CZ2013370A3 - Specifické genové sekvence jednotlivých oligo-prób pro rodově specifickou detekci virů obilnin a trav pomocí technologie Microarray - Google Patents
Specifické genové sekvence jednotlivých oligo-prób pro rodově specifickou detekci virů obilnin a trav pomocí technologie Microarray Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2013370A3 CZ2013370A3 CZ2013-370A CZ2013370A CZ2013370A3 CZ 2013370 A3 CZ2013370 A3 CZ 2013370A3 CZ 2013370 A CZ2013370 A CZ 2013370A CZ 2013370 A3 CZ2013370 A3 CZ 2013370A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- univ
- bymo
- bymovirus
- luteovirus
- probes
- Prior art date
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Řešení popisuje oligonukleotidové sondy, které mají specifické genové sekvence a lze je použít pro rodově specifickou detekci virů obilnin a trav pomocí technologie Microarray.
Description
Specifické genové sekvence jednotlivých oligo-prób pro rodově specifickou detekci virů obilnin a trav pomocí technologie Microarray
Oblast techniky
Řešení popisuje specifické genové sekvence určené pro určení osmi různých rodů virů obilnin a trav pomocí techniky Microarray čip, kdy dochází k hybridizaci nukleových kyselin (RNA/DNA) virů na specifické sondy připevněné na čip. Během jedné reakce je tedy možno zjistit přítomnost více rodů virových patogenů najednou a následně identifikovat jejich druhové zastoupení včetně nálezů virových patogenů nových či nově zavlečených.
Dosavadní stav techniky
Virózy rostlin jsou doposud neléčitelné a zejména u hospodářsky důležitých plodin, jakými obilniny jsou, dokážou způsobit obrovské ztráty na výnosech. Umělé rozšíření druhů Poaceae v ekosystémech, často ve velmi rozsáhlých oblastech, společně s rychlými změnami kultivačních metod, neodvratně přineslo proměny rovnováhy rostlina/patogenní organismus. Poaceae tak hostí mnoho patogenních organismů včetně více jak 100 druhů virů (Lapierre a Signoret, 2004). Téměř 20 % veškerých známých rostlinných virů je schopno napadat Poaceae (Brunt et al., 1996).
Běžně využívané detekční techniky, ať už založené na nukleových kyselinách nebo na bílkovinách, mají svá omezení, přičemž největším je nutnost presumpce znalosti identity viru ve vzorku, a tudíž neschopnost detekovat viry nové, neznámé, nebo u daného vzorku nepředpokládané (Grover et al., 2010). Pokud toto vše vezmeme v potaz, východiskem rostlinných virologů jsou metody schopné detekce širokého počtu různých virů, často včetně takových, které doposud nebyly s danou oblastí nebo podmínkami spojovány (Boonham et al., 2007). Rutinně se bohužel v ČR i celosvětově obecně testuje pouze na několik nejdůležitějších a nejběžněji se vyskytujících virů, což je nedostačující.
