CZ2006505A3 - Polymerní konjugáty doxorubicinu s pH-rízeným uvolnováním léciva a zpusob jejich prípravy - Google Patents
Polymerní konjugáty doxorubicinu s pH-rízeným uvolnováním léciva a zpusob jejich prípravy Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2006505A3 CZ2006505A3 CZ20060505A CZ2006505A CZ2006505A3 CZ 2006505 A3 CZ2006505 A3 CZ 2006505A3 CZ 20060505 A CZ20060505 A CZ 20060505A CZ 2006505 A CZ2006505 A CZ 2006505A CZ 2006505 A3 CZ2006505 A3 CZ 2006505A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- doxorubicin
- hpma
- reaction
- polymer
- dox
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/58—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. poly[meth]acrylate, polyacrylamide, polystyrene, polyvinylpyrrolidone, polyvinylalcohol or polystyrene sulfonic acid resin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
Polymerní kancerostatické lécivo, které je ve forme konjugátu kopolymeru N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu (HPMA) s doxorubicinem, vázaným na polymerprostrednictvím spojek obsahujících hydrolyticky štepitelné hydrazonové vazby vzorce I, kde SP.sub.1.n. predstavuje aminoacylovou spojku, x = 40 až 335, y = 1 až 25, sestávající z 90 až 99,5 % mol. jednotek HPMA a 10 až 0,5 % mol. komonomerních jednotek obsahujících doxorubicin. Konjugát se pripravuje prímou kopolymerací monomeru obsahujícího doxorubicin vzorce II s HPMA.
Description
Oblast techniky
Vynález se týká nového způsobu přípravy vodorozpustných polymerních kancerostatik umožňujících cílený transport a řízené uvolňování cytostatik v organizmu, preferenčně v nádorové tkáni a nádorových buňkách. Polymerní kancerostatika jsou připravována přímo kopolymerizací s monomerem obsahujícím ve své struktuře kancerostatikum. Použití polymerních konjugátů je zaměřeno na cílenou terapii nádorových onemocnění v humánní medicíně.
Dosavadní stav techniky
U nových farmakologicky účinných látek, nevyjímaje kancerostatika, se jejich vývoj stále více zaměřuje na nové formy, které umožňují specifické působení aktivního léčiva pouze v určité tkáni a nebo dokonce jen v určitém typu buněk. Cíleně působící léčiva nalézají uplatnění především v oblastech, kdy vedlejší účinky aktivní složky mohou vést k poškození zdravých částí organizmu. Při přípravě cíleně působících látek se stále více uplatňuje použití makromolekul polymerů, a to přírodních nebo syntetických. V minulosti bylo připraveno a studováno velké množství polymerních konjugátů kancerostatik a bylo prokázáno, že ve většině případů je nezbytné pro dosažení farmakologické účinnosti polymerní formy léčiva zajistit uvolnění původní nízkomolekulámí cytotoxické látky z její polymerní formy. Připojení cytostatika k vodorozpustnému polymeru chemickou vazbou umožňuje ovšem také zásadním způsobem zvýšit rozpustnost nerozpustných nebo málo rozpustných léčiv a výrazně snížit jejich toxicitu. V neposlední řadě vyšší molekulová hmotnost polymerů zabraňuje rychlému vyloučení léčiva z organizmu glomerulámí filtrací, a tím zajišťuje prodlouženou dobu cirkulace v krvi a setrvání v organizmu a tím i větší biologickou využitelnost léčiva. Uvolnění cytostatika z polymerního nosiče může být s výhodou vyřešeno prostřednictvím biodegradovatelné spojky, použité k napojení léčiva na polymer, jejíž degradace v cílové tkáni vede k cílenému a řízenému uvolnění léčiva v této tkáni. Významnou skupinu výše popsaných léčiv tvoří polymerní léčiva připravená na bázi kopolymerů V-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu (HPMA). Přehled doposud dosažených « ?
i } i S i > » » i > * > * i i 9 }
- 2'—výsledků v této oblasti je velmi dobře zpracován v publikaci G.S. Kwona a práci J. Kopečka a spol. [Kopeček a kol. 2000, Kwon 2005]. V poslední době byly publikovány práce o přípravě a působení polymemích léčiv, ve kterých bylo kancerostatikum doxorubicin navázáno na polymerní nosič, připravený na bázi kopolymerů HPMA, prostřednictvím hydrolyticky nestálé hydrazonové vazby [Etrych a kol. 2001 a 2002, Říhová a kol. 2001, Ulbrich a kol. 2003, 2004a, 2004b] a tyto látky byly patentovány [Ulbrich a kol.]. Popsaná léčiva vykazovala podstatné snížení vedlejších, především toxických účinků na organizmus za současného výrazného zvýšení protinádorového účinku ve srovnání s běžně užívanými nízkomolekulámími cytostatiky [Říhová a kol. 2001, Kovář a kol. 2004, Hovorka a kol. 2002].
Syntéza takovýchto konjugátů byla prováděna nejdříve polymeranalogickou reakcí polymemích 4-nitrofenylových esterů (ONp) s hydrazinem a později kopolymerizací HPMA s A-Boc (terc- butyloxykarbonyl) skupinou chráněnými methakryloylovanými hydrazidy. V pozdější době byla vyvinuta nová metoda přípravy polymemích konjugátů spočívající v přípravě monomeru 6_ (methakryloylamino)hexanoylhydrazinu ajeho kopolymerizací s HPMA. Tato metoda znamenala významný pokrok v syntéze a poskytla možnost přesně řídit molekulové hmotnosti polymemích prekurzoru a konečného produktu [Etrych patent]. Ve všech zmíněných postupech bylo léčivo navázáno na polymerní prekurzor obsahující volné hydrazidové skupiny polymeranalogickou reakcí.
