CZ301540B6 - Zpusob stanovení prognózy B-bunecné chronické lymfocytární leukémie - Google Patents

Abstract

Zpusob stanovení prognózy B-bunecné chronické lymfocytární leukémie z biologického vzorku odebraného z tela pacienta, jehož podstata spocívá v tom, že se stanoví exprese genu LAG3 (lymphocyte-activation gene 3), LPL a ZAP70. Stanovení exprese techto genu muže vést ke stanovení prognózy onemocnení s až 95% jistotou. Vysoká exprese techto genu koreluje s prítomností nemutovaného genu pro IgVH a tedy s horším prubehem onemocnení a kratším prežíváním pacientu.

Description

Předkládaný vynález se týká způsobu stanovení prognózy u pacientů s diagnostikovanou Bbuněčnou chronickou lymfocytámí leukémií.

Dosavadní stav techniky

B-buněčná chronická lymfocytámí leukémie (B-CLL) je charakterizována jako monoklonální expanze zralých B-lymfocytů, které se hromadí v periferní krvi a lymfatických orgánech (Chiorazzi N et al., N. Engl J. Med. 2005;352:804-815). Donedávna se v klinické praxi k určení prognózy používal pouze stagíng podle Raie (Rai KR et al., Blood 1975;46:219-234) nebo podle Bineta (Binet JL et aí., Cancer 1981;48:198-206). Tento empirický systém však není v současné době dostačující. Pacienti jsou diagnostikováni často ve velmi raném stádiu B-CLL a na základě prostého stagingu nelze odlišit pacienty, kteří budou rychle progredovat od pacientů s tndolentní formou onemocnění. B-CLL je klinicky značně heterogenní onemocněni a doba přežití se u jed20 notlivých pacientů velmi liší. Navíc chemoterapie včasných stádiích onemocnění nepřináší nemocnému očekávaný užitek, naopak často dochází ke zkrácení doby přežití nebo rozvoji sekundárních malignit. Z tohoto důvodu se u B-CLL pacientů bez klinických příznaků nemoci Často doporučuje pouze sledování. Problematické je zejména včasné rozpoznání agresivní nemoci často doporučuje pouze sledování. Problematické je zejména včasné rozpoznání agresivní formy choroby, která se častěji projevuje u mladších pacientů. Během posledních deseti let byla onemocnění B-CLL věnována velká pozornost a výsledkem je soubor několika skupin parametrů, které B-CLL podrobně charakterizují a umožňují predikci průběhu nemoci.

Dosud nevýznamnějším prognostickým markérem u B-buněčné chronické lymfocytámí leuké30 mie se jeví mutační status genu pro těžký řetězec imunoglobulinu (IgVH). Přítomnost nemutovaného genu pro IgVH (nukleotidová homologie se zárodečnou linií větší než 98 %) je spojena s horším průběhem a kratším přežíváním pacientů (8 let vs. 25 let u pacientů s mutovaným IgVH) (Damle RN et al., Blood 1999;94:1840-1847; HamblinTJ et al. Blood 1999;94:1848-1854). Stanovení tohoto parametru nezbytného pro stanovení prognózy a léčby onemocnění je však vysoce techniky, Časově i finančně náročné, je proto snaha nahradit jeho detekci jiným snadno stanovitelným markérem nebo skupinou markérů. Mutační status genu pro IgVH se stanovuje následujícím způsobem: z nádorových buněk je vyizolována RNA, ta je následně přepsána do cDNA. cDNA je amplifíkována s primery specifickými pro jednotlivé VH rodiny. Při monoklonálním typu onemocnění je PCR produkt přímo sekvenován. U polyklonálních pacientů je nutné jednotlivé klony odlišit pomocí klonování a následné sekvenace. V obou případech jsou získané sekvence následně porovnány se sekvencí dané zárodečné linie v databázi a určena míra jejich homologie. Toto stanovení se provádí u monoklonálních pacientů jedenkrát a považuje se za faktor, který se během onemocnění nemění. U polyklonálních pacientů se průběžně sleduje pravděpodobný nárůst nejagresivnějšího klonu.

