CZ2012476A3 - Lipidované peptidy jako antiobezitika - Google Patents

Lipidované peptidy jako antiobezitika Download PDF

Info

Publication number
CZ2012476A3
CZ2012476A3 CZ2012-476A CZ2012476A CZ2012476A3 CZ 2012476 A3 CZ2012476 A3 CZ 2012476A3 CZ 2012476 A CZ2012476 A CZ 2012476A CZ 2012476 A3 CZ2012476 A3 CZ 2012476A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
dpr
lipidated
myr
amino acid
palm
Prior art date
Application number
CZ2012-476A
Other languages
English (en)
Inventor
Lenka Maletínská
Blanka Železná
Miroslava Blechová
Andrea Špolcová
Original Assignee
Ústav organické chemie a biochemie Akademie věd ČR, v. v. i.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ústav organické chemie a biochemie Akademie věd ČR, v. v. i. filed Critical Ústav organické chemie a biochemie Akademie věd ČR, v. v. i.
Priority to CZ2012-476A priority Critical patent/CZ2012476A3/cs
Priority to PCT/IB2013/001837 priority patent/WO2014009808A2/en
Priority to AU2013288383A priority patent/AU2013288383B2/en
Priority to EP13767072.5A priority patent/EP2872124B1/en
Priority to US14/414,034 priority patent/US9937235B2/en
Priority to CA2877594A priority patent/CA2877594C/en
Publication of CZ2012476A3 publication Critical patent/CZ2012476A3/cs
Priority to IL236264A priority patent/IL236264A/en
Priority to US15/094,390 priority patent/US20160331812A1/en

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/2257—Prolactin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/543—Lipids, e.g. triglycerides; Polyamines, e.g. spermine or spermidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Lipidované peptidy, analogy obou forem peptidu uvolňujícího prolaktinu, PrRP31 a PrRP20, představují anorexigenní látky snižující příjem potravy, které po periferním podání působí v mozku. Analogy PrRP31 a PrRP20 lipidované na N-konci myristovou nebo palmitovou kyselinou se vážou s vysokou afinitou k potkaní hypofyzární buněčné linii RC-4B/C s endogenním receptorem GPR10. Tyto lipidované peptidy po periferním podání rovněž výrazně snižují příjem potravy u hladových myší v závislosti na dávce a mají ve srovnatelných dávkách podobné účinky jako centrálně podaný přirozený PrRP31, avšak mnohem výraznější a déle trvající.

