CZ2016685A3 - Aminooxylipidy pro konstrukci samoskladných liposomálních systémů umožňujících jejich následnou modifikaci biologicky funkčními molekulami - Google Patents

Aminooxylipidy pro konstrukci samoskladných liposomálních systémů umožňujících jejich následnou modifikaci biologicky funkčními molekulami Download PDF

Info

Publication number
CZ2016685A3
CZ2016685A3 CZ2016-685A CZ2016685A CZ2016685A3 CZ 2016685 A3 CZ2016685 A3 CZ 2016685A3 CZ 2016685 A CZ2016685 A CZ 2016685A CZ 2016685 A3 CZ2016685 A3 CZ 2016685A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
formula
linker
liposomes
boc
aminooxylipids
Prior art date
Application number
CZ2016-685A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ307452B6 (cs
Inventor
Miroslav Ledvina
Roman Effenberg
Jaroslav Turánek
Elissa Bartheldyová
Ladislav DroĹľ
Original Assignee
Vysoká škola chemicko-technologická v Praze
VÝZKUMNÝ ÚSTAV VETERINÁRNÍHO LÉKAŘSTVÍ, v.v.i.
Apigenex S.R.O.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, VÝZKUMNÝ ÚSTAV VETERINÁRNÍHO LÉKAŘSTVÍ, v.v.i., Apigenex S.R.O. filed Critical Vysoká škola chemicko-technologická v Praze
Priority to CZ2016-685A priority Critical patent/CZ307452B6/cs
Priority to PCT/CZ2017/050054 priority patent/WO2018082723A1/en
Priority to US16/336,844 priority patent/US11492327B2/en
Priority to EP17832461.2A priority patent/EP3535238B1/en
Priority to CA3039404A priority patent/CA3039404C/en
Publication of CZ2016685A3 publication Critical patent/CZ2016685A3/cs
Publication of CZ307452B6 publication Critical patent/CZ307452B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C239/00—Compounds containing nitrogen-to-halogen bonds; Hydroxylamino compounds or ethers or esters thereof
    • C07C239/08—Hydroxylamino compounds or their ethers or esters
    • C07C239/20—Hydroxylamino compounds or their ethers or esters having oxygen atoms of hydroxylamino groups etherified
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/543—Lipids, e.g. triglycerides; Polyamines, e.g. spermine or spermidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
    • A61K47/6913—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome the liposome being modified on its surface by an antibody
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Nové aminooxylipidy obecného vzorce I, kde n= 5 až 30 a X je polymethylenová spojka obecného vzorce II, kde n= 2 až 10, nebo polyethylenglykolová spojka obecného vzorce III, kde n= 1 až 14. Způsob přípravy aminooxylipidů obecného vzorce I vyznačující se tím, že acylacíbutoxykarbonyl-polymethylendiaminu (CH)C-O-C=O)-HN-(CH)NH, n = 2 až 13, či-butoxykarbonyl-polyethyleglykoldiaminu (CH)C-O(C=O)-HN-(CH)-[O-(CH)]-O-(CH)NH, n = 1 až 14, symetricky v poloze C(2) větvenou mastnou kyselinou obecného vzorce IV, v přítomnosti kondenzačního činidla nebo od kyseliny I odvozeným acylchloridem obecného vzorce V, se připraví-Boc-aminolipidy obecného vzorce VI. Ty se převedou na aminolipidy obecného vzorce VII. Jejich kondenzací s kyselinou-butoxykarbonylaminooxyoctovou v přítomnosti kondenzačního činidla se získajíBoc-aminooxylipidy obecného vzorce VIII, které debocilací poskytnou aminooxylipidy obecného vzorce I. Acylchloridy obecného vzorce V se připraví reakcí kyselin obecného vzorce IV s oxalylchloridem v přítomnosti katalytického množství-dimethylformamidu v organickém aprotickém rozpouštědle. Použití aminooxylipidů obecného vzorce I pro konstrukci netoxických samoskladných liposomálních nosičů léčiv prezentujících aminooexyskupiny a takzvaná postliposomální modifikace těchto nosičů biologicky funkčními molekulami za použití oximové ligační techniky.

Description

Oblast techniky
Vynález se týká nových lipidů obsahujících aminooxyskupinu s potlačenou cytotoxicitou, způsobu jejich přípravy a využití těchto látek pro konstrukci samoskladných liposomálních nosičů léčiv prezentujících aminooxyskupiny a které lze takzvaně „postliposomálně kovalentně modifikovat biologicky funkčními molekulami nesoucími aldehydové nebo keto skupiny za použití oximové ligační techniky (vazebné páry: aminooxyskupina a aldehydová nebo keto skupina).
Dosavadní stav techniky
Samoskladné nanostrukturované liposomální systémy, díky své biokompatibilitě, biodegradovatelnosti, nízké toxicitě a schopnosti internalizovat látky různých fyzikálně-chemických vlastností, představují v současnosti jeden z nejhlouběji prostudovaných platforem pro cílený transport léčiv in vivo, které již nalezly řadu klinických aplikací. Pro internalizaci biologicky funkčních látek lze využít, jak vnitřní prostor, tak i jejich obálku tvořenou fosfolipidovou dvojvrstvou. Do vnitřního vodného prostoru lze enkapsulovat hydrofilní látky/terapeutika a fosfolipidová dvojvrstva umožňuje ukotvení biomolekul přes jejich hydrofobní doménu (Koudelka, Š. a spol. 2016). Posledně jmenovaného principu bylo využito při konstrukci vektorovými biomolekulami cílených liposomů a liposomálních vakcín (Marques-Gallego, P. a spol. 2014; Turánek, J. a spol. 2012) Při zabudování vektorových molekul do lipidové dvojvrstvy se uplatňují dva základní postupy, z nichž první je založen na aplikaci vektorovou molekulou modifikovaného lipidu jako kolipidu při konstrukci liposomů a druhý je založen na tzv. postliposomální modifikaci již hotových liposomů. V druhém případe je kolipidem lipid prezentující strukturní motiv umožňující ukotvit vektorovou molekulu na povrch již vytvořeného liposomů. Klasické postupy pro postliposomální modifikace jsou založeny na reakcích jako je tvorba amidové vazby, disulfidového můstku, vzájemné propojení aminů homobifunkční spojkou a adici thiolu na dvojnou C=C vazbu maleinimidu. Společnou nevýhodou těchto postupů je nízká ortogonalita (chemoselektivita) jmenovaných reakcí ve vztahu ostatním funkčním skupinám • 4 přítomným v ligované (navazované) komplexní biomolekule. Z uvedeného důvodu je v posledních letech soustředěna pozornost vývoji tzv. bioortogonálních ligačních metod založených na chemoselektivní reakci mezi dvěma funkčními skupinami, z nichž ani jedna není přítomna v nativní biomolekule, což eliminuje tvorbu vedlejších produktů. Dalším kritériem kladeným na tyto reakce je, že by měly probíhat za mírných reakčních podmínek ve vodném prostředí, s vysokou konverzí a dostatečnou rychlostí. Pro ligační techniky splňující uvedené požadavky byl zaveden pojem „clickchemistry. Typickým představitelem „click technik je ligace založená na jednomocnou mědí katalyzované Huisgenově 1,3-dipolární cykloadici azidu a trojnou vazbu (Hassane, F. S. a spol., 2006). Problémy s použitím měďných solí v biologických systémech byl následně vyřešen vypracováním tzv. „Copper-Free Click Chemistry, kde dochází k cykloadici azidu na fluorem aktivovanou trojnou vazbu v 2,2-difluorcyklooktynovém kruhu (Baskin, J. M. a spol. 2007). Katalýzu rovněž nevyžaduje Staudingerova ligace, založenoá na Staudingerove redukci organických azidů na aminy působením trifenylfosfinu. V případě Staudingerovy ligace vazebný kolipid prezentuje trifenyfofinový strukturní motiv nesoucí současně v orto-poloze jednu methoxykarbonylovou skpinu, která umožňuje následné navázání redukcí vzniklého aminu amidovou vazbou (Vabbilisetty, P. a spol. 2014).
Do kategorie bioortogonálních „click ligací náleží rovněž oximová ligace, založená na spontánní kondenzaci aminooxyskupiny s aldehydovou skupinou nebo ketoskupinou (Ulrich, S. a spol. 2014). Oximová ligace je alternativou reduktivní aminace která nevyžaduje katalýzu. Vzniklý oxim s KD = 10'8M je ve srovnání s iminy výrazně odolnější vůči hydrolýze. Oximová ligace probíhá za podmínek vstřícných k biologickým systémům a je ortogonální k většině funkčních skupin přítomných v biomolekulách, a to včetně aminoskupin, což z ní činí ideální ligační techniku pro postliposomální modifikace. V případě postliposomálních ligací jsou jako kationickou aminooxyskupinu prezentující vazebné kolipidy popsány jednořetězcové aminooxylipidy s hydrofobní doménou tvořenou lineárním uhlovodíkovým řetězcem (Tang, L. 2015), dvouřetězcové amiaminooxylipidy s hydrofobní doménou založenou na symetrických lipofilních di-O-acyl- resp. di-O-alkylderivátech glycerolu a na symetrických sekundárních dialkylamidech aminokyselin (Liu, Y. a spol. 2007; Milller, A. D. a spol. 2005). Specifickou skupinou jsou a aminooxylipidy jejichž hydrofobní doména je tvořena planárním polycyklickým choesterolem připojeným k kationické doméně přes uretanovou spojku (Miller, A.D. a spoll. 2005; Carmona, S. a spol. 2009).
