol) ble samdestillert med toluen (3 x 50 ml) under vakuum, og resten ble behandlet med DMF (50 ml), DBU (3,8 ml) og diisopropyl-2-kloretoksymetylfosfonat (7 ml). Blandingen ble omrørt i 16 timer ved 100 °C og de

flyktige stoffene fjernet ved fordamping ved 50 °C/2 kPa. Resten ble tatt opp i kloroform (200 ml), og det ble filtrert og vasket med mettet NaCl (100 ml). Den vandige vaskeoppløsning ble ekstrahert med kloroform (5 x 50 ml), de kombinerte ekstrakter ble tørket med magnesiumsulfat og inndampet. Separasjon på silikagelkolonne (150 ml) i kloroform ved hjelp av kloroform-etanol-gradient ga 2-amino-4-klor-6-[2-(diisopropylfosfonylmetoksy)etoksy]pyrimidin, utbytte 27,2%, smp. 89 °C. For C13H23CIN3O5P (367,77) beregnet 42,46% C, 6,30% H, 9,64% Cl, 11,43% N, 8,42% P; funnet 42,34% C, 6,34% H, 9,79% Cl, 11,30% N, 8,23% P. Massespektrum: 368,3 (MH<+>)(100).<!>H NMR (CD3SOCD3): 1,22 d, 6 H og 1,23 d, 6 H, J(CH3,CH)=6,1 (CH3); 3,78 d, J(CH2-P)=8,3 (CH2-P); 3,80 m, 2 H (H-2'); 4,37 m, 2 H (H-l'); 4,58 m, 2 H (P-OCH); 6,06 s, 1 H (H-5); 7,05 bs, 2 H (NH2).<13>C NMR (CD3SOCD3): 23,83 d, 2C, J(CH3,P)=4,9 og 23,97 d, 2C, J(P,C)=3,9 (CH3); 65,00 d, J(P,C)=164,1 (P-C); 65,15 (C-l'); 70,35 d, 2C, J(P,C)=6,7 (P-OC); 70,52 d, 2C, J(P,C)=11,7 (C-2'); 94,46 (C-5); 160,12 (C-2); 162,97 (C-4); 170,56 (C-6).

Videre eluering og krystallisering fra etylacetat-eter ga 2-amino-4-klor-l-[2-(diisopropylfosfonylmetoksy)etyl]pyrimidin-6(lH)-on, utbytte 52,4%, smp. 95 °C. For Ci3H23ClN305P (367,77) beregnet 42,46% C, 6,30% H, 9,64% Cl, 11,43% N, 8,42% P; funnet 42,28% C, 6,22% H, 9,65% Cl, 11,50% N, 8,27% P. Massespektrum: 368,4 (MH<+>)(100).<!>H NMR (CD3SOCD3): 1,20 d, 6 H og 1,22 d, 6 H, J(CH3,CH)=6,1 (CH3); 3,691, 2 H, J(2',l')=5,5 (H-2'); 3,76 d, J(CH2-P)=8,1 (CH2-P); 4,061, 2 H, J(l',2')=5,5 (H-l'); 4,55 m, 2 H (P-OCH); 5,67 s, 1 H (H-5); 7,60 bs, 2 H (NH2).<13>C NMR (CD3SOCD3): 23,84 d, 2C, J(CH3,P)=3,9 og 23,97 d, 2C, J(P,C)=3,9 (CH3); 40,29 (C-l'); 65,03 d, J(P,C)=164,1 (P-C); 69,01 d, 2C, J(P,C)=11,7 (C-2'); 70,41 d, 2C, J(P,C)=5,9 (P-OC); 98,28 (C-5); 155,73 (C-2); 157,87 (C-4); 161,48 (C-6).

( b) 2- amino- 4- hydroksy- 6- r2-( fosfonometoksv) etoksvlpyrimidin

En blanding av 2-amino-4-klor-6-[2-(diisopropylfosfonylmetoksy)etoksy]-pyrimidin (5,7 g), DABCO (3,6 g) og K2C03(9,0 g) i vann (100 ml) ble kokt under tilbakeløps-kjøling i 150 minutter under omrøring, avkjølt og surgjort ved tilsetning av Dowex 50 X 8 (H+<->form). Suspensjonen ble gjort alkalisk med konsentrert, vandig ammoniakk, etter 5 minutters omrøring, filtrert og harpiksen vasket med 50% vandig metanol (200 ml). Filtratet ble inndampet til tørrhet, etanol (50 ml) ble tilsatt og blandingen inndampet til tørrhet. Resten ga etter kromatografi på silikagelkolonne (150 ml) med kloroform-etanol-gradient krystallinsk 2-amino-6-[2-(diisopropylfosfonylmetoksy)etoksy]-4-hydroksypyrimidin, smp. 154 °C i 78% utbytte. For Ci3H24N306P (349,3) beregnet 44,70% C, 6,92% H, 12,0% N, 8,37% P; funnet 44,58% C, 7,02% H, 11,95% N, 8,53% P.<!>H NMR (CD3SOCD3): 1,24 d, 6 H og 1,23 d, 6 H, J(CH3,CH)=6,2 (4xCH3); 3,74 m, 2 H (H-2'); 3,76 d, J(CH2-P)=8,3 (CH2-P); 4,19 m, 2 H (H-l'); 4,59 m, 2 H (P-OCH); 4,75 s, 1 H (H-5); 6,65 bs, 2 H, 2 H (NH2); 10,45 s, 1 H (OH).<13>C NMR (CD3SOCD3): 23,87 d, 2C, J(CH3,P)=4,9 og 24,01 d, 2C, J(P,C)=3,9 (CH3); 65,03 d, J(P,C)=164,6 (P-C); 65,04 (C-l'); 70,37 d, 2C, J(P,C)=6,3 (P-OC); 70,87 d, J(P,C)=11,7 (C-2'); 79,95 (C-5); 155,68 (C-4); 164,25 (C-2); 171,01 (C-6).

Dette produkt ble behandlet med bromtrimetylsilan (10 ml) i acetonitril (80 ml) over natten, inndampet under vakuum og resten behandlet med vann (50 ml). Etter 10 minutter ble konsentrert, vandig ammoniakk tilsatt inntil alkalisk reaksjon, og blandingen ble inndampet. Resten ble avionisert på en kolonne (100 ml) med Dowex 50 X 8, og det UV-absorberende ammoniakkeluat ble inndampet til tørrhet. Det ble oppløst i minimalt varmt vann ved tilsetning av konsentrert, vandig ammoniakk og surgjort ved hjelp av konsentrert HC1 inntil pH 3-3,5. Utfellingen ble samlet opp, vasket med vann, etanol og tørket under vakuum. Utbytte, 0,7 g, smp. 227 °C. For C7H12N3O6P (265,16) beregnet 31,71% C, 4,56% H, 15,85% N, 11,68% P; funnet 31,55% C, 4,62% H, 16,15% N, 11,51% P.

Eksempel 3

( a) 2, 4- diamino- 6-( S)-[ 2-( fosfonometoksv) propoksvlpyrimidin- ( H- 3560) diisopropyl-( S)- 2-( 4-toluensulfonvloksv) propvloksvmetylfosfonat

(25,7 g, 63 mmol) i DMF (40 ml) ble tilsatt ved 90 °C til en omrørt blanding av 2,4-diamino-6-hydroksypyrimidin (60 mmol), DMF (40 ml) og DBU (10,6 ml, 60 mmol). Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 100 °C i 24 timer og inndampet under vakuum. Resten ble tatt opp i kloroform (200 ml), og det ble filtrert og vasket med mettet NaCl (100 ml). Den vandige vaskeoppløsning ble ekstrahert med kloroform (5x50 ml), og de kombinerte ekstrakter ble tørket med magnesiumsulfat og inndampet. Separasjon på silikagelkolonne (150 ml) i kloroform ved hjelp av kloroform-etanol-gradient ga hovedproduktet (06-isomer) som en oljeaktig rest som ble tørket under vakuum over fosforpentoksid over natten. Acetonitril (80 ml) og bromtrimetylsilan (20 ml) ble tilsatt, og oppløsningen fikk stå over natten i en lukket kolbe. De flyktige stoffene ble fordampet under vakuum, og resten ble behandlet med vann (100 ml). Etter 10 minutter ble konsentrert, vandig ammoniakk tilsatt inntil alkalisk reaksjon, og blandingen ble inndampet. Resten ble avionisert på en kolonne (100 ml) med Dowex 50 X 8, og det UV-absorberende ammoniakkeluat ble inndampet til tørrhet. Dette produktet i vann (20 ml) ble gjort alkalisk ved hjelp av konsentrert, vandig ammoniakk og tilført på en kolonne (200 ml) Dowex 1X2 (acetat-form) forvasket med vann. Eluering med vann etterfulgt av lineær gradient av eddiksyre (0-0,5 M, 1,5 1 hver) ga hoved-UV-absorpsjonsfraksjonen som ble inndampet, og resten ble samdestillert med vann (3 x 50 ml) og krystallisert fra vann. Utbytte, 3,5 g (19,7%), smp. 281 °C. For monohydrat C8H15N4O5P.H2O (296,22) beregnet 32,44% C, 5,78% H, 18,91% N, 10,46% P; funnet 32,67% C, 5,86% H, 19,40% N, 10,60% P. lU NMR (D20 + NaOD): 1,26 d, 3 H, J(3',2')=6,4 (H-3'); 3,51 dd, 1 H, J(CHb,P)=9,4, J(gem)=12,2 (CHbP); 3,60 dd, 1 H, J(CHa,P)=9,4, J(gem)=12,2 (CFLP); 3,92 m, 2 H (H-2'); 4,06 dd, 1 H, J(l'b,2')=5,5, J(gem)=10,5 (H-1'b); 4,14 dd, 1 H, J(l'a,2')=3,7, J(gem)=10,5 (H-1'a); 5,41 s, 1 H (H-5).<13>C NMR (D20): 15,84 (C-3'); 66,99 d, J(CH2-P)=149,9 (P-C); 69,68 (C-l'); 75,14 d, J(2',P)=11,2 (C-2'); 76,84 (C-5); 166,74 (C-2); 162,83 (C-4); 171,05 (C-6).

( b) 2, 4- diamino- 6-( R)-[ 2-( fosfonometoksv) propoksvlpyrimidin ( H- 3567)

(R)-enantiomeren ble fremstilt analogt med eksempel 3(a) fra isopropyl-(R)-2-(4-toluensulfonyloksy)propyloksymetylfosfonat (50 mmol), 2,4-diamino-6-hydroksypyrimidin

(60 mmol) og DBU (60 mmol) i DMF (70 ml). Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 100 °C i 24 timer. Videre opparbeidelse fulgte fremgangsmåten beskrevet i eksempel 4. Utbytte, 24%, ikke smeltende under 290 °C. For monohydrat C8H15N4O5P.H2O (296,22) beregnet 32,44% C, 5,78% H, 18,91% N, 10,46% P; funnet 32,54% C, 5,90% H, 19,10% N, 10,65% P.<!>H NMR- og<13>C NMR-spektra er identiske med de for (S)-enantiomeren.

Eksempel 4

2, 4- diamino- 6- r2-( fosfonometoksv) etylsulfanvHpvrimidin

En suspensjon av 2,4-diamino-6-sulfanylpyrimidinhemisulfat (2,616 g, 13,7 mmol) i DMF (40 ml) ble behandlet med natriumhydrid (1,0855 g, 27 mmol, 60% dispersjon i paraffinolje) i 1 time under omrøring, etterfulgt av diisopropyl-2-kloretoksymetylfosfonat (9 ml, 17,2 mmol). Blandingen ble omrørt i 8 timer ved 80 °C, filtrert gjennom celite-pute og inndampet under vakuum. Resten i kloroform ble renset på silikagelkolonne (150 ml) i kloroform-etanol (49:1), hvorved man fikk 2,4-diamino-6-[2-(diisopropylfosfonylmetoksy)etylsulfanyl]pyrimidin (4,0 g, 80%), smp. 109 °C. For C13H25N4O4PS (364,40) beregnet 42,85% C, 6,91% H, 15,38% N, 8,50% P, 8,80% S; funnet 42,48% C, 6,94% H, 15,50% N, 8,63% P, 9,01% S.<!>H NMR (CD3SOCD3): 1,24 d, 6 H og 1,25 d, 6 H, J(CH3,CH)=6,1 (CH3); 3,17 t, 2 H, J(l',2')=6,6 (H-l'); 3,681,2 H, J(2',l')=6,6 (H-2'); 3,77 d, J(CH2-P)=8,3 (CH2-P); 4,60 m, 2 H (P-OCH); 5,60 s, 1 H (H-5); 5,95 brs, 2 H og 6,17 brs, 2 H (NH2).