Podstata vynálezu
Uvedené nedostatky odstraňují specifické genové sekvence jednotlivých oligo-prób pro rodově specifickou detekci virů obilnin a trav pomocí technologie Microarray, podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že diagnostika virů obilnin je prováděna sondami o následujících sekvencích
| Sonda | Virus | Sekvence |
| Bymo-univ-1 | Bymovirus | AAGACAACCAAYCRCAGGGTTCTGG |
| Bymo-univ-2 | Bymovirus | CAAGCTTGCYGCCATTGGTGTTGGCACA WGCAA |
| Bymo-univ-3 | Bymovirus | ACCACTGAAACCCGAMGGCGCAA |
| Bymo-univ-1 rc | Bymovirus | CCAGAACCCTGYGRTTGGTTGTCTT |
| Bymo-univ-2rc | Bymovirus | TTGCWTGTGCCAACACCAATGGCRGCAA GCTTG |
| Bymo-univ-3rc | Bymovirus | TTGCGCCKTCGGGTTTCAGTGGT |
| Fiji-univ-1 | Fijivirus | DGATGTTCAARTTATT GGTAATAAAKG |
| Fiji-univ-1 rc | Fijivirus | CMTTTATTACCAATAAYTTGAACATCH |
| Furo-univ-1 | Fůro virus | AAATGACGGTTTGGGTCGAAGTWT GA |
| Furo-univ-1rc | Fůro virus | TC AWACTTCG ACCC AAACCGT CATTT |
| Luteo-univ-1 | Luteovirus | GGKTTTTTAGAGGGGCTCTGTWCCGMC TCTGGI I I IGA |
| Luteo-univ-2 | Luteovirus | TGG AATACTTAAG KCCTACCAT |
| Luteo-univ-1 rc | Luteovirus | TCAAAACCAGAGKCGGWACAGAGCCCC TCTAAAAAMCC |
| Luteo-univ-2rc | Luteovirus | ATGGTAGGMCTTAAGTATTCCA |
| Marafi-univ-1 | Marafivirus | CCTGGAAAGCTTGCCAGACCCTCGCTCT CATGCACGATG |
| Marafi-univ-2 | Marafivirus | TMGCTWCAGGGTGAATTGCTTCAB |
| Marafi-univ-1 rc | Marafivirus | CATCGTGCATGAGAGCGAGGGTCTGGC AAGCTTTCCAGG |
| Marafi-univ-2rc | Marafivirus | VTGAAGCAATTCACCCTGWAGCKA |
| Mastre-univ-1 | Mastrevirus | GGAGTCATDTCCTTSAKCCA |
| Mastre-univ1rc | Mastrevirus | TGGMTSAAGGAHATGACTCC |
| Rymo-univ-1 | Rymovirus | TTGGCTSCTBGAGCAAGAACCATACAAG WSC |
| Rymo-univ-2 | Rymovirus | CGTATGCTTTCGACTTCTATGAAATAACW TCCGMA |
| Rymo-univ-1 rc | Rymovirus | GSWCTTGTATGGTTCTTGCTCVAGSAGC CAA |
| Rymo-univ-2rc | Rymovirus | TKCGGAWGTTATTTCATAGAAGTCGAAA GCATACG |
| Tritimo-univ-1 | Tritimovirus | GTG AGCTCTCGC ATAG AG AT AAGC |
| Tritimo-univ-2 | Tritimovirus | CAGGWAGCATTTTCTGGTCAA |
| Tritimo-univ1rc | Tritimovirus | GCTTATCTCTATGCGAGAGCTCAC |
| Tritimo-univ2rc | Tritimovirus | TTG ACCAGAAAATGCTWCCT G |
Specifické genové sekvence podle vynálezu jsou určené pro stanovení osmi rodů virů obilnin pomocí techniky Microarray čip, kdy nukleové kyseliny virů hybridizují na specifické sondy připevněné na čip.
Reakční směs obsahuje vzorek testované nukleové kyseliny připravené k hybridizaci následujícím způsobem. RNA se izoluje z rostlin pomocí Spectrum Plant Total RNA kitu (Sigma) dle manuálu výrobce. V dalším kroku se RNA přepíše pomocí M-MLV reversní transriptázy do cDNA za použití aminoally-dUTP. V dalším kroku se dosyntetizuje druhé vlákno cDNA pomocí Klenowova fragmentu. Připravená dvouvlákenná cDNA se izoluje pomocí PureLink PCR Purification Kitu (Invitrogen) a následně přečistí a zakoncentruje pomocí etanolové precipitace.
Takto získaná cDNA se smíchá s barvou Alexa Fluoro 647 Carboxylic Acid, obarvená cDNA se rozpustí v 8 μΙ H2O a efektivita navázání barvy se ověří pomocí spektroskopu Nanodrop 2000 (Thermoscience). Tato směs je nanesena na sklo obsahující specifické sondy určené k detekci jednotlivých virů. Seznam sond a jejich sekvence jsou uvedeny v následující Tabulce 1.