Celková geometrie hydrofobní domény kationického aminooxylipidu má zásadní vliv na utváření strukturních fází v roztoku a stabilitu lipidové dvojvrstvy. Dvouřetězcové kationické lipidy jsou strukturně bližší dvouřetězcové hydrofobní doméně fosfolipidů a ve vodném roztoku se samouzavírají do sférických liposomů, čímž lépe vytváří lipidové dvojvrstvy ve srovnání s jednořetězcovými. Naproti tomu kationické lipidy s jedním řetězcem mají zvýšenou tendenci vytvářet micely resp. reverzní micely (Niculescu-Duvaz, D. a spol. 2003; Tsukamoto, M. a spol. 1995). Charakter hydrofobní domény má rovněž vliv na toxicitu. Kationické lipidy jejichž hydrofobní doména je tvořena lipofilními acylovými zbytky jsou vzhledem k jejich biodegradovatelnosti obecně méně toxické, než kationické lipidy s hydrofobní doménou založenou na lipofilních alkylových řetězcích (Leventis, R. a spol. 1990; Lv, H. a spol. 2006). Ve vztahu k uvedenému se jeví jako velice atraktivní dvouřetězcové lipofilní doména založená synteticky dobře dostupných v poloze C(2) symetricky větvených mastných kyselinách, která byla úspěšně aplikována v případě designu nových polykationických lipidů jako kompozit pro konstrukci polykationických lipsomálních transfekčních systémů (Korvasova, Z. a spol. 2012; Drašar, L. a spol. 2013: Czech. Pat. A PCT appl., Drašar, L. a spol. 2016 US pat. US 9,393,200 B2). V případě sudého počtu atomu uhlíku v jejich alkylových řetězcích jsou tyto kyseliny v organizmu odbouratelné β-oxidací, tj. stejně jako biogenní mastné kyseliny se sudým počtem uhlíkových atomů.
Podstata vynálezu
Vynález použitím synteticky dobře dostupných, vůči solvolytické degradaci stabilních a metabolizovatelných v poloze C(2) symetricky větvených mastných kyselin jako hydrofobní domény v předmětných aminooxylipidech řeší problém: (a) syntetické náročnosti kationických aminooxylipidů obsahujících dvě symetrické alifatické hydrofobní domény, založené na symetrických lipofilních diacylderivátech a dialkylderivátech glycerolu jakož i na symetrických sekundárních dialkylamidech aminokyselin; (b) limitované stability diacylderivátů glycerolu a uretanové spojky v případě lipopolyaminů odvozených od cholesterolu; (c) problém odbourávání aminooxylipidů jejichž hydrofobní doména je tvořena lineárními O- a /V-alkýlovými řetězci.
Předmětem vynálezu jsou aminooxylipidy obecného vzorce I
Kde ni = 5 - 30 a X je polymethylénová spojka obecného vzorce II
kde n2 - 2 -10 nebo polyethylenglykolová spojka obecného vzorce III
lil kde n2 = 1 -14
Dále je význakem vynálezu, že aminooxylipidy obecného vzorce I mají s výhodou ni = 13 a spojku X výše zmíněného obecného vzorce II, kde je n2 = 2 či n2 = 3.
Význakem vynálezu je také skutečnost, že aminooxylipidy obecného vzorce I mají s výhodou ni = 13 a spojku X výše zmíněného obecného vzorce III, kde je n3 = 1.
Předmětem vynálezu je rovněž způsob přípravy aminooxylipidů obecného vzorce I.
Symetricky v poloze C(2) větvené mastné kyseliny obecného vzorce IV
kde ni = 5 = 30 (dostupné postupem podle lit. Kusumoto, S. a spol. 1978) se převedou reakcí s oxalylchloridem v přítomnosti katalytického množství /V,/V-dimethylformamidu v organickém aprotickém rozpouštědle (s výhodou v dichlormethanu)na jejich acylchloridy obecného vzorce V • ·
kde ni = 5 - 30.
Kondenzací výše uvedených acylchloridů obecného vzorce V s komerčně dostupnými N-tercbutoxykarbonyl-polymethylendiaminy {(CH3)3C-O-(C=O)-HN-(CH2)n-NH2, n - 2 - 13}, či N-tercbutoxykarbonyl-polyethyleglykoldiaminy {(CH3)3C-O-(C=O)-HN-(CH2)2-[O-(CH2)]n-O-(CH2)2NH2, η = 1 -14} v přítomnosti organické báze v organickém aprotickém rozpouštědle (s výhodou v přítomnosti Λ/,/V-diisopropyletylaminu v dichlormethanu) se připraví aminolipidy obecného vzorce VI
Boc—NH.
X
kde ni = 5 - 30 a X je polymethylénová spojka výše uvedeného obecného vzorce II nebo polyethylenglykolová spojka výše uvedeného obecného vzorce III.
Hydrolytickým odštěpením /V-terc-butoxykarbonylové chránící skupiny (tzv. debocilací) látek obecného vzorce VI (s výhodou za použití kyseliny trifluoroctové v dichlormethanu) se získají aminolipidy obecného vzorce VII
kde ni = 5 - 30 a X je polymethylénová spojka výše uvedeného obecného vzorce II nebo polyethylenglykolová spojka výše uvedeného obecného vzorce III.
Λ/,Λ/'-Diisopropylkarbodiimidem promotovanou kondenzací /V-terc-butoxykarbonylaminooxyoctové kyseliny s aminolipidy obecného vzorce VII se připraví /V-Boc-aminooxylipidy obecného vzorce Vlil • · ·
kde ni = 5 - 30 a X je polymethylénová spojka výše uvedeného obecného vzorce II nebo polyethylenglykolová spojka výše uvedeného obecného vzorce III.
Hydrolytickým odštěpením /V-terc-butoxykarbonylové chránící skupiny látek obecného vzorce Vlil (s výhodou za použití kyseliny trifluoroctové v dichlormethanu) se získají cílové aminooxylipidy obecného vzorce I.
Předmětem vynálezu je též použití aminooxylipidů obecného vzorce I pro konstrukci netoxických samoskladných liposomálních nosičů léčiv prezentujících aminooxyskupiny a jejich takzvaná „postliposomální modifikace biologicky funkčními molekulami za použití oximové ligační techniky (vazebné páry: aminooxyskupina a aldehydová skupina nebo keto skupina).
Skutečnost, že pří zabudování aminooxylipidů obecného vzorce I do liposomální dvojvrstvy lipsomu nemá za následek zvýšení jeho cytotoxicity byla prokázána srovnáním cytotoxicity EPS liposomů a EPS liposomů se zabudovaným aminooxylipidem obecného vzorce I v in vitro experimentech s Tlymfocyty a buňkách H1299 nádorové linie plicního nádoru.
Schopnost samoskladných liposomálních nosičů léčiv modifikovaných aminooxylipidy obecného vzorce I kovalentně vázat biologicky funkční molekuly nesoucí aldehydové nebo keto skupiny byla prokázána navázáním:
a) kyseliny hyaluronové (8 -15 kDa) via redukující konec její molekuly;
b) reduktivní aminací fluoresceinem značené kyseliny hyaluronové (50 - 200 kDa) modifikované v omezeném rozsahu poloze C-6 N-acetylglukosaminové podjednotky aldehydovými skupinami vygenerovanými řízenou oxidací primárních OH skupin;
c) Mannamu;
d) aldehydovými funkčními skupinami modifikovaného proteinu, tj. z vaječného žloutku izolovaného imunoglobulinu třídy IgY modifikovaného aldehydovými skupinami vygenerovanými oxidativním štěpením jeho sacharidové části.
• · ·
Vazba molekul typu polysacharidů (mannan, kyselina hyaluronové) na líposomy modifikované aminooxy lipidy je striktně chemoselektivní a regioselektivní, tj. via redukující konec polysacharidů, což má za následek uniformní směrování molekul na povrchu liposomů (viz níže). Nahodilá vazba pomocí kroslinkerů (např. karbodiimid) nemůže vést k definované chemoselektivní a regioselektivní vazbě.
Kyselina W-a«tyigluko»min
B-glykou ronoví
• ·
• · · · .
·· ·· ·
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1: SEM a TEM liposomů: SEM liposomu s navázanou kys. hyaluronovou (A); TEM liposomu s navázanou kys. hyaluronovou (barveno molybdenanem amonným) (B); TEM směsi liposomů s navázanou kys. hyaluronovou a nemodifikovaných liposomů (barveno molybdenanem amonným). Modifikované liposomy (černé šipky), nemodifikovaný liposom (bílá šipka) (C); SEM nemodifikovaného liposomu (D); TEM nemodifikovaného liposomu (E).
