CZ2012829A3

CZ2012829A3 - Polypeptidy pro léčbu autoimunitních chorob založenou na blokaci receptoru pro lidský cytokin IL-23

Info

Publication number: CZ2012829A3
Application number: CZ2012-829A
Authority: CZ
Inventors: Petr Malý; ebo Peter Ĺ; Milan Kuchař; Lucie Vaňková; Hana Petroková
Original assignee: Biotechnologický Ústav Av Čr, V.V.I.
Priority date: 2012-11-23
Filing date: 2012-11-23
Publication date: 2014-06-11
Also published as: CZ304514B6; EP2922560B1; WO2014079399A1; EP2922560A1

Abstract

Předkládané řešení se týká polypeptidů, které jsou odvozeny z albumin-vazebné domény streptokokového proteinu G divokého typu o sekvenci LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLINNAKTVEGVKALIDEILAALP (ABDwt) a vykazují schopnost vazby na receptor pro lidský cytokin IL-23 s afinitní konstantou K.sub.d.n.menší než 10.sup.-7.n.M. Tyto polypeptidy byly vybrány z ABD peptidové knihovny, připravené randomizací 11 zbytků ABDwt, s ohledem na vazbu k IL-23R. Součástí řešení je také jejich použití pro přípravu léčiva pro léčbu autoimunitních chorob, zejména psoriázy, Crohnovy choroby, revmatiodní artritidy a roztroušené sklerózy.

Description

Polypeptidy pro léčbu autoimunitních chorob založenou na blokaci receptoru pro lidský cytokin IL-23

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nových polypeptidů odvozených od albumin-vazebné domény (ABD) streptokokového proteinu G, které jsou vhodné pro léčbu autoimunitních chorob a jako diagnostická činidla.

Dosavadní stav techniky

O autoimunitních chorobách, jakými jsou například psoriáza, Crohnova choroba, revmatoidní artritida nebo roztroušená skleróza, je známo, že souvisejí s cytokinem IL-23 indukujícím signalizační funkci zprostředkovanou subpopulací Th17 buněk nebo přirozených zabij ečských buněk (NKC), které exprimují buněčně povrchový receptor pro IL-23 (Oppmann B et al.: Immunity 2000; 13(5):715-725; Cua DJ et al.: Nátuře 2003;421(6924):744-748; Langrish CL et al.:J Exp Med 2005;201(2):233-240; Chán JR et al.:J Exp Med 2006;203(12):2577-2587; Capon F et al.: Hum Genet 2007;122(2):201-206; Vaknin-Dembinsky A et al.: J Immunol 2006;176(12):7768-7774; Duerr RH et al.: Science 2006;314(5804): 1461-1463). V těchto typech buněk cytokin IL-23, uvolněný z dendritických buněk a sestávající z unikátní podjednotky pl9 a obecné podjednotky p40 (Beyer BM et al.: J Mol Biol 2008;382(4):942955; Lupardus PJ et al.: J Mol Biol 2008;382(4):931 -941), aktivuje signální dráhu prostřednictvím interakce pl9 podjednotky se svým buněčným membránovým receptorem IL- 23R a interakcí podjednotky p40 s povrchovým receptorem βΐ cytokinu IL-12 (Parham C et al.: J Immunol 2002;168(l l):5699-5708; Kastelein RA et al.: Annu Rev Immunol 2007;25:221-242). Synergická vazba heterodimeru IL-23 k oběma receptorovým jednotkám vede k heterodimerizaci receptoru následované tvorbou kvartemího komplexu, která spouští signální kaskádu dráhy jak/stat, zahrnující molekuly Jak2, Tyk2, Stati, Stat3, Stat4 a Stat5. Transdukce signálu aktivuje transkripci, která vyvolává sekreci směsi modulátorů zánětu, jimiž jsou IL-17A, IL-17F, IL-22 a některé chemokiny stimulující keratinocyty a další typy buněk, a tedy hrajících zásadní roli v prozánětlivém procesu (přehledový článek Bonifáce K et al.: Immunol Rev 2008;226:132-146).

n · · ) · ^? * · % » · » » *

Efektivní terapeutická intervence potlačující hyperproliferaci keratinocytů jako klinický projev psoriázy vede k blokádě interakce mezi podjednotkami pl9/p40 IL-23 a jejich receptory v buněčných membránách (Toichi E et al.: J Immunol 2006;177(7):4917-4926; Krueger GG et al.: N Engl J Med 2007;356(6):580-592; Gottlieb AB et al.: Curr Med Res Opin 2007;23(5):1081-1092). Nedávno bylo ukázáno, že léčivo na bázi monoklonální protilátky Stelara (ustekinumab, Janssen Biotech), blokující podjednotku p40 cytokinu IL-23 a bránící její interakci s βΐ receptorem cytokinu IL-12, dosahuje výborných výsledků v léčbě středních a těžkých forem psoriázy (Leonardi CL et al.: Lancet 2008;371(9625): 1665-1674; Papp KA et al.: Lancet 2008;371(9625): 1675-1684). Protože však podjednotka p40 je součástí cytokinů IL-12 i IL-23, ovlivňuje léčivo dvě rozdílné signální dráhy, což přináší nežádoucí vedlejší účinky včetně kardiovaskulárních problémů a vyššího rizika rakoviny. Pozornost se proto v současné době soustředí na vývoj nových léčiv cíleně zasahujících pouze signální dráhu zprostředkovanou IL-23, jakými jsou specifické anti-pl9 protilátky MK-3222 (Měrek), CNTO 1959 (Janssen Biotech) and AMG 139 (Amgen/Medlmmune) (Garber K: Nat Biotechnol 2012;30(6):475-477), nebo cílené protilátky popsané v patentových přihláškách WO 2008/10^432, WO 2010/027^766 a WO 2012/093-127. Protilátky jsou však velké molekuly, náročné na přípravu a s omezenou pohyblivostí v organismu, a to především z hlediska prostupnosti kůží a tkáněmi.

Alternativou ke konvenčním léčivům založeným na monoklonálních protilátkách jsou uměle vytvořené vazebné molekuly odvozené od malých proteinových struktur (Binz HK et al.: Current Opinion in Biotechnology 2005;16(4):459-469; Nygren PA et al.: Joumal of Immunological Methods 2004;290(l-2):3-28; Gronwall C et al.: J Biotechnol 2009; 140(34):254-269). Malé proteinové struktury vzniklé modifikací aminokyselin ABD v γ streptokovového proteinu G jsou známy z US 2008/0(187617, kde byly připraveny za účelem zvýšení afinity k lidskému sérovému albuminu (HSA). Dále jsou známy proteiny odvozené od

A f fíbronektinu, vážící IL-23 (WO 2011 /1 034 05).

Receptor IL-23 patří do rodiny cytokinových receptorů třídy I a sdílí typické znaky s tandemovými doménami fíbronektinového typu III (FnlII) obsahujícími typické disulfídové vazby a WQPWS sekvenci, podobající se WSXWS sekvenci cytokinových receptorů lokalizované v transmembránově proximální doméně FnlII (Parham C et al.: J Immunol 2002; 168(11):5699-5708). Obě domény tvoří cytokin-vážící homologní oblast (CHR), která je spolu s terminální imunoglobulínu podobnou doménou považována za zásadní pro vazbu IL23.

Protože přesná molekulární struktura komplexu IL-23/IL-23R dosud nebyla objasněna, je navrhování efektivních inhibitorů funkce IL-23 se slibným terapeutickým účinkem značně problematické.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu jsou polypeptidy obsahující sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující: KYKNGINNALCVRRVKALIDWILAYLP (SEQ. ID NO. 1) TYKNDINAASYVPAVKWAIDRILASLP (SEQ. ID NO. 2) YYKNRINPACHVLSVKSNIDWILASLP (SEQ. ID NO. 3) VYKNTINIAIPVRVVKRVIDWILAVLP (SEQ. ID NO. 4) AYKNLINAALIVAKVKLLIDAILAPLP (SEQ. ID NO. 5) HYKNWINPARRVRPVKWLIDAILAALP (SEQ. ID NO. 6) RYKNSINRALPVAAVKWALDLILAWLP (SEQ. ID NO. 7) WYKNCITAARAVTTVKLLIDTILALLP (SEQ. ID NO. 8) HYKNSINPAPQVIVVKVNIDLILAGLP (SEQ. ID NO. 11) RYKNWINRAWLVALVKRQIDQILALLP (SEQ. ID NO. 12) EYKNAINAANPVSGVKRPIDVILAALP (SEQ. ID NO. 13) WYKNRINTALTVACVKLVIDWILAALP (SEQ. ID NO. 15) přičemž na N-konci uvedené sekvence je přímo připojena sekvence mající alespoň 80% sekvenční identitu se sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující LAEAKVLANRELDKYGVSD (SEQ ID NO. 17) LAEAKVLTNRELDKYGVSD (SEQ ID NO. 18) LAETKVLANRELDKYGVSD (SEQ ID NO. 19), přičemž asociační a disociační rovnováha vazby uvedeného polypeptidů na receptor pro lidský cytokin IL-23 charakterizovaná vazebnou afinitní konstantou K_d vykazuje hodnotu menší než 10‘⁷M.