Cílem předkládaného vynálezu je nahradit stávající stanovení mutačního statusu genu pro IgVH souborem genů, jejichž exprese by odlišovala obě prognostiky rozdílné skupiny. V současné době jsou známy některé geny, jejichž míra exprese koreluje s přítomností či nepřítomnosti mutovaného genu pro IgVH. Jedním z takových markérů objevených u B-CLL pomocí DNA čipových analýz je ZAP70. Tato tyrosin kináza je fyziologicky exprímovaná v T-lymfocytech a její vysoká exprese koreluje s přítomností nemutovaného genu pro IgVH (Rosenwald A et al., J Exp. Med. 2001;194:1639-1647; Wiesner A et al., Blood 2003; 101:4944-^951). Dalším genem s rozdílnou expresí odlišující obě skupiny je LPL (lipoproteinová lipáza). I tento gen byl detekován na základě čipových analýz (Oppezzo P et ai., Blood 2005;106:650-657; Bilban M et al., Leukemia

2006;20:1080-1088) ajeho vysoká exprese koreluje s přítomností nemutovaného genu pro IgVH.

-1CZ 301540 B6

LAG3 (CD223) (lymphocyte-activation gene 3) je membránový protein strukturně podobný

CD4, a to jak na genové, tak na proteinové úrovni. LAG3 se exprimuje na T lymfocytech a NK buňkách po jejich aktivaci (Triebel F et al., Journal of Experimental Medicine 1996; 171:13935 1405). Později bylo zjištěno, že se LAG3 exprimuje také na B lymfocytech, a to po jejich aktivaci prostřednictvím T lymfocytů (Kisielow M et al., European Journal of Immunology 2Q05;35(7);2081-2088). Protein tvoří dvě podjednotky - 70 kDa transmembránový řetězec oligomerizuje s druhým zkráceným 54 kDa extracelulámím fragmentem, zbývající 16 kDa řetězec s transmembránovou doménou se uvolňuje jako solubilní LAG3 (LiN et al., Journal of io Immunology 2004; 173(11):6806-6812). Funkce tohoto proteinu zatím není zcela objasněna. Pravděpodobně se účastní celé řady regulací imunitních pochodů. Signalizace na T lymfocytech přes LAG3 např. inhibuje aktivaci CD4+ a CD8+ T lymfocytů (Macon-Lemaitre L and Triebel F, Immunology 2005; 115(2): 170—178) a reguluje jejich expanzi (Workman CJ and Vignali DA, European Journal of Immunology 2003;33(4):970-979). Dále tento protein ovlivňuje např. zrání dendritíckých buněk (Andreae Set al., Journal of Immunology 2002; 168(8):3874-3880) a reguluje diferenciaci makrofágů dendritíckých buněk z monocytámích prekurzorů (Buisson S and Triebel F, Immunology 2005; 114(3):369-374) apod. V literatuře se uvádí souvislost vysoké exprese genu LAG3 s nemutovaným IgVH statusem a špatnou prognózou onemocnění spojenou s nutností léčby (Chuang et al., Blood (ASH Annual Meeting Abstracts) 2005; 106(11), abstract

2952; Kotašková J. et al., Haematologica 2007;92, suppl. 1,390, abstract 1056).

Podstata vynálezu

Tento vynález se týká nového souboru prognostických markérů, které umožňují s až 95% jistotou stanovit prognózu pacienta s B-buněČnou chronickou lymfocytární leukémii (B-CLL).

Předmětem předloženého vynálezu je způsob stanovení prognózy B-buněčné chronické lymfocytámí leukémie z biologického vzorku odebraného z těla pacienta, jehož podstata spočívá v tom, že se stanoví exprese genů LAG3 (lymphocyte-activation gene 3), ZAP70 a LPL v B-CLL buňkách vzorku. Biologickým vzorkem může být vzorek periferní krve, vzorek kostní dřeně nebo vzorek tkáně, zejména může být vzorkem tkáně vzorek lymfatické uzliny.

