CZ200475A3 - Univerzální buněčný systém pro testování vstupu látek do jader - Google Patents
Univerzální buněčný systém pro testování vstupu látek do jader Download PDFInfo
- Publication number
- CZ200475A3 CZ200475A3 CZ200475A CZ200475A CZ200475A3 CZ 200475 A3 CZ200475 A3 CZ 200475A3 CZ 200475 A CZ200475 A CZ 200475A CZ 200475 A CZ200475 A CZ 200475A CZ 200475 A3 CZ200475 A3 CZ 200475A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- nls
- egfp
- sequence
- testing
- cell
- Prior art date
Links
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 25
- 239000000126 substance Substances 0.000 title claims abstract description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 title abstract description 4
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 21
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 15
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 4
- 102100029462 Sodium-dependent lysophosphatidylcholine symporter 1 Human genes 0.000 claims description 3
- 101710185583 Sodium-dependent lysophosphatidylcholine symporter 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 3
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 claims 3
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 claims 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 abstract description 17
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 abstract description 17
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 abstract description 14
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 abstract description 14
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 abstract description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 abstract 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract 1
- 230000030648 nucleus localization Effects 0.000 abstract 1
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 description 30
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 18
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 17
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 10
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 8
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 7
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 7
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 210000000633 nuclear envelope Anatomy 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 4
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N Guanosine-5'-triphosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 210000004492 nuclear pore Anatomy 0.000 description 3
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 102000011781 Karyopherins Human genes 0.000 description 2
- 108010062228 Karyopherins Proteins 0.000 description 2
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 2
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-amino-4,5-dihydroxy-6-[(1r)-1-hydroxyethyl]oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]([C@@H](C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N 0.000 description 1
- 108010022579 ATP dependent 26S protease Proteins 0.000 description 1
- 241000242764 Aequorea victoria Species 0.000 description 1
- 101000997963 Aequorea victoria Green fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 101100268670 Caenorhabditis elegans acc-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100032826 Homeodomain-interacting protein kinase 3 Human genes 0.000 description 1
- 101710110791 Homeodomain-interacting protein kinase 3 Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 206010023825 Laryngeal cancer Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000003789 Nuclear pore complex proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000163 Nuclear pore complex proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010068086 Polyubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102100037935 Polyubiquitin-C Human genes 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000708 Proteasome Endopeptidase Complex Proteins 0.000 description 1
- 102000004245 Proteasome Endopeptidase Complex Human genes 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 241000242583 Scyphozoa Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 108091005971 Wild-type GFP Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 238000012382 advanced drug delivery Methods 0.000 description 1
- 101150073130 ampR gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 229910001882 dioxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 201000005264 laryngeal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000006674 lysosomal degradation Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- 210000005155 neural progenitor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000025308 nuclear transport Effects 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- MVMXJBMAGBRAHD-UHFFFAOYSA-N picoperine Chemical compound C=1C=CC=NC=1CN(C=1C=CC=CC=1)CCN1CCCCC1 MVMXJBMAGBRAHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000026447 protein localization Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000022983 regulation of cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000007363 regulatory process Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 238000010798 ubiquitination Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Univerzální buněčný systém pro testování vstupu látek do jader
Oblast techniky:
Toto řešení náleží do oblasti molekulární genetiky a genové terapie, klonování rekombinantních DNA molekul, vytvoření geneticky modifikovaných, stabilně transformovaných buněčných linií. Vynález je úzce spojen s použitím DNA expresního vektoru nesoucí reportérový fúzní protein, který umožňuje monitorovat transport látek přes jadernou membránu.
Dosavadní stav techniky:
GFP (Green fluorescent protein) je v molekulární biologii často užívaným markérem pro sledování pochodů v buňce, ke studiu genové exprese a lokalizace proteinů. Poprvé byl izolován z mořského živočicha, medúzy Aequorea victoria. Celý gen je tvořen 238 aminokyselinami. Je schopen tvořit fúzní proteiny jak na C-, tak i N- konci při současném zachování fluorescence.