Denne forbindelsen i acetonitril (50 ml) ble behandlet med bromtrimetylsilan (5 ml) over natten, og de flyktige stoffene ble avdampet under vakuum. Resten ble behandlet med vann (100 ml). Etter 10 minutter ble konsentrert, vandig ammoniakk tilsatt til alkalisk reaksjon, og blandingen ble inndampet. Resten ble avionisert på en kolonne (100 ml) Dowex 50 X 8, og det UV-absorberende ammoniakkeluat ble inndampet til tørrhet. Dette produktet i vann (20 ml) ble gjort alkalisk ved hjelp av konsentrert, vandig ammoniakk og tilført på en kolonne (100 ml) Dowex 1X2 (acetatform) forvasket med vann. Eluering med vann etterfulgt av lineær gradient av eddiksyre (0-0,5 M, 1,5 1 hver) ga hoved-UV-absorpsjonsfraksjonen som ble inndampet, og resten ble samdestillert med vann (3 x 50 ml), og resten ble krystallisert fra vann. Utbytte, 2,8 g (91%) 2,4-diamino-6-[2-(fosfonometoksy)etylsulfanyl]pyrimidin, smp. 246 °C. For C7H13N4O4PS (280,24) beregnet 30,00% C, 4,68% H, 19,99% N, 11,05% P, 11,44% S; funnet 30,27% C, 4,80% H, 19,74% N, 10,98% P, 11,60% S.<!>H NMR (D20 + NaOD): 3,18 t, 2 H, J(l',2')=6,8 (H-l'); 3,56 d, 2 H, J(CH2,P)=8,7; (CH2P); 3,68 t, 2 H, J(2',l')=6,8 (H-2'); 5,70 s, 1 H (H-5); 6,32 brs, 2 H (2-NH2); 6,48 brs, 2 H (4-NH2).

Eksempel 5

4- amino- 6-[ 2-( fosfonometoksv) etoksvlpyrimidin og 4- amino- l-[ 2-( fosfonometoksv) etyll-pyrimidin- 6( 1 H)- on

4-amino-6-hydroksy-2-sulfanylpyrimidin (20 g) i kokende etanol (300 ml) ble behandlet under omrøring med Raney-Ni inntil utgangsmaterialet forsvant. Suspensjonen ble filtrert mens den var varm, utfellingen ble vasket med varm etanol (300 ml) og filtratet inndampet

til tørrhet. Resten ga etter krystallisering fra etanol (eter tilsatt inntil turbiditet) 4-amino-6-hydroksypyrimidin, smp. 272 °C. Utbytte, 10,0 g (64,4%). For C4H5N30 (111,10) beregnet 43,24% C, 4,54% H, 37,82% N; funnet 43,40% C, 4,65% H, 38,01%N. Massespektrum: 112 (MH<+>).<!>H NMR (CD3SOCD3): 4,97 s, 1 H (H-5); 6,42 brs, 2 H (NH2); 7,77 s, 1 H (H-2);

11,41 brs, 1 H(OH).

Denne forbindelsen (3,6 g, 33,6 mmol) i DMF (70 ml) ble behandlet med NaH (1,36 g, 34 mmol, 60% dispersjon i paraffinolje) i 0,5 time under omrøring, og diisopropyl-2-kloretoksymetylfosfonat (9,4 ml, 40,5 mmol) ble tilsatt. Blandingen ble omrørt i 8 timer ved 80 °C, filtrert gjennom celite-pute og inndampet under vakuum. Resten i kloroform ble renset på silikagel, og eluering med kloroform-etanol (97,5:2,5) ga 4-amino-6-[2-(diisopropylfosfonylmetoksy)etoksy]pyrimidin som ble krystallisert fra etylacetat-petroleter. Utbytte, 3,0 g (26,8%), smp. 112 °C. For C13H24N3O5P (333,32) beregnet 46,84% C, 7,26% H, 12,61% N, 9,29% P; funnet 46,69% C, 7,38% H, 12,45% N, 9,40% P.<!>H NMR (CD3SOCD3): 1,22 d, 6 H og 1,23 d, 6 H, J(CH3,CH)=6,1 (4xCH3); 3,78 brt, 2 H, J(2',l')=4,5 (H-2'); 3,78 d, J(CH2-P)=8,4 (CH2-P); 4,31 brt, 2 H, J(l',2')=4,5 (H-l'); 4,59 m, 2 H (P-OCH); 5,67 s, 1 H (H-5); 6,62 bs, 2 H (NH2); 8,07 s, 1 H (H-2).<13>C NMR (CD3SOCD3): 64,42 (C-l').

Denne forbindelsen ble behandlet med bromtrimetylsilan (10 ml) i acetonitril (70 ml) over natten ved romtemperatur. Etter inndamping under vakuum ble resten behandlet med vann (100 ml). Etter 10 minutter ble konsentrert, vandig ammoniakk tilsatt inntil alkalisk reaksjon, og blandingen ble inndampet. Resten ble avionisert på en kolonne (100 ml) Dowex 50 X 8, og det UV-absorberende ammoniakkeluat ble inndampet til tørrhet. Dette produktet i vann (20 ml) ble gjort alkalisk ved hjelp av konsentrert, vandig ammoniakk og tilført på en kolonne (150 ml) Dowex 1X2 (acetatform) forvasket med vann. Eluering med vann etterfulgt av lineær gradient av eddiksyre (0-1 M, 1 1 hver) ga hoved-UV-absorpsjonsfraksjonen som ble inndampet, og resten ble samdestillert med vann (3 x 50 ml), og resten ble krystallisert fra vann. Utbytte, 1,8 g (80%) 4-amino-6-[2-(fosfonometoksy)etoksy]pyrimidin, smp. 254 °C. For C7H12N3O5P (249,16) beregnet 33,74% C, 4,85% H, 16,86% N, 12,43% P; funnet 34,02% C, 4,80% H, 16,88% N, 12,58% P.

Videre eluering av den urene reaksjonsblanding på silikagelkolonne med kloroform-etanol (95:5) ga det oljeaktige 4-amino-l-[2-(diisopropylfosfonylmetoksy)etyl]pyrimidin-6(lH)-on som ble tørket under vakuum. Utbytte, 4,6 g (41,1%). Denne forbindelsen ble behandlet med bromtrimetylsilan (10 ml) i acetonitril (70 ml) over natten ved romtemperatur. Etter inndamping under vakuum ble resten behandlet med vann (100 ml). Etter 10 minutter ble konsentrert, vandig ammoniakk tilsatt inntil alkalisk reaksjon, og blandingen ble inndampet. Resten ble tilført på en kolonne (100 ml) av Dowex 50 X 8, og det ble eluert med vann. Hoved-UV-absorpsjonsfraksjonen ble inndampet, og resten ble krystallisert fra 70% vandig etanol (eter tilsatt inntil turbiditet). Utbytte, 2,8 g (91%) 4-amino-l-[2-(fosfono-metoksy)etyl]pyirmidin-6(lH)-on, smp. 233 °C. For C7H12N3O5P (249,16) beregnet 33,74% C, 4,85% H, 16,86% N, 12,43% P; funnet 34,02% C, 4,80% H, 16,88% N, 12,58% P.<!>H NMR

(CD3SOCD3): 3,56 d, 2 H, J(CH2,P)=8,8 (CH2P); 3,641,2 H, J(2',l')=4,9 (H-2'); 3,901,2 H, J(l',2')=4,9 (H-l'); 5,06 s, 1 H (H-5); 6,45 brs, 2 H (NH2); 6,90 brs, 2 H (P-OH); 7,98 s, 1 H (H-2).<13>C NMR (CD3SOCD3): 44,44 (C-l').

Eksempel 6

2- amino- 4- dimetvlamino- 6-[ 2-( fosfonometoksv) etoksv1pyrimidin og 2- amino- 4- dimetylamino- 1 - r2-( fosfonometoksv) etvHpyrimidin- 6( 1 H)- on

2-amino-4-klor-6-hydroksypyrimidin-monohydrat (5,0 g) ble omrørt med 30% dimetylamin i etanol (180 ml) ved 100 °C i en autoklav i 16 timer. Det krystallinske produkt ble filtrert, vasket med vann, aceton, eter og tørket under vakuum, hvorved man fikk 2-amino-4-dimetylamino-6-hydroksypyrimidin som ikke smeltet under 300 °C. Utbytte, 4,3 g (81%). For C6H10N4O (154,17) beregnet 46,34% C, 6,54% H, 36,34% N; funnet 46,38% C, 6,65% H, 36,68% N.<!>H NMR (CD3SOCD3): 2,89 s, 6 H (N-CH3); 4,51 s, 1 H (H-5); 6,18 brs, 2 H (NH2); 9,75 brs, 1 H (OH).

Denne forbindelsen (4,0 g, 26 mmol) og cesiumkarbonat (4,22 g, 13 mmol) i DMF (60 ml) ble omrørt ved 100 °C i 1 time, og diisopropyl-2-kloretoksymetylfosfonat (8 ml) ble tilsatt. Blandingen ble omrørt ved 100 °C i 24 timer, filtrert mens den var varm og inndampet under vakuum. Resten ble ekstrahert med varm kloroform (100 ml), filtrert og renset ved hjelp av kromatografi på silikagelkolonne (200 ml). Eluering med kloroform ga 2-amino-4-dimetylamino-6-[2-(diisopropylfosfonylmetoksy)etoksy]pyrimidin som en tykk olje (4,6 g). Den ble behandlet med bromtrimetylsilan (5 ml) og acetonitril (50 ml) over natten ved romtemperatur. Etter inndamping under vakuum ble resten behandlet med vann (100 ml). Etter 10 minutter ble konsentrert, vandig ammoniakk tilsatt til alkalisk reaksjon, og blandingen ble inndampet. Resten ble avionisert på en kolonne (100 ml) av Dowex 50 X 8, og det UV-absorberende ammoniakkeluat ble inndampet til tørrhet. Dette produktet i vann (20 ml) ble gjort alkalisk ved hjelp av konsentrert, vandig ammoniakk og tilført på en kolonne (150 ml) Dowex 1X2 (acetatform) forvasket med vann. Eluering med vann etterfulgt av lineær gradient av eddiksyre (0-0,4 M, 1 1 hver) ga hoved-UV-absorpsjonsfraksjonen som ble inndampet, og resten ble samdestillert med vann (3 x 50 ml), og resten ble krystallisert fra vann. Utbytte, 1,1 g 2-amino-4-dimetylamino-6-[2-(fosfonometoksy)etoksy]pyrimidin, smp. 168 °C. For C9H17N4O5P (292,23) beregnet 36,99% C, 5,86% H, 19,17% N, 10,60% P; funnet 37,05% C, 5,80% H, 18,98% N, 10,51% P.<!>H NMR (DMSO): 6,69 bs, 2 H (NH2); 4,69 s, 1 H (H-5); 3,98 t, J=6,0 Hz, 2 H (2xH-10; 3,611, J=6,0 Hz, 2 H (2xH-2'); 3,59 d, 2 H, J(H,P)=8,3 Hz (P-CH2); 2,89 s, 6 H (N(CH3)2).<13>C NMR (DMSO): 162,37, 161,94 og 154,67 (C-2, C-4 og C-6); 75,79 (C-5); 69,82 d, J(C,P)=10,3 Hz (C-2'); 66,76 d, J(C,P)=158,7 Hz (P-CH2); -40,0 (C-l', overlappet med DMSO); 36,93 (N(CH3)2).

Videre eluering av silikagelkolonnen med kloroform-etanol-gradient ga 2-amino-4-dimetylamino-l-[2-(diisopropylfosfonylmetoksy)etyl]pyrimidin-6(lH)-on som en tykk olje (2,0

g) som ble behandlet med bromtrimetylsilan (5 ml) og acetonitril (50 ml) over natten og opparbeidet på lignende måte. Etter kromatografi med Dowex 1 ga produktet etter krystallisering

fra vann 2-amino-4-dimetylamino-l-[2-(fosfonometoksy)etyl]pyirmidin-6(lH)-on, smp. 235 °C. For C9H17N4O5P (292,23) beregnet 36,99% C, 5,86% H, 19,17% N, 10,60% P; funnet 37,15% C, 5,92% H, 19,28% N, 10,66% P.<!>H NMR (DMSO): 6,03 bs, 2 H (NH2); 5,20 s, 1 H (H-5); 4,26 m, 2 H (2xH-l'); 3,74 m, 2 H (2xH-2'); 3,58 d, 2 H, J(H,P)=8,8 Hz (P-CH2); 2,93 s, 6 H (N(CH3)2).<13>C NMR (DMSO): 169,93, 164,91 og 161,92 (C-2, C-4 og C-6); 75,02 (C-5); 70,89 d, J(C,P)=11,4 Hz (C-2'); 66,96 d, J(C,P)=160,7 Hz (P-CH2); 64,28 (C-l'); 36,95 (N(CH3)2).