Význakem vynálezu je, že ke stanovení exprese genu lze využít detekci hladiny mRNA daného genu.

Na základě DNA čipové analýzy genové exprese B-CLL buněk za účelem definování nových prognostických markérů bylo detekováno zhruba 50 genů s rozdílnou mírou exprese odlišující pacienty s mutovaným a nemutovaným IgVH a rozdílným klinickým průběhem onemocnění.

Bylo zjištěno, že soubor 3 markérů, ZAP70, LPL a LAG3, umožňuje s 95% jistotou stanovit prognózu pacienta s B-CLL a na základě této prognózy stanovit vhodnou léčbu. Jednoduchá detekce exprese tohoto setu genů by mohla spolehlivě doplnit nebo nahradit náročné stanovení mutačního statusu genu pro IgVH, což by přineslo časovou i finanční úsporu. Kromě primární diagnostiky Ieukemických pacientů by se tato metodika mohla uplatnit i u pacientů po léčbě, u nichž vlivem terapie může dojít k potlačení dominantního klonu B-lymfocytů (Obr. 2).

Pro stanovení exprese genů se s výhodou využívá detekce hladiny mRNA daného genu, například prostřednictvím jejího přepisu do cDNA a stanovením metodou kvantitativní RT-PCR v reálném so Čase (RT-qPCR). Stanovení exprese zmíněných genů, např. pomocí RT-qPCR, lze využít pro detekci progrese nového klonu B-lymfocytů s odlišným mutačním statusem IgVH. U pacientů s nízkou expresí je ze stejných důvodů vhodné stanovení periodicky opakovat.

Soubor genů LPL, ZAP70 a LAG3 je vhodným souborem prognostických markérů pro stanovení prognózy B-CLL a mutačního statusu IgVH.

-2CZ 301540 B6

Přehled obrázků

Obr. 1 znázorňuje Kaplan-Meierovy křivky, vyjadřující dobu (ve dnech) od diagnózy onemocnění do zahájení terapie ve skupinách pacientů s vysokou a nízkou expresí genu LAG3 v B-CLL buňkách. Na ose x je Čas ve dnech, na ose y podíl pacientů.

Obr. 2 znázorňuje fřagmentační analýzu genu pro IgVH. Vlevo vzorek pacienta před terapií dominantní klon s mutovaným IgVH z rodiny VH 3-30, vpravo tentýž pacient půl roku po ukončení terapie - došlo ke změně dominantního klonu. Nový klon nese nemutovaný IgVH z rodiny io VH1-69. Záchyt na základě sledování exprese LAG3, LPL a ZAP 70 v průběhu onemocnění.

Obr. 3 ukazuje rozdílně exprimované geny mezi skupinami B-CLL buněk s rozdílným mutačním statusem genu pro IgVH detekované pomocí DNA čipů. Sloupce reprezentují jednotlivé vzorky, řádky reprezentují jednotlivé geny. „M“ - mutovaný gen pro IgVH (n=10), „N“^- nemutovaný gen pro IgVH (n=9). Červeně jsou vyznačeny up-regulované geny, zeleně jsou vyznačeny downregulované geny.

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1

V naší studii jsme provedli DNA Čipovou (microarray) analýzu genové exprese B-CLL buněk za účelem definování nových prognostických markérů u B-CLL. Pomocí RNeasy Mini Kit (Qiagen) byla izolována totální RNA z B-CLL buněk. Kvalita a koncentrace získané totální RNA byla stanovena spektrofotometricky (NanoDrop) a elektroforeticky (BioAnalyzer 2100). Pro další analýzy byly použity pouze vzorky s dobrými parametry (RIN > 8, koncentrace > 100 ng/ul). Pro analýzu genové exprese pomocí DNA microarrays byla RNA lineárně amplifikována a fluores30 cenčně naznačena. Pro lineární amplifikaci byl použit Low RNA Input Linear Amplification Kit (Agilent). Protokol výrobce byl pozměněn tak, aby byla umožněna produkce amplifikované RNA s inkorporovaným modifikovaným nukleotidem aminoallyl-UTP. Protokol zahrnuje několik kroků: 1) přepis RNA do dvouvláknové cDNA s inkorporací T7 promotoru, 2) lineární amplifikace RNA pomocí in vitro transkripce enzymem T7 RNA polymerázou s inkorporací aminoallyl35 UTP, 3) přečištění amplifikované RNA. Dosažená úroveň amplifikace RNA byla monitorována spektrofotometricky. Pro fluorescenční označení amplifikované RNA byl použit vlastní protokol využívající aminoreaktivní fluorescenční barvy (DY-547-NHS-ester a DY-647-NHS-ester; Dyomics), které se v alkalickém prostředí kovalentně váží na primární aminové skupiny, v tomto případě na aminoskupinu aminoallyl-UTP. Pro proběhnutí značící reakce byla amplifikovaná