Proběhla hybridizace a následně čtečka ktomu určená přečetla intenzitu signálu a tím určila přítomnost nukleové kyseliny virů a stanovila jeho rod.
Specifické genové sekvence podle vynálezu umožňují simultánní stanovení osmi rodů obilných virů, což má obrovský význam při šlechtění a pěstování obilnin. Takto rozsáhlých a přesných výsledků nebylo dosud dosahováno.
Zde uváděné sondy jsou řešeny tak, aby byly schopny detekovat celý rod viru a tudíž jsou schopny zachytit i viry nové či neznámé, nebot s vysokou pravděpodobností budou jejich sekvence nukleové kyseliny v oněch konzervativních oblastech, v nichž byly sondy navrženy, hodně obdobné či identické. Takovéhoto řešení doposud nebylo u obilných virů dosaženo.
Následující příklad provedení vynález pouze dokládá, aniž by jej jakkoliv omezoval.
Příklad provedení
Příklad 1
Vyhodnocení zdravotního stavu vzorků obilnin z polí.
Pro analýzu zdravotního stavu porostu ozimé pšenice symptomaticky odpovídající viróznímu stavu byly z pozemků odebrány symptomatické vzorky listů pšenice. RNA byla izolována z rostlin pomocí Spectrum Plant Total RNA kitu (Sigma) dle manuálu výrobce. V dalším kroku byla RNA přepsána pomocí M-MLV reversní transriptázy do cDNA za použití aminoally-dUTP. V dalším kroku bylo dosyntetizováno druhé vlákno cDNA pomocí Klenowova fragmentu. Připravená dvouvlákenná cDNA byla izolována pomocí PureLink PCR Purification Kitu (Invitrogen) a následně přečištěna a zakoncentrována pomocí etanolové precipitace.
Takto získaná cDNA byla smíchána s barvou Alexa Fluoro 647 Carboxylic Acid, obarvená cDNA byla rozpuštěna v 8 pl H2O a efektivita navázání barvy byla ověřena pomocí spektroskopu Nanodrop 2000 (Thermoscience). Připravené vzorky byly hybridizovány na čip obsahující následující sondy:
| Sonda | Virus | Sekvence |
| Bymo-univ-1 | Bymovirus | AAGACAACCAAYCRCAGGGTTCTGG |
| Bymo-univ-2 | Bymovirus | CAAGCTTGCYGCCATTGGTGTTGGCACA WGCAA |
| Bymo-univ-3 | Bymovirus | ACCACTGAAACCCGAMGGCGCAA |
| Bymo-univ-1 rc | Bymovirus | CCAGAACCCTGYGRTTGGTTGTCTT |
| Bymo-univ-2rc | Bymovirus | TTGCWTGTGCCAACACCAATGGCRGCAA GCTTG |
| Bymo-univ-3rc | Bymovirus | TTGCGCCKTCGGG I I ICAGTGGT |
| Fiji-univ-1 | Fiji virus | DGATGTTCAARTTATTGGTAATAAAKG |
| Fiji-univ-1 rc | Fijivirus | CMTTTATTACCAATAAYTTGAACATCH |
| Furo-univ-1 | Fůro virus | AAATGACGGTTTGGGTCGAAGTWTGA |
| Furo-univ-1rc | Fůro virus | TCAWACTTCGACCCAAACCGTCATTT |
| Luteo-univ-1 | Luteovirus | GGK Illi TAGAGGGGCTCTGTWCCGMC TCTGGI I I IGA |
| Luteo-univ-2 | Luteovirus | TGGAATACTTAAGKCCTACCAT |
| Luteo-univ-1 rc | Luteovirus | TCAAAACCAGAGKCGGWACAGAGCCCC TCTAAAAAMCC |
