CZ2005363A3 - Pouzití makarpinu ke klasifikaci bunek prutokovoucytometrií - Google Patents

Abstract

Resení se týká pouzití makarpinu jako supravitální sondy k merení prítomnosti a/nebo obsahu nukleových kyselin v suspenzích bunek analyzovaných na prutokových cytometrech a podobných analyzátorech. Intracelulární vazba makarpinu k nukleovým kyselinám umoznuje rozlisení erytrocytu, retikulocytu a leukocytu kostní drene a periferní krve u zvírat a lidí bez detekce exprese diferenciacních znaku. Umoznuje rozlisení jednotlivých stádií bunecného cyklu u bunek s neporusenou cytoplazmatickou membránou. Rozlisení muze být provedeno i na jednoduchých prutokových cytometrech vybavených excitacním zdrojem v modrozelené oblasti spektra. Makarpin je mozno pouzít jako supravitální fluorescencní sondu rovnez v kombinaci s beznými i méne tradicními fluorochromy pri soucasné mnohobarevné imunofenotypizacia kvantifikaci DNA na prutokovém cytometru. Metoda predstavuje rychlý, nedestruktivní diagnostický a separacní postup umoznující objektivne rozlisit a trídit jednotlivý typy zivocisných i rostlinnýchbunek.

Description

Oblast techniky '

Vynález se týká použití makarpinu ke klasifikaci buněk průtokovou cytometrií na základě supravitální identifikace a kvantifikace nukleových kyselin (DNA a/nebo RNA) jejich zviditelněním v nepermeabilizovaných buňkách, s možností paralelní imunofenotypizace. Vazba makarpinu k nukleovým kyselinám v intaktních buňkách umožňuje v řádu vteřin po jeho přidání rozlišení erytrocytů, retikulocytů a leukocytů kostní dřeně a periferní krve bez detekce exprese povrchových znaků při měření na standardních průtokových cytometrech vybavených excitačním zdrojem v modrozelené oblasti spektra (standardně o vlnové délce 488 nm) a třemi detektory fluorescence s běžnou soupravou emisních filtrů. Emisní spektrální charakteristika makarpinu vázaného k nukleovým kyselinám umožňuje současnou detekci fluorescence makarpinu vedle fluorescence některých běžných fluorochromů, např. isothiokyanátu fluoresceinu (FITC) na cytometrech s jedním zdrojem a dále allophycocyaninu (APC) a jeho tandemu s Cy7 (APC-Cy7) na cytometrech se dvěma zdroji (standardně 488, 633 nebo 635 nm) eventuelně Pacific Blue a Cascade Yellow při možnosti excitace ve fialové oblasti spektra (např. lasery o vlnové délce 405 nm). Vazebné a emisní vlastnosti makarpinu dále umožňují semikvantitativní stanovení obsahu DNA v intaktních buňkách.

Stav techniky

Průtoková cytometrie využívá princip rozptylu světla, excitace a emise fluorochromních molekul k získání víceparametrických dat z mikroskopických částic a buněk. Při této metodě jsou buňky hydrodynamicky soustředěny do tenkého proudu v kapiláře, kterou protékají vysokou rychlostí, přičemž jsou ozařovány monochromatickým koherentním zářením, nejlépe z laseru. Jedinečnost průtokové cytometrie spočívá v tom, že na rozdíl od spektrofotometrie, která měří sumární absorpci nebo transmisi, lze sjejí pomocí měřit fluorescenci každé částice nebo buňky zvlášť. Před vlastním měřením se na studovaný objekt může navázat fluorescenční barvivo, označované jako fluorescenční sonda nebo fluorescenční značka. Optické systémy průtokového cytometru a jeho funkce jsou známé a jsou popsány např. v US 6248^90 nebo US 2004/145725. Ozáříme-li fluorescenční barvivo studovaného objektu, který prochází cytometrem, světlem vhodné vlnové délky, dojde k jeho excitaci, tj. k přechodu elektronů na vyšší energetickou hladinu. Excitovaný stav je však nestabilní a elektrony se vzápětí vrací zpět do původního, základního stavu. Tento přechod bývá doprovázen uvolněním tepelné a světelné energie - fluorescence, jejíž vlnová délka závisí na hladině energetického přeskoku. Protože část energie se ztrácí ve formě tepla, má vyzářené světlo delší vlnovou délku, než původní excitační záření. Vhodně zvolenou kombinací filtrů lze pak obě záření oddělit a fluorescenci pomocí průtokového cytometru měřit. Intenzita fluorescence jednotlivých buněk pak odpovídá počtu struktur, které na sebe fluorescenční barvivo vážou. Rozptyl světla ve směru souběžném se směrem paprsku, vycházejícího ze zdroje světla, umožňuje hodnotit velikost buněk, rozptyl světla ve směru kolmém na paprsek je charakteristický pro granularitu (vnitřní strukturu) buněk.

