CZ2007453A3 - Substituované 6-anilinopurinové deriváty jako inhibitory cytokinin oxidasy a prípravky obsahující tyto slouceniny - Google Patents

Abstract

Vynález se týká substituovaných 6-anilinopurinových derivátu obecného vzorce I pro použití jako inhibitoru cytokinin oxidasy, ve kterých R znamená 1 až 5 substituentu nezávisle vybraných ze skupiny zahrnující vodík, halogen, hydroxyl, amino, alkylosy a alkylovou skupinu a R2 znamená amino, halogen,nitro, thio, alkylthio nebo alkylovou skupinu. Vynález se týká rovnež prípravku obsahujících tyto slouceniny.

Description

Substituované 6-anÍlinopurinové deriváty jako inhibitory cytokinin oxidasy a přípravky obsahující tyto sloučeniny

Oblast techniky

Vynález se týká substituovaných 6-anilinopurinových derivátů, jejich použití jako inhibitorů cytokinin oxidasy a přípravků obsahujících tyto sloučeniny.

Dosavadní stav techniky

V posledních letech jsou 6-substituované aminopuriny považovány za látky se značným biochemickým významem. Některé látky tohoto typu stimulují růst rostlin a jsou řazeny do skupiny růstových regulátorů označovaných cytokininy (Letham, Ann. Rev. Plant. Physiol. 18, 349, 1967). První objevenou molekulou s cytokininovou aktivitou je kinetin (N⁶furfuryladenin), který byl původně izolován z autoklávované DNA spermatu sledě (Miller et al. 1955, J. Am. Chem. Soc. 77:1392). Cytokininy blízce příbuzné kinetinu také tvoří modifikované báze RNA (Skoog et al,, Science 154:1354, 1966). V tRNA pro serin a tyrosin kvasinek, rostlin a živočichů sousedí cytokininy přímo s antikodonem. Některé N⁶substituované adenosiny s cytokinovou aktivitou inhibují růst savčích buněčných kultur (Grace et al., Proc.AmAssoc.Cancer Res. 8:23, 1967).

Cytokininy jsou významné rostlinné hormony regulující mnoho aspektů vývoje rostlin. Současné studie na transgenních rostlinách s pozměněným cytokininovým metabolismem nebo signalingem odhalily zajímavé důsledky cytokininové deflcience, čí narušení percepcc cytokininů (Werner et al, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 98:10487, 2001, Werner et al, Plant Cell 15:2532, 2003; Riefler et al., Plant Cell 18:40, 2006). Modulace hladiny cytokininů jejich exogenní aplikací nebo genetickou regulací endogenních hladin pomocí cytokinin oxidasy/dchydrogenasy (CKX, EC 1.5.99.12), klíčového enzymu degradace cytokininů, již ukázaly své potenciální využití v zemědělství. Exogenní aplikace cytokininů vedla například ke zkrácení období předcházejícímu době kvetení u rajčete (Sawhney and Shukla, Am J Bot 81:1640, 1994), nebo k reverzi samčí sterility u ječmene (Ahokas, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 79:7605, 1992). Specifická exprese CKX v prašníku a pylu kukuřice byla prezentována jako účinný nástroj k navození samčí sterility pro produkci hybridů u tradičně nesnadno hybridizovatelných plodin (Huang et al,, 2003). Současná práce také přinesla poznatky o účasti CKX na regulaci produkce zrn u rýže (Ashikari et al., Science 309:741,2005).

V současné době jsme objevili nove generace CKX inhibitorů založené na 2substituo váných 6-anilinopurinech. Mezi nej slibnější substituenty, ve smyslu přípravy specifických CKX inhibitorů, patří 2-chlor, 2-íluor and 2-amino skupiny.

Předmětem tohoto vynálezu jsou cytokininová analoga mající vylepšenou selektivitu a index účinnosti inhibice cytokinin oxidasy, tzn. jsou ménč toxické, avšak účinnější, než dříve známá analoga.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu jsou substituované 6-anilinopurinové deriváty obecného vzorce

Ϊ

I a jejich farmaceuticky využitelné soli s alkalickými kovy, amoniakem či aminy ve formě racemátů nebo opticky aktivních isomerů, jakož i jejich adičních solí s kyselinami, ve kterých

R znamená 1 až 5 substituentů nezávisle vybraných ze skupiny zahrnující vodík, halogen, hydroxyl, amino, alkyloxy a alkylovou skupinu,

R2 je vybráno ze skupiny zahrnující amino, halogen, nitro, thio, alkylthio a alkylovou skupinu, pro použití jako inhibitory cytokinin oxidasy.

Výše uvedené dosud nevymczcnc generické skupiny mají významy uvedené v následující legendě, přičemž amino znamená skupinu -NEC, halogen znamená atom halogenu vybraný ze skupiny zahrnující atom fluoru, atom bromu, atom chloru a atom jodu, nitro znamená skupinu -NO2, thio znamená skupinu -SH, alkyl znamená přímou nebo rozvětvenou alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, hydroxy znamená skupinu -OH, alkyloxy znamená skupinu -OR, ve které R je alkyl, přičemž uvedené generické substituentové skupiny mají významy, které jsou identické s definicemi odpovídajících skupin uvedenými v této legendě, alkylthio znamená skupinu -SR, ve které R je alkyl, přičemž uvedené generické substituentové skupiny mají významy, které jsou identické s definicemi odpovídajících skupin uvedenými v této legendě.

Výhodnými sloučeninami podle vynálezu jsou substituované 6-anilinopurinové deriváty obecného vzorce I ze skupiny zahrnující: 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-anilinopurin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2-chloroanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(3-chloroanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(4-chloroanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2-fluoroanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(3-fluoroanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(4-fluoroanilino)purin, 2-( chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(2-bromoanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(3-bromoanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(4-bromoanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2-methoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methy 1)-6-(3-methoxyanilinojpurin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(4-methoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2-ethoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(3-ethoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(4-ethoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2-aminoanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, mcthyl)-6-(3-aminoanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(4-aminoanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2-methylanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(3-methylanilino)purin, 2-(chloro, iluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(4-methylanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2-hydroxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(3-hydroxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(4-hydroxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2,3-difluoroanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2,4<lifluoroanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2,3,4-trifluoroanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2,4,5-trifluoroanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2,3-dichloroanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, mcthylthio, methyl)-6-(2,4-dichloroanilino)purin,2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl, ethyl)-6-(2,4-dimethoxyanilino)purin, 2-(chIoro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, mcthyl)-6-(2,3-dimethoxyanilino)purin, 2(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl, ethyl)-6-(3,4dimethoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, mcthyl)-6(2,5-dimethoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl, cthyl)-6-(3,4,5-trimcthoxyanilino)purin, 2-(amino, chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl, ethyl)-6-(2,4,6-trimethoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2,3-dimethylanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl, ethyl)-6-(2,4-dimethylanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(3,4-dimcthylanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl, ethyl)-6-(3,5-dimethylanilino)purin, 2(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl, ethyl)-6-(2,3dihydroxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6(2,4-dihydroxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2,5-dihydroxyanilino)purin, 2-(amino, chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(3,5-dihydroxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(3-hydroxy-2-methylanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, mcthylthio, mcthyl)-6-(3-hydroxy-4-methylanilino)purm, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2-hydroxy-5-methyIanilino)purin,

2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(3-hydroxy-2methoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, mcthylthio, melhyl)-6-(3hydroxy-4-methoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2-hydroxy-3-methoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2-hydroxy-5-methoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(4-hydroxy’3,5-dimethoxyanilino)purin, 2-(amino, chloro, fluoro, hydroxy, thio, methylthio, methyl)-6-(2-chloro-4-methoxyanilino)purin, 2(amino, chloro, fluoro, bromo, nitro, thio, methylthio, mcthyl)-6-(2-chloro-5methoxyanilinojpurin, 2-(amino, chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, mcthyl)-6-(2-chloro-3-methoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2-bromo-3-methoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6’(2-methoxy-3-chloroanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, mcthyl)-6-(2miethoxy-4<hloroanilino)purin, a jejich soli s alkalickými kovy, amoniakem či aminy ve formě racemátů nebo opticky aktivních isomerů, jakož i jejich adičních solí s kyselinami, pro použití jako inhibitory cytokinin oxidasy.

Mimořádně výhodnými sloučeninami podle vynálezu jsou substituované 6anilinopurinové deriváty zahrnující:

2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, mcthylthio, methyl)-6-(3-methoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2-hydroxy-3methoxyanilinojpurin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2chloro-3-methoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2-bromo-3-methoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, mcthyl)-6-(4-hydroxyanilino)purin, a jejich soli s alkalickými kovy, amoniakem či aminy ve formě racemátů nebo opticky aktivních isomerů, jakož i jejich adičních solí s kyselinami, pro použití jako inhibitory cytokinin oxidasy.

Vynález rovněž zahrnuje farmaceutické, kosmetické a růstovč-regulační přípravky obsahující alespoň jednu sloučeninu obecného vzorce I či sůl takovéto sloučeniny s alkalickým kovem, amoniakem či aminem ve formě racemátu nebo opticky aktivního isomeru, nebo jeho adiční soli s kyselinou, včetně pomocných látek.

Předmětem vynálezu je rovněž použití substituovaného 6-anilinopurinovcho derivátu obecného vzorce I nebo jejich soli s alkalickými kovy, amoniakem či aminy ve formč racemátů nebo opticky aktivních isomerů, jakož i jejich adičních solí s kyselinami pro přípravu přípravku pro použití pro inhibici cytokinin oxidasy.

Předmětem vynálezu je rovněž použití substituovaných 6-anilinopurinových derivátů obecného vzorce I jako inhibitorů cytokinin oxidasy, zejména pro zvýšení výnosu a kvality zemědělských produktů.

Předmětem vynálezu jc rovněž použití substituovaných 6-anilinopurinových derivátů obecného vzorce I jako inhibitorů cytokinin oxidasy v tkáňových kulturách ke stimulaci proliferace a morfogeneze.

Předmětem vynálezu je rovněž použití substituovaných 6-anilinopurinových derivátů obecného vzorce I jako inhibitorů cytokinin oxidasy pro zpomalení senescence buněk rostlin, živočichů, mikroorganismů, kvasinek a hub.

Předmětem vynálezu je rovněž použití substituovaných 6-anilinopurinových derivátů obecného vzorce I jako inhibitorů cytokinin oxidasy pro zpomalení senescence savčích pokožkových buněk, například fibroblastů a keratinocytů.

Předmětem vynálezu je rovněž použití substituovaných 6-anilinopurinových derivátů obecného vzorce I pro výrobu přípravků používaných ke klonování rostlinných i savčích zárodečných buněk a embryí, s výhodou oocytů.

Předmětem vynálezu je konečně použití substituovaných 6-anilinopurinových derivátů obecného vzorce I jako inhibitorů cytokinin oxidasy na potlačení imunostimulacc například arthritis nebo při supresi rejekce transplantovaných orgánů u savců.

Předmětem vynálezu je konečně použití substituované 6-anilinopurinové deriváty obecného vzorce I jako inhibitorů cytokinin oxidasy při produkci užitkových rostlin, s výhodou u obilovin (pšenice, ječmen, rýže, kukuřice, žito, oves, čirok a další druhy), řep (cukrová a krmná řepa); malvic, peckovic a bobulovin (jablka, hrušky, švestky, broskve, mandle, jahody, maliny a ostružiny); vikvovitých rostlin (bob, Čočka, hrách, sója); olejnin (řepka, hořčice, mák, olivy, slunečnice, kokos, Ricinus, kakaový bob, podzemnice olejna); lilkovitých rostlin (dýně, okurky, melouny); přadných rostlin (bavlna, len, konopí, juta); citrusů (pomeranče, citrony, grapefruity, mandarinky); zeleniny (špenát, skořice, kafr) nebo rostlin jakými jsou tabák, ořešák, baklažán, cukrová třtina, čajovník, réva vinná, chmel, banány a přírodní kaučukovníkové a léčivé rostliny stejně tak jako okrasné rostliny. Plodiny zahrnují ty, které poskytují toleranci vůči třídám růstových faktorů konvenčním křížením nebo metodami genetického inženýrství. Plevely, jejichž růst může být kontrolován zahrnují jak jednoděložné tak dvoudčložné druhy, například Stellaria, Nasturtium, Agrostis, Digitaria, Avena, Setaria, Sinapis, Lolium, Solanum, Echinochloa, Scirpus, Monochoria, Sagittaria, Bromus, Alopecurus, Sorghum halepense, Rottboellia, Cyperus, Abutilon, Sida, Xanbthium, Amaranthus, Chenopodium, Ipomoena, Chrysanthemum, Galium, Viola and Veronica.

Sloučeniny obecného vzorce I jsou používány v nemodifikované formě, nebo s výhodou společně s pomocnými látkami běžně využívanými v přípravcích. Jsou přednostně používány koncentráty aktivních látek a dále také suspenze nebo disperze, obzvláště izotonické vodné roztoky, suspenze a disperze, ředěné emulze, rozpustné prášky, prach, granuláty, krémy, gely, olejové suspenze a rovněž enkapsulované produkty, např polymerní substance. Ve vztahu ktypu přípravku je určena i metoda aplikace, například spěj ování, atomizace, poprach, rozptyl, nátěr a polévání, která je zvolena ve vztahu k předurčenému použití a převažujících okolnostech. Přípravky mohou být sterilizovány anebo obsahují další přídavné látky neutrální povahy, například konzervační přípravky, stabilizátory, zvlhčovadla anebo emulgátory, rozpouštěcí činidla, hnojivá, či donory mikrohnojiv nebo další přípravky za účelem získání speciálních účinků.

Sloučenina obecného vzorce I může být smíchána s dalšími růstovými regulátory za účelem dosažení synergického účinku.

Přípravky

Přípravky obsahující sloučeniny obecného vzorce 1 (aktivní látky), a pokud je třeba, jednu nebo více pevných nebo kapalných pomocných látek, jsou připraveny známými způsoby, například smísením nebo mletím účinné látky s pomocnými látkami, jako jsou např. rozpouštědla nebo pevné nosiče. Do přípravků mohou být přidávány povrchově aktivní látky (surfaktanty).

V závislosti na povaze sloučeniny obecného vzorce I, která má být formulována, vhodné povrchově aktivní látky jsou neiontové, kationtové a/nebo aniontové povrchově aktivní látky a jejich směsi mající dobré emulzifikační, dispergační a zvlhčovači vlastnosti.