Předmětem tohoto vynálezu je nový způsob přípravy polymemích cytostatik na bázi kopolymerů HPMA s doxorubicinem vázaným pH-labilní hydrazonovou vazbou k polymemímu nosiči. Námi navrhovaný postup přípravy umožňuje zabudování léčiva do struktury polymemího konjugátu přímo kopolymerizací HPMA s monomerem obsahujícím doxorubicin připojený k polymerizovatelné skupině hydrazonovou vazbou přes spojku (spacer), tedy bez nezbytnosti následné reakce vazby léčiva na polymerní prekurzor. Použití zmíněného monomem při syntéze umožňuje přípravu polymemích konjugátů o přesně dané struktuře polymemího řetězce obsahujícího pouze monomerní jednotky HPMA a monomerní jednotky nesoucí hydrazonové navázané léčivo.
í ‘ ΐ » i i iii ? i * 9 í *
1 » » >
a 3 i » J i
Literatura:
Etrych, T., Jelínková, M., Říhová, B. and Ulbrich K., New HPMA copolymers containing doxorubicin bound via pH sensitive linkage. Synthesis, in vitro and in vivo biological properties.
J. Controlled Release 73, 89-102 (2001).
T. Etrych, P. Chytil, M. Jelínková, B. Říhová, K. Ulbrich, Synthesis of HPMA Copolymers Containing Doxorubicin Bound via a Hydrazone Linkage. Effect of Spacer on Drug Release and in vitro Cytotoxicity. Macromolecular Biosci. 2, 43-52 (2002)
Etrych T., Chytil P., Pechar M., Studenovský M., Říhová B., Ulbrich K.: Způsob přípravy polymerních konjugátů doxorubicinu s pH-řízeným uvolňováním léčiva, CZPV 2005-558
O. Hovorka, T. Etrych, M. Šubr, J. Strohalm, K. Ulbrich, B. Říhová, Differences in the Intracellular Fate of Free and Polymer-Bound Doxorubicin. J. Controlled Release 80, 101-117 (2002)
J. Kopeček, P. Kopečková, T. Minko, Z. Lu, HPMA Copolymer-Anticancer Drug Conjugates: Design, Activity, and Mechanism of Action. Europ. J. Pharm. Biopharm. 50, 61 - 81 (2000)
M. Kovář, L.Kovář, V. Šubr, T. Etrych, K. Ulbrich, T. Mrkvan, J. Loucká and B.Říhová, HPMA Copolymers Containing Doxorubicin Bound by Proteolytically oř Hydrolytically Cleavable Bond: Comparison of Biological Properties In Vitro. J. Controlled Release 99,301-314 (2004)
G.S. Kwon, Polymeric Drug Delivery Systems, Series: Drugs and the Pharmaceutical Sciences, Vol. 148, Dekker, Marcel Incorporated, 2005
B. Říhová, T. Etrych, M. Pechar, M. Jelínková, M. Šťastný, O. Hovorka, M. Kovář, K. Ulbrich, Doxorubicin Bound to a HPMA Copolymer Carrier Through Hydrazone Bond is Effective also in a Cancer Cell Line with a Limited Content of Lysosomes. J. Controlled Release 74, 225-232 (2001) * :·
3 *
Κ. Ulbrich, V. Šubr, J. Strohalm, D. Plocová, M. Jelínková, B. Říhová, Polymeric Drugs Based on Conjugates of Synthetic and Natural Macromolecules I. Synthesis and Physico-chemical Characterisation. J. ControlledRel. 64, 63-79(2000)
K. Ulbrich, T. Etrych, P. Chytil, M. Jelínková, B. Říhová, HPMA Copolymers with pHControlled Release of Doxorubicin. In vitro Cytotoxicity and in vivo Antitumor Activity. J. Controlled Release 87, 33-47 (2003)
K. Ulbrich, T. Etrych, P. Chytil, M. Jelínková, B. Říhová, Antibody-Targeted PolymerDoxorubicin Conjugates with pH-Controlled Activation, J. Drug Targeting 12(8) (2004) 477489]. (A)
K. Ulbrich, V. Šubr, Polymeric Anticancer Drugs with pH-Controlled Activation, Adv. Drug DeliveryRev. 56/7, 1025-1052 (2004) (B)
K. Ulbrich, T. Etrych, B. Říhová, M. Jelínková, M. Kovář: pH Senzitivní polymemí konjugáty antracyklinového kancerostatika pro cílenou terapii. CZ 293787, CZ 293886
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je postup přípravy polymemího konjugátu HPMA kopolymerů s doxorubicinem vázaným na polymer prostřednictvím různých spojek obsahujících hydrolyticky štěpítelné hydrazonové vazby. Postup přípravy vychází ze dvoustupňové syntézy sestávající ze syntézy monomerů, a to HPMA a methakryloylovaných derivátů aminokyselin a oligopeptidů zakončených hydrazonovou vazbou připojeným doxorubicinem, a přímé syntézy polymerních konjugátů kopolymerizací s uvedeným monomerem obsahujícím kancerostatikum doxorubicin vázané kovalentní hydrazonovou vazbou.