Eksempel 7

2- amino- 4- svklopropvlamino- 6- r2-( fosfonometoksv) etoksvlpyrimidin og 2- amino- 4- syklo-propvlamino- l- r2-( fosfonometoksv) etvl1pvirmidin- 6( lHVon

2-amino-4-klor-6-hydroksypyrimidin-monohydrat (5,0 g) ble kokt under tilbake-løpskjøling i etanol (150 ml) med syklopropylamin i 12 timer. Blandingen ble inndampet under vakuum, samdestillert med etanol (3 x 50 ml), adsorbert fra metanol på silikagel og tilført på en kolonne av silikagel (200 ml) i kloroform. Eluering med kloroform-etanol-gradient ga krystallinsk produkt som ble filtrert fra eter og tørket under vakuum, hvorved man fikk 2-amino-4-syklopropylamino-6-hydroksypyrimidin, smp. 229 °C. Utbytte, 3,0 g. For C7H10N4O (166,18) beregnet 50,59% C, 6,07% H, 33,71% N; funnet 50,49% C, 6,25% H, 33,61% N.<!>H NMR (DMSO): 9,73 brs, 1 H (OH); 6,55 bs, 2 H (NH); 6,08 brs, 2 H (NH2); 4,66 s, 1 H (H-5); 2,30 m, 1 H og 0,62 m, 2 H og 0,40 m, 2 H (C-CH2, N-CH).

Blandingen av denne forbindelsen (3,0 g, 18 mmol) og cesiumkarbonat (2,92 g, 9 mmol) i DMF (50 ml) ble omrørt ved 100 °C i 1 time, og diisopropyl-2-kloretoksymetylfosfonat (6 ml) ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 100 °C i 24 timer, filtrert mens den var varm og inndampet under vakuum. Resten ble ekstrahert med varm kloroform (100 ml), filtrert, konsentrert under vakuum og renset ved hjelp av kromatografi på silikagelkolonne (2 x 200 ml). Eluering med kloroform ga 2-amino-4-syklopropylamino-6-[2-(diisopropylfosfonylmetoksy)- etoksy]pyrimidin som en tykk olje (1,8 g). Den ble behandlet med bromtrimetylsilan (5 ml) og acetonitril (50 ml) over natten ved romtemperatur. Etter inndamping under vakuum ble resten behandlet med vann (100 ml). Etter 10 minutter ble konsentrert, vandig ammoniakk tilsatt inntil alkalisk reaksjon og blandingen ble inndampet. Resten ble avionisert på en kolonne (100 ml) av Dowex 50 X 8, og det UV-absorberende ammoniakkeluat ble inndampet til tørrhet. Dette produktet i vann (20 ml) ble gjort alkalisk ved hjelp av konsentrert, vandig ammoniakk og tilført på en kolonne (150 ml) Dowex 1X2 (acetatform) forvasket med vann. Eluering med vann etterfulgt av lineær gradient av eddiksyre (0-0,4 M, 1 1 hver) ga hoved-UV-absorpsjonsfraksjonen som ble inndampet, og resten ble samdestillert med vann (3 x 50 ml), og resten ble krystallisert fra vann. Utbytte, 1,0 g 2-amino-4-syklopropylamino-6-[2-(fosfonometoksy)etoksy]pyrimidin, smp. 244 °C. For C10H17N4O5P (304,24) beregnet 39,48% C, 5,63% H, 18,42% N, 10,18% P; funnet 39,65% C, 5,70% H, 18,59% N, 10,11% P.<!>H NMR (D20 + NaOD): 0,54 m, 2 H og 0,80 m, 2 H (C-CH2); 2,53 m, 1 H (N-CH); 3,57 d, 2 H, J(CH2,P)=8,4 (CH2P); 3,91 m, 2 H (H-2'); 4,32 m, 2 H (H-l'); 5,61 s, 1 H (H-5).

Videre eluering av silikagelkolonnen med kloroform-etanol-gradient ga (etter krystallisasjon fra etanol-eter) gult 2-amino-4-syklopropylamino-l-[2-(diisopropylfosfonyl-metoksy)etyl]pyrimidin-6(lH)-on (1,6 g) som ble behandlet med bromtrimetylsilan (5 ml) og acetonitril (50 ml) over natten og opparbeidet på lignende måte. Etter kromatografi med Dowex 50 ble produktet eluert med vann og inndampet under vakuum. Resten ga etter krystallisering fra vann 2-amino-4-syklopropylamino-l-[2-(fosfonometoksy)etyl]pyrimidin-2-on, som ikke smeltet under 290 °C. Utbytte, 0,90 g. For C10H17N4O5P (304,24) beregnet 39,48% C, 5,63% H, 18,42% N, 10,18% P; funnet 39,70% C, 5,78% H, 18,69% N, 10,32% P.<13>C NMR (D20 + NaOD): 173,71,170,07 og 165,53 (C-2, C-4 og C-6); 78,75 (C-5); 73,31 d, J(C,P)=10,3 Hz (C-2'); 72,19 d, J(C,P)= 149,4 Hz (P-CH2); 69,14 (C-l'); 25,96 (N-CH); 9,43 (2xCH2 av syklopropyl).

Eksempel 8

2- amino- 4- metvl- 6- r2-( fosfonometoksv) etoksvlpyrimidin og 2- amino- 4- metyl- l-[ 2-( fosfonometoksv) etyl1pyrimidin- 6( 1 H)- on

Diisopropyl-2-kloretoksymetylfosfonat (15 ml, 62,5 mmol) ble tilsatt til en blanding av 2-amino-6-hydroksy-4-metylpyrimidin (6,25 g, 50 mmol) og cesiumkarbonat (11,3 g, 25 mmol) i DMF (70 ml) som før tilsetning var blitt omrørt ved 100 °C i 1 time. Reaksjonsblandingen ble så omrørt ved 100 °C i 14 timer, filtrert mens den var varm og inndampet under vakuum. Resten ga etter ekstraksjon med kloroform og etterfølgende rensing på silikagelkolonne (250 ml) 2-amino-4-metyl-6-[2-(diisopropylfosfonylmetoksy)etoksy]pyrimidin som ble krystallisert fra etylacetat-petroleter. Utbytte, 5,75 g, smp. 72-73 °C. For C14H26N3O5P (347,35) beregnet 48,41% C, 7,54% H, 12,10% N, 8,92% P; funnet 48,70% C, 7,60% H, 12,32% N, 9,14% P.<*>H NMR (CDC13): 5,95 q, 1 H, J=0,6 Hz, (H-5); 4,90 b, 2 H (NH2); 4,76 dh, 2 H, J(H,P)=7,6 Hz og J(H,H)=6,2 Hz (2xOCH (iPr)); 4,42 m, 2 H (2xH-l'); 3,90 m, 2 H (2xH-2'); 3,82 d, 2 H, J(H,P)=8,2 Hz (P-CH2); 2,26 d, 3 H, J=0,6 Hz (CH3); 1,34 d, 6 H, J=6,2 Hz og 1,33 d, 6 H, J=6,2 Hz (4xCH3(iPr)).<13>C NMR (CDC13): 170,36, 168,27 og 162,48 (C-2, C-4 og C-6); 97,03 (C-5); 71,17 d, J(C,P)=10,8 Hz (C-2'); 71,06 d, J(C,P)=6,8 Hz (OCH (iPr)); 65,99 d, J(C,P)=167,6 Hz (P-CH2); 64,60 (C-l'); 24,04 d, J(C,P)=3,9 Hz og 23,90 d, J(C,P)=4,9 Hz (4xCH3(iPr)); 23,61 (CH3).

Denne forbindelsen ble behandlet med bromtrimetylsilan (5 ml) i acetonitril (50 ml) ved romtemperatur over natten, og de flyktige stoffene ble avdampet under vakuum. Resten ble oppløst i vann (100 ml), konsentrert, vandig ammoniakk ble tilsatt inntil alkalisk reaksjon, og blandingen ble inndampet. Resten ble avionisert på en kolonne (100 ml) av Dowex 50 X 8, og det UV-absorberende ammoniakkeluat ble inndampet til tørrhet. Dette produktet i vann (20 ml) ble gjort alkalisk ved hjelp av konsentrert, vandig ammoniakk og tilført på en kolonne (150 ml) Dowex 1X2 (acetatform) forvasket med vann. Eluering med vann etterfulgt av lineær gradient av eddiksyre (0-0,4 M, 1 1 hver) ga hoved-UV-absorpsjonsfraksjonen som ble inndampet, og resten ble samdestillert med vann (3 x 50 ml), og resten ble krystallisert fra vann. Utbytte, 3,67 g 2-amino-4-metyl-6-[2-(fosfonometoksy)etoksy]pyrimidin, smp. 245 °C. For C8H14N3O5P (263,19) beregnet 36,51% C, 5,36% H, 15,97% N, 11,77% P; funnet 36,65% C, 5,60% H, 15,69% N, 11,92% P.<!>H NMR (D20 + NaOD): 6,13 s, 1 H (H-5); 4,39 m, 2 H (2xH-l'); 3,92 m, 2 H (2xH-2'); 3,57 d, 2 H, J(H,P)=8,5 Hz (P-CH2); 2,26 s, 3 H (CH3).<13>C NMR (D20 + NaOD): 173,63,172,80 og 165,50 (C-2, C-4 og C-6); 98,75 (C-5); 73,09 d, J(C,P)=10,2 Hz (C-2'); 72,06 d, J(C,P)=149,4 Hz (P-CH2); 68,85 (C-l'); 25,42 (CH3).

Videre eluering av silikagelkolonnen etterfulgt av krystallisering fra etylacetat-petroleter ga 2-amino-4-metyl-l-[2-(diisopropylfosfonylmetoksy)etyl]pyrimidin-6(lH)-on (4,2 g), smp. 88 °C. For Ci4H26N305P (347,35) beregnet 48,41% C, 7,54% H, 12,10% N, 8,92% P; funnet 48,49% C, 7,62% H, 12,30% N, 9,08% P.<!>H NMR (CDCI3): 5,79 q, 1 H, J=0,8 Hz (H-5);

5,62 b, 2 H (NH2); 4,72 dh, 2 H, J(H,P)=7,6 Hz og J(H,H)=6,2 Hz (2xOCH (iPr)); 4,20 m, 2 H (2xH-l'); 3,90 m, 2 H (2xH-2'); 3,74 d, 2 H, J(H,P)=8,6 Hz (P-CH2); 2,12 d, 3 H, J=0,8 Hz (CH3); I, 32 d, 6 H, J=6,2 Hz og 1,29 d, 6 H, J=6,2 Hz (4xCH3(iPR)).<13>C NMR (CDC13): 164,33, 162,93 og 156,37 (C-2, C-4 og C-6); 102,22 (C-5); 72,88 d, J(C,P)=11,7 Hz (C-2'); 71,27 d, J(C,P)=6,8 Hz (OCH (iPr)); 66,17 d, J(C,P)=168,1 Hz (P-CH2); 43,06 (C-l'); 23,97 d, J(C,P)=3,9 Hz og 23,91 d, J(C,P)=4,9 Hz (2xCH3(iPr)); 23,64 (CH3).

Dette produktet ble behandlet analogt med bromtrimetylsilan (5 ml) i acetonitril (50 ml), hvorved man etter kromatografi av den avioniserte reaksjonsblanding på Dowex 1X2 og krystallisering fra vann fikk 2-amino-4-metyl-l-[2-(fosfonometoksy)etyl]pyrimidin-6(lH)-on. Utbytte, 2,3 g, smp. 283 °C. For C8Hi4N305P (263,19) beregnet 36,51% C, 5,36% H, 15,97% N, II, 77% P; funnet 36,40% C, 5,23% H, 15,77% N, 12,00% P.<!>H NMR (D20 + NaOD): 5,77 s, 1 H (H-5); 4,18 t, 2 H, J=5,3 Hz (2xH-l'); 3,82 t, 2 H, J=5,3 Hz (2xH-2'); 3,50 d, 2 H, J(H,P)=8,7 Hz (P-CH2); 2,12 s, 3 H (CH3).<13>C NMR (D20 + NaOD): 169,48, 168,32 og 160,25 (C-2, C-4 og C-6); 102,40 (C-5); 73,17 (C-2'); 72,55 d, J(C,P)=142,0 Hz (P-CH2); 45,60 (C-l'); 25,43 (CH3).