V rámci předkládaného vynálezu bylo zjištěno, že polypeptidy podle vynálezu, odvozené z albumin-vazebné domény streptokokového proteinu G divokého typu (ABDwt, SEQ. ID NO. 16), jsou vhodnými kandidáty pro látky vážící se na receptor pro lidský cytokin IL-23 a blokující tak specificky jeho vazbu s podjednotkou pl9 IL-23. ABDwt je tříhelikální struktura a bylo zjištěno, že zejména helixy 2 a 3 (aminokyselinové zbytky 20 až 46) jsou důležité pro vazbu na receptor IL-23. Sekvence helixu 1 (aminokyselinové zbytky 1 až 19) nebo její část může být připojena na N-konec sekvence nebo na C-konec sekvence odvozené od aminokyselinových zbytků 20 až 46 nebo její části. Dále mohou být prováděny bodové záměny aminokyselin, s výhodou alespoň 5 aminokyselinových zbytků, a také zkrácení či prodloužení sekvence.

Asociační a disociační rovnováha vazby polypeptidu (P) podle předkládaného vynálezu na receptor IL-23 (L) za vzniku komplexu (C), je vyjádřena vztahem C ?=± P -f- L, a je charakterizována vazebnou afinitní konstantou Kj spočítanou podle vzorce ΤΊ (kde [P] je koncentrace P, [L] je koncentrace L a [C] je koncentrace C vyjádřené v mol/1), která vykazuje hodnotu menší než 10’⁷ M. Tato vazebná afinitní konstanta může být stanovena známými metodami, které poskytují ekvivalentní výsledky, vhodnou metodou může být například metoda povrchové rezonance plasmonů (SPR).

S výhodou je polypeptid vybrán ze skupiny zahrnující sekvence SEQ ID NO. 1 až SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 11 až SEQ ID NO. 13, a SEQ ID NO. 15, které mají na C-konci nebo na N- konci připojenu sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO. 17 až SEQ ID NO. 19.

Předmětem předkládaného vynálezu je také sekvence DNA vybraná ze skupiny zahrnující komplementární DNA kódující aminokyselinovou sekvenci polypeptidů podle předkládaného vynálezu a DNA hybridizující s uvedenou komplementární DNA za vysoce stringentních podmínek. Vysoce stringentními podmínkami jsou v tomto vynálezu míněny následující podmínky pro odmytí značené DNA sondy: použití odmývacího roztoku obsahujícího 0,5 x SSC + 0,1% SDS o teplotě 60 °C.

Předkládaný vynález dále zahrnuje použití uvedené sekvence DNA pro přípravu polypeptidů podle vynálezu produkovaných v bakteriálních, kvasinkových, hmyzích, savčích nebo lidských hostitelských buňkách, a rovněž tyto hostitelské buňky, obsahující sekvence DNA podle vynálezu.

Polypeptidy podle vynálezu jsou vhodné pro použití v medicíně, zejména v léčbě autoimunitních chorob. Zejména terapeuticky vhodné jsou polypeptidy obsahující sekvence SEQ. ID NO. 1-7, nejvhodnější jsou polypeptidy obsahující sekvence SEQ ID NO. 3 a 6.

Polypeptidy podle vynálezu jsou vhodné prd i pro použití jako diagnostická činidla, zejména pro autoimunitní choroby. Za tímto účelem je zejména vhodné připojit k polypeptidům podle předkládaného vynálezu chromofor nebo fluorofor.

Autoimunitní choroby jsou choroby zahrnující prozánětlivé procesy zprostředkované IL-23, a zahrnují například psoriázu, Crohnovu chorobu, revmatoidní artritidu a roztroušenou sklerózu.

Polypeptidy podle vynálezu inhibují vazbu podjednotky pl9 k receptoru IL-23R interakcí s receptorem, čímž specificky blokují prozánětlivou signální dráhu, tedy jsou vhodné jako léčiva další generace pro léčbu autoimunitních chorob. Tato inhibiční schopnost byla prokázána v in vítr o vazebných stanoveních, kompetičních experimentech i v ex vivo funkčním stanovení. Dále sekvence podle předkládaného vynálezu vykazují sníženou afinitu proti sérovým albuminům.

Přehled Vyobrazeny

Obr. 1. Vazba rozpustného fúzního rekombinantního proteinu DH-MBP-pl9 a refoldováného DH-pl9 k imobilizovanému IL-23 receptoru ověřená testem ELISA. Receptor byl produkován v bakteriálním kmeni E. coli SHuffle a po extrakci refoldován z roztoku 8M močoviny. Interakce byla detegována pomocí myší polyklonální protilátky proti lidskému interleukinu 23 (anti-human IL-23 (pl 9)) a sekundární kozí protilátky fúzované s křenovou peroxidázou (anti» ί· ί * · • IgG-HRP). Výsledek ukazuje, že námi připravené bakteriální produkty se vzájemně rozpoznávají na základě specifické vazby.

Obr. 2. Vazebná doména ABD jako strukturní kostra pro konstrukci vazebných proteinů proti různým cílovým molekulám (tzv. ABD scaffold). Proteinová struktura (PDBID 1GJT) s vyobrazenými 11 aminokyselinovými pozicemi vybranými pro randomizovanou mutagenezi byla použita k tvorbě vysoce komplexní knihovny ABD variant o teoretické kompexitě 10¹⁴variant (podrobnosti jsou uvedeny v publikaci Ahmad a ost., Proteins 2012;80(3):774-789, 2012).

Obr. 3. Fylogenetický strom znázorňující sekvenční podobnost klonů REX selektovaných pro vazbu na receptor exIL-23R. Sekvenční analýza klonů ukázala 18 unikátních variant z celkového počtu 34 analyzovaných klonů. Pro tuto analýzu byla použita oblast sekvencí mezi

20. a 46. pozicí aminokyselin. Předcházející část (N-konec) aminokyselin 1-19 představující nemutovanuu oblast aminokyselinové sekvence nebyla do této analýzy zahrnuta.

Obr. 4.(a) Vazba REX variant k imobilizovanému receptoru exIL-23 s použitím ELISA. Receptor byl produkován v kmeni £. coli SHuffle a po extrakci refoldován z roztoku 8M močoviny. Interakce byla detegována pomocí streptavidinu konjugovaného s křenovou peroxidázou. (b) Vazba receptoru exIL-23R k imobilizovaným REX variantám. Interakce byla detegována pomocí polyklonální protilátky proti lidskému receptoru exIL-23R (anti-human IL- 23R) a sekundární protilátky fúzované s křenovou peroxidázou (anti-goat IgG-HRP). Grafy ukazují cíleně navozenou vazbu REX variant k IL-23 receptoru v porovnání s původní nemutovanou molekulou ABDwt.

Obr. 5. Kompetiční ELISA stanovení. Deset variant REX-ToIA-AVI (obr. 4 a, b) soutěží s

J fuzním proteinem DH-MBP-pl9 o vazbu k imobilizovanému receptoru exIL-23R vyprodukovanému z bakteriálního kmene E. coli SHuffle. Z jednotlivých variant REX klonů byly připraveny série ředění v roztoku PBST s 1% BSA obsahující 2θ’ηΜ DH-MBP-pl9. Zvyšující se koncentrace inhibujících REX variant měla za následek snížení vazby pl9 proteinu na receptor v protikladu k původní nemutované molekule ABDwt. Vazba pl9 na receptor byla detegována pomocí myší polyklonální protilátky anti-IL-23 (pl9) rozpoznané anti-IgG-HRP konjugátem kozí protilátky s křenovou peroxidázou. Tyto výsledky ukazují inhibiční účinky příslušných REX variant ve vazebném systému využívajícím bakteriální refoldovaný receptor.

Obr. 6. Kompetice inhibičních variant REX009 a REX125 s pl9/IL-23 o vazbu na receptor IL- 23R. Zvýšení koncentrace inhibičních variant REX (REX-TolA-AVI) má za následek úbytek vazby jak rekombinantního fuzního proteinu DH-MBP-pl9 (a) , tak kompletního eukaryotického produktu IL-23 cytokinu (b) k imobilizovanému rozpustnému receptoru ve formě chiméry IL-23R-IgG vyprodukované v myších fibroblastech. Vazba pl9 byla detegována pomocí myší polyklonální protilátky anti-IL-23 (pl9) rozpoznané sekundární kozí protilátkou anti-IgG-HRP konjugovanou s křenovou peroxidázou. Původní nemodifikovaná varianta ABD použitá jako negativní kontrola ve formě proteinu ABDwt-TolA-AVI v rozmezí použitých koncentrací proteinů neovlivňuje vazbu pl9 na IL-23R. Tento výsledek dokumentuje, že inhibiční účinek použitých REX variant nalezený s použitím bakteriálního receptoru je zachován i v případě rozpustné eukaryoticky produkované a glykosylované formy IL-23 receptoru aje potvrzen i sníženou vazbou kompletního lidského IL-23.