Obr. 2: KryoTM liposomů s HA navázanou pomocí oximové ligace
Obr. 3: Hodnoty distribuce velikosti liposomů s 1% aminooxylipidem obecného vzorce I (dle příkladu 14) a stejných liposomů s navázaným IgY. Distribuce je vyjádřena v počtech částic v třídě dané velikosti: 107 nm pro samotné liposomy; 126 nm pro liposomy s IgY; 9 nm pro IgY.
Obr. 4: TEM liposomů s 1% aminooxylipidem obecného vzorce I (dle příkladu 14) (a) a liposomů s navázaným IgY (b): šipky označují povrchově vázané molekuly IgY na povrchu liposomu. Zřetelný je i tvar a orientace molekul IgY (insert).
Obr. 5: Distribuce velikosti prázdných vs. manosylovaných liposomů: velikost prázdných liposomů je 145 nm, velikost mannanu 6 nm. Velikost manosylovaných liposomů je 155 nm, došlo k zvětšení o 10 nm.
Obr. 6: Modifikované a nemodifikované liposomy zobrazené pomocí transmisní (TEM) a skanovací (SEM) elektronové mikroskopie: nemodifikovaný liposom zobrazený pomocí TEM (vlevo), liposom s navázaným mannanem zobrazený pomocí TEM (uprostřed), liposom s navázaným mannanem zobrazený pomocí SEM (vpravo)
Obr. 7: Snímky z konfokálního mikroskopu: barvení jádra (vlevo nahoře); barvení povrchového HLADR antigenu (vpravo nahoře); manosylované liposomy (vlevo dole); spojení všech 3 obrázků (vpravo dole)
Obr. 8: Množství kyseliny hyaluronové v jednotlivých frakcích po dělení gelovou chromatografií, detekováno fluorimetricky
Obr. 9: Srovnání signálu na Flow cytometru: tečkované samotné buňky, čárkovaně buňky po přídavku prázdných liposomů, plná čara fluorescence buněk ošetřených liposomy s navázanou kyselinou hyaluronovou.
• · · ·
Obr. 10: Srovnání navázání prázných vs.modifikovaných liposomů na povrch H1299 po 15 minutách a 24 hodinách.
Přehled tabulek
Tab. 1: Počet apoptotických buněk v jednotlivých vzorcích
Tab. 2: Stimulace dendritických buněk manosylovanými liposomy a srovnání s LPS: manosylované liposomy stimulují dendritické buňky ve srovnatelném rozsahu jako standard LPS.
Příklady provedení vynálezu
Seznam zkratek
NMR nukleární magnetická rezonance
ESI-MS hmotnostní spektrometrie s ionizací elektrosprejem
FAB-MS hmotnostní spektrometrie s ionizací urychlenými atomy
HR- MS hmotnostní spektrometrie s vysokým rozlišením
HA kyselina hyaluronová
EPC vaječný fofsfatidyl cholin (viz EPC liposomy)
Buňky H1299 linie buněk plicního nádoru H1299
TEM transmisní elektronová mikroskopie
SEM scannovací elektronová mikroskopie
DLS dinamický rozptyl světla
PBS 20mM fosfátový pufr. 0,14M NaCl, pH 7,2
DOPE l,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
Příklad 1
K míchané suspenzi kyseliny 2-tetradecylhexadekanové IV (kde ni - 13; 1,5 g, 3,32 mmol) v dichlormethanu (50 ml) se přidá oxalylchlorid (420 mg, 6,63 mmol) a katalytické množství N,Ndimethylformamidu a směs se míchá 1,5 hod za laboratorní teploty. Rozpouštědlo se oddestiluje, a • · · • · • · • · • · · • · odparek rozpustí v benzenu (100 ml) a roztok se promyje vodou (2 x 50 ml) a nasyceným roztokem NaHCO3 (2 x 50 ml). Po vysušení organické fáze nad bezvodým MgSO4 a následném odpařením za sníženého tlaku se získá 1,52 g (97%) analyticky čistého 2-tetradecylhexadekanoylchloridu V (kde ni - 13). Pro C30H59CIO vypočteno: relativní molekulová hmotnost 471.24, monoisotopická hmotnost 470.43; nalezeno ESI-MS m/z: 471.4 ([M+H]+) (25), 493.4 ([M+Na]+) (100), pro C30H59CIO (471.24) vypočteno: 76.46% C, 12.62% H, 7.52% Cl; nalezeno: 76.28% C, 12.60% H, 7.32% Cl.
Příklad 2
K míchanému roztoku 2-tetradecylhexadekanoylchloridu V (kde ni = 13; 0,39 g; 0.82 mmol) v dichlormethanu (25 ml) se přidá /V-terc-butoxykarbonyl-l,2-diaminoethan-hydrochlorid ((ClUhCO-(C=O)-HN-(CH2)n-NH2' HCL, n = 2; 174 mg, 0,88 mmol) a následně /V-ethyldiizopropylamin (240 μΙ) a směs se míchá přes noc při laboratorní teplotě. Poté se ke směsi přidá dichlormethan (50 ml) a roztok se promyje vodným roztokem NaHSO4 (5%; 2 x 15 ml) a vodou (2 x 15 ml). Organická fáze se vysuší nad bezvodým MgSO4 a odpaří za sníženého tlaku. Po chromatografii odparku na sloupci silikagelu (110 ml) v systému toluen - etyl-acetát (gradient 0-63% etyl-acetát, 14 ml/min, 64 min, naneseno v chloroformu) a následné lyofilizaci homogenní frakce z dioxanu se získá 445 mg (95% výtěžek) /V2-(2-tetradecylhexadekanoyl)-/V2-terc-butoxykarbony-l,2-diaminoethanu VI (kde ni = 13 a X je polymethylénová spojka obecného vzorce II kde Π2 = 2). IČ spektrum (CHCI3): v=3347 (NH), 3308 (NH), 2919, 2850, 1689 (C=O; Boc), 1645 (Amid I), 1549 (Amid II), 1535 (Amid II), 1467, 1447, 1390 (CH3; Boc), 1367 (CH3; Boc), 1286, 1268, 1252, 1236, 1178, 938, 864, 719 cm-1. XH NMR spektrum (400 MHz, CDCI3): o= 6.20 (s, N2H); 4.96 (s, ΝΧΗ); 3.36 (dt, J = 4.7, 4.7 Hz, 2H, H-l); 3.27 (dt, J = 4.7,
4.7 Hz, 2H, C-2); 1.99 (spt, J = 4.7 Hz, H-2'); 1.6-1.51 (m, 2H, H-3', H-l); 1.43 (s, 9H, 3 x CH3); 1.411.36 (m, 2H, H-3', H-l); 1.30-1.20 (m, 48H, 24 x CH2); 0.87 (t, J = 7.0 Hz, 6H, H-16', H-14). 13C NMR spektrum (100 MHz, CDCI3): o= 176.94 (C-l'), 156.87 (N2C), 79.65 (C(CH3)3), 48.07 (C-2'), 40.50 (2C, C-l, C-2), 32.98 (2C, C-3', C-l), 31.91 (2C, C-14', C-12), 29.75-29.6 (m, 14C), 29.53 (2C, C-13', C11), 29.35 (2C, C-6', C-4), 28.35 (3C, (C(CH3)3), 27.67 (2C, C-4', C-2), 22.68 (2C, C-15', C-13), 14.1 (2C, C-16', C-14). Pro C37H74N2O3 vypočteno: relativní molekulová hmotnost 595.0, monoisotopická hmotnost 594.6; nalezeno ESI-MS m/z: 595.6 ([M+H]+) (25), 617.6 ([M+Na]+) (100), 618.6 ([M+H+Na]+) (30), 1212.1 ([2M+Na]+) (50), 1213.1 ([2M+H+Na]+) (40). HR-MS m/z: pro C37H75N2O3
vypočteno 595.57722, nalezeno 595.57741; pro C37H74N2O3Na vypočteno 617.55917, nalezeno 617.55924.