Eksempel 9

4- amino- 2- metvlsulfanvl- 6-[ 2-(' fosfonometoksv) etoksvlpvrimidin

Dietyl-2-hydroksyetylfosfonat (5,3 g, 25 mmol) i DMF (40 ml) ble behandlet ved 0 °C med NaH (1,0 g, 60% dispersjon i paraffinolje) og etter 1 times omrøring ved 0 °C ble 4-amino-6-klor-2-metylsulfanylpyrimidin (3,5 g, 20 mmol) tilsatt i én porsjon. Blandingen ble omrørt i 16 timer ved 100 °C, inndampet til tørrhet under vakuum og ekstrahert med varm kloroform (300 ml). Ekstrakten ble inndampet under vakuum, og resten ble behandlet med bromtrimetylsilan (10 ml) i acetonitril (50 ml) ved romtemperatur over natten. Blandingen ble inndampet til tørrhet under vakuum, og resten ble avionisert på en kolonne (100 ml) av Dowex 50 X 8, og det UV-absorberende ammoniakkeluat ble inndampet til tørrhet. Dette produktet i vann (20 ml) ble oppløst ved tilsetning av konsentrert, vandig ammoniakk og surgjort ved hjelp av HC1 til pH 3-3,5. Utfellingen ble samlet opp, vasket med vann, etanol og tørket under vakuum. Utbytte, 0,8 g 4-amino-2-metylsulfanyl-6-[2-(fosfonometoksy)etoksy]pyrimidin, smp. 210-211 °C. For CgHnNaOsP (263,19) beregnet 32,54% C, 4,78% H, 14,23% N, 10,49% P, 10,86% S; funnet 32,42% C, 4,93% H, 14,07% N, 10,62% P, 11,04% S.<!>H NMR (D20): 5,68 s, 1 H (H-5); 4,36 m, 2 H (2xH-l'); 3,94 m, 2 H (2xH-2'); 3,72 d, 2 H, J(H,P)=8,5 Hz (P-CH2); 2,48 s, 3 H

(SCH3).<13>C NMR (D20): 173,70,172,13 og 167,93 (C-2, C-4 og C-6); 84,82 (C-5); 73,53 d, J(C,P)=10,7 Hz (C-2'); 70,01 d, J(C,P)=156,3 Hz (P-CH2); 69,20 (C-l'); 16,02 (SCH3).

Eksempel 10

2- amino- 4, 6- bis-[ 2-( fosfonometoksv) etoksvlpyrimidin og 2- amino- 4-[ 2-( fosfonometoksy)-etoksvl- 1 - r2-( fosfonometoksv) etyllpyrimidin- 6( 1 H)- on

2-amino-4,6-dihydroksypyrimidin (12,7 g, 0,1 mol) og cesiumkarbonat (27,8 g, 85 mmol) i DMF (200 ml) ble omrørt i 1 time ved 100 °C, og diisopropyl-2-kloretoksymetylfosfonat (30 ml) ble tilsatt. Blandingen ble omrørt i 16 timer ved 100 °C, filtrert mens den var varm og inndampet under vakuum. Resten ble renset ved hjelp av silikagelkromatografi (200 ml kolonne), hvorved man fikk 2,8 g av den oljeaktige rest som så ble behandlet med bromtrimetylsilan (7 ml) i acetonitril (50 ml) over natten. Resten ble oppløst i vann (100 ml), konsentrert, vandig ammoniakk ble tilsatt inntil alkalisk reaksjon, og blandingen ble inndampet. Resten ble avionisert på en kolonne (100 ml) av Dowex 50 X 8, og det UV-absorberende ammoniakkeluat ble inndampet til tørrhet. Dette produktet ble samdestillert med etanol og filtrert fra etanol. Utbytte, 1,4 g 2-amino-4,6-bis-[2-(fosfonometoksy)etoksy]pyrimidin, smp. 127 °C. For CioHi9N30ioP2(403,22) beregnet 29,79% C, 4,75% H, 10,42% N, 15,36% P; funnet 29,90% C, 4,87% H,

10,24% N, 15,64% P.<*>H NMR (DMSO): 6,55 b, 2 H (NH2); 5,36 s, 1 H (H-5); 4,29 m, 2 H (2xH-l'); 3,76 m, 2 H (2xH-2'); 3,58 d, 2 H, J(H,P)=8,6 Hz (P-CH2).<13>C NMR (DMSO): 171,30 (C-4, C-6), 162,76 (C-2); 78,60 (C-5); 70,70 d, J(C,P)=11,7 Hz (C-2'); 66,86 d, J(C,P)=160,2 Hz (P-CH2); 64,81 (C-l').

Videre eluering av silikagelkolonnen ga tykk olje (4,8 g) som ble behandlet med bromtrimetylsilan (10 ml) i acetonitril (70 ml) over natten og inndampet under vakuum. Resten ble sendt gjennom Dowex 50 X 8-kolonne (H+<->form) (150 ml), og kolonnen ble eluert med vann. Etter utvasking av de uorganiske syrer eluerte produktet med retensjon. Dets fraksjon ble inndampet og resten omrørt med etanol-aceton-blanding (1:1,100 ml). Det gulaktige produkt ble filtrert, vasket med eter og tørket. Utbytte, 1,8 g 2-amino-4-[2-(fosfonometoksy)etoksy]-l-[2-(fosfonometoksy)etyl]pyrimidin-6(lH)-on, smp. 108 °C. For CioHi9N30ioP2(403,22) beregnet 29,79 % C, 4,75 % H, 10,42 % N, 15,36 % P; funnet 29,90 % C, 4,87 % H, 10,24 % N,

15,64 % P.

Eksempel 11

( a) 2, 4- diamino- 6-[ 2-( fosfonometoksv) etoksvlpyrimidin

Natriumhydrid (60% suspensjon i paraffinolje) (2,4 g, 60 mmol) ble forsiktig tilsatt porsjonsvis til redestillert etylenglykol (50 ml) og utelukkelse av fuktighet inntil oppløsning. 2,4-diamino-6-klorpyrimidin (2,89 g, 20 mmol) ble så tilsatt i én porsjon, og blandingen ble omrørt i 6 timer ved 80 °C. Reaksjonsblandingen ble avkjølt, fortynnet med vann (200 ml) og sendt gjennom en kolonne (200 ml) av Dowex 50 X 8 i syresyklus. Kolonnen ble vasket med vann (1 1), og harpiksen ble oppslemmet i vann (300 ml). Denne suspensjon ble gjort alkalisk med konsentrert, vandig ammoniakk, filtrert og harpiksen vasket med kokende vann (11). De kombinerte filtrater ble inndampet til tørrhet, og resten ble krystallisert fra vann, hvorved man fikk 2,4-diamino-6-(2-hydroksyetoksy)pyrimidin, smp. 190 °C. Utbytte, 2,3 g (79,4 %). For C6Hi0N4O2(170,18) beregnet 42,34% C, 5,92% H, 30,37% N; funnet 42,09% C, 5,89 % H, 30,63% N. Massespektrum: 171,3 (MH<+>).<*>H NMR (CD3SOCD3): 3,67 br q, 2 H, J(CH2CH2)~/(CH2,OH)=4,8 (0-CH2); 4,101, 2 H, J(CH2,CH2)=5,0 (0-CH2); 4,79 t, 1 H, J(OH,CH2)=4,5 (OH); 5,05 s, 1 H (H-5); 5,89 br s, 2 H og 6,01 br s, 2 H (NH2).

Denne forbindelsen (4,25 g, 25 mmol) og diisopropyl-p-toluensulfonyloksymetylfosfonat (8,75 g, 25 mmol) i DMF (50 ml) ble behandlet med 60% NaH (3,5 g, 3,5 ekvivalenter). Blandingen ble omrørt ved omgivende temperatur i 3 dager, og eddiksyre (4 ml) ble tilsatt dråpevis. Oppløsningsmidlet ble strippet av under vakuum og resten ekstrahert med kloroform. Reaksjonsproduktet ble renset ved hjelp av silikagelkolonnekromatografi, hvorved man etter krystallisering fra etylacetat-petroleter fikk 2,4-diamino-6-[2-(diisopropylfosfonylmetoksy)etoksy]pyrimidin, smp. 159 °C. Utbytte, 6,45 g (74%). For Ci3H25N405P (348,3) beregnet 44,83% C, 7,23% H, 16,08% N, 8,89% P; funnet 44,86% C, 7,15% H, 16,21% N, 9,05% P. Massespektrum: 349,3 (MH<+>).<!>H NMR-spektrum (CD3SOCD3) er identisk med det som er beskrevet i eksempel 1.

Omdannelse av denne forbindelsen til 2,4-diamino-6-[2-(fosfonometoksy)etoksy]pyrimidin ble utført hovedsakelig som beskrevet i eksempel 1 og ga forbindelse som er identisk med dette autentiske materiale ifølge NMR- og massespektra.

( b) 2, 4- diamino- 6-[ 2-( fosfonometoksv) etoksvlpyrimidin

Reaksjonen ble utført hovedsakelig som beskrevet under (a), bortsett fra at NaH ble erstattet med den samme molare mengde av kalium-tert.-butoksid. Utbytte av 2,4-diamino-6-(2-hydroksyetoksy)pyrimidin var 81 %. Videre fremgangsmåte forble uendret.

Eksempel 12

( a) 2, 4- diamino- 6-[( RSV3- hydroksv- 2-(' fosfonometoksv) propoksvlpvrimidin

4-hydroksymetyl-2,2-dimetyl-l,3-dioksolan (13,2 g, 0,1 mol) i nylig redestillert tetrahydrofuran (100 ml) ble tilsatt dråpevis i en suspensjon av NaH (0,2 mol) i tetrahydrofuran (400 ml). Blandingen ble omrørt inntil oppløsning, og 2,4-diamino-6-klorpyrimidin (14,46 g, 0,1 mol) ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble kokt under tilbakeløpskjøling under omrøring i en argonatmosfære i 12 timer og nøytralisert med eddiksyre. Oppslemmingen ble filtrert, vasket med tetrahydrofuran og filtratet inndampet til tørrhet under vakuum. Rensing på en silikagelkolonne (300 ml) i kloroform ga etter krystallisering fra etylacetat-petroleter, 2,4-diamino-6-[2,2-dimetyl-l,3-dioksolanyl-4-metoksy]pyrimidin, smp. 128 °C. Utbytte, 16,0 g (66,6%). For C10H16N4O3(240,3) beregnet 49,99% C, 6,71% H, 23,32% N; funnet 49,95% C, 6,84% H, 23,05% N. Massespektrum: 241,3 (MH<+>).<!>H NMR (CD3SOCD3): 1,27 s, 3 H og 1,33 s, 3 H (CH3); 3,68 dd, 1 H, J(3'b,2')=6,2, J(gem)=8,3 (H-3'b); 4,02 dd, 1 H, J(3'a,2')=6,6, J(gem)=8,3 (H-3'a); 4,19 m, 2

H (H-1'a); 4,10 dd, 1 H, J(l'b,2')=6,0, J(gem)=l 1,0 (H-1'b); 4,13 dd, 1 H, J(l'a,2')=5,0, J(gem)=l 1,0 (H-1'a); 4,30 m, 1 H (H-2'); 5,06 s, 1 H (H-5); 5,94 br s, 2 H og 6,06 br s, 2 H (NH2).<13>C NMR (CD3SOCD3): 25,75 og 26,94 (CH3); 65,72 (C-3'); 66,22 (C-l'); 74,00 (C-2'); 76,58 (C-5); 109,06 (CiPr); 163,23 og 166,38 og 170,11 (C-6, C-2, C-4).

Denne forbindelsen (14,4 g, 60 mmol) i 0,25 M H2S04(250 ml) fikk stå over natten ved romtemperatur. Blandingen ble nøytralisert med mettet bariumhydroksidoppløsning, filtrert og filtratet inndampet til tørrhet. Resten ga etter rekrystallisering fra 90% etanol (eter tilsatt inntil turbiditet) 2,4-diamino-6-(2,3-dihydroksypropoksy)pyrimidin, smp. 160 °C. Utbytte, 10,0 g (83,3%). For C7Hi2N403(200,2) beregnet 42,00% C, 6,04% H, 27,99% N; funnet 41,84% C, 6,24% H, 28,06% N. Massespektrum: 201,2 (MH<+>),<!>H NMR (CD3SOCD3): 3,40 d, 2 H, J(3',2')=5,4 (H-3'); 3,72 m, 1 H (H-2'); 4,01 dd, 1 H, J(l'b,2')=6,2, J(gem)=10,9 (H-1'b); 4,10 dd, 1 H, J(l'a,2')=4,4, J(gem)=10,9 (H-1'a); 4,73 br s, 1 H og 5,02 br s, 1 H (OH); 5,09 s, 1 H (H-5); 5,99 br s, 2 H og 6,07 br s, 2 H (NH2).<13>C NMR (CD3SOCD3): 63,14 (C-3'); 67,16 (C-l'); 70,28 (C-2'); 76,64 (C-5); 163,19 og 166,27 (C-2, C-4); 170,62 (C-6).

