JPH01320464A - 白血球の鑑別および測定のための方法および剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、全血中の白血球の鑑別および定量のための方
法および刑、およびフローサイトメトリー（ｆｌｏｗ　
ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）または鏡検にその刑を用いること
に関する。

白血球の血球学的計数および鑑別は、病院その他におい
て、一般的に、頻繁に行われる研究室的検査である。鑑
別血球数の確認は、次の有核血球の絶対数と％を測定す
ることより成る：リンパ球、単核球、中好性、塩基好性
および酸好性顆粒（０血）球およびそれらリンパ系およ
び骨髄系の前駆体。

鑑別血球数の確認には２つの異なる方法、すなわち、マ
ニュアル式方法および自動式方法が知られているが、マ
ニュアル式方法の方がよく用いられている。マニュアル
式方法では、血液塗抹標本をスライド上に調製し、乾燥
しそしてロマノウスキー染色（Ｒｏｌｌａｎｏｗｓｋｉ
ｓｔａｉｎｓ）で染色する６次いで細胞を検査し、分類
し、そして顕微鏡下に計数する。鑑別される細胞数は少
くとも１００　＠胞個である。

マニュアル式方法の欠点は、鑑別血球数の確認に長時間
（１０分間に及ぶこともあり得る）を要する点である。

この方法のもう一つの大きな欠点は、個々の生物種の分
布の信頼区間が広い点である。このことは、あまり多く
存在しない細胞、例えば単核球や酸好性および塩基好性
顆粒球などの場合に特にいえる、更に、それを用いた場
合、個々の細胞タイプの分布率（％）だけしか分らない
、絶対値を確認するにはすべての白血球を個別に計数す
る必要がある。

工別血球数の確認により最近用いられている自動式方法
は、フローサイトメトリーの原理に基づいている。ヨー
ロッパ公開明細書第１２１２６１号は、広角散乱光の関
数としての細胞容積から、リンパ球、単核球および顆粒
球の間の区別を可能とするこのタイプの白血球鑑別方法
を開示している。更に、これに関しては、２種類のイム
ノフルオレッセンス色素（フルオレラセンイソチオシア
ネートおよびファイコニリスリン）の添加についても記
載されているが、これは前記３つの集団以上にわたる鑑
別に寄与することはない。

ヨーロッパ公開明細書１６１７７０に同様に白血球鑑別
のためのフローサイトメトリー法が記載されているが、
この方法では、測定に先立ち、検体は赤血球を溶解しそ
して白血球画分を固定できる忍解剤で処理されている。

この場合においても、蛍光ｇ識抗体の添加後に、広角散
乱および一種以上の蛍光測定を用いて顆粒球、単核球お
よびリンパ球への鑑別がなされているが、この方法も、
３種類の細胞タイプしか鑑別し得ないという欠点の他に
、実際のフローサイトメトリーが全部で４０分におよぶ
インキュベーション時間および２回の遠心分離を経なけ
ればならないという欠点を有する。

本発明の目的は、既知の方法の欠点がなく、かつ、遠心
分離を伴うことなく極めて短時間でしかも高い精度で５
種類の白血球集団の信頼性ある鑑別を行うことができる
全血中白血球の鑑別および定量測定のための方法および
刑を提供することにある。

本発明は、フローサイトメトリーを用いて、細胞容積、
散乱光および蛍光を測定することにより全血中白血球の
鑑別および定量測定を行う方法を提供するものであって
、この方法は、赤血球を溶解し白血球を固定する活性組
成物で全血を処理し、そしてチアゾール類およびアミノ
キサンテン類より成る群から選ばれた少くとも２種類の
蛍光色素の混合物と混合し、染色された細胞をある波長
で励起し、少くとも２種類の異なる波長範囲における蛍
光発光の相対強度を同時測定し、そして前方および広角
の散乱光を測定することを特徴とする。

更に本発明は、この方法を行うための刑として、溶解作
用および固定作用を有する活性組成物と発色試薬とを含
有する刑を提供するものである。この活性組成物は本質
的にサポニンと低級アルデヒドを含有し、また前記の呈
色試薬はチアゾール類およびアミノキサンテン類の群の
各々より選ばれた少くとも１種類の色素を含有する。上
記の白血球の鑑別および定量測定のたメツ刑は、フロー
サイトメーター（ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏ−ｉｅｔｅｒ　）
を用いる自動式方法、および蛍光顕微鏡を用いるマニュ
アル式方法のいずれにも使用することができる。