Obr. 7. Termální stability vazebných variant REX-TolA-AVI měřené metodou fluorescenčního posunu vlivem tepelné denaturace (tzv. fluorescence-based thermal-shift assay). Během vzrůstající teploty dochází k postupnému rozvolňování struktury proteinu (denaturaci), a tím zpřístupnění těchto oblastí pro vazbu fluorescenčního činidla SYPRO® Orange, v důsledku čehož narůstá měřený fluorescenční signál (excitace při 470 nm a emise 570 nm). Grafy ukazují průběhy normalizovaných hodnot fluorescence v závislosti na vzrůstající denaturační teplotě (a) a její derivace (b). Zjištěná teplota tání Tm pro REX009 je 50,0fC, pro REX125 je 56,Q°C a pro REX128 je měřením odhadnuta na 56,5 °C. Tyto výsledky dokumentují dostatečnou stabilitu použitých variant.

Obr. 8. (a) K-562 a THP-1 buňky exprimují na svém povrchu molekuly IL-23 receptoru a toto je dokumentováno vazbou anti-IL23R protilátky. Buňky byly vystaveny vazbě protilátky proti lidskému IL-23R značené APC nebo její izotypové kontrole konjugované s APC a poté analyzovány průtokovou cytometrií. (b) Analýza vazby různých variant ligandů REX-TolAAVI na K-562 a THP-1 buňky. Buňky byly inkubovány s in vivo biotinylovanými REX proteiny nebo s negativními kontrolami, a to s ABDwt nebo s variantou His-TolA molekuly postrádající ABD doménu, tzv. klonem delta (Δ) ABD. Navázané proteiny byly následně obarveny streptavidinem značeným fycoerytrinem a analyzovány průtokovou cytometrií. N.P. značí vzorek samotných buněk bez ABD i REX proteinu.

Obr. 9. Vazba různých variant REX ligandů na lidské buněčné linie koreluje s expresí IL-23 receptoru na těchto buňkách, (a) K-562 a Jurkat buňky exprimují na svém povrchu molekuly IL-23 receptoru. Buňky byly vystaveny vazbě protilátky proti lidskému IL-23R značené APC nebo její izotypové kontrole a analyzovány průtokovou cytometrií. (b) Profil vazby REX ligandů na K-562 a Jurkat buňky koreluje s intenzitou vazby protilátky proti lidskému IL-23R. Buňky byly inkubovány s in vivo biotinylovanými REX proteiny nebo s negativní kontrolou (ABDwt) a navázané proteiny byly následně obarveny streptavidinem značeným fycoerytrinem a analyzovány průtokovou cytometrií.

Obr. 10. REX varianty inhibují produkci IL-17 pozitivních T-buněk získaných z mononukleámích buňek periferní krve, (a) Intracelulámí barvení buněk produkujících IL-17. Významný pokles výskytu IL-17+ populace byl pozorován ve vzorcích stimulovaných IL-23 kultivovaných v přítomnosti REX ligandů oproti vzorkům s ABD-WT kontrolou nebo bez přítomnosti ABD proteinu, (b) Počet buněk produkujících IL-17 v jedné jamce po třídenní inkubaci s IL-23 a IL-2 bez přídavku ligandů nebo v kombinaci s přidaným REX009, REX125, REX128 nebo negativní kontrolou ABDwt. Buňky byly zpočátku stimulovány anti-CD3 protilátkou a poté znovu stimulovány ve třetím dni inkubace. Přítomnost CD4⁺ T-buňek produkujících IL-17 byla prokázána použitím intracelulámího barvení cytokinů. Tento výsledek dokumentuje imunomodulační potenciál vytvořených antagonistů IL-23 receptoru a potvrzuje, že vytvořené vazebné REX proteiny blokují IL-23R-zprostředkovanou aktivací Tbuněk vedoucí k produkci a sekreci IL-17.

Příklady provedení vynálezu

Materiály a metody

Protilátky a detekční činidla: monoklonální protilátky (mAbs) anti-lidský IL-23RAllophycocynin (APC) (myší IgG2B) specifický pro lidský receptor IL-23 a IgG2B isotypová kontrola-APC (myší IgG2b) byly získány od R&D Systems, Minneapolis, MN. Myší anti-pl9 monoklonální protilátka byla získána od Biolegend, San Diego, CA. Cy5 konjugovaný kozí . * ♦ 3 3 . *1 * “ H i ·, í « » -3 · í · * , · » ·4 ' anti-myší IgG (F(ab')2 fragment) byl získán z Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA. Streptavidin-fykoerytrin byl zakoupen od eBioscience, San Diego, CA.

Buněčné linie a podmínky kultivace: v příkladech byly použity buněčné linie lidské akutní monocytické leukémie ΊΉΡ-1 (ATCC číslo: TIB-202), lidské leukémie K-562 (ATCC číslo: CCL-243) a lidského T-buněčného lymfomu Jurkat (ATCC číslo: TIB-152). Buňky byly kultivovány v médiu RPMI-1640 (Sigma-AIdrich, St. Louis, MO) suplementovaném 10% fetálním telecím sérem (FCS) (GIBCO, Grand Island, N.Y.) a roztokem antibiotik a antimykotik (ATB) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).

Příprava rekombinantního IL-23R

Lidský gen pro receptor IL-23 se skládá z 10 exonů kódujících 629 aminokyselin receptorové molekuly. cDNA kódující extracelulární část (fragment Gly24-Asn350) lidského receptoru IL- 23 (IL-23R, GenBank: AF461422.1) byla amplifikována metodou PCR pomocí forward primeru IL23Rex-F-Nco-his (ATTACCATGGGCAGCAGCCACCATCATCATCATCACAGCAGCGGAATTACAAATA TAAACTGCTCTGG), obsahujícího startovní kodón a polyhistidinylovou sekvenci (His₆), a reverzního primeru IL23Rex-R-Xho (GGGCACCTTACTTCTGACAACTGACTCGAGATAT) nesoucího TGA stop kodón. Výsledný PCR produkt byl vložen do pET-28b vektoru (Novagen, Německo) za využití Ncol a Xhol klonovacích míst a vložen do buněk Escherichia coli TOP 10. Výsledný plasmid byl použit pro produkci proteinu v E. coli, kmene SHuffle (SHuffle T7 Express Competent E. coli, New England Biolabs, Ipswich, MA). Bakteriální buňky byly kultivovány v LB médiu s kanamycinem (60 pg/l) při 30 °C, produkce proteinu byla indukována přídavkem limM isopropyl-P-D-thiogalaktopyranosidu (IPTG) poté, co kultura dosáhla denzity ODgoo = 0,6, a buňky byly sklizeny centrifugací 4 hodiny po indukci. Protein byl extrahován po sonikaci v TN pufru (50 mM Tris, 150; mM NaCl, pH = 8,0) jako nerozpustný při fyziologickém pH. Sraženina proteinu byla zcentrifugována při 40000xg po dobu 20 minut a promyta TN pufrem, poté centrifugována a rozpuštěna v TN pufru obsahujícím 8M močovinu (50 mM Tris, 150ζ mM NaCl, 8M močovina, pH = 8,0). Pro zvýšení čistoty proteinu byla provedena Ni-NTA afínitní chromatografie a výsledný protein byl eluován v elučním pufru EB (50 mM Tris, 150» mM NaCl, 250 mM imidazolu, pH = 8,0) obsahujícím 4M močovinu (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 250 mM imidazolu, 4M močovina, pH - 8,0).

Pro produkci proteinu v periplasmě byla příslušná cDNA vložena po směru čtení (downstream) za pelB-vedoucí sekvenci do pET-26b vektoru (Novagen, Německo) s využitím stejných restrikčních míst jak je uvedeno výše a poté vložena do E. coli kmene BL21 (DE3). Kultura v LB médiu s kanamycinem (60 pg/l) byla pěstována při 30 °C do dosažení denzity ODóoo = 1,0, produkce proteinu byla indukována 1’mM IPTG a buňky byly sklizeny po 4 hodinách. Exprese vedla k produkci nerozpustného proteinu, který byl po sonikaci extrahován 8M močovinou v TN pufru a přečištěn na koloně s Ni-NTA-agarózou.