RNA znovu přečištěna. Pro DNA microarray analýzu byla použita technika dvoubarevné hybridízace. Před hybridizací byl vzorek amplifikované fluorescenčně značené RNA pacienta smíchán se stejným množstvím obdobně připravené referenční RNA (Universal Human Reference RNA; Stratagene) značené jinou fluorescenční barvou, Pro hybridizací byla směs RNA chemicky fragmentována (průměrná délka fragmentů 200bp). Hybridizace probíhala 17 hodin pří 65 °C. Po hybridizací byly DNA microarrays promyty pro odstranění nenavázané RNA, usušeny centriťugací a skenovány fluorescenčním skenerem ScanArray Express (Perkin Elmer). Obrazová data byla následně převedena do numerické podoby použitelné k dalším analýzám. Převod obrazových dat na numerická (analýza obrazu) byl proveden programem QuantArray (Perkin Elmer). Pro redukci zdrojů variability, které nemají biologický podklad, byla hrubá data transformována a normalizována pomocí R and R Bioconductor (Gentleman RC et al., Genome Biol. 2004;5(10):R80). K vyhledání genů, na základě jejichž exprese je možné rozdělit jednotlivé vzorky do tříd (skupin), byly použity dva typy algoritmů. První náleží do skupiny „unsupervised (machine) leaming“ a jsou schopny rozdělit vzorky do skupin (clusters) bez jejich předchozí znalosti (Hierarchical Clustering, K-Means/Medians Clustering, Šelf Organizing Maps - pro55 gram TIGR MultiExperimentViewer). Druhým typem jsou postupy využívající „supervised

-3CZ 301540 B6 (machine) leaming“, vyhledávající geny schopné rozlišit mezi dvěma předem známými skupinami (TIGR MultiExperimentViewer -Support Vector Machines) (Saeed AI et al., Biotechniques

2003;34(2):3 74-8). Normalizovaná data byla statisticky zpracována pomocí SAM (Significance

Analysis of Microarrays) (Tusher VG et al., Proč. Nati Acad Sci USA 2001;98(9);5116-21).

Expresní analýzu B-CLL buněk jsme prováděli na čipech Human IA Arrays (Agilent). Zvolené DNA čipy jsou celogenomové a nesou oligonukleotídové sondy o délce 60 bází. Detekovali jsem - 50 genů (Obr. 3) s rozdílnou mírou exprese odlišující pacienty s mutovaným a nemutovaným IgVH a rozdílným klinickým průběhem onemocnění. Kromě již známých prognostických markérů jsme detekovali LAG3 (lymphocyte-activation gene 3), který zatím nebyl v souvislosti s ΒΙΟ CLL a mutačním statusem publikován. Jeho vysoká exprese koreluje s nemutovaným IgVH statusem a Špatnou prognózou onemocnění spojenou s nutností léčby. Zjistili jsme tedy, že gen LAG3 významně koreluje se závažností onemocnění a jeho stanovení přináší významnou informaci o prognóze onemocnění a očekávané době přežití pacienta.