| Luteo-univ-2rc | Luteovirus | ATGGTAGGMCTTAAGTATTCCA |
| Marafi-univ-1 | Marafivirus | CCTGGAAAGCTTGCCAGACCCTCGCT CT CATGCACGATG |
| Marafi-univ-2 | Marafivirus | TMGCTWCAGGGTGAATTGCTTCAB |
| Marafi-univ-1 rc | Marafivirus | CATCGTGCATGAGAGCGAGGGTCTGGC AAGCTTTCCAGG |
| Marafi-univ-2rc | Marafivirus | VTGAAGCAATTCACCCTGWAGCKA |
| Mastre-univ-1 | Mastrevirus | GGAGTCATDTCCTTSAKCCA |
| Mastre-univ1rc | Mastrevirus | TGGMTSAAGGAHATGACTCC |
| Rymo-univ-1 | Rymovirus | TTGGCTSCTBGAGCAAGAACCATACAAG WSC |
| Rymo-univ-2 | Rymovirus | CGTATGCTTTCGACTTCTATGAAATAACW TCCGMA |
| Rymo-univ-1 rc | Rymovirus | GSWCTTGTATGGTTCTTGCTCVAGSAGC CAA |
| Rymo-univ-2rc | Rymovirus | TKCGGAWGTTATTTCATAGAAGTCGAAA GCATACG |
| Tritimo-univ-1 | Tritimovirus | GTGAGCTCTCGCATAGAGATAAGC |
| Tritimo-univ-2 | Tritimovirus | CAGGWAGCATTTTCTGGT CAA |
| Tritimo-univ- 1 rc | Tritimovirus | GCTTATCTCTATGCGAGAGCT CAC |
| Tritimo-univ2rc | Tritimovirus | TTGACCAGAAAATGCTWCCT G |
Výsledky hybridizace byly analyzovány včtečce ktomu určené. V rostlinách byl identifikován virus rodu Luteovirus a současně proběhly analýzy určující jeho druh a kmen. Takto lze testovat jak materiál na šlechtitelských stanicích, tak rostliny z polních odběrů nebo laboratorní izoláty. Protože infekci viry nelze nijak léčit, je jedinou ochranou proti virovým chorobám obilnin použití rezistentních odrůd a včasná diagnostika.
Účinnost specifických genových sekvencí podle vynálezu byla úspěšně ověřena původci ve Výzkumném ústavu rostlinné výroby, v.v.i., Praha, CZ.
Průmyslová využitelnost
Microarray čipy se specifickými genovými sekvencemi určenými pro diagnostiku virů obilnin je možno dodávat laboratořím zabývající se detekcí rostlinných patogenů jako detekční kit k okamžitému použití (ready - to use), kdy uživateli postačí pouze připravit svůj vzorek testované RNA a provést reakci dle přesně stanovených podmínek. Lze tak hned v počátku odhalit nemocné rostliny a zabránit jejich epidemickým výskytům.
Použitá literatura
Boonham N., Tomlinson J., a. Mumford R. 2007. Microarrays for Rapid Identification of Plant Viruses. Annu. Rev. Phytopathol. 45, 307-28.
Brunt A.A., Crabtree K., Dallwitz M.J., Gibb A.J., Watson L. a Zurcher E.J. 1996. Plant viruses online: descriptions and lists from the VIDE Database, Version 20.
Grover V., Piercea M. L, Hoyta P., Zhanga F., Melchera U. 2010. Oligonucleotide-based microarray for detection of plant viruses employing sequence-independent amplification of targets. J. Virol. Methods, 163: 57-67.
Lapierre H., Signoret P.A. (Ed): Viruses and virus diseases of Poaceae (Gramineae). INRA edition, Paris, France, pp 453- 455.