Produkce rekombinantní podjednotky pl9 cytokinu IL-23

Pro studium interakcí mezi IL-23R a IL-23 byly sestrojeny plasmidové konstrukty pro produkci pl9/IL-23 v bakteriích. Rekombinantní pl9/IL-23 (jeho vypočtená molámí hmotnost je 23,3 kDa) s N-terminálním dvojitým polyhistidylovým motivem His6 a TEV konzervativním štěpícím místem pro proteázu (tzv. DH-pl9 protein) byl připraven použitím syntetické, kodónově optimalizované pl9 kódující cDNA (GENEART, Německo), která byla vpravena do vektoru pET-28b klonováním s využitím Ncol+Xhol restrikčních míst. Vzniklý plasmid byl vložen do buněk E. coli Top 10, namnožen a sekvenováním ověřen. Protein byl poté produkován v hostitelských buňkách E. coli BL21(DE3). Kultivace přes noc v 50 ml média LB obsahujícím 60 pg/ml kanamycinu byla použita pro inokulaci 1 1 LB média a následnou kultivaci při 37 °C do dosažení ODóoo= 1,0. Kultura byla indukována 1 mM IPTG po dobu 4 h při 37 °C. Buňky byly sklizeny centrifugací (6000xg, 20 min), promyty TN pufrem (50<mM Tris pufř s 150jmM NaCl, pH = 8) a znovu centrifugovány (5000xg, 10 min). Pelety byly resuspendovány v 10 ml TN pufru a rozrušeny sonikátorem MISONIX 3000. Lyzáty byly centrifugovány 20 min při 40000xg a nerozpustný DH-pl9 byl extrahován z inkluzních tělísek 2 ml 8M močoviny v TN pufru. Močovinový extrakt byl ponechán třepat 1 h při laboratorní teplotě a centrifugován 20 min při 40000xg. Supematant byl aplikován na 1 ml Ni-NTA agarózovou kolonu ekvilibrovanou 5 ml TN pufru. Promývání bylo prováděno 10 ml TN pufru s 8M močovinou a poté TN pufrem obsahujícím 8M močovinu a 20 mM imidazol. DH-pl9 byl eluován TN pufrem obsahujícím 8M močovinu a 250 mM imidazol v 0,5 ml frakcích.

Alternativně byl rozpustný pl9 připraven z upraveného konstruktu DNA ve formě fuzního proteinu s cDNA proteinu vážícího maltózu (MBP) (Mal E) nesoucího dvojité His₆ značení na N-konci (vypočtená molámí hmotnost 69 kDa). Bylo zjištěno, že malE cDNA kódující MBP v kombinaci s modifikací na C-konci podporuje rozpustnost výsledného pl9-MBP fuzního proteinu. Sekvence pl9 byla vložena do vektoru odvozeného od pET-28b, nesoucího sekvenci

9 » * ♦ > * -» ♦ ‘ · i » 9 ·· 4·· » » · * kódující dvojitý polyhistidinylový tag za tvorby výsledné sekvence pro produkci proteinu Hisé-MBP-TEV-MCS-TEV-óxHis, a to s použitím primerů pl9-F-NheI (GGGCTAGCTAGCAGAGCTGTGCCTGGGGGC) a pl9-R-XhoI (GCGCCTCGAGGGGACTCAGGGTTGCTGCTC). Hostitelské buňky E.coli TOP 10 (Life Technologies, Carlsbad, CA) byly transformovány vektorem s klonovaným p 19 a vysety na LB agar suplementovaný 60 pg/ml kanamycinu. Protein byl produkován v E. coli BL21(DE3). K inokulaci 50 ml LB média obsahujícího 60 pg/ml kanamycinu byla použita jediná kolonie. 20 ml kultury pěstované přes noc bylo použito k inokulaci 1 1 kultivačního média a dále pěstováno při 37 °C do dosažení OD₆oo - 0,6. Kultura byla indukována IPTG při 20 °C a ponechána růst 4 h. Buňky byly sklizeny centrifůgací 20 min při 6000xg, promyty TN pufrem (pH = 8) a centrifugo vány 10 min při 5000xg. Pelety byly resuspendovány v 10 ml TN pufru a rozrušeny ultrazvukovými pulsy na sonikátoru MISONIX3000. Lyzáty byly centrifugovány 20 min při 40000xg. Cytoplasmatická frakce obsahující rozpustný DH-MBP-pl9 byla nalita na 5’ml HisTrap kolonu s Ni-NTA agarózou a přečištěrt na AKTA purifier (GE Healthcare, Británie). Eluce bylo provedena ve třech krocích s pufrem obsahujícím 250, 500 a 1000 mM imidazolu. Frakce o objemu 1,5 ml získané elucí 500 mM imidazolem byly ověřeny na SDS-PAGE a ty, které obsahovaly DH-MBP-pl9, byly sloučeny a použity dále.

ELISA test vazebné aktivity exIL-23R a pl9

Rekombinantní extracelulámí receptor IL-23 (exIL-23R) nebo protein pl9 byly imobilizovány přímo na NUNC Polysorp 96-jamkovou destičku zředěním ve vazebném pufru (lOOjmM

J.2.’ hydrogenuhličitanový/uhličitanový roztok, pH = 9,6) na koncentraci 5/10 pg/ml a inkubovány za nízké teploty (cca 7°C) přes noc. Další den byla destička omyta PBS pufrem obsahujícím 0,05% Tweenu (PBST) a blokována 1% BSA rozpuštěným ve stejném roztoku (PBSTB). V případě imobilizace exIL-23R (E. coli SHuffle a BL21 (DE3)) byl tento receptor v 4M močovinovém roztoku zředěn alespoň 20x ve vazebném pufru; a přečištěné rekombinantní proteiny DH-MBP-pl9 i DH-pl9 byly aplikovány v sériovém ředění v PBSTB a detegovány za použití kozí polyklonální protilátky proti lidskému IL-23 (anti-pl9) a následně myšího anti• kozího konjugátu IgG-křenové peroxidázy (HRP) (BioLegend, San Diego, CA), obojí zředěno v PBSTB 1:1000. Vazba exIL-23R k imobilizovanému DH-MBP-pl9 byla detegována pomocí kozí polyklonální protilátky anti-IL-23R (1:250) a následně sekundárního králičího anti-kozího konjugátu s HRP (1:1000) (R&D Systems, Minneapolis, MN).

» · -9 i · · » · » i 9 i i >

* f · 4 · ‘ « · » » · · · f

Všechny experimenty ELISA byly vizualizovány enzymatickou reakcí HRP s OPD substrátem (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) v citrátovém pufru (3,31% dihydrátu-citrátu trisodného, fosforečná kyselina, pH = 5,0), reakce byla zastavena 2M kyselinou sírovou a byla měřena absorbance při 492 nm.

Pomocí ELISA, kde byly imobilizované proteiny exIL-23R testovány na vazbu pl9, bylo ověřeno, že oba rekombinantní exIL-23R proteiny rozeznávají pl9 protein. Jak je ukázáno na obr. 1, rozpustný DH-MBP-pl9 se váže na imobilizovaný produkt H-exIL23R s vysokou afinitou. Tento výsledek byl potvrzen i inverzním provedením ELISA, kde byl imobilizován DH-MBP-pl9, a také ELISA testy, kde byl protein DH-MBP-pl9 zaměněn za refoldovaný DH-pl9. Obě varianty proteinů pl9 vázaly také pelB-H-exIL-23R. Kombinace všech dat ukazuje, že refolding H-exIL-23R je dostačující pro to, aby byl protein rozpoznán pl9, a tedy může být používán jako cíl pro selekci IL-23R-specifických vazebných molekul.