本発明方法を用いれば、白血球を、リンパ球、単核球、
中野性、酸好性および塩基好性顆粒球、および骨髄系お
よびリンパ球系の前駆体の群に鑑別することができる。

全細胞量中の各個別集団の割合を測定できるほかに、そ
れによって血液１μｍあたりの細胞の絶対数を測定する
ことができる。

本発明の方法は、フローサイトメトリーによる測定に基
づいて行われる。白血球を固定し染色すると同時に赤血
球を溶解後、前方および広角散乱光、２種類の蛍光パラ
メータおよび細胞容積といったパラメータを測定する。

驚くべきことに、細胞を唯一の波長範囲でしかも極めて
狭い波長範囲で照射でき、また前方および広角散乱光を
介してすべての白血球を予め選択した後、後者を二次元
ヒストグラム（蛍光１対蛍光２）で鑑別することにより
容易に前述の諸群に分けることを可能にする色素組合せ
を見出すことができな。

その色素組合せはチアゾール類およびアミノキサンテン
類の群の少くとも２Ｎ類の蛍光色素より成る。適当なチ
アゾール色素の例はチオフラビンＴＣＮ　　（Ｃ，１，
４９００５）、チオフラビンＳ、プリムリン（Ｃ，１，
４９０００）、好ましくはチオフラビンＴＣＮである。

適当なアミノキサンテン色素の例はサフラニリン、ベー
シックレッド８（Ｃ，１゜４５１５０）、ベーシックレ
ッド１（Ｃ，１，４５１６０）、アシッドバイオレット
９　（Ｃ，１，４５１９０）、ベーシックレッド３　（
Ｃ，１，４５２１０）、アシッドレッド５２（Ｃ，１，
４５１００）、ビロニンＢ　（Ｃ，１，４５０１０）、
ビロニンＧ　（Ｃ，１，４５００５）、好ましくはサフ
ラニリンである。

それら２群からの色素は１：２〜２：１、好ましくはｌ
：１、の割合で用いられ、また色素混合物の濃度は０．
６〜６０μｇ／’ｊ、好ましくは２０〜４０μｇ／ｊ　
　（溶液）、の範囲とすべきである１色素溶液は好まし
くは更に５０〜１００ｉＨの緩衝剤を、そして適切な場
合には２０〜１００１１８の塩化ナトリウムを含有する
。そのｌ）Ｈは適当な酸またはアルカリを用いて、中性
〜弱酸性ｐＨ１好ましくは７．５のＤＨ５に調整される
。

赤血球を溶解し白血球を固定する働きをする前記の活性
組成物は低級アルデヒド、好ましくはホルムアルデヒド
、サポニン、好ましくはジギトニン、とｐＨを５〜８．
５の範囲に保つための等張Ｍ１衝剤の基礎として適切な
Ｍ？ＩＩ′！ＩＪ質、好ましくはトリス緩衝剤とを含有
する。類似の前処理試薬は、例えばヨーロッパ公開明細
書第１６１７７０号に開示されている。

本発明方法は、血液細胞の一定の性質を色素により染色
しそして細胞の大きさに相関させて測定することに基づ
いている。フローサイトメトリーによる測定の場合には
、それら細胞を前処理後染色し、検体アプリケータを介
して被包ストリーム（［ＩＶＣｉｌＯＤｉｎ（ｌ　Ｓｔ
ｒｅａｌｍ）中に通し、後者により中心に据え（ｃｅｎ
ｔｅｒｅｄ　）　、レンズの下に通し、それら細胞をレ
ンズを順次通過させながら例えばレーザー光で照射し励
起して蛍光を出させる。このようにして多数の細胞を短
時間で測定することができる。レーザービーム照射によ
り染色細胞から発光する蛍光は２つのスペクトル部分に
分割された後、光電子倍増管により検出され適宜の電流
に変換される。同様に広角散乱光も記録される。前方散
乱光は光ダイオードを用いて定量される。このようにし
て得られた信号は、ディジタル変換されコンピュータに
ディジタル記憶される。それらは、１−および２−パラ
メータヒストグラムとしてアレンジされる。これら４つ
のパラメータを様々に組み合わせることによって血球集
団の十分に離間したクラスタを得ることができる。