Claims (1)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Specifické genové sekvence jednotlivých oligo-prób pro rodově specifickou detekci virů obilnin a trav pomocí technologie Microarray, vyznačující se tím, že diagnostika virů obilnin je prováděna sondami o následujících sekvencích
Sonda Virus Sekvence Bymo-univ-1 Bymovirus AAGACAACCAAYCRCAGGGTTCTGG Bymo-univ-2 Bymovirus CAAGCTTGCYGCCATTGGTGTTGGCACA WGCAA Bymo-univ-3 Bymovirus ACCACTGAAACCCGAMGGCGCAA Bymo-univ-1 rc Bymovirus CCAGAACCCTGYGRTTGGTTGTCTT Bymo-univ-2rc Bymovirus TTGCWTGTGCCAACACCAATGGCRGCAA GCTTG Bymo-univ-3rc Bymovirus TTGCGCCKTCGGGTTTCAGTGGT Fiji-univ-1 Fijivirus DGATGTTCAARTTATTGGTAATAAAKG Fiji-univ-1 rc Fijivirus CMTTTATTACCAATAAYTT GAACATCH Furo-univ-1 Fůro virus AAATGACGGTTTGGGTCGAAGTWT GA Furo-univ-1rc Fůro virus TCAWACTTCGACCCAAACCGT CATTT Luteo-univ-1 Luteovirus GGKTTTTTAGAGGGGCTCTGTWCCGMC TCTGGI I I IGA Luteo-univ-2 Luteovirus TGGAATACTTAAG KCCTACCAT Luteo-univ-1 rc Luteovirus TCAAAACCAGAGKCGGWACAGAGCCCC TCTAAAAAMCC Luteo-univ-2rc Luteovirus ATGGTAGGMCTTAAGTATTCCA Marafi-univ-1 Marafivirus CCTGGAAAGCTTGCCAGACCCTCGCTCT CATGCACGATG Marafi-univ-2 Marafivirus TMGCTWCAGGGTGAATTGCTTCAB Marafi-univ-1 rc Marafivirus CATCGTGCATGAGAGCGAGGGTCTGGC AAGCTTTCCAGG Marafi-univ-2rc Marafivirus VTGAAGCAATTCACCCTGWAGCKA Mastre-univ-1 Mastrevirus GGAGTCATDTCCTTSAKCCA Mastre-univ1 rc Mastrevirus TGGMTSAAGGAHATGACTCC Rymo-univ-1 Rymovirus TTGGCTSCTBGAGCAAGAACCATACAAG WSC Rymo-univ-2 Rymovirus CGT ATG CTTTCG ACTT CT AT G AAAT AAC W TCCGMA Rymo-univ-1rc Rymovirus GSWCTTGTATGGTTCTTGCTCVAGSAGC CAA Rymo-univ-2rc Rymovirus TKCGGAWGTTATTTCATAGAAGTCGAAA GCATACG Tritimo-univ-1 Tritimovirus GTGAGCTCTCGCATAGAGATAAGC Tritimo-univ-2 Tritimovirus CAGGWAGCATTTTCTGGT CAA Tritimo-univ1rc Tritimovirus GCTTATCTCTATGCGAGAGCT CAC Tritimo-univ2rc Tritimovirus TTGACCAGAAAATGCTWCCT G
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2013-370A CZ2013370A3 (cs) | 2013-05-21 | 2013-05-21 | Specifické genové sekvence jednotlivých oligo-prób pro rodově specifickou detekci virů obilnin a trav pomocí technologie Microarray |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2013-370A CZ2013370A3 (cs) | 2013-05-21 | 2013-05-21 | Specifické genové sekvence jednotlivých oligo-prób pro rodově specifickou detekci virů obilnin a trav pomocí technologie Microarray |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2013370A3 true CZ2013370A3 (cs) | 2014-12-03 |
Family
ID=51989661
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2013-370A CZ2013370A3 (cs) | 2013-05-21 | 2013-05-21 | Specifické genové sekvence jednotlivých oligo-prób pro rodově specifickou detekci virů obilnin a trav pomocí technologie Microarray |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ2013370A3 (cs) |
-
2013