Použití metody je velice všestranné, v biologii jde např. o stanovení obsahu jaderné DNA, určení ploidie, analýzu buněčného cyklu, studium genové exprese, počítání a určení typu krevních buněk, detekci a charakterizaci mikroorganismů, třídění požadovaných částic, atd.

Hlavními výhodami průtokové cytometrie jsou: jednoduchá příprava vzorků, velká rychlost analýz velkých souborů jednotlivých buněk nebo částic, nedestruktivnost, snadná detekce subpopulací částic a také relativně nízké finanční náklady na provedení analýzy jednoho vzorku.

Kvalitu výsledku, kromě výběru a přípravy vlastního pozorovaného objektu a optického systému, zásadně ovlivňuje volba fluorescenčního barviva. Je vhodné, aby se zvolená látka vázala specificky (nebarvila i jiné objekty) a kvantitativně (tj. množství navázaného barviva bylo přímo úměrné množství objektů). V současné době je známo mnoho druhů fluorescenčních barviv. Jako fluorescenční barviva se používají molekuly, obsahující konjugované dvojné vazby a volné elektronové páry, které lze snadno a koordinovaně excitovat a které se také rychle vracejí zpět na nižší energetickou hladinu. Jde o aromatické sloučeniny a aromatické heterocykly, zpravidla s více kondenzovanými kruhy, jejichž π-elektrony jsou delokalizovány v orbitalech nad a pod rovinou planární molekuly.

Jako fluorescenční barviva se používají fluoresceiny, rhodaminy, kumariny, pyreny, apod. Použití ethidium bromidu při výzkumu DNA popisuje například US 6^43151,

Λα použití při detekci vnitrobuněčných bakterií ve vzorcích krve US4pJ8|821. V US 6;í07^30 je pro barvení při výzkumu DNA použito barvivo Hoechst 33258. S výhodou se při cytometrii používají i kombinace známých nebo nových fluorescenčních barviv. Trojbarevné činidlo obsahující 7-aminoactinomycin D (7-AAD), fluoresceinizothiokynát (FITC) a phycoerythrin (PE) používané v trojbarevné cytometrii pro měření počtu CD4 pozitivních lymfocytů popisuje patentový dokument

Jako supravitální sondy se označují fluorochromy, které spontánně procházejí nepoškozenou cytoplazmatickou membránou buněk a v intracelulárním prostoru se po navázání na specifické struktury, například nukleové kyseliny, mění výtěžek jejich fluorescence a spektrální charakteristiky. Supravitálních sond lze využít ke kvalitativní a/nebo kvantitativní detekci např. obsahu nukleových kyselin v buňkách bez nutnosti opracování buněk fixačními a permeabilizačními činidly. Příkladem supravitálních sond na DNA jsou již dříve zmíněný Hoechst 33258 nebo LDS-751. Dosud nebyla popsána supravitální sonda, kterou by bylo možno použít na průtokových cytometrech s excitační vlnovou délkou přibližně 488 nm (v modrozelené oblasti spektra) a která by umožňovala (semi)kvantitativní určení obsahu nukleových kyselin jednotlivých buněk.

Makarpin (I) je benzo[c]fenanthridinový alkaloid (5,7-dimethoxy-13-rnethyl[1,3]benzodioxolo[5,6-c]-1,3-dioxolo[4,5-i]fenanthridin), který byl poprvé izolován Slavíkem z kořene rostlinného druhu Macleaya microcarpa v roce 1955 (Slavík, J., Slavíková, L., Collect. Czech. Chem. Commun. 20, 356 (1955). Později byl nalezen i v dalších druzích čeledi Papaveraceae. (Slavík, J., Slavíková, L., Appelt, J. Collect. Czech. Chem. Commun. 30, 887 (1965), Slavík, J., Collect. Czech. Chem. Commun. 26, 2933 (1961), Slavík, J., Hanuš, V., Slavíková, L., Collect. Czech. Chem. Commun. 56, 1116 (1991). Byla rovněž popsána úplná syntéza tohoto alkaloidu (Ishikawa

T.,Saito T., Ishii H. Tetrahedron 51, 8447 (1995). V německém patentu DE 3835632, bylo popsáno použití makarpinu pro značení nukleových kyselin při fluorescenční spektroskopii a mikroskopii.