Polymemí léčivo připravené podle vynálezu se vyznačuje tím, že je jeho struktura tvořena hydrofilním ve vodě rozpustným kopolymerem obsahujícím jednotky HPMA a jednotky methakryloylovaného derivátu aminokyselin nebo oligopeptidů zakončeného doxorubicinem připojeným k aminokyselinovým nebo oligopeptidovým zbytkům (spacerům) pH-senzitivní hydrolyticky štěpitelnou hydrazonovou vazbou. Spacery mohou být tvořeny jednotlivými
3 5 i 3
C; » ) » i i > ’ i > * » 1 « í » >
- 5—· aminokyselinami, oligopeptidy a nebo dalšími strukturami dovolujícími jejich zakončení hydrazidovou skupinou a kní připojení doxorubicinu hydrazonovou vazbou. Obsah komonomemích (Dox obsahujících) jednotek vkopolymeru může být 0,5 až 10 % mol. Kopolymer neobsahuje žádné další málo definované jednotky, např. methakryloylované hydrazidy.
Polymer s chemicky vázaným cytostatikem je stabilní v průběhu cirkulace v krevním řečišti, hydrazonová vazba mezi doxorubicinem a polymerem je relativně stabilní za fyziologických podmínek krevního řečiště (pH 7,4). Po extravasaci a záchytu v nádorech dochází k průniku molekulárně rozpuštěného konjugátu do jednotlivých nádorových buněk pinocytózou a v důsledku poklesu pH z vnějšího pH 7,4 na intracelulámí pH 5 až 6 by mělo dojít k hydrolýze hydrazonové vazby, uvolnění cytostatika v cílové buňce a tedy k aktivaci jeho cytotoxického efektu. Reálnost výše navrženého mechanizmu působení polymerních léčiv podle vynálezu je doložena experimenty modelového uvolňování doxorubicinu z polymemího nosiče. Výsledky těchto testů jsou uvedeny v příkladové části přihlášky.
Syntéza monomerů vychází ze syntézy HPMA monomeru již dříve popsaným způsobem [Ulbrich 2000]. Syntéza methakryloyl(aminoacyl)hydrazidů lišících se strukturou acylové komponenty je velmi obdobná u všech připravených monomerů a provádí se již dříve popsaným způsobem [Ulbrich patenty, Etrych patent]. Tato syntéza vychází z methakryloylace methylesteru hydrochloridu příslušné aminokyseliny nebo oligopeptidu methakryloylchloridem prováděné v dichlormethanu v přítomnosti bezvodého uhličitanu sodného. Výsledný produkt se převede na methakryloylovaný aminoacylhydrazin hydrazinolýzou příslušného methylesteru hydrazin hydrátem prováděnou v methanolovém nebo 2-propanolovém roztoku. Jako aminoacyl v methakryloyl(aminoacyl)hydrazinech je možno s výhodou použít glycyl, glycylglycyl, β-alanyl,
6-aminohexanoyl, 4-aminobenzoyl a nebo složený acyl vycházející z oligopeptidů GlyPheGly, GlyLeuGly nebo GlyPheLeuGly. Jako příklad syntézy methakryloyl(aminoacyl)hydrazinu je uvedena v příkladě 1 syntéza 6-methakroyl(aminohexanoyl)hydrazidu.
Příprava (methakryloylamino)acylhydrazid-doxorubicinů vychází z vazebné reakce doxorubicin hydrochloridu na methakryloyl(aminoacyl)hydraziny za vzniku hydrazonové vazby. Reakce se provádí s výhodou v methanolu za katalýzy definovaného množství kyseliny octové s přídavkem inhibitoru. Reakce může být prováděna i v dimethylsulfoxidu, dimethylformamidu, sušeném ethanolu nebo dimethylacetamidu. Při použití jiných rozpouštědel nežli methanol reakce probíhá ί i ’ i i > '<
» » 1 > ϊ
J 1 » í J >
- 6dobře, její výtěžky jsou však nižší. Vliv struktury spojky na průběh vazebné reakce je minimální. Pro dosažení optimálního výtěžku vazby a minimálního obsahu nenavázaného doxorubicinu v produktu je ve všech případech důležité dodržet koncentrace reaktantů a kyseliny octové v reakční směsi: koncentrace doxorubicinu (DOX) 19 mg/ml, koncentrace kyseliny octové 51 mg/ml. Optimální doba reakce je 24 h při teplotě 25 °C. Výše uvedené podmínky jsou optimální, vedoucí k maximálním výtěžkům. Reakce může být prováděna i za mírně pozměněných reakčních podmínek, přizpůsobených typu použitého rozpouštědla i (methakryloylamino)acylhydrazidu. Pokud je použita nižší koncentrace DOX (10 mg/ml), je třeba pracovat při vyšší teplotě (až do 35 °C), je možné snížit koncentraci kyseliny octové až na 35 mg/ml, případně prodloužit dobu reakce (až do 28 hodin). Při vyšší koncentraci DOX (30 mg/ml) je výhodné zvýšit koncentraci kyseliny octové až max. na 60 mg/ml a zkrátit reakční dobu na 20 hodin, případně snížit teplotu na 20 °C. Na odstranění volného léčiva z produktu je možné s výhodou použít malý přídavek polymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2), jehož hydrazidové skupiny vyváží nezreagovaný doxorubicin (DOX). Reakční směs je následně vyčištěna gelovou filtrací, s výhodou na koloně LH-20 v methanolu. Frakce monomemího derivátu DOX je po zahuštění izolována vysrážením do diethyletheru. Příprava 6-'(methakryloylamino)hexanoylhydrazid-doxorubicinu a methakroylglycylfenylalanylleucylglycylhydrazid-doxorubicinu jako příklady syntézy (methakryloylamino)acylhydraziddoxorubicinů jsou uvedeny v příkladové části.