Příklad 3
K míchanému roztoku 2-tetradecylhexadekanoylchloridu V (kde ni - 13; 0,39 g, 0,83 mmol) v dichlormethanu (25 ml) se přidá /V-terc-butoxykarbonyl-l,3-diaminopropan-hydrochlorid ((ChhhCO-(C=O)-HN-(CH2)n-NH2HCI, n = 3; 186 mg, 0,88 mmol) a následně /V-ethyldiizopropylamin (240 μΙ) a směs se míchá přes noc při laboratorní teplotě. Poté se ke směsi přidá dichlormethan (50 ml) a roztok se promyje vodným roztokem NaHSCU (5%; 2 x 15 ml) a vodou (2 x 15 ml). Organická fáze se vysuší nad bezvodým MgSO4 a odpaří za sníženého tlaku. Po chromatografíi odparku na sloupci silikagelu (110 ml) v systému toluen - etyl-acetát (gradient 0-42% etyl-acetát, 14 ml/min, 64 min, naneseno v CHCh) a následné lyofilizaci z dioxanu se získá 460 mg (94% výtěžek) /V2-(2tetradecylhexadekanoyl)-/V3-terc-butoxykarbony-l,3-diaminopropanu VI (kde ni = 13 a X je polymethylénová spojka obecného vzorce II kde n2 = 3). IČ spektrum (CHCI3): v=3347 (NH), 3308 (NH), 2953, 2919, 2850, 1684 (C=O; Boc), 1644 (Amid I), 1544 (Amid II), 1526 (Amid II), 1467, 1447, 1390 (CH3; Boc), 1365 (CH3; Boc), 1277,1248,1175, 940, 870, 720 cm’1. XH NMR spektrum (400 MHz, CDCI3): o= 6.20 (s, NTH); 4.98 (s, N3H); 3.31 (dt, J = 6, 5.7 Hz, 2H, H-l); 3.16 (t, J = 5.7 Hz, 2H, H-3); 2.04 (spt, J = 4.7 Hz, H-2'); 1.64-1.56 (m, 4H, H-3', H-l, H-2); 1.44 (s, 9H, 3 x CH3); 1.41-1.36 (m, 2H, H-3', H-l); 1.30-1.20 (m, 48H, 24 x CH2); 0.87 (t, J = 7.4 Hz, 6H, H-16', H-14). 13C NMR spektrum (100 MHz, CDCI3): σ= 176.65 (C-l'), 156.63 (N3C), 79.33 (C(CH3)3), 48.09 (C-2'), 36.98 (C-l), 35.55 (C3), 33.08 (2C, C-3', C-l), 31.91 (2C, C-14', C-12), 30.44 (C-2), 29.80-29.60 (m, 14C), 29.54 (2C, C13', C-ll), 29.35 (2C, C-6', C-4), 28.38 (3C, (C(CH3)3), 27.62 (2C, C-4', C-2), 22.68 (2C, C-15', C13), 14.1 (2C, C-16', C-14).Pro C38H76N2O3 vypočteno: relativní molekulová hmotnost 609.0, monoisotopická hmotnost 608.6 MS; nalezeno ESI MS m/z: 609.6, ([M+H]+) (100), 631.6 ([M+Na]+) (100), 632.6 ([M+H+Na]+) (40), 1218.2 ((2M+H]+) (20), 1240.2 ([2M+H+Na]+) (40). HR-MS m/z: pro C38H77N2O3 vypočteno 609.59287, nalezeno 609.59311; pro C3sH76N2O3Na vypočteno 631.57482, nalezeno 631.57487.
Příklad 4
K míchanému roztoku 2-tetradecylhexadekanoylchloridu V (kde ni = 13; 0,5 g, 1,06 mmol) v dichlormethanu (30 ml) se přidá A/-terc-butoxykarbonyl-3,6-dioxa-l,8-diaminooktan ((CFhhC-O(C=O)-HN-(CH2)ž-[O-(CH2)]n-O-(CH2)2NH2, n = 1; 260 mg, 0,96 mmol) a následně Nethyldiizopropylamin (310 pl) a směs se míchá při laboratorní teplotě přes noc. Poté se přidá dichlormethan (60 ml) a roztok se promyje vodným roztokem NaHSCU (5%; 2 x 19 ml) a vodou (2 x 19 ml). Organická fáze se vysuší nad bezvodým MgSO4 a za sníženého tlaku odpaří. Po Chromatografií odparku na sloupci silikagelu (110 ml) systému toluen - etyl-acetát (gradient 0-84% etyl-acetát, 15 ml/min, 44 min, naneseno v CHCI3) a následné lyofilizaci odparku homogenní frakce z dioxanu se získá 650 mg (90% výtěžek) /V1-(2-tetradecylhexadekanoyl)-/V3-te/'c-butoxykarbony-l,8-diamino-2,6dioxaoktanu VI (kde ni = 13 a X polyethylenglykolová spojka obecného vzorce III kde m = 1). IČ spektrum (CHCI3): v=3364 (NH), 3292 (NH), 2954, 2919, 2850, 1687 (C=O; Boc), 1644 (Amid I), 1552 (Amid II), 1532 (Amid II), 1466,1391 (CH3; Boc), 1365 (CH3; Boc), 1282,1255,1178,1137,1115,1034, 870, 721 cm A XH NMR spektrum (400 MHz, CDCI3): o= 7.35 (s, NXH); 6.04 (s, N8H); 3.61 (dt, J = 4.7 Hz, 4H, H-2, H-7); 3.55 (t, J = 5.1 Hz, 4H, H-4, H-5); 3.48 (dt, J = 4.7 Hz, 2H, H-8); 3.31 (t, J = 5.1 Hz, 2H, H-l); 2.05 (spt, J = 4.7 Hz, H-2'); 1.64-1.54 (m, 2H, H-3', H-l); 1.45 (s, 9H, 3 x CH3); 1.41-1.35 (m, 2H, H-3', H-l); 1.30-1.20 (m, 48H, 24 x CH2); 0.87 (t, J = 7.4 Hz, 6H, H-16', H-14). 13C NMR spektrum (100 MHz, CDCI3): o= 176.65 (C-l'), 156.11 (N8C), 79.54 (C(CH3)3), 70.38-70.11 (m, 4C, C-2, C-4, C-5, C-7), 47.85 (C-2'), 40.48 (C-8), 39.29 (C-l), 33.05 (2C, C-3', C-l), 31.91 (2C, C-14', C-12), 29.7529.60 (m, 14C), 29.57 (2C, C-13', C-ll), 29.35 (2C, C-6', C-4), 28.38 (3C, (C(CH3)3), 27.62 (2C, C-4', C-2), 22.68 (2C, C-15', C-13), 14.1 (2C, C-16', C-14).Pro C41H82N2O5 vypočteno: relativní molekulová hmotnost 683.2, monoisotopická hmotnost 682.6; nalezeno ESI-MS m/z: 683.6 ([M+H]+) (10), 705.6 ([M+Na]+) (100), 1388.2 ([2M+H]+) (20), 1240.2 ([2M+Na]+) (15). HR-MS m/z: pro C41H83N2O5 vypočteno 683.62965, nalezeno 683.62995; pro C4iHs2N2O5Na vypočteno 705.61159, nalezeno 705.61178.
Příklad 5
Směs 2-tetradecylhexadekanové kyseliny (111 mg, 0,245 mmol), HATU (1[bis(dimethylamino)methylen]-lH-l,2,3-triazolo[4,5-b]pyridinium-3-oxid-hexafluorofosfát) 100 mg, 0,262mmol), /V,A/-dimethylaminopyridinu (katalytické množství) se za vakua (20 Pa) suší 4 hod. Aparatura se propláchne argonem a pod argonem se přidá suchý /V,/V-dimethylformamid (4 ml) a N• · · • · methylmorfolin (50 μΙ) a vzniklý roztok se míchá při laboratorní teplotě 1 hod. K roztoku se za míchání přidá /V-terc-butoxykarbonyl-3,6-dioxa-l,8-diaminooktan ((CH3)3C-O-(C=O)-HN-(CH2)2-[O-(CH2)]n-O(CH2)2NH2, n = 1; 50 μΙ, 0,242 mmol) a dichlormethan (5 ml) a v míchání se pokrčuje při laboratorní teplotě přes noc. Směs se za vakua (20 Pa) odpaří a odparek se rozpustí v dihlormethanu (15 ml). Roztok se promyje vodným nasyceným roztokem NaHCO3 (2 x 10 ml), vodným roztokem NaHSCL (5%; 2 x 10 ml) a vodou (2 x 10 ml). Organická fáze se vysuší nad bezvodým MgSO4 a za sníženého tlaku odpaří a odparek se kodestiluje s dioxanem (3 x lOml). Po chromatografii odparku na sloupci silikagelu (120 ml) v systému toluen - etyl-acetát (gradient 0-50% etyl-acetát, 14 ml/min, 84min) a následné lyofilizaci odparku homogenní frakce z dioxanu se získá 148 mg (90% výtěžek) ^-(2tetradecylhexadekanoyl)-/V3-terc-butoxykarbony-l,8-diamino-2,6-dioxaoktanu VI (kde ni = 13 a X polyethylenglykolová spojka obecného vzorce III kde n3 = 1) identického s produktem získaným dle postupu popsaném v příkladu 4.
Příklad 6
Roztok A/ffž-tetradecylhexadekanoyQ-A/^terc-butoxykarbony-l^-diaminoethanu VI (kde ni = 13 a X je polymethylénová spojka obecného vzorce II kde n2 = 2; 420 mg, 0,71 mmol) ve směsi dichlormethanu (12 ml) a kyseliny trifluoroctové (1,5 ml) se míchá při laboratorní teplotě 3 hod. Rozpouštědla se oddestilují a odparek se kodestiluje s dichlormethanem (3x3 ml) a následně za vakua (20 Pa) suší 8 hod. Po lyofilizaci odparku z dioxanu se získá 430 mg (100% výtěžek) Λ/2-(2tetradecylhexadekanoyl)-l-amino-2-amoniumethan-trifluotacetátu VII (kde ni = 13 a X je polymethylénová spojka obecného vzorce II kde Π2 = 2). Pro C32H66N2O vypočteno: relativní molekulová hmotnost 494.9, monoisotopická hmotnost 494.5; nalezeno ESI-MS m/z: 495.5 ((M+H]+) (100), 517.5 ([M+Na]+) (30). HR-MS m/z: pro C32H67N2O vypočteno 495.52479, nalezeno 495.52480.