Description

Lipidované peptidy jako antiobezitika
Oblast techniky
Nové analogy peptidu uvolňujícího prolaktin představují anorexigenní látky, které po periferním podání snižují příjem potravy. Popsána je syntéza těchto lipidovaných peptidů a jejich farmakologické účinky in vitro a in vivo.
Dosavadní stav techniky
Obezita představuje stále rostoucí problém rozvíjejících se i vyspělých zemí, pro který zatím neexistují účinné terapie. Jediným lékem dostupným v ČR je Orlistat, inhibitor střevní lipázy, který snižuje vstřebávání tuků z tenkého střeva. Má však vedlejší účinky, jako např. průjmy. Z trhu byl stažen Sibutramin, inhibitor zpětného vychytávání serotoninu a noradrenalinu, který navozuje pocit sytosti, při jehož užívání bylo zjištěno zvýšené riziko výskytu srdečních chorob (Strader and Woods, 2005; Heal et al., 2012). V posledním desetiletí 20. století pak byla objevena řada látek, které zásadně ovlivňují regulaci energetického metabolismu, a mezi nimi i neuropeptid PrRP (prolactin-releasing peptide, peptid uvolňující prolaktin) (Hinuma et al., 1998).
V organismu se vyskytují dvě formy PrRP, jedna obsahuje 31 aminokyselin (PrRP/1-31/; PrRP31) a druhá 20 aminokyselin (PrRP/12-31/; PrRP20) (Hinuma et al., 1998). C-koncový dvacetipeptid je identický, přičemž C-koncový dipeptid RF-amid, tvořený argininem a amidovaným fenylalaninem, je zcela nezbytný pro zachování biologické aktivity (Fukusumi et al., 2006).
PrRP má v organismu více úloh. Prvním popsaným biologickým účinkem PrRP byla stimulace uvolňování prolaktinu (Hinuma et al., 1998). Následně však bylo zjištěno, že u potkaních samců není tento účinek ovlivněn, a tudíž pravděpodobně není primární úlohou PrRP (Jarry et al., 2000). Díky objevu PrRP v hypotalamických jádrech PVN a DMN (paraventrikulámím a dorsomediálním jádru), která jsou důležitá pro udržování energetické rovnováhy, se o PrRP začalo uvažovat jako o faktoru ovlivňujícím příjem potravy (Lawrence • «η · · · · ♦ ♦ * · * • «. «> « · · »««« * · * * · ν .»·«’« · * ·
2- > fc fr 4» • · · · · * · ♦· · ······· et al., 2000). Výskyt PrRP a jeho receptoru v dalších oblastech mozku pak naznačují, že PrRP působí i při regulaci odpovědi na stres a na bolestivé podněty (Onaka et al., 2010).
Anorexigenní efekt PrRP31 se projevil po jeho injektování do třetí mozkové komory, jejíž přední stěna a dno jsou tvořeny hypotalamem (tzv. intracerebroventrikulámí podání, ICV). U potkanů došlo k významnému krátkodobému snížení příjmu potravy, které dále způsobilo snížení hmotnosti (Lawrence et al., 2000; Lawrence et al., 2004). Toto snížení příjmu potravy neovlivnilo příjem vody ani chování pokusných zvířat. Nebyla prokázána nevolnost ani nechutenství (Lawrence et al., 2002).
Působení PrRP jako anorexigenní látky bylo prokázáno i při dalších experimentech. Bylo zjištěno, že při negativní energetické bilanci, ke které dochází např. při kojení či při hladovění, dochází ke snížení transkripce genu pro PrRP. To je typické i pro další anorexigenní neuropeptidy, jako je např. peptid CART (cocaine- and amphetamine-regulated transcript) či POMC (proopiomelanocortin) (Lawrence et al., 2000; Ellacott et al., 2002). K redukci hmotnosti po ICV injikaci PrRP však nedochází pouze snížením příjmu potravy, ale projeví se i zvýšení tělesné teploty a spotřeby kyslíku, což jsou nepřímé důkazy zvýšeného energetického výdeje. Vyšší je rovněž produkce mRNA pro tzv. uncoupling protein 1 (UCP1) v hnědé tukové tkáni, což taktéž svědčí pro zvýšený energetický výdej (Ellacott et al., 2003).
Ke zjišťování funkcí PrRP v organismu byla využívána i geneticky modifikovaná zvířata (tzv. knock-out, KO zvířata s vyloučeným genem kódujícím PrRP či jeho receptor GPR10) (Bjursell et al., 2007; Takayanagi et al., 2008). Myši s vyloučeným genem pro PrRP trpí hyperfagií, kdy není ovlivněna frekvence příjmu jednotlivých dávek potravy, ale dochází ke zvětšení každé jednotlivé dávky jídla. U těchto jedinců nedochází ke snížení energetického výdeje, neboť jejich tělesná teplota i spotřeba kyslíku jsou srovnatelné s kontrolními jedinci (Takayanagi et al., 2008; Mochiduki et aL, 2010).
Myši s vyloučeným genem pro receptor GPR10 rovněž vykázaly vyšší příjem potravy vedoucí k obezitě, významnější pak u samic (Gu et al., 2004; Bjursell et al., 2007). Zároveň bylo zjištěno, že uGPRIO KO zvířat nebyl příjem potravy snížen ani po podání cholecystokininu (CCK). Tento nález potvrzuje hypotézu, že systém GPR10-PrRP může mít
*. ® » * · ·····*· · * « · · 4 klíčovou úlohu v přenosu signálu CCK, periferního peptidů, který navozuje pocit sytosti při příjmu potravy (Bechtold and Luckman, 2006).
Pokud se týká strukturních požadavků, pro správnou funkci PrRP je nezbytně nutná přítomnost argininu v pozici 30. Při jeho modifikaci či záměně za jinou aminokyselinu dochází k úplné ztrátě vazby k receptorů i biologické aktivity. Pro vazbu PrRP k receptorů GPR10 je dále důležitá pozice 31, vyžadující přítomnost fenylalaninu či jiné aminokyseliny s aromatickou skupinou navázanou k minimálně jedné skupině CH2 postranního řetězce aminokyseliny (Boyle et al., 2005).
Pro vazebné experimenty s analogy PrRP je využíván PrRP se 125I na tyrosinu v pozici 20 (Satoh et al., 2000). Bylo potvrzeno, že monojodace tyrosinu neovlivní vazbu PrRP k receptorů (Maixnerová et al., 2011). V nedávné studii (Maletínská et al., 2011) byly využity modifikace přirozeného peptidů PrRP20, jehož biologická aktivita in vitro je srovnatelná sPrRP31 (Langmead et al., 2000; Maixnerová et al., 2011a). C-koncový fenylalanin byl nahrazen nekódovými aminokyselinami, deriváty fenylalaninu PheCl2, PheF5 a PheNO2, nebo nekódovými aminokyselinami s objemným naftylalaninem 1-Nal a 2-Nal, nebo tyrosinem. Všechny analogy měly zachován C-koncový amid, který je nezbytný pro biologickou aktivitu (Hinuma et al., 1998; Roland et al., 1999) a navíc byly acetylovány na N-konci peptidového řetězce, aby byla zvýšena jejich stabilita, zvláště při experimentech in vivo. Biologická aktivita není závislá na obměně aminokyselin v polohách před C-koncovým heptapeptidem.
K hypofyzámí buněčné linii RC-4B/C, u které se přirozeně vyskytuje receptor GPR10 v řádu desetitisíců vazebných míst na buňku (Maixnerová et al., 2011), se [Tyr31]PrRP20, [1Nal3l]PrRP20, [PheF531]PrRP20, [PheCl231]PrRP20 a [PheNO23,]PrRP20 vázaly s Kit řádově srovnatelnou s hodnotami pro PrRP31 a PrRP20 (Maletínská et al., 2011). Kromě toho všechny zmíněné analogy PrRP zvyšovaly v buňkách RC-4B/C fosforylaci enzymů MAPK/ERK1/2 (mitogen activated phosphorylase/extracellular-regulated kinase) i proteinu CREB (cAMP response element-binding protein) a stimulovaly uvolňování prolaktinu do média s podobnou hodnotou EC50 jako PrRP20 (Hinuma et al., 1998). Jmenované analogy PrRP po ICV podání v dávce 10 nmol způsobily statisticky významné snížení příjmu potravy u hladových myší (Maletínská et al., 2011). Tyto analogy tedy přestavují velmi účinné
anorexigenní peptidy, příjem potravy však snižují pouze po centrálním, nikoliv po periferním podání.
Nyní bylo zjištěno, že navázání mastné kyseliny na N-konec zvyšuje řádově funkčnost jak PrRP20 a PrRP 31, tak zejména analogů obou těchto forem. Účinek byl pozorován jak při pokusech in vitro, tak in vivo. Statisticky velmi významného snížení příjmu potravy u hladových myší po podání lipidovaných peptidů PrRP 20 i 31 a zvláště pak jejich analogů bylo zcela nově dosaženo i po periferním (subkutánním, SC) podání.
Podstata vynálezu