Konstrukce ABD knihovny a selekce pomocí ribozomálního displeje

Kombinatoriální knihovna DNA o teoretické komplexitě 10¹⁴ variant proteinů byla vytvořena metodami popsanými dříve (Ahmad JN et al.: Proteins 2012;80(3):774-789). Sestavená knihovna byla transkribována/translatována in vitro v jediném kroku pomocí extraktu E. coli (EasyXpress Protein Synthesis Mini Kit, QIAGEN, Německo) a použita pro selekci přeložených vazebných proteinů pomocí metody ribozomálního displeje. Pro selekci vazebných proteinů byly jamky na Maxisorp destičce (NUNC, Dánsko) pokryty rekombinantním IL-23R, vyprodukovaným kmenem E. coli SHuffle (DH-exIL-23R) a blokovány 3% BSA. Preselekce byla prováděna v jamkách pokrytých jen BSA. Dvě skupiny cDNA vazebných proteinů ABD přepsaných po třetím nebo pátém kole selekčního procesu byly klonovány mezi restrikční místa Ncol a Xhol ve vektoru pET-28b obsahujícím vloženou úplnou sekvenci tolA cDNA, a transformovány do hostitelských buněk E. coli TOPIO. Dále byla na C-konec tolA přidána sekvence AviTag (GLNDIFEAQKIEWHE), umožňující in vivo biotinylaci na lysinu a vazbu streptavidinu. Sekvence AviTag byla vložena pomocí PCR s forward primerem EWT5-ABDforl (TTCCTCCATGGGTATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACTTAGCTGAAGCT AAAGTCTTA) a reverzním primerem tolA-AVIrevl (TTTCCGCTCGAGCTATTCGTGCCATTCGATTTTCTGAGCCTCGAAGATGTCGTTCA GGCCCGGTTTGAAGTCCAATGGCGC). Finální fuzní vazebné proteiny 6xHis-ABD-TolA• AviTag byly připraveny jako biotinylované proteiny v kmeni Escherichia coli BL21 (DE3) « » .»· · ·

BirA exprimujícím biotin ligázu (BirA). Bakteriální buňky byly kultivovány v LB médiu obsahujícím kanamycin (60 pg/ml) a 5Ο’'μΜ d-biotinU (připraven 5,mM roztok v 10) mM bicinovém pufru, pH - 8.3). Produkce proteinů byla indukována přidáním 2;mM IPTG poté, co ·>

kultura dosáhá denzity ODďoo = 0,6. Kultura byla sklizena 4 hodiny po indukci, sonikována v Tris pufru (50-mM Tris, 150’mM NaCl, pH = 8,0), centrifugována a protein byl pak přečištěn na koloně s Ni-NTA agarózou.

Byla identifikována sada vazebných polypeptidů vážících se na rekombinantní H-exIL-23R. Aby bylo možno produkovat in vivo biotinylované varianty ABD potřebné pro ověření vazebné afinity metodou ELISA, byly varianty ABD nalezené po třetím nebo pátém kole selekčního procesu modifikovány vložením Avitag sekvence po směru přepisu (downstream) od C-konce TolA.

Dále byly testovány následující sekvence vazebných polypeptidů:

LAEAKVLANRELDKYGVSDKYKNGINNALCVRRVKALIDWILAYLP (SEQ. ID NO. 20) (REX001) LAEAKVLANRELDKYGVSDTYKNDINAASYVPAVKWAIDRILASLP (SEQ. ID NO. 21) (REX005) LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNRINPACHVLSVKSNIDWILASLP (SEQ. ID NO. 22) (REX009) LAEAKVLANRELDKYGVSDVYKNTINIAIPVRWKRVIDWILAVLP (SEQ. ID NO. 23) (REX115) LAEAKVLTNRELDKYGVSDAYKNLINAALIVAKVKLLIDAILAPLP (SEQ. ID NO. 24) (REX122) LAEAKVLANRELDKYGVSDHYKNWINPARRVRPVKWLIDAILAALP (SEQ. ID NO. 25) (REX125) LAEAKVLANRELDKYGVSDRYKNSINRALPVAAVKWALDLILAWLP (SEQ. ID NO. 26) (REX128) LAEAKVLANRELDKYGVSDWYKNCITAARAVTTVKLLIDTILALLP (SEQ. ID NO. 27) (REX129) LAEAKVLANRELDKYGVSDHYKNPINVAWTVGRVKVWIDAILAPLP (SEQ ID NO. 28) (REX012) LAEAKVLANRELDKYGVSDPYKNPINCACPVTEVKPPIDAILALLP (SEQ. ID NO. 29) (REX016) LAEAKVLANRELDKYGVSDHYKNSINPAPQVIWKVNIDLILAGLP (SEQ. ID NO. 30) (REX101) LAEAKVLANRELDKYGVSDRYKNWINRAWLVALVKRQIDQILALLP (SEQ. ID NO. 31) (REX107) LAEAKVLANRELDKYGVSDEYKNAINAANPVSGVKRPIDVILAALP (SEQ. ID NO. 32) (REX108) LAEAKVLANRELDKYGVSDHYKNSINPAFKVHSVKMGIDWILAGLP (SEQ. ID NO. 33) (REX127) LAETKVLANRELDKYGVSDWYKNRINTALTVACVKLVIDWILAALP (SEQ. ID NO. 34) (REX136).

Konstrukce a produkce proteinu ABD divokého typu (ABDwt)

Pro všechny vazebné testy byl používán fuzní protein TolA s původní albumin-vazebnou doménou (ABDwt) jako negativní kontrola. Konstrukce ABDwt se sekvencemi TolA a AviTag (6xHis-ABDwt-TolA-AVI) byla provedena PCR amplifíkací s ABDwt-tolA plasmidovou

DNA jako templátem, forward primerem EWT5-ABDforl (viz výše) a reverzním primerem ABDrev (TTACTAGGATCCAGGTAATGCAGCTAAAATTTC). Amplifikovaný produkt PCR byl štěpen enzymy Ncol a BamHI a ligován do vektoru pET-28b nesoucího sekvenci tolA-AVI po směru (downstream) od BamHI. Výsledný exprimovaný protein ABDwt-TolA- AVI byl produkován a přečištěn stejným způsobem jako modifikované varianty, jak je popsáno výše.

Screening vazebných variant IL-23R metodou ELISA

Pro vazebné testy byly použity vybrané klony a vkládaná sekvence byla ověřena restrikční analýzou (Ncol, BamHI, Xhol) a DNA sekvenováním. Klony obsahující správnou sekvenci 6xHis-ABD-TolA-AviTag byly použity pro izolaci plasmidové DNA a následnou transformaci kmene E. coli BL21 (DE3) BirA. Pro ELISA analýzu produkovaných modifikovaných variant ABD byl použit buněčný lyzát klonů připravený podle dříve popsaného protokolu (Ahmad JN et al.: Proteins 2012;80(3):774-789) nebo přečištěné proteiny. Byla použita dvě různá sendvičová uspořádání. V prvním případě byla destička NUNC Polysorp přímo pokryta proteinem exIL-23R (5 pg/ml, rekombinantní varianta produkována v kmenu E. coli SHuffle) ve vazebném pufru za nižší teploty (cca 7°C) přes noc. Další den byla destička omyta pufrem PBST a jamky byly blokovány PBSTB. Vzorky lyzátů REX variant v PBSTB nebo varianty přečištěných proteinů a kontrolní ABDwt byly aplikovány v sériovém ředění v PBSTB a vázané biotinylované REX klony byly detegovány konjugátem streptavidinu-HRP naředěném ve stejném pufru 1:1000 (Pierce). V druhém případě byla destička pokryta streptavidinem (1 pg/ml) ve vazebném pufru a blokována stejným způsobem. Biotinylované varianty modifikovaného ABD naředěné v PBSTB na koncentraci 5 pg/ml byly imobilizovány streptavidinem. exIL-23R v roztoku 4M močoviny byl naředěn 20x a pak dále vždy 3x, takže byla připravena série ředění proteinu v PBSTB a vazba receptoru k variantám modifikovaného ABD byla detegována kozí polyklonální protilátkou anti-exIL-23R (1:250) a následně sekundárním králičím anti-kozím HRP konjugátem (1:1000) (R&D Systems, Minneapolis, MN). Metodou ELISA testované pozitivní buněčné lyzáty klonů polypeptidů podle předkládaného vynálezu s TolA-AVI sekvencemi byly použity pro další analýzu.

Kompetiční ELISA stanovení

Destičky Maxisorp nebo Polysorp (NUNC, Denmark) byly pokryty H-exIL-23R vyprodukovaným v kmeni E. coli SHuffle nebo periplasmatickým pelB-exIL-23R vyprodukovaným v E. coli BL21(DE3), a vazba DH-MBP-pl9 nebo DH-pl9 jako analytů byla detegována pomocí protilátek, jak bylo popsáno výše. Alternativně byly destičky pokryty DH- MBP-pl9 nebo DH-pl9 a byla detegována vazba receptorových variant pomocí odpovídajících protilátek. V obou uspořádáních experimentu byla použita konstantní koncentrace každého analytu (20‘nM DH-MBP-pl9, 50 nM DH-pl9, 60jnM oba exIL-23R) v roztoku v PBSTB, z níž byly sériovým ředěním připravovány vzorky pro kompetici s testovanými modifikovanými ABD proteiny. Dvě nejúčinněji inhibující varianty, REX009 a REX125, byly testovány na imobilizovaném rekombinantním IL-23R Fc chimémím proteinu (R&D Systems, Minneapolis, MN) produkovaném buněčnou linií myšího myelomu. Destička Polysorp byla pokryta 1 až 2 pg/ml IL-23R chimémího proteinu naředěného ve vazebném pufru, a DH-MBP-pl9 (20 mM) nebo lidský cytokin IL-23 (23AM) (R&D Systems, Minneapolis, MN) byl následně použit pro kompetici s REX009 a REX 125 obsahujícími klony.