Příklad 7
Roztok A/J-(2-tetradecylhexadekanoyl)-/V3-terc-butoxykarbony-l,3-diaminopropanu VI (kde ni = 13 a X je polymethylénová spojka obecného vzorce II kde n2 = 3; 359 mg, 0,69 mmol) ve směsi dichlormethanu (12 ml) a kyseliny trifluoroctové (1,5 ml) se míchá při laboratorní teplotě 3 hod. Rozpouštědla se oddestilují a odparek se kodestiluje s dichlormethanem (3x3 ml) a následně za vakua (20 Pa) suší 8 hod. Po lyofilizaci odparku z dioxanu se získá 430 mg (100% výtěžek) /VJ-(214 tetradecylhexadekanoyl)-l-amino-3-amoniumpropan-trifluotacetátu VII (kde ni = 13 a X je polymethylénová spojka obecného vzorce II kde n2 = 3). Pro C33H68N2O vypočteno: relativní molekulová hmotnost 508.9, monoisotopická hmotnost 508.5; nalezeno ESI-MS m/z: 509.5 ([M+H]+) (100). HR-MS m/z: pro C33H69N2O vypočteno 509.54044, nalezeno 509.54046.
Příklad 8
Roztok Afi-p-tetradecylhexadekanoylj-Af-terc-butoxykarbony-LS-diamino^G-dioxaoktanu IV (kde ni = 13 a X polyethylenglykolová spojka obecného vzorce III kde Π3 = 1; 680 mg, 1 mmol) se míchá ve směsi dichlormethanu (12 ml) a kyseliny trifluoroctové (2 ml) teploty při laboratorní teplotě 3 hod. Rozpouštědla se oddestilují a odparek se kodestiluje s dichlormethanem (3x3 ml) a následně za vakua (20 Pa) suší 8 hod. Po lyofilizaci odparku z dioxanu se získá 696 mg (100% výtěžek) ^-(2tetradecylhexadekanoyl)-l-amino-8-amonium-2,6-dioxaoktan-trifluotacetátu VII (kde ni = 13 a X polyethylenglykolová spojka obecného vzorce III kde n3 = 1). Pro C36H74N2O3 vypočteno: relativní molekulová hmotnost 583.0, monoisotopická hmotnost 582.6; nalezeno ESI-MS m/z: 583.6 ([M+H]+) (100), 605.6 ([M+Na]+) (40). HR-MS m/z: pro C36H75N2O3 vypočteno 583.57722, nalezeno 583.57721; pro C36H74l\l2O3Na vypočteno 605.55971, nalezeno 605.55905.
Příklad 9
K míchanému roztoku ^-(Z-tetradecylhexadekanoylj-l-amino-Z-amoniumethan-trifluotacetátu VII (kde ni = 13 a X je polymethylénová spojka obecného vzorce II kde n2 = 2; 135 mg, 0,22 mmol) v dichlormethanu (10 ml) se přidá /V,A/-dimethylaminopyridin (38 mg, 0,31 mmol), kyselina /V-tercbutoxykarbonylaminooxyoctová (58 mg; 0,27 mmol) a diisopropylkarbodiimid (41 μΙ, 0,26 mmol) a směs se míchá při laboratorní teplotě přes noc. Poté se ke směsi přidá dichlormethan (15 ml) a roztok se promyje nasyceným vodným roztokem NaHCCh (2 x 10 ml), vodným roztokem NaHSO4 (5%; 2 x lOml) a vodou (2 x 10 ml). Organická fáze se oddělí, vysuší nad bezvodým MgSO4 a za sníženého tlaku odpaří. Po chromatografii odparku na sloupci silikagelu (100 ml) v systému toluen - etyl-acetát (gradient 10-73% etyl-acetát, 14 ml/min, 74 min, naneseno v CHCI3) a následné lyofilizaci odparku z dioxanu se získá 126 mg (86% výtěžek) A/J-(2-tetradecylhexadekanoyl)-/V2-(/V-tercbutoxykarbonylamiooxyacetyl)-l,2-diaminoethanu Vlil (kde ni = 13 a X je polymethylénová spojka obecného vzorce II kde n2 = 2). IČ spektrum (CHCI3): v=3392 (NH), 3280 (NH), 3099,2954, 2919, 2850, ·· ···· ·· · · ! ě ♦ · c ·· · * αΣ· *·· ♦ · •· ·· ···
1755 (C=0; Boc), 1726 (C=O; Boc), 1707, 1645 (Amid I), 1551 (Amid II), 1467, 1447, 1390 (CH3; Boc), 1368 (CH3; Boc), 1283, 1253, 1234, 1164, 1105, 1048, 1014, 973, 761, 719 cm1; XH NMR spektrum (400 MHz, CDCI3): o= 8.23 (s, ΝΧΗ); 7.84 (s, N2H); 6.39 (s, NHCO2); 3.45 (s, 4H, H-l, H-2); 2.04 (spt, J =
4.7 Hz, H-2'); 1.6-1.54 (m, 2H, H-3', H-l); 1.49 (s, 9H, 3 x CH3); 1.43-1.35 (m, 2H, H-3', H-l); 1.321.18 (m, 48H, 24 x CH2); 0.87 (t, J = 7.0 Hz, 6H, H-16', H-14). 13C NMR spektrum (100 MHz, CDCI3): 0= 177.42 (C-l'), 169.83 (N2C), 157.71 (NHCO2) 83.11 (C(CH3)3), 76.42 (C=OCH2O); 48.01 (C-2'), 39.60 (2C, C-l, C-2), 32.93 (2C, C-3', C-l), 31.91 (2C, C-14', C-12), 29.75-29.6 (m, 14C), 29.53 (2C, C-13', C-ll), 29.35 (2C, C-6', C-4), 28.15 (3C, (C(CH3)3), 27.66 (2C, C-4', C-2), 22.68 (2C, C-15', C-13), 14.11 (2C, C-16', C-14). Pro C3gH77N30s vypočteno: relativní molekulová hmotnost 668.1, monoisotopická hmotnost 667.6; nalezeno ESI-MS m/z: 690.6 ([M+Na]+) (100), 691.6 (|M+H+Na]+) (40). HR-MS m/z: pro C3gH78N30s vypočteno 668.59360, nalezeno 668.59363; pro C3gH77N30sNa vypočteno 690.57554, nalezeno 690.57564.
Příklad 10
K míchanému roztoku /V1-(2-tetradecylhexadekanoyl)-l-amino-3-amoniumpropan-trifluotacetátu VII (kde ni = 13 a X je polymethylénová spojka obecného vzorce II kde n2 = 3; 181 mg, 0,29 mmol) v dichlormethanu (13 ml) se přidá A/,A/-dimethylaminopyridin (50 mg; 0,41 mmol), kyselina /V-tercbutoxykarbonylaminooxyoctová (76 mg, 0,35 mmol) a diisopropylkarbodiimid (56 μΙ, 0,36 mmol) a směs se míchá při laboratorní teplotě přes noc. Poté se ke směsi přidá dichlormethan (18 ml) a roztok se promyje nasyceným vodným roztokem NaHCO3 (2 x 16 ml), vodným roztokem NaHSCU (5%; 2 x 16 ml) a vodou (2 x 16 ml). Organická fáze se oddělí, vysuší nad bezvodým MgSO4 a za sníženého tlaku odpaří. Po chromatografii odparku na sloupci silikagelu (100 ml) v systému toluen - etyl-acetát (gradient 10-73% etyl-acetát, 14 ml/min, 74 min, naneseno v CHCI3) a následné lyofilizaci odparku z dioxanu se získá 174 mg (88% výtěžek) /7^-(2 tetradecylhexadekanoyl)-/73-(N-tercbutoxykarbonylamiooxyacetyl)-l,3-diaminopropanu Vlil (kde ni = 13 a X je polymethylénová spojka obecného vzorce II kde n2 = 3). IČ spektrum (CHCI3): v=3392 (NH), 3280 (NH), 3086, 2954, 2919, 2850, 1755 (C=O; Boc), 1726 (CH3; Boc), 1645 (Amid I), 1544 (Amid II), 1467, 1437, 1393 (CH3; Boc), 1368 (CH3; Boc), 1271, 1252, 1173, 1132, 1050, 1016, 984, 758, 719 cm1; XH NMR spektrum (400 MHz, CDCIs): o= 8.24 (s, N^); 8.1 (s, N2H); 6.53 (s, NHCO2); 4.33 (dt, 2H, 7 = 6, 5.7 Hz, H-l); 3.29 (dt, 2H, J = 6, 5.7 Hz, H-3); 2.06 (spt, J = 4.7 Hz, H-2'); 1.68 (tt, 2H, J = 4.7, 4.7 Hz, H-2); 1.6-1.54 (m, 2H, H-3', • ·
H-l); 1.47 (s, 9H, 3 x CH3); 1.43-1.37 (m, 2H, H-3', H-l); 1.32-1.18 (m, 48H, 24 x CH2); 0.87 (t, J = 7.0 Hz, 6H, H-16', H-14). 13C NMR spektrum (100 MHz, CDCI3): σ= 176.96 (C-Γ), 169.75 (N2C), 157.78 (NHCO2) 82.89 (C(CH3)3), 75.95 (OOCH2O); 48.10 (C-2'), 35.44 (C-l), 35.23 (C-3), 33.02 (2C, C-3', C1), 31.91 (2C, C-14', C-12), 29.75-29.6 (m, 14C), 29.54 (2C, C-13', C-ll), 29.35 (2C, C-6', C-4), 29.21 (C-2), 28.09 (3C, (C(CH3)3), 27.70 (2C, C-4', C-2), 22.67 (2C, C-15', C-13), 14.11 (2C, C-16', C14). Pro C40H79N3O5 vypočteno: relativní molekulová hmotnost 682.1, monoisotopická hmotnost 681.6; nalezeno ESI-MS m/z: 704.6 ([M+Na]+) (100), 405.6 ([M+H+Na]+) (40). HR-MS m/z; pro C40H80N3O5 vypočteno 682.60925, nalezeno 682.60931; pro C4oH79N3OsNa vypočteno 704.59119, nalezeno 704.59123.