(I)

Benzofenanthridinové alkaloidy tvoří početnou skupinu látek, které nacházejí uplatnění v mnoha farmaceutických oborech. Jejich antibakteriální a antifungální účinky popisuje například US 5^9^15. Způsob separace jednotlivých benzofenanthridinových alkaloidů z extraktu popisuje US sjl 33^81.

Předmět vynálezu

Bylo zjištěno, že ve směsích jaderných a bezjaderných buněk jako jsou periferní krev, biopsie kostní dřeně a obecně suspenze buněk připravené z výrazně prokrvených orgánů, umožňuje makarpin odlišení erytrocytů od leukocytů a dalších jaderných buněk při současné možnosti vícebarevné povrchové imunofenotypizace na průtokových cytometrech, vybavených jedním nebo více excitačními zdroji. Spektrální charakteristiky makarpinu vázaného na RNA a/nebo DNA navíc umožňují rozlišit erytrocyty, retikulocyty a leukocyty kostní dřeně a periferní krve bez detekce exprese povrchových znaků i na jednoduchých průtokových cytometrech vybavených jedním excitačním zdrojem o vlnové délce přibližně 488 nm.

Makarpin se ve vodném roztoku po přidání k suspenzi buněk váže i při velmi nízkých koncentracích na DNA a RNA obsažené v širokém spektru živých buněk. Fluorescence makarpinu je přibližně úměrná množství DNA, případně RNA a proto umožňuje jejich přibližné kvantitativní stanovení v živých intaktních buňkách. Nevyžaduje permeabilizaci buněk, jeho průnik do buněk je velmi rychlý, v řádu několika sekund a buňky v průběhu měření morfologicky nepoškozuje. Po Dřidání k suspenzi buněk se makarpin váže k nukleovým kyselinám, což lze využít k jejich zviditelnění při mikroskopické nebo průtokově cytometrické analýze. Může být použit samostatně jako barvivo na DNA a/nebo RNA nebo v kombinaci s dalšími barvivý - fluorescenčními značkami, které mají vhodné absorpční a/nebo emisní spektrum. Lze jej s výhodou kombinovat např. s Cascade Yellow, Pacific Blue, izothiokyanátem fluoresceinu (FITC) nebo allophycocyaninem (APC) a jeho tandemem s Cy7 (APC-Cy7).

Makarpin vyzařuje jasnou fluorescenci ve žluté až červené oblasti viditelného spektra, což umožňuje detekci jednotlivých buněk obsahujících nukleové kyseliny DNA a RNA. S výhodou jej lze použít k odlišení intaktních buněk obsahujících DNA nebo RNA od intaktních buněk, které signifikantní množství nukleových kyselin neobsahují, jako jsou např. trombocyty a savčí erytrocyty. Výhody makarpinu se v průtokové cytometrii projevují především při značení DNA a RNA ve smíšených populacích erytrocytů a leukocytů. Na rozdíl od většiny dosud používaných DNA sond není potřebná permeabilizace buněk, protože plazmatická membrána živé buňky je pro makarpin plně propustná.

Pomocí makarpinu lze průtokovou cytometrii na základě obsahu DNA v buňkách rozlišit tři fáze buněčného cyklu. V první fází (G0/G1) buňka obsahuje základní množství DNA, (2 sady chromosomu u diploidních buněk, jedna u haploidních), v druhé fázi (S) dochází k duplikaci genetické informace (syntéze DNA) aniž by se počet buněk měnil a na konci této fáze buňky obsahují dvojnásobné množství DNA (4 sady chromozomů u diploidních buněk, 2 sady u haploidních). Ve třetí fázi (G2/M) se množství DNA nejdříve udržuje na dvojnásobné hodnotě a pak dochází k rozdělení genetického materiálu - k mitóze, přičemž množství DNA v buňce klesne na základní úroveň (2 sady chromosomů u diploidních buněk, jedna u haploidních). Makarpin, díky svým spektrálním vlastnostem umožňuje tyto tři fáze buněčného cyklu jednoduchým způsobem kvalitativně (na úrovni mikroskopické) i kvantitativně (na úrovni průtokové cytometrie) rozlišit a stanovit. Situaci lze graficky znázornit počtem bodů, odpovídajících jednotlivým buňkám (osa y), které prošly měřící zónou cytometru v závislosti na intenzitě fluorescence v jednotlivých buňkách (osa x).