GFP fluoreskuje díky chromoforu, který vzniká autokatalyticky cyklizací tří aminokyselin za přítomnosti molekulárního kyslíku. Nevyžaduje pro svou fluorescenci žádné další substráty nebo koíaktory (1). Proces intramolekulámí biosyntézy GFP chromoforu vyžaduje oxidaci O2 a vedlejším produktem této reakce je uvolnění molekul H2O2 ve stechiometrickém poměru 1:1 vztažené k počtu vzniklých molekul GFP s aktivním chromoforem (2) , viz Obr. 1. Generované kyslíkové radikály se stávají pro buňku toxickými s následnou indukcí apoptózy (3).
V současné době je známo několik typů mutant GFP, které se dělí do skupin podle typu jejich chromoforu, který je zodpovědný za fluorescenci. EGFP (enhanced GFP) je mutantní variantou divokého typu (wild-type) GFP, ve které došlo k substituci dvou aminokyselin, a to k záměně Phe za Leu v poloze 64 a Ser za Thr v poloze 65. EGFP má na rozdíl od divokého typu jiné spektrální vlastnosti, jasnější fluorescenci a výrazně se liší ve schopnosti fluorescence při 37°C. Zatímco divoký typ fluoreskuje při pokojové a teplotách
*-4—* nižších, EGFP má schopnost fluoreskovat při 37^C. Jinak jsou si mutanty strukturálně velice podobné (4).
Použití GFP nebo EGFP je předmětem mnoha řešení patentů. Příkladem může být patent US2002009712. Příkladem využití GFP fúzního proteinu, např. s Gas proteinem je patent
Z5Í^zVo03008435.
Nukleární lokalizační signál (NLS) je jedním z řady lokalizačních signálů, který řídí jaderný transport látek. Kromě mitózy, kdy je jaderná membrána rozpadlá, je transport látek řízen komplexem jaderných pórů NPC (nuclear póre complex), které jsou tvořeny asi sto různými proteiny, tzv. nukleoporiny. Ty jsou uspořádány do kruhu tak, že tvoří podobu basketbalového koše, kterým se NLS protein spolu s přenášeným substrátem přenese z cytoplazmy do jádra.
Proteiny do velikosti přibližně 40 kDa mohou do jádra procházet prostou difúzí. Proteiny o velikosti větší než 40 kDa vstupují do jádra^ zprostředkovaně, vyžadují energii a NLS.
Navzdory tomu oligonukleotidy o velikosti 10^25 bps (což odpovídá průměrně 6 kDa) mají limitující schopnost penetrace. Oligonukleotidy mají hydrofilní charakter a nepříliš snadno prostupují buněčnými membránami.
Mechanismus přenosu přes jadernou membránu je následující: NLS obsahuje vazebné místo pro ímportin a. V první fázi transportu se NLS váže k heterodimeru α,β importinu prostřednictvím zmiňovaného vazebného místa. ímportin β je zodpovědný za dopravu NLS spolu s importovaným substrátem k cytoplazmatickým fílamentům NPC. Ihned proběhne translokace systému na jadernou stranu NPC. Translokace je energeticky náročný proces, vyžaduje hydrolýzu GTP. Transnukleární proces je ukončen uvolněním importovaného substrátu v jádře a uvolněním heterodimeru importinu, který se v disociovaném stavu vrací zpět do cytoplazmy (5).
NLS se v molekulární biologii využívá ke studiu zprostředkovaného transportu nebo pasivní difúze látek, proteinů přes jaderný obal v eukaryotických buňkách. Využívá se fúzních proteinů NLS s např. GFP nebo EGFP, čímž se také zabývá patent WO9849325.
Ubiquitin je součástí proteolytického degradačního systému, který má význam v mnoha regulačních procesech buňky, jako jsou např. regulace buněčného cyklu, diferenciace, apoptóza. Nezanedbatelný význam má také. v regulaci transkripce a v onkogenezi.
« 3
Ubiquitinylace je jedním z hlavních nelysozomálních procesů odbourávání proteinů s kťátkým i dlouhým poločasem rozpadu v savčích buňkách. Specificky rozpoznává chybné, abnormální, nadbytečné nebo buňce cizí proteiny. Nejprve se substrát váže kovalentně k řetězci polyubiquitinu, následně 26S proteazom pomocí specifického signálu rozpoznává takto navázaný substrát a degraduje jej (6).