Byly připraveny neuropeptidy PrRP31 i PrRP20 a jejich analogy s obměněným aminokyselinovým složením, lipidované mastnou kyselinou (např. myristoylem či palmitoylem) na N-konci peptidu. Oba typy neuropeptidů s rozdílnou délkou řetězce se vázaly s vysokou afinitou k receptoru pro PrRP v podmínkách in vitro a vykázaly až velmi signifikantní (P < 0.001) snížení příjmu potravy u hladových myší v závislosti na dávce nejen po centrálním, ale také po periferním podání. Lipidizace neuropeptidů ovlivňujících příjem potravy, které působí v hypotalamu a mozkovém kmeni, představuje novou možnost, jak tyto peptidy dopravit přes hematoencefalickou bariéru po periferním injekčním podání. Až doposud nebyly publikovány žádné lipidované analogy neuropeptidů, které by po periferním podání snižovaly příjem potravy.
Předmětem vynálezu jsou lipidované peptidy tvořené 20 nebo 31 aminokyselinami, přičemž jejich C-konec tvoří sekvence IRPVGRF—NH2, v níž isoleucin muže být nahrazen fenylglycinem či alaninem a valin může být nahrazen fenylglycinem, koncový fenylalanin může být nahrazen aminokyselinou s postranním řetězcem obsahujícím CH2-Ar nebo CH2-SCH2-Ar, kde Ar zahrnuje fenyl nebo naftyl, případně substituované halogenem či nitroskupinou, přičemž na aminoskupině N-koncové aminokyseliny, která je s výhodou vybrána ze skupiny zahrnující serin, kyselina diaminopropionová a threonin, je amidovou vazbou navázána C6 až Cl8 mastná kyselina, případně je N-koncovou aminokyselinou samotná kyselina diaminopropionová.
Význakem vynálezu je, že zmíněné lipidované peptidy jsou vybrány ze skupiny zahrnující:
o « « * · · · · · * · · • » * » * · * w * , #· » » · ♦ * 5« «ί * * ··«··»· ·« · ·······
X-TPDINPAWYmoRprRPsGRt-NH2, a
X-SRmHnHSqETRTPDINPAWYmoRprRPsGRt-NH2, kde m je T, A nebo methylalanin, o je G nebo S, n je Q nebo R, p je G, A, P nebo S, q je M nebo norleucin, r je I, A nebo fenylglycin, s je V nebo fenylglycin, t je F nebo aminokyselina s postranním řetězcem obsahujícím CH2-Ar nebo CH2-S-CH2-Ar, kde Ar zahrnuje fenyl nebo naftyl, případně substituované halogenem či nitroskupinou, a X je mastná kyselina C6 až Cl8 navázaná amidovou vazbou na aminoskupině N-koncové aminokyseliny, popřípadě je struktura X-S nebo X-T nahražena samotnou kyselinou diaminopropionovou.
Význakem předkládaného vynálezu je také skutečnost, že výše zmíněné lipidované peptidy jsou vybrány ze skupiny zahrnující:
X-TPDINPAWYmoRGrRPsGRt-NH2, a
X-SRmHnHSMETRTPDINPAWYmoRGrRPsGRt-NH2, kde m je T nebo A a o je G nebo S, n je Q nebo R, r je I, A nebo fenylglycin, s je V nebo fenylglycin, t je F nebo aminokyselina s postranním řetězcem obsahujícím CH2-Ar nebo CH2S-CH2-Ar, kde Ar zahrnuje fenyl nebo naftyl, případně substituované halogenem či nitroskupinou, a X je mastná kyselina 6 až Cl8 navázaná amidovou vazbou na aminoskupině N-koncové aminokyseliny, popřípadě je struktura X-S nebo X-T nahražena samotnou kyselinou diaminopropionovou.
Dalším význakem předkládaného vynálezu je to, že výše zmíněné lipidované peptidy nesou C-koncovou aminokyselinu, zvolenou ze skupiny, zahrnující naftylalanin, benzylcystein, benzylhistidin, pentafluorofenylalanin, nitrofenylalanin.
Význakem předkládaného vynálezu je také skutečnost, že mastná kyselina je zvolena ze skupiny, zahrnující mastné kyseliny o 6 až 18, s výhodou 13 až 18 uhlíkových atomech.
Předmětem vynálezu jsou dále peptidy zvolené ze skupiny, zahrnující:
(Dpr(oct))RmHnHSN/eETRTPDINPAWYmoRGrRPsGRF-NH2 (Dpr(dodec))RmHnHSA7eETRTPDINPAWYmoRGrRPsGRF-NH2 (Dpr(tridec))RmHnHSMeETRTPDINPAWYmoRGrRPsGRF-NH2 (Dpr(myr))RmHnHSMeETRTPDINPAWYmoRGrRPsGRF-NH2 (Dpr(palm))RmHnHSMeETRTPDINPAWYmoRGrRPsGRF-NH2 • » · · · * ♦ * * « e * · * · - * 6» * * * ·····*· · · · »····· (myr)TPDINPAWYmoRGrRPsGRF-NH2 (palm)TPDINPAWYmoRGrRPsGRF-NH2 (Dpr(oct))RmHnHSA7eETRTPDINPAWYmoRGrRPsGR 7-AW-NH2 (Dpr(dodec))RmHnHSA/eETRTPDINPAWYmoRGrRPsGR 7-A«/-NH2 (Dpr(tridec))RmHnHSA/eETRTPDINPAWYmoRGrRPsGR 7-AW-NH2 (Dpr(myr))RmHnHSA/eETRTPDWAWYmoRGrRPsGR7-AG/-NH2 (Dpr(palm))RmHnHSA/eETRTPDINPAWYmoRGrRPsGR 7-AW-NH2 (myr)TPDINPAWYmoRGrRPsGR 7-W-NH2 (palm)TPDINPAWYmoRGrRPsGR 7-AG/-NH2 kde kde m je T nebo A a oje G nebo S, n je Q nebo R, r je I, A nebo fenylglycin, s je V nebo fenylglycin, Dpr je kyselina diaminopropionová, 1-Nal je 1-naftylalanin, Nle je norleucin, myr je myristoyl, palm je palmitoyl, oct je oktanoyl, dodec je dodekanoyl, tridec je tridekanoyl; přičemž v polohách 1 až 24 peptidů mohou být dále provedeny takové záměny aminokyselin, které nezvýší hodnotu vazebné afinity vzniklého lipidovaného peptidu kreceptoru GPR10 nad Kj 10'6 moLf1 a jeho anorektická aktivita, hodnocená pomocí testu příjmu potravy u hladových myší, po periferním i centrálním podání je stejná jako po podání PrRP, nebo vyšší.
Předmětem vynálezu jsou rovněž peptidy zvolené ze skupiny, zahrnující: (Dpr(oct))RmHnHSMeETRTPDINPAWYmoRGIRPVGRF-NH2 (Dpr(dodec))RmHnHSMeETRTPDINPAWYmoRGIRPVGRF-NH2 (Dpr(tridec))RmHnHSMeETRTPDINPAWYmoRGIRPVGRF-NH2 (Dpr(myr))RmHnHSA7eETRTPDINPAWYmoRGIRPVGRF-NH2 (Dpr(palm))RmHnHSA/eETRTPDINPAWYmoRGIRPVGRF-NH2 (myr)TPDINP A WYmoRGIRP V GRF-NH2 (palm)TPDINPAWYmoRGIRPVGRF-NH2 (Dpr(oct))RmHnHSA7eETRTPDINPAWYmoRGIRPVGR 7-AW-NH2 (Dpr(dodcc))RmHnHSA/eETRTPDINPAWYmoRGIRPVGR 7-M//-NH2 (Dpr(tridec))RmHnHSMeETRTPDINPAWYmoRGIRPVGR7-A«/-NH2 (Dpr(myr))RmHnHSA/eETRTPDINPAWYmoRGIRPVGR7-W-NH2 (Dpr(palm))RmHnHSA/eETRTPDINPAWYmoRGIRPVGR 7-7Va/-NH2 (myr)TPDINPAWYmoRGIRPVGR 7-AW-NH2 (palm)TPDINPAWYmoRGIRPVGR 7-AW-NH2 • · * · · ♦ · · ·t · · ♦ , , β » * * * *· * ® · * * f » * · “'·*
7» · Λ í ® ······· · · · ·*····· kde kde m je T nebo A a oje G nebo S, n je Q nebo R, Dpr je kyselina diaminopropionová, 1Nal je 1-naftylalanin, Nle je norleucin, myr je myristoyl, palm je palmitoyl, oct je oktanoyl, dodec je dodekanoyl, tridec je tridekanoyl; přičemž v polohách 1 až 24 peptidů mohou být dále provedeny takové záměny aminokyselin, které nezvýší hodnotu vazebné afinity vzniklého lipidovaného peptidů kreceptoru GPR10 nad K, 10 6 mold a jeho anorektická aktivita, hodnocená pomocí testu příjmu potravy u hladových myší, po periferním i centrálním podání je stejná jako po podání PrRP, nebo vyšší.
Předmětem vynálezu je i použití výše zmíněných lipidovaných peptidů jako anorexigenních látek, snižujících příjem potravy po periferním podání.
Předmětem vynálezu je konečně i použití uváděných lipidovaných peptidů k výrobě léčiva pro léčení obezity.
Na základě struktumě-aktivitních studií byly navrženy analogy potkaního (identický s myším) a lidského PrRP31 a PrRP20, lipidované na N-koncové aminoskupině nebo postranní skupině N-koncové aminokyseliny pomocí mastné kyseliny, obsahující výhodně C14 až Cl 8. Methionin v poloze 8 byl vPrRP31 byl nahražen stabilnějším norleucinem. Rovněž bylo zjištěno, že pro zachování anorektické aktivity u myší po centrálním podání nestačí kratší peptid obsahující klíčovou koncovou sekvenci, jako tridekapeptid PrRP13 (obsahující aminokyseliny 18 až 31 zPrRP31) a je nutné použít analogy přirozených PrRP31 nebo PrRP20.
Aminokyseliny ležící v polohách před C-koncovým heptapeptidem nejsou pro popsanou biologickou aktivitu lipidovaných peptidů zásadní. Jejich záměna za jinou aminokyselinu je možná za předpokladu, že výsledný lipidovaný peptid bude mít vazebnou afinitu k receptoru pro PrRP s K, řádově 10’6 mol.!-1 a méně (výhodněji 1(Γ8 mokl'1 a méně), bude vykazovat agonistickou aktivitu vzhledem kPrRP (určovanou pomocí signalizace MAPK/ERK1/2 v buňkách RC-4B/C) a anorektickou aktivitu, stanovenou pomocí testu příjmu potravy u hladových myší po jeho centrálním i periferním podání, stejnou jako PrRP, nebo vyšší.