Příklad 2

Periferní krev pacienta s diagnózou B-CLL byla odebrána do odběrových zkumavek s antikoagulační látkou (heparin). Mononukleámí buňky byly separovány pomocí gradientově centri20 fugace (Ficoll-Paque PLUS, GE Healthcare), které předcházela inkubace s koktejlem bispecifických protilátek (na jednom konci anti CD2, CD3, CD 16, CD36, CD56, CD66b a na druhém konci anti-glykoforin A) (RosetteSep® B Cell Enrichment Cocktail, StemCell). Nežádoucí buňky tvoří pomocí bispecifíckých protilátek společně s červenými krvinkami formace zvané rozety. Hustota vytvořených rozet je vyšší než hustota samotné nežádoucí buňky a během gradi25 entové centrifugace dochází k jejich sedimentaci. Totální RNA byla ze separovaných B-CLL buněk izolována pomocí RNeasy Mini Kit podle instrukcí výrobce (Qiagen). Kvalita a koncentrace získané totální RNA byla stanovena spektrofotometrícky (NanoDrop) a elektroforeticky (BioAnalyzer 2100). Pro další analýzy byly použity pouze vzorky s dobrými parametry (RIN > 8, koncentrace > 50ng/ul). K syntéze cDNA byl používán systém SuperScriptTM ΠΙ Reverse

Transcriptase s oligo(dT)12-18 primerem (Invitrogen). Každý vzorek byl analyzován v triplikátu pomocí systému TaqMan® Gene Expression Assay (Applied Biosystems) podle instrukcí výrobce. Amplifíkace DNA byla následně detekována přístrojem 7300 Reál Time PCR System (Applied Biosystems) a získaná data byla analyzována pomocí softwaru Sequence Detection System (SDS) software version 1.3.1. Výsledkem bylo číslo cyklu, při kterém fluorescence dosáhne nastaveného prahu (CT - fluorescence threshold cycte). Relativní exprese genu byla normalizována k expresi provozního genu GAPDH, který byl vybrán na základě stability exprese napříč vzorky.

Příklad 3

Periferní krev B-CLL pacienta byla přenesena do zkumavky a byl změřen objem krve. Dále byl přidán RosetteSep® Human B Cell Enrichment Cocktail (50pI/ml krve), směs byla promíchána kroužením a inkubována 20 minut při laboratorní teplotě. Poté byl přidán minimálně stejný objem 2% FBS (fetální bovinní sérum ve fyziologickém roztoku s fosfátovým pufrem), promícháno a navrstveno 6 ml ředěné krve na 3 ml Ficoll-Paque Plus® vytemperovaného na laboratorní teplotu. Byla provedena centrifugace 30 minut/400 g. Vrstva lymfocytů byla přenesena do čisté zkumavky (15 cm) a doplněna 2% FBS na 10 ml, počet zkumavek byl zvolen tak, aby byly separované lymfocyty naředěny alespoň 2x, obsah zkumavek byl dobře promíchán. Poté byla provedena centrifugace 10 až 15 minut/200 g, byl odsát supematant a sediment byl rozsuspendovan v 1 ml chlazeného lyzačního pufru (lyže eiytrocytů - 154,9 mM NH4C1, 9,9 mM NH4HCO3, 1 mM EDTA), objem byl doplněn na 10 ml a převracením promíchán. Sedimenty z více zkumavek byly v tomto kroku spojeny. Byla provedena centrifugace 10 až 15 minut/200 g, odsát supematant a sediment rozsuspendován v 2% FBS a přenesen do mikrozkumavky. Po další

-4CZ 301540 B6 centrifugaci 10 minut/200 g byl odsát supematant a sediment byl lyžován v 350 μί RLT pufru (lyzační pufr, součást RNeasy Mini Kit firmy Qiagen určenému na izolaci totální RNA).