Syntéza polymerních konjugátů doxorubicinu - kopolymerů HPMA s methakryloylovanými deriváty aminokyselin a oligopeptidů zakončených hydrazonovou vazbou připojeným doxorubicinem je založena na přímé radikálové kopolymerizací HPMA s odpovídajícími methakryloylovanými deriváty DOX vzorce II i t Μ t t i i Ϊ ) )
Ž $ >
lir* »*
ί·Ό
Polymerace je prováděna v roztoku za použití methanolu, ethanolu, dimethylsulfoxidu nebo dimethylformamidu jako polymeračního prostředí. Polymerizace je iniciována tepelně rozložitelnými iniciátory_radikálové polymerizace na bázi azo nebo peroxy iniciátorů. S výhodou je možno použít azobis(ifobutyronitril) (AIBN), azobis(i|okyan#valerová kyselina) (ABIK) nebo diiřopropylperkarbonát (DIP). Teplota polymerizace se řídí příslušným iniciátorem a použitým rozpouštědlem (AIBN, ABIK v methanolu, ethanolu, DMF a DMSO 50 až 60 °C, DIP 40 až 50 °C). Obvyklá doba polymerizace je 15 až 24 h. Příprava všech polymerních konjugátů radikálovou polymerizací je analogická, například kopolymerizace HPMA s methakryloylovaným derivátem DOX je uvedena v příkladu 3. Oproti dříve používané polymeranalogické vazebné reakci DOX na polymerní prekurzor poly(HPMA-co-MA-AHNHNH2) vede přímá kopolymerizace HPMA s methakryloylovaným derivátem DOX k přesně definovaným polymemím konjugátům.
Polymerní konjusát je kopolymer HPMA s methakryloylovanými deriváty aminokyselin a oligopeptidů zakončených hydrazonovou vazbou připojeným doxorubicinem vzorce I t i t ? Í
S » ϊ Ϊ t i » 3 i i » i ř » » í » 3 » »
U) jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje 90 až 99,5 % mol. HPMA a 10 až 0,5 % mol. jednotek (methakryloylamino)acylhydrazid-doxorubicinů.
V používaných strukturních schématech je zavedena zkratka pro spojky (spacery) v bočních řetězcích konjugátů a monomerů - SPi je aminoacyl v methakryloylacylhydrazid-doxorubicinech, například glycyl, glycylglycyl, β-alanyl, 6-aminohexanoyl (AH), 4-aminobenzoyl a nebo složený acyl vycházející z oligopeptidů GlyPheGly, GlyLeuGly, GlyLeuPheGly a GlyPheLeuGly.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1 představuje schéma struktury methakryloylovaných derivátů aminokyselin a oligopeptidů zakončených hydrazonovou vazbou připojeným doxorubicinem ((methakryloylamino)acylhydrazid-doxorubicin)).
Obr. 2 představuje schéma struktury konjugátu 1 - kopolymerů HPMA a methakryloylo váného derivátu aminokyselin a oligopeptidů zakončených hydrazonovou vazbou připojeným doxorubicinem (x = 40 až 335, y = 1 až 25).
) S 3 i > » ί ί »
» i »
- 9Obr. 3 představuje graf rychlosti uvolňování DOX z poiymerního konjugátu 1 a poiymerního konjugátu připraveného polymeranalogickou reakcí (patent Etrych) v pufru o pH 5 (model intracelulámího prostředí).
Obr. 4 představuje graf rychlosti uvolňování DOX z poiymerního konjugátu 1 a poiymerního konjugátu připraveného polymeranalogickou reakcí (patent Etrych) v pufru o pH 7,4 (model krevního řečiště).
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Syntéza monomerů
HPMA byl připraven podle dříve popsaného postupu [Ulbrich a kol. 2000]. Elementární analýza: vypočteno 58,8 % C, 9,16 % H, 9,79 % N; nalezeno 58,98 % C, 9,18 % H, 9,82 % N. Produkt byl chromatografícky čistý.
6-(methakryloylamino)hexanoylhydrazid (Ařl-(6-hydrazino-6-oxohexyl)-2-methylakrylamid) (MA-AH-NHNH2) byl připraven podle dříve popsaného postupu [Ulbrich patenty, Etrych patent].
Methakroylglycylfenylalanylleucylglycylhydrazid (MA-Gly-D,L-PheLeuGly-NHNH2) byl připraven podle dříve popsaného postupu [Etrych patent],
6-(Methakryloylamino)hexanoylhydrazid-doxorubicin (MA-AH-NHN=DOX)
6-(Methakryloylamino)hexanoylhydrazid (40 mg, 0,188 mmol) byl rozpuštěn pri teplotě místnosti v 6 ml methanolu. Tento roztok byl nalit do reakční nádobky, ve které byl umístěn doxorubicin.HCl (115 mg, 0,198 mmol), a suspenze byla intenzivně míchána. Do této suspenze bylo přidáno 310 μΐ kyseliny octové a reakční směs byla míchána 24 hodin pri 25 °C. Průběh reakce sledován na TLC - destičky Silikagel 60 F254 (methanol:chloroform:kyselina octová 2:8:1, Rf(DOX)= 0,75, Rf(MA-AH-NHN=DOX)= 0,9). V průběhu reakce došlo k pozvolnému rozpuštění suspenze a po 20 h reakce byl roztok homogenní. Po 24 hodinách bylo do homogenní reakční směsi přidáno 100 mg kopolymerů poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2) (na vyvázání zbytkového volného DOX) a reakční směs míchána další 4 h při teplotě místnosti. Produkt byl vyčištěn od polymemích a nízkomolekulámích příměsí pomocí gelové chromatografie na koloně (30cm x 3cm) naplněné Sephadexem LH-20 v methanolu. Nízkomolekulámí frakce byla zahuštěna na 2 ml a produkt vysrážen do 30 ml diethyleteru. Produkt byl odsát, promyt malým i * > i ) i »3 3 J i i i i 3 · ‘ » *» ?