Získané výsledky lze shrnout následovně:
• · · · » · · · · · ·· * « · * - * * · « * e · *· » Λ » ·' > * · ·
8- » $» ·»···<·· · · · *··**··
- Lipidizace peptidů, které jsou analogy PrRP31 a PrRP20 na N-konci umožňuje centrální účinek neuropeptidu, endogenně specificky exprimovaného v hypotalamu, po subkutánním, tedy periferním podání.
- Lipidizace všech těchto peptidů vedla ke zlepšení vazby k receptorů - snížení K, při vazbě na buňky RC-4B/C v závislosti na délce řetězce mastné kyseliny. Navázání mastné kyseliny tedy nejenom zachovalo vazbu k receptorů (v důsledku lipidace na N-konci peptidu, zatímco pro vazbu na receptor je důležitý zejména C-koncový RF-amid), ale dokonce došlo až k jejímu řádovému zlepšení.
- Příslušné lipidované peptidy jako analogy lidského i potkaního PrRP se vázaly se stejnou afinitou k potkanímu receptorů na buňkách RC-4B/C a to bez ohledu na to, zda vytěsňovaly vazbu potkaního či lidského l25I-PrRP31.
- Všechny testované peptidy byly agonisté PrRP (což bylo stanoveno signalizací MAPK/ERK1/2, mitogenem aktivované proteinkinázy/extracelulámím signálem regulované proteinkinázy 1/2 v buňkách RC-4B/C).
- Lipidované peptidy jako analogy PrRP v žádném z provedených testů po SC podání myším nevyvolaly sekreci prolaktinu.
- V testu příjmu potravy po SC podání myším peptidy lipidované kyselinou myristovou nebo palmitovou, částečně i kyselinou tridekanovou, významně snižovaly příjem potravy v závislosti na dávce. Jde o vůbec první popis modifikovaného neuropeptidu, který snižuje příjem potravy po periferním podání. Látky byly po periferním podání účinnější než po podání centrálním do 3. mozkové komory.
- Účinek na příjem potravy byl dlouhodobý, v závislosti na dávce přetrvával více než 10 hodin po podání. Je to patrně v důsledku jak zvýšené odolnosti proti degradaci proteázami (vnesení mastné kyseliny a nekódových aminokyselin), tak vazby lipopeptidu na sérový albumin.
Nejúčinnějšími z testovaných analogů PrRP31 byly potkaní myristované analogy č. 5 (Dpr(myr)) RAHQHS Nle ETRTPDINPAWYTGRGIRPVGRF-NH2, a č. 9 (Dpr(myr)) RAHQHS Nle ETRTPDINPAWYTGRGIRPVGR /-AW-NH2, a palmitovaný analog:
č. 10 (Dpr(palm)) RAHQHS Nle ETRTPDINPAWYTGRGIRPVGRF-NH2.
Nejúčinnějším z testovaných analogůPrRP20 byl myristovaný analog
č. 10 (myr)TPDINPAWYTGRGIRPVGRF-NH2.
* « » · » · · * · · » · » '· · « ·»“<* · ‘· *
Λ ve* y «···«·· · · · ···*···
Popis obrázků na výkresech
Obrázek 1 znázorňuje závislost příjmu potravy na čase po ICV podání PrRP31 hladovým myším C57BL/6 v dávce 4 a 10 nmol/myš. Na ose x je vynesen čas v minutách, na ose y kumulativní příjem potravy v procentech potravy přijaté kontrolní skupinou injikovanou fyziologickým roztokem (n = 6-7). Signifikance je **P < 0,01, ***P < 0,001 vs fyz. roztok v čase 45 a 75 min po injekci (one-way ANOVA následovaná Dunnettovým post-hoc testem). - fyz. roztok, o - PrRP31 (4 nmol), · - PrRP31 (10 nmol).
Obrázek 2 znázorňuje závislost příjmu potravy na čase po ICV podání analogů PrRP31 s různě dlouhým lipidovým řetězcem hladovým myším C57BL/6 v dávce 4 nmol/myš. Na ose x je vynesen čas v minutách, na ose y kumulativní příjem potravy v procentech potravy přijaté kontrolní skupinou injikovanou fyziologickým roztokem (n =6-7). Signifikance je *P < 0,05, ***P < 0,001 vs fyz. roztok po celou dobu testu (one-way ANOVA následovaná Dunnettovým post-hoc testem). - fyz. roztok, · - PrRP31, Δ - analog 1, - analog 2, A analog 5.
Obrázek 3 znázorňuje závislost příjmu potravy na čase po SC podání analogů PrRP31 s různě dlouhým lipidovým řetězcem hladovým myším C57BL/6 v dávce 5 mg/kg. Na ose x je vynesen čas v minutách, na ose y kumulativní příjem potravy v procentech potravy přijaté kontrolní skupinou injikovanou fyziologickým roztokem (n = 6). Signifikance je *P < 0,05, ***p < 0,001 vs fyz. roztok (one-way ANOVA následovaná Dunnettovým post-hoc testem). — fyz. roztok, Δ - analog 1, - analog 2, - analog 3, A - analog 4, A - analog 5, A analog 6.
Obrázek 4 znázorňuje závislost příjmu potravy na čase po SC podání lidských a potkaních lipidovaných analogů PrRP31 a PrRP20 hladovým myším C57BL/6 v dávce 5 mg/kg. Na ose x je vynesen čas v minutách, na ose y kumulativní příjem potravy v procentech potravy přijaté kontrolní skupinou injikovanou fyziologickým roztokem (n = 6). Signifikance je ***P<0,001 vs fyz. roztok (one-way ANOVA následovaná Dunnettovým post-hoc testem), vs fyz. roztok po celou dobu testu (one-way ANOVA následovaná Dunnettovým post-hoc testem).
- fyz. roztok, - analog 5, A - analog 10, - analog 12, ♦ - analog 13.
» »> * * · fe · · * * * » ' « - * ·. * · * · · ’ * ····**· · · · * · * · · ··
Obrázek 5 znázorňuje závislost příjmu potravy na čase po SC podání myristoylovaného analogu [Dpr']PrRP31 (č.5) hladovým myším C57BL/6 v dávce 1, 2, 5 a 10 mg/kg. Na ose x je vynesen čas v minutách, na ose y kumulativní příjem potravy v procentech potravy přijaté kontrolní skupinou injikovanou fyziologickým roztokem (n = 6). Signifikance je ***P < 0,001 vs fyz. roztok po celou dobu testu (one-way ANOVA následovaná Dunnettovým posthoc testem). - fyz. roztok, Δ - analog 5: 1 mg/kg, - analog 5: 2 mg/kg, A - analog 5: 5 mg/kg, A - analog 5:10 mg/kg.
Obrázek 6 znázorňuje závislost příjmu potravy na čase po SC podání myristoylovaného analogu [Dpr',Nal3']PrRP31 (č. 9) hladovým myším C57BL/6 v dávce 1, 2, 5 a 10 mg/kg. Na ose x je vynesen čas v minutách, na ose y kumulativní příjem potravy v procentech potravy přijaté kontrolní skupinou injikovanou fyziologickým roztokem (n = 6). Signifikance je **P<0,01, ***P<0,001 vs fyz. roztok (one-way ANOVA následovaná Dunnettovým post-hoc testem). - fyz. roztok, o - analog 9: 1 mg/kg, - analog 9: 2 mg/kg, · - analog 9: 5 mg/kg, • - analog 9: 10 mg/kg.
Příklady provedení vynálezu
Použité zkratky
ANOVA analýza rozptylu
BSA hovězí sérový albumin
BPTI hovězí pankreatický inhibitor trypsinu
EGF epidermální růstový faktor
HEPES kyselina (4-(2-hydroxyethyl)-l-piperazinethansulfonová
PBS fosfátem pufrovaný fyziologický roztok
SDS dodecylsulfát sodný
TBS Trisem pufrovaný fyziologický roztok obsahující Tween-20
Metody použité v testech s analogy PrRP
Peptidy byly syntetizovány metodou syntézy na pevné fázi na dle postupu Maixnerové a kol. (Maixnerová et al., 2007) s využitím Fmoc strategie na syntetizátoru ABI 433A (Applied
Biosystems, Foster City, CA, USA). Lipidizace příslušnou mastnou kyselinou byla provedena před odštěpením peptidů z pryskyřice popsaným postupem (Maletínská et al., 2012).
Peptid PrRP31 byl jodován pomocí Na125! činidlem lodo-Gen (Pierce, Rockford, IL, USA) dle popsaného postupu (Maixnerová et al., 2011). Monojodovaný peptid byl uchován v alikvotech při -20 °C a byl spotřebován při vazebných studiích v průběhu jednoho měsíce.
Příklad 1: Kompetitivní vazebné experimenty
Kompetitivní vazebné experimenty byly prováděny podle principů Motulského a Neubiga (Motulsky and Neubig, 2002). Pro vazebné pokusy se hypofyzámí potkaní buněčná linie RC4B/C (ATCC, Manassas, USA) pěstovala na 24-jamkových destičkách, jejichž dno bylo potaženo polyetyleniminem. Buňky byly pěstovány do optimálního počtu 300-450 tisíc buněk/jamku. Pro experiment byl použit vazebný pufr (20 mmol.r1 HEPES o pH 7,4; 118 mmol.r1 NaCl, 4,7 mmol.r1 KC1, 5 mmol.r1 MgCl2, 5,5 mmol.r1 glukosa, 1 mg/ml BSA, 0,1 mg/ml BPTI), neznačené analogy PrRP s finální koncentrací v rozmezí 10’11 až 10'4 mol.I’1 a 125I-PrRP31 s finální koncentraci 10’10 mokl'1 (Maixnerová et ak, 2011). Destička pak byla inkubována 60 min při laboratorní teplotě. Po inkubaci byly buňky solubilizovány v 0,1 mol/1 roztoku NaOH a radioaktivita navázaná na buňkách byla změřena v γ-čítači. Pokusy byly vždy prováděny v duplikátech a nejméně třikrát opakovány.