１次元ヒストグラムでは極めてわずがな細胞分離しか起
きないが、２つのパラメータを組み合わせることにより
相関２−パラメータヒストグラムが得られ、クラスタの
明瞭な分割が認められる。しかしながら異なる集団の明
確な分離がこれによって可能とはなるが、多大な困雛を
伴う０重複頭域での２集団への分別は達成し得ても多大
な数学的処理を必要とし、また大きな不確定要因を伴う
、更に、これら１次元ヒストグラムに基づく分割は最大
３集団（リンパ球、単核球および顆粒球）に対して確実
に行われるにすぎない。

第１図のヒストグラムが示すように、本発明方法によれ
ば、同時および相関測定により、そして１個の同じ細胞
からの２つの蛍光発光（緑色および赤色蛍光）を同時に
記録することにより、大きな数学的処理を伴うことなく
５集団への分離を達成することができる。そこには６個
の点クラスタが極めて明白であり、また異なる白血球集
団を表わしている。第１図は前処理され蛍光染色された
全血の緑色蛍光（ｙ）を赤色蛍光（ｘ）に対しプロット
した２次元ヒストグラムを示す、第２図は第１図に示さ
れたヒストグラムにおける各種白血球クラスタの位置を
示す、ＬｌおよびＬ２により同定される集団はリンパ球
を表わす、集団Ｂは塩基好性顆粒球を表わす、集団Ｍは
単核球を表わす、中野性顆粒球は集団Ｎそして酸好球は
集団Ｅに認められる。

これら６集団への分割は、大きな数学的処理を必要とす
ることなく、単に検査操作を行うだけで明瞭にされる。

それら集団の確認はクラスタ分析により自動化すること
ができる。更にこれは血液固体差により生じる限界を変
えるということをももたらす、より小さな血球：例えば
赤血球や血小板は、前方散乱光のゲーティング（ｇａｔ
ｉｎｇ）によって除去される、すなわち、緑色および赤
色の蛍光は、前方散乱光がある大きさを超える細胞から
のみ記録される。白血球鑑別のほか、このようにすれば
検体の単位容量あたりのこれら細胞の厳密な数も得られ
る。

鑑別血球数確認のためのこの自動化されたバージョンの
ほか、本発明によればこの染色および前処理法は、鑑別
血球数定量用の鏡検用標本の調製にも適している。

本発明による刑を用いて、前処理および染色を行った後
の様々な白血球の特徴的性質は以下の如く述べることが
できる： 中野性顆粒球：成熟中好性細胞は主にスペクトルにより
同定できる。核は強い緑色蛍光を有し、またその顕著な
分離（ｓｅｇｎｅｎｔａｔ　１ｏｎ）が極めて明白であ
る。細胞質は淡橙色蛍光を有する。

その緑色および赤色の蛍光の両者の強度は、他のすべて
の細胞のそれよりも大きい、このタイプの細胞のもう一
つの特徴は、細胞質が顕著に顆粒化し、黄色蛍光を有す
る極めて多くの微粒子を有している点である。

酸好性顆粒球：これらを特徴付ける球状核の有する緑色
蛍光はそのふち部が細胞質との強い緑色境界となってい
る。ＨＪ胞質は強い橙色を発しまた完全に均質である。

細胞質には強い黄色蛍光をもった顆粒が認められる。

塩基好性顆粒球：これらは、三葉の形または不規則に分
離した、そして明るい緑色蛍光を有する核をもつ、細胞
質の基本色は橙色である。

強い濃橙色光を発し、そして細胞質とは明らかに異なる
顆粒は、特に細胞のふち、およびセグメント間の間隙に
存在する。

単核球：それらは、淡緑色蛍光を有する凹所のある“分
葉核を持つ、核のふちの蛍光は極めて強い、＋ｄＢ胞質
の蛍光は顆粒球のそれよりも弱くまたリンパ球のそれよ
りは黄色〜橙色が強い。