Totální RNA byla ze separovaných B-CLL buněk izolována pomocí RNeasy Mini Kit podle instrukcí výrobce (Qiagen). Kvalita a koncentrace získané totální RNA byla stanovena spektrofotometricky (NanoDrop) a elektroforeticky (BioAnalyzer 2100), Pro další analýzy byly použity pouze vzorky s dobrými parametry (RTN > 8, koncentrace > 50 ng/μΙ). K syntéze cDNA byl použit systém SuperScriptTM ΙΠ Reverse Transcriptase s oligo(dT)12-18 primerem (Invitrogen) podle instrukcí výrobce. Bylo transkribováno 500 ng totální RNA, Získaných 20 μΐ cDNA bylo io naředěno RNAse-free vodou na konečný objem 50 μί. Každý vzorek byl analyzován v triplikátu pomocí systému TaqMan® Gene Expressíon Assay (Applied Biosystems) podle instrukcí výrobce. Amplifíkace DNA byla následně detekována přístrojem 7300 Reál Time PCR System (Applied Biosystems) a získaná data byla analyzována pomocí softwaru Sequence Detection System (SDS) software version 1.3.1. Výsledkem bylo číslo cyklu, pri kterém fluorescence i5 dosáhne nastaveného prahu (Ct - fluorescence threshold cycle). Relativní exprese genu byla normalizována k expresi provozního genu GAPDH (Δ Ct). Získaná data byla analyzována pomocí neparametrického Wilcoxonova testu.

Exprese genů LAG3, LPL a ZAP70 byly stanoveny pomocí RT-qPCR u souboru 94 B-CLL

2o pacientů (viz Příklad 2). Na základě výsledků, které dokumentují obr. 1,2 a Tab. 1, bylo zjištěno, že soubor genů LAG3, LPL a ZAP70, jejichž exprese odlišuje pacienty s nemutovaným IgVH od pacientů s mutovaným IgVH, tedy pacienty s různou prognózou onemocnění, je vhodným souborem pro stanovení prognózy onemocnění u pacienta s vysokou jistotou.

Tabulka 1 ukazuje souhrnné výsledky stanovení exprese genů LAG3, LPL a ZAP70 RT-qPCR u souboru 94 B-CLL pacientů. Vzorky byly podle exprese jednotlivých genů (LPL, LAG3, ZAP70) rozděleny do skupin pozitivní (exprese genu vyšší než stanovená mez) a negativní (exprese genu nižší než stanovená mez). Mez pozitivity byla stanovena pro LAG3 8,8 Δ Ct, pro LPL 8,4 Δ Ct a pro ZAP70 4,7 Δ Ct. Souhrn pro všechny tři sledované geny byl vytvořen tak, že vzorky klasifikované jako pozitivní pro všechny tři geny byly zařazeny do skupiny pozitivních, ostatní byly vyhodnoceny jako negativní. V tabulce jsou vzorky seskupeny podle mutačního stavu genu IgVH a dále podle pozitivity/negativity pro stanovené geny. Čísla tučně představují skutečný počet případů, v závorce jsou vyjádřeny jako procento (100 % - počet vzorků v dané skupině se shodným stavem IgVH). Poslední řádek tabulky představuje procento správně klasifi35 kovaných vzorků (100 % - všechny vyšetřené vzorky).

Tab. 1

	gen exprese	LPL	ZAP70	LAG3	3 geny
IgVH UNMUT (n = 40)	POZITIVNÍ	39 (97,5%)	39 (97,5%)	4Q(ioo,o%)	38 (95,0%)
NEGATIVNÍ	1 (2,5%)	1 (2,5%)	0 (0%)	2 (5,0%)
IgVHMUT (n=54)	POZITIVNÍ	9 (16,7%)	22(40,7%)	39(66,7%)	3 (5,6%)
NEGATIVNÍ	45 (83,3%)	32 (59.3%)	IB (33,3%)	51 (94,4%)
Procento správně určeného mutačního statusu	89%	80%	62%	95%

Claims (3)

1. Způsob stanovení prognózy B -buněčné chronické lymfocytámí leukémie (B-CLL) z biologického vzorku odebraného z těla pacienta, vyznačený tím, že se stanoví exprese genů LAG3, LPL a ZAP70 v B-CLL buňkách vzorku.

10

2. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že ke stanovení exprese genu se použije detekce hladiny mRNA daného genu.

3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačený tím, že biologickým vzorkem je vzorek periferní krve, kostní dřeně nebo vzorek tkáně, s výhodou je vzorkem tkáně vzorek lymfatické

15 uzliny.