Makarpin lze s výhodou využít při automatizovaném testování a hodnocení velkého množství vzorků ve farmaceutickém průmyslu z hlediska účinků biologicky aktivních látek na průběh buněčného cyklu.

V kombinaci se zviditelněním běžných leukocytárních a erytrocytárních antigenů umožňuje fluorescence makarpinu klasifikaci a kvantifikaci leukocytů, nezralých erytrocytů a zralých erytrocytů na modelech anemie i u anemických pacientů.

Metodou dle vynálezu lze např. rozlišit CD45-pozitivní leukocyty s jasnou fluorescencí makarpinu od podskupin CD45 negativních krevních a krvetvorných buněk. Ve skupině CD45 negativních buněk fluorescence makarpinu rozlišuje makarpin pozitivní buňky obsahující RNA (retikulocyty) a makarpin negativní buňky (vyzrálé erytrocyty). Díky rozdílu emisních spekter makarpinu vázaného na RNA a makarpinu vázaného na DNA umožňuje vzájemné rozlišení buněk obsahujících DNA i RNA a buněk obsahujících pouze RNA i při měření na standardních průtokových cytometrech vybavených jedním laserem. Přítomnost jádra (DNA) má za důsledek celkově vyšší intenzitu fluorescence a její posuv do oblasti kratších vlnových délek, což se projevuje posuvem v FL2/FL3 diagramu při měření na uvedeném přístroji. Buňky neobsahující DNA se dají odlišit díky tomu, že nepřítomnost DNA má za následek celkově nižší emisi a relativně vyšší fluorescenci (FL) makarpinu v kanálu 3 (FL3) a tak i vyšší poměr intenzity FL3 proti FL2.

Při průtokové cytometrii pomocí přístrojů se dvěma a více excitačními zdroji je možné využít i kombinované fluorescence makarpinu vedle fluorescence dalších fluoroforů s vhodnými spektrálními vlastnostmi, jako jsou např. fluorescenční značky Pacific Blue, Cascade Yellow nebo APC a jeho tandemu APC-Cy7.

Při metodě simultánní imunofluorescence (zviditelnění pomocí protilátek vázaných k fluorochromům jako jsou isothiokyanát fluoresceinu a allophycocyanin) se nadbytek protilátky odstraní promytím a poté se nejméně 10 vteřin před měřením přidá makarpin v koncentraci 1 pg /10⁶ buněk.

Metoda je pro svoji rychlost a jednoduchost pracovního protokolu vhodná jako velmi rychlá, nedestruktivní diagnostická a separační metoda schopná objektivně rozlišit a třídit jednotlivé typy živočišných i rostlinných buněk.

Příklady provedení

Příklad 1

Stanovení obsahu DNA u intaktních buněk buněčné linie

Ke stanovení obsahu DNA u intaktních buněk linie MOLT-1 v exponenciální fázi růstu bylo použito 2x10⁴ buněk ve 100 pl značícího média (fosfátový pufr s 0,2 % hmot.

želatiny a 0,1 % hmot. azidu sodného, dále WSB), ke kterým bylo přidáno 10 pl makarpinu (100 pg/ml) po dobu 30 sec. Poté byl vzorek měřen na standardním průtokovém cytometru FACSCalibur (Becton Dickinson, La Jolla, USA) vybaveném modrým argonovým laserem (488 nm, 15 mW) a červeným polovodičovým laserem (633 nm, 20 mW) při nízké (LOW) rychlosti akvizice.

Obr. 1 - Dvojdimenzionální diagram rozptylu excitačního paprsku 488 nm v přímém směru (FSC) a v kolmém směru (SSC) pro všechny buňky,

Obr. 2 - FSC versus plocha píku fluorescence v kanálu FL2 (FL2-A) v lineární škále. Populace v jednotlivých fázích buněčného cyklu jsou označeny zkratkami fází.

Obr. 3 - FSC versus FL3-A v lineární škále. Z porovnání rozlišení v kanálech FL2 a FL3 vyplývá, že pro přesnější stanovení obsahu DNA je kanál FL2 vhodnější, protože kanál FL3 je citlivější k obsahu RNA. Poloha populací v jednotlivých fázích buněčného cyklu je vyznačena v Obr. 2.