リンパ球：それらは、弱緑色蛍光を有する丸いまたは腎
臓形の核を持つ、核内に時として核小体が存在する。細
胞質は通常黄橙色蛍光を有する狭い境界としてしかみえ
ない。

本発明方法は一般的には、次のようにして行われる。ま
ず、溶解および固定の作用を有する活性組成物（前処理
ン容液）および発色試薬溶液を調製する。フローサイト
メトリーによる方法の実施にあたっては、例えば５０μ
」の血液を試験管に入れ、そして５０μｍの前処理試薬
をピペットで入れる。血液と前処理試薬の容量比は２：
１〜１：２とすべきである。その溶液を緩やかに攪拌し
ながら５〜１２０秒間インキュベートし、５００μｍの
緩衝剤を混合物に添加し、そして振盪する４次に振盪し
ながら１００μ」の発色試薬溶液を添加する。その溶液
を更に５〜１２０秒間インキュベートした後それを測定
する。この為に、それをフローサイトメーターに送るが
、そのフローサイトメーターの被包ストリームはｐＨ範
囲７〜８の緩衝剤より成る。照射は５１５ｎｌ以下の波
長で行い、そして蛍光発光は５００〜５５０および５７
０〜６３０ｎｎの範囲で測定する。

蛍光顕微鏡による方法を行うには、血液１滴を前処理試
薬１滴とスライド上で混合する。約１０秒間のインキュ
ベーション後、発色試薬溶液を直接添加する。標本にカ
バーグラスをかぶせた後、励起波長＜５００　ｎＩＩお
よび発行波長〉５００ｎｌにて蛍光顕微鏡で検査するこ
とができる。

被検血液検体としては新鮮な静脈血、濃縮白血球（密度
勾配沈降）または毛細血管血等の様々な給源に由来する
ものがあげられる。その血液には、凝血防止剤として、
ヘパリン、ＥＤＴＡまたはクエン酸塩を添加することが
できるが、凝血防止剤としてＥＤＴＡを含む血液を用い
るのが好ましい。

本発明方法は、上述した長所すなわち、迅速さ、高精度
、５つの白血球集団の鑑別等のほかに、フローサイトメ
ーターで得られるデータが反応温度および前処理または
染色時間の変化に対し低い感度を示すという長所をも有
する。

また、あまり新鮮でない血液、すなわち、２４〜３６時
間令までの血液を用いることができる。

さらに一つの長所は、蛍光顕微鏡下の細胞の蛍光パター
ンを従来の染色法［例えば透過光下のライト染色（Ｗｒ
ｉｇｈｔ　５ｔａｉｎ）　］と直接比較できる点、すな
わち従来用いられているマニュアル式の方法との比較が
容易であるという点である。

実施例１ 静脈ＥＤＴ＾血１部全１部組成を有する前処理溶液１部
と混合する。

１、ホルマリン（３７％）　　　２００　ｍｅ２、ジギ
トニン　　　　　　２０　ｇ ３、トリス１ｉｌＩ衡剤　　　　　５０　ｎｍｏ１４、
二重蒸留水ａｄ、　　　　　　１オ（）ＩＣｊ″ｉ：ｐ
Ｈ＝７．５とする）検体を混合して２０秒間インキュベ
ートする。

次に５００μｍの５０ｎＨトリス緩衝剤（ｐＨ７，５）
を添加する。その混合物を攪拌後染色溶液ＡおよびＢを
各々５０μｍ添加する： 溶　液Ａ： １、サフラニリン　　　　　５０■ ２、トリスｔ！ＩＩ衝剤　　　　５０　ｎｎｏ１３、塩
化ナトリウム　　　１００１１１０＋４、二重蒸留水ａ
ｄ、　　　　　Ｉ　Ｊｌ（ｐＨ＝７．５　、ＨＣＪＩを
用いる）溶　液Ｂ： １、チオフラビンＴＣＮ　　　１００■２、トリス緩衝
剤　　　　　５０　ｍｎｏ１３、塩化ナトリウム　　　
１００１１１０１４、二重蒸留水ａｄ、　　　　　Ｉ　
Ｊ（１１Ｈ＝７．５　、ＨＣｊを用いる）その混合物を
再び撹拌し、そして検体をフローサイトメーターに通し
た。細胞を４８８　ｒ＋ｎの波長で照射し、そしてそれ
によって誘出された蛍光を５００〜５５０の範囲および
５７０〜６３０ｎ！ｌの範囲で測定する。更に、細胞が
流通する際に生じる前方散乱光および広角散乱光（９０
°）の強度も記録する。ｆｌ！！の３つの信号は前方散
乱光のおよび／または９０°散乱光の信号によりトリガ
ーされる、すなわち、前方散乱光の信号がある程度の強
度を超える場合にのみ、９０’散乱光および蛍光■およ
び蛍光■の値も記録する。