Ubiquitin je v praxi také využíván ke studiu aktivity proteazomu. K vyhodnocení aktivity na základě akumulace reportérového proteinu v živých buňkách slouží vektor kódující fúzní protein ubiquitin-GFP, čímž se zabývá patent/WÓ018lT277
Kromě ubiquitinu je známá PĚST sekvence (sekvence bohatá na prolin (P), glutámovou kyselinu (E), serin (S) a threonin (T)), která se podílí také na degradaci proteinů. Tato sekvence byla použita při zkonstruování vektoru obsahující fúzní protein s EGFP proto, aby ( se zvýšil obrat EGFP, jehož zvýšená exprese se stává pro buňku toxickou. Příkladem je patent kde je výše zmíněné předmětem řešení.
Podstata vynálezu:
Tento buněčný systém pro testování vstupu látek do jader je založen na konstrukci expresního vektoru kódující sekvenci pro fúzní protein ubiquitinu, EGFP a amplifikováného jaderného lokalizačního signálu (Ubi_EGFP_NLS). Dále, námi předkládané řešení je založeno na využití výše zmíněného expresního vektoru pro vytvoření stabilně transfekované buněčné linie produkující fúzní protein Ubi_EGFP_NLS.
EGFP je zde pro svou schopnost fluorescence využíván jako reportéra vý gen. EGFP si zachovává svou funkčnost i po spojení s cílovým proteinem jak na C-, tak i na N-konci. Tohoto faktu bylo využito při konstrukci fúzního proteinu s amplifiko vanou NLS sekvencí na C-konci EGFP. V tomto případě jaderný lokalizační signál (odvozen od SV40 T-large antigenu izolovaného z opičího viru) zabezpečí transport EGFP do jádra a zajistí tak zelenou jadernou fluorescenci za daných podmínek.
Jak bylo zmíněno v části Dosavadní stav techniky, jsou patentované vektory kódující fúzní protein GFP, příp. EGFP sNLS. Námi předkládaný návrh se odlišuje od výše citovaného patentu zejména tím, že ve vektorovém konstruktu je také začleněna sekvence ubiquitinu, jehož funkcí je zajistit zvýšenou degradaci EGFP a tím zabránit možnému toxickému působení na živé buňky a také uspořádáním amplifikované NLS sekvence.
Exprese EGFP je řízena silným eukaryontním CMV promotorem, který je zakódován ve vektoru pUF2. Při vysoké expresi EGFP se tento protein může stát pro buňku toxickým a ta na to reaguje spuštěním apoptické kaskády. Zvýšené množství EGFP proteinu je možné regulovat specifickým proteinem ubiquitinem, který se účastní proteolytických pochodů v buňce.
Fúzní protein ubiquitinu s EGFP zajistí degradaci fúzního proteinu a tedy i jeho rychlejší obrat, čímž se snižuje toxický vliv kyslíkových radikálů vznikajících při tvorbě EGFP aktivního chromoforu. V námi navrhovaném řešení je ubiquitin připojen k EGFP na jeho N-konci. Jedinečností tohoto návrhu je to, že oproti jiným patentům námi předkládaná sekvence kóduje „in frame“ nejen ubiquitin a EGFP, ale je také spojen s amplifíkovanou NLS sekvencí.
Fúzní protein ubiquitinu, EGFP a amplifované NLS sekvence zajistí na jedné straně lokalizaci EGFP v jádře a následně jeho zelenou fluorescenci, na druhé straně se zvýší celkový obrat EGFP a tím se sníží jeho možné toxické působení na buněčnou kulturu.
Jak již bylo zmíňeno, vektor kódující Ubi_EGFP_NLS je použit pro přípravu stabilní linie exprimující EGFP do jádra při současném zvýšeném obratu EGFP. Takto připravený buněčný testovací systém je vhodný pro testování a monitorování vstupu, transportu fluorescenčně značených látek různé chemické povahy do jader eukaryotických buněk.