Příklady vhodných anionlových, neiontových a kationtových smáčedel jsou shrnuty například ve WO 97/34485.

Pro přípravu formulací obsahujících inhibitory cytokinin oxidasy na bázi substituovaných 6-anilinopurinových derivátů jsou podle toho vynálezu používána smáčedla konvečně používaná při přípravě technologií přípravků, která jsou popsána, např. v McCutcheon’s Detergents and Emulsifiers Annual” MC Publishing Corp., Ridgewood New Jersey, 1981, Stachc, H, Tensid- Taschenbuch”, Carl Hanser Verlag, MunichNicnna, 1981 and M. and J. Ash, Encyclopedia of Surfactants, Voll-111, Chemical Publishing Co., New York, 1980-81.

Formulace přípravku s inhibitorem cytokinin oxidasy obsahuje váhové od 0,1 do 95% aktivní látky, přičemž obsahují od 5 do 99,9% směsi přísad či farmaceutických nosičů a to v závislosti na způsobech aplikace a obsahují váhově i od 0,1 do 25% smáčedla.

Ačkoliv jsou komerční produkty obvyklé připravovány vc formě koncentrátů, konečný uživatel upotřebí naředěný přípravek. Kompozice může proto obsahovat i dalsi přísady, jakými jsou stabilizátory, např. rostlinné oleje nebo epoxidizované rostlinné oleje (epoxidizovaný palmový olej 0;l, řepkový nebo olivový olej), odpěňovače, např. silikonový olej, konzervační přípravky, stabilizátory, zvlhčovadla anebo cmulgátory, viskozitní činidla, pojivá, lepidla, a také hnojivá a další aktivní přísady, S výhodou jsou využívány přípravky následujícího složení: (% - hmotnostní procento)

Emulgované koncentráty:

směs aktivní přísady:	1 až 90 %, s výhodou 5 až 20 %
smáčedlo:	1 až 30 %, s výhodou 10 až 20 %
kapalný nosič:	5 až 94 %, s výhodou 70 až 85 %
Prášky: směs aktivní přísady:	0,1 až 10 %, s výhodou 0,1 až 5 %
pevný nosič:	99,9 až 90 %, s výhodou 99,9 až 95 %
Suspenzní koncentráty: směs aktivní přísady:	5 až 75 %, s výhodou 10 až 50 %
voda:	94 až 24 %, s výhodou 88 až 30 %
smáčedlo:	1 až 40 %, s výhodou 2 až 30 %
Smáčivé prášky: směs aktivní přísady:	0,5 až 90 %, s výhodou 1 až 80 %
smáčedlo:	0,5 až 20 %, s výhodou 1 až 15 %
pevný nosič:	5 až 95 %, s výhodou 15 až 90 %
Granule: směs aktivní přísady:	0,1 až 30 %, s výhodou 0,1 až 15 %
pevný nosič:	99,9 až 70 %, s výhodou 99,9 až 85 %

Kompozice mohou rovněž obsahovat další příměsi, jakými jsou stabilizátory, například vegetativní oleje nebo epoxidizovanc vegetativní oleje (cpoxidisovaný kokosový olej, řepkový olej nebo sojový olej), odpěňovače, např. silikonový olej, konzervační látky, regulátory viskozity, pojivá, zahušťovadla, a také hnojivá a další aktivní látky. Pro použití sloučenin obecného vzorce I, nebo kompozic je obsahujících, při ochraně rostlin před škodlivým vlivem růstových regulátorů se používají rozdílné metody a technologie, kterými jsou například následující:

i) Obalování osiva

a) Obalování osiva smáčivou práškovou formulací sloučeniny obecného vzorce I, a to mícháním v nádobě až do stejnorodé distribuce na povrchu semen (suché obalování). Při takové proceduře je přibližně 1 až 500 g sloučeniny obecného vzorce I (4 g až 2 kg smáčivého prášku) používáno na 100 kg osiva.

b) Obalování osiva emulzifikováným koncentrátem sloučeniny obecného vzorce I v souladu s metodou a) (mokře obalování).

c) Obalování osiva cestou máčení semen po dobu 1 až 72 h v tekutině obsahující od 100 do 1000 ppm sloučeniny obecného vzorce I, a s výhodou následného usušení semen (imerzní obalování).

Obalování semen nebo ošetření klíčících semen jsou upřednostňovanou metodou aplikace, protože ošetření aktivní látkou je určeno cílovou plodinou. Obecně jsou antidota používána od 1 do 1000 g, s výhodou od 5 do 250 g, na 100 kg semen, avšak v závislosti na metodice, která rovněž umožňuje přidání dalších aktivních látek nebo mikroživin; určené koncentrační limity se mohou pohybovat nahoru nebo dolů (opakované obalování).

ii) Aplikace cisternové směsi

Kapalná formulace směsi růstového regulátoru a antidota je používána ve váhovém poměru jednoho k druhému od 10:1 do 1 :100, rychlost aplikace růstového regulátoru od 0,005 do 5,0 kg na hektar. Taková cisternová aplikace směsi se provádí před anebo po setí.

iii) Aplikace do semenné brázdy

Sloučenina obecného vzorce I je zavedena do otevřené brázdy oseté semenem vc formě emulzifíkovaného koncentrátu, smáčivého prášku nebo granulí. Jakmile je semenná brázda zaklopena, je růstový regulátor aplikován cestou obvykle používanou při preemergentním procesu.

iv) Kontrolované uvolňování aktivních látek

Sloučeniny obecného vzorce 1 jsou aplikovány v roztoku k minerálním granulovaným nosičům nebo polymerizovaným granulím (močovina, formaldehyd) a jsou vysušeny. V případě, že je to žádoucí, tak se provádí obalování, které umožňuje postupné uvolňování látky v měřitelných množstvích po určitou specifickou periodu (obalované granule).

Kosmetické kompozice obsahují od přibližně 0,05% (w/w) do 10% (w/w) aktivní látky, s výhodou od 0,1 % (w/w) do 2 % (w/w). Kosmetické kompozice jsou ve formě krčmu, aerosolu, pleťové vody, roztoků, náplasti, obkladu, šampónu, rtěnky, pasty, krému, tinktury, spreje, atd.

Masti jsou emulze oleje ve vodě, které obsahují ne více než 70%, ale přednostně 20 až 50% vody nebo vodné fáze. Tukovou fázi tvoří uhlovodíky, například vazelína, parafínový olej nebo tvrdé parafíny, které přednostně obsahují vhodné hydroxysloučeniny jako mastné alkoholy a jejich estery, například cetyl alkohol, nebo alkoholy lanolinu, s výhodou lanolin pro zlepšení kapacity pro vázání vody. Emulgátory jsou odpovídající lipofilní sloučeniny jako sorbitanové estery mastných kyselin (Spaný), s výhodou sorbitan oleát nebo sorbitan isostearát. Aditiva k vodné fázi jsou například smáčedla jako polyalkoholy, například glycerol, propylen glykol, sorbitol a polyethylenglykol, nebo konzervační prostředky či příjemně vonící látky.

Mastné masti jsou nevodné a obsahují jako bázi hlavně uhlovodíky, například parafín, vazelínu nebo parafínový olej, a dále přírodní nebo semisyntetické tuky, například hydrogenované kokosové triglyceridy mastných kyselin nebo hydrogenované oleje, například hydrogenovaný ricínový olej nebo olej zpodzemnice olejně, a dále částečné glyccrolové estery mastných kyselin, například glycerol mono- a distearát. Dále obsahují například mastné alkoholy, emulgátory a aditiva zmíněná v souvislosti s mastmi, která zvyšují příjem vody.

Krémy jsou emulze oleje ve vodě, které obsahují více než 50% vody. Používané olejové báze jsou mastné alkoholy, například isopropyl myristát, lanolin, včelí vosk, nebo uhlovodíky, s výhodou vazelína (petrolatum) a parafínový olej. Emulgátory jsou povrchově aktivní sloučeniny s převážně hydrofilními vlastnostmi, jako jsou odpovídající neiontové emulgátory, například estery mastných kyselin polyalkoholů nebo jejich ethylenoxy adukty, například polyglycerických mastných kyselin nebo polyethylen sorbitanové estery či kyselé estery polyglycerických mastných kyselin (Tween), dále polyoxyethylenové otěry mastných alkoholů nebo polyoxyethylenové estery mastných kyselin, nebo odpovídající iontové emulgátory, jako alkalické soli sulfátů mastných alkoholů, s výhodou laurylsulfát sodný, cetylsulfát sodný nebo stearylsulfát sodný, které jsou obvykle používány v přítomnosti mastných alkoholů, např. cetyl stearyl alkoholu nebo stearyl alkoholu. Aditiva k vodné fázi jsou mimo jiné činidla, která chrání krémy před vyschnutím, například polyalkoholy jako glycerol, sorbitol, propylenglykol a polyethylenglykol, a dále konzervační činidla a příjemně vonící látky.

Pasty jsou krčiny nebo masti obsahující práškové složky absorbující sekreci jako jsou oxidy kovů, například oxidy titanu nebo oxid zinečnatý, a dále talek či silikáty hliníku, které mají za úkol vázat přítomnou vlhkost nebo sekreci.

Olejové suspense obsahují jako olejovou složku rostlinné, syntetické nebo semisyntetické oleje obvyklé pro injekční účely. Oleje, které zde mohou být zmíněny, jsou obzvláště kapalné estery mastných kyselin, které obsahují jako kyselou složku mastnou kyselinu s dlouhým řetězcem majícím 8-22, s výhodou pak 12-22 uhlíkových atomů, například kyselinu laurovou, tridekanovou, myristovou, pentadekanovou, palmitovou, margarovou, stearovou, arachidonovou a behenovou, nebo odpovídající nenasycené kyseliny, například kyselinu olejovou, alaidikovou, eurikovou, brasidovou a linoleovou, případně s přídavkem antioxidantů, například vitaminu E, β-karotenu nebo 3,5-di-ň?n-butyl-4hydroxytoluenu. Alkoholová složka těchto esterů mastných kyselin nemá více než 6 uhlíkových atomů a je mono- nebo polyhydrická, například mono-, di- nebo trihydrické alkoholy jako metanol, etanol, propanol, butanol nebo pentanol a jejich isomery, ale hlavně glykol a glycerol. Estery mastných kyselin jsou s výhodou například ethyl oleát, isopropyl myristát, isopropyl palmitát, „Labrafil M 2375“ (polyoxyethylen glycerol triolcát, Gattefoseé, Paříž), „Labrafil M 1944 CS“ (nenasycené polyglykolované glyceridy připravené alkoholýzou oleje z meruňkových jader a složený z glyceridů a esterů polyethylenglykolu; Gattefoseé, Paříž), „Labrasol“ (nasycené polyglykolované glyceridy připravené alkoholýzou TCM a složené z glyceridů a esterů polyethylenglykolu; Gattefoseé, Paříž), „Miglyol 812“ (triglycerid nasycených mastných kyselin s délkou řetězce Cg až C12 od Huis AG, Německo) a zvláště rostlinné oleje jako bavlníkový olej, mandlový olej, olivový olej, ricinový olej, sezamový olej, sójový olej a olej z podzemnicc olejné.

Pěny jsou aplikovány z tlakových nádob a jsou to kapalné emulze oleje ve vodě v aerosolové formě, přičemž jako hnací plyny jsou používány halogenované uhlovodíky, jako chlor-fluor nižší alkany, např. dichlorfluormethan a dichlortctrafluorethan, nebo přednostně nehalo gen ováné plynné uhlovodíky, vzduch, N2O či oxid uhličitý. Používané olejové fáze jsou stejné jako pro masti a také jsou používána aditiva tam zmíněná.

Tinktury a roztoky obvykle obsahují vodně-etanolickou bázi, ke které jsou přimíchána zvlhčovadla pro snížení odpařování jako jsou polyalkoholy, například glycerol, glykoly a polyethylenglykol, dále promazávadla jako estery mastných kyselin a nižších polyethylenglykolů, tj. lipofilní látky rozpustné ve vodné směsi nahrazující tukové látky odstraněné z kůže etanolem, a pokud je to nutné, i ostatní neutrální látky a aditiva.

Seznam vyobrazení

Obr. 1 ukazuje obnovení přirozeného fenotypu po systematické aplikaci látky 12 na CKX nadprodukující rostliny. + znamená ošetřeno, - neošetřeno.

Obr. 2 ukazuje srovnání účinku cytokininu a CKX inhibitoru na obnovení přirozeného fenotypu AtCKXl semenáčků Arabidopsis. (A) AtCKXl, (B) AtCKXl kultivované na 0,1 μΜ látce 12, (C) AtCKXl kultivované na 0,1 μΜ BAP, (D) kontrolní rostlina s přirozeným fenotypem.

Obr. 3 znázorňuje účinek látky 12 na kvetení rostlin Arabidopsis.

Obr. 4 znázorňuje vliv 2-chlor-6-(4-hydroxyanilino) purinu na adhcrenci buněk Hodnoty uvedeny relativně vzhledem ke kontrole.

Obr. 5 znázorňuje vliv 2-chlor-6-(4-hydroxyanilino)purinu na viabilitu buněk po 3 dnech. Hodnoty uvedeny relativně vzhledem ke kontrole.

Obr. 6 znázorňuje růstovou křivku lidských diploidních fibroblastů BJ ovlivněných 2-chlor-6-(4hydroxyanilino)purinem

Obr. 7 ukazuje počet buněk po 7 a 14 denním působení 2-chlor-6-(4-hydroxyanilino)purinu. Hodnoty uvedeny relativně vzhledem ke kontrole.

Příklady provedení vynálezu

Výchozím materiálem pro přípravu sloučenin obecného vzorce 1 je 2,6-chlorpurin. Dalším výchozím materiálem je 2-amino-6-chlorpurin nebo 2-fluor-6-chlorpurin, který je možné buď připravit z 2-amino-6-chlorpurinu reakcí s kyselinou tetrafluoroboritou v přítomnosti vodného roztoku dusičnanu sodného (Beach et al., 1992). Další výchozí materiál, 2-brom-ó-chlorpurin, je možné připravit z 2-amino-6-chlorpurinu diazotací s tbutyl nitritem a následnou bromací za přítomnosti vhodného donoru bromu (Kim Ilak Sung et al.; J.Med.Chem.46; 23; 2003; 4974-4987). Další výchozí materiál může být ještě 2methyl-6-chlorpurin, který je možné připravit z 6-chlor-2-jodpurinu Stillovým cross couplingem (Kim et al., 2003). Dalším výchozím materiálem může ještě být 2-nitro-6-chlor9-Boc-purin, který je možné připravit z 6-chlorpurinu (Rodenko ct al.; J .Am. Chem .Soc. 2005, 127, 5957-5963).

