CZ200983A3

CZ200983A3 - Antimikrobiální peptidy

Info

Publication number: CZ200983A3
Application number: CZ20090083A
Authority: CZ
Inventors: Monincová@Lenka; Cerovský@Václav; Slaninová@Jirina; Hovorka@Oldrich; Cvacka@Josef; Voburka@Zdenek; Fucík@Vladimír; Borovicková@Lenka
Original assignee: Ústav organické chemie a biochemie Akademie ved Ceské republiky, v. v. i.
Priority date: 2009-02-12
Filing date: 2009-02-12
Publication date: 2010-06-02
Also published as: EP2396020A2; CZ301719B6; WO2010091651A4; WO2010091651A3; EP2396020B1; WO2010091651A2

Abstract

Popsány jsou peptidy o vzorcích (I) a (II) isolované jedových vácku eusociálních vcel Halictus sexcinctus a jejich syntetické analogy pripravené zámenou aminokyseliny v poloze 4, 11 nebo 12 vzorce (I) nebo v poloze 4 vzorce (II) aminokyselinou Lys, vykazující biologické úcinky a jejich použití pro výrobu léciva k lécbe mikrobiálních, parazitických a plísnových onemocnení a pro lécení rakovin.

Description

Antimikrobiální peptidy

Oblast techniky

Vynález se týká antimikrobiálních peptidů, isolovaných z přírodního materiálu, vzorců

I all

H-Gly-Met-T rp-Ser-Lys-Ile-Leu-Gly-His-Leu-Ile-Arg-NHí (I)

H-Gly-Lys-Trp-Met-Ser-Leu-Leu-Lys-His-Ile-Leu-Lys-NH2 (II) a jejich syntetických analogů, majících v poloze 4, 11 nebo 12 vzorce (I) nebo v poloze 4 vzorce (II) aminokyselinu Lys, jakož i použití takových sloučenin pro přípravu antimikrobiálních, antiparazitických, protiplísňových a protirakovinných léčiv.

Dosavadní stav techniky

Prvotní obrana proti mikrobiální infekci, kterou si příroda během evoluce vyvinula, spočívá v sekreci látek peptidové povahy dnes v odborné terminologii označovaných jako antimikrobiální peptidy [1-3]. Ty byly identifikovány prakticky v celém spektru živočišné a rostlinné říše. Například v říši hmyzu právč antimikrobiální peptidy představují hlavni prostředek obrany proti mikrobům [4]. S přihlédnutím k prostředí, ve kterém se hmyz pohybuje, se musí jednat o peptidy velmi účinné. Tyto peptidy jsou schopny velice rychle zabíjet bakterie a některé další mikroorganismy, a to mechanismem zcela odlišným než využívá imunitní systém vyšších organismů. 1 když tento mechanismus ještě není zcela objasněn, v podstatě spočívá v narušeni buněčné membrány bakterii tvorbou transmembránových pórů nebo iontových kanálů. To způsobí únik metabolite a zborcení celé mikrobiální struktury [5,6], Obecně je též známo, že antimikrobiální peptidy u bakterii nevyvolávají resistenci, jako třeba doposud používaná tradiční antibiotika. Poněkud zvláštní skupina peptidů s antimikrobiálmm účinkem se nachází vjedu hmyzu rodu Hymenoptera [7], V přírodě je antimikrobiální účinek peptidů isolovaných z jedu vos, včel, čmeláků a mravenců většinou sekundární, a jejich hlavni úloha spočívá spíše v toxicitě či vyvolání bolesti a zánětu.

255

-2jako třeba u peptidů patřících do skupiny mastoparanů [8]. Nicméně antimikrobiální účinek peptidů isolovaných například z jedu primitivních včel je značně výrazný a vzhledem k tomu, že se jedná o peptidy snadno dostupné synteticky, mohly by se tyto peptidy využít v praktické medicíně. To souvisí se současnou situací, kdy překonávání resistence bakteriálních patogenů vůči tradičním antibiotikům vyžaduje vyhledávání stále nových typů antibakteriálních látek, z nichž nej perspektivnějšími se zdají být antimikrobiální peptidy.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu jsou antimikrobiální peptidy mající následující vzorce:

H-Gly-Met-Trp-Ser-Lys-Ile-Leu-Gly-His-Leu-Ile-Arg-NH₂ (I)

H-Gly-Lys-Trp-Met-Ser-Leu-Leu-Lys-His-Ile-Leu-Lys-NH₂ (Π)

H-Gly-Mct-Trp-Lys-Ly s41e-Lcu-Gly-His-Leu-Ile-Arg-NH₂ (I-A/l)

H-Gly-Met-Trp-Ser-Lys-Ile-Leu-Gly-His-Leu-Lys-Arg-NH₂ (I-A/2)

H-Gly-Met’Trp-Ser-Lys41e-Leu-Gly-His-Leu-Ile-Lys-NH₂ (I-A/3)

H-Gly-Lys-Trp-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-His-Ile-Leu-Lys-NH₂ (II-A/l)

Tento vynález se rovněž týká použití uvedených antimikrobiálních peptidů o vzorcích I, Π, I-A/l-3 a II-A/1 pro přípravu antimikrobiálních, antiparazitických, protiplísňových a protirakovinných léčiv.