Blandingen av denne forbindelsen (8,0 g, 40 mmol), tritylklorid (36,4 g, 131 mmol) og 4-dimetylaminopyridin (2 g) i pyridin (160 ml) ble omrørt i 15 timer ved 50 °C og helt sakte under omrøring til vann (2 1). Oppslemmingen ble omrørt i 1 time, dekantert, og etter omrøring med en ny porsjon vann (2 1) ble den filtrert og vasket med vann. Utfellingen ble tatt opp i kloroform (600 ml), tørket med MgS04, inndampet og samdestillert med toluen (3 x 100 ml porsjoner) under vakuum. Den resulterende gummi ble oppløst i minimalt volum eter og dryppet under kraftig omrøring til petroleter (11). Utfellingen ble filtrert, vasket med petroleter og tørket. Utbytte, 33,4 g (91,5%) 6-[2-hydroksy-3-(trityloksy)propoksy]-2,4-bis(tritylamino)pyrimidin, smp. 138 °C. For C64H54N402(911,1) beregnet 6,15% N; funnet 5,96% N. Dette tritylderivatet (27,3 g, 30 mmol) og diisopropyl-p-toluensulfonyloksymetylfosfonat (15,75 g, 45 mmol) i tetrahydrofuran (300 ml) ble behandlet med 60% NaH (5,4 g, 3,5 ekvivalenter). Blandingen ble omrørt ved omgivelsestemperatur i 3 dager og nøytralisert i eddiksyre. Oppløsningsmidlet ble strippet av under vakuum, resten oppløst i etylacetat (800 ml) og ekstrahert med vann (3 x 200 ml). Den organiske fase ble inndampet til tørrhet og resten kokt under tilbakeløpskjøling i 80% vandig eddiksyre (300 ml) i 30 minutter, avkjølt og inndampet under vakuum. Vann (300 ml) ble tilsatt og blandingen ekstrahert med eter (4 x 100 ml). Vannfasen ble befridd for flyktige stoffer under vakuum og tilført på en Dowex 50 X 8-kolonne (200 ml) i syreform. Kolonnen ble vasket med vann inntil fallet i surhet og UV-absorbans og så eluert med 2,5% vandig ammoniakk. Det UV-absorberende ammoniakkeluat ble samlet opp, inndampet til tørrhet under vakuum, resten ble samdestillert med etanol (3 x 100 ml) og tørket over P2Osunder vakuum over natten. Acetonitril (100 ml) og bromtrimetylsilan (30 ml) ble tilsatt, og blandingen fikk stå over natten under utelukkelse av fuktighet. Etter fordamping av de flyktige stoffene under vakuum ble vann (200 ml) tilsatt til resten, etterfulgt av konsentrert, vandig ammoniakk inntil en alkalisk reaksjon. Denne oppløsningen ble inndampet til tørrhet og resten avionisert på en Dowex 50 X 8-kolonne (200 ml) under i det vesentlige de samme betingelsene. Det UV-absorberende ammoniakkeluat ble tatt ned under vakuum, resten ble oppløst i minimalt vann og gjort alkalisk til pH 10 ved hjelp av ammoniakk. Denne oppløsning ble tilført på en kolonne (200 ml) Dowex 1X2 (acetatform) forvasket med vann. Kolonnen ble vasket med vann inntil fallet i UV-absorbans for eluatet og så med lineær gradient av eddiksyre (0-0,3 M, 1,5 1 hver). Hoved-UV-absorpsjonsfraksjonen ble samlet opp, inndampet under vakuum og resten samdestillert med vann (2 x 100 ml). Krystallisering av resten fra vann ga 2,4-diamino-6-[(RS)-3-hydroksy-2-(fosfonometoksy)-propoksy]pyrimidin som monohydrat. Utbytte, 3,8 g (40,6%), hvite nåler, smp. 213 °C. For C8H15N4O6P.H2O (312,2) beregnet 30,78% C, 5,49% H, 17,94% N, 9,92% P; funnet 30,98% C, 5,52% H, 17,99% N, 9,82% P. Massespektrum: 295,0 (MH<+>).<!>H NMR (D20 + NaOD): 3,48 dd, 1 H, J(P,CHb)=9,8, J(gem)=12,l (P-CHb); 3,59 dd, 1 H, J(P,CHa)=8,9, J(gem)=12,l (P-CHa), 3,61 dd, 1 H, J(3'b,2')=6,8, J(gem)=12,9 (H-3'b); 3,70 m, 1 H (H-2'); 3,71 dd, 1 H, J(3'a,2')=3,6, J(gem)=12,9 (H-3'a); 4,11 dd, 1 H, J(l'b,2')=5,0, J(gem)=10,7 (H-1'b); 4,14 dd, 1 H, J(l'a,2')=4,6, J(gem)=10,7 (H-1'a); 5,36 s, 1 H (H-5);<13>C NMR (D20 + NaOD): 60,62 (C-3'); 65,58 (C-l'); 68,03 d,J(P,C)= 149,4 (P-C); 76,63 (C-5); 79,89 d, J(P,C)=10,7 (C-2'); 162,63 og 166,54 (C-2, C-4); 170,78 (C-6).

( b) 2, 4- diamino- 6-[( S)- 3- hvdroksv- 2-( fosfonometoksv) propoksvlpyrimidin

(S)-2,2-dimetyl-4-hydroksymetyl-l,3-dioksolan (40 g, 0,3 mol) nylig fremstilt fra l,2:5,6-diisopropyliden-D-mannitol og destillert under vakuum og ble tilsatt dråpevis til en suspensjon av NaH (0,3 mol) i tetrahydrofuran (600 ml). Blandingen ble omrørt i 30 minutter, og 2,4-diamino-6-klorpyrimidin (36,2 g, 0,25 mol) ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble kokt under tilbakeløpskjøling og omrøring i en argonatmosfære i 12 timer og nøytralisert med eddiksyre. Oppslemmingen ble filtrert, vasket med tetrahydrofuran og filtratet inndampet til tørrhet under vakuum. Rensing på en silikagelkolonne (600 ml) i kloroform ga etter krystallisering fra etylacetat-petroleter, 2,4-diamino-6-(S)-(2,2-dimetyl-1,3-dioksolan-4-ylmetoksy)pyrimidin. Utbytte, 46,0 g (76,6%). Denne forbindelsen (43,3 g, 0,18 mol) i 0,25 M H2S04(800 ml) fikk stå over natten ved romtemperatur. Blandingen ble nøytralisert ved hjelp av mettet bariumhydroksid-oppløsning, filtrert og filtratet inndampet til tørrhet. Resten ga etter rekrystallisering fra 90% etanol (eter tilsatt inntil turbiditet) 2,4-diamino-6-(S)-(2,3-dihydroksypropoksy)pyrimidin, smp. 149 °C. Utbytte, 32,0 g (89%). For C7Hi2N403(200,2) beregnet 42,00% C, 6,04% H, 27,99% N; funnet 41,94% C, 6,35% H, 27,75% N. Massespektrum: 201,2 (MH<+>). NMR-spektra var identiske med de for den racemiske forbindelse.

Blandingen av denne forbindelsen (32,0 g, 0,16 mmol), tritylklorid (140 g, 0,5 mmol) og 4-dimetylaminopyridin (3 g) i pyridin (500 ml) ble omrørt i 24 timer ved 80 °C og helt sakte over i vann (5 1) under omrøring. Oppslemmingen ble omrørt i 1 time, dekantert, og etter omrøring med ny porsjon vann (2 1) ble den filtrert og vasket med vann. Utfellingen ble tatt opp i kloroform (2 1), tørket med MgS04, inndampet og samdestillert med toluen (3 x 200 ml porsjoner) under vakuum. Den resulterende gummi ble oppløst i minimalt volum eter og dryppet under kraftig omrøring til petroleter (2,5 1). Utfellingen ble filtrert, vasket med petroleter og lufttørket over natten. Tørking under vakuum ga 99,5 g (69%) 6-(S)-[2-hydroksy-3-(trityloksy)-propoksy]-2,4-bis(tritylamino)pyrimidin. For C64H54N4O2(911,1) beregnet 6,15% N; funnet 5,96% N. Dette tritylderivatet (99,5 g, 0,11 mol) og diisopropyl-p-toluensulfonyloksymetylfosfonat (42 g, 0,12 mol) i nytørket tetrahydrofuran (600 ml) ble behandlet med 60% NaH (14,4 g, 0,36 mol). Blandingen ble omrørt ved omgivelsestemperatur i 3 dager, filtrert over celite-pute, og filtratet ble behandlet med etanol (20 ml). Oppløsningsmidlet ble strippet av under vakuum, resten kokt under tilbakeløpskjøling i 80% vandig eddiksyre (500 ml) i 30 minutter og fikk stå over natten ved romtemperatur. Det krystallinske produkt ble filtrert, vasket med 80% eddiksyre, og filtratet ble inndampet under vakuum. Vann (700 ml) ble tilsatt, og blandingen ble ekstrahert med eter (4 x 200 ml). Vannfasen ble konsentrert under vakuum og tilført på en Dowex 50 X 8-kolonne (250 ml) i syreform. Kolonnen ble vasket med 20% vandig metanol inntil fallet i surhet og UV-absorbans, og så eluert med 2,5% ammoniakk i 20% vandig metanol. Det UV-absorberende ammoniakkeluat ble samlet opp, inndampet til tørrhet under vakuum, resten samdestillert med etanol (3 x 100 ml) og tørket over P2O5under vakuum over natten. Acetonitril (200 ml) og bromtrimetylsilan (50 ml) ble tilsatt, og blandingen fikk stå over natten under utelukkelse av fuktighet. Etter avdamping av de flyktige stoffene under vakuum ble vann (300 ml) tilsatt til resten, etterfulgt av konsentrert, vandig ammoniakk inntil alkalisk reaksjon. Denne oppløsningen ble inndampet til tørrhet og resten avionisert på en Dowex 50 X 8-kolonne (250 ml) under identiske betingelser. Det UV-absorberende ammoniakkeluat ble tatt ned under vakuum, resten ble oppløst i minimal mengde vann og gjort alkalisk til pH 10 med ammoniakk. Denne oppløsningen ble tilført på en kolonne (250 ml) Dowex 1X2 (acetatform) forvasket med vann. Kolonnen ble vasket med vann inntil fallet i UV-absorbans for eluatet, og så med lineær gradient av eddiksyre (0-0,3 M, 2 1 hver). Hoved-UV-absorpsjonsfraksjonen ble inndampet under vakuum, og resten ble samdestillert med vann (2 x 100 ml). Rekrystallisering fra vann ga 2,4-diamino-6-(S)-[3-hydroksy-2-(fosfonometoksy)propoksy]pyrimidin som et monohydrat. Utbytte, 13,8 g (40%), hvite nåler, smp. For C8H15N4O6P.H2O (312,2) beregnet 30,78% C, 5,49% H, 17,94% N, 9,92% P; funnet 31,00% C, 5,70% H, 17,79% N, 9,75% P. Massespektrum: 295,0 (MH<+>). NMR-spektra var identiske med de til den racemiske forbindelse.