Obr. 4 - Diagram FL2-A versus šířka píku (FL2-W) umožňující odlišení jednotlivých buněk v různých částech buněčného cyklu (oblast R1) od apoptotických buněk (oblast R2) a vícebuněčných případů (multipletů, oblast R3). Objekty v oblasti R1 mají charakter intaktních buněk (Obr. 5), zatímco objekty v R2 jsou menší, což odpovídá buňkám v apoptóze (Obr. 6).

Příklad 2

Určení poměrného zastoupení buněk podle obsahu nukleových kyselin, fází buněčného cyklu a přítomnosti povrchových antigenů na modelu krve anemických selat - identifikace jaderných buněk a retikulocytů. (V symbolických označeních, pokud nelze jinak, je pro stručnost místo termínu makarpin použito zkratky MA).

100 pl heparinizované (20 U/ml) krve ze selat se silnou anémií (desetinásobná redukce erytrocytů) bylo označeno fluoresceinem značenou myší anti-prasečí CD45 monoklonální protilátkou a poté bylo přidáno 10 μΙ makarpinu (100 pg/ml) po dobu 30 sec. Vzorek byl měřen na analyzátoru FACSCalibur.

Obr. 7 - Velikost (FSC) versus logaritmus (log) fluorescence makarpinu v kanálu FL2 (FL2-H). Kromě negativních buněk (populace I) lze odlišit buňky se slabou fluorescencí (populace II) a buňky jasně značené makarpinem (populace III).

Obr. 8 - Diagram exprese CD45 (FL1-H) versus makarpin (FL-2H) ukazuje možnost odlišit leukocyty (oblast R1; CD45⁺MA⁺) od buněk nepatřících k bílé řadě krvetvorby.

Oblasti R4 a R5 obsahují erytroidní prekurzory s vysokým (R4) a nižším (R5) obsahem RNA (CD45MA⁺), erytrocyty bez nukleových kyselin se nacházejí v oblasti R6 (CD45MA‘). Populaci v oblasti R1 lze dále rozdělit na mononukleární leukocyty s vyšší expresí CD45 a vyšší fluorescencí makarpinu (R3) a granulocyty (R2).

Obr. 9 - Porovnání intenzity fluorescence makarpinu v kanálech FL2 a FL3 ukazuje, že přítomnost DNA zvyšuje relativní intenzitu v kanále FL2, což se v uvedené reprezentaci projevuje posuvem populace leukocytů doprava. Proto je výhodnější u přístroje FACSCalibur a přístrojů s podobným vybavením měřit obsah DNA v kanálu FL2. U jiných cytometrických analyzátorů se optimální kanál může lišit podle použitého vybavení optickými a optoelektronickými elementy. Diagramy uvedené v dolní části obrázku (FSC versus SSC) ukazují rozptylové charakteristiky jednotlivých populací rozlišitelných na základě vazby anti-CD45 a makarpinu. Oblasti R2 a R3 na Obr. 8 odpovídají mononukleárním leukocytům (monocyty a lymfocyty, R3) s vyšší expresí CD45 a intenzivnější fluorescencí MA než je tomu u granulocytú (R2). Oblasti R4, R5 a R6 obsahují retikulocyty s různým obsahem RNA, zatímco makarpin negativní buňky v oblasti R6 jsou erytrocyty s nulovým obsahem nukleových kyselin.

Příklad 3

Určení poměrného zastoupení buněk podle množství nukleových kyselin, fází buněčného cyklu a přítomnosti povrchových antigenů na modelu lidské kostní dřeně identifikace jaderných buněk a retikulocytů

100 pl vzorku lidské kostní dřeně bylo označeno kombinací monoklonálních protilátek: anti-lidská CD45 konjugovaná s allophycocyaninem (anti-CD45-APC) a anti-lidská glycophorin-A konjugovaná s fluoresceinem (anti-GiphA-FITC). Poté bylo přidáno 10 pl makarpinu (100 pg/ml) po dobu 30 sec a vzorek byl analyzován na FACSCalibur se dvěma lasery (488nm a 633 nm).

Obr. 10 - FSC/SSC diagram ukazující reprezentaci všech analyzovaných buněk s převládající populací s rozptylem světla charakteristickým pro erytroidní řadu (kvůli přehlednosti je znázorněno pouze 2 000 objektů).