Podrobný popis vynálezu

Peptidy vzorce (I) a (II) byly nazvány Wictin I a halictin II a tsolovány z jedových nesociálních včel Halier sM. Peptidy I a II, mají výrazný anumttabtata Účinek, doprovázený nevýraznou hemolytickou aktivitou.

I když primární funkce těchto peptidů v pHrodé není známa, jedná se o jedinečné, nové, dosud nepopsané peptidy s výraznými antimikrobiálními účinky. Své anttmtkrobralnr vlastnosti mají diky jedinečné primární struktuře, která podmiňuje úč.nnou sekundanti

-3strukturu v přítomnosti buněčné membrány bakterií a chemických látek napodobujících vlastnosti membrán [9],

Sekundární struktura halictinů, která je neuspořádaná ve vodném prostředí, snadno přechází na strukturu a-helixu v přítomnosti látek tuto strukturu podporujících, jako jsou trifluoroethanol či dodecylsulfát sodný (SDS) [9], nebo v kontaktu s biologickou membránou. V tzv. Edmundsonově kruhové projekci [10] (Obr. 1) je patrný amphipathický charakter [11, 12] těchto peptidů s dobře definovaným hydrofobními i hydro filními sektory. Rozdělení těchto dvou sektorů na opačné strany a-helixu, nebo-li tzv. amphipathicita [11,12], hraje výraznou úlohu při interakci antimikrobiálního peptidu s bakteriální membránou a je tedy jedním z nej důležitějších faktorů vedoucích k narušení bakteriální membrány a v konečném výsledku ke smrti bakterie [6]. V tomto procesu se zároveň uplatňuje kationicita peptidu [11], která je v případě halictinů I zajištěna přítomnosti tri bazických aminokyselin (Lys, His, Arg) v sekvenci a v případě halictinů II přítomností čtyř babických aminokyselin (tři Lys a jeden His) soustředěných v hydrofilních sektorech peptidů. Toto prostorové uspořádání umožňuje elektrostatickou atrakci kladně nabitého sektoru peptidů k záporně nabitým fosfolipidům obsažených v bakteriální membráně. Hydrofobní sektor peptidů je poté vnořen do lipofílní části membrány a po dosažení určité koncentrace peptidu na bakteriální stěně dojde kjejímu narušení. Teoreticky mohou halictiny v tzv. anisotropním prostředí vytvořit strukturu optimálního α-helixu o třech závitech, jenž je stabilizován spojením jednotlivých závitů pomocí vodíkových můstků mezi kyslíky α-karbonylů jednoho závitu a vodíky -NH- skupin závitu následujícího. Z literatury je známo [9], že mírné narušení ahelikální struktury může příznivě eliminovat nežádoucí hemolytickou aktivitu antimikrobiálních peptidů, která je mírou toxicity těchto peptidů. To můžeme ovlivnit náhradou aminokyselin v centrální části molekul halictinů za jiné aminokyseliny narušující a- helikální uspořádání (tzv. helix braker). Dalšími záměnami původních aminokyselin [13] v sekvenci halictinů za jiné ovlivníme celkovou kationicitu, hydrofobicitu či amphipathicitu halictinů ve snaze zvýšit jejich antimikrobiální účinek a na druhé straně potlačit aktivitu hemolytickou. Příklady několika změn a jejich následky na antimikrobiální a hemolytickou aktivitu peptidů jsou uvedeny v příkladech.

-4Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 znázorňuje helikální kruhovou projekci halictinů: a) halictin I, b) halictin II, Podtržené jsou vyznačeny hydrofobní aminokyseliny, kurzívou babické aminokyseliny (Arg, Lys, His) a tučně ostatní hydrofilní aminokyseliny.