Výchozí substituované fenylaminy, které nebyly komerčně dostupné (ostatní získány od Sigma Aldrich nebo Fluorochem), byly připraveny zodpovídajících aldehydů v přítomnosti katalyzátoru. Ty, které mají více hydroxy skupin, mohou být s výhodou připraveny demctylací odpovídajících methoxyderivátů 48% HBr v N2 atmosféře.

Elementární analýzy (C, H a N) byly měřeny na EA1108 CHN analyzátoru (Fissons Instruments). Na zjišťování bodu tání byl použit přístroj BÚCHI Melting Point B-540. Analytická tcnkovrstvá chromatografie (TLC) byla prováděna na destičkách silikagelu 60 WF254 (Merck), v mobilní fázi CHClyMEOITkonc. NII4OH (8:2:0,2, v/v/v). ES+ hmotová spektra byla naměřena za použití přímého nástřiku na Waters ZMD 2000 hmotovém spektrometru. Hmotnostní interval při měření byl 10 - 1500 amu. Spektra byla měřena za použití cyklických skenů o délce 3,0 sekundy, při napětí na vstupní štěrbině 25 V a teplotě vypalovacího bloku 150 °C, desolvatační teplotě 80 °C a průtoku desolvatačního plynu 200 1/hodinu. Získaná data byla zpracována pomocí programu MassLynx data system. NMR spektra byla měřena na přístroji Broker Avance AV 300 při teplotě 300 K a frekvenci 300,3 MHz (^lH) respektive 75,48 MHz (¹³C). Vzorky byly připraveny rozpuštěním daných látek v DMSO-d₆. Tetramethylsilan (TMS) byl použit jako interní standard.

Příklad 1

2-Chlor-6-anilinopurm

Anilin (4,66 g; 0,05 mol) byl přidán do suspenze 2,6-dichlorpurinu (5,67 g; 0,03 mol) v npropanolu (60 ml) a N,N-ethyldiisopropylaminu (6,44 g; 0,05 mol). Reakění směs byla míchána při 100 °C po 4 hodiny. Po ochlazení na pokojovou teplotu byl vzniklý precipitát zfiltrován, promyt n-propanolem (2x10 ml) a vodou (3x10 ml) a vysušen při 60 C do konstantní váhy. Výtěžek: 6,26 g nažloutlé pevné látky (84,9 %). TLC (chloroform-metanol; 85:15): žádné nečistoty; bez výchozích látek, HPLC čistota: 98+ %

Příklad 2

2-Chlor-6f3<hloranilino)purin

2,6-Dichlorpurin (3,78 g; 0,02 mol) byl smíchán s 3-chloranilinem (3,83 g; 0,03 mol) v nbutanolu (40 ml) v přítomnosti triethylaminu (7 ml; 0,05 mol) při 110 °C 3 hodiny. Po ochlazení na pokojovou teplotu byla reakční směs míchána při 0 °C 2 hodiny. Žlutý precipitát byl zfiltrován, promyt chladným n-butanolcm (2x10 ml), vodou (3x10 ml) a vysušen při 60 °C do konstantní váhy. Výtěžek: 3,69 g žlutý krystalický prášek (65.8 %). Surový produkt byl rekrystalizován v isopropanolu a poskytl 2,85 g čisté látky. ILC (chloroform-metanol; 85:15): žádné nečistoty; bez výchozích látek. HPLC čistota: 98+ %

Příklad 3

2*Chlor-6-(3-fliioranilino)purin

Látka byla připravena, jak je popsáno v příkladu 2, reakcí 2,6-dichlorpurinu s 3fluoroanilinem. Reakční směs byla následně odpařena na rotační vakuové odparce, zbytek byl rozdělen mezi ethylacetát a 0,5 M HCL Organická vrstva byla promyta vodou, vysušena .\4gSO4, a odpařena v výtěžkem žluté pevné látky (3,72 g). Surový produkt byl přečištěn flash chromatografií. Výtěžek: 2,20 g žlutého krystalického prasku. ILC (chloroformmetanol; 85:15): homogenní. HPLC čistota: 98+ %

Příklad 4

2-Chlor-6-(3-hydroxyanilino)purin

Tato látka byla připravena reakcí 2,6-dichlorpurinu (3,78 g; 0,02 mol), 3-aminofenolu (3,27 g; 0,03 mol), a N,N-ethyldiisopropylaminu (6,44 g; 0,05 mol) v n-butanolu (40 ml) při 90 °C 4 hodiny. Reakční směs pak byla míchána při pokojové teplotě a vzniklá krystalická sraženina, promytá chladným n-butanolem (3x10 ml), vodou (3x10 ml), byla následně vysušena do konstantní váhy.

TLC (chloroform-metanol; 85:15): homogenní. HPLC čistota: 98+ %

Příklad 5

2-CMor-6-(3-methoxyanilino)purin

Do suspenze 2,6-dichlorpurinu (3,78 g; 0,02 mol) a m-anisidinu (3,69 g; 0,03 mol) v npentanolu (40 ml), byl přidán triethylamin (7 ml; 0,05 mol). Reakční směs byla míchána při 100 °C 4 hodiny a následně ochlazena na pokojovou teplotu. Bílá sraženina byla po odsátí promyta isopropanolem (2x10 ml) a vodou (3x10 ml). Surový produkt byl rekrystalován z metanolu s aktivním uhlím za vzniku bílých krystalů. Výtěžek: 4,36 g (77,8%). TLC (chloroform-metanol; 85:15): žádné nečistoty, neobsahuje výchozí látky, HPLC čistota:98+ %

Tabulka 1

Látky připravené způsobem podle příkladu 1-5

SUBSTITUENT PURINU	CHN ANALÝZY	MS ANALÝZA-ZMD
	R6	R2	[%]	[M-H] a)	(M+Hfb)
1	anilino	chlor	C=53,5; H=3,3,N=28,6	244	246
2	2-chlornan i linn	chlor	C=46,8; H=2,9; N=24,7	278	280
3	3-chloroanilino	chlor	C=46,8; H=2,9, N-24,6	278	280
4	4-chloroanilino	chlor	C=46.9; 11=3,0; N-24,7	278	280
5	2-fl uoroani lirlů	chlor	C-49,9; 1'1=3,0; N-26.5	262	264
6	3-i! uoroani! ino	chlor	C=49,7; H=3,0, N-26,7	262	264
7	4-fl uoroani lino	chlor	C=49.8; H=3,l; N-26,4	262	264
8	2-hydroxy anilino	chlor	C-49,7, H=3J;N=26,7	260	262
9	3 -hydroxy anil ino	chlor	049,9,11-3,2; N=26,7	260	262
10	4-hydroxyanilino	chlor	C=5O,5;! 1=3,1; N-26,8	260	262
11	2-melhoxy anil ino	chlor	0=51,4, H=3,8; N=25,5	274	276
12	3-rnetlioxyanilino	chlor	C=5I,8; H=3,8; N=25,2	274	276
13	4-mcthoxyanilino	chlor	C=52,0; H=3,7; N=25,2	274	276
14	2-aminoamlin(j	chlor	050,5; 11=3,2; N=32,8	259	261
15	3-aminoanilino	chlor	0=50,6,11=3,2; N-32,5	259	261
16	4-aminoanilino	chlor	0=50,4; 11=3,3; N=32,3 Ί	259	261
17	3,4-dimethoxy anilino	chlor	C=51,3;H=3,9;N=23,3	304	306
18	2,5-dime(hoxyanilino	chlor	0=51,3; 11=4,0; N-23,2	304	306
19	3,4,5-trimelhoxy anilino	chlor	0=49,9; 11=4,2, N-21,0	334	336
20	3,4-dihydroxyanilino	chlor	C=47,2; 11=2,8; N=25,5	276	278
21	2,5-dihydroxyanilino	chlor	0=47,3; ÍI=2,8; N=25,6	276	278
22	2-chloro-5-methoxyanilino	chlor	0=46,3; H=2.9;N=22,7	308	310
23	2-chloro-3-metlioxy anilino	chlor	C-46,4; H=2,9; N=22,7	308	310
24	2’-bromo-3-methoxyanilino	chlor	0=40,8, H=2,5;N=19,4	353	355
25	2-melhoxy-3-chlOroanilino	chlor	046,4; 11=3,0; N=22,6	308	310
26	3-ethoxyanilino	chlor	0-53,8; H=4,I;N=24,3	288	290
27	2-hydroxy’5-methylanili[io	chlor	051,9. H=3.6; 025,7	274	276
28	3-hydroxy-4-niethylanilino	chlor	0=52,1,11=3,7; N=25.5	274	276
29	3-hydroxy-2-methyl anil ino	chlor	0=52,1; H=3,8;N=25,4	274	276
30	3,4-dimethylanilino	chlor	056,8; H=4,l,N=25,7	272	274
31	2-hydroxy-3-methoxyanilino	chlor	0=49,3 H-3.6; N=24,3	290	292
32	2-hvdroxy-4-mcthoxy anil ino	chlor	049,2; 11=3,7; N-24,7	290	292

33	4-hvdroxy-3,5-dimeLhoxyan ilino	chlor	C=48,2; 11=3.6; N=21.9	320	322
34	2,3-difl uoroani lino	chlor	0=46,6; 11=2,0, N=25,l	280	282
35	2,4-difluoroandinO	chlor	0=46,7, H=2,0; N=25,l	280	282
36	2,3,4-triiluoroanilino	chlor	0=43,6; H=1,6;N=23,7	280	282
37	2,4,5-triíl uoroanil ino	chlor	0=43,8,11=1,6, N=23,6	280	282
38	2,3-dichloroanilino	chlor	042,3, H=2,0; N=22.0	312	314
39	2,4-dichloroanilino	chlor	0=42,0; H=2,0;N-22,2	312	314

Příklad 6

2~Ammo-6-(3-methoxyanilim))purin

Do suspenze 2-amino-6-chlorpurinu (1,69 g; 0,01 mol) a m-anisidinu (1,23 g; 0,01 mol) v nbutanolu (20 ml) byl přidán triethylamin (3,5 ml; 0,025 mol). Vzniklá hustá suspenze byla míchána 3 hodiny při 110 °C. Když TLC potvrdilo absenci výchozích látek a přítomnost produktu, reakce byla následně ochlazena na pokojovou teplotu. Bílá sraženina byla odfiltrována, promyta n-butanolcm (3x10 ml), vodou (3x10 ml) a vysušena do konstantní váhy. Výtěžek: 2,19 g (85 %). Surový produkt byl přečištěn jako hydrochlorid krystalizací z 2,5 M roztoku HC1 v metanolu za vzniku 2,17 g téměř bílých krystalů hydrochloridu. TLC (chloroform-mctanol-NIUOH; 4:1:0.05): žádné nečistoty, neobsahuje výchozí látky. HPLC čistota: 99+ %.

Tabulka 2

Látky připravené způsobem podle příkladu 6

SUBSTITUENT PURINU	CHN ANALÝZY	MS ANALÝZY-ZMD
	R6	R2	[%]	[M-H]’ a)	[M+H]+b)
40	anil ino	fluor	C=57,6;H=3,5;N=30,7	228	230
41	2-chloroanilino	fluor	C=49,7;H=2.7;N=26.8	262	264
42	3-chloroanilino	fluor	C-49,9; 11=2,7; N=26,7	262	264
43	4-chloroanil ino	fluor	0=50,0; H=2,7;N=26,7	262	264
44	2-Π uoroanil ino	fluor	0=53,4; 11=2,7; N=28,5	246	248
45	3-íluoroanilino	fluor	C=53.3; H=2,7;N=28,5	246	248
46	4-fluoro an i lino	lluor	0=53,4; H=2,8;N=28,4	246	248
47	2-hydroxyanilino	11 uor	0=53,0; H=3,4; N=28,3	244	246
48	3-hydroxy anil ino	fluor	0=53,4; H=3,4;N=28,2	244	246
49	4-hydroxyanilino	fluor	0=53,9; 11=3,3; N-28,5	244	246

50	2-methoxy ani lino	11 nor	054,7; O4J, 027.0	258	260
51	3-methoxy i lino	fluor	055,1; H =4.0; 026,9	258	260
52	4-melhoxyanilino	fluor	055.0; 11=4.0,027,4	258	260
53	3,4-dimcthoxyanilino	fluor	053.7; H=3,9; 024,8	288	290
54	2.5-dimcthoxyanilmo	fluor	053,6; H=4,0; 024,5	288	290
55	3,4-dihydroxyanilino	fluor	050,2,11=3,0; 027,3	260	262
56	2,5-dihydroxyanilino	fluor	050,2; 11=3,0; 027.2	260	262
57	2-chloiO-5-nicthoxyanilino	fluor	049,0,11=3,1,024,0	292	294
58	2*mcthoxy-3-chloroauilino	fluor	018,0; 03,0; 024,0	292	294
59	3-cthoxyanilino	fluor	056,8; 04,2; 026,0	272	274
60	2-hydroxy-5-methyl am lino	fluor	055,2,11-3,8; 027,2	258	260
61	3-hydroxy-4-methylanilino	fluor	055,3; 03,8; 027,2	258	260
62	3-hydroxy-2-methylanilino	fluor	055,3; 03,9; 027,0	258	260
63	3,4-dimcthylaniltno	fluor	060,4; 11=4,6; 027,4	256	258

Příklad 7

2-Fluor-6-(3-methoxyanilino)purin

Látka byla připravena reakcí 2-fluor-6-chlorpurinu (1,7 g; 0,01 mol), m-anisidinu (1,23 g; 0,01 mol) a triethylaminu (3,5 ml; 0,025 mol) v n-butanolu (20 ml) při 90 °C po dobu 4 hodin. Reakční směs byla následně ochlazena na pokojovou teplotu a vzniklá bílá sraženina byla odsáta, promyta n-butanolem (3x10 ml), vodou (3x10 ml) a vysušena do konstantní hmotnosti. Výtěžek: 5,55 g (61 %) nažloutlého krystalického prášku. TLC (chloro formmetanol; 85:15): žádné nečistoty. HPLC čistota: 99+ %.