Tento systém je vhodný pro testování vstupu nemodifikovaných i modifikovaných fluorescenčně značených oligonukleotidů do buněčných jader jako potenciálních genových terapeutik.
Vektorové konstrukty kódující EJbi_EGFP_NLS nejsou zatím předmětem žádného řešení patentů.
Příklad provedení vynálezu:
Základní kostru vektoru pUF2_Ubi_EGFP_NLS tvoří plazmid pUF2. Je tvořen 6252 bps, nese geny pro neomycinovou a ampicilinoyou rezistenci, CMV promotor. Do tohoto plazmidu je restriktázami Xbal a Notl vklonován „in frame“ gen kódující fúzní protein pro Ubi _EGFP_NLS.
Sekvence ubiquitinu byla namnožena pomocí PCR. Templátovou DNA byla lidská cDNA. Za použití DNA/RNA syntetizéru (ABI 394; Applied Biosystems, Foster City, USA) byly nasyntetizovány primery:
Ubi_sense: 5‘-CGG GAT CCC CGC GCC ATC ATG GAG ATC TTC GTG AAG ACC-3‘ Ubi_antisense: 5‘- GGA ATT CGG TAC CGC GCA GAC GCA GCA CCA GGT GCA AGG-3‘
Primer Ubi_sense je navržen tak, že kóduje restrikční místo pro BamHI a Bglll, primer obsahuje také ATG kodon s Kozákovou sekvencí. Primer Ubi_antisense kóduje restrikční místo pro KpnI a EcoRI.
Namnožená DNA byla štěpena enzymy KpnI a BamHI a vligována T4 DNA ligázou do vektoru pUC131 štěpeného týmiž restrikčními enzymy, viz Obr. 2. Takto připravený rekombinantní plazmid pUC131_Ubi byl namnožen v bakteriální kultuře E. coli, poté byla izolována plazmidová DNA (QIAGEN kit). Insert byl ověřen restrikcí a sekvenací.
Sekvence ubiquitinu o velikosti 242 bps byla dále překlonována restriktázami BamHI a Ncol do vektoru pEGFP (Clontech) štěpeného stejnými enzymy, viz Obr. 3.
Velikost plazmidu pEGFP je 3355 bps. Úsek od 289 do 1008 bps kóduje gen pro EGFP. EGFP z vektoru pEGFP je modifikovanou variantou wild-typu GFP a vyznačuje se jasnější fluorescencí s excitačním maximem 488 nm a emisním maximem 507 nm.
Do vzniklého rekombinantního vektoru pUbi_EGFP byla vklonována amplifíkovaná NLS sekvence, viz Obr. 4. Tato sekvence o velikosti 84 bps je složena ze 4 dílčích oligonukleotidů označených NLS 1-4, přičemž oligonukleotidy NLS1 a NLS2 tvoří řetězec ve směru 5'-3', oligonukleotidy NLS3 a NLS4 tvoří k tomu řetězec komplementární ve směru 3'-5'.
Za použití DNA/RNA syntetizéru (ABI 394) byly nasyntetizovány na 5’konci fosforylované oligonukleotidy NLS 1-4 o následující sekvenci:
NLS 1: 5‘-GTA CAT AGA TCC AAA AAA GAA GAG AAA GGT AGA TCC AAA AAA GAA GAG AAA GGT AGA-3 ‘
NLS 2: 5‘-TCC AAA AAA GAA GAG AAA GGT ATA AGC-3‘
NLS 3: 5‘-TTT TGG ATC TAC CTT TCT CTT CTT TTT TGG ATC TAT-3‘
NLS 4: 5‘-GGC CGC TTA TAC CTT TCT CTT CTT TTT TGG ATC TAC CTT TCT CTT CTT -3‘
Tyto sekvence jsou navrženy tak, že po příslušné hybridizaci vzájemně komplementárních úseků (NLS 1 a 3; NLS 2 a 4) vytvářejí na obou koncích konce kohezivní pro restrikční enzymy BsrGI (5 ‘ -konec) a Nati (3 ’ -konec).