Příklady,L'. ^{/ Λ}

Příklad 1

Isolace z přírodního materiálu

Včely Halictus sexcinctus byly pochytány v oblasti východních Čech v lokalitě Veská u Hradce Králového a po několikadenním skladování při -20 °C byly vypreparovány jedové váčky z pěti jedinců. Tyto byly extrahovány směsí 50% vodného acetonitrilu s obsahem 0,1% kyseliny trifluorooctové (TFA) (25 μΐ). Extrakt byl frakcionován pomoci vysoceúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) na koloně Vydac C-18 (250 x 4.6 mm) při průtoku 1 ml/min za použití gradientu od 5% acetonitril/voda/0,1% TFA do 70% acetonitril/voda/O,l%TFA. Hlavní peptidové frakce, které byly detekovány UV absorpcí, byly sebrány a koncentrovány v rotačním vakuovém koncentrátoru. Jejich primární struktura byla stanovena pomoci hmotové spektrometrie a metodou automatického Edmanova odbourávání. Halictiny představují hlavní peptidovou složku extraktu.

Příklad 2

Syntéza sloučenin vzorců (I), (II) a jejich analogů I-A a II-A

Tyto peptidy lze syntetizovat metodou syntézy peptidů na pevné fázi (SPPS). Syntéza byla provedena manuálně v 5 ml polypropylenových injekčních stříkačkách s teflonovým filtrem na dně stříkačky s využitím protokolu Fmoc-chemie. Jako pevný nosič byla použita pryskyřice Rink Amide MBHA o substituci 0,7 mmol/g. Chráněné Fmoc-aminokyseliny byly kondensovány ve 4-násobném přebytku v dimethylformamidu a ke kondensaci byl použit diisopropylcarbodiimid v přítomnosti l-hydroxybezotriazolu. Surové halictiny (I) a (II) byly získány odštěpením z pryskyřice a deprotekcí působením směsi TFA/1,2ethanedithiol/FhO/thioanisol/triisopropylsilan (90 : 2,5 : 2,5 : 3 : 2) po dobu 3.5 hbdl a následnou precipitací íert-butyl methyl etherem. Tímto postupem bylo získáno 70 * 80 mg surových peptidů. Část tohoto materiálu (20 mg) byla v každém případě čištěna preparativní HPLC na koloně Vydac C-l8 (250 x 10 mm) při průtoku 3.0 ml/min a s využitím stejného . >

gradientu, jaký je popsán výše. Takto bylo získáno 841 mg peptidů čistých podle HPLC, jejichž identita byla ověřena hmotovou spektrometrií, jak udává Tabulka 1.

Tabulka 1. Sekvence halictinů (I) a (II) jejich syntetických analogů (I-A) a (II-A) peptid sekvence monoisotopická molekulární hmotnost (Da) vypočtená nalezená

H-Gly-Met-Trp-Ser-Ly s-Ile-Leu-Gly-His-Leu-He-Arg-NHi 1408,81 1408,9 (II) H-Gly-Lys-Trp-Met-Ser-Leu-Leu-Lys-His-Ile-Leu-Lys-NH₂ 1451,88 1451,8 (I-A/l) H-Gly-Met-Trp-Lys-Lys’lle-Leu-Gly-His-Leu-Ile-Arg-NH2 (I-A/2) H-Gly-Met-Trp-Ser-Lys-Ile-Leu-Gly-His-Leu-Lys-Arg-NHi (I-A/3) H-Gly-Met-Trp-Ser-Lys-Ile-Leu-Gly-His-Leu-Ile-Lys-NH₂ (Π- A/l) H-Gly-Lys-Trp-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-His-Ile-Leu-Lys-NH2

1449,88 1449,8

1423,82 1423,6

1380,81 1380,6

1448.93 1449,0 (zaměněné aminokyseliny jsou vytištěny tučně)

Příklad 3

Stanovení antimikrobiální aktivity

Antimikrobiální aktivita byla stanovena jako tzv. minimální inhibiční koncentrace (MIC) pozorováním růstu bakterií v přítomnosti různých koncentrací peptidů (Tabulka 2). Bakterie v exponenciální fázi růstu byly přidány k roztoku testovaného antimikrobiálního peptidů o různé koncentraci (0,5 až 100 pmolT¹) v LB médiu (obsahuje v 11 deštil, vody 10 g tryptonu, 5 g kvasinkového extraktu a 10 g NaCl) v inkubačních destičkách a inkubovány při 37 °C po 20 h za stálého třepání v přístroji Bioscreen C. Absorbance byla měřena při 540 nm každých 15 min. V experimentech bylo použito 1 x 10⁴ - 7,5 x 10⁴ CFU bakterií (CFU =

- 6 colony forming unit, tzn. jednotka vytvářející kolonie). Jako standard by] použit tetracyklin v koncentraci 1^j 50 μιηοΙ.Γ¹.