Tabulka 3

Látky připravené způsobem podle příkladu 17

SUBSTITUENT PURINU	CHN ANALÝZY	MS ANALÝZA-ZMD
	R6	R2	[%]	[M-H]' a)	(M+Hfb)
64	aniline	aminu	058,2,11=4,4; 037,5	225	227
65	2-chloroanilino	amino	050,2; 11=3,3; 032,9	259	261
66	3-chloroanilino	amino	050,5; 03,4; 032,6	259	261
67	4-chloroanilino	ani i no	050,5; 03,4; 032,5	259	261
68	2-íluoroanilino	amino	053,8; 03,7; 034,7	243	245
69	3-Íluoroanilino	amino	053,9; 11=3,6; 034,8	243	245
70	4-fluoroariilino	amino	054,0; 03.7; 034,5	243	245

71	2-hydroxyanilino	amino	054,0; H=4J;N=34,9	241	243
72	3-hydroxyanil ino	amino	054,1; H=4,2; N=34,8	241	243
73	4-hydroxyanilino	amino	054,4; H-4,2, N=34,7	241	243
74	2-methoxyanilÍno	amino	055,9; H=4,7; N=33,0	255	257
75	3-methoxyanilino	amino	056,0; N-32,9	255	257
76	4-methoxyanilino	amino	056,3; H-4,7; N=32,9	255	257
77	3,4-dimethylanil ino	amino	051.0; H=5,5, N=33,4	253	255

Příklad 8

2-Thioxanthin

4,5-Diamino-6-hydroxy-2-thiopyrimidin (100 g) byl refluxován s 90% kyselinou mravenčí (500 ml) dvě hodiny za mechanického míchání. Po ztuhnutí směsi bylo přidáno dalších 100 ml kyseliny mravenčí. Směs ochlazena na 1 °C a surový 4-amino-5-íormamido-6-hydroxy-2thiopyrimidin byl následně odfiltrován a vysušen pod vakuem. Filtrační koláč byl resuspendován ve formamidu (225 ml) a zahříván na teplotu 175-185 °C v parafinové lázni po dvě hodiny za občasného míchání. Směs byla následně ochlazena na pokojovou teplotu, znovu zfi litována, promyta dvěma litry 1 M NaOH a vysušena dvě hodiny při teplotě 95 °C. Výtěžek 103 g (97 %).

Příklad 9

2-Benzylthio-6-purmol

5,28 gramů 8-thioxanthinu bylo resuspendováno v 78,5 ml 1 M NaOH, naředěno vodou na celkový objem 400 ml. (Výchozí látka se zcela nerozpustí ani po přidání 2,5-násobku báze). Následně bylo přidáno 3,7 ml benzyl chloridu a smě byla silně míchána po dobu 3 hodin při pokojové teplotě, pak upraveno pH na 5 pomocí ledové kys. octové.Vznikla červená sraženina, která byla odsáta, promyta důkladně vodou a vysušena přes noc ve vakuu 80 °C. Takto bylo získáno 7,33 g růžové pevné látky, která byla použita do následující reakce bez dalšího přečištění.

Příklad 10

2-Benzylthio-6-chlorpurin

K 2-benzylthioxanthinu (27,6 g. 0,107 mmol) byl přidán POC1₃ (506 ml) a N,Ndiethylanílin (40 ml). Směs byla refluxována 1,5 hodiny a přebytek POCI3 byl odstraněn odpařením ve vakuu. Výsledný sirup byl smíchán s ledem (2 kg) a za přidání hydroxidu sodného a chlazení vznikla pevná látka. Směs byla následně okyselena pomocí koncentrované HC1 na pH 1 a vzniklá pevná látka byla odsáta, promyta vodou a vysušena několik hodin při teplotě 70 °C. Surový produkt, na prášek rozmělněný, byl smíchán s malým množstvím metanolu a žlutá pevná látka byla vysušena ve vakuu při 70 °C. Výtěžek 17,5 g (59%). Surový 2-benzylthio-6-chlorpurin, stejně jako 2-benzylthioxanthin, je dobře rozpustný v DMSO. TLC (chloro form-methanol; 95:5): bez výchozích látek. Surový produkt byl čištěn kolonovou chromatografií (125 g silika) a cluován 2,5 % McOH/chloroform. Z frakcí (100ml) 7-36 byla odpařením získána žlutá pevná látka, která byla následně rekrystalována z 50% metanolu. Získána bílá krystalická látka a vysušena do konstantní váhy při 45°C (chloridem vápenatým a následně oxidem fosforečným přes noc). Výtěžek: 3 g. Bod tání 176-178 °C, bez rozkladu. TLC (SILICA-5% MeOH/chloroform). HPLC čistota: 95+%

Příklad 11

2-Benzyllhio-6-anilinopurin

2-Benzylthio-6-chlorpurin (3,9 g) a anilin ( 3,42 g) byl refluxován v n-BuOH (100 ml) za přítomnosti triethylaminu (7,5 ml) 2 h. Reakční směs byla následně ochlazena na pokojovou teplotu, odpařena do sucha na rotační vakuové odparce, znovu ochlazena ledem a přidáno 400 ml vody za silného třepání. Při stání přes noc při -16°C vznikl tmavohnědý surový produkt, který byl následně vysušen do konstantní váhy a přečištěn preparativní kolonovou chromatografií (100 g silica). Kolona byla promyta chloroformem a 500 ml x 1,25% McOH/chloroform, následně eluována 1,5 1 x 2,5% MeOH/chloroform. Frakce (100 ml) 1215 byly odpařeny do sucha za vzniku světle hnědého produktu, který byl rekrystalizován z metanolu za přítomnosti aktivního uhlí. Výtěžek: 1,18 g bílé amorfní látky. 4LC (2.5% MeOH/chloroform) žádné nečistoty. HPLC čistota: 98+%.

Příklad 12

2-Thio-6-anilinopurin

2-Benzylthio-6-anilinopurin (1,18 g) byl rozpuštěn v tekutém amoniaku (125 ml). Do vzniklého roztoku byl následně přidáván sodík po malých částech do vzniku stabilního modrého zabarvení. V dalším kroku bylo pak přidáno male množství chloridu amonného a tak odstraněn přebytek sodíku. Po zredukování objemu byl přidán ether (125 ml) (k odstranění vedlejších produktu). Po odstranění zbytku amoniaku byla reakční směs extrahována vodou (2 x 65 ml). pH vodné frakce bylo následně upraveno pomocí kys, octové na 5 a roztok ochlazen suchým ledem pod -10 °C, za vzniku pevné látky krémové barvy. Produkt byl zfiltrován, promyt důkladně vodou a vysušen přes noc nad chloridem vápenatým. Výtěžek; 760 mg téměř bílého prášku. 1LC: žádné nečistoty. HPLC čistota. 95%.

Tabulka 4

Látky připravené způsobem podle příkladu 12

SUBSTITUENT PURINU	CHN ANALÝZY	MS ANALÝZA-ZMD
	R6	R2	[%]	[M-II]’ a)	[M+H] b)
78	anúino	thio	054,0; H-3,5;N-29.0	242	244
79	2-chloroani!ino	thio	047.2; H-2,7, N-25,4	276	278
80	3-cldoroanilino	thio	C=47,4; H=2,8; N-25,1	276	278
81	4-chloroanilino	thio	047,4; H=2,8; N=25,2	276	278
82	2-fluoroanilino	thio	050,5; H=3,0; N=27,0	260	262
83	3-ílnorcianilino	thio	050,5; 02,8; N=27.0	260	262
84	441 uoroan i 1 ino	thio	C=50.4; H=3,0;N=27,2	260	262
85	2-hydroxyanilino	thio	050,6; H=3,4; N=27,2	258	260
86	3-hydiO.xyanilitiů	thio	050,2; 03,2; 027,7	258	260
87	2-methoxyanilino	thio	052,5; H=M,0;N-26,0	272	274
88	3-mctlioxyanilino	thio	052.6; O4,1;N=25.7	272	274
89	4-melhoxyanilino	thio	052,5; H=4,Q; N=25,9	272	274
90	3,4-dimethoxyaniIino	thio	051,7; O4,l;N-23,5	302	304
91	2,5-dimcthoxyanilino	thio	051,1; 11-4,3; 023,3	302	304
92	2’Chloro-5-metlioxyamlino	thio	C=46.3; 03,1; 022,9	306	308
93	2-mcthoxy-3-chk>roanilino	thio	C=46,4; 03,2; 022,9	306	308

Příklad 13

2-Methylíhioxcmthin

Do Čerstvě připraveného roztoku 2-thioxanthinu (103g, 0,613 molu) ve 2 M NaOH (613 ml) a vodě (245 ml) byl po kapkách přidán dimethyl sulfát (77 g, 58 ml), teplota byla udržována mezi 25 a 40 °C, Reakční směs byla další hodinu míchána a pak ponechána přes noc při pokojové teplotě. Poté byla tmavě červená kapalina zfiltrována a produkt vysrážen ledovou kyselinou octovou, zfiltrován a rekrystalizován z horké vody (1500 ml) s přídavkem aktivního uhlí. Produkt vykrystaloval při -10°C, byl následně zfiltrován a sušen při 95 °C 3 h, a poté nad oxidem fosforečným do konstantní váhy. Výtěžek: 48 %. HPLC čistota: 80%.

Příklad 14

2-Melhylthio-6-chlorpurin

2-Methylthioxanthin (65 g) byl smíchán s POC1₃ (975 ml) a N,N-diethylanilinem (97,5 ml). Rcakční směs byla následně reíluxována s mechanickým mícháním po dobu 90 minut. Přebytek POCI3 byl odstraněn na vakuové rotační odparce při 55-60 °C a zbytek byl míchán sledem (0 °C, 1,75 kg) po dobu 10 minut (do dokončení hydrolýzy POCI3. Produkt byl následně extrahován ethylacetátem (4 x 2,5 1). Extrakty byly promyty vodou a odpařeny do sucha, za vzniku tmavě hnědé pevné látky. Surový produkt byl rekrystalován s etanolu za přítomnosti aktivního uhlí a vysušen do konstantní hmotnosti nad oxidem fosforečným. Výtěžek: 23,6 g (33%). HPLC čistota: 99%. TLC (chloroform/methanol, 9/1) bez nečistot.

Příklad 15

2'Meíhylthio-6-anilinopurin

Směs 2-methylthio-6-chlorpurinu (10 g, 50 mmol), anilinu (7,7 g, 63 mmol) a triethylaminu (35 ml, 250 mmol) byla reíluxována v butanolu (400 ml) 2 hodiny. Butanol byl odpařen pod vakuem a po ochlazení přidána voda (290 ml). pH bylo upraveno na 8,0 a směs byla ponechána přes noc při -16 °C. Vzniklý žluto-zelený produkt (10 g) byl zfiltrován, vysušen pod vakuem nad oxidem fosforečným a chromatograficky přečištěn (250 g silika, Fisons, v chloroformu), eluován směsí chloroform/metanol (97/3, v/v). Odpovídající frakce byly odpařeny do sucha, produkt rekrystalován z etanolu s přídavkem aktivního uhlí a následně vysušen nad oxidem fosforečným do konstantní hmotnosti. Výtěžek 5,76 g, ( 46% ), HPLC Čistota >98%.

TLC: Chloroform/metanol (9:1, v/v), bez nečistot.

Tabulka 5

Látky připravené způsobem podle příkladu 15

SUBSTITUENT PURINU	CHN ANALÝZY	MS ANALÝZA-ZMD
	R6	R2	[%]	[M-H]' a)	[M+H]%)
94	anilino	metliylthio	C=55,9; H=4,2; N=27,3	256	258
95	2-chloroanitino	tnetliylthio	049,1; H=3,3; N-24,3	290	292

96	3-chloroanilino	mcthylthio	0=49,1; H=3J; N=24.1	290	292
97	2-fluoroanilino	methyl th i o	C=52,2; H=3,7; N=25.3	274	276
98	3-fluoro an i lino	mcthylthio	0=52,4; H=3,6;N=25.4	274	276
99	4-fluoroanihno	mcthylthio	C=51,9; H=3,4. N=25.6	274	276
100	2-hydroxyanilino	methylthio	C=52,5,11=4,0; N=25,8	272 H	274
101	3-hydroxy ani lino	mcthylthio	0=52,5; H-4,0; N=25.7	272	274
102	2-methoxyanilmo	mcthylthio	C=54,3; H=4,4; N=24,6	286	288
103	3-metlioxyanilino	mcthylthio	0=54,0; H_4,4,N-24,9	286	288
104	4-methoxyamlino	mcthylthio	0=53,8; H-4,3;N=24,7	286	288
105	3,4-dimethoxyanilino	methyl th io	C-52,6; 11-4,7; N=22,2	316	318
106	2,5-dimetlioxyanilino	mcthylthio	0=52,9; 11=4,8; N=22,2	316	318
107	2-chloro-5-mdhoxy anilinu	meihylthio	0=48,8; 11=4,7; N=22,0	320	322
108	2-metlioxy-3-chloroanilino	mcthylthio	0=48,1; H=5,3;N=2I,3	320	322

Příklad 16

2-Methy}-6-(3-methoxyamlino)purm

Do suspenze 2-methyl-6-chlorpurinu (1,69 g; 0,01 mol) a m-anisidinu (1,23 g; 0,01 mol) v nbutanolu (20 ml) byl přidán triethylamin (3,5 ml; 0,025 mol). Vzniklá hustá směs byla míchána při 110 °C po 3 hodiny, kdy TLC ukázalo nepřítomnost výchozích látek v rcakční směsi. Ta byla následně ochlazena na pokojovou teplotu. Bílá sraženina byla zfiltrována, promyta n-butanolem (2x10 ml), vodou (3x10 ml) a vysušena do konstantní hmotnosti. Výtěžek: 1,92 g (75 %). Surový produkt byl přečištěn jako hydrochlorid krystalizací z 2.5 M roztoku kyseliny chlorovodíkové v metanolu. TLC (chloroform-metanol-NH₄OH; 4:1:0,05): bez nečistot a výchozích látek. IIPLC čistota: 99+ %.