Obr. 11 - Exprese GlphA (FL1-H) a CD45 (FL4-H) rozlišuje CD45'GlphA⁺ erytroidní buňky od buněk bílé řady krvetvorby (CD45⁺GlphA). CD45⁺ populace se slabou fluorescencí v kanálu FL1 jsou buňky s rozptylem světla odpovídajícím eozinofilním granulocytům. Jsou označeny hvězdičkou a bez značení makarpinem není tato populace odlišitelná od ostatních GlphA- buněk. Z tohoto usuzujeme, že současné značení anti-CD45 a MA umožňuje odečíst relativní počty eozinofilů.

Obr. 12 - Diagram exprese CD45 a fluorescence makarpinu v kanálu FL2 (zobrazena je plocha píku). Je zřetelné, že jak mezi CD45⁺ leukocyty, tak i CD45^|OW prekurozory a CD45' buňkami erytroidní linie lze najít většinovou populaci s nižší fluorescencí makarpinu a menší část buněk emitujících větší množství světla do kanálu FL2. Spolu s nálezy na buněčných liniích (viz. příklad 1) tento rozdíl interpretujeme jako rozdíl v obsahu nukleových kyselin, především DNA. Je zřejmé, že základní úroveň fluorescence u bezjaderných erytrocytů je mnohem nižší, než u leukocytů obsahující normální množství DNA.

Obr. 13 - Histogram plochy píku intenzity fluorescence kanálu FL2 v lineární škále. Oblasti R vymezují populace s různými intenzitami emise: R1 - velmi nízká fluorescence vypovídající o žádném nebo velmi nízkém obsahu nukleových kyselin, R2 - střední intenzita fluorescence zhruba odpovídající diploidnímu obsahu DNA v jádře (N), R3 - vysoká intenzita fluorescence odpovídající obsahu DNA u buněk syntetizujících DNA a buněk v mitóze.

Obr. 14 až 16 - CD45 versus Glph A exprese na buňkách z oblastí R1 (Obr. 14), R2 (Obr. 15) a R3 (Obr. 16) histogramu (Obr. 13). Je zřejmé, že oblast R1 zahrnuje většinou erytroidní buňky (Obr. 14), většina leukocytů se naopak nachází v oblasti R2 (obr. 15). Mitoticky aktivní buňky (leukocyty i erytroidní prekursory) se nacházejí v oblasti R3 (Obr. 16). Rozptylové charakteristiky na Obr. 17 až Obr. 19 potvrzují příslušnost buněk z oblasti R1 k erytroidní řadě (srovnej Obr. 17 s Obr. 10), buněk z oblasti R2 k bílé řadě krvetvorby (na Obr. 18 je zobrazen typický profil rozptylu leukocytů krve nebo kostní dřeně). Obr. 19 znázorňuje, kde se v dvojdimensionálním diagramu nacházejí buňky v aktivní fázi buněčného cyklu (S-fáze, M-fáze).

Průmyslové využití

Použití makarpinu jako supravitální sondy k rychlému měření přítomnosti a obsahu nukleových kyselin a dalších víceparametrických dat na jednoduchých průtokových cytometrech u hromadných vzorků obsahujících suspendované buňky.

Makarpin lze s výhodou využít zejména při automatizovaném testování a hodnocení velkého množství vzorků ve farmaceutickém průmyslu z hlediska účinků biologicky aktivních látek na průběh buněčného cyklu.

Použití makarpinu je výhodné k určení poměrného zastoupení buněk podle množství nukleových kyselin, k určení jednotlivých fází buněčného cyklu a k identifikaci jaderných buněk a retikulocytů v kostní dřeni nebo v krvi bez nutnosti detekce povrchových antigenů.

Makarpin je použitelný jako supravitální fluorescenční sonda rovněž v kombinaci s dalšími fluorochromy při současné mnohobarevné imunofenotypizaci buněk.

Claims (3)

1. Použití makarpinu ke klasifikaci buněk průtokovou cytometrií supravitální identifikací a kvantifikací nukleových kyselin na cytometrech s excitačním zdrojem vyzařujícím v modrozelené oblasti spektra od 480 do 490 nm.

2. Použití makarpinu podle nároku 1,Vyznačující -s-e -H-mr-žé se buňky dále označí nejméně jedním dalším fluorochromem.

3. Použití makarpinu podle nároku 2, Vyznač uj-t-c-t—s-e—t-í m , že/ fluorochromem je sloučenina vybraná ze skupiny zahrnující isothiokyanát