- 6 ~
NLS 1 a 2 po spojení enzymem T4 DNA ligázou tvoří řetězec 5‘-3‘, kdežto oligonukleotidy NLS 3 a 4 tvoří k tomu řetězec komplementární ve směru 3‘-5‘.
Tato navržená amplifikovaná NLS sekvence kóduje tři po sobě jdoucí opakování motivu GAT CCA AAA AAG AAG AGA AAG GTA. Sekvence kóduje také stop kodon TAG.
Protokol skládání umělého genu:
1. Ve zkumavce A smíchat 200 pmolů oligonukleotidů NLS1 a NLS3.
2. Ve zkumavce B smíchat 200 pmolů oligonukleotidů NLS2 a NLS4.
3. Inkubovat 2 min při 80 °C.
4. Poté inkubovat 30 min při pokojové teplotě.
5. Smíchat obsah zkumavky A s obsahem zkumavky B a inkubovat 5 min při 40 °C.
6. Poté inkubovat 20 min při pokojové teplotě.
7. Ligace hybridizovaných oligonukleotidů T4 DNA ligázou (New England Biolabs) 1 hod. při 16°C.
Produkt byl izolován pomocí gelové elektroforézy.
Vlastní klonování pak zahrnuje štěpení pUbi_EGFP restriktázami BsrGI a Notl a do takto připraveného plazmidu byla vklonována sekvence NLS s navrženými lepivými konci pro oba zmiňované enzymy. Vzniklý plazmid pUbi_EGFP_NLS o velikosti 3645 bps byl transformován do E. coli, namnožen pod selekčním tlakem ampicilinového antibiotika. Jednotlivé klony byly izolovány a plazmidy s inserty ověřeny restrikcí.
Z pUbi_EGFP_NLS byla vyštěpena enzymy Xbal a Notl kazeta kódující fúzní protein Ubi_EGFP_NLS o délce 1043 bps a vložena do cílového vektoru pUF2 naštěpeného týmiž enzymy, viz Obr. 5. Insert byl po namnožení v E. coli opět izolován a ověřen restrikcí.
Tato kazeta Ubi_EGFP_NLS může být vklonováná do jakéhokoli vektoru vhodnými restrikčními enzymy. Příkladem může být klonování kazety vyštěpené z vektoru pUbi_EGFP_NLS enzymy Sáli, Notl do plazmidu pLNCX2 štěpeného Xhol, Notl, přičemž SaU a Xhol mají navzájem kompatibilní kohezivní konce.
Vektor pUF2_Ubi_EGFP_NLS byl testován v eukaryotické buněčné linii Hep2 (human larynx carcinoma cells). Buňky byly kultivovány v DMEM lx high glucose ( L-glutamin 584 mg/1, pyruvát sodný 110 mg/1) médiu (PAA Laboratories) obsahující 10% FCS (PAA Laboratories), 50 pg/ml gentamycinu (PAA Laboratories). Buňky byly kultivovány v inkubátoru při 37 °C, 5% CO2.
6^
Den před transfekcí byly buňky rozesety v hustotě 4x104 na 24 jamkovou destičku. 0,4 pg plazmidu pUF2_Ubi_EGFP_NLS bylo transfekováno pomocí Effectene Transfection Reagent (QIAGEN). 24 hodin po transfekci byly pozitivně transfekované buňky detekovány fluorescenční mikroskopií (Nikon Eclipse TE300) s použitím B-2A filtr bloku (Nikon, ex 450-490 nm, DM 505 nm, BA 520 nm). 24 hodin po transfekci byla buněčná linie podrobena selekčnímu tlaku antibiotika G418 (PAA Laboratories) o koncentraci 400 pg/ml média po dobu 20 dnů. Klony exprimující EGFP byly dále izolovány pomocí klonovacích disků (Sigma).