Tabulka 6

Látky připravené způsobem podle příkladu 16

PURIN SUBSTITUENT	CHN ANALYSES	MS ANALYSES-ZMD
	R6	R2	[%]	[M-H]' a)	[Μ+Η]\)
109	anilinů	methyl	0=63,8. H=4,9; N=31,2	224	226
110	2-chloroanilino	methyl	0=55,3; H=3,7;N=27.3	258	260
111	3-chloroanilino	methyl	0=55,3; 11=3.8; N=27,3	258	260
112	2-fluoroanilino	methyl	C=59,0, H=4,l;N=29,0	242	244

113	3-fluoroanilino	methyl	059,2; 11=4,2; N=29J	242	244
114	4-tluoroanilino	methyl	059,1; 04,1; N=29.0	242	244
115	2-hydroxvanilino	methyl	C=60,0; 04,6; 029,2	240	242
116	3-hydroxyamlino	methyl	059,9; H=4,6,N=29.1	240	242
117	2-mcthoxyanilino	methyl	061,1; 05,2; 027,9	254	256
118	3-melhoxyanilino	methyl	060,8; O5,1;N=27,5	254	256
119	4-mcthoxyanílíno	methyl	061,0:05.1:027,5	254	256
120	3,4-dimetlioxyanilino	methyl	058,5; 05,1; 024.9	284	286
121	2,5-dimethoxyanilino	methyl	058,8; 05,1; N=24,6	284	286
122	2-ch!oro5-metlioxyamlino	methyl	053,7; 04,1; 024,3	288	290
123	2-methoxy-3-chloroaní!ino	methyl	053,8, H=4.2;N=24,6	288	290

Příklad 17

2-Brom-6-(methoxyanilino)purín

2-Brom-6-(methoxyanilino)purin byl připraven podobně jako látka v příkladu 5, zde reakcí 2-brom-6-chlorpurinu a m-anisidinu (v molárním poměru 1:1) v přítomnosti triethylaminu (2,5 eq.) v n-propanolu při 100 °C 4 hodiny. Po ochlazení na pokojovou teplotu byla vzniklá bílá sraženina zfiltrována, promyta chladným n-propanolem, vodou a vysušena v exikátoru do konstantní hmotnosti. Výtěžek: 69% (jako hydrobromid). Surový produkt byl rekrystalován z metanolu a volná báze byla získána reakcí hydrobromidu s 10% vodným roztokem amoniaku. IIPLC čistota: 98+%.

Tabulka 7

Látky připravené způsobem podle příkladu 17

SUBSTITUENT PURTNU	CI IN ANALÝZY	MS ANALÝZA-ZMD
	R6	R2	[%]	[M-H] a)	[M+H]+b)
124	anilino	brom	045,4; 02.7; 024.3	289	291
125	2-cliloroanilino	brom	040.5:02.1,021.7	323	325
126	3-chloroanilino	brom	040.5,11=2.1:021.6	323	325
127	2-fluoroanilino	brom	C=44.5;O2 1; 023.0	307	309
128	3-fluoroani lino	brom	044.7; 02.1; 022.9	307	309
129	3-methoxy ani lino	brom	044.6:03.2:021.6	319	321
130	2-hydroxy anil in o	brom ;	042 9; 02.6; 023.1	305	307
131	3-hydroxyanilino	brom	043 2; 04,6; 022.9	305	307

Příklad 18

2-Nitro-6-(3-methoxyfenyl)amino-9-Boc-purin

Do roztoku 2-nitro-6-chlor-9-THP-purinu (3,00 g; 0,01 mol) v metanolu (40 ml) při 0°C byl po kapkách přidán roztok m-anisidinu (1,48 g; 0,012 mol) a triethylaminu (3,0 g = 4,2 ml; 0.03 mol) v metanolu (1 Oml). Teplota při rekci byla udržována +5 °C. Po přidání veškerého m-anisidinu byla reakční směs (monitorována ÍLC do vymizení výchozího 2-nitro-6-chlor-9TlIP-purinu v reakční směsi) za míchání pomalu ohřátá na pokojovou teplotu. Methanol byl následně odpařen a produkt rozdělen mezi vodu (50 ml) a ethylacctát (50 ml). Vodná fáze byla znovu reextrahována ethylacetátem (50 ml). Spojené organické fáze byly promyty vodou (20 ml), sušeny bezvodým MgSO₄, a odpařeny do sucha. Surový produkt byl rekrystalován ze směsi ether - cyklohexan (1:1). Výtěžek: 3,1 g (80 %) téměř bílého krystalického produktu. Čistota (HPLC): 98%+,

Příklad 19

2-Nitro-6-(3-melhoxyfenyl)amÍHopurin

2-Nitro-6-(3-methoxyfcnyl)amino-9-Boc-purin (3,86 g; 0,01 mol) byl rozpuštěn v 50% kyselině trifluoroctové (50 ml) při 0 °C. Roztok byl inkubován přes noc v lednici a následně odpařen na rotační vakuové odparce. Krystalický produkt byl smíchán s vychlazeným 5 % vodným roztokem amoniaku (100 ml). Surový produkt byl /filtrován a rekrystalován z 50% metanolu. Výtěžek: 1,97g (69 %) nažloutlé krystalické látky; čistota (IIPLC): 98%+.

Tabulka 8

Látky připravené způsobem podle příkladu 18-19

SUBSTITUENT PURINU	CHN ANALÝZY	MS ANALÝZA-ZMD
	R6	R2	[%]	[M-H]' a)	[M+H]+b)
124	antlino	nitro	0=55.1; H=3 4; N-35 1	239	241
125	2-chloroanihno	nitro	C=47.9; H=2.6;N=30 9	273	275
126	3-chloroanilino	nitro	C=48.0; H=2 6;N=30.7	273	275
127	2-fluoroanilino	nitro	0=51 0; 11=2.6, N=32.8	257	259
128	341Liomanilino	nitro	C=51.1; H=2 7, N=32.8	257	259
129	3-methoxyanilino	nitro	C=53 1; 1-1=3.6; N-31.5	269	271
130	2-hydroxyanilino	nitro	C=51.5; H=3.1;N=33.O	255	257

131

3-hydroxyanilino

nitro

051.3: Η=2.9;Ν=32.9 | 255 | 257 |

Příklad 20

Inhibice aktivity cytokinin oxidasy

Hodnoty IC50 byly stanoveny užitím testu v mikrotitrační destičce. Každá jamka obsahovala 100 μΐ PMS/MTT [fenazin methosulfát/3-(4,5’dimcthylthiazol-2-yl)-2,5difenyltctrazolium bromid] reakční směsi (výsledné koncentrace složek: 0,1 M KH2PO4, pH 7,4, 1 mM MTT, 0,2 mM PMS) obsahující testovanou látku (3 x 10⁷ M 3 x 1(T⁴M) a 30 μΜ N⁶-isopentenyladeninu (iP) jako substrátu. Ke směsi bylo přidáno 100 μΐ buněk prostého růstového media kmene S. cerevisiae 23344c ura nesoucího plasmid pYES2-AtCKX2, jako zdroje AtCKX2. Destičky byly inkubovány 30 min ve tmě a enzymatická reakce byla zastavena přídavkem 25 μΐ 35% kys. octové. Následně byla změřena absorbance při 578 nm na spektrofotometru Tecan. Absorbance vzorku bez iP byla odečtena.

Hodnota IC₅₀, tedy koncentrace látky inhibující aktivitu enzymu z 50%, byla spočtena ze získaných křivek odezvy. V tabulce 9 jsou uvedené průměry ze tří opakování, celý test byl proveden nejméně dvakrát. Látky účinnější než thidiazuron (referenční látka) mají IC50 nižší než thidiazuron.

Tabulka 9

Účinek nových látek na inhibici rckombinantní A1CKX2

No.	Testovaná látka	IC50 (gmol.L’1)
R6	R2
	thidiazuron		30
1	anilino	chloro	22.6
3	3-chloroanilino	chloro	6.3
4	4-chloroanilino	chloro	24.1
6	3-fluoroanilino	chloro	12.2 - — _ ---------------
7	4-fluoroanilino	chloro	28.3
9	3-hydroxyanilino	chloro	3.5
12	3-methoxyanilino	chloro	0.8
13	4-methoxyanilino	chloro	18

40	anilino	fluoro	14.9
42	3-chloroanilino	fluoro	15.3
43	4-chloroanilino	fluoro	27
45	3-fluoroanilino	fluoro	22.1
48	3-hydroxyanilino	fluoro	11,8
51	3-methoxyanilino	fluoro	0.4
66	3-chloiOanilino	amino	25.6
69	3-fluoroanilino	amino	29.4
75	3-methoxyanilino	amino	24.7
80	3-chloroanilino	thio	28.4
83	3-fluoroanilino	thio	22.6
88	3-methoxyanilino	thio	28.3
111	3-chloroanilino	methyl	15.7
113	3-fluoroanilino	methyl	21.8
118	3-mcthoxyanilino	methyl	9.4

Příklad 21

In vivo účinek 2-chlor~6-(3-methoxyanilino)aminopurimi (látka 12)

Transgenní rostliny Arabidopsis 35S:AtCKXl a tabáku 35S:AtCKX2 pěstované v půdě ve skleníku byly systematicky ošetřovány 10 μΜ látky 12. Nadzemní části kontrolních transgenních rostlin byly sprejovány každý druhý den po dobu jednoho měsíce vodným roztokem látky 12 obsahujícím 0,01% smáčedla Silwet L-77. Z obrázku 1 je jasně patrné, že aplikace CKX inhibitoru 2-chlor-6-(3methoxyanilino)aminopurinu (látka 12) uvolnila rostliny z růstové inhibice způsobené poklesem cytokininů a vedla k obnovení přirozeného fenotypu. Abychom potvrdili, že tento účinek není obecným účinkem exogennč aplikovaného cytokininů, ale specifickým účinkem CKX inhibitoru, byly CKX1 nadprodukující semenáčky Arabidopsis pěstovány in vitro na MS mediu obsahujícím 0,1 μΜ cytokinin BAP (obrázek 2C) nebo stejnou koncentraci látky 12 (obrázek 2B). K obnovení přirozeného fenotypu došlo pouze pokud byla v médiu přítomná látka 12.

Dlouhodobá aplikace látky 12 na přirozené rostliny Arabidopsis vedla k pozměněnému vývoji kvetů a inhibici oplodnění (obrázek 3). Květy měly špatně vyvinuté prašníky a byly sterilní.

Příklad 22

Aktivace cytokininových receptorú

Escherichia coli kmeny KMI001 nesoucí plasmid pIN-Ill·AHK4 nebo pSTV28ΛΗΚ3 byly pěstovány přes noc při 25 °C v M9 médiu obohaceném 0,1% kasaminovými kyselinami do ΟΓ>6οο~ 1. Prekultura byla naředěna 1:600 v 1 ml M9 média obsahujícího 0,1% kasaminovými kyselinami a k ní byl přidán 1 μΐ zásobního roztoku testované látky (10'⁷ M - 5 x ΙΟ'⁵ M) nebo rozpouštědla (DMSO, ethanol, methanol). Kultury byly dále kultivovány při 25 °C v mikrotitrační destičce, 200 μΐ na jamku, po dobu 17 h v případě CRE1/AIIK4 kultury a 28 h v případě AHK3 kultury. Poté byly kultury zccntrifugovány a 50 μΐ alikvoty supematantu byly přeneseny do mikrotitrační destičky obsahující 2 μΐ 50 mM 4-methyl umbclliferyl galaktosidu v každé jamce a následně inkubovány 1 h při 37 °C. Reakce byla zastavena přídavkem 100 μΐ 0,2 M Na2CO3- Fluorescence vzorků byla změřena spektrofotometrem Fluoroscan Ascent (Labsystems, Finsko) při vlnových délkách 365 nm (excitační) and 460 nm (emisní). Bylo stanoveno OD₆oo zbylé kultury a aktivita β-galaktosidasy byla vyjádřena jako nmol 4- methylumbelliferonu x ODóoo'¹ x h’¹.

Hodnoty EC50, tedy koncentrace látky aktivující receptor z 50 %, byla spočtena ze získaných křivek odezvy. V tabulce 10 jsou uvedené průměry ze tří opakování, celý test byl proveden nejméně dvakrát. Látky aktivující receptory méně než rran.v-zeatin (referenční látka) jsou zajímavé jako CKX inhibitory. Nové substituované 6anilinopuriny vykazovaly mnohem menší afinitu k cytokininovým receptorům než /rans-zeatin.

Tabulka 10

Účinek nových látek na aktivaci cytokininových receptorů Arabidopsis thaliana CRE1/AHK4 and AHK3.