-ϊ Ϊ 3 5 t
- 10 — množstvím diethyleteru a vakuově sušen do konstantní hmotnosti. Výtěžek činil 110 mg produktu (79 %) s teplotou tání 172 až 175 °C. TLC (methanol:chloroform:kyselina octová 2:8:1) jedna skvrna při Rf= 0,9. MALDI-TOF MS: 762 (M+Na).
Methakroylglycylfenylalanylleucylglycylhydrazid-doxorubicin (MA-GFLG-NHN=DOX)
Příprava MA- GFLG-NHN=DOX byla prováděna za podobných podmínek, jako v případě MAΑΗ-ΝΗΝ=ΟΟΧ. Methakroylglycylfenylalanylleucylglycylhydrazid (122 mg, 0,258 mmol) byl rozpuštěn při teplotě místnosti v 8,2 ml methanolu. Tento roztok byl nalit do reakční nádobky, ve které byl umístěn doxorubicin.HCl (157 mg, 0,271 mmol), a suspenze byla intenzivně míchána. Do této suspenze bylo přidáno 420 μΐ kyseliny octové a reakční směs byla míchána 24 hodin při 25 °C. Průběh reakce sledován na TLC - destičky Silikagel 60 F254 (methanol:chloroform:kyselina octová 2:8:1, Rf(DOX)= 0,75, Rf(MA-GFLG-NHN=DOX)= 0,95). V průběhu reakce došlo k pozvolnému rozpuštění suspenze a po 19 h reakce byl roztok homogenní. Po 24 hodinách bylo do homogenní reakční směsi přidáno 130 mg kopolymeru poly(HPMA-co-MA-AH-NHNH2) (na vyvázání zbytkového volného DOX) a reakční směs míchána další 4 h při teplotě místnosti. Produkt byl vyčištěn od polymerních a nízkomolekulámích příměsí pomocí gelové chromatografie na koloně (30cm x 3cm) naplněné Sephadexem LH-20 v methanolu. Nízkomolekulámí frakce byla zahuštěna na 2,5 ml a produkt vysrážen do 40 ml diethyleteru. Produkt byl odsát, promyt malým množstvím diethyleteru a vakuově sušen do konstantní hmotnosti. Výtěžek činil 210 mg produktu (78 %) s teplotou tání 179 až 182 °C. TLC (methanol:chloroform:kyselina octová 2:8:1) jedna skvrna při Rf= 0,95. MALDI-TOF MS: 1023 (M+Na).
Příklad 2: Syntéza polymemího konjugátu - Konjugátu 1 - kopolymeru HPMA s MA-AH- NHN=DOX
Kopolymer poly(HPMA-co-MA-AH-NHN=DOX)] byl připraven roztokovou radikálovou kopolymerizací HPMA a MA-AH-NHN=DOX v methanolu při 60 °C.
840 mg HPMA a 165 mg MA-AH-NHN=DOX (18 hm%jponomerů) bylo rozpuštěno v 5,7 ml metanolu, k roztoku bylo přidáno 67 mg ABIN (1,2 hm%). Po filtraci byla polymerizační směs vložena v argonové atmosféře do polymerizačního reaktoru (objem 20 ml) umístěného v termostatu. Nad hladinu byl ještě několik minut zaváděn dusík. Teplota polymerizační směsi byla nastavena na 60 °C a polymerizace probíhala za míchání (50 rpm) v dusíkové atmosféře.
ž } 5 > ϊ j :· i i ϊ >
ί ϊ » • a 3 i s >
-11ϊ ϊ ί ’
Polymerizační směs byla po 22 h vyjmuta z termostatu, ochlazena v lázni na pokojovou teplotu a polymer byl izolován vysrážením do ethylacetátu (celkem 100 ml). Vysrážený polymer byl izolován filtrací na fritě S4. Sraženina byla promyta ethylacetátem a sušena při teplotě místnosti za vakua membránové vývěvy cca 1 h. Polymerní produkt byl vyčištěn od nízkomolekulámích příměsí a nenavázaného léčiva gelovou chromatografií na koloně naplněné Sephadexem LH-20 v methanolu. Polymerní frakce byla zachycena, zahuštěna na vakuové rotační odparce na objem 5 ml a kopolymer byl izolován vysrážením do 50 ml ethylacetátu. Produkt byl vysušen do konstantní hmotnosti.
Obsah celkového DOX byl stanoven spektrálně. Mw a Mn byly stanoveny kapalinovou chromatografií (LC AKTA) s detekcí rozptylem světla (Multiangel detector DAWN DSP, Wyatt).
Charakterizace polymerního léčiva; Yýýěžek polymerizační reakce: 750 mg (75 %), obsah celkového DOX 10,8 %váhovýeh, obsah volného DOX 0,35 % z celkového obsahu DOX, molekulová hmotnost M w = 34^)00, index polydisperzity Afw/ Mn = 1,72.
Příklad 3: Syntéza polymerního konjugátu - Konjugátu 2 - kopolymerů HPMA s MA-AHNHN=DOX
Kopolymer poly(HPMA-co-MA-AH-NHN=DOX) byl připraven roztokovou radikálovou kopolymerizaci HPMA a MA-AH-NHN=DOX v methanolu při 60 °C stejným způsobem jako v příkladu 2, s tím rozdílem, že složení polymerizační směsi bylo následující: 770 mg HPMA,
235 mg MA-AH-NHN=DOX, 5,7 ml metanolu, 67 mg ABIN (1,2 hm%f Izolace a čištění produktu bylo prováděno stejným způsobem, jako u příkladu 2. Charakterizace polyperního z./^ léčiva: Výtěžek polymerizační reakce: 740 mg (74 %), obsah celkového DOX 16,5 % vanových, obsah volného DOX 0,45 % z celkového obsahu DOX, molekulová hmotnost = 3^800, index polydisperzity Mw! M„ = 1,78.