蛍光Ｉおよび■の相開から得られる二次元ヒストグラム
を記録する。蛍光■信号の強度をＸ方向にプロットし、
そして蛍光■信号の強度をｙ方向にプロットし、一方、
蛍光工および蛍光■信号の特定の強度組合せを有する細
胞数を２方向に示す、第３図は得られる２次元ヒストグ
ラムおよび関連の１次元ヒストグラムを示す。

この図から明らかなように、ヒストグラムには２つの顕
著な領域が存在する：第１の領域は高い蛍光工および蛍
光■強度を示す細胞であり、そして第２の領域は低い蛍
光Ｉおよび蛍光■強度を有する細胞である。生物学的関
連細胞集団の２次元ヒストグラムの個々のクラスタへの
割当ては第３図から明らかである。

実施例２ 静脈ＥＤＴＡ血１滴全１滴鏡スライドに置きそして前処
理試薬１滴と混合する。

前処理試薬は次の組成を有する： ■、サポニン　　　　　　　　０．７５ｇ２、ホルムア
ルデヒド（３７％）　５−３、燐酸水素二ナトリウム　
　０，３ｇ４、燐酸二水素ナトリウム　　０．４５ｇ５
．二重蒸留水ａｄ、　　　　　　１００ｗ＋１１０秒経
過後、この混合物を以下の組成を有する染色試薬１滴と
混合する： １、チオフラビンＴＣＮ　　　　２５０■２、サフラニ
リン　　　　　２５０　Ｎｚ３、トリスＭ衝剤　　　　
　　５０１ｎｏ１４、二重蒸留水ａｄ、　　　　　　１
　ｊその溶液を７．５の１）１１に調節する。

この実施例において、染色された懸濁細胞は、青色光で
照射し、そして蛍光票微鏡で５００　ｎｉ以上の発光を
観察したところ、各種白血球の特徴的性質として記述し
たものと同じ光学的性質を示す。

チオフラビンＴＣＮおよびサフラニリンに代えてプリム
リンおよびベーシックレッド８を用いても同様の結果が
得られる。

実施例３ フローサイトメーターで得られたデータと、顕微鏡を用
いての対応実験で得られたデータとの相関 被験者２５０名からのＥＤＴＡ血液を各々実施例１およ
び２と同様にして、顕微鏡下にマニュアル的に鑑別し、
またフローサイトメーターで測定し、そして前述の集団
限界に基づいて、リンパ球、単核球、中野性、酸好性お
よび塩基好性顆粒の量を測定する。そのデータをＢａｂ
ｌｏｋ　−ＰＰａ５−１ｎ法により相関させた。関連統
計値は比較方法間に明らかな相関を示す。

実施例４ フロー血球計算器による単離されたリンパ球集団の測定 純度〉９５％のリンパ球を簸別（ｅｌｕｔｒｉａｔｉｏ
ｎ）によりＥＤＴＡ全血から単離する。リンパ球集団の
純度はＰＡＮリンパ球抗体による抗体染色により実証す
る。単離後、５０μｍの細胞懸濁液（約５＾１０’細胞
個／−）を次の組成を有する５０ｇｊの前処理試薬と混
合する： １、ジギトニン　　　　　　　５ｇ ２、ホルマリン（３７％）７５αに ３、トリスｔＩｔ衝剤　　　　　１００　ｉｍｏ１４、
二重蒸留水ａｄ、　　　　　　１　ｊ（ｐＨ＝　８．０
） １０秒間インキュベーション後、その懸濁液を５００μ
」のトリス緩衡剤（ｐＨ７，５）と混合する。