Přehled obrazové dokumentace:
Obr. 1: Reakční mechanismus vzniku aktivního chromoforu GFP/EGFP, převzato z: Tsien R.Y.: The green fluorescent protein, Annu. Rev. Biochem., 67, 509-44, 1998
Obr. 2: Klonovací schéma pUC131_Ubi
Obr. 3: Klonovací schéma pUbi_EGFP
Obr. 4: Klonovací schéma pUbi_EGFP_NLS
Obr. 5: Klonovací schéma pUF2_ Ubi_EGFP_NLS
| Použité zkratky v textu a obrázcích: | |
| ampR | ampicilinová rezistence |
| BGHpA | bovine growth hormone polyadenilační signál |
| bps | base pairs, páry baží |
| cut | označení štěpeného plazmidu restrikčním enzymem |
| EGFP | enhancovaný zeleně fluoreskující protein |
| GFP | zeleně fluoreskující protein |
| GTP | guanozintrifosfát |
| LacZ | gen pro β-galaktosidázu |
| 1ITR | left inverted terminál repeat |
| neoR | neomycinová rezistence |
| NLS | jaderný lokalizační signál |
| pCMV | promotor odvozený od cytomegaloviru |
| pLac | laktózový promotor |
| POenh | polyoma enhancer |
| pTK | thimidin kinázový promotor |
| pUC ori | pUC plazmid replikační počátek |
| rITR | right inverted terminál repeat |
| SD/SA intron | splice donor/splice akceptor místo |
| SV40pA | polyadenilační signál |
| Ubi | ubiquitin |
”8 ~~
Průmyslová využitelnost:
Tento buněčný testovací systém lze využít pro testování a monitorování vstupu, transportu fluorescenčně značených látek různé chemické povahy do jader eukaryotických buněk.
Tento systém je vhodný pro testování vstupu nemodifikovaných i modifikovaných fluorescenčně značených oligonukleotidů do buněčných jader jako potenciálních genových terapeutik.
Reference:
(1) Dopf J., Horiagon T.M.: Deletion mapping of the Aequorea victoria green fluorescent protein, Gene, 173, 39-44, 1996 (2) Tsien R.Y.: The green fluorescent protein, Annu. Rev. Biochem., 67, 509-44,1998 (3) Hsiao-Sheng L., Ming-Shiou J. et al.: Is green fluorescent protein toxic to the living cells?, Biochem. and Biophys. Res. Communications, 260, 712-717, 1999 (4) Zimmer M.: Green fluorescent protein (GFP): Applications, structure, and related photophysical behavior, Chem. Rev., 102, 759-781, 2002 (5) Escriou V., Carriere M. et al.: NLS bioconjugates for targeting therapeutic genes to the nucleus, Advanced Drug Delivery Reviews, 55, 295-306, 2003 (6) Attaix D., Combaret L. et al.: Reguiation of proteolysis, Current Op. In clin.nutrition and metabolic care, 4, 45-49, 2001
Claims (7)
- Patentové nároky:1. Fúzní protein Ubi_EGFP_NLS o sekvenci aminokyselin /NH2-MEIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLED GRTLSDYN1QKESTLHLVLRLRGT$$$MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGH KFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHM KQHDFFKSAMPEGYVQERTJFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFK EDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQ QNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAG1TLGMDEL YI$$$DPKKKRKVDPKKKRKVDPKKKRKV -COOH, kdy $ je jakákoliv aminokyselina.
- 2. Oligonukleotidy NLS1 až NLS4 o sekvenci NLS 1: 5‘-GTACATAGATC CAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGATCCAAAAAAG AAGAGAAAGGTAGA-3 4;NLS 2: 5‘-TCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTATAAGC-3‘; NLS 3: 5‘-TTTT GGATCTACCTTTCTCTTCTTTTTTGGATCTAT-34; NLS 4: 5‘-GGCCGCTTA TACCTTTCTCTTCTTTTTTGGATCTACCTTTCTCTTCTT-34 použité pro fúzi amplifikované sekvence NLS na C-konec EGFP
- 3. Plasmid nebo virový DNA či RNA vektor obsahující sekvenci kódující polypeptid podle nároku 1.
- 4. Prokaryontní hostitelská buňka transformovaná vektorem podle nároku 3.
- 5. Eukaryotní hostitelská buňka, do které byl vnesený transfekci či jiným způsobem)^ vektor podle nároku 3.