Příklad 11
K míchanému roztoku /V1-(2-tetradecylhexadekanoyl)-l-amino-8-amonium-2,6-dioxaoktatrifluotacetátu VII (kde ni = 13 a X polyethylenglykolová spojka obecného vzorce III kde n3 = 1; 414 mg, 0,575 mmol) v dichlormethanu (3,5 ml) se přidá A/-A/-dimethylaminopyridin (98 mg, 0,8 mmol), kyselina /V-terc-butoxykarbonylaminooxyoctová (151 mg, 0,69 mmol) a diisopropylkarbodiimid (110 μΙ, 0,71 mmol) a směs se míchá při laboratorní teplotě přes noc. Poté se ke směsi přidá dichlormethan (40 ml) a roztok se promyje nasyceným vodným roztokem NaHCO3 (2 x 35 ml), vodným roztokem NaHSCU (5%; 2 x 35 ml) a H2O (2 x 35 ml). Organická fáze se oddělí, vysuší nad bezvodým MgSO4 a za sníženého tlaku odpaří. Po chromatografii odparku na sloupci silikagelu (110 ml) v systému toluen - etyl-acetát (gradient 10-100% etyl-acetát, 14 ml/min, 74 min, naneseno v CHCI3) a následné lyofilizaci odparku z dioxanu se získá 370 mg (85% výtěžek) A/J-(2 tetradecylhexadekanoyl)-/V8-(/V-terc-butoxykarbonylamiooxyacetyl)-l,8-diamino-2,6-dioxaoktanu Vlil (kde m = 13 a X polyethylenglykolová spojka obecného vzorce III kde n3 = 1). IČ spektrum (CHCI3): v=3392 (NH), 3292 (NH), 3090, 2954, 2919, 2850, 1756 (C=O; Boc), 1644 (Amid I), 1551 (Amid II), 1467, 1425, 1394 (CH3; Boc), 1368 (CH3; Boc), 1321, 1273, 1251, 1166, 1137, 1115, 1034, 980, 854,758, 721, 594 cm-1; Ψ NMR spektrum (400 MHz, CDCI3): o= 8.07 (s, N1^; 7.99 (s, N2H); 6.22 (s, NHCO2); 3.62 (s, 4H, H-4, H-5); 3.59 (t, J = 5.4 Hz, 2H, H-7); 3.55 (t, J = 5.3 Hz, 2H, H-2); 3.51 (dt, J =
5.5 Hz, J = 5.3 Hz 2H, H-l); 3.45 (dt, J = 5.5 Hz, J = 5.0 Hz 2H, H-l); 2.06 (spt, J = 4.8 Hz, H-2'); 1.6-1.54 (m, 2H, H-3', H-l); 1.47 (s, 9H, 3 x CH3); 1.43-1.37 (m, 2H, H-3', H-l); 1.32-1.18 (m, 48H, 24 x CH2); 0.87 (t, J = 7.0 Hz, 6H, H-16', H-14). 13C NMR spektrum (100 MHz, CDCI3): 0= 176.47 (C-l'), 168.92 • · o • · · ·” • · · · · ·· • · · · ·* ·· ·· ·····♦ « (N2C), 157.56 (NHCO2) 82.77 (C(CH3)3), 75.99 (C=OCH2O); 70.28 (1C, C4); 70.25 (1C, C-5); 70.13 (2C, C-2, C-7); 47.90 (C-2'); 39.04 (1C, C-8); 38.75 (1C, C-l); 33.02 (2C, C-3', C-l), 31.91 (2C, C-14', C12), 29.75-29.6 (m, 14C), 29.57 (2C, C-13', C-ll), 29.34 (2C, C-6', C-4), 28.09 (3C, (C(CH3)3), 27.70 (2C, C-4', C-2), 22.67 (2C, C-15', C-13), 14.11 (2C, C-16', C-14). Pro C43H85N3O7 vypočten: relativní molekulová hmotnost 742.2, monoisotopická hmotnost 741.7; nalezeno ESI-MS m/z: 756.6 ((M+H]+) (5), 778.6 ([M+Na]+) (100). HR-MS m/z: pro C43H86N3O7 vypočteno 756.64603, nalezeno 756.64616; pro C43H85N3O7Na vypočteno 778.62797, nalezeno 778.62805.
Příklad 12
Roztok /V2-(2-tetradecylhexadekanoyl)-/V2-(/\/-terc-butoxykarbonylamiooxyacetyl)-l,2diaminoethanu Vlil (kde ni = 13 a X je polymethylénová spojka obecného vzorce II kde n2 = 2; 202 mg, 0,3 mmol) se míchá ve směsi dichlormethanu (8 ml) a kyseliny trifluoroctové kyseliny (8 ml) při laboratorní teplotě 2,5 hod. Rozpouštědla se za sníženého tlaku oddestilují a odparek se kodestiluje s dichlormethanem (3x4 ml) a následně za vakua (20 Pa) suší 8 hod. Po lyofilizaci odparku z dioxanu se získá 200 mg (97% výtěžek) /V1-(2-tetradecylhexadekanoyl)-/V2-amoniumoxyacetyl-l,2diaminoethan-trifluoracetátu I (kde ni = 13 a X je polymethylénová spojka obecného vzorce II kde n2 = 2). Pro C34H69N3O3 vypočten: relativní molekulová hmotnost 567.9, monoisotopická hmotnost 567.5; nalezeno ESI-MS m/z: 575.5 ([M-NH2+H+Na]+) (80), 590.6 ([M+Na]+) (100). HR-MS m/z: pro C34H70N3O3 vypočteno 568.54117, nalezeno 568.54138; pro C34H69N3O3Na vypočteno 590.52311, nalezeno 590.52322.
Příklad 13
Roztok N1-(2 tetradecylhexadekanoyl)-A/2-(N-terc-butoxykarbonylamiooxyacetyl)-l,3diaminopropanu Vlil (kde ni - 13 a X je polymethylénová spojka obecného vzorce II kde n2 = 3; 87 mg, 0,13 mmol) se míchá ve směsi dichlormethanu (3,5 ml) a kyseliny trifluoroctové (3,5 ml) při laboratorní teplotě 2,5 hod. Rozpouštědla se oddestilují a odparek se kodestiluje s dichlormethanem (3x2 ml) a následně za vakua (20 Pa) suší 8 hod. Po lyofilizaci odparku z dioxanu se získá 87 mg (99% výtěžek) /VJ-(2 tetradecylhexadekanoyl)-/V2-amoniuoxyacetyl-l,3-diaminopropan-trifluoracetátu I (kde ni = 13 a X je polymethylénová spojka obecného vzorce II kde n2 = 3). Pro C35H71N3O3 vypočteno: relativní molekulová hmotnost 582.0, monoisotopická hmotnost 581.6; nalezeno ESI-MS m/z: 604.4 • · ([M+Na]+) (100). HR-MS m/z: pro C35H72N3O3 vypočteno 582.55682, nalezeno 582.55702; pro C35H7iN3O3Na vypočteno 604.53876, nalezeno 604.53892.