更に１０秒間インキュベーション後、次の組成を有する
発色試薬溶液を添加する。

１、サフラニリン　　　　　５００１１Ｉｒ２、チオフ
ラビンＴＣＮ　　　　５００■３、トリスｋｌｉ街刑　
　　　　１００　ｖｉｏ１４、塩化ナトリウム　　　　
２０　ｍｍｏ１５、二重蒸留水ａｄ、　　　　　　ｉ　
Ｊ（ｌ］ｌ＋＝７．５　、塩酸使用） それら２つの溶液を混合後、染色されたリンパ球集団を
フローサイトメーターに通す、実施例１と同様にして、
前方散乱光、９０’散乱光、蛍光Ｉおよび蛍光■を測定
する。蛍光工を蛍光■に対してプロットした２次元ヒス
トグラムには単一の細胞集団のみ認められる。ヒストグ
ラムにおける相対位置はリンパ球として既に前述された
集団と同じである。

実施例５ 酸好性顆粒球の分類 ５０μｍの細胞を実施例２と同様に測定を行うため前処
理し、染色しそしてフローサイトメーターに通す、前方
散乱光によるトリガリングの後細胞の蛍光■および蛍光
■を測定する。酸好性顆粒球に属するクラスタ領域をマ
ークする。

次いで、このようにしてマークされた領域に入る細胞を
残りの細胞からとり出すことができる。

このようにして得られた細胞をスライドにのせ、展延し
、そして空気乾燥する０次にそれら細胞を処理してフロ
ーサイトメーター染色からの色素残分を除去する。それ
らをまず蒸留水で１分間処理し次いで酢酸ナトリウムＭ
衝剤、ＤＨ５、で５分間蒸留する９次いでＧｉｅｎｓａ
ｙＸ液の１：１０希釈液を用いてａｒｅｎｓａ染色を行
う。

約８〜１０分間の染色時間が最適であることがわかる。

アルコール中に各々１５秒間２５．７０．８０および９
０から１００％まで順次増加させながら浸漬することに
より染色標本から水分を除去する。

それらスライドを次にキシレン中に３０分間移した後カ
バーをかぶせる。

分類により得られた染色スライドを蛍光顕微鏡下に検査
した後細胞を写真撮影する。他のいかなる細胞タイプも
混入していない均質な酸好性細胞集団が得られる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明方法の一実施例により前処理された蛍
光染色されな全血例の緑色蛍光（ｙ）を赤色蛍光（ｘ）
に対しプロットした２次元ヒストグラムを示す。 第２図は、第１図に示されたヒストグラムにおける各種
白血球のクラスタの位置を示す。 第３図は、本発明により得られる２次元ヒストグラムお
よび関連の１次元ヒストグラムの例を示す。 第　　１　　図 第　　２　　　図 ム 箒３図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）フローサイトメトリーを用いて細胞容積、散乱光お
   よび蛍光を測定することにより全血中白血球の鑑別およ
   び定量測定を行う方法であつて、赤血球を溶解し、白血
   球を固定する活性組成物を用いて全血を処理し、そして
   チアゾール類およびアミノキサンテン類より成る群から
   選ばれた少くとも２種類の蛍光色素の混合物と混合し、
   染色細胞をある波長で励起し、少くとも２種類の異なる
   波長範囲における蛍光発光の相対強度を同時測定し、そ
   して前方および広角の散乱光を測定することを特徴とす
   る前記方法。 ２）前記の溶解作用および固定作用を有する活性組成物
   と発色試薬とを含有する請求項１記載の方法を行うため
   の剤。 ３）前記の溶解作用および固定作用を有する活性組成物
   が、サポニンと低級アルデヒドを含有し、そして前記の
   発色試薬が、チアゾール類およびアミノキサンテン類の
   群の各々より選ばれた少くとも１つの色素を含有する請
   求項２記載の剤。 ４）フローサイトメトリーまたは鏡検により、全血中の
   白血球の鑑別および定量測定を行うための請求項２およ
   び３記載の剤。