Na základě výsledků vazebných testů byla dále zkoumána schopnost nej lepších modifikovaných ABD proteinů inhibovat vazbu pl9/IL-23R. Zde byla použita kompetiční ELIS A s imobilizo váným H-exIL-23R a konstantním množstvím DH-MBP-pl9 analytu s různými koncentracemi modifikovaných ABD proteinů-TolA-AVI. Zjistili jsme, že 11 variant vykazuje inhibicí vazby pl9 v mikromolámích koncentracích, a dvě nej lepší varianty, REX009 a REX 125, dokonce v nanomolámích koncentracích. Výsledky kompetiční ELIS A pro 10 nej lepších modifikovaných ABD proteinů jsou ukázány na obr. 5. Pro ověření inhibičního potenciálu polypeptidů podle předkládaného vynálezu byla zopakována kompetiční ELISA i v opačném uspořádání, která potvrdila výsledky.

Ověření stability proteinů pomocí stanovení posunu teplotní denaturace na bázi fluorescenční detekce

Vzorky proteinů (0,1 mg/ml) v HEPES pufru a činidlo 5x Sypro Orange (Sigma-Aldrich, St

Louis, MO, USA) byly smíchány do finálního objemu 25’μΐ. Pomocí real-time PCR Detection

Systém CFX96 Touch (Bio-Rad Laboratories, USA) byly proteiny inkubovány v teplotním gradientu od 2oj^( do 8Q°C s přírůstkem teploty 0,5°C v intervalu 30s. Stupeň rozbalení proteinů byl sledován kanálem FRET (fluorescence resonance energy transfer), který zachycoval spektrální vlastnosti komplexů Sypro Orange s rozbaleným proteinem (excitační vlnová délka -470 nm a emisní vlnová délka -570 nm). Data byla analyzována softwarem CFX Manager a,bedy taní byly stanoveny pomocí první derivace spektra.

Detekce IL-23R na povrchu buněk a vazba modifikovaných ABD proteinů a pl9/IL-23 k buněčným liniím

Všechna stanovení byla prováděna v pufru HBSS (lOinM HEPES, pH 7,4, 140'mM NaCl, 5j ' ·* mM KC1) doplněném 2 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂ a 1% (v/v) FCS (cElBSS) na 96-jamkových kultivačních destičkách (NUNC, Roskilde, Denmark). Barvení molekul IL-23R na buněčném povrchu bylo prováděno tak, že bylo 30 min při 4j°C inkubováno 5 x 10⁵ buněk v 50 μΐ pufru cHBSS obsahujícího anti-lidský IL-23R-APC (ředění 1:5) nebo monoklonální protilátky isotypové kontroly-APC (ředění 1:5). Ve vazebných stanoveních pro modifikované ABD proteiny bylo inkubováno 5 x 10⁵ buněk ve 100 μΐ pufru cHBSS s biotinylovanými modifikovanými ABD proteiny nebo ABD kontrolami (10 pg/ml) po dobu 30 min při 4 °C, promyto cHBSS, a na buňkách vázaný komplex modifikovaného ABD proteinu s biotinem nebo ABD-biotin byl barven streptavidin-phycoerythrinem (ředění 1:400) po dobu 30 min při 4 °C. Při vazebném stanovení s DH-pl9 bylo inkubováno 5 x 10⁵ buněk ve 100 μΐ cHBSS s nebo bez DH-pl9 (10 pg/ml) po dobu 30 min při 4 °C. Buňky byly promyty cHBSS a na buňkách vázaný DH-pl9 byl barven myší monoklonální protilátkou proti pl9 (ředění 1:50) po dobu 30 min při 4 °C a po promytí dále kozí anti-myší prolátkou IgG značenou Cy5 (ředění 1:50) po dobu 30 min při 4 °C.

Buňky byly promyty, resuspendovány v 100 μΐ HBSS a analyzovány průtokovou cytometrií na přístroji FACS LSR II (BD Biosciences, San Jose, CA) v přítomnosti 5 pg/ml propidium jodidu. K vyloučení buněčných agregátů a mrtvých buněk byly použity odpovídající nastavení parametrů pro třídění buněk a vazebná data byla stanovena na základě průměrných intenzit fluorescence (MFI).

DH-pl9 blokování vazby modifikovaných ABD proteinů k buňkám THP-1

Blokování vazby modifikovaných ABD proteinů k buňkám k molekule receptoru IL-23 proteinem DH-pl9 bylo zkoumáno tak, že buňky THP-1 (2 x 10⁵) byly preinkubovány po dobu 15 min při 4 °C v přítomnosti sériově ředěného DH-pl9 v 50 μΐ pufru cHBSS. Biotinylované klony REX-TolA-AVI nebo ABD-WT-TolA-AVI jako negativní kontrola v 50 μΐ pufru cHBSS v konečné koncentraci 13 nM byly přidány k buňkám ve stálé přítomnosti DH-pl9 a inkubovány při 4 °C po dobu 30 min. Buňky byly promyty cHBSS a na buňce vázané biotinylované modifikované ABD proteiny nebo ABDwt byly detegovány konjugátem streptavidinu-fykoerytrinu (ředění 1:400) po dobu 30 min při 4 °C. Buňky byly promyty, resuspendovány v 100 μΐ HBSS a analyzovány průtokovou cytometrií jak je popsáno výše.

* Λ

Testování T-buněk produkujících IL-17 pomocí anti-CD3 stimulace PBMC

Neseparované buňky periferní krve odebrané do zkumavek obsahujících EDTA byly použity pro získání přečištěných mononukleámích buněk (PBMCs) za použití Ficoll-Paque (Pharmacia, Uppsala, Sweden). PBMCs byly jednou promyty PBS a resuspendovány v úplném médiu RPMI 1640 (RPMI 1640 suplementované 10% tepelně inaktivovaným FCS, lOOU/ml penicilinem, 100 pg/ml streptomycin sulfátem a 1,7'mM glutamátem sodným). Buňky PBMC byly vyředěny na koncentraci 2x 10⁶ buňek/ml a aktivovány na 96-jamkové destičce předem potažené anti-CD3 (MEM-57, 10 pg/ml, Exbio Praha a.s., Praha) v přítomnosti kostimulačních protilátek (CD28/CD49d, Ipg/ml, BD Biosciences, San Jose, CA, USA), IL-23 (10 ng/ml), IL2 (100 U/ml). Do každé jamky buď nebyl přidán žádný inhibitor^ nebo byly přidány modifikované ABD proteiny REX009, REX125, REX128 nebo kontrola ABDwt REXWT (7pg/ml), a buňky byly inkubovány tři dny při 37 °C. Pak byly buňky ponechány stát přes noc při 37 °C v čerstvých jamkách. Další ráno byly buňky restimulovány v jamkách předem pokrytých protilátkou anti-CD3 (10pg/ml, Exbio Praha, Praha) a znovu byly přidány kostimulační protilátky (CD28/CD49d, 1 pg/ml, BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Buňky byly inkubovány 2 h při 37 °C. Poté byl do každé jamky přidán brefeldin A (10 pg/ml, SigmaAldrich, St Louis, MO, USA). Stimulace pokračovala další 4 h při 37 °C. Po inkubaci byly buňky barveny protilátkami proti CD8 Horizon V-500 (BDB) po dobu 15 min ve tmě. Buňky byly pak promyty promývacím pufrem (PBS obsahující 0.1% azidu· sodnéhé a 2% želatiny(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) a fixovány pomocí lyzačního roztoku pro FACS/FACS Perm 2 (BDB) podle instrukcí výrobce. Po fixaci a permeabilizaci byly buňky promyty a barveny CD3 PerCP-Cy5.5 (eBioscience, San Diego, CA, USA), CD4 ECD (Immunotech, Marseille, France) a intracelulámími markéry lidského interferonu-γ PE Cy7, IL2 APC, IL17 PB (eBioscience) a CD 154 PE (Immunotech). Buňky pak byly znovu promyty a měřeny na průtokovém cytometru FACS ARIA II (BDB). Pomocí trubiček BD Truecount (BDB) naplněných známým množstvím referenčních perliček byly získány absolutní počty buněk, a buňky byly barveny Syto-16 a DAPI (Invitrogen).