Příklad 4: Syntéza polymerního konjugátu - Konjugátu 3 - kopolymerů HPMA s MAGFLG-NHN=DOX
Kopolymer poly(HPMA-co-MA-GFLG-NHN=DOX) byl připraven roztokovou radikálovou kopolymerizaci HPMA a MA-GFLG-NHN=DOX v methanolu při 60 °C stejným způsobem jako v příkladu 2, s tím rozdílem, že složení polymerizační směsi bylo následující: 700 mg HPMA, ί ?
! ί 5 ϊ * ?
» J » ί > Í ♦ » »
- 12183 mg MA-AH-NHN=DOX, 5 ml metanolu, 64 mg ABIN (1,3 hm%). Izolace a čištění produktu bylo prováděno stejným způsobem, jako u příkladu 2. Charakterizace polymemíha i léčiva: Výtěžek polymerizační reakce: 670 mg (76 %), obsah celkového DOX 10,5 % váhových·, obsah volného DOX 0,32 % z celkového obsahu DOX, molekulová hmotnost Mw - 34800, indexpolydisperzity Mw! Mn=l,%2.
Příklad 5: Uvolňování doxorubicinu z roubovaných polymemích konjugátů Bylo měřeno množství doxorubicinu uvolněného z polymemích konjugátů po jejich inkubaci ve fosfátovém pufru o pH 5,0 (0,1 M fosfátový pufr obsahujícím 0,05 M NaCl) modelujícím intracelulámí prostředí a fosfátovém pufru pH 7,4 modelujícím prostředí krevního řečiště. Množství uvolňovaného DOX v inkubačním roztoku bylo stanoveno pomocí HPLC (Shimadzu).
V předem určených časových intervalech bylo odebíráno 50 μΐ inkubačního roztoku a analyzováno na koloně TSKGel G 3000x1, izokratický průtok 0,5 ml/min mobilní fáze složené ze směsi methanokoctanový pufr pH 6,5 (80 : 20 % obj.). Množství DOX bylo vypočteno z ploch píků volného a vázaného DOX (UV-VIS detekce při 488 nm). Po inkubaci konjugátů (koncentrace 5 mg/ml) ve fyziologickém prostředí při 36 °C (fosfátový pufr, pH 7,4) se uvolňuje jen malé množství léčiva (do 10 %/24 hod) (Obr. 4); naopak rychlost uvolňování DOX z roubovaných polymemích konjugátů, a tedy rychlost aktivace cytotoxického léčiva, je v mírně kyselém prostředí při pH 5,0 (Obr. 3) značná. Rychlosti uvolňování léčiva v pH 7,4 a pH 5 z polymemích konjugátů připravených přímou kopolymerizací s využitím 6-(methakryloylamino)acylhydrazid-doxorubicinů jsou plně srovnatelné s rychlostmi uvolňování léčiva zjištěných u hydrazonových konjugátů připravených polymeranalogickou reakcí (PA reakce) [Etrych patent]. Výsledky měření rychlosti in vitro uvolňování aktivního léčiva z polymerního nosiče v prostředí modelujícím prostředí krve (při dopravě léčiva organizmem) a intracelulámí prostředí cílové buňky potvrzuje vhodnost použití navrhovaného polymerního cytostatika pro nádorově specifické terapie.
> » >
> í i s : * I
S 3 ’>
) Μ } >3 » » » » » « í i i > *
- 13 —
Claims (13)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Polymerní léčivo ve formě konjugátu kopolymeru V-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu HPMA s doxorubicinem vázaným na polymer prostřednictvím spojek obsahujících hydrolyticky štěpitelné hydrazonové vazby vzorce I (’), kde SPi představuje aminoacylovou spojku, zvolenou ze skupiny zahrnující glycyl, glycylglycyl, β-alanyl, 6-aminohexanoyl, 4-aminobenzoyl nebo složený acyl vycházející z oligopeptidů GlyPheGly, GlyLeuGly, GlyLeuPheGly nebo GlyPheLeuGly, x = 40 až 335, y= 1 až 25, sestávající z 90 až 99,5 % mol. jednotek HPMA a 10 až 0,5 % mol. komonomemích jednotek obsahujících doxorubicin.
- 2. Způsob výroby polymerního konjugátu vzorce I podle nároku 1, vyznačující se přímou kopolymerací monomeru obsahujícího doxorubicin vzorce II i ϊ ·> i > ί JI JI* ί » » ϊ 5 3 — 14 — (π), kde SPj má význam uvedený v nároku 1, s HPMA v molámím poměru 90 až 99,5 : 10 až 0,5.azobis(i$okyan$valero
- 3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že se polymerace provádí v prostředí methanolu, ethanolu, dimethylsulfoxidu nebo dimethylfi^mamidu a je iniciována tepelně rozložitelnými iniciátory radikálové polymerace.
- 4. Způsob podle nároku 2 nebo 3, vyznačující se tím, že jsou iniciátory radikálové polymerace zvoleny ze skupiny, kterou tvoří azobis(ijiobutyronitril) AIBN, vá^kyselina ABIK a diifopropylperkarbonát DIP.
- 5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že je iniciátor zvolen ze skupiny AIBN nebo ABIK a reakce probíhá při 50 až 60 °C po dobu 15 až 24 hodin.
- 6. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že je jako iniciátor zvolen DIP a reakce probíhá při 40 až 50 °C pod dobu 15 až 24 hodin.