Eksempel 13

2- amino- 4- hvdroksv- 6-[ 2-( fosfonometoksv) etoksv1pyrimidin

4-hydroksymetyl-2,2-dimetyl-l,3-dioksolan (15 ml, 0,12 mol) ble tilsatt dråpevis i løpet av 30 minutter til en omrørt suspensjon av NaH (60% dispersjon i paraffinolje, 4,8 g, 0,12 mol) i tetrahydrofuran (250 ml). Etter 1 times omrøring ved romtemperatur ble 2-amino-4,6-diklorpyrimidin (16,4 g, 0,1 mol) tilsatt og blandingen holdt ved reflukstemperatur inntil utgangsmaterialet i det vesentlige var forsvunnet (TLC på silikagelplater; system metanol-kloroform, 1:9). Blandingen ble avkjølt, nøytralisert ved tilsetning av eddiksyre, filtrert over celite, vasket med tetrahydrofuran og inndampet under vakuum. Resten ble dekantert to ganger med eter (100

ml hver gang), oppløst i kloroform (100 ml) og filtrert gjennom en kort silikagelkolonne (vasking med 11 kloroform). Filtratet ble inndampet under vakuum, og resten ble oppløst i varmt etylacetat; et likt volum eter ble forsiktig tilsatt til den varme oppløsning, etterfulgt av petroleter inntil turbiditet. Produktet som krystalliserte i et kjøleskap, ble samlet opp ved filtrering, vasket med eter/petroleter-blanding (1:1) og tørket under vakuum. Utbytte, 20,5 g (79%) 2-amino-4-klor-6-[2,2-dimetyl-l,3-dioksolan-4-ylmetoksy]pyrimidin, smp. 152 °C. For C10H14CIN3O3(259,7) beregnet 46,25% C, 5,43% H, 13,65% Cl, 16,18% N; funnet 46,45% C, 5,46% H, 13,90% Cl, 15,95% N.<!>H NMR (CD3SOCD3): 1,28 s, 3 H og 1,33 s, 3 H (CH3); 3,71 dd, 1 H, J(3'b,2')=6,l, J(gem)=8,4 (H-3'b); 4,05 dd, 1 H, J(3'a,2')=6,6, J(gem)=8,4 (H-3'a); 4,22 dd, 1 H, J(l'b,2')=6,3, J(gem)=ll,2 (H-ITj); 4,28 dd, 1 H, J(l'a,2')=4,5, J(gem)=l 1,2 (H-1'a); 4,35 m, 1 H (H-2'); 6,10 s, 1 H (H-5); 7,08 br s, 2 H (NH2).<13>C NMR (CD3SOCD3): 25,48 og 26,76 (CH3); 65,82 og 66,84 (C-l',C-3'); 73,35 (C-2'); 94,48 (C-5); 109,05 (CiPr); 160,21 (C-2); 162,95 (C-4); 170,48 (C-6).

Blandingen av denne forbindelsen (13 g, 50 mmol), DABCO (12 g) og K2C03(21,5 g) i vann (300 ml) ble omrørt i 3 timer ved reflukstemperatur. Etter avkjøling til romtemperatur ble Dowex 50 X 8 (syreform) tilsatt porsjons vis under omrøring til pH~6, for å dekomponere karbonatet og nøytralisere DABCO. Suspensjonen ble så gjort svakt alkalisk ved tilsetning av konsentrert, vandig ammoniakk, filtrert, vasket med vann, og filtratet ble inndampet under vakuum. Harpiksen ble på nytt oppslemmet i fortynnet (1:20) vandig ammoniakk (300 ml), filtrert og harpiksen deretter vasket med kokende vann (4 x 200 ml). Filtratet og vaske-oppløsningene ble inndampet under vakuum. Begge restene ble tørket ved samdestillering med etanol og ekstrahert med kloroform. Det halvkrystallinske, faste stoff ble filtrert, vasket med kloroform og adsorbert fra metanolisk oppløsning på silikagel (50 ml). Dette materiale ble tilført på en kort kolonne (150 ml) i kloroform, og produktet ble eluert med kloroform-metanol-blanding (9:1). Krystallisering fra etanol (eter tilsatt inntil turbiditet) ga 2-amino-4-hydroksy-6-[(2,2-dimetyl-l,3-dioksolan-4-yl)metoksy]pyrimidin, smp. 258 °C. Utbytte, 8,2 g (68%). For CioH15N304(241,2) beregnet 46,25% C, 5,43% H, 13,65% Cl, 16,18% N; funnet 46,45% C, 5,46% H, 13,90% Cl, 15,95% N. Massespektrum: 242 (M+H).<*>H NMR (CD3SOCD3): 1,27 s, 3 H og 1,32 s, 3 H (CH3); 3,67 dd, 1 H, J(3'b,2')=6,2, J(gem)=8,4 (H-3'b); 4,02 dd, 1 H, J(3'a,2')=6,6, J(gem)=8,4 (H-3'a); 4,05 dd, 1 H, J( 1 'b,2')=6,1, J(gem)= 11,0 (H-1T>); 4,10 dd, 1 H, J(l'a,2')=4,6, J(gem)=ll,0 (H-1'a); 4,30 qd, 1 H, J(l'a,2')=4,6, J(2',r)~J(2',3')=6,3 (H-2'); 4,78 s, 1 H (H-5); 6,67 br s, 2 H (NH2), 10,47 br s, 1 H (NH).<13>C NMR (CD3SOCD3): 25,54 og 26,78 (CH3); 65,83 (C-3'); 66,70 (C-l',); 73,63 (C-2'); 79,99 (C-5); 108,94 (CiPr); 164,25 og 155,69 (C-2, C-6).

Eksempel 14

2- amino- 6- r2-( diisopropvlfosfonvlmetoksv) etoksv1- 4- hydroksvpvrimidin

En blanding av 2-amino-4-klor-6-[2-(diisopropylfosfonylmetoksy)etoksy]-pyrimidin (5,7 g), DABCO (3,6 g) og K2C03(9,0 g) i vann (100 ml) ble kokt under tilbake- løpskjøling i 150 minutter under omrøring, avkjølt og surgjort ved tilsetning av Dowex 50 X 8 (H+<->form). Suspensjonen ble gjort alkalisk med konsentrert, vandig ammoniakk og filtrert etter 5 minutters omrøring, og harpiksen ble vasket med 50% vandig metanol (200 ml). Filtratet ble inndampet til tørrhet, etanol (50 ml) ble tilsatt og blandingen inndampet til tørrhet. Resten ga etter kromatografi på silikagelkolonne (150 ml) med kloroform-etanol-gradient krystallinsk 2-amino-6-[2-(diisopropylfosfonylmetoksy)etoksy]-4-hydroksypyrimidin, smp. 154 °C i 78% utbytte. For C13H24N3O6P (349,3) beregnet 44,70% C, 6,92% H, 12,03% N, 8,37% P; funnet 44,58% C, 7,02% H, 11,95% N, 8,53% P.<!>H NMR (CD3SOCD3): 1,24 d, 6 H og 1,23 d, 6 H, J(CH3,CH)=6,2 (4xCH3); 3,74 m, 2 H (H-2'); 3,76 d, J(CH2-P)=8,3 (CH2-P); 4,19 m, 2 H (H-l'); 4,59 m, 2 H (P-OCH); 4,75 s, 1 H (H-5); 6,65 bs, 2 H, 2 H (NH2); 10,45 s, 1 H (OH).<13>C NMR (CD3SOCD3): 23,87 d, 2C, J(CH3,P)=4,9 og 24,01 d, 2C, J(P,C)=3,9 (CH3); 65,03 d, J(P,C)=164,6 (P-C); 65,04 (C-l'); 70,37 d, 2C, J(P,C)=6,3 (P-OC); 70,87 d, J(P,C)=11,7 (C-2'); 79,95 (C-5); 155,68 (C-4); 164,25 (C-2); 171,01 (C-6).

Dette produktet ble behandlet med bromtrimetylsilan (10 ml) i acetonitril (80 ml) over natten, inndampet under vakuum og resten behandlet med vann (50 ml). Etter 10 minutter ble konsentrert, vandig ammoniakk tilsatt inntil alkalisk reaksjon, og blandingen ble inndampet. Resten ble avionisert på en kolonne (100 ml) av Dowex 50 X 8, og det UV-absorberende ammoniakkeluat ble inndampet til tørrhet. Det ble oppløst i minimalt varmt vann ved tilsetning av konsentrert, vandig ammoniakk og surgjort ved hjelp av konsentrert HC1 inntil pH 3-3,5. Utfellingen ble samlet opp, vasket med vann, etanol og tørket under vakuum, hvorved man fikk 2-amino-6-[2-(diisopropylfosfonylmetoksy)etoksy]-4-hydroksypyrimidin. Utbytte, 0,7 g, smp. 227 °C. For C7H12N306P (265,16) beregnet 31,71% C, 4,56% H, 15,85% N, 11,68% P; funnet 31,55% C, 4,62% H, 16,15% N, 11,51% P.

Eksempel 15

2, 4- diamino- 5- brom- 6- r2-( fosfonometoksv) etoksv1pvrirnidin

2,4-diamino-6-[2-(diisopropylfosfonylmetoksy)etoksy]pyrimidin (4,3 g, 12,3 mmol) i DMF (40 ml) ble omrørt med bromoppløsning i CCU (0,3 M, 50 ml) i 3 timer ved omgivelsestemperatur, gjort alkalisk med trietylamin og inndampet. Råproduktet ble renset på silikagelkolonne (150 ml) i systemet kloroform-etanol og krystallisert fra etylacetat-petroleter. Utbytte, 3,9 g (11,9 mmol) av diesteren som ble behandlet med bromtrimetylsilan (20 ml) i acetonitril (50 ml) over natten, inndampet under vakuum og dekomponert ved hjelp av ammoniakk-vann. Etter avionisering på Dowex 50 (100 ml kolonne) ble resten av ammoniakk-eluatet renset ved kromatografi med Dowex 1 X 2-kolonne (100 ml) med en gradient av eddiksyre (0-0,5 M, 11 hver). Hovedfraksjonen ble inndampet og krystallisert fra vann, hvorved man fikk 3,1 g (84%) av tittelforbindelsen, smp. 218 °C. For C7Hi2BrN405P (343,07) beregnet 24,51% C, 3,53% H, 23,29% Br, 16,33% N, 9,03% P; funnet 24,56% C, 3,55% H, 23,51% Br, 16,07% N, 8,89% P.

Denne omsetningen ble gjentatt med 2-amino-6-[2-(diisopropylfosfonylmetoksy)-etoksy]-4-hydroksypyrimidin, hvorved man fikk 5-halogenanalogen.

Eksempel 16

De antivirale aktivitetene til forbindelser som her er omtalt, ble bestemt i overensstemmelse med de generelle fremgangsmåter som er beskrevet i J. Balzarini et al. "9-(2-phos-phonylmethoxyethyl)adenine (PMEA) effectively inhibits retrovirus replication in vitro and simian immunodeficiency virus infection in rhesus monkeys" AIDS 5:21-28,1991, og J. Balzarini et al. "Differential antiherpesvirus and antiretrovirus effects of the (S) and (R) enantiomers of acyclic nucleoside phosphonates: potent and selective in vitro and in vivo antiretrovirus activities of (R)-9-(2-phosphonomethoxypropyl)-2,6-diaminopurine" Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 37:332-338, 1993.

Resultatene er vist i tabell la hvor høyere styrke er angitt ved hjelp av lavere absolutte verdier.

Eksempel 17

Virus. Opprinnelsene til MSV, HIV-type 1 (HIV-1) (stamme IIIB og Ba-L), HIV-2 (stamme ROD) og FIV (stamme Petaluma) er blitt beskrevet tidligere (Balzarini et al., AIDS 5:21-28,1991; De Clercq et al., Proe. Soc. Exp. Biol. Med. 137:590-594,1971; Egberink et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 87:3087-3091,1990; Hartmann et al., Antiviral Chem. Chemother. 5:13-19, 1994; Popovic et al., Science 224:497-500,1984). HIV-1 (III»)- og HIV-2 (ROD)-forråd ble erholdt fra supernatanter fra virusinfiserte MT-4-cellekulturer. HIV-Ibbl ble formert i human, primær-M/M, hvis supernatanter ble samlet opp, filtrert og lagret ved -80 °C før bruk. Karakteristika for virusforråd brukt til denne studien, var 2,1 x 10<8>HIV-RNA-genomer/ml (som tilsvarer 35 ng p24-antigen) og 5 000 vevskulturinfeksiøse doser 50% pr. ml (TCID5o/ml) som fastlagt ved hjelp av virustitrering i andre primære M/M-kulturer. Isoleringen og karakteriseringen av de kliniske HIV-1-isolatene LIS, L6S og L6S/PMEA er blitt rapportert (Thormar et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 93:3283-3287, 1995; Van Laethem et al., AIDS 15:553-561,2001). Det kliniske HIV-l/LlS-isolat ble utvunnet fra en pasient som ikke var behandlet med NRTI-er (nukleosid reverstranskriptaseinhibitorer) eller ANP-er, og dyrket uten selektive trekk av eventuelle legemidler. Det inneholdt derfor ingen åpenbare mutasjoner som er karakteristiske for NRTI- eller ANP-behandlede pasienter. HIV-1/L6S er et klinisk isolat fra et legemiddelbehandlet individid dyrket uten det selektive trykk av eventuelle legemidler. Slik det er karakteristisk for NRTI-behandlede pasienter, inneholdt det S68G-, K70T-, V75I-, F77L-, Fl 16Y- og Q151M-mutasjoner i sitt RT. HIV-1 /L6S/PMEA er det kliniske isolat HIV-1/L6S som er blitt isolert etter dyrking av viruset i 11 passeringer i nærvær av økende konsentrasjoner av PMEA (adefovir). I tillegg til mutasjonene nevnt for HIV-1/L6S, oppnådde det også den PMEA-karakteristiske K65R-mutasjon i sin reverstranskriptase (RT).