- 2013-05-21 CZ CZ2013-370A patent/CZ2013370A3/cs unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Milner et al. | Quantitative polymerase chain reaction (Q-PCR) and fluorescent in situ hybridization (FISH) detection of soilborne pathogen Sclerotium rolfsii | |
| CN116356052A (zh) | 一种特异性检测槟榔黄化植原体的巢式引物组、试剂盒及其检测方法 | |
| CN101712982A (zh) | 用于水稻细菌性谷枯病菌检测的引物对及检测方法 | |
| Demirel et al. | Quantitative evaluation of chickpea Fusarium wilt | |
| Abdelbacki et al. | Molecular markers identification of leaf rust resistant genes Lr19, Lr21, Lr24, Lr47 and Lr51 in selected Egyptian wheat cultivars. | |
| CZ2013370A3 (cs) | Specifické genové sekvence jednotlivých oligo-prób pro rodově specifickou detekci virů obilnin a trav pomocí technologie Microarray | |
| Mannan et al. | A molecular tool for differenciation of xanthomonas oryzae pathovars isolated from rice | |
| CZ26380U1 (cs) | Oligonukleotidová sonda pro rodově specifickou detekci virů obilnin a trav pomocí technologie Microarray | |
| TWI485255B (zh) | 檢測葫蘆科作物是否受到瓜類褪綠黃化病毒感染的引子組及方法 | |
| CZ25572U1 (cs) | Sonda pro molekulární detekci virových patogenů obilnin a trav pomocí technologie Microarray | |
| Singhal et al. | Techniques for detection of viroids | |
| CN104513853B (zh) | 桃褐腐菌抗dmi类杀菌剂的田间检测试剂盒 | |
| CZ2013345A3 (cs) | Specifické genové sekvence jednotlivých oligo-prób pro molekulární detekci virových patogenů obilnin a trav pomocí technologie Microarray | |
| CZ31435U1 (cs) | Reakční směs pro detekci a kvantifikaci RNA tří obilných virů (WDV, WSMV, BYDV) pomocí TaqMan Real-time RT-PCR | |
| Al-Abrahim | Molecular identification of Alfalfa mosaic virus isolated from naturally infected alfalfa (Medicago sativa) crop in Saudi Arabia | |
| Duman et al. | Diagnosis of Peach latent mosaic viroid (PLMVd) and Hop stunt viroid (HSVd) by RT-PCR using different extraction protocols | |
| KR101389776B1 (ko) | 구근류에서 발생하는 파이토프토라속 균주를 검출하기 위한 중합효소연쇄반응의 프라이머, 이를 이용한 검출키트 및 방법 | |
| 오승현 | Molecular and morphological screening of Korean soybean genotypes resistance to soybean mosaic virus, soybean yellow mottle mosaic virus, and soybean yellow common mosaic virus | |
| CN108220462B (zh) | 一种同时检测瓜类细菌性果斑病菌和角斑病菌的方法及其专用试剂盒 | |
| MX2010013507A (es) | Método para la detección del fitoplasma causante del amarillamiento letal en en cocotero y estuche de reactivos para ello. | |
| Mba | Detection of Three Cereal Viruses in Oats | |
| CZ30605U1 (cs) | Reakčnísměs pro kvantifikaci genu replikázy RNA viru žluté zakrslosti ječmene pomocí Syber Green Real-time RT-PCR | |
| CZ201369A3 (cs) | Reakční směs L3 pro molekulární detekci viru svinutky bramboru (PLRV) pomocí kvantitativní RT-PCR | |
| Zavriev et al. | Effective and efficient approach to potato pathogen sensitive detection and identification | |
| RUST et al. | International Journal of Phytopathology |