- 7. Způsob podle nároků 2 až 6, vyznačující se tím, že je monomemí jednotka vzorce II vyrobena reakcí doxorubicin hydrochloridu s methakryloyl(aminoacyl)hydraziny vzorce MA-SP1NHNH2, kde MA je methakryloyl a SPi má význam uvedený v nároku 1, v organickém rozpouštědle za přítomnosti kyseliny octové.- 158. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že je ve výchozí směsi koncentrace doxorubicinu volena v rozmezí koncentrací 10 až 30 mg/ml a kyseliny octové v rozmezí 35 až 60 mg/ml.
- 9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že je ve výchozí reakční směsi koncentrace doxorubicinu hydrochloridu 19 mg/ml a kyseliny octové 51 mg/ml.
- 10. Způsob podle libovolného z nároků 7 až 9, vyznačující se tím, že reakce se provádí při teplotě 20 až 35 °C po dobu 20 až 28 hodin.
- 11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že reakce se provádí při teplotě 25 °C po dobu 24 h.
- 12. Způsob podle nároku 7 až 11, vyznačující se tím, že se po ukončení reakce pro odstranění přebytečného doxorubicinu použije kopolymer HPMA s methakryloylo váným (aminoacyl)hydrazidem.
- 13. Způsob podle nároku 7 až 12, vyznačující se tím, že je reakční prostředí tvořeno organickým rozpouštědlem zvoleným ze skupiny, kterou tvoří methanol, bezvodý ethanol, dimethylsulfoxid, dimethylformamid a dimethylacetamid.
- 14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, zeje reakční prostředí tvořeno methanolem.ΊΧοΡ- pop-
Priority Applications (11)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20060505A CZ299053B6 (cs) | 2006-08-09 | 2006-08-09 | Polymerní konjugáty doxorubicinu s pH-rízeným uvolnováním léciva a zpusob jejich prípravy |
| AT07785504T ATE495759T1 (de) | 2006-08-09 | 2007-08-08 | Polymerkonjugate von doxorubicin mit ph- regulierter freisetzung des arzneimittels und herstellungsverfahren |
| EA200900295A EA200900295A1 (ru) | 2006-08-09 | 2007-08-08 | Полимерные конъюгаты доксорубицина с рн-регулируемым высвобождением лекарственного средства и способ получения |
| PT07785504T PT2049157E (pt) | 2006-08-09 | 2007-08-08 | Conjugados poliméricos de doxorubicina com libertação do fármaco regulada pelo ph e método de preparação |
| UAA200902032A UA95814C2 (ru) | 2006-08-09 | 2007-08-08 | ПОЛИМЕРНЫЕ КОНЬЮГАТЫ ДОКСОРУБИЦИНА С рН-РЕГУЛИРОВАННЫМ ВЫСВОБОЖДЕНИЕМ ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ |
| PL07785504T PL2049157T3 (pl) | 2006-08-09 | 2007-08-08 | Polimeryczne koniugaty doksorubicyny o uwalnianiu leku regulowanym za pomocą pH i sposób wytwarzania |
| US12/376,915 US20100190928A1 (en) | 2006-08-09 | 2007-08-08 | Polymeric conjugates of doxorubicin with ph-regulated release of the drug and a method of preparing |
| ES07785504T ES2356991T3 (es) | 2006-08-09 | 2007-08-08 | Conjugados poliméricos de doxorubicina con liberación del fármaco regulada por ph y un método de preparación. |
| EP07785504A EP2049157B1 (en) | 2006-08-09 | 2007-08-08 | Polymeric conjugates of doxorubicin with ph-regulated release of the drug and a method of preparing |
| DE602007012111T DE602007012111D1 (de) | 2006-08-09 | 2007-08-08 | Polymerkonjugate von doxorubicin mit ph-regulierter freisetzung des arzneimittels und herstellungsverfahren |
| PCT/CZ2007/000077 WO2008017277A2 (en) | 2006-08-09 | 2007-08-08 | Polymeric conjugates of doxorubicin with ph-regulated release of the drug and a method of preparing |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20060505A CZ299053B6 (cs) | 2006-08-09 | 2006-08-09 | Polymerní konjugáty doxorubicinu s pH-rízeným uvolnováním léciva a zpusob jejich prípravy |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2006505A3 true CZ2006505A3 (cs) | 2008-04-09 |
| CZ299053B6 CZ299053B6 (cs) | 2008-04-09 |
Family
ID=38828704
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20060505A CZ299053B6 (cs) | 2006-08-09 | 2006-08-09 | Polymerní konjugáty doxorubicinu s pH-rízeným uvolnováním léciva a zpusob jejich prípravy |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20100190928A1 (cs) |
| EP (1) | EP2049157B1 (cs) |
| AT (1) | ATE495759T1 (cs) |
| CZ (1) | CZ299053B6 (cs) |
| DE (1) | DE602007012111D1 (cs) |
| EA (1) | EA200900295A1 (cs) |
| ES (1) | ES2356991T3 (cs) |
| PL (1) | PL2049157T3 (cs) |
| PT (1) | PT2049157E (cs) |
| UA (1) | UA95814C2 (cs) |
| WO (1) | WO2008017277A2 (cs) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20090311182A1 (en) * | 2004-03-31 | 2009-12-17 | Dong Wang | Macromolecular Delivery Systems for Non-Invasive Imaging, Evaluation and Treatment of Arthritis and Other Inflammatory Diseases |