Všechny testované potkaní analogy PrRP (struktura viz tabulka 1), tedy lipidované peptidy, se vázaly s vysokou afinitou k receptoru v buňkách RC-4B/C (řádově vnmol.l'1 oblasti). S prodlužujícím se řetězcem navázané mastné kyseliny se hodnoty Kj snižovala, tedy vazba zvyšovala, a to až o 1 řád proti původnímu peptidů (viz tabulka 2).
Lidské lipidované analogy PrRP (struktura viz tabulka 1) vytěsňovaly srovnatelně jak vazbu !25I-PrRP potkaního, tak lidského, k buňkám RC-4B/C s potkaním receptorem pro PrRP, a to v nmol.r1 oblasti (viz tabulka 3).
Tab. 1 Struktura lipidovaných analogů PrRP31 a PrRP20 a/ Lipidované analogy PrRP31 - potkaní
PrRP31 SRAHQHSMETRTPDINPAWYTGRGIRPVGRF-NH2 (Dpr) RAHQHS Nle ETRTPDINPAWYTGRGIRPVGRF-NH2 (Dpr(oct)) RAHQHS Nle ETRTPDINPAWYTGRGIRPVGRF-NH2 (Dpr(dodec)) RAHQHS Nle ETRTPDINPAWYTGRGIRPVGRF-NH2 (Dpr(tridec)) RAHQHS Nle ETRTPDINPAWYTGRGIRPVGRF-NH2 (Dpr(myr)) RAHQHS Nle ETRTPDINPAWYTGRGIRPVGRF-NH2 (Dpr(palm)) RAHQHS Nle ETRTPDINPAWYTGRGIRPVGRF-NH2 (Dpr) RAHQHS Nle ETRTPDINPAWYTGRGIRPVGR 1 -Nal-NH2 (Dpr(oct)) RAHQHS Nle ETRTPDINPAWYTGRGIRPVGR 1 -Nal-NH2 (Dpr(myr)) RAHQHS Nle ETRTPDINPAWYTGRGIRPVGR 1-Nal-NH2 b/ Lipidované analogy PrRP20 - potkaní
PrRP20 TPDINPAWYTGRGIRPVGRF-NH2 (myr)TPDINPAWYTGRGIRPVGRF-NH2 c/ Lipidované lidské analogy PrRP31 a PrRP20 hPrRP31 SRTHRHSMETRTPDINPAWYASRGIRPVGRF-NH2 (Dpr) RTHRHS Nle ETRTPDINPAWYASRGIRPVGRF-NH2 (Dpr(myr)) RTHRHS Nle ETRTPDINPAWYASRGIRPVGRF-NH2 (myr)TPDINPAWYASRGIRPVGRF-NH2
Dpr - diaminopropionová kyselina, oct - oktanoyl, dodec - dodekanoyl, tridec — tridekanoyl, myr - myristoyl, palm - palmitoyl, Nle — norleucin, 1-Nal - naftylalanin.
Příklad 2: Buněčná signalizace.
Buňky RC-4B/C, které byly využity k prokázání, zda lipidované analogy PrRP20 spouští signalizační dráhu MAPK/ERK1/2, byly pěstovány na 6-jamkových destičkách do optimální hustoty 700-900 tisíc buněk/jamku. 17 hodin před sběrem vzorků bylo vyměněno růstové médium za médium bez séra a bez EGF (epidermal growth factor). Do každé jamky byl přidán příslušný lipidovaný analog PrRP ve finální koncentraci 10'6 molT1. Po 5 minutové inkubaci při 37 °C byla destička vložena na led a každá jamka byla třikrát propláchnuta pufrem PBS o pH 7,4 (137 mmolT1 NaCl, 2,7 mmolT1 KC1, 8 mmol.!’1 Na2HPO4.2H2O a 1,76 mmolT1 KH2PO4), který byl temperován na teplotu 4 °C. Buňky pak byly solubilizovány ve vzorkovém pufru (62,5 mmol.l1 Tris-HCl pH 6,8, 10% glycerol, 2% SDS, 0,01% bromfenolová modř, 5% merkaptoethanol, 50 mmolT1 NaF a 1 mmol.l1 Na3VO4), odebrány λ » - e ·» « · * * » . * < - · Λ « «'
1β ·*.*»»** · * · * ’ r ·· ► * · do mikrozkumavek a zamraženy při teplotě -20 °C. Vzorky byly sbírány alespoň ve třech nezávislých pokusech.
K prokazování, zda lipidované analogy PrRP20 spouští signalizační dráhu MAPK/ERK1/2, byla využita metoda Western blotu. Elektroforéza byla prováděna na 5% /12% polyakrylamidovém gelu v přítomnosti SDS (SDS-PAGE) na přístroji Mini-Protean 3 (BioRad, Herkules, CA, USA). Vzorky, které byly na gely nanášeny, byly 1 minutu dezintegrovány ultrazvukem, poté 2 minuty zahřívány při 100 °C a nakonec odstřed ovány 5 minut při 500 x g při laboratorní teplotě. Jako pozitivní kontrola byl využit PrRP20, u kterého bylo prokázáno, že spouští signalizační dráhy MAPK/ERK1/2 (Maixnerová et al., 2011). Elektroforéza probíhala za stálého napětí 100 V 10 minut a asi 60 minut při napětí 150 V.
Pro prokázání přítomnosti fosforylovaných proteinů ve vzorcích byly proteiny z SDS-PAGE gelu přeneseny na membránu Immobilon™-P PVDF (difluorid polyvinylidenu) (SigmaAldrich, USA). Přenos probíhal v blotovacím pufru o pH 8,3 (25 mmol.l·1 Tris, 192 mmol.l1 glycin a 20% methanol) po dobu 20 hodin při 4 °C za konstantního napětí 30 V.
Po přenesení proteinů na PVDF membránu byly membrány 5 minut promývány v promývacím TBS pufru (20 mmol.l1 Tris, 140 mmol.l NaCl a 0,1% Tween-20) a poté byly jednu hodinu inkubovány v blokovacím pufru (TBS s 5% odtučněným sušeným mlékem a 5 mmolT1 Na3VO4 a 50 mmolT1 NaF) při laboratorní teplotě. Následně byly membrány třikrát promyty promývacím TBS pufrem po dobu 5 minut. Dále byly membrány jednu hodinu inkubovány s primární protilátkou proti Fosfo-p44/42MAPK(Thr202/Tyr204) (Cell Signaling Technology, Beverly, USA), která byla ředěna v blokovacím pufru v poměru 1:1000. Po opětovném trojím promytí membrán promývacím TBS pufrem po dobu 5 minut byly membrány jednu hodinu inkubovány s králičí sekundární protilátkou značenou peroxidázou (Sigma, St Louis, USA), která byla ředěna v blokovacím pufru v poměru 1.12 000.
Poté byly membrány opět třikrát promyty v promývacím TBS pufru po dobu 5 minut a následně na ně byl aplikován roztok Femto (Pierce SuperSignal, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA), který způsobil chemiluminiscenci, která byla detekována pomocí CCD kamery LAS-3000 (Fuji Photo Film GmBH, Dusseldorf, Německo).
► 1* «· *< W «
Výsledky stanovení signalizace MAPK/ERK1/2 v buňkách RC-4B/C ukazuje tabulka 2.
Tab. 2
Afinita lipidovaných peptidických analogů potkaního PrRP31 a PrRP20 k potkanímu receptorů a biologická aktivita v buňkách RC-4B/C
Vytěsnění potkaního 125I-PrRP31 lipidovanými peptidy - analogy PrRP31 a PrRP20
Analog l25I-potkaní PrRP31 signalizace ERK.
Kj (nM) % vazby PrRP31
PrRP31 4.93 ± 0.61 100 agonista
1 3.74 ±0.29 132 agonista
2 2.86 ±0.17 172 agonista
3 1.12 ± 0.12 440 agonista
4 0.51 ±0.03 967 agonista
5 0.82 ±0.13 601 agonista
6 0.46 ± 0.06 1072 agonista
7 60.07 ±2.10 8 agonista
8 39.24 ±2.71 13 agonista
9 2.95 ±0.62 167 agonista
PrRP20 3.44 ±0.85 143 agonista
10 0.78 ±0.45 632 agonista
Všechny testované lipidované peptidy vykazovaly pozitivní výsledek signalizace v buňkách RC-4B/C, který byl srovnatelný nebo vyšší než účinek PrRP31. Všechny lipidované peptidy jsou tedy agonisté in vitro.
Vyhodnocení in vitro experimentů.
Pro vyhodnocení kompetitivních vazebných experimentů byl využit program Graph Pad Prism Software (San Diego, CA, USA). Pro vyhodnocení spouštění signalizačních drah bylo využito denzitometrické stanovení pomocí programu Quantity One (BioRad, Hercules, CA,
USA).
• ·· · · · · * · · · · • * · · e » » » » »« » e * t ť« K * · · ► · v« · · * ·····»· ·· « ·······
Pro kompetitivní vazebné experimenty byla využita metoda nelineární regrese za předpokladu jednoho vazebného místa. Hodnotu K, byla vypočítaná pomocí rovnice Chenga a Prussofa (Cheng and Prusoff, 1973) s použitím hodnoty Kd 4,21 nmol.F1 a koncentrace radioligandu byla 0,1 nmol.l·1 (Maixnerová et al., 2011).
Pro statistické vyhodnocení statisticky významné odpovědi u buněčné signalizace byla využita metoda jednocestného testu ANOVA s následným Dunnettovým post-hoc testem. Data byla statisticky významná při P < 0,05.
Tab. 3
Afinita lipidovaných analogů potkaního a lidského PrRP k potkanímu receptoru v buňkách RC-4B/C
Vytěsnění potkaního a lidského 125I-PrRP31 lipidovanými analogy lidského PrRP
Analog l25I-potkaní PrRP31 Ki (nM) l25I-lidský PrRP31 Ki (nM)
hPrRP31 1.54 ±0,42 3.01 ±0.70
11 2.28 ±1.30 2.00 ± 1.26
12 4.13 ±2.57 3.16 ±0.83
13 0.41 ±0.13 0.66 ±0.14