No.	'Testované látky	EC50 (pmol.L'1)
R6	R2	CRE1/AIIK4	ΛΗΚ3
	/raw-zeatin		0.9	2.1
	benzylamino		19.7	18.2
1	anilino	chloro	35.4	10
3	3-chloroanilino	chloro	7.5	20
4	4-chloroanilino	chloro	27.8	2.5
6	3-fluoroanilino	chloro	>50	33.3

7	4-fluoroanilino	chloro	n.i.	8.3
8	2-hydroxyanilino	chloro	50	31.7
9	3-hydroxyanilino	chloro	37.1	2.8
10	4-hydroxyanilino	chloro	26.7	44.4
11	2-methoxyanilino	chloro	>50	6.1
12	3-methoxyanilino	chloro	313	9.5
13	4-methoxyanilino	chloro	n.i.	6
30	3,4-dimcthylanilino	chloro	33.3	>50
40	anilino	fluoro	46.2	19
42	3-chloroanilino	fluoro	21	31.6
43	4-chloroanilino	fluoro	39.8	27
45	3-fluoroanilino	fluoro	>50	42.1
46	4-fluoroanilino	fluoro	n.i.	22.5
47	2-hydroxyanilino	fluoro	>50	45.8
48	3-hydroxyaniIino	fluoro	49.6	15
49	4-hydroxyanilino	fluoro	37.1	>50
50	2-methoxyanilino	fluoro	>50	17.4
51	3-methoxyanilino	fluoro	43	22.7
52	4-methoxyanilino	fluoro	n.i.	18.9
64	anilino	amino	n.i.	25.3
66	3-chloroanilino	amino	n.i.	43
67	4-chloroanilino	amino	n.i.	8.1
69	3-fluoroanilino	amino	n.i.	>50
70	4-fluoroanilino	amino	n.i.	19.5
71	2-hydroxyanilino	amino	>50	>50
72	3-hydroxyanilino	amino	>50	7.7
73	4-hydroxyanilino	amino	>50	>50
74	2-methoxyanilino	amino	n.i.	29
75	3-melhoxyanilino	amino	n.i.	20.4
76	4-methoxyanilino	amino	n.i.	26.3
80	3-chloroanilino	thio	n.i.	42
81	4-chloroanilino	thio	n.i.	10.2
83	3-fluoroanilino	thio	n.i.	>50
88	3-methoxyanilino	thio	n.i.	31.7
96	3-chloroanilino	methylthio	41	29
98	3-fluoroanilino	methylthio	49	32
103	3-methoxyanilino	methylthio	>50	27.5
111	3-chloroanilino	methyl	n.i.	>50
113	3-fluoroanilino	methyl	n.i.	n.i.
118	3-methoxyanilino	methyl	n.i.	>50

n.i. znamená bez interakce

Příklad 23

Stimulační vliv nových látek na buněčné dělení rostlinných buněk

Stimulační vliv nově připravených derivátů byl testován v kalusovém biotestu za použití cytokinin-dependentního kalusu tabáku. Tento cytokinin-dependentní tabákový kalus Nicotiana tabacum L. cv. Wisconsins 38 byl udržován při 25 °C na modifikovaném mediu Murashige-Skoog obsahujícím na 1 litr: 4 pmol kys. nikotinové, 2,4 pmol pyridoxin hydrochloridu, 1,2 pmol thiaminu, 26,6 pmol glycinu, 1,37 pmol glutaminu, 1,8 pmol myoinositolu, 30 g sacharosy, 8 g agaru, 5,37 pmol cc-naftyloctové kyseliny a 0,5 pmol 6benzylaminopurinu. Subkultivace probíhala každé 3 týdny. Čtrnáct dní před započetím biotestu byl kalus přenesen na médium bez 6-benzylaminopurinu. Stimulační růstová aktivita byla stanovena na základě nárůstu čerstvé hmoty kalusu po 4 týdnech kultivace, Pět replikátů bylo připraveno pro každou testovanou koncentraci a daný test byl opakován minimálně 2krát. V každém experimentu byla použita jako kontrolní látka kinetin, který je znám velmi vysokou cytokininovou aktivitou. Testované cytokininy byly rozpuštěny v dimethylsulfoxidu (DMSO) a zásobní roztok doplněn vodou na 10' M. Tento zásobní roztok byl dále ředěn testovacím médiem v koncentračním rozsahu 10‘ až 10' M. Finální koncentrace DMSO v médiu nepřevýšila 0,2% a v této koncentraci neovlivňovala biologickou aktivitu testu.

Ze získaných dat byla opět vypočítána maximální účinná koncentrace testované látky a její relativní účinnost v této koncentraci (Tab. 11). 10'⁵ M koncentrace kontrolní látky kinetinu byla postulována jako 100% biologické aktivity.

Výsledky v tabulce 11 naznačují, že substituce v poloze 2 a 6 purinového kruhu vedla k nárůstu cytokininové aktivity v kalusovém biotestu ve srovnání s klasickým cytokininem kinctinem (K).

Tabulka 11

Vliv nových cytokininů na růst cytokinin-dependentního tabákového kalusu Nicotiana tabacum L. cv. Wisconsins 38

č.	Pěstovaná sloučenina	maximální účinná koncentrace (mol.r1)	aktivita (%) |10'5mol.r' K = 100%]
R6	R2

c	furfuryl am i no	H	I0’5	100
3	3-chloroanilino	chloro	10’5	110(16)
4	4-chloroanilino	chloro	IO'5	102 (±8)
6	3-fluoroanilino	chloro	10'5	119.7(18)
7	4-fluoroanilíno	chloro	IO'5	112(112)
9	3-hydroxyanilino	chloro	icr5	116.2 (± 13)
11	2-metlioxyanilino	chloro	IO“5	109 (± 5)
12	3-methoxyanilino	chloro	10'5	102 (± 3)
40	anilino	fluoro	10'5	108.1(14)
42	3-chloroanilino	fluoro	10‘5	121 (±8)
43	4-chloroanilino	fluoro	IQ-5	130(16)
45	3-fluoroanilino	fluoro	10'5	127.9(+8)
46	4-fluoroanilino	fluoro	10‘3	110.7(+5)
48	3-hydroxyanilino	fluoro	IO’5	104.2 (13)
49	4-hydroxyanilino	fluoro	10‘5	106 (+ 3)
50	2-methoxyanilino	fluoro	10-5	117.6(± 9)
51	3-methoxyanilino	fluoro	w5	120.5(+ 13)
52	4-methoxyanilino	fluoro	I0’5	105 ¢+7)
80	3-chloroanilino	thio	10‘5	126 (±5)
81	4-chloroanilino	thio	IO'5	115.7(+4)
83	3-fluoroanilino	thio	10'5	102.5(+10)
88	3-methoxyanilino	thio	10-5	103.4 ¢+ 12)
96	3-chloroanilino	methylthio	IO‘5	121.2 (1 18)
98	3-fluoroanilino	methylthio	10-5	130.3(+ 17)
103	3-methoxyanilino	methylthio	10‘5	142.8(+21)
111	3-chloroanilino	methyl	10‘5	128.3(+6)
113	3-fluoroanilino	methyl	10-5	125.3(+7)
118	3-methoxyanilino	methyl	10-5	105.7(15)

Příklad 24

Testování nových cytokininů v amarantovém bio tes tu

Pro studium cytokininovc aktivity byl rovněž použit “amarantový” biotcst v následující modifikaci. Semena Amaranthus caudatus var. Atropurpurea byla povrchově sterilizována 10% N-chlorbenzensulfonamidem (w/v) po dobu 10 min a poté promyta 5-krát deionizovanou vodou. Semena byla rozmístěna v 15 cm Petriho miskách s filtračním papírem saturovaným destilovanou vodou. Po 72 hodinách kultivace při 25 °C ve tmě byly zc semenáčků odstraněny kořeny. Tyto explantáty obsahující 2 kotyledony a hypokotyl byly umístěny do 5 cm Petriho misek na 2 vrstvy filtračního papíru nasyceného 1 ml inkubačního média obsahujícího 10 pmol NX-JlPCE-KlTPOi. pH 6,8, 5 pmol tyrosinu a testovaný cytokinin. Na misku bylo umístěno 20 explantátů, Veškeré manipulace byly prováděny pod zeleným světlem v temné komoře. Po 48 hodinách inkubace při 25 °C ve tmě byl betacyanin extrahován cestou zmražení explantátů v 3,33 pM kyselině octové. Koncentrace betacyaninu byla stanovena porovnáním absorbancí při 537 a 620 nm a vypočtena pomocí vzorce ΔΑ = A_537nm - A₆20nm. Hodnoty byly vyneseny do grafů závislosti ΔΑ na koncentraci. Pět replikátů bylo připraveno pro každou testovanou koncentraci a daný test byl opakován minimálně 2krát. V každém experimentu byl použit jako kontrolní látka kinetin, který je znám velmi vysokou cytokininovou aktivitou. Testované cytokininy byly rozpuštěny v dimethylsulfoxidu (DMSO) a zásobní roztok doplněn vodou na 10'³ M. Tento zásobní roztok byl dále ředěn testovacím médiem v koncentračním rozsahu 10“⁸ až ΙΟ’⁴ M. Finální koncentrace DMSO v mediu nepřevýšila 0,2% a v této koncentraci neovlivňovala biologickou aktivitu testu.

Ze získaných dat byla vypočítána maximální účinná koncentrace testované látky a její relativní účinnost v této koncentraci (Tab. 8). ΙΟ’⁴ M koncentrace K byla postulována jako 100% biologické aktivity.

Výsledky naznačují, že substituce v poloze 2 a 6 purinovcho kruhu vedla k nárůstu obsahu betacyaninu (purpurová barva) v explantátech kotyledonů/hypokotylů Amaranthus caudatus ve srovnání s klasickým cytokininem kinetinem (K).

Tabulka 12

Vliv nových cytokininů na obsah betacyaninu v explantátech kotyledonů/hypokotylů Amaranthus caudatus.

č.	Testovaná sloučenina	maximální účinná koncentrace (mol.l·1)	Účinnost (%) [ΙοΑηοΙ.Γ1 Κ = 100%]
R6	R2
c	furfurylamino	H	ΙΟ’5	100
3	3-chloroanilino	chloro	ΙΟ’5	166 (±4)
4	4-chloroanilino	chloro	10’5	107 (±8)
6	3-fluoroanilino	chloro	10’5	120(±15)
7	4-fluoroanilino	chloro	10’5	104(±4)
9	3-hydroxyanilino	chloro	ΙΟ'5	115.4 (± 18)
11	2-methoxyanilíno	chloro	10’5	110.3(+ 15)
12	3-methoxyanilino	chloro	ΙΟ’5	132.3(+ 14)

40	anílino	fluoro	IO’5	107(±5)
42	3-chloroanilino	fluoro	l(T?	121 (±6)
43	4-chloroanilino	fluoro	10'5	102.6 (±1)
45	3-fluoroanilino	fluoro	IO’5	105.1 (+13)
46	4-fluoroanilino	fluoro	10'5	109 (±8)
48	3-hydroxyanilino	fluoro	IO'5	100.3(+ 10)
50	2-methoxyanilino	fluoro	10’5	105.2(+ 9)
51	3-methoxyanilino	fluoro	IO’5	117.2(± II)
64	anílino	amino	IO’5	125.2 (±14)
66	3-chloroanilino	amino	10’5	122 (±5)
67	4-chloroanilino	amino	I0'5	141.7(16)
69	3-fluoroanilino	amino	10'5	113.2 (±10)
70	4-fluoroanilino	amino	10’5	136 (±7)
~72	3-hydroxyanilino	amino	1(/	119.8(1 15)
74	2-methoxyanilino	amino	IO’5	108 (+ 13)
75	3-methoxyanilÍno	amino	IO'5	123.6(± 19)
80	3-chloroanilino	thio	10’5	106(±4)
81	4-chloroanilino	thio	10'J	122.9(15)
83	3-fluoroanilino	thio	IO'5	133.5(111)
88	3-methoxyanilino	thio	IO‘5	113.4 (± 15)
96	3-chloroanilino	methylthio	IO'5	145.8 (1 23)
98	3-fluoroanilino	methylthio	10'5	142.5(1 15)
103	3-methoxyanilino	methylthio	10'5	156.4 (i 18)
11	3-chloroanilino	methyl	10'5	121.7(15)
113	3-fluoroanilino	methyl	10'5	120.2 (16)
118	3-methoxyanilino	methyl	10·’	144.2 (± 8)

Příklad 25

In vitro cytotoxická aktivita nových derivátů

Nízká cytotoxicita je nezbytná pro použití těchto látek v kosmetice. Jedním z parametrů používaných jako základ pro cytotoxickou analýzu jc metabolická aktivita životaschopných buněk. Například mikrotitrační analýza, kde se používá Calcein ΛΜ, jc dnes rozšířena jako metoda kvantifikace buněčné proliferace a cytotoxicity. Tento test je využíván v programech pro screening léků a pro testy chcmosensitivity. Testem se rozpoznají pouze životaschopné buňky. Množství zredukovaného Calceinu AM odpovídá poctu životaschopných buněk v kultuře.

Lidská T-lymfoblastická leukemická buněčná linie CEM, promyelocytární HL-60 a monocytární U937 leukemie, buněčné linie prsního karcinomu MCF-7, buňky ccrvikálního karcinomu HELA, myší fibroblasty NIH3T3, lidská erythroleukemic K562, buňky G361 lidského maligního melanomu byly použity pro rutinní screening sloučenin. Buňky byly udržovány v Nunc/Corning 80 cm plastikových lahvích a pěstovány v mediu pro buněčné kultury (DMEM obsahující 5 g/1 glukózy, 2 mM glutaminu, 100 U/ml penicilinu, 100 pg/ml streptomycinu, 10 % fetálního telecího séra a hydrogenuhličitan sodný), sloučeniny byly připraveny podle postupu podle předloženého vynálezu.

Buněčné suspenze byly připraveny a naředěny podle typu buněk a podle očekávané konečné hustoty buněk (10⁴ buněk na jamku na základě charakteristik buněčného růstu), pipetovalo sc 80 μΐ buněčné suspenze na 96-jamkové mikrotitrační destičky. Inokuláty byly stabilizovány 24 hodinovou preinkubací při 37 °C v atmosféře 5% CO2. Jednotlivé koncentrace testovaných látek byly přidány v čase nula jako 20 μΐ alikvotní podíl do jamek mikrotitračních destiček. Obvykle sc sloučeniny ředily do šesti koncentrací v čtyřnásobné ředící řadě. Při rutinním testování byla nejvyšší koncentrace v jamce 166,7 μΜ, změny této koncentrace závisí na dané látce. Všechny koncentrace byly testovány v triplikátech. Inkubace buněk s testovanými deriváty trvala 72 hodin pří 37 °C, 100 % vlhkosti a v atmosféře 5% CO2 . Na konci inkubační periody byly buňky analyzovány po přidání roztoku Calceinu AM (Molecular Probes) a inkubace probíhala další 1 hodinu. Fluorescence (FD) byla měřena pomocí Labsystem FIA readeru Fluorskan Ascent (Microsystems). Přežití nádorových buněk (tumor cell survival-TCS) bylo spočítáno podle následujícího vztahu: GI₅Q=(FD_jamka s derivátem /FDkontrolní jamka ) x 100 %. Hodnota GI50, která odpovídá koncentraci látky, kdy je usmrceno 50 % nádorových buněk, byla vypočtena ze získaných dávkových křivek.

Nulová cytotoxicita je základním předpokladem pro použití těchto látek v zemědělských aplikacích. Pro vyhodnocení protinádorové aktivity byla testována toxicita nových derivátů na panelech obsahujících buněčné linie rozdílného histogcnetického a druhového původu (Tab. 14). Ukázalo se, že pro všechny testované nádorové linie bylo působení nových sloučenin srovnatelné, kdežto nemaligní buněčné linie, tzn. NIII3T3 fibroblasty a normální lidské lymfocyty, byly vůči tomuto působení rezistentní. Sloučeniny uvedené v tab. 14 je možné rozdělit do 2 skupin. První skupina obsahuje ‘klasické cytokininy” reprezentované 6-substítuovanými puriny (jejich působení jc již známé). Druhá skupiny zahrnuje nové substituované 6-anilinopurinové deriváty. Tyto výsledky naznačují, že substituce v pozici 2 purinového skeletu vede obecně k poklesu cytotoxické aktivity ve srovnání s „klasickými cx tokininovými” analogy. Jak je ukázáno v tabulce 14, GI50 pro NIH3T3 fibroblasty a normální lidské lymfocyty byla vždy vyšší než 166,7 μΜ. Nové deriváty vykazují nulovou toxicitu pro normální i nádorové buňky v koncentracích okolo 166,7 μΜ a jsou proto mnohem vhodnější pro zemědělské a kosmetické aplikace než “klasické cytokininy” (6-substituované deriváty purinu).