I « · · « · » · · * » « r

Sequence Listing abd_ST25 SEQUENCE LISTING

<110>	Biotechnologický ústav AV ČR, v. v. i.
<120>	Polypeptidy pro léčbu autoimunitnich chorob založenou na blokaci receptoru pro lidský cytokin il-23
<130>	P
<160>	34
<170>	Patentin versi on 3.5
<210>	1
<211>	27
<212>	PRT
<213>	artificial
<220> <223>	modified ABD sequence
<400>	1
Lys Tyr Lys Asn Gly ile Asn Asn Ala Leu Cys val Arg Arg val Lys

10 15

Ala Leu ile Asp Trp ile Leu Ala Tyr Leu Pro

25 <210> 2 <211> 27 <212> PRT <213> artificial <220>

<223> modified ABD sequence <400> 2

Thr Tyr Lys Asn Asp Ile Asn Ala Ala Ser Tyr Val Pro Ala Val Lys 15 10 15

Trp Ala ile Asp Arg ile Leu Ala Ser

Leu

Pro <210> 3 <211> 27 <212> PRT <213> artificial <220>

<223> modified ABD sequence <400>3

Tyr Tyr Lys Asn Arg Ile Asn Pro Ala Cys His val Leu Ser Val Lys

1015 ser Asn ile Asp Trp Ile Leu Ala

Leu Pro <210>4

Stránka 1

Ser

lit <211> 27 <212> PRT <213> artificial

Sequence Listing ABD_ST25 <22O>

<223> modified ABD sequence <400>4

Val Tyr Lys Asn Thr ile Asn ile Ala 11e Pro Val Arg val Val Lys 15 1015

Arg val ile Asp Trp Ile Leu Ala val Leu Pro

2025 <210>5 <211>27 <212> PRT <213> artificial <220>

<223> modified ABD sequence <400>5

Ala Tyr Lys Asn Leu ile Asn Ala Ala Leu ile val Ala Lys val Lys 15 1015

Leu Leu ile Asp Ala ile Leu Ala Pro Leu Pro

2025 <210> 6 <211>27 <212> PRT <213> artificial <220>

<223> modified ABD sequence <400>6

His Tyr Lys Asn Trp ile Asn Pro Ala Arg Arg Val Arg pro val Lys

1015

Trp Leu ile Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 2025 <210>7 <211>27 <212> PRT <213> artificial <22O>

<223> modified ABD sequence <400> 7

Arg Tyr Lys Asn Ser Ile Asn Arg Ala Leu Pro Val Ala Ala Val Lys 15 10 15

Trp Ala Leu Asp Leu Ile Leu Ala Trp Leu Pro

Stránka 2 * »

	20	Sequence Listing ABD_ST25 25
<210>	8
<211>	27
<212>	PRT
<213>	artificial
<220>
<223>	modified ABD	sequence

<400> 8
Trp Tyr	Lys	Asn	Cys	Ile	Thr	Ala	Ala	Arg	Ala val	Thr Thr val Lys
1			5					10		15
Leu Leu	ile	Asp	Thr	ile	Leu	Ala	Leu	Leu	pro
		20					25

<210> 9 <211> 27 <212> PRT <213> artificial <22O>

<223> modified abd sequence <400> 9

His Tyr Lys Asn Pro ile Asn val Ala Trp Thr val Gly Arg val Lys

10 15 val Trp ile Asp Ala ile Leu Ala

Pro

Leu

Pro <210> 10 <211> 27 <212> PRT <213> artificial <220>

<223> modified ABD sequence <400> 10

Pro Tyr Lys Asn Pro Ile Asn Cys Ala Cys Pro val Thr Glu val Lys

10 15

Pro Pro ile Asp Ala ile Leu Ala Leu

Leu

Pro <210> 11 <211> 27 <212> PRT <213> artificial <220>

<223> modified ABD sequence <400> 11

His Tyr Lys Asn ser ile Asn Pro Ala Pro Gin val ile Val val Lys Stránka 3

Sequence Listing abd_ST25

15

Val Asn lle Asp Leu lle Leu Ala Gly Leu

Pro <210> 12 <211> 27 <212> PRT <213> artífícial <220>

<223> modified abd sequence <400>12

Arg Tyr Lys Asn Trp ile Asn Arg Ala Trp Leu val Ala Leu val Lys

1015

Arg Gin ile Asp Gin ile Leu Ala Leu Leu Pro

2025 <210>13 <211>27 <212> PRT <213> artificíal <220>

<223> modified ABD sequence <400>13

Glu Tyr Lys Asn Ala ile Asn Ala Ala Asn Pro Val ser Gly val Lys

1015

Arg Pro Ile Asp val ile Leu Ala Ala Leu Pro <210>14 <211>27 <212> PRT <213> artificíal <220>

<223> modified abd sequence <400> 14

His Tyr Lys Asn Ser ile Asn Pro Ala Phe Lys Val His Ser val Lys

10 15

Met Gly ile Asp Trp

Ile Leu Ala Gly

Leu Pro

<210> <211> <212> <213>	15 27 PRT artificíal
<220> <223>	modified ABD sequence

Stránka 4 · · · ♦ * * « « · * ♦ · • « * < t

Sequence Listing ABD_ST25 <400>15

Trp

Tyr

Lys

Asn

Arg

ile

Asn

Thr

Ala

Leu

Thr

Val

Ala

cys

val

Lys

1

5

10

15

Leu

Val

ile

Asp

Trp

Ile

Leu

Ala

Leu

Pro

20

25

<210>

16

<211>

46

<212>

PRT

<213>

Streptococcus

; sp.

<400>

16

Leu

Ala

Glu

Ala

Lys

val

Leu

Ala

Asn

Arg

Glu

Leu

Asp

Lys

Tyr

Gly

1

5

10

15

val

Ser

Asp

Tyr

Lys

Asn

Leu

Ile

Asn

Ala

Lys

Thr

val

Glu

20

25

30

Gly

val

Lys

Ala

Leu

Ile

Asp

Glu

Ile

Leu

Ala

Leu

Pro

35

40

45

<210>17 <211>19 <212> PRT <213> artificial <220>

<223> modified ABD sequence <400> 17

Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly

10 15 val Ser Asp

<210> <211> <212> <213>	18 19 PRT artificial
<220> <223>	modified ABD sequence
<400>	18

Leu Ala Glu Ala Lys Val

5

Leu Thr Asn Arg Glu

Leu Asp Lys Tyr Gly val Ser Asp

<210>	19
<211>	19
		Stránka 5

» • · <212> PRT <213> artificial

Sequence Listing ABD_ST25 <22O>

<223> modified ABD sequence <400>19

Leu Ala Glu Thr Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly

1015 val Ser Asp

<210>	20
<211>	46
<212>	PRT
<213>	artificial
<220>
<223>	modified ABD sequence

<400> 20

Leu

Ala

Glu

Ala

Lys

Val

Leu

Ala

Asn

Arg

Glu

Leu

Asp

Lys

Tyr

1

5

10

15

val

Ser

Asp

Lys

Tyr

Lys

Asn

Gly

ile

Asn

Ala

Leu

cys

Val

20

25

30

Arg

val

Lys

Ala

Leu

ile

Asp

Trp

Ile

Leu

Ala

Tyr

Leu

Pro

40 45 <210> 21 <211>46 <212> PRT <213> artificial <22O>

<223> modified ABD sequence <400> 21

Leu

Ala

Glu

Ala

Lys

Val

Leu

Ala

Asn

Arg

Glu

Leu

Asp

Lys

Tyr

Gly

1

5

10

15

val

Ser

Asp

Thr

Tyr

Lys

Asn

Asp

Ile

Asn

Ala

Ser

Tyr

Val

Pro

20

25

30

Ala

val

Lys

Trp

Ala

Ile

Asp

Arg

ile

Leu

Ala

Ser

Leu

Pro

40 45

<210> <211> <212> <213>	22 46 PRT artificial
<220> <223>	modified ABD sequence

Stránka 6

Sequence Listing ABD_ST25 <400> 22

Leu Ala

Glu Ala

Lys

val

Leu

Ala

Asn

Arg

Glu

Leu

Asp

Lys

Tyr

Gly

1

5

10

15

Val ser

Asp Tyr

Tyr

Lys

Asn

Arg

Ile

Asn

Pro

Ala

cys

His

Val

Leu

20

25

30

Ser val

Lys Ser

Asn

ile

Asp

Trp

Ile

Leu

Ala

ser

Leu

Pro

35

40

45

<210>

23

<211>

46

<212>

PRT

<213>

artificial

<220>

<223>

módi fi ed

ABD

sequence

<400>

23

Leu Ala

. Glu Ala

Lys

Val

Leu

Ala

Asn

Arg

Glu

Leu

Asp

Lys

Tyr

Gly

1

5

10

15

Val Ser

Asp val

Tyr

Lys

Asn

Thr

Ile

Asn

ile

Ala

ile

Pro

val

Arg

20

25

30

Val val

Lys Arg

Val

Ile

Asp

Trp

Ile

Leu

Ala

Val

Leu

Pro

35

40

45

<210>

24

<211>

46

<212>

PRT

<213>

arti fi ci al

<220>

<223>

módi fi ed

ABD

sequence

<400>

24

Leu Ala

Glu Ala

Lys

Val

Leu

Thr

Asn

Arg

Glu

Leu

Asp

Lys

Tyr

Gly

1

5

10

15

val ser

Asp Ala

Tyr

Lys

Asn

Leu

ile

Asn

Ala

Leu

ile

val

Ala

20

25

30

Lys val

Lys Leu

Leu

Ile

Asp

Ala

Ile

Leu

Ala

Pro

Leu

Pro

35

40

45

<210> <211> <212> <213>	25 46 PRT artificial
<220> <223>	modified ABD sequence
<400>	25

Stránka 7

I

Gly

Tyr , i. 't is «·.