Tab. 2 a 3: Hodnoty inhibiční konstanty neznačené látky KÍ5 byly vypočítané dosazením IC5o do rovnice Chenga a Prusoffa (za Ka byla dosazena hodnota 4,21 nmol.l1 zjištěná při saturačních vazebných experimentech a koncentrace radioligandu byla 0,1 nmol.l ) s příslušnými hodnotami S.E.M.
Příklad 3: Test příjmu potravy po SC nebo ICV podání lipidovaných analogů PrRP
Myší samci kmene C57BL/6 (An Lab, Praha 4) byli chováni v akreditovaném zvěřinci ÚOCHB AV ČR, v.v.i., Praha v areálu ústavů akademie věd v Krči při teplotě 22 ± 2°C a měli volný přístup k potravě i k pití. Rytmus světlo/tma byl 12/12 hodin (začátek světla 6.00). Se zvířaty se zacházelo podle zákona o ochraně zvířat proti týrání (zákon ě. 246/1992 Sb.). Samci byli krmeni standardní dietou St-1 (Mlýn Kocanda, Praha, ČR), která obsahovala 66 % sacharidů, 25 % proteinů a 9 % tuků a jejíž energetická hodnota byla 3,4 kcal/g.
* * β » S i « á *4 1 -· *· * · ».
* e · ’-· * » ·«
.. ..· :
hodin před injektováním lipidovaného peptidů byla myším odebrána potrava, ale zůstal volný přístup k pití. Injektování fyziologického roztoku a PrRP i lipidovaných analogů PrRP po rozpuštění ve fyziologickém roztoku bylo prováděno SC, v dávkách 1-10 mg/kg (objem 0,2 ml/myš), nebo ICV pomocí infuzní pumpy (kanyly byly myším zavedeny do 3. mozkové komory 4 dny před pokusem podle postupů Maixnerové a kol. (Maixnerová et al., 2011) a jednotlivá dávka peptidů činila 4 nmol/myš (5 μΐ/myš).
minut po injektování lipidovaného peptidů byla myším podána předem zvážená potrava. Potrava pak byla vážena každých 30 minut po dobu 5-10 hodin. Podání každé dávky lipidovaného analogu PrRP bylo prováděno nejméně dvakrát a jedna skupina myší čítala minimálně 6 myší. Výsledky jsou vyjádřeny v procentech příjmu potravy ve srovnání s kontrolní skupinou injikovanou fyziologickým roztokem.
Pro statistické vyhodnocení byl použit program Graph-Pad Prism Software (San Diego, CA, USA), metoda one-way ANOVA s následným Dunnettovým post-hoc testem. Rozdíly v příjmu potravy mezi jedinci, jimž byl injektován fyziologický roztok, a jedinci, kterým byl injektován hodnocený peptid, byly považovány za statisticky významné při P < 0,05.
Výsledky jsou shrnuty v tabulce 4 a v obrázcích 1-6.
Tab. 4 Biologická aktivita lipidovaných peptidů - analogů potkaního PrRP in vivo
Příjem potravy u hladových myší C57BL po SC injekci (5 nebo 10mg/kg) nebo ICV injekci (4nmol/myš, odpovídá dávce 0.6 mg/kg).
Analog SC podání ICV podání
45 minut 300 minut 45 minut 300 minut
přijatá potrava (g) % kontrol přijatá potrava (g) % kontrol přijatá potrava (g) % kontrol přijatá potrava (g) % kontrol
PrRP31 0,32 100 1,15 105 0,42 75 1,37 104
1 0,38 117 1,05 97 0,39 70 0,71 53
3 0,12 50 0,61 60 NT
4 0,07 30 1,04 101 0,38 71 1,4 105
5 0,05 25 0,18 21 0,35 62 0,96 73
17 * ♦ · • * « * * * · • · · · · · · • * · · · · ·' · · * · » « » “ * ' « ·. » » · »: ·» · ·*·····
6 0 0 0,14 14 0,38 71 1,3 100
7 0,16 49 0,88 81 NT
8 0,17 76 0,78 90 0,34 60 1,05 79
9 0,01 2 0,22 25 0,28 51 1,03 78
PrRP20 0,32 100 1,1 100 0,32 68 1,29 100
10 0,11 32 44 44 0,28 51 1,1 86
Příjem potravy byl sledován 300 min po injekci látky. Ve 45 min po podání je maximální
účinek látky. Látky 1, 2, 5, 7, 8, 9 v dávce 10 mg/kg, látky 3, 4, 6, 10 v dávce 5 mg/kg (SC
podání). Fyz - fyziologický roztok (kontrola). NT - netestováno.
Lipidované analogy potkaního PrRP31 i PrRP20 snižovaly příjem potravy u hladových myší po ICV podání v podobné míře jako u PrRP31 (viz obr. 1 a publikaci (Maixnerová et al., 2011), ale jejich účinek byl ve srovnání sPrRP31 prodloužený (příklady na obr. 2). Účinek lipidovaných analogů PrRP po ICV podání nebyl závislý na délce či existenci mastné kyseliny.
Lipidované analogy potkaního PrRP31 a PrRP20 s navázanou kyselinou myristovou nebo palmitovou (příklad analogů PrRP31 na obr. 3) snižovaly velmi významně a dlouhodobě příjem potravy u hladových myší po SC podání. U analogu s kyselinou tridekanovou došlo k částečnému snížení příjmu potravy, avšak účinek byl výrazně nižší než u výše jmenovaných analogů. Analogy bez mastné kyseliny nebo obsahující oktanoyl nebo dodekanoyl snižovaly příjem potravy, ale nikoli statisticky významně - pravděpodobně v důsledku špatného průstupu hematoencefalickou bariérou.
Myristoylované analogy lidského PrRP31 a PrRP20 snižovaly velmi významně příjem potravy u hladových myší, srovnatelně s účinkem příslušných potkaních analogů (obr. 4).
Snížení příjmu potravy u myší po SC podání lipidovaných analogů PrRP bylo závislé na podané dávce (obr. 5 ukazuje účinek látky 5 a obr 6 účinek látky 9). Dávky 2-10 mg/kg významně snižovaly příjem potravy.
Průmyslová využitelnost
Potenciální antiobezitika po subkutánním podání.
• · * · » ···· ·: « » • * * * * ¢- · · « « f. «
IQ * * «
Ιο ······· ·· · ·······
Literatura:
Bechtold D and Luckman S (2006); Endocrinology 147:4723-4729.
Bjursell M, Lennerás M, Goransson M, Elmgren A and Bohlooly-Y M (2007); Biochem Biophys Res Commun 363:633-638.
Boyle R, Downham R, Ganguly T, Humphries J, Smith J and Travers S (2005); J Pept Sci 11:161-165.
Cheng Y and Prusoff WH (1973); Biochem Pharmacol 22:3099-3108.
Ellacott K, Lawrence C, Pritchard L and Luckman S (2003); Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 285:R1005-1010.
Ellacott K, Lawrence C, Rothwell N and Luckman S (2002); Endocrinology 143:368-374.
Fukusumi S, Fujii R and Hinuma S (2006); Peptides 27:1073-1086.
Gu W, Geddes B, Zhang C, Foley K and Stricker-Krongrad A (2004); J Mol Neurosci 22:93103.
Heal DJ, Gosden J and Smith SL (2012); Neuropharmacology 63:132-146.
Hinuma S, Habata Y, Fujii R, Kawamata Y, Hosoya M, Fukusumi S, Kitada C, Masuo Y, Asano T, Matsumoto H, Sekiguchi M, Kurokawa T, Nishimura O, Onda H and Fujino M (1998); Nature 393:272-276.
Jarry H, Heuer H, Schomburg L and Bauer K (2000); Neuroendocrinology 71:262-267.
Langmead C, Szekeres P, Chambers J, Ratcliffe S, Jones D, Hirst W, Price G and Herdon H (2000); Br J Pharmacol 131:683-688.
Lawrence C, Celsi F, Brennand J and Luckman S (2000); Nat Neurosci 3:645-646.
Lawrence C, Ellacott K and Luckman S (2002); Endocrinology 143:360-367.
Lawrence C, Liu Y, Stock M and Luckman S (2004); Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 286:R101-107.
Maixnerová J, Hlaváček J, Blokesová D, Kowalczyk W, Elbert T, Sanda M, Blechová M, Železná B, Slaninová J and Maletínská L (2007); Peptides 28:1945-1953.
Maixnerová J, Špolcová A, Pýchová M, Blechová M, Elbert T, Řezáčova M, Železná B and Maletínská L (2011); Peptides 32:811-817.
Maletínská L, Pýchová M, Holubová M, Blechová M, Demianová Z, Elbert T and Železná B (2012); J Pharmacol Exp Ther 340:781-786.
Maletínská L, Špolcová A, Maixnerová J, Blechová M and Železná B (2011); Peptides
32:1887-1892.
* · ft ·· ··· · ft ·· • * · ft « * * * * ft ft — ft < -ft ft 9 ft « ft * * t » · ř ft ft»» ft · ft ft ft ft · · ft · ft ft ft ft ft ft ft
Mochiduki A, Takeda T, Kaga S and Inoue K (2010); J Neuroendocrinal 22:576-584.
Motulsky H and Neubig R (2002); Curr Protoč Neurosci Chapter 7:Unit 7.5.
Onaka T, Takayanagi Y and Leng G (2010); Trends Endocrinol Metab 21:287-293.
Roland B, Sutton S, Wilson S, Luo L, Pyati J, Huvar R, Erlander M and Lovenberg T (1999);
Endocrinology 140:5736-5745.
Satoh F, Smith D, Gardiner J, Mahmoodi M, Murphy K, Ghatei M and Bloom S (2000); Br J Pharmacol 129:1787-1793.
Strader A and Woods S (2005); Gastroenterology 128:175-191.
Takayanagi Y, Matsumoto H, Nakata M, Mera T, Fukusumi S, Hinuma S, Ueta Y, Yada T, Leng G and Onaka T (2008); J Clin Invest 118:4014-4024.