Tabulka 14

Cytotoxicita nových sloučenin pro různé nádorové buňky

Použitá buněnčá linie / GI$o (pmol/L)

Sloučenina	HOS	K-562	MCF7	B16-F0	NIH-3T3	G-361	CEM	HL60
kinetin	>166.7	164.1	>166.7		>166.7		155.1
isopentenyladcnin	>166.7	146.9	>166,.7		>166.7		92,2	>166.7
benzyladenin	>166.7	138.9	166.1		>166.7		>166.7	>166,7
/rawÁ-zeatin			>166.7		>166.7		>166.7	>166.7
/rteta-topolin	>166.7	128.4	>166.7	90.6	>166.7	>166.7	90.1	79.2
ardw-topolin	>166.7	>166.7	>166.7	150	>166.7	103,4	69.2	78
adenin		>166.7	>166.7		>166.7		>166.7	>166.7
1	>166.7		>166.7		>166,7		>166.7
3 ________	>166.7		>166.7		>166.7		>166.7
4	>166.7	>166.7	>166.7		>166.7		>166,7
6	>166.7	>166.7	>166.7		>166.7
9	>166.7		>166.7		>166.7
12	>166.7		>166.7		>166.7
40	>166.7		>166.7		>166.7		>166.7
42	>166.7		>166.7		>166.7		>166.7
48	>166.7	>166.7	>166.7		>166.7
51	>166.7		>166.7		>166.7
64	>166.7		>166.7		>166.7
66_____________	>166.7		>166.7		>166.7
72	>166.7		>166.7		>166.7
73	>166.7		>166.7		>166.7
78	>166.7		>166.7		>166.7
83	>166.7		>166.7		>166.7
87	>166.7		>166.7		>166.7
94	>166.7		>166.7		>166.7
101	>166.7		>166.7		>166.7
103	>166.7		>166.7		>166.7
116	>166.7		>166.7		>166.7
131	>166.7		>166.7		>166.7

Příklad 26

Zpomalení vzniku, případně reverze senescentního fenotypu normálních lidských fibroblastú

V tomto příkladu byly pro studium β-galaktosidázovc aktivity použity lidské diploidní fibroblasty (HCA buňky s rozdílnou úrovní pasažování: pasáž 25 - označení HCA25; pasáž 45 - označení HCA45; pasáž 80 - označení HCA80). Medium použité pro kultivaci buněk bylo odstraněno, buňky byly promyty 2-krát PBS a fixovány ve 2-3 ml fixačního činidla skládajícího se ze 2% formaldehydu a 0,2% glutaraldehydu v PBS. Buňky byly inkubovány při teplotě místnosti po dobu 5 min. a poté 2-krát promyty PBS. Buňky byly pak inkubovány při 37 °C (bez CO₂) P° dobu 1 až 16 hodin ve 2-3 ml roztoku obsahujícího ferrikyanid draselný (5 mM), ferrokyanid draselný (5 mM), MgCl₂ (2 mM), Xgal (5-brom-4-chlor-3-indolyl-p-D-galaktopyranosid) (1 mg/ml), v citrát/fosfátovém pufru, pH 6.0) Po této inkubacní periodě byly buňky pozorovány mikroskopicky za účelem zjištění senescentních buněk anebo pro měření intenzity zabarvení při 415 nm spektrofotometricky pomocí readeru Multiscam MCC (Labsystems) (positivně senescentní buňky). V těchto experimentech byly označeny pouze senescentní buňky a to díky účinku β-galaktosidasy na substrát.

Tabulka 15

Vliv nových sloučenin na počet senescentních buněk v kultuře lidských fibroblastú

Sloučenina	Senescentní buňky (%)
IICA25	HCA50	ÍICA80
Kinetin	3	5	38
2-chloro-6-(4-hydroxyaniIino)purin	4	6	22
2-chloro- 6-(3-methoxyanilino)purin	5	5	24
2-chloro-6-(4-methoxyanilino)purin	4	3	26
2-chloro-6-(3-methoxy-4hydroxyani!ino)purin	4	6	25
2-amino-(4-hydroanilino)purin	3	4	21
2-methy lthio-6-(4hydroxyanilino)purin	4	6	34
2-fluoro-6-(4-hydroxyanilino)purin	3	4	18
2-fluoro- 6-(3-methoxyanilino)purin	3	5	29
2-amino-6-(3-methoxyaniIíno)purin	4	4	22
2-chloro-6-(3-methoxy-4hydroxyanilino)purin	4	6	31
2-amino-(4-hydroxyanilino)purin	4	4	18

Se zvyšujícím se počtem pasáží docházelo k /intenzívnění zabarvení. U nejstarších buněk byly pozorovány pouze buňky od jasně modré až po tmavě matnou barvu. Substituované 6anilinopurinové deriváty byly obecně mnohem efektivnější než kinetin při udržování nižší hladiny senescentních buněk po 80 pasáži.

Příklad 27

Protizánětlivá aktivita nových substituovaných 6-anilinopurinů

Protizánětlivá aktivita několika substituovaných 6-anilinopurinů byla stanovena na buněčné linii krysího gliomu C6 (ATCC No. CCL107). Jako kontrola byl použit kinetin. Buňky byly pěstovány v jedné vrstvě v chemicky definovaném médiu bez přídavku séra. Kultivační médium mělo následující složení: Ilámovo médium F10 / minimální esenciální médium (1:1 v/v), 2 mM L-glutamin, 1 % (v/v) minimální esenciální vitamíny (ΙΟΟχ), 1 % (v/v) minimální neesenciální aminokyseliny (lOOx), 100 U/ml penicilín, 100 mg/ml streptomycin a 30 nM seleničitan sodný. Inkubace probíhala při 37 °C a 100 % vzdušné vlhkosti. Experimenty byly prováděny v logaritmické růstové fázi při hustotě buněk 2,5x10⁵ buněk/cm².

Syntéza cAMP byla indukována přídavkem 5 mM (-)-isoproterenolu, který byl k buněčným kulturám přidáván zároveň s testovanou látkou. Inkubace probíhala 30 minut. cAMP bylo stanoveno pomocí ELISA (cAMP-enzyme immunoassay kit firmy Amersham). Hodnoty ho byly odečteny z kalibrační křivky. Stanovení bylo provedeno v duplikátu. Výsledky byly následující:

Sloučenina	ProtizánČtlivá aktivita
I50 (μΜ)	Účinek
Kinetin (6-furfuryIaniinopurin)	0	neaktivní
2-chloro-6-(2-hydroxyanilino)purin	25	Inhibice
2-chloro-6-(4-hydroxyanilino)purin	13	Inhibice
2-chloro-6-(3rnethoxybenzylamino)purin	7	Inhibice
2-chloro-6-(3,5dimethoxybcnzylamino)purin	11	Inhibice

Substituované 6-anilinopuriny vykázaly protizánětlivou aktivitu. Kinetin byl neúčinný.

Příklad 28

Wiv látek na adherend fibroblastů

Test adhcrenční schopnosti buněk je jednou z metod hodnocení akutní toxicity látek vůči adherentním buňkám. Testovaná látka se přidá do média s definovaným počtem ztrypsinizovaných buněk a po stanovené době se spočítá počet buněk přisedlých ke dnu kultivační nádoby. V experimentu jsme použili lidské diploidní fibroblasty BJ (19. pasáž) ve standardním kultivačním médiu (DMEM obsahující 5 g/1 glukózy, 2 mM glutaminu, 100 U/ml penicilinu, 100 pg/ml streptomycinu a 10% felálního telecího séra), Počty přisedlých buněk byly stanoveny po 6 hodinách. Experiment byl proveden v triplikátu. Výsledky ukazuje Obr.4.

Procento buněk adhcrovaných k povrchu nebylo významně ovlivněno 2-chlor-6-(4hydroxyanilino)purinem v koncentračním rozmezí od 40 do 200 pM, látka tedy nevykazuje vůči fibroblastům akutní toxicitu.

Příklad 29

Sledováni in vitro viability lidských diploidnich fibroblastů pomocí MTT

MTT test je standardní kolorimetrickou metodou pro měření proliferacc a přežívání buněk. Žluté MTT je v metabolicky aktivních buňkách redukováno na fialový formazan a ten je stanoven spcktrofotometricky. Diploidní lidské fibroblasty BJ (19. pasáž) byly vysety do 96 jamkové mikrotitrační desky v počtu 5 000 na jamku, po 6 hodinách bylo médium (DMEM obsahující 5 g/1 glukózy, 2 mM glutaminu, 100 U/ml penicilinu, 100 pg/ml streptomycinu a 10% fetálního telecího séra) odsáto a nahrazeno médiem obsahujícím testovanou látku v koncentračním rozmezí 0-200 pM. Každá koncentrace byla testována v pentaplikátu. MTT bylo k buňkám přidáno po 72 hodinách (finální koncentrace 0,5 mg/ml) a inkubace probíhala 3 hodiny. Obr. 5 ukazuje výsledky pro 2-chlor-6-(4-hydroxyanilino)purin. Z výsledků vyplývá, že látka není pro lidské diploidní fibroblasty toxická.

Příklad 30

Sledování in vitro toxicity na lidských diploidních fibroblast ech vyhodnocením růstové křivky Diploidní lidské fibroblasty BJ (19. pasáž) byly vysety do 24 jamkového panelu po 10 000 buňkách na jamku. Po 6 hodinách bylo médium (DMEM obsahující 5g/l glukózy, 2mM glutaminu, 100 U/ml penicilinu, 100 pg/ml streptomycinu a 10% fetálního telecího séra) odsáto a nahrazeno médiem obsahujícím testovanou látku v koncentračním rozmezí 12,5-400 pM. Každá koncentrace byla testována v triplikátu. Počty bunčk byly sledovány 12 dní. Z obrázku 6 je patrné, že sledovaná látka nevykazuje ve sledovaném časovém období toxicitu vůči lidským diploidním fibroblastům.

Příklad 31

Účinek na senescentní lidské diploidnífibroblasty

Přežití buněk: Senescentní diploidní lidské fibroblasty SNF20 (38. pasáž) byly vysety do 24 jamkového panelu po 10 000 buňkách na jamku. Po 6 hodinách bylo médium (DMEM obsahující 5 g/1 glukózy, 2 mM glutaminu, 100 U/ml penicilinu, 100 pg/ml streptomycinu a 10% fetálního telecího séra) odsáto a nahrazeno médiem obsahujícím testovanou látku v koncentračním rozmezí 12,5-400 ΠΜ. Každá koncentrace byla testována v triplikátu. Počty bunčk byly odečteny 7. a 14. den.

Z obr. 7 je patrné, že 2’Chlor-6-(4-hydroxyanilino)purin v koncentracích do 200 pM nemá výrazný negativní vliv na přežilí senescentních buněk ve sledovaném časovém intervalu.

Morfologie senescentních buněk:

Fibroblasty SNF20 (38. pasáž) byly kultivovány po dobu 14 a 30 dní v přítomnosti

2-chlor-6-(4-hydroxyanilino)purinu v koncentracích od 12,5 do 200 μΜ po dobu 14 a 30 dní. Poté byl aktinový cytoskelet obarven phalloidinem konjugováným s TRITC a pozorován ve flourescenčním mikroskopu . V případě buněk ovlivněných 25, 50 a 100 pM byl zjištěn vyšší podíl morfotypů odpovídajících nižší pasáži, aktinový cytoskelet byl více difúzní a přítomno bylo méně stresových vláken.

Příklad 32

Amesův test

K. vyloučení mutagenního působení 2-chlor-6-(4-hydroxyanilino)purinu byl použit Amesův test. Jako indikátorové kmeny byly použily histidinové auxotrofy Salmonella typhimurium TA98 a TA 100 a test byl proveden podle standardních protokolů (Ames et al., Mutation Research, 31, 347’364 (1975); Maron ct al., Mutation Research, 1 13, 173-215 (1983)). Látka byla nemutagenní i v koncentracích překračujících mez. rozpustnosti látky v daném médiu (2,5, 5,0, 15, 50, 500, 1500, a 5000 pg/misku).

Příklad 33

Přípravky

Přípravky ovlivňující růst obvykle obsahují od 0,1 do 99 % (w/w), zejména pak od 0,1 do 95 % (w/w), aktivní složky nebo složek odpovídajících látce nebo látkám vzorce I, od 1 do 99.9 % (w/w), pevných nebo tekutých pomocných látek, a od 0,1 do 25 % (w/w), zejména od 0,1 do 25 % (w/w) surfaktantu. Zatímco komerční přípravky jsou obvykle formulovány jako koncentráty, koncový uživatel používá přípravek ředěný. Přípravek může zahrnovat i další komponenty jako stabilizátory, např. rostlinné oleje nebo epoxidované rostlinné oleje (cpoxidovaný kokosový olej 0; 1, řepkový olej, podzemnicový olej), protipěnivé látky, např. silikonový olej, konservační látky, látky regulující viskozitu, pojivá, látky zvyšující přilnavost, hnojivá, případně další aktivní složky. Preferované přípravky mají zejména toto složení (uvedena hmotnostní procenta):

Λ1. Emulgovatelné koncentráty	a)	b)	c)	d)
Směs aktivních složek	5%	10%	25%	50%
dodecylbenzensulfonát vápenatý	6%	8%	6%	8%
polyoxycthylovaný ricinový olej (polyglykol ether ricinového oleje) (36 mol ethylen oxid)	4%	-	4%	4%
oktylfcnol polyglykol ether -	4%	-	2%

(7-8 mol ethylen oxid) cyklohexanon směs aromatických uhlovodíků

10% 20%

85% 78% 55% 16%

C9-C[2

Emulse o vyžadované finální koncentraci mohou být získány z takového koncentrátu zředěním vodou.

A2. Roztoky	a)	b)	c) d)
Směs aktivních složek	5%	10%	50%	90%
l-methoxy-3-( 3-mcthoxypropoxy)-propan	-	20%	20%	-
polyethylenglykol MW 400	20%	10%	-	-
N-mcthyl-2-pyrrolidon	-	-	30%	10%
směs aromatických uhlovodíků C9-C12	75%	60%	-	-
Roztoky jsou vhodné k aplikaci ve formě mikrokapének.
A3. Smáčí ve prášky	a)	b)	<0	d)
Směs aktivních složek	5%	25%	50%	80%
lignosulfonát sodný	4%	-	3 %	-
laurylsulfát sodný	2%	3%	-	4%
diisobutylnaftalensulfonát sodný	-	6%	5%	6%
oktylfenol polyglykol ether -	1 %	2%	-
(7-8 mol ethylen oxid) vysoce disperzní kyselina křemičitá	1 %	3 %	5%	10%
kaolin	88%	62%	35%	-

Aktivní složka je důkladně promísena s pomocnými látkami a směs jc důkladně rozemleta ve vhodném mlýnu. Suspenzi libovolné koncentrace je možné získat smísením vzniklého prachu s vodou.

A4. Potahované granule

a) b) c)

Směs aktivních složek

0.1% 5% 15% vysoce disperzní kyselina křemičitá 0.9 % 2 % 2 % anorganický nosič

99.0 % 93 % 83 % (0,1 -1 mm) např. CaCOa nebo S1O2

Aktivní složka je rozpuštěna v methylenchloridu odpařeno ve vakuu.

a nasprejována na nosič. Rozpouštědlo je

A5. Potahované granule	a)	b)	c)
Směs aktivních složek	0.1 %	5%	15%
polyethylenglykol MW 200	1.0%	2%	3 %
vysoce disperzní kyselina křemičitá	0.9 %	1 %	2%
anorganický nosič	98.0 %	92%	80%

(AE 0,1-1 mm) např. CaCO₃ nebo SiO₂

Jemně rozemletá aktivní složka je v mixéru stejnoměrně nanesena na nosič zvlhčený polyethylenglykolem. Takto jsou získány neprašné granule.

A6. Extrudované granule	a)	b)	c)	d)
Směs aktivních složek	0,1 %	3%	5%	15%
lignosulfonát sodný	1.5%	2%	3%	4%
karboxymethylcelulosa	1.4%	2%	2%	2%
kaolin	97.0 %	93%	90%	79%

Aktivní složka je smísena a rozemleta s pomocnými látkami a složka je zvlhčena vodou Směs je extrudována a usušena v proudu vzduchu.

A7. Prachy	a)	b)
Směs aktivních složek	0.1 %	1 %	5%
talek	39.9 %	49%	35%
kaolin	60.0 %	50%	60%

Prachy k přímému použití jsou získány rozemletím aktivní složky s nosičem vc vhodném mlýnu.

A8. Suspenzní koncentrát	a) 3%	b) 10%	c) 25%	d) 50%
Směs aktivních složek
ethylen glykol	5 %	5%	5%	5%
nonylfenol polyglykol ether-	1 %	2%	-
(15 mol ethylen oxid)
lignosulfonát sodný	3 %	3%	4%	5 %
karboxymethylcelulosa	1 %	1 %	1 %	1%
37 % vodný roztok formaldehydu	0.2 %	0.2 %	0.2 %	0.2%
emulse silikonového oleje	0.8%	0.8 %	0.8 %	0.8%

voda 87 % 79 % 62 %

38%

Jemně rozemletá aktivní složka je smíchána s pomocnými látkami. Vzniklý suspcnzní koncentrát umožňuje přípravu suspenze o požadované koncentraci zředěním vodou.

Příklad 34

Gel

Názvy složek jsou uváděna v souladu s terminologií registračních úřadů. Složky jsou

uváděny v gramech na 100 g. Gel	/100 g
Aktivní látka 2-chlor-6-(4-hydroxyanilino)purin (2C14OHAP) butylhydroxytolucn (Nipanox BHT) butylparaben (Nipabutyl) diethylenglykol monoethyl ether (Transcutol P) bezvodá koloidní silika (Zeopharm 177) propylenglykol laurát (Lauroglycol FCC)	l.Og 0,2 g 0.2 g 10,0 g 5.0 g 83,6 g

Konzistence gelu může být dále modifikována přidáním bezvodé koloidní siliky.

Účinek aktivní látky může být zvýšen pomocí transdermálního systému Transeutol P/Lauroglycol bCC. Bezvodá koloidní silika pravděpodobně zpomalí penetraci účinné látky, což povede k protrahovanému účinku.

Příklad 35

Příprava přípravku určeného k aplikací na kůži (mast)

Názvy složek jsou uváděna v souladu s terminologií registračních uváděny v gramech na 200 g	úřadů. Složky jsou /200 g
aktivní látka 2-chlor-6-(4-hydroxyanilino)purin (2C14OIIAP) butylhydroxytolucn (Nipanox BHT) 200018035611NP	2,0 g 0.4 g
butylparaben (Nipabutyl) diethylenglykol monoethyl ether (Transcutol P) 3260/02	0,4 g 20,0 g

glycerol dibehenát

3123/04 propylenglykol laurát

3219/00 (Comprítol 888 ATO) 44,0 g (Lauroglycol FCC) 133,2 g

Doporučeny postup

Fáze A gramy účinné látky byly rozpuštěny ve 20 g Transcutolu P stálým mícháním v oddělené skleněné nebo nerezové ocelové nádobě při laboratorní teplotě. Rozpouštění může být urychleno zahříváním na maximálně 40 °C,

Fáze B

0,4 gramu Nipanox BUT a 0,4 g Nipabutylu byly rozpuštěny za stálého míchání při teplotě přibližně 70°C v 133,2 g Lauroglycol FCC. Operace byla provedena v oddělené skleněné nebo nerezové ocelové nádobě. Čirý olej ovitý roztok byl zahřát na přibližně 80 °C a v něm bylo za míchání roztaveno 44 g Compritolu 888 ΛΓΟ. Vzniklý roztok byl ochlazen na přibližně 60 °C a během stálého míchání chladnoucího roztoku smíchán s fází A. Vzniklá bčlavá masťovitá hmota byla rozdělena po 15 gramech do plastových nádobek

Příklad 36

Příprava přípravku pro topickou aplikaci na kůži

Složení topického přípravku určeného k aplikaci na kůži (hmotnostní procenta):

Aktivní látka 2-chlor-6-(4-hydroxyanilino)purin (2C14OIIAP) 0,1 %

Olejová fáze

Cetyl alkohol 5,0 %

Glyceryl monostearát 15,0 %

Sorbitan monooleát 0,3 %

Polysorbát 80 USP 0,3 %

Vodná fáze

Methylcelulosa 100 eps 1,0 %

Methyl paraben 0,25 %

Propyl paraben

Destilovaná voda

0,15% kvantitativně do 100 %

Methylcelulosa byla rozpuštěna ve vodě obsahující methyl a propyl paraben. Směs pak byla zahřátá na 72 °C a přimíchána k olejové fázi o teplotě 70 °C. Úěínná látka 2C14OHAP byla přidána po ochlazení směsi na 35°C a míchána do vychlazení.

Tento přípravek je určen k aplikaci na kůži na přinejmenším denní bázi dokud se nedostaví požadovaný příznivý efekt (omlazovací účinek).

Claims (12)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Substituované 6-anilinopurinové deriváty obecného vzorce I

   I a jejich farmaceuticky využitelné soli s alkalickými kovy, amoniakem či aminy ve formě racemátů nebo opticky aktivních isomerú, jakož i jejich adičních solí s kyselinami, ve kterých

   R znamená 1 až 5 substituentů nezávisle vybraných zc skupiny zahrnující vodík, halogen, hydroxyl, amino, alkyloxy a alkylovou skupinu,

   R2 znamená amino, halogen, nitro, thio, alkylthio nebo alkylovou skupinu pro použití jako inhibitory cytokinin oxidasy.
2. 2. Substituované 6-anilinopurinové deriváty podle nároku l obecného vzorce I ze skupiny zahrnující 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6anilinopurin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methy 1)-6-(2chloroanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methy 1)-6-(3- chloroanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(4chloroanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2fluoroanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, mcthyl)-6-(3fluoroanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(4fluoroanilino)purin, 2-( chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio)-6-(2bromoanilinojpurin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(3bromoanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(4bromoanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, met hyl )-6-(2methoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(3mcthoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(4methoxyanilinojpurin, 2-(chloro, fluoro, bromo, ammo, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(247 ethoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(3ethoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(4 ethoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, mcthylthio, methyl)-6-(2aminoanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, mcthyl)-6-(3aminoanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(4aminoanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, mcthylthio, methyl)-6-(2 methylanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, mcthyl)-6-(3mcthylanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(4mcthylanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, mcthylthio, methyl)-6-(2hydroxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(3hydroxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, mcthylthio, methyl)-6-(4 hydroxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6 (2,3-difluoroanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, rnethyl)

   6-(2,4-difluoroanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, mcthylthio, methyl)-6-(2,3,4-trifluoroanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2,4,5-trifluoroanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2,3-dichloroanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2,4-dichloroanilino)purin,2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl, cthyl)’6-(2,4-dimethoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2,3-dimcthoxyanilino)purin. 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methyl thio, methyl, ethyl)-6-(3,4-dimethoxyanilino)purin,

   2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, mcthyl)-6-(2,5dimethoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl, ethyl)-6-(3,4,5-trimethoxyanilino)purin, 2-(amino, chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl, ethyl)-6-(2,4,6-lrimethoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2,3-dimethylanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, mcthylthio, methyl, ethyl)-6-(2,4-dimcthylanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, mcthylthio, methyl)-6-(3,4-dimethylanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl, ethyl)-6-(3,5-dimethylanilino)purm, 2(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl, ethyl)-6-(2,3dihydroxyanilino)punn, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, mcthylthio, methyl)-6(2,4-dihydroxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, mcthylthio, methyl)-6-(2,5-dihydroxyanilino)purin, 2-(amino, chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio,

   48 methylthio, methyl)-6-(3,5-dihydroxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(3-hydroxy-2-mcthylanilino)purin_} 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(3-hydroxy-4-methylanilino)purin_? 2-(chIoro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2-hydroxy-5-methylanilino)purin, 2-(chIoro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, mcthylthio, methyl)-6-(34iydroxy-2methoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, mcthylthio, methyl)-6-(3hydroxy-4-methoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, mcthylthio, methyl)-6-(2-hydroxy-3-methoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, mcthyl)-6-(2-hydroxy-5-methoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(4-hydroxy-3,5-dimethoxyanilino)purin, 2-(amino, chloro, fluoro, hydroxy, thio, methylthio, methyl)-6-(2-chloro-4-methoxyanilino)purin, 2(amino, chloro, fluoro, bromo, nitro, thio, mcthylthio, methyl)-6-(2-chloro-5methoxyanilino)purin, 2-(amino, chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methyl thio, methyl)-6-(2-chloro-3-methoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, mcthylthio, methyl)-6-(2-bromo-3-methoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, mcthylthio, methyl)-6-(2-methoxy-3-chloroanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2-methoxy-4-chloroanilino)purin_? a jejich farmaceuticky využitelné soli s alkalickými kovy, amoniakem či aminy ve formě racemátů nebo opticky aktivních isomerů, jakož i jejich adičních solí s kyselinami, pro použití jako inhibitory cytokinin oxidasy.
3. 3. Substituované 6-anilinopurinové deriváty podle nároku 2 obecného vzorce 1 ze skupiny zahrnující s výhodou 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, mcthyl)-6-(3-methoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, mcthylthio, mcthyl)-6-(2-hydroxy-3-methoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(2-chloro-3-methoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, mcthylthio, methyl)-6-(2-bromo-3-methoxyanilino)purin, 2-(chloro, fluoro, bromo, amino, nitro, thio, methylthio, methyl)-6-(4-hydroxyanilino)purin, a jejich farmaceuticky využitelné soli s alkalickými kovy, amoniakem či aminy ve formě racemátů nebo opticky aktivních isomerů, jakož i jejich adičních solí s kyselinami, pro použití jako inhibitory cytokinin oxidasy.
4. 4. Substituované 6-anilinopurinové deriváty obecného vzorce I podle nároku 1 nebo 2 pro použití jako inhibitorů cytokinin oxidasy, zejména pro zpomalení senescence buněk rostlin, živočichů, mikroorganismů, kvasinek a hub.
5. 5. Substituované 6-anilinopurinové deriváty obecného vzorce I podle nároku 1 nebo 2 obecného vzorce I pro použití jako inhibitoru cytokinin oxidasy pro zpomalení senescence savčích pokožkových buněk, zejména keratinocytů a fibroblastů.
6. 6. Substituované 6-anilinopurinové deriváty obecného vzorce 1 podle nároku 1 nebo 2 pro použití jako inhibitory cytokinin oxidasy ve tkáňových kulturách ke stimulaci prolifcrace a morfogeneze.
7. 7. Substituované 6-anilinopurinové deriváty obecného vzorce I podle nároku 1 nebo 2 pro použití jako inhibitory cytokinin oxidasy pro zvýšení výnosu a kvality zemědělských produktů.
8. 8. Substituované 6-anilinopurinové deriváty obecného vzorce I podle nároku 1 pro použití pro výrobu přípravků používaných ke klonování rostlinných i savčích zárodečných buněk a embryí, s výhodou oocytů.
9. 9. Substituované 6-anilinopurinové deriváty obecného vzorce I podle nároku 1 pro použití jako inhibitory cytokinin oxidasy na potlačení imunostimulace nebo při supresi rcjekcc transplantovaných orgánů u savců.
10. 10. Substituované 6-anilinopurinové deriváty obecného vzorce I podle nároku 1 pro použití jako inhibitory cytokinin oxidasy při produkci užitkových rostlin
11. 11. Kosmetické, farmaceutické a růstově-regulační přípravky, vyznačující se tím, že obsahují alespoň jeden substituovaný 6-anilinopurinový derivát obecného vzorce I nebo jeho sůl s alkalickým kovem, amoniakem či aminem ve formě racemátu nebo opticky aktivního isomeru, nebo jeho adiční soli s kyselinou, včetně pomocných látek.
12. 12. Použití substituovaného 6-anilinopurinového derivátu obecného vzorce I nebo jejich soli s alkalickými kovy, amoniakem či aminy ve formě raccmátů nebo opticky aktivních isomerů, jakož i jejich edičních solí s kyselinami pro přípravu přípravku pro použití pro inliibici cytokinin oxidasy.