II» c « *

Leu Ala Glu Ala 1

Lys Val 5

Leu

Sequence Ala Asn

Li sti ng Arg Glu 10

ABD_ST25 Leu Asp Lys

val Ser

Asp

H1 S

Tyr

Lys

Asn

Trp

Ile

Asn

Pro

Ala

Arg

20

25

30

Pro Val

Lys

Trp

Leu

11 e

Asp

Ala

Ile

Leu

Ala

Leu

Pro

35

40

45

<210>

26

<211>

46

<212>

PRT

<213>

artificial

<220>

<223>

modified

ABD

sequence

<400>

26

Leu Ala

Glu

Ala

Lys

val

Leu

Ala

Asn

Arg

Glu

Leu

Asp

Lys

1

5

10

Val Ser

Asp

Arg

Tyr

Lys

Asn

Ser

ile

Asn

Arg

Ala

Leu

Pro

20

25

30

Ala Val

Lys

Trp

Ala

Leu

Asp

Leu

Ile

Leu

Ala

Trp

Leu

Pro

35

40

45

<210>

27

<211>

46

<212>

PRT

<213>

artificial

<22O>

<223>

modified

ABD

sequence

<400>

27

Leu Ala

Glu

Ala

Lys

val

Leu

Ala

Asn

Arg

Glu

Leu

Asp

Lys

1

5

10

Val Ser

Asp

Trp

Tyr

Lys

Asn

cys

ile

Thr

Ala

Arg

Ala

20

25

30

Thr val

Lys

Leu

ile

Asp

Thr

ile

Leu

Ala

Leu

Pro

35

40

45

Val val

Val

Tyr

Arg

Gly

Ala

Gly

Thr

<210>	28
<211>	46
<212>	PRT
<213>	artifi ci al
<220> <223>	modified ABD sequence

<400> 28

Leu Ala Glu Ala	Lys Val	Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly
1	5	10 Stránka 8	15

* l 4 * * ¹ ' ; { tt «. β í < 9 t « » l 9 t ti

Sequence

val Ser Asp His	Tyr	Lys Asn	Pro	Ile 25
	20
Arg val	Lys	Val	Trp	ile	Asp	Ala	Ile
	35					40
<210>	29
<211>	46
<212>	PRT
<213>	artificial
<22O>
<223>	modified	ABD	sequence
<400>	29
Leu Ala	L Glu	Al a	Lys	val	Leu	Ala	Asn
1			5
Val Ser	' Asp	Pro	Tyr	Lys	Asn	Pro	Ile
		20					25
Glu Val	Lys	Pro	Pro	ile	Asp	Ala	Ile
	35					40
<210>	30
<211>	46
<212>	PRT
<213>	artificial
<220>
<223>	modified	ABD	sequence
<400>	30
Leu Ala	L G1U	Ala	Lys	val	Leu	Ala	Asn
1			5
Val Ser	' Asp	His	Tyr	Lys	Asn	Ser	Ile
		20					25
val val	Lys	Val	Asn	ile	Asp	Leu	ile
	35					40
<210>	31
<211>	46
<212>	PRT
<213>	artificial
<220>
<223>	módi fi ed	ABD	sequence
<400>	31
Leu Ala	Glu	Ala	Lys	val	Leu	Ala	Asn
1			5

ABD_ST25

Ala Trp Thr Val Gly

Pro Leu Pro

Leu Asp Lys Tyr Gly

Ala Cys Pro Val Thr

Leu Leu Pro

Leu Asp Lys Tyr Gly

Ala Pro Gin Val Ile

Gly Leu Pro

Leu Asp Lys Tyr Gly

Stránka 9 sequence Listing ABD_ST25

Val Ser Asp Arg Tyr Lys Asn Trp 11e Asn Arg Ala Trp Leu Val Ala 20 2530

Leu Val

Lys Arg Gin 11e Asp Gin ile Leu Ala Leu Leu Pro 35 4045 <210>32 <211>46 <212> PRT <213> artificial <220>

<223> modified ABD sequence <400> 32

Leu Ala Glu Ala Lys val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly 15 10 15

val

Ser

Asp

Glu

Tyr

Lys

Asn

A1 a

ile

Asn

Ala

Asn

Pro

20

25

30

Gly

val

Lys

Arg

Pro

ile

Asp

val

Ile

Leu

Ala

Leu

Pro

35

40

45

Ser <210> 33 <211> 46 <212> PRT <213> artificial <22O>

<223> modified ABD sequence <400> 33

Leu Ala Glu Ala Lys val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly 15 10 15 val

Ser Asp His Tyr Lys Asn

Ser ile Asn

Pro Ala Phe Lys val

His

Ser val

Lys Met Gly ile Asp Trp ile Leu Ala Gly Leu Pro 35 4045 <210>34 <211>46 <212> PRT <213> artificial <220>

<223> modified ABD sequence <400> 34

Leu Ala Glu Thr Lys val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly 15 10 15 val

Ser Asp Trp Tyr Lys Asn Arg 20

Ile Asn Thr Ala Leu Thr Val Ala

30

Stránka 10

Sequence Listing ABD_ST25 cys val Lys Leu val ile Asp Trp ile Leu Ala Ala Leu Pro

40 45

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Polypeptid, obsahující sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující: KYKNGINNALCVRRVKALIDWILAYLP (SEQ. ID NO. 1) TYKNDINAASYVPAVKWAIDRILASLP (SEQ. ID NO. 2) YYKNRINPACHVLSVKSNIDWILASLP (SEQ. ID NO. 3) VYKNTINIAIPVRVVKRVIDWILAVLP (SEQ. ID NO. 4) AYKNLINAALIVAKVKLLIDAILAPLP (SEQ. ID NO. 5) HYKNWINPARRVRPVKWLIDAILAALP (SEQ. ID NO. 6) RYKNSINRALPVAAVKWALDLILAWLP (SEQ. ID NO. 7) WYKNCITAARAVTTVKLLIDTILALLP (SEQ. ID NO. 8) HYKNSINPAPQVIVVKVNIDLILAGLP (SEQ. ID NO. 11) RYKNWINRAWLVALVKRQIDQILALLP (SEQ. ID NO. 12) EYKNAINAANPVSGVKRPIDVILAALP (SEQ. ID NO. 13) WYKNRINTALTVACVKLVIDWILAALP (SEQ. ID NO. 15) přičemž na N-konci uvedené sekvence je přímo připojena sekvence mající alespoň 80% sekvenční identitu se sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující LAEAKVLANRELDKYGVSD (SEQ ID NO. 17)

LAEAKVLTNRELDKYGVSD (SEQ ID NO. 18) LAETKVLANRELDKYGVSD (SEQ ID NO. 19), přičemž asociační a disociační rovnováha vazby uvedeného polypeptidu na receptor pro lidský cytokin IL-23 charakterizovaná vazebnou afinitní konstantou Kq vykazuje hodnotu menší než 10’⁷ M.
2. Sekvence DNA vybraná ze skupiny zahrnující komplementární DNA kódující aminokyselinovou sekvenci polypeptidů podle nároku 1 a DNA hybridizující s uvedenou komplementární DNA za vysoce stringentních podmínek.
3. Použití sekvence DNA podle nároku 2 pro přípravu polypeptidů podle nároku 1 produkovaných v bakteriálních, kvasinkových, hmyzích, savčích nebo lidských hostitelských buňkách.
4. Hostitelské buňky obsahující komplementární sekvenci DNA podle nároku 2 kódující aminokyselinovou sekvenci polypeptidů podle nároku 1.
5. Polypeptid podle nároku 1 pro použití v medicíně.
6. Polypeptid podle nároku 1 pro použití v léčbě autoimunitních chorob.
7. Polypeptid podle nároku 1 pro použití v léčbě autoimunitních chorob vybraných ze skupiny zahrnující psoriázu, Crohnovu chorobu, revmatoidní artritidu a roztroušenou sklerózu.
8. Polypeptid podle nároku 1 pro použití jako diagnostické činidlo.
9. Použití polypeptidu podle nároku 1 pro přípravu léčiva pro léčbu autoimunitních chorob.
10. Použití polypeptidu podle nároku 1 pro přípravu léčiva pro léčbu autoimunitních chorob vybraných ze skupiny zahrnující psoriázu, Crohnovu chorobu, revmatoidní artritidu a roztroušenou sklerózu.