Claims (9)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Lipidované peptidy tvořené 20 nebo 31 aminokyselinami, přičemž jejich C-konec tvoří sekvence IRPVGRF-NH2, v níž isoleucin může být nahrazen fenylglycinem či alaninem a valin může být nahrazen fenylglycinem, koncový fenylalanin může být nahrazen aminokyselinou s postranním řetězcem obsahujícím CH2-Ar nebo CH2-S-CH2-Ar, kde Ar zahrnuje fenyl nebo naftyl, případně substituované halogenem či nitroskupinou, přičemž na aminoskupině N-koncové aminokyseliny, která je s výhodou vybrána ze skupiny zahrnující serin, kyselina diaminopropionová a threonin, je amidovou vazbou navázána C6 až Cl 8 mastná kyselina, nebo je N-koncovou aminokyselinou samotná kyselina diaminopropionová.
  2. 2. Lipidované peptidy podle nároku 1, vyznačující se tím, že jsou vybrány ze skupiny zahrnující:
    X-TPDINPAWYmoRprRPsGRt-NH2, a
    X-SRmHnHSqETRTPDINPAWYmoRprRPsGRt-NH2, kde m je T, A nebo methylalanin, o je G nebo S, n je Q nebo R, p je G, A, P nebo S, q je M nebo norleucin, r je I, A nebo fenylglycin, s je V nebo fenylglycin, t je F nebo aminokyselina s postranním řetězcem obsahujícím CH2-Ar nebo CH2-S-CH2-Ar, kde Ar zahrnuje fenyl nebo naftyl, případně substituované halogenem či nitroskupinou, a X je mastná kyselina C6 až Cl8 navázaná amidovou vazbou na aminoskupině N-koncové aminokyseliny, popřípadě je struktura X-S nebo X-T nahražena samotnou kyselinou diaminopropionovou.
  3. 3. Lipidované peptidy podle nároku 1, vyznačující se tím, že jsou vybrány ze skupiny zahrnující:
    X-TPDINPAWYmoRGrRPsGRt-NH2, a
    X-SRmHnHSMETRTPDINPAWYmoRGrRPsGRt-NH2, kde m je T nebo A a o je G nebo S, n je Q nebo R, r je I, A nebo fenylglycin, s je V nebo fenylglycin, t je F nebo aminokyselina s postranním řetězcem obsahujícím CH2-Ar nebo CH2S-CH2-Ar, kde Ar zahrnuje fenyl nebo naftyl, případně substituované halogenem či nitroskupinou, a X je mastná kyselina 6 až C18 navázaná amidovou vazbou na aminoskupině N-koncové aminokyseliny, popřípadě je struktura X-S nebo X-T nahražena samotnou kyselinou diaminopropionovou.
  4. 4. Lipidované peptidy podle nároku 1,2 nebo 3, vyznačující se tím, že C-koncová aminokyselina je zvolena ze skupiny, zahrnující naftylalanin, benzylcystein, benzylhistidin, pentafluorofenylalanin, nitro fenylalanin.
  5. 5. Peptidy podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že mastná kyselina je zvolena ze skupiny, zahrnující mastné kyseliny o 6 až 18, s výhodou 13 až 18 uhlíkových atomech.
  6. 6. Peptidy podle nároku 1, vyznačené tím, že jsou vybrány ze skupiny zahrnující:
    (Dpr(oct))RmHnHSNZeETRTPDINPAWYmoRGrRPsGRF-NH2 (Dpr(dodec))RmHnHSNZeETRTPDINPAWYmoRGrRPsGRF-NH2 (Dpr(tridec))RmHnHSA7eETRTPDINPAWYmoRGrRPsGRF-NH2 (Dpr(myr))RmHnHSMeETRTPDINPAWYmoRGrRPsGRF-NH2 (Dpr(palm))RmHnHSMeETRTPDINPAWYmoRGrRPsGRF-NH2 (myr)TPDINPAWYmoRGrRPsGRF-NH2 (palm)TPDINPAWYmoRGrRPsGRF-NH2 (Dpr(oct))RmHnHSMeETRTPDINPAWYmoRGrRPsGR7-Ya/-NH2 (Dpr(dodec))RmHnHSMeETRTPDINPA\VYmoRGrRPsGR /-AW-NH2 (Dpr(tridec))RmHnHSMeETRTPDINPAWYmoRGrRPsGR7-AaZ-NH2 (Dpr(myr))RmHnHSA7eETRTPDWAWYmoRGrRPsGR7-W-NH2 (Dpr(pahn))RmHnHSMeETRTPDINPAWYmoRGrRPsGR7-W-NH2 (myr)TPDINPAWYmoRGrRPsGR Z-M/Z-NH, (palm)TPDINPAWYmoRGrRPsGR Z-M/Z-NH2 kde kde m je T nebo A a oje G nebo S, n je Q nebo R, r je I, A nebo fenylglycin, s je V nebo fenylglycin, Dpr je kyselina diaminopropionová, 1-Nal je 1-naftylalanin, Nle je norleucin, myr je myristoyl, palm je palmitoyl, oct je oktanoyl, dodec je dodekanoyl, tridec je tridekanoyl; přičemž v polohách 1 až 24 peptidů mohou být dále provedeny takové záměny aminokyselin, které nezvýší hodnotu vazebné afinity vzniklého lipidovaného peptidu k receptorů GPR10 nad Kj 10'6 mol.I’1 a jeho anorektická aktivita, hodnocená pomocí testu příjmu potravy u hladových myší, po periferním i centrálním podání je stejná jako po podání PrRP, nebo vyšší.
    • ·· ·»··«.· Λ * * * * · · w r ’ * · * *«·»*< * * * Λ « β β ζζ ···*··· ·· · ·»·.*.
  7. 7. Peptidy podle nároku 1, vyznačené tím, že jsou vybrány ze skupiny zahrnující:
    (Dpr(oct))RmHnHSWeETRTPDINPAWYmoRGIRPVGRF-NH2 (Dpr(dodec))RmHnHSWeETRTPDINPAWYmoRGIRPVGRF-NH2 (Dpr(tridec))RmHnHSA/eETRTPDINPAWYmoRGIRPVGRF-NH2 (Dpr(myr))RmHnHSA7eETRTPDINPAWYmoRGIRPVGRF-NH2 (Dpr(palm))RmHnHSA/eETRTPDINPAWYmoRGIRPVGRF-NH2 (myr)TPDINPAWYmoRGIRPVGRF-NH2 (palm)TPDINPAWYmoRGIRPVGRF-NH2 (Dpr(oct))RmHnHSAZeETRTPDINPAWYmoRGIRPVGR7-AGZ-NH2 (Dpr(dodec))RmHnHSAZeETRTPDINPAWYmoRGIRPVGR7-W-NH2 (Dpr(tndec))RmHnHSMtETRTPDINTAWYmoRGIRPVGR Z-AW-NH2 (Dpr(myr))RmHnHSMeETRTPDINPAWYmoRGIRPVGR 7-7VízZ-NH2 (Dpr(palm))RmHnHSAZeETRTPDINPAWYmoRGIRPVGR7-AaZ-NH2 (myr)TPDINPAWYmoRGIRPVGR 7-A«Z-NH2 (palm)TPDINPAWYmoRGIRPVGR 7-A«Z-NH2 kde kde m je T nebo A a o je G nebo S, n je Q nebo R, Dpr je kyselina diaminopropionová, 7Nal je 1-naftylalanin, Nle je norleucin, myr je myristoyl, palm je palmitoyl, oct je oktanoyl, dodec je dodekanoyl, tridec je tridekanoyl přičemž v polohách 1 až 24 peptidů mohou být dále provedeny takové záměny aminokyselin, které nezvýší hodnotu vazebné afinity vzniklého lipidovaného peptidů k receptoru GPR10 nad Kj 10 6 mol.l1 a jeho anorektická aktivita, hodnocená pomocí testu příjmu potravy u hladových myší, po periferním i centrálním podání je stejná jako po podání PrRP, nebo vyšší.
  8. 8. Použití lipidovaných peptidů podle kteréhokoliv z nároku 1 až 7 jako anorexigenních látek snižujících příjem potravy po periferním podání.
  9. 9. Použití lipidovaných peptidů podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7 k výrobě léčiva pro léčení obezity.
CZ2012-476A 2012-07-12 2012-07-12 Lipidované peptidy jako antiobezitika CZ2012476A3 (cs)