Příklad 14:
Roztok /VJ-(2 tetradecylhexadekanoyl)-/Vs-(A/-terc-butoxykarbonylamiooxyacetyl)-l,8-diamino-2,6dioxaoktanu Vlil (kde ni = 13 a X polyethylenglykolová spojka obecného vzorce III kde n3 = 1; 345 mg, 0,13 mmol) se míchá ve směsi dichlormethanu (14 ml) a kyseliny trifluoroctové (14 ml) při laboratorní teplotě 2,5 hod. Rozpouštědla se oddestilují a odparek se kodestiluje s dichlormethanem (3x8 ml) a následně za vakua (20 Pa) suší 8 hod. Po lyofilizaci odparku z dioxanu se získá 330 mg (98% výtěžek) A/1-(2-tetradecylhexadekanoyl)-/Vs-amoniumoxyacetyl-l,8-diamino-2,6-dioxaoktantrifluoracetátu I (kde ni = 13 a X polyethylenglykolová spojka obecného vzorce III kde Π3 = 1). Pro C38H77N3O5 vypočteno: relativní molekulová hmotnost 656.1, monoisotopická hmotnost 655.6; nalezeno ESI-MS m/z: 604.4 ([M+Na]+) (100). HR-MS m/z: pro C38H78N3O5 vypočteno 656.59360, nalezeno 656.59380; pro CssfůzNsOsNa vypočteno 678.57554, nalezeno 678.57573.
Příklady provedení - povrchová modifikace liposomů a biologické aktivity
Příklad 15
Příprava liposomů se zabudovanými aminooxylipidy obecného vzorce I (dle příkladu 12,13 a 14).
Metody: Liposomy se zabudovaným aminoxylipidem byly připraveny hydratací fosolipidního filmu. Lipidy byly společně rozpuštěny v chloroformu v koncentraci lOmg lipidu/1 ml chloroformu v molárním poměru 99% EPC na 1% aminooxylipidů obecného vzorce I (dle příkladu 12, 13 a 14). Chloroformový roztok byl odpařen v baňce kulovitého tvaru na vakuové rotační odparce; tlak 100 hPa, teplota vodní lázně 37 °C, otáčky 90/min). Vytvořený lipidový film byl hydratován PBS (pH 7,2, 0,14M NaCl, 20 mM Na-fosfát) na výslednou koncentraci 10 mg/ml. Liposomy byly následně extrudovány přes polykarbonátové filtry Nucleopore s velikostí pórů 400 a 100 nm. Velikost a zetapotenciál nyly stanoveny na přístroji Nanosizer ZS (Malvern, Velká Británie) v cele DTS při attenuátoru 4, teplotě 25 °C.
Výsledky: zabudování /V-aminooxylipidů obecného vzorce I (dle příkladu 12, 13 a 14) do liposomů nemá podstatný vliv na konečnou distribuci liposomů. Příklad s lipidem obecného vzorce I (dle příkladu 12): EPC liposomy: velikost 82 nm, PDI 0,11; EPC+ aminooxylipid 1%: velikost 81 nm, PDI 0,1.
Aminooxylipidy obecného vzorce I (dle příkladu 12,13 a 14) jsou schopny s dalšími pomocnými lipidy (EPC = vaječný fosfatidyl cholin) tvořit stabilní lipidní dvojvrstvu a tudíž je lze použít na přípravu liposomů. Velikost liposomů koresponduje s velikostí pórů použitého filtru pro extruzi. Zeta potenciál liposomů obsahujících 1% aminoxylipidu obecného vzorce I (dle příkladu 12, 13 nebo 14) v neutrálním pH roztoku PBS dosahuje hodnot kolem 0 mV.
Příklad 16
Cytotoxicita liposomů a se zabudovanými aminooxylipidy obecného vzorce I
Metody: Cytotoxicita liposomů připravených postupem popsaným v příkladu 15 se stanoví srovnáním cytotoxicity EPC liposomů a EPC liposomů se zabudovaným aminooxylipidem obecného vzorce I (dle příkladu 12, 13 nebo 14) v in vitro experimentech s T-lymfocyty a na buňkách H1299 nádorové linie plicního nádoru.
Měření bylo provedeno na flowcytometru Fortessa (Beckton Dickinson). Apoptické buňky byly detekovány a kvantifikovány pomocí fluorescenčního barviva Annexin V (Invitrogen)
Ve všech experimentech bylo pracováno s 500 pl media v jamce, obsah lipidu 100 pg na 1 ml media. Inkubovány byly nemodifikované liposomy a postliposomálně modifikované liposomy hyaluronovou kyselinou. V experimentu 1 byly plicní nádorové buňky H1299 inkubovány 30 minut při teplotě 4°C.
V experimentu 2 byly použity T-lymfocyty, které byly inkubovaný při laboratorní teplotě v rotátoru.
V experimentech 3 a 4 byly použity buňky plicní nádorové linie H1299, které byly inkubovány 2 hodiny v CO2 inkubátoru (37°C, 5% CO2) V pokusu 5 byly použity plicní nádorové buňky H1299, které byly 30 minut inkubovány v lednici při teplotě 4°C.
Výsledky: Zabudování aminooxylipidů obecného vzorce I (dle příkladu 12,13 nebo 14) do liposomální dvojvrstvy liposomů nemá za následek zvýšení jejich cytotoxicity. Netoxičnost byla prokázána srovnáním cytotoxicity EPC liposomů a EPC liposomů se zabudovaným aminooxylipidem obecného • · · vzorce I (dle příkladu 12, 13 nebo 14) v in vitro experimentech s T-lymfocyty a buňkách H1299 nádorové linie plicního nádoru.
Data jsou uvedena v tabulce (Tabulka 1).
Příklad 17
Příprava liposomů s navázanou HA přes redukující konec její molekuly; změna velikosti liposomů s 1% aminooxylipidem obecného vzorce I (dle příkladu 12, 13 nebo 14) po navázání HA; DLS a TEM snímky struktury liposomů s návázanou HA
Metody: Liposomy připravené postupem popsaným v příkladu 15, obsahující 1% aminoxylipidu obecného vzorce I (dle příkladu 12,13 nebo 14) o výchozí koncentraci 10 mg/ml PBS, byly smíchány s HA (Mr 10440, Contipro) o koncentraci 1 mg/ml PBS v poměru 1 mg celkového lipidu na 0,1 mg HA. Inkubace probíhá minimálně 30 minut při pokojové teplotě. Nadbytečná HA byla ostraněna gelovou chromatografii na koloně Superose 6 (Pharmacia).
Měření na DLS probíhalo za stejných podmínek jako v příkladu 15.
Pro TEM (Philips 208S Morgagni,FEI, Czech Republic) byly preparáty barveny molybdenanem amonným (1% roztok), pro SEM (Hitachi SU 8010, Hitachi Ltd., Japan) se preparáty nebarvily a pro KryoTEM bylo použito kontrastní barvení pomoci uranyl acetátu (UO2+2; 0.05%) vzhledem k jeho selektivní elektrostatické vazbě na HA
Výsledky: Měření DLS
Kyselina hyaluronová 5-15 kDa: velikost 5-6 nm; nemodifikované liposomy: velikost 71 nm; liposomy s navázanou HA: velikost 82 nm; ζ-potenciál prázdných liposomů byl 0,4 mV, po navázání HA (Mr 10440) klesl na -4,4 mV.
Výsledky z TEM a SEM (Obrázek 1); patrná je kartáčová struktura tvořená lineárními vlákny HA, viz. šipky.
Výsledky z kryoTEM (Obrázek 2); vnější vrstva HA je více kontrastní vzhledem k vazbě s UO2 +2 (černá šipka). Síla této vrstvy je 3.5-6.7 nm, což je v dobrém souladu s hydrodynamickým průměrem molekuly HA. Vnitřní vrstva (bílá šipka) representuje fosfolilpidovou dvojvrstvu o síle 3.7 - 4.2 nm.
• · • ·
Zvětšení velikosti liposomů (měřeno pomocí DLS) je zhruba 7-12 nm, což je v dobrém souladu s daty získanými pomocí kryoTEM (bílá úsečka o délce 10 nm).
Příklad 18
Příprava liposomů s navázanou kyselinou hyaluronovou o Mr 391 kDa přes redukující konec její molekuly
Metody: Liposomy připravené postupem popsaným v příkladu 15, obsahující 1% aminoxylipidu obecného vzorce I (dle příkladu 12, 13 nebo 14) o výchozí koncentraci 10 mg/ml PBS, byly smíchány s HA (Mr 391 kDa, Contipro) o koncentraci 1 mg/ml PBS v poměru 1 mg celkového lipidu na 0,1 mg HA. Inkubace probíhá minimálně 30 minut při pokojové teplotě. Nadbytečná HA byla ostraněna gelovou chromatografii na koloně Superose 6 (Pharmacia).
Výsledky: ζ-potenciál prázdných liposomů je -0,4 mV a po přidání HA (Mr 391 KDa) klesl na -7 mV. Nárůst velikosti liposomů modifikovaných HA je 20 nm. Snímky z TEM potvrzují navázání HA o Mr 391 kDa.
Příklad 19
Příprava liposomů s fluoerscenčně značenou HK
Metody: Liposomy připravené postupem popsaným v příkladu 15, obsahující 1% aminoxylipidu obecného vzorce I (dle příkladu 12,13 nebo 14) o výchozí koncentraci 10 mg/ml PBS, byly smíchány s HA modifikovanou FITC (Sigma-Aldrich) o koncentraci 1 mg/ml PBS v poměru 1 mg celkového lipidu na 0,1 mg HA. Inkubace probíhá minimálně 30 minut při pokojové teplotě. Nadbytečná HA byla ostraněna gelovou chromatografii na koloně Superose 6 (Pharmacia). Takto připravené liposomy jsou dále použity v pokusech, kde je výhodou jejich zobrazení pomocí fluorescenčních technik (fluorescenční mikroskopie, fluorimetrie).