- 6. Použití plasmidu nebo virového DNA či RNA vektoru podle nároku 3 a/nebo buněk podle nároku 5 pro testování a monitorování vstupu a/nebo transportu fluorescenčně značených syntetických molekul různé chemické povahy do jader eukaryotických buněk.
- 7. Použití plasmidu nebo virového DNA či RNA vektoru podle nároku 3 a/nebo buněk podle nároku 5 pro testování a monitorování vstupu a/nebo transportu fluorescenčně značených syntetických molekul různé chemické povahy do jader eukaryotických buněk, kdy syntetickou molekulou je oligonukleotid nebo jiná molekula schopná vazby na strukturu DNA.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ200475A CZ200475A3 (cs) | 2004-01-15 | 2004-01-15 | Univerzální buněčný systém pro testování vstupu látek do jader |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ200475A CZ200475A3 (cs) | 2004-01-15 | 2004-01-15 | Univerzální buněčný systém pro testování vstupu látek do jader |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ295047B6 CZ295047B6 (cs) | 2005-05-18 |
| CZ200475A3 true CZ200475A3 (cs) | 2005-05-18 |
Family
ID=34529463
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ200475A CZ200475A3 (cs) | 2004-01-15 | 2004-01-15 | Univerzální buněčný systém pro testování vstupu látek do jader |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ200475A3 (cs) |
-
2004
- 2004-01-15 CZ CZ200475A patent/CZ200475A3/cs not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ295047B6 (cs) | 2005-05-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7820434B2 (ja) | アルブミン遺伝子座からの導入遺伝子発現のための組成物及び方法 | |
| US20250115905A1 (en) | Methods of Rescuing Stop Codons via Genetic Reassignment with ACE-tRNA | |
| US9388425B2 (en) | Tunable genetic switch for regulating gene expression | |
| US12534711B2 (en) | Destabilising domains for conditionally stabilising a protein | |
| BR112020005323A2 (pt) | polinucleotídeos, composições e métodos para edição de genoma | |
| JP2025028917A (ja) | 核酸構築物及び使用方法 | |
| KR20200093635A (ko) | 변형된 폐쇄된 말단 dna (cedna)를 사용한 유전자 편집 | |
| KR20160122125A (ko) | 바이러스 벡터 생산 시스템 | |
| JP2009232862A (ja) | 治療および診断に使用する新規な特性をもたらしおよび／または該特性を現す組成物 | |
| JP2008200041A (ja) | モジュラートランスフェクション系 | |
| US20240200104A1 (en) | Ltr transposon compositions and methods | |
| KR102915369B1 (ko) | X-연관 연소 망막층간분리 치료법을 위한 crispr 및 aav 전략 | |
| KR20210151785A (ko) | 비바이러스성 dna 벡터 및 fviii 치료제 발현을 위한 이의 용도 | |
| KR20230003478A (ko) | 비-바이러스성 dna 벡터 및 고셰 치료제 발현을 위한 이의 용도 | |
| EP1470224B1 (en) | Molecular libraries | |
| Cohen et al. | Functional expression of rat GLUT 1 glucose transporter in Dictyostelium discoideum | |
| CN118632622A (zh) | 突变型肌纤蛋白疾病模型及其用途 | |
| CZ200475A3 (cs) | Univerzální buněčný systém pro testování vstupu látek do jader | |
| CN114729021B (zh) | 能破坏细胞的氨基酸序列及相关核苷酸序列和相关的应用 | |
| CN105968211B (zh) | 一种重组抗病毒蛋白及其制备方法和应用 | |
| RU2833486C1 (ru) | Стратегии crispr и aav для терапии х-сцепленного ювенильного ретиношизиса | |
| RU2811724C2 (ru) | РЕДАКТИРОВАНИЕ ГЕНОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОДИФИЦИРОВАННОЙ ДНК С ЗАМКНУТЫМИ КОНЦАМИ (зкДНК) | |
| JP2023150865A (ja) | 新規ポリペプチド及びその利用 | |
| AU2024338976A1 (en) | Transgenic mitochondrial delivery system | |
| WO2020020471A1 (en) | Ascl2-responsive reporters for labeling of intestinal stem cell activity |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20130115 |