Priority Applications (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2012-476A CZ2012476A3 (cs) 2012-07-12 2012-07-12 Lipidované peptidy jako antiobezitika
PCT/IB2013/001837 WO2014009808A2 (en) 2012-07-12 2013-07-11 Lipidated peptides as anti-obesity agents
AU2013288383A AU2013288383B2 (en) 2012-07-12 2013-07-11 Popelova, AndreaLipidated peptides as anti-obesity agents
EP13767072.5A EP2872124B1 (en) 2012-07-12 2013-07-11 Lipidated peptides as anti-obesity agents
US14/414,034 US9937235B2 (en) 2012-07-12 2013-07-11 Lipidated peptides as anti-obesity agents
CA2877594A CA2877594C (en) 2012-07-12 2013-07-11 Lipidated peptides as anti-obesity agents
IL236264A IL236264A (en) 2012-07-12 2014-12-15 Fatty residue peptides as anti-obesity agents
US15/094,390 US20160331812A1 (en) 2012-07-12 2016-04-08 Lipidated peptides as anti-obesity agents

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2012-476A CZ2012476A3 (cs) 2012-07-12 2012-07-12 Lipidované peptidy jako antiobezitika

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ2012476A3 true CZ2012476A3 (cs) 2014-01-22

Family

ID=49253347

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2012-476A CZ2012476A3 (cs) 2012-07-12 2012-07-12 Lipidované peptidy jako antiobezitika

Country Status (7)

Country Link
US (2) US9937235B2 (cs)
EP (1) EP2872124B1 (cs)
AU (1) AU2013288383B2 (cs)
CA (1) CA2877594C (cs)
CZ (1) CZ2012476A3 (cs)
IL (1) IL236264A (cs)
WO (1) WO2014009808A2 (cs)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ309217B6 (cs) * 2014-05-27 2022-06-01 Ústav Organické Chemie A Biochemie Av Čr, V.V.I. Lipidované peptidy jako neuroprotektiva

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ2012476A3 (cs) 2012-07-12 2014-01-22 Ústav organické chemie a biochemie Akademie věd ČR, v. v. i. Lipidované peptidy jako antiobezitika
AU2015207776B2 (en) * 2014-01-15 2017-06-15 Fyziologicky Ustav Akademie Ved Cr, V.V.I. Lipidated peptides for lowering blood glucose
EP3180021A4 (en) * 2014-08-11 2018-04-18 Albany Medical College Myristoylated leptin-related peptides and uses thereof
US20220153782A1 (en) * 2019-03-27 2022-05-19 Memoryplus Ltd. Compounds, compositions and methods for treating a neurological condition
CZ310754B6 (cs) * 2022-11-29 2026-07-22 Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, v. v. i. Palmitovaný analog peptidu uvolňujícího prolaktin určený pro intranasální podání

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6383764B1 (en) * 2000-04-28 2002-05-07 The Regents Of The University Of California Methods of identifying compounds for controlling absence seizures in a mammal relating to prolactin-releasing peptide(PrRP)
US20090054623A1 (en) * 2004-12-17 2009-02-26 Neose Technologies, Inc. Lipo-Conjugation of Peptides
WO2009046851A1 (en) 2007-09-11 2009-04-16 Mondobiotech Laboratories Ag Cgrp as a therapeutic agent
WO2009126132A1 (en) * 2008-03-31 2009-10-15 Mark Rosenberg Formulations and methods for modulating satiety
HRP20220519T1 (hr) 2011-06-24 2022-05-27 Nono Inc. Kombinacijska terapija ishemije
CZ2012476A3 (cs) 2012-07-12 2014-01-22 Ústav organické chemie a biochemie Akademie věd ČR, v. v. i. Lipidované peptidy jako antiobezitika

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ309217B6 (cs) * 2014-05-27 2022-06-01 Ústav Organické Chemie A Biochemie Av Čr, V.V.I. Lipidované peptidy jako neuroprotektiva

Also Published As

Publication number Publication date
WO2014009808A3 (en) 2014-03-06
US20160331812A1 (en) 2016-11-17
IL236264A (en) 2017-10-31
CA2877594C (en) 2018-01-02
AU2013288383A1 (en) 2015-01-22
AU2013288383A8 (en) 2015-03-19
CA2877594A1 (en) 2014-01-16
US9937235B2 (en) 2018-04-10
WO2014009808A2 (en) 2014-01-16
EP2872124A2 (en) 2015-05-20
US20150175674A1 (en) 2015-06-25
EP2872124B1 (en) 2017-11-08
AU2013288383B2 (en) 2015-12-10
IL236264A0 (en) 2015-02-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210206817A1 (en) Metabolically Stable Apelin Analogs in the Treatment of Disease Mediated by the Apelin Receptor
Moody et al. I. High affinity receptors for bombesin/GRP-like peptides on human small cell lung cancer
TW201143793A (en) Oxyntomodulin peptide analogue
Sánchez-Margalet et al. Reprint of: Metabolic effects and mechanism of action of the chromogranin A-derived peptide pancreastatin
WO2013178490A1 (en) Pancreatic polypeptide compounds and use
Audinot et al. [125I]‐S36057: a new and highly potent radioligand for the melanin‐concentrating hormone receptor
EP2872124B1 (en) Lipidated peptides as anti-obesity agents
Ohinata et al. Albutensin A and complement C3a decrease food intake in mice
Chatenet et al. Urocontrin, a novel UT receptor ligand with a unique pharmacological profile
Ögren et al. Differential effects of the putative galanin receptor antagonists M15 and M35 on striatal acetylcholine release
Aloyz et al. Processing of the L5–67 precursor peptide and characterization of LUQIN in the LUQ neurons of Aplysia californica
CA2602127A1 (en) Human leptin-derived polypeptides and uses thereof
Prosser et al. Cardiovascular effects of native and non-native urotensin II and urotensin II-related peptide on rat and salmon hearts
AU2014366425B2 (en) Novel compound for treatment of severe hypoglycemia
Conklin et al. Pharmacological characterization of arginine vasotocin vascular smooth muscle receptors in the trout (Oncorhynchus mykiss) in vitro
Maletínská et al. Biological properties of prolactin-releasing peptide analogs with a modified aromatic ring of a C-terminal phenylalanine amide
Champion et al. Structure–activity relationships of adrenomedullin in the circulation and adrenal gland
Sexton et al. Amylin is an agonist of the renal porcine calcitonin receptor
WO2000078805A1 (en) Peptide having preptin functionality
MX2014009233A (es) Efectores de beta-arrestina y composiciones y metodos de uso de la misma.
Ohinata et al. Proadrenomedullin N-terminal 20 peptide (PAMP) inhibits food intake and gastric emptying in mice
Batra et al. Pneumadin: a new lung peptide which triggers antidiuresis
Anjos et al. Production and characterisation of gilthead sea bream (Sparus auratus) recombinant parathyroid hormone related protein
CZ2014429A3 (cs) Dlouhodobě působící stabilní peptidové analogy ghrelinu k léčbě kachexie
Audinot et al. Structure-activity relationship studies of MCH-related peptide ligands of SLC-1, the human melanin-concentrating hormone receptor