| CZ303072B6 (cs) * | 2009-02-13 | 2012-03-21 | Zentiva, K.S. | Polymerní konjugáty paclitaxelu a docetaxelu s pH rízeným uvolnováním kancerostatika |
| EP2475325B1 (en) * | 2009-09-09 | 2018-01-10 | Board of Regents of the University of Nebraska | Compositions and methods for detecting and treating implant loosening and osteolysis |
| CN103936945B (zh) * | 2013-01-23 | 2017-02-08 | 中国科学院化学研究所 | 一类高效抗肿瘤靶向药物载体及其制备方法 |
| CN105963706B (zh) * | 2016-04-15 | 2019-03-15 | 四川大学 | 一种支化hpma共聚物-dox偶联物及其制备方法和应用 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69432867T2 (de) * | 1993-11-18 | 2004-04-22 | Sirtex Medical Ltd., Burswood | Zubereitung mit gesteuerter freisetzung |
| US6060518A (en) * | 1996-08-16 | 2000-05-09 | Supratek Pharma Inc. | Polymer compositions for chemotherapy and methods of treatment using the same |
| CZ293787B6 (cs) * | 2001-12-20 | 2004-07-14 | Zentiva, A.S. | pH senzitivní polymerní konjugáty antracyklinového kancerostatika pro cílenou terapii |
| CZ297827B6 (cs) * | 2005-09-05 | 2007-04-04 | Zentiva, A. S. | Zpusob prípravy polymerních konjugátu doxorubicinu s pH-rízeným uvolnováním léciva |
-
2006
- 2006-08-09 CZ CZ20060505A patent/CZ299053B6/cs not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-08-08 PL PL07785504T patent/PL2049157T3/pl unknown
- 2007-08-08 AT AT07785504T patent/ATE495759T1/de not_active IP Right Cessation
- 2007-08-08 US US12/376,915 patent/US20100190928A1/en not_active Abandoned
- 2007-08-08 DE DE602007012111T patent/DE602007012111D1/de active Active
- 2007-08-08 ES ES07785504T patent/ES2356991T3/es active Active
- 2007-08-08 UA UAA200902032A patent/UA95814C2/ru unknown
- 2007-08-08 PT PT07785504T patent/PT2049157E/pt unknown
- 2007-08-08 EA EA200900295A patent/EA200900295A1/ru unknown
- 2007-08-08 EP EP07785504A patent/EP2049157B1/en active Active
- 2007-08-08 WO PCT/CZ2007/000077 patent/WO2008017277A2/en not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20100190928A1 (en) | 2010-07-29 |
| EA200900295A1 (ru) | 2009-06-30 |
| DE602007012111D1 (de) | 2011-03-03 |
| PT2049157E (pt) | 2011-02-23 |
| ATE495759T1 (de) | 2011-02-15 |
| WO2008017277A3 (en) | 2008-03-27 |
| UA95814C2 (ru) | 2011-09-12 |
| ES2356991T3 (es) | 2011-04-15 |
| EP2049157B1 (en) | 2011-01-19 |
| EP2049157A2 (en) | 2009-04-22 |
| PL2049157T3 (pl) | 2011-04-29 |
| CZ299053B6 (cs) | 2008-04-09 |
| WO2008017277A2 (en) | 2008-02-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4883515B2 (ja) | 均一分子量ポリマー | |
| EP2063914B1 (en) | Grafted macromolecular conjugates of doxorubicin with anticancer activity and method of their preparation | |
| KR20160106223A (ko) | 공유결합된 치료제 전달을 위한 사이클로덱스트린-기초 중합체 | |
| CA3046541A1 (en) | Biocompatible and hydrophilic polymer conjugate for targeted delivery of an agent | |
| EP1922087B1 (en) | Method for the preparation of polymeric conjugates of doxorubicin with ph-controlled release of the drug | |
| EP1463529B1 (en) | Ph-sensitive polymeric conjugates of an anthracycline cancerostatic drug for targeted therapy | |
| EP2049157B1 (en) | Polymeric conjugates of doxorubicin with ph-regulated release of the drug and a method of preparing | |
| KR20180085761A (ko) | 능동 타겟팅 나노입자 | |
| CZ303072B6 (cs) | Polymerní konjugáty paclitaxelu a docetaxelu s pH rízeným uvolnováním kancerostatika | |
| CZ2009844A3 (cs) | Dendritické vysokomolekulární polymerní nosice léciv a jejich konjugáty s lécivy pro lécbu zejména pevných nádoru | |
| WO2007110003A2 (en) | Micellar carriers for drugs with anti-cancer activity | |
| Chytil et al. | Structural design and synthesis of polymer prodrugs | |
| Sintov et al. | Polymeric drug delivery of enzymatically degradable pendant agents: Peptidyl-linked procainamide model system studies | |
| Class et al. | Patent application title: POLYMERIC CONJUGATES OF DOXORUBICIN WITH PH-REGULATED RELEASE OF THE DRUG AND A METHOD OF PREPARING Inventors: Tomas Etrych (Praha, CZ) Karel Ulbrich (Praha, CZ) | |
| KR102266865B1 (ko) | 지방산을 유효성분으로 포함하는 수용성 광감작제 결합체 및 이의 제조방법 | |
| CZ2019778A3 (cs) | Kopolymer s hydrolytickým uvolňováním kancerostatika cytarabinu, způsob jeho přípravy a jeho použití | |
| Kotrchová et al. | Synthesis of water-soluble star polymers based on cyclodextrins | |
| RO138087A2 (ro) | Conjugate polimerice pe bază de poli(2-izopropenil-2-oxazolină) şi doxorubicină pentru imuno-chimio-terapia cancerului şi procedeu de obţinere al acestora | |
| CZ2003605A3 (en) | pH sensitive polymeric conjugates of anthracycline cancerostatic for targeted therapy |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20210809 |