Radioaktive kjemikalier. [Me(y/-<3>H]tymidin (spesifikk radioaktivitet 42 Ci/mmol), [5-<3>H]uridin (spesifikk radioaktivitet: 26 Ci/mmol) og [4,5-<3>H]leucin (spesifikk radioaktivitet: 52 Ci/mmol) ble innkjøpt fra Amersham Pharmacia Biotech (Buckinghamshire,

U.K.).

Forbindelser. De følgende forbindelser ble brukt i denne studien: 1,2,4-diamino-6-[2-(fosfonometoksy)etoksy]pyrimidin; 2, 2,4-diamino-6-{[2-(fosfonometoksy)etyl]sulfanyl}-pyrimidin; 3, 4-amino-6-[2-(fosfonometoksy)etoksy]pyrimidin; 4, 2-amino-4-hydroksy-6-[2-(fosfonometoksy)etoksy]pyrimidin; 5, 2-amino-4-hydroksy-6- {[2-(fosfonometoksy)etyl]-sulfanyl}pyrimidin; 6,2-amino-4-dimetylamino-6-[2-(fosfonometoksy)etoksy]pyrimidin; 7,2-amino-4-syklopropylamino-6-[2-(fosfonometoksy)etoksy]pyrimidin; 8, 4-amino-2-metylsulfanyl-6- [2-(fosfonometoksy)etoksy]pyrimidin; 9, 2-amino-4-metyl-6- [2-(fosfonometoksy)etoksy]pyri midin; 10, 2,4-cuamino-6-(S)-[2-(fosfonometoksy)propoksy]pyrimidin; 11, 2,4-diamino-6-(R)-[2-(fosfonometoksy)propoksy]pyrimidin; PMEA, 9-[(2-fosfonometoksy)etyl]adenin; (i?)-PMPA, (i?)-9-[(2-fosfonometoksy)propyl]adenin.

In vitro antivirusanalyser. Aktiviteten mot HIV-1- og HIV-2-indusert cyto-patisitet ble undersøkt i MT-4-cellekulturer på dag 5 etter infeksjon og basert på bestemmelsen av cellelevedyktighet ved hjelp av trypan-blåfarging eller i CEM-cellekulturer på dag 4 til 5 etter infeksjon og basert på den mikroskopiske undersøkelse av virusindusert kjempecelledannelse. HIV-1 og HIV-2 ble tilsatt ved 100 CCID50til cellekulturene.

Mononukleære celler fra perifert blod (PBMC) fra friske donorer ble isolert ved hjelp av densitetssentrifugering (Lymphoprep; Nycomed Pharma, AS Diagnostics, Oslo, Norge) og stimulert med fytohemagglutin (PHA) (Sigma Chemical Co., Bornem, Belgia) i 3 dager. De aktiverte celler (PHA-stimulerte blåster) ble vasket med PGS, og virusinfeksjoner ble gjort som beskrevet ved hjelp av de kliniske AIDS-forsøksgruppeprotokollene. I korte trekk ble PBMC-er (2x 105/200 brønn) platet ut i nærvær av seriefortynninger av testforbindelsen og ble infisert med HIV-forråd ved 1 000 CCID5opr. ml. På dag 4 etter infeksjon ble 125 ul av supernatanten fra de infiserte kulturene fjernet og erstattet med 150 ul nytt medium inneholdende testforbindelsene ved de passende konsentrasjoner. 7 dager etter utplating av cellene ble p24-antigen påvist i kultursupernatanten ved hjelp av en enzymbundet immunosorbentanalyse (NEN, Paris, Frankrike).

Humane primærmakrofager (M/M) ble fremstilt og renset på følgende måte. Mononukleære celler fra perifert blod (PBMC), erholdt fra friske HIV-1-negative donorer, ble separert over en Ficoll-gradient og inokulert i 48-brønners plater ved 1,8 x IO<6>celler/brønn i 1 ml RPMI 1640 inneholdende 20% varmeinaktiverte, endotoksin- og mykoplasmafritt, bovint fosterserum (Hyclone Laboratories, Inc., Logan, UT), 4 mM L-glutamin (Life Technologies), 50 U/ml penicillin og 50 ug/ml streptomycin (Life Technologies) (heretter henvist til som komplett medium). 5 dager etter utplating og dyrking av PBMC ved 37 °C i en fuktet atmosfære anriket med 5% CO2, ble adherente celler forsiktig fjernet med gjentatte vaskinger med oppvarmet RPMI-1640, hvorved det ble tilbake et monolag av adherente celler som til sist ble inkubert i komplett medium. Celler behandlet under disse betingelsene, er tidligere blitt påvist å være >97% M/M, som bestemt ved hjelp av cytofluorimetrisk analyse. Makrofager ble behandlet i 30 minutter med forbindelsene og så utfordret med 300 TCID5o/ml HIV-lsaL- 2 timer etter virusutfordring ble M/M vasket for å fjerne virusinokulumet, komplett medium inneholdende de passende forbindelseskonsentrasjoner ble erstattet der dette ble bedt om, og M/M ble så dyrket så lenge forsøkene varte. Hver forbindelseskonsentrasjon ble kjørt in triplo, mens positive kontroller ble kjørt in sekstuplo. Forbindelser ble derfor erstattet hver gang ved mediumendring. Supernatanter ble samlet opp på dag 14 etter infeksjon for fastleggelse av virusproduksjon ved hjelp av analyse av HIV-l-p24-antigen.

For anti-FIV-analysene ble IO<5>CrFK-celler inokulert på 24-brønners vevskulturplater. Celler ble dyrket med 2 ml kulturmedium/brønn inneholdende 2,5% kalvefosterserum i nærvær av forskjellige legemiddelkonsentrasjoner. Analysene ble utført in triplo. Etter en 1-times inkubasjonsperiode ved 37 °C ble celler infisert med FIV. Virus fikk være i kontakt med kulturene i 1 dag, hvoretter mediet ble fjernet, og nytt medium inneholdende de passende legemiddelkonsentrasjoner, ble tilsatt. Etter 6 dager ble tilstedeværelsen av FIV-p24-antigen undersøkt ved hjelp av en antigenoppfangningsanalyse.

Inhibitoreffekten av testforbindelsene på MSV-indusert transformasjon av murin embryofibroblast C3H/3T3-cellekulturer ble undersøkt mikroskopisk på dag 6 etter infeksjon. MSV ble tilsatt ved 75 fokusdannende enheter til cellekulturene. De nærmere fremgangsmåter for de antiretrovirale evalueringene er blitt beskrevet nærmere før (Balzarini et al., AIDS 5:21-28, 1991; Balzarini et al., Antimicrob. Agents Chemother. 37:332-338,1993; De Clercq et al., Proe. Soc. Exp. Biol. Med. 137:590-594, 1971).

Anti-MSV-aktivitet in vivo. Inhibitoreffektene av forbindelsene på initieringen av MSV-indusert tumordannelse og overlevelse av MSV-inokulerte mus ble evaluert som tidligere beskrevet (Balzarini et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 86:332-336,1989; Balzarini et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88:4961-4965,1991; Balzarini et al., Antimicrob. Agents Chemother. 37:332-338,1993). I korte trekk ble 2 til 3 dager gamle NMRI-mus hver inokulert subkutant i det venstre bakben med MSV og behandlet intraperitonealt med en enkeltdose av testforbindelse 4 timer før virusinfeksjon (dag 1), etterfulgt av en enkeltdose av testforbindelse på dagene 2,3,4 og 5. Legemiddeldoser var 50, 20, 8, 4 og/eller 2 mg/kg/dag for tenofovir [(i?)-PMPA], adefovir (PMEA), 1 (betegnet PMEO-2,4-di-NH2-Pym), 2 (betegnet PMES-2,4-di-NH2-Pym) og 11 (betegnet (i?)-PMPO-2,4-di-NH2-Pym). Det ble ikke observert noen toksisitet for den høyeste dose av testforbindelsen. Fremkomsten og veksten av MSV-induserte tumorer på stedet for virusinokulasjon, samt overlevelse for musene i opp til 30 dager etter infeksjon, ble målt daglig.

Cytostatisk og antimetabolsk effekt av asykliske nukleosidfosfonater in vitro. Analysene for å undersøke inhiberingen av CEM-cellevekst ved hjelp av testforbindelsene er blitt beskrevet tidligere (Balzarini et al., AIDS 5:21-28, 1991). Den 50% cytostatiske konsentrasjon (CC5o) ble definert som den konsentrasjon av forbindelse som reduserte antallet levende celler med 50%. For å måle MT-4-celletoksisitet av testforbindelsene ble 5 x IO<4>MT-4-celler inkubert i brønnene i 96-brønners mikroplater i nærvær eller fravær av forskjellige konsentrasjoner av testforbindelsene i 5 dager ved 37 °C. CC50ble så beregnet ut fra antallet levende celler tellet under et mikroskop ved hjelp av trypanblå-utelukkelsesmetoden.

Inkorporeringen av [/«eø>/-<3>H]tymidin, [<3>H]uridin og [<3>H]leucin i den metanoloppløselige CEM-cellefraksjon ble også målt i mikroplater. Til hver brønn ble det tilsatt IO<5>CEM-celler, 5,9 pmol (0,25 uCi) [me/)>/-<3>H]tymidin, 38 pmol (1,0 uCi) [<3>H]uridin og 19 pmol (1,0 uCi) [4,5-<3>H]leucin og en bestemt mengde av testforbindelsen. Cellene fikk proliferere i 20 timer ved 37 °C i en fuktet, CCvkontrollert atmosfære. Ved slutten av denne inkubasjonsperioden ble innholdene i brønnene (200 ul) brakt over på 25-mm glassfiberfiltre (type A/G; Gelman Instrument Co., Ann Arbor, MI) montert på et Millipore 3025 prøvetakings-apparat. Filtrene ble vasket to ganger med kald PBS (fosfatbufret saltoppløsning), to ganger med kald 10% trikloreddiksyre, to ganger med kald 5% trikloreddiksyre, én gang med kald etanol og én gang med kald eter. Filtrene fikk så tørke i 10 minutter ved 60 °C og ble analysert med hensyn på radioaktivitet i en toluenbasert scintillant.

Anti-HIV-l-aktivitet av asykliske pyrimidinnukleosidfosfonatanaloger i CEM-cellekulturer. En forutsetning for sterk antiretroviral aktivitet er tilstedeværelsen av en aminogruppe i C-2 i pyrimidinringen sammen med en aminogruppe i C-4 (dvs. forbindelsene 1, 2,11) eller en hydroksylgruppe i C-4 (dvs. forbindelse 4) (tabell 1). Disse 6-PMEO- og 6-PMPO-substituerte pyrimidinstrukturene resulterte i en anti-HIV-aktivitet med en EC50som varierte mellom 0,80 og 2,0 ug/ml. Mangel på en aminogruppe i C-2 (dvs. forbindelse 3 eller 8), eller tilstedeværelsen av en dimetylamino- eller metyl- eller syklopropylaminorest i C-4 (dvs. hhv. forbindelsene 6, 9 og 7) resulterte i fullstendig tilintetgjørelse av den antiretrovirale aktivitet (tabell 1). Tioeterderivater var som regel 5 til 10 ganger mindre aktive enn de tilsvarende eterderivatene (dvs. sammenlign forbindelse 2 med forbindelse 1) eller til og med fullstendig inaktive (dvs. forbindelse 5). Interessant nok oppviste den antiretrovirale aktivitet av de nye pyrimidin-ANP-ene markert enantiospesifisitet i sin virkning mot HIV-1. (i?)-6-PMPO-pyrimidinderivatet 11 var merkbart mer inhiberende for disse virusene enn det tilsvarende (5)-6-PMPO-pyrimidinderivat (10) (tabell 1). Den gjenværende antivirale aktivitet som legges merke til for (5)-enantiomeren, kan skyldes forurensningen med (R)-enantiomer som skriver seg fra det kirale utgangsmateriale (1-2%).