Příklad 20
Příprava liposomů s navázaným imunoglobulinem třídy IgY modifikovaným aldehydovými skupinami vygenerovanými oxidativním štěpením jeho sacharidové složky a specifická interakce liposomů s bakteriíS. aureus
Metody: Liposomy připravené postupem popsaných v příkladu 15, obsahující 1% aminoxylipididu obecného vzorce I (dle příkladu 14) o výchozí koncetraci 10 mg/ml PBS, byly smíchámy s IgY • · • · · ·
aktivovanou iodistanem v PBS v poměru 1 mol aminoxylipidu na 1 mol IgY. Inkubace probíhá minimálně 30 minut při pokojové teplotě. Nadbytečný nenavázaný IgY byl odstraněn gelovou chromatografií na koloně Superose 6. Použitý IgY byl izolován ze žloutků vajec od slepice imunizované usmrcenými bakteriemi S. aureus. Bakterie S. aureus byly inkubovány s fluorescenčně značeným IgY (fluorescein) z vajec imunizovaných slepic.
Výsledky: Rozdíl přibližně 19 nm mezí nemodifikovanými liposomy a proteoliposomy s navázaným IgY odpovídá zvětšení velikosti liposomů vlivem homogenního navázání IgY na jejich povrch, což bylo stanoveno pomocí DLS (Obrázek 3) a TEM (Obrázek 4a,b). Specifický IgY se vázal na bakterie a došlo k jejich označení; IgY nemá schopnost agregovat antigeny a proto jsou jednotlivé kroky oddělené (Obrázek 4c). Fluorescenčně zančené liposomy (fluoresceinfosfatidyl etanolamin) s navázaným specifickým IgY interagovaly s bakteriemi, došlo k jejich fluorescenčnímu označení a agregaci (Obrázek 4d). Vazba na bakterie byla pozorována na fluorescenčním mikroskopu. Výsledek prokazuje, že vazba imunoglobulinů na liposomy metodou N-oxy ligace zachovává jejich schopnost rozopoznat antigen, agregovat ho a zacílit terapeutikum k buňkám (např. cytostatikum) nebo bakteriím (antibiotikum). V případě bakterií je tentosystém vhodný pro léčbu mastitid u dojnic.
Příklad 21
Vazba polysacharidu mannanu na liposomy a stimulace dendritických buněk liposomy s navázaným mannanem
Metody: Liposomy připravené postupem popsaným v příkladu 15, obsahující 1% aminoxylipididu obecného vzorce I (dle příkladu 14) o výchozí koncetraci 10 mg/ml PBS, byly smíchány s roztokem mannanu v PBS v poměru 1 mg celkového lipidu na 0,1 mg mannanu. Reakce probíhala při pokojové teplotě. Nízkomolekulární komponenty a nenavázaný mannan byly odstraněny gelovou chromatografií na koloně Superose 6. Průkaz vazby mannanu na povrch liposomů byl proveden: a) skenovací a transmisní elektronovou mikroskopií; b) změna velikosti liposomů byla stanovena technikou DLS (Zetasizer ZS, Malvern UK). Polysacharid mannan byl izolován z kvasinky Candida albicans. Velikost molekuly mannanu a liposomů byla měřena pomocí DLS. Modifikace povrchu liposomů byla rovněž prokázána pomocí TEM a SEM. Dendritické buňky byly připraveny kultivací z periferní krve zdravých dárců. Stimulační aktivita byla srovnána s aktivitou lipopolysacharidu (LPS, standard Salmonela minesota).
• · · ·
Výsledky: Molekula mannanu má velikost 6 nm, nemodifikované liposomy mají velikost 145 nm a liposomy s navázaným mannanem mají velikost 155 nm. Z čehož je zřejmé, že došlo ke zvětšení o 10 nm což je v dobré korelaci s teoreticky očekávaným nárůstem o 12 nm (dvojnásobek velikosti molekuly mannanu). Distribuce velikosti distribuce velikosti je znázorněna na Obrázku 5. Molekuly vázaného mannanu jsou patrné na snímcích z elektornové mikroskopie po negativním barvení molybdenanem amonným (Obrázek 6). Liposomy s navázaným mannanem si zachovávaly výraznou imunostimulační aktivitu, která byla prokázána na lidských dendritických buňkách in vitro. Konfokální mikroskopie prokázala interakci liposomů modifikovaných mannanem s denritickými buňkami (DC) a internalizaci do cytoplasmy (Tabulka 2). Specifické markéry aktivace dendritických buněk byly sledovány pomocí průtokové cytometrie. Interakce s DC byla zobrazena zobrazenou pomocí konfokální mikroskopie (Obrázek 7).
Příklad 22:
Srovnání vazby HA na liposomy prezentující aonooxyskupinu vs. liposomy prezetující aminoskupinu
Metody: Liposomy prezentující aonooxyskupinu byly připraveny postupem popsaným v příkladu 15; obsahující 1% aminoxylipididu obecného vzorce I (dle příkladu 14) o výchozí koncetraci 10 mg/ml PBS. Liposomy prezentující aminoskupinu byly připraveny stejnou technikou s lipidem DOPE obsahujícím aminovou skupinu. Tyto liposomy o výchozí koncetraci lOmg/ml PBS byly smíchámy s fluorescenčně značenou HA (Sigma-Aldrich) o koncentraci 1 mg/ml PBS v poměru 1 mg celkového lipidu na 0,1 mg HA. Inkubace probíhá minimálně 30 minut při pokojové teplotě (viz příklad 19). Oba vzorky byly inkubovány v 10 mM kyselině citrónové. Nenavázaná HA byla odstraněna na koloně Superose 6 (nástřik 200 pl, průtok první mililitr 0,1 ml/min, potom 0,3 ml/min, sběr frakcí po 1 ml). Fluorescence byla měřena na fluorimetru Perkin Elmer při odpovídajících vlnových délkách (excitace pro FITC-HA 490 nm, emise 505 nm)
Výsledky: Ve frakci obsahující liposomy (2 ml) u liposomů s aminoxylipidem obecného vzorce I (dle příkladu 14) bylo navázáno 45% původního množství HA, které se vlivem okyselení nezměnilo. Pro ostatní aminooxylipidy obecného vzorce I (dle příkladu 12,13) byla data téměř totožná. U liposomů obsahující DOPE, bylo navázáno 27% původního množství HA a po okyselení zůstalo navázáno 20% (Obrázek 8)
Příklad 23:
Vazba liposomů obsahujícím aminooxylpid obecného vzorce I (dle příkladu 14) na buňky H1299
Metody:_K buňkám H1299 byly přidány liposomy připravené stejně jako v příkladu 15 obsahující 0,4% fluorescenčního lipidu v objemu max. 10% z celkového objemu v jamce. Celkové množství liposomů bylo 100 pg lipidu na 1 ml media. Množství liposomů zachycených buňkami bylo měřeno flowcytometrem FASCCalibur (Becton Dickinson, USA), pro pozorování byl použit fluorescenční mikroskop (Nikon, Japonsko).
Výsledky: Výsledky z flowcytometru (Obrázek 9), výsledky z fluorescenčního mikroskopu (Obrázek 10) ukazují, že vazba kyseliny hyaluronové zlepšuje vazbu liposomů na buňky přes receptor CD44. Liposomy s kyselinou hyaluronovou navázanou přes aminoxylipid je možné využívat pro cílení do buněk exprimujících CD44 receptor.
Přehled použité literatury
Aberle, A. M.; Tablin, F.; Zhu, J.; Walker, N. J.; Gruenert, D. C.; Nantz, Μ. H., A novel tetraester construct that reduces cationic lipid-associated cytotoxicity. Implications for the onset of cytotoxicity. Biochemistry 1998, 37 (18), 6533-6540.
Baskin, J. M.; Prescher, J. A.; Laughlin, S. T.; Agard, N. J.; Chang, P. V.; Miller, I. A.; Lo, A.; Codelli, J. A.; Bertozzi, C. R., Copper-free click chemistry for dynamic in vivo imaging. Proceedings of the Notional Academy ofSciences ofthe United States ofAmerica 2007,104 (43), 16793-16797.
Carmona, S.; Jorgensen, M. R.; Kolli, S.; Crowther, C.; Salazar, F. H.; Marion, P. L.; Fujino, M.; Natori, Y.; Thanou, M.; Arbuthnot, P.; Miller, A. D., Controlling HBV Replication in Vivo by Intravenous Administration of Triggered PEGylated siRNA-Nanoparticles. Molecular Pharmaceutics 2009, 6 (3), 706-717.
Drašar, L.; Ledvina, M.; Korvasová, Z.; Turanek, J., Lipopolyaminy sperminového typu pro konstrukci liposomálních transfekčních systémů. Czech. Pat. 303963, 2013.
Drašar, L.; Ledvina, M.; Korvasová, Z.; Turanek, J., Lipopolyamines of spermine type for construction