Tabulka 2. Antimikrobiální a hemolytické aktivity halictinů (I) a (II) a jejich analogů peptid antimikrobiální aktivita hemolytická aktivita

MIC [pmol.r¹] LCso

	B.s.	S.a.	E.c.	P.a.
(I)	0,7	7,4	3,8	45	80
(Π)	0,8	7,5	2,2	33	80
(I-A/l)	1,1	6,0	1,8	12,5	93
(I-A/2)	2,2	100	28	90	>200
(I-A/3)	0,75	12,5	6.0	50	111
(II-A/1)	1,5	25	3	12,5	95

B.s,. Bacillus subtilis; S.a., Staphylococcus aureus; Ec., Escherichia coli; P.a., Pseudomonnas aeruginosa

Příklad 4

Stanovení hemolytické aktivity

Peptidy v koncentraci M00 (200) pmolT¹ byly inkubovány s potkaními červenými krvinkami (5%) v 0,2 ml fysiologického roztoku po dobu 1 h při 37°C. Poté byly vzorky centrifugovány při 250 g po dobu 5 min. Absorbance supematantu byla stanovena při 540 nm. Jako kontrola pro 100% hemolýzu byl místo peptidu použit 0,2% roztok TRITONU X100. Výsledky testování jsou uvedeny v Tabulce 2.

Literatura

1. Zasloff Μ. (2002) Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature 415, 389-395

2. Hancock R.E.W., Sahl H.-G. Antimicrobial and host-defense peptides as new antiinfective therapeutic strategies. Nátur. Bitech. 24,1551-1557 (2006)

3. Toke 0. Antimicrobial peptides: New candidates in the fight against bacterial infection. Biopolymers (Peptide Science) 80,717-735 (2005).

4. Otvos L. Jr. Antimicrobial peptides isolated from insects. J. Peptide Sci. 6, 497-511 (2000)

5. Oren Z, Shai Y. Mode of action of linear amphipathic α-helical antimicrobial peptides. Biopolymers 47,451-463 (1998)

6. Yeaman M.R., Yount N.Y. Mechanisms of antimicrobial peptide action and resistance Pharm. Rev. 55,27-55 (2003)

7. Kuhn-Nentwig L. Antimicrobial and cytolytic peptides of venomous arthropods. Ceil. Mol. Life Sci. 60,2651-2668 (2003)

8. Čeřovský V., Slaninová J., Fučík V, HulaČová H, Borovičková L., Ježek R and Bednářová L. New potent antimicrobial peptides from the venom of Polistinae wasps and their analogs. Peptides (2008) 29,992-1003.

9. Čeřovský V., Hovorka O., Cvačka J., Voburka Z., Bednářová L., Borovičková L., Slaninová J., and Fučík V. Melectin: a novel antimicrobial peptide from the venom of the cleptoparasitic bee Melecta albifrons. ChemBioChem 9,2815-2821 (2008).

10. Schiffer M. and Edmundson A. B. Use of helical wheels to represent the structures of proteins and to identify segments with helical potential. Biophys. J. 7,121-135 (1967).

ll. Tossi A., Sandri L., Giangaspero A. Amphipathic, α-helical antimicrobial peptides. Biopolymers (Peptide Science) 55,4-30 (2000)

12. Pathak N., Salas-Auvert R., Ruche G., Janna M.-H., McCarthy D., Harrison R.G. Comparison of the effect of hydrophobicity, amphiphilicity, and a-helicity on the activities of antimicrobial peptides. Proteins: Struct. Funct. Genet. 22; 182-86 (1995)

13. Conlon J. M., Al-Ghaferi N., Abraham B. and Leprince J. Strategies for transformation of naturally-occurring amphibian antimicrobial peptides into therapeutically valuable antiinfective agents. Methods 42, 349-357 (2007).

Claims

Patentové nároky

1. Antimikrobiální peptidy mající následující vzorce:

H-Gly-Met-Trp-Ser-Lys-Ile-Leu-Gly-His-Leu-Ile-Arg-N^

H-Gly-Lys-Trp-Met-Ser-Leu-Leu-Lys-His-Ile-Leu-Lys-NH₂

H-Gly'Met-Trp-Lys-Lys-Ile-Leu-Gly-His-Leu-Ile-Arg-NH2

H-Gly-Met-Trp-Ser-Lys-Ile-Leu-Gly-His-Leu-Lys-Arg-NH₂

H-Gly-Met-Trp-Ser-Lys-Ile-Leu-Gly-His-Leu-Ile-Lys-NH₂

H-Gly-Lys-Trp-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-His-Ile-LeU'Lys-NH₂ (I) (Π) (I-A/l) (I-A/2) (I-A/3) (II-A/1)
2. Použití antimikrobiálních peptidů podle nároku l pro výrobu léčiva pro léčení mikrobiálních, parazitických, plísňových onemocnění a pro léčení rakovin.