For de fleste forbindelsene ble lav, om noen cytotoksisitet registrert ved en konsentrasjon på 100 ug/ml, med et slående unntak for forbindelse 4 (CC50: 2,5 ug/ml for CEM-celler). Det antiviralt mest aktive 6-PMEO-2,4-di-NH2-pyrimidinderivat (forbindelse 1) oppviste en CC50på 11 ug/ml for CEM-celler, mens dens tilsvarende tioeteranalog 2 og (i?)-6-PMPO-2,4-di-NH2-pyrimidinderivatet 11 hadde CCso-verdier rundt 60 ug/ml (tabell 1). Interessant nok var 5-bromderivatet av 1 aktivt mot HIV-1 i CEM-cellekulturer ved 2,5 ug/ml, og ikke toksisk ved 100 ug/ml. Verken forbindelsene 1 eller 2, eller forbindelse 11 var inhiberende mot [<3>H]dThd-, [<3>H]Urd- og [<3>H]leu-inkorporering i TCA-uoppløselig CEM-cellemateriale innenfor en 12-timers inkubasjonsperiode ved 200 ug/ml. PMEA og (i?)-PMPA var heller ikke inhiberende overfor makromolekylær syntese ved denne legemiddelkonsentrasjon (data ikke vist).

Anti-retrovirusaktivitet av asykliske pyrimidinnukleosidfosfonatanaloger i flere virus/celle-systemer. 6-PMEO-derivatene 1 og 4, 6-PME-tioeteren (6-PMES) 2, og ( R)- 6-PMPO-derivatet 11 ble evaluert med hensyn på deres inhibitoraktivitet mot flere in vitro retrovirusmodeller (tabell 2). Som regel passet de antivirale aktivitetsverdiene for testforbindelsene som ble funnet for HIV-I(IIIb) i CEM-cellekulturer (tabell 1), svært godt til de antivirale aktivitetsverdiene som ble funnet for HIV-2(ROD) i CEM-celler, HIV-1 og HIV-2 i MT-4-cellekulturer, og FIV i Crandell kattenyreceller. EC5o-verdiene for forbindelse 1 for HIV varierte således mellom 0,29 og 0,80 ug/ml, og forbindelse 11 mellom 1,3 og 3,0 ug/ml. Disse verdiene var nær opp til de som ble observert for referanseforbindelsene PMEA (adefovir) (EC50: 0,96-2,0 ug/ml) og (Æ)-PMPA (tenofovir) (EC50: 0,36-0,52 ug/ml). Når 6-PMEO- og 6-(R)- PMPO-derivatene ble evaluert mot HIV-1 i primære celler [HIV-1(IIIB) i PBL og HIV-l(Ba-L) i monocytt/makrofager (M/M)], var den antiretrovirale styrke enda mer uttalt. Faktisk inhiberte forbindelsene 1 og 11 viruset i PBL ved en EC50på hhv. 0,07 og 0,12 ug/ml, sammenlignet med 1,9 og 0,33 ug/ml for referanseforbindelsene PMEA og (Æ)-PMPA. 6-PMEO- og (Æ)-6-PMPO-derivatene var enda mer inhiberende overfor HIV-1 (Ba-L) i M/M, noe som også ble observert for PMEA og (i?)-PMPA. Som regel viste forbindelsene seg å være mindre cytotoksiske i MT-4, sammenlignet med CEM-celler, og ikke toksiske ved 100 ug/ml i monocytt/makrofager.

Siden det tidligere er blitt påvist at PMEA og (i?)-PMPA oppviser uttalt inhibitoraktivitet mot murint Moloney-sarkomvirus (MSV) både i cellekultur og hos nyfødte mus, ble de nye 6-PMEO- og (i?)-6-PMPO-derivatene også evaluert med hensyn på deres in vzYro-aktivitet mot MSV. Forbindelsene 1,11 og 4 var svært inhiberende mot MSV-indusert C3H-celletransformasjon. ECso-verdiene var så lave som 0,05-0,15 ug/ml (tabell 2).

Effekt av naturlige nukleosider og nukleobaser på anti-HIV-aktiviteten av de asykliske pyrimidinnukleotidfosfonatanalogene i cellekultur. Det er godt kjent at anti-HIV-aktiviteten av pyrimidinnukleosidanaloger, slik som 3'-azido-3'-deoksytymidin (AZT, zidovudin) og 2',3'-dideoksycytidin (ddC, zalcitabin), kan påvirkes (dvs. reduseres) i nærvær av naturlige nukleosider, slik som dThd og dCyd (Balzarini et al., Textbook of AIDS Medicine, kapittel 49, Broder, S., T.C. Merigan, og D. Bolognesi, red. Williams & Wilkins, Baltimore, Maryland, s. 751-772, 1994; Balzarini et al., Antimicrob. Agents Chemother. 37:332-338,1993). For å beregne hvorvidt tilstedeværelsen av naturlige nukleosider og nukleobaser vil kunne påvirke anti-HIV-aktiviteten av de nye 6-PMEO- og (i?)-6-PMPO-pyrimidinderivatene, ble effekten av subtoksiske konsentrasjoner av pyrimidinnukleosidene tymidin (dThd) og 2'-deoksycytidin (dCyd), purinnukleosidene adenosin (Ado) og guanosin (Guo), og nukleobasen adenin (Ade) undersøkt (tabell 3). Ingen av de naturlige nukleosidene og nukleobasene hadde noen målbar innvirkning på anti-HIV-1-aktiviteten av testforbindelsene i CEM-cellekulturer. I alle tilfeller ble den antiretrovirale aktivitet av forbindelsene fullstendig bevart, noe som også var tilfellet for referanseforbindelsene PMEA, (R)-PMPA og PMEG (tabell 3).

Effektiviteten av asykliske pyrimidinnukleosidfosfonatanaloger mot MSV-indusert tumordannelse hos nyfødte NMRI-mus. 6-PMEO-derivatet 1 og dets tioeteranalog 2, og (i?)-6-PMPO-derivatet 11 ble evaluert med hensyn på deres inhibitoreffekt på MSV-indusert tumordannelse og ledsagende død hos nyfødte NMRI-mus (tabell 4). PMEA (adefovir) og ( R)-PMPA (tenofovir) ble inkludert som referanseforbindelser. Av de nye 6-PMEO- og (i?)-6-PMPO-derivater viste forbindelse 1 seg å være mest effektiv når det gjelder å forhindre MSV-indusert tumordannelse og ledsagende død hos nyfødte NMRI-mus (tabell 4). Minst 80% av musene ble beskyttet mot tumordannelse ved 50 og 20 mg/kg, og de gjenværende mus som utviklet tumorer, overlevde i mer enn 30 dager etter infeksjon. Ved en så lav dose som 2 mg/kg kunne forbindelse 1 fortsatt forhindre tumordannelse hos 5% av musene og ga 15% langtidsoverlevende. Forbindelse 1 hadde en sammenlignbar evne til å forhindre tumordannelse og ledsagende dyredød som PMEA og (i?)-PMPA (tabell 4). I motsetning til denne var det tilsvarende tioeterderivat 2 ikke i stand til å forhindre tumordannelse ved alle doser som ble testet, og det ga 20% langvarige overlevende ved en dose på 8-50 mg/kg. Evnen til (i?)-6-PMPO-derivatet 11 når det gjelder å forhindre tumordannelse og ledsagende død, lå i mellom det som ble observert for forbindelsene 1 og 2. Alle legemidler forsinket MSV-indusert tumordannelse på en doseavhengig måte. Forbindelse 1 hadde en inhibitoreffekt som var sammenlignbar med den til (7?)-PMPA og PMEA. Forbindelse 11 var dårligere enn forbindelse 1, og forbindelse 2 oppviste bare en uttalt forsinkelse i tumordannelse ved en dose på 50 mg/kg. Som angitt for tumordannelse, ble det også oppnådd forsinkelse av ledsagende dyredød på en doseavhengig måte, og forbindelse 1 var minst like effektiv når det gjelder å forsinke død som referanselegemidlene PMEA og (i?)-PMPA.

Sensitivitet hos muterte HIV-l-stammer overfor asykliske

pyrimidinnukleosidfosfonatanaloger i CEM-cellekulturer. Forbindelsene 1, 2 og 11 ble evaluert med hensyn på deres inhibitoraktivitet mot HIV-l(IIlB)-stammer inneholdende ikke-nukleosid-RT-inhibitor (NNRTI)-spesifikke L1001-, K103N-, Y181C- og Y188H-mutasjoner i RT. Alle tre forbindelsene bibeholdt full aktivitet mot disse mutantvirusstammene (data ikke vist). De samme forbindelsene ble også evaluert med hensyn på deres inhibitoreffekt på de kliniske isolatene HIV-l/LlS, HIV-1/L6S og HIV-1 /L6S/PMEA (tabell 5). PMEA og (Æ)-PMPA ble tatt med som referanseforbindelser. Forbindelse 1 bibeholdt uttalt antivirusaktivitet mot de tre virusstammene. Forbindelsene 2 og særlig 11 oppviste klart redusert aktivitet mot HIV-l/L6S/PMEA-isolatet, og det gjorde også PMEA og (Æ)-PMPA. De multi-NRTI-resistente mutasjonene (S68G, K70T, V75I, F77L, Fl 16Y og Q151M) og den PMEA-karakteristiske K65R-mutasjon som er til stede i HIV-1/L6S/PMEA, påvirket ikke merkbart den antivirale styrke til forbindelse 1 og PMEA (~ 3,6- til 4,5-ganger økning av EC5o), mens den mer merkbart reduserte sensitivitet overfor de øvrige ANP-er (tabell 5).

Tabell 1. Anti-retroviral og cytostatisk aktivitet av asykliske pyrimidinnukleosidfosfonater i HIV-1-infiserte CEM-cellekulturer.

"Angitte legemiddeldose gitt 2 timer før MSV-infeksjon etterfulgt av 4 ytterligere daglige doser i løpet av de 4 påfølgende dager etter infeksjon. Gjennomsnittsdagen for tumorutvikling hos kontroll-MSV-infiserte mus var 4,5 dager, mens gjennomsnittsdag for dyredød hos MS V-infiserte mus var 12,3 dager.<b>Ved den angitte legemiddeldose (50 mg/kg) døde 16% av musene altfor tidlig (<24 dager), sannsynligvis på grunn av toksisitet av legemidlet og uten tegn på tumordannelse. For tidlig død ble ikke regnet med ved beregning av prosentandelen av langvarig overlevende.<c>Ved den angitte legemiddeldose (20 mg/kg) døde 50% av musene for tidlig (<6 dager), sannsynligvis på grunn av toksisitet av legemidlet og uten tegn på tumordannelse. For tidlig død ble ikke regnet med ved beregning av prosentandelen av langvarig overlevende. dAlle mus døde før dag 6, sannsynligvis på grunn av legemidlets toksisitet. Ingen av musene oppviste tumordannelse før død.

Claims

1. Forløperlegemiddel med formel (I)

hvor Ri er H, amino eller metylsulfanyl; R2 er H, metyl, halogen, -N(R5 )2 , hydroksy, beskyttet hydroksy eller en gruppe med formel (Ia)

R3 er uavhengig H, metyl, hydroksymetyl, halometyl eller beskyttet hydroksymetyl; R4 er H eller halogen; X er uavhengig oksygen, svovel eller en binding; Z er uavhengig en ester eller et amid; R5 er uavhengig H, Ci -Cg-alkyl eller en beskyttelsesgruppe; og <*> betegner et kiralt karbonatom når R3 er metyl, hydroksymetyl, halometyl eller beskyttet hydroksymetyl; og salter og solvater derav, karakterisert ved at én eller begge Z-gruppene hydrolyseres fra fosfonatet av esteraser og/eller karboksypeptidaser først etter inntak av forløperlegemidlet.

3. Forløperlegemiddel ifølge krav 1, hvor Z er et eller to amider valgt fra naturlig forekommende aminosyrer og den eller de frie karboksylgruppene i aminosyre Z-gruppene er eventuelt forestret med Ci -Cg-alkyl.

4. Forløperlegemiddel ifølge krav 1, hvor Z er én eller to estere med fenyl.

5. Forløperlegemiddel ifølge krav 1, hvor forløperlegemidlet (i) ikke hydrolyseres eller hydrolyseres forholdsvis sakte i den øvre del av tarmkanalen, (ii) er tarm- og cellepermeable og (iii) hydrolyseres i cellecytoplasmaet og/eller det systemiske blodomløp.

6. Preparat, karakterisert ved at det omfatter et forløperlegemiddel ifølge krav 1 og en farma-søytisk akseptabel eksipiens.

7. Anvendelse av et forløperlegemiddel ifølge krav 1 til fremstilling av et preparat for behandling av en virusinfeksjon.

8. Anvendelse ifølge krav 7, hvor viruset er et DNA-virus.

9. Anvendelse ifølge krav 8, hvor viruset er et retrovirus eller hepadnavirus.