CZ2008336A3 - Zpusob stanovení prognózy B-bunecné chronické lymfocytární leukémie - Google Patents
Zpusob stanovení prognózy B-bunecné chronické lymfocytární leukémie Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2008336A3 CZ2008336A3 CZ20080336A CZ2008336A CZ2008336A3 CZ 2008336 A3 CZ2008336 A3 CZ 2008336A3 CZ 20080336 A CZ20080336 A CZ 20080336A CZ 2008336 A CZ2008336 A CZ 2008336A CZ 2008336 A3 CZ2008336 A3 CZ 2008336A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- gene
- expression
- lag3
- cll
- igvh
- Prior art date
Links
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 title description 6
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 title description 3
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 title 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 42
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 40
- 208000010839 B-cell chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 claims abstract description 36
- 208000031422 Lymphocytic Chronic B-Cell Leukemia Diseases 0.000 claims abstract description 36
- 208000032852 chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 claims abstract description 36
- 101001137987 Homo sapiens Lymphocyte activation gene 3 protein Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 102100020862 Lymphocyte activation gene 3 protein Human genes 0.000 claims abstract description 25
- 101000818543 Homo sapiens Tyrosine-protein kinase ZAP-70 Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 102100021125 Tyrosine-protein kinase ZAP-70 Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims abstract description 5
- 108010013563 Lipoprotein Lipase Proteins 0.000 claims description 14
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 13
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 8
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 3
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 claims description 2
- 102100022119 Lipoprotein lipase Human genes 0.000 claims 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 20
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 20
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 abstract description 6
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 29
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 21
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 19
- 102000043296 Lipoprotein lipases Human genes 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 9
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 238000003633 gene expression assay Methods 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- 101150112014 Gapdh gene Proteins 0.000 description 2
- 101100268065 Homo sapiens ZAP70 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 101150019975 ZAP70 gene Proteins 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000012997 ficoll-paque Substances 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 1
- 108050005493 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Proteins 0.000 description 1
- 102000049320 CD36 Human genes 0.000 description 1
- 108010045374 CD36 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102100025470 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 8 Human genes 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000914320 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 8 Proteins 0.000 description 1
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 1
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 1
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000017578 LAG3 Human genes 0.000 description 1
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000001793 Wilcoxon signed-rank test Methods 0.000 description 1
- 108010046882 ZAP-70 Protein-Tyrosine Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000007624 ZAP-70 Protein-Tyrosine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000012197 amplification kit Methods 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 210000003519 mature b lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 208000011571 secondary malignant neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012706 support-vector machine Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Zpusob stanovení prognózy B-bunecné chronické lymfocytární leukémie z biologického vzorku odebraného z tela pacienta, jehož podstata spocívá v tom, že se stanoví exprese genu LAG3 (lymphocyte-activation gene 3). Stanovení exprese tohoto genu spolu se stanovením exprese dalších genu, LPL a ZAP70, muže vést ke stanovení prognózy onemocnení s až 95 % jistotou. Vysoká exprese techto genu koreluje s prítomností nemutovaného genu pro IgVH a tedy s horším prubehem onemocnení a kratším prežíváním pacientu.
Description
Způsob stanovení prognózy B-buněčné chronické Iymfocytámí leukémie
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká způsobu stanovení prognózy u pacientů s diagnostikovanou BbuněČnou chronickou Iymfocytámí leukémií.
Dosavadní stav techniky
B-buněčná chronická Iymfocytámí leukémie (B-CLL) je charakterizována jako monoklonální expanze zralých B-lymfocytů, které se hromadí v periferní krvi a lymfatických orgánech (Chiorazzi N et al., N Engl J Med. 2005;352:804-815). Donedávna se v klinické praxi k určení prognózy používal pouze staging podle Raie (Rai KR et al., Blood 1975;46:219-234) nebo podle Bineta (Binet JL et al., Cancer 1981;48:198-206). Tento empirický systém však není v současné době dostačující. Pacienti jsou diagnostikováni často ve velmi raném stádiu B-CLL a na základě prostého stagingu nelze odlišit pacienty, kteří budou rychle progredovat od pacientů s indolentní formou onemocnění. B-CLL je klinicky značně heterogenní onemocnění a doba přežití se u jednotlivých pacientů velmi liší. Navíc chemoterapie v časných stádiích onemocnění nepřináší nemocnému očekávaný užitek, naopak často dochází ke zkrácení doby přežití nebo rozvoji sekundárních malignit, Z tohoto důvodu se u B-CLL pacientů bez klinických příznaků nemoci často doporučuje pouze sledování. Problematické je zejména včasné rozpoznání agresivní formy choroby, která se Častěji projevuje u mladších pacientů. Během posledních deseti let byla onemocnění B-CLL věnována velká pozornost a výsledkem je soubor několika skupin parametrů, které B-CLL podrobně charakterizují a umožňují predikci průběhu nemoci.
Dosud nej významnějším prognostickým markérem u B-buněčné chronické Iymfocytámí leukémie se jeví mutační status genu pro těžký řetězec imunoglobulinu (IgVH). Přítomnost nemutovaného genu pro IgVH (nukleotidová homologie se zárodečnou linií větší než 98 %) je spojena s horším průběhem a kratším přežíváním pacientů (8 let vs. 25 let u pacientů s mutovaným IgVH) (Damle RN et al., Blood 1999;94:1840-1847; Hamblin TJ et al. Blood 1999;94:1848-1854). Stanovení tohoto parametru nezbytného pro stanovení prognózy a léčby onemocnění je však vysoce technicky, časově i finančně náročné, je proto snaha nahradit jeho detekci jiným snadno stanovitelným markérem nebo skupinou markérů. Mutační status genu
pro IgVH se stanovuje následujícím způsobem: z nádorových buněk je vyizolována RNA, taje následně přepsána do cDNA. cDNA je amplifíkována s příměry specifickými pro jednotlivé VH rodiny. Při monoklonálním typu onemocnění je PCR produkt přímo sekvenován. U polyklonálních pacientů je nutné jednotlivé klony odlišit pomocí klonování a následné zárodečné linie v databázi a určena míra jejich homologie. Toto stanovení se provádí u monoklonálních pacientů jedenkrát a považuje se za faktor, který se během onemocnění nemění. U polyklonálních pacientů se průběžně sleduje pravděpodobný nárůst nej agresivnějšího klonu.
Cílem předkládaného vynálezu je nahradit stávající stanovení mutačního statusu genu pro IgVH souborem genů, jejichž exprese by odlišovala obě prognosticky rozdílné skupiny. V současné době jsou známy některé geny, jejichž míra exprese koreluje s přítomností či nepřítomností mutovaného genu pro IgVH. Jedním z takových markérů objevených u B-CLL pomocí DNA čipových analýz je ZAP70. Tato tyrosin kináza je fyziologicky exprimovaná v T-lymfocytech a její vysoká exprese koreluje s přítomností nemutovaného genu pro IgVH (Rosenwald A et al., J Exp Med. 2001;194:1639-1647; Wiesner A et al., Blood 2003;101:4944-4951). Dalším genem s rozdílnou expresí odlišující obě skupiny je LPL (lipoproteinová lipáza). I tento gen byl detekován na základě čipových analýz (Oppezzo P et al., Blood 2005;106:650-657; Bilban M et al., Leukemia 2006;20:1080-1088) a jeho vysoká exprese koreluje s přítomností nemutovaného genu pro IgVH.
Podstata vynálezu
Tento vynález se týká nového prognostického markéru a souboru markérů, které umožňují s až 95% jistotou stanovit prognózu pacienta s B-buněčnou chronickou lymfocytámí leukémií (B-CLL).
Předmětem předloženého vynálezu je způsob stanovení prognózy B-buněčné chronické lymfocytámí leukémie z biologického vzorku odebraného z těla pacienta, jehož podstata spočívá v tom, že se stanoví exprese genu LAG3 (Iymphocyte-activation gene 3) v B-CLL buňkách vzorku. Biologickým vzorkem může být vzorek periferní krve, vzorek kostní dřeně nebo vzorek tkáně, zejména může být vzorkem tkáně vzorek lymfatické uzliny.
• · ··
Ve výhodném uspořádání vynálezu se stanoví exprese genu LAG3 a alespoň jednoho genu vybraného ze skupiny zahrnující LPL a ZAP70. S výhodou se stanoví exprese souboru genů LAG3.LPL aZAP70.
Význakem vynálezu je, že ke stanovení exprese genu lze využít detekci hladiny mRNA daného genu.
Na základě DNA čipové analýzy genové exprese B-CLL buněk za účelem definování nových prognostických markérů bylo detekováno zhruba 50 genů s rozdílnou mírou exprese odlišující pacienty s mutovaným a nemutovaným IgVH a rozdílným klinickým průběhem onemocnění. Nově bylo zjištěno, že vysoká exprese genu LAG3 (lymphocyte-activation gene 3) koreluje s nemutovaným IgVH statusem a špatnou prognózou onemocnění spojenou s nutností léčby. Souvislost tohoto genu s mutačním statusem IgVH u B-CLL dosud nebyla známa.
LAG3 (CD223) je membránový protein strukturně podobný CD4 a to jak na genové, tak na proteinové úrovni. LAG3 se exprimuje na T lymfocytech a NK buňkách po jejich aktivaci (Triebel F et al., Joumal of Experimental Medicine 1996;171:1393-1405). Později bylo zjištěno, že se LAG3 exprimuje také na B lymfocytech, a to po jejich aktivaci prostřednictvím T lymfocytů (Kisielow M et al., European Joumal of Immunology 2005;35(7):2081-2088). Protein tvoří dvě podjednotky - 70 kDa transmembránový řetězec oligomerizuje s druhým zkráceným 54 kDa extracelulámím fragmentem, zbývající 16 kDa řetězec s transmembránovou doménou se uvolňuje jako solubilní LAG3 (Li N et al., Joumal of Immunology 2004;173(l 1):6806-6812). Funkce tohoto proteinu zatím není zcela objasněna. Pravděpodobně se účastní celé řady regulací imunitních pochodů. Signalizace na T lymfocytech přes LAG3 např. inhibuje aktivaci CD4+ a CD8+ T lymfocytů (Macon-Lemaitre L and Triebel F, Immunology 2005;l 15(2):170-178) a reguluje jejich expanzi (Workman CJ and Vignali DA, European Joumal of Immunology 2003;33(4):970-979). Dále tento protein ovlivňuje např. zrání dendritických buněk (Andreae S et al,, Joumal of Immunology 2002;I68(8):3874-3880) a reguluje diferenciaci makrofágů a dendritických buněk z monocytámích prekurzorů (Buisson S and Triebel F, Immunology 2005; 114(3):369-374) apod.
• ··♦
Podle našich zjištění gen LAG3 významně koreluje se závažností onemocnění a jeho stanovení přináší významnou informaci o prognóze onemocnění a očekávané době přežití pacienta (Obr. 1).
Dále bylo zjištěno, že soubor 3 markérů, ZAP70, LPL a LAG3, umožňuje s 95% jistotou stanovit prognózu pacienta s B-CLL a na základě této prognózy stanovit vhodnou léčbu. Jednoduchá detekce exprese tohoto setu genů by mohla spolehlivě doplnit nebo nahradit náročné stanovení mutačního statusu genu pro IgVH, což by přineslo časovou i finanční úsporu. Kromě primární diagnostiky leukemických pacientů by se tato metodika mohla uplatnit i u pacientů po léčbě, u nichž vlivem terapie může dojít k potlačení dominantního klonu B-lymfocytů (Obr. 2).
Pro stanovení exprese genů se s výhodou využívá detekce hladiny mRNA daného genu, například prostřednictvím jejího přepisu do cDNA a stanovením metodou kvantitativní R.TPCR v reálném čase (RT-qPCR). Stanovení exprese zmíněných genů, např. pomocí RT-qPCR, lze využít pro detekci progrese nového klonu B-lymfocytů s odlišným mutačním statusem IgVH. U pacientů s nízkou expresí je ze stejných důvodů vhodné stanovení periodicky opakovat.
Soubor genů LPL a ZAP70 doplněný o námi nově detekovaný LAG3 je vhodným souborem prognostických markérů pro stanovení prognózy B-CLL a mutačního statusu IgVH.
Přehled obrázků
Obr. 1 znázorňuje Kaplan-Meierovy křivky, vyjadřující dobu (ve dnech) od diagnózy onemocnění do zahájení terapie ve skupinách pacientů s vysokou a nízkou expresí genu LAG3 v B-CLL buňkách. Na ose x je čas ve dnech, na ose y podíl pacientů.
Obr. 2 znázorňuje fragmentační analýzu genu pro IgVH. Vlevo vzorek pacienta před terapií dominantní klon s mutovaným IgVH z rodiny VH 3-30, vpravo tentýž pacient půl roku po ukončení terapie - došlo ke změně dominantního klonu. Nový klon nese nemutovaný IgVH z rodiny VH1-69. Záchyt na základě sledování exprese LAG3, LPL a ZAP 70 v průběhu onemocnění.
Obr. 3 ukazuje rozdílně exprimované geny mezi skupinami B-CLL buněk s rozdílným mutačním statusem genu pro IgVH detekované pomocí DNA čipů. Sloupce reprezentují • ··· jednotlivé vzorky, řádky reprezentují jednotlivé geny. „M“ - mutovaný gen pro IgVH (n= 10), „N“ - nemutovaný gen pro IgVH (n=9). Červeně jsou vyznačeny up-regulované geny, zeleně jsou vyznačeny down-regulované geny.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
V naší studii jsme provedli DNA čipovou (microarray) analýzu genové exprese B-CLL buněk za účelem definování nových prognostických markérů u B-CLL. Pomocí RNeasy Mini Kit (Qiagen) byla izolována totální RNA z B-CLL buněk. Kvalita a koncentrace získané totální RNA byla stanovena spektrofotometricky (NanoDrop) a elektroforeticky (BioAnalyzer 2100). Pro další analýzy byly použity pouze vzorky s dobrými parametry (RIN > 8, koncentrace > 100 ng/ul). Pro analýzu genové exprese pomocí DNA microarrays byla RNA lineárně amplifíkována a fluorescenčně naznačena. Pro lineární amplifikaci byl použit Low RNA Input Linear Amplification Kit (Agilent). Protokol výrobce byl pozměněn tak, aby byla umožněna produkce amplifikované RNA s inkorporovaným modifikovaným nukleotidem aminoallylUTP. Protokol zahrnuje několik kroků: 1) přepis RNA do dvouvláknové cDNA s inkorporací T7 promotoru, 2) lineární amplifikace RNA pomocí in vitro transkripce enzymem T7 RNA polymerázou s inkorporací aminoallyl-UTP, 3) přečištění amplifikované RNA. Dosažená úroveň amplifikace RNA byla monitorována spektrofotometricky. Pro fluorescenční označení amplifikované RNA byl použit vlastní protokol využívající aminoreaktivní fluorescenční barvy (DY-547-NHS-ester a DY-647-NHS-ester; Dyomics), které se v alkalickém prostředí kovalentně váží na primární aminové skupiny, v tomto případě na aminoskupinu aminoallylUTP. Po proběhnutí značící reakce byla amplifikovaná RNA znovu přečištěna. Pro DNA microarray analýzu byla použita technika dvoubarevné hybridizace. Před hybridízací byl vzorek amplifikované fluorescenčně značené RNA pacienta smíchán se stejným množstvím obdobně připravené referenční RNA (Universal Human Reference RNA; Stratagene) značené jinou fluorescenční barvou. Pro hybridizaci byla směs RNA chemicky fragmentována (průměrná délka fragmentů 200bp). Hybridizace probíhala 17 hodin při 65°C. Po hybridizaci byly DNA microarrays promyty pro odstranění nenavázané RNA, usušeny centrifúgací a skenovány fluorescenčním skenerem ScanArray Express (Perkin Elmer). Obrazová data byla následně převedena do numerické podoby použitelné k dalším analýzám. Převod obrazových dat na numerická (analýza obrazu) byl proveden programem QuantArray (Perkin Elmer). Pro φ *··
• φ φ φ * redukci zdrojů variability, které nemají biologický podklad, byla hrubá data transformována a normalizována pomocí R and R Bioconductor (Gentleman RC et al., Genome Biol. 2004;5(10):R80). K vyhledání genů, na základě jejichž exprese je možné rozdělit jednotlivé vzorky do tříd (skupin), byly použity dva typy algoritmů. První náleží do skupiny „unsupervísed (machine) leaming“ a jsou schopny rozdělit vzorky do skupin (clusters) bez jejich předchozí znalosti (Hierarchical Clustering, K-Means/Medians Clustering, Šelf Organizing Maps - program TIGR MultiExperimentViewer). Druhým typem jsou postupy využívající „supervised (machine) leaming“, vyhledávající geny schopné rozlišit mezi dvěma předem známými skupinami (TIGR MultiExperimentViewer -Support Vector Machines) (Saeed AI et al., Biotechniques 2003;34(2):374-8). Normalizovaná data byla statisticky zpracována pomocí SAM (Significance Analysis of Microarrays) (Tusher VG et al., Proč Nati Acad Sci USA 2001 ;98(9):5116-21). Expresní analýzu B-CLL buněk jsme prováděli na čipech Human 1A Arrays (Agilent). Zvolené DNA čipy jsou celogenomové a nesou oligonukleotidové sondy o délce 60 bází. Detekovali jsme ~ 50 genů (Obr. 3) s rozdílnou mírou exprese odlišující pacienty s mutovaným a nemutovaným IgVH a rozdílným klinickým průběhem onemocnění. Kromě již známých prognostických markérů jsme detekovali LAG3 (lymphocyte-activation gene 3), který zatím nebyl v souvislosti s B-CLL a mutačním statusem publikován. Jeho vysoká exprese koreluje s nemutovaným IgVH statusem a Špatnou prognózou onemocnění spojenou s nutností léčby. Zjistili jsme tedy, že gen LAG3 významně koreluje se závažností onemocnění a jeho stanovení přináší významnou informaci o prognóze onemocnění a očekávané době přežití pacienta.
Příklad 2
Periferní krev pacienta s diagnózou B-CLL byla odebrána do odběrových zkumavek s antikoagulační látkou (heparin). Mononukleární buňky byly separovány pomocí gradientově centrifugace (Ficoll-Paque PLUS, GE Healthcare), které předcházela inkubace s koktejlem bispecifických protilátek (na jednom konci anti CD2, CD3, CD16, CD36, CD56, CD66b a na druhém konci anti-glykoforin A) (RosetteSep® B Cell Enrichment Cocktail, StemCell). Nežádoucí buňky tvoří pomocí bispecifických protilátek společně s červenými krvinkami formace zvané rozety. Hustota vytvořených rozet je vyšší než hustota samotné nežádoucí buňky a během gradientově centrifugace dochází k jejich sedimentaci. Totální RNA byla ze separovaných B-CLL buněk izolována pomocí RNeasy Mini Kit podle instrukcí výrobce (Qiagen). Kvalita a koncentrace získané totální RNA byla stanovena spektrofotometricky φ
• ··* • · « · ♦ · (NanoDrop) a elektroforeticky (BioAnalyzer 2100). Pro další analýzy byly použity pouze vzorky s dobrými parametry (RIN > 8, koncentrace > 50 ng/ul). K syntéze cDNA byl používán systém SuperScriptTM III Reverse Transcriptase s oligo(dT)12-18 primerem (Invitrogen). Každý vzorek byl analyzován v triplikátu pomocí systému TaqMan® Gene Expression Assay (Applied Biosystems) podle instrukcí výrobce. Amplifikace DNA byla následně detekována přístrojem 7300 Reál Time PCR Systém (Applied Biosystems) a získaná data byla analyzována pomocí softwaru Sequence Detection Systém (SDS) software version 1.3.1. Výsledkem bylo číslo cyklu, při kterém fluorescence dosáhne nastaveného prahu (CT fluorescence threshold cycle). Relativní exprese genu byla normalizována k expresi provozního genu GAPDH, který byl vybrán na základě stability exprese napříč vzorky.
Příklad 3
Periferní krev B-CLL pacienta byla přenesena do zkumavky a byl změřen objem krve. Dále byl přidán RosetteSep® Human B Cell Enrichment Cocktail (50pl/ml krve), směs byla promíchána kroužením a inkubována 20 minut při laboratorní teplotě. Poté byl přidán minimálně stejný objem 2% FBS (fetální bovinní sérum ve fyziologickém roztoku s fofátovým pufrem), promícháno a navrstveno 6 ml ředěné krve na 3 ml Ficoll-Paque Plus® vytemperováného na laboratorní teplotu. Byla provedena centrifugace 30 minut/400g. Vrstva lymfocytů byla přenesena do čisté zkumavky (15 cm) a doplněna 2% FBS na 10 ml, počet zkumavek byl zvolen tak, aby byly separované lymfocyty naředěny alespoň 2x, obsah zkumavek byl dobře promíchán. Poté byla provedena centrifugace 10-15 minut/200g, byl odsát supernatant a sediment byl rozsuspendován v 1 ml chlazeného Iyzačního puftu (lyže erytrocytů - 154,9 mM NH4C1, 9,9 mM NH4HCO3, 1 mM EDTA), objem byl doplněn na 10 ml a převracením promíchán. Sedimenty z více zkumavek byly v tomto kroku spojeny. Byla provedena centrifugace 10-15 minut/200g, odsát supernatant a sediment rozsuspendován v 2% FBS a přenesen do mikrozkumavky. Po další centrifugací 10 minut/200g byl odsát supernatant a sediment byl lyžován v 350 μΐ RLT pufru (lyzační pufr, součást RNeasy Mini Kit firmy Qiagen určenému na izolaci totální RNA).
Totální RNA byla ze separovaných B-CLL buněk izolována pomocí RNeasy Mini Kit podle instrukcí výrobce (Qiagen). Kvalita a koncentrace získané totální RNA byla stanovena spektrofotometricky (NanoDrop) a elektroforeticky (BioAnalyzer 2100). Pro další analýzy byly použity pouze vzorky s dobrými parametry (RIN > 8, koncentrace > 50 ng/μΐ). K syntéze cDNA byl použit systém SuperScriptTM III Reverse Transcriptase s oligo(dT)!2-18 primerem φ φ « · ··· • · φ · φφ (Invitrogen) podle instrukcí výrobce. Bylo transkribováno 500 ng totální RNA. Získaných 20 μΐ cDNA bylo naředěno RNAse-free vodou na konečný objem 50 μΐ. Každý vzorek byl analyzován v triplikátu pomocí systému TaqMan® Gene Expressíon Assay (Applied Biosystems) podle instrukcí výrobce. Amplifikace DNA byla následně detekována přístrojem 7300 Reál Time PCR Systém (Applied Biosystems) a získaná data byla analyzována pomocí softwaru Sequence Detection Systém (SDS) software version 1,3,1, Výsledkem bylo číslo cyklu, při kterém fluorescence dosáhne nastaveného prahu (Ct - fluorescence threshold cycle), Relativní exprese genu byla normalizována k expresi provozního genu GAPDH (Δ Ct). Získaná data byla analyzována pomocí neparametrického Wilcoxonova testu.
Exprese genů LAG3, LPL a ZAP70 byly stanoveny pomocí RT-qPCR u souboru 94 B-CLL pacientů (viz Příklad 2). Na základě výsledků, které dokumentují obr. 1,2 a Tab. 1, bylo zjištěno, že soubor genů LAG3, LPL a ZAP70, jejichž exprese odlišuje pacienty s nemutovaným IgVH od pacientů s mutovaným IgVH, tedy pacienty s různou prognózou onemocnění, je vhodným souborem pro stanovení prognózy onemocnění u pacienta s vysokou jistotou.
Tabulka 1 ukazuje souhrnné výsledky stanovení exprese genů LAG3, LPL a ZAP70 RT-qPCR u souboru 94 B-CLL pacientů. Vzorky byly podle exprese jednotlivých genů (LPL, LAG3, ZAP70) rozděleny do skupin pozitivní (exprese genu vyšší než stanovená mez) a negativní (exprese genu nižší než stanovená mez). Mez pozitivity byla stanovena pro LAG3 8,8 Δ Ct, pro LPL 8,4 Δ Ct a pro ZAP70 4,8 Δ Ct. Souhrn pro všechny tři sledované geny byl vytvořen tak, že vzoiky klasifikované jako pozitivní pro všechny tři geny byly zařazeny do skupiny pozitivních, ostatní byly vyhodnoceny jako negativní. V tabulce jsou vzorky seskupeny podle mutačního stavu genu IgVH a dále podle pozitivity/negativity pro stanovované geny. Čísla tučně představují skutečný počet případů, v závorce jsou vyjádřeny jako procento (100% = počet vzorků v dané skupině se shodným stavem IgVH). Poslední řádek tabulky představuje procento správně klasifikovaných vzorků (100% = všechny vyšetřené vzorky).
« φ ··· φ ·
Tab. 1
| gen exprese | LPL | ZAP70 | LAG3 | 3 geny | |
| IgVH UNMUT (η = 40) | POZITIVNÍ | 39 (97.5%a) | 39 (97,5%) | 40 (100,0%) | 38 (95,0%) |
| NEGATIVNÍ | 1 (2.5%) | 1 (2,5%) | 9(0%) | 2 (5,0%) | |
| IgVH MUT (n = 54) | POZITIVNÍ | 9(16,7%) | 22 (40.7%) | 36 (66,7%) | 3 (5.6%) |
| NEGATIVNÍ | 45 (83,3%) | 32 (59,3%) | 18 (33.3%) | 51 (94,4%) | |
| Procento správně určeného mutačního statusu | 89% | 80% | 62% | 95% |
• ···
Claims (5)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob stanovení prognózy B-buněčné chronické lymfocytámí leukémie (B-CLL) z biologického vzorku odebraného z těla pacienta, vyznačený tím, že se stanoví exprese genu LAG3 (lymphocyte-activation gene 3) v B-CLL buňkách vzorku.
- 2. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že se stanoví exprese genu LAG3 a alespoň jednoho genu vybraného ze skupiny zahrnující LPL a ZAP70.
- 3. Způsob podle nároku 2, vyznačený tím, že se stanoví exprese genů LAG3, LPL a ZAP70.
- 4. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačený tím, že ke stanovení exprese genu se použije detekce hladiny mRNA daného genu.
- 5. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, vyznačený tím, že biologickým vzorkem je vzorek periferní krve, kostní dřeně nebo vzorek tkáně, s výhodou je vzorkem tkáně vzorek lymfatické uzliny.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20080336A CZ301540B6 (cs) | 2008-05-30 | 2008-05-30 | Zpusob stanovení prognózy B-bunecné chronické lymfocytární leukémie |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20080336A CZ301540B6 (cs) | 2008-05-30 | 2008-05-30 | Zpusob stanovení prognózy B-bunecné chronické lymfocytární leukémie |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2008336A3 true CZ2008336A3 (cs) | 2009-12-09 |
| CZ301540B6 CZ301540B6 (cs) | 2010-04-07 |
Family
ID=41397251
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20080336A CZ301540B6 (cs) | 2008-05-30 | 2008-05-30 | Zpusob stanovení prognózy B-bunecné chronické lymfocytární leukémie |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ301540B6 (cs) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2413475C (en) * | 2002-04-25 | 2010-07-27 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Zap-70 expression as a marker for chronic lymphocytic leukemia/small lymphocytic lymphoma (cll/sll) |
| CA2586874A1 (en) * | 2004-11-08 | 2006-05-11 | Institut Pasteur | Method of diagnosis/prognosis of human chronic lymphocytic leukemia comprising the profiling of lpl/adam genes |
-
2008
- 2008-05-30 CZ CZ20080336A patent/CZ301540B6/cs unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ301540B6 (cs) | 2010-04-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lamant et al. | Gene-expression profiling of systemic anaplastic large-cell lymphoma reveals differences based on ALK status and two distinct morphologic ALK+ subtypes | |
| EP3994696B1 (en) | Systems and methods for sample preparation, sample sequencing, and sequencing data bias correction and quality control | |
| CN105189783B (zh) | 鉴定生物样品中定量细胞组成的方法 | |
| JP2021526825A (ja) | ゲノム変化を評価するための組成物および方法 | |
| US20150147271A1 (en) | Targets for diagnosis, prognosis and therapy of acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndromes | |
| JP2009529878A (ja) | 原発細胞の増殖 | |
| JP2015535178A (ja) | 末梢血における形質細胞増殖障害のクロノタイプのモニタリング | |
| WO2014071279A2 (en) | Gene fusions and alternatively spliced junctions associated with breast cancer | |
| US20220064738A1 (en) | Genetic abnormalities in plasma cell dyscrasias | |
| EP1937846A2 (en) | Systemic lupus erythematosus diagnostic assay | |
| KR20140105836A (ko) | 다유전자 바이오마커의 확인 | |
| JP2021526791A (ja) | セルフリー核酸の細胞起源を決定するための方法およびシステム | |
| Kotaskova et al. | High expression of lymphocyte-activation gene 3 (LAG3) in chronic lymphocytic leukemia cells is associated with unmutated immunoglobulin variable heavy chain region (IGHV) gene and reduced treatment-free survival | |
| WO2017136508A1 (en) | Dissociation of human tumor to single cell suspension followed by biological analysis | |
| JP2010537659A (ja) | Ｅｒ−患者におけるガンの予後判定のための方法およびツール | |
| Yuregir et al. | Fluorescent in situ hybridization studies in multiple myeloma | |
| EP3983565B1 (en) | Method of stratifying subjects into sub-groups for therapeutic treatment | |
| JP2010537658A (ja) | Ｈｅｒ２＋患者におけるガンの予後判定のための方法およびツール | |
| JP6543573B2 (ja) | ＣＤ８＋Ｔリンパ球、特にＣＤ８α及びβＴリンパ球の亜集団の同定用のエピジェネティック法 | |
| Qi et al. | Expression of Dlk1 gene in myelodysplastic syndrome determined by microarray, and its effects on leukemia cells | |
| CA3085464A1 (en) | Compositions and methods for diagnosing lung cancers using gene expression profiles | |
| ES2324751A1 (es) | Metodos y kits para diagnosticar y/o pronosticar el estado de tolerancia en el transplante de higado. | |
| CZ2008336A3 (cs) | Zpusob stanovení prognózy B-bunecné chronické lymfocytární leukémie | |
| Sabourdy et al. | Gene expression profiling of systemic anaplastic large cell lymphoma | |
| US20230313312A1 (en) | Methods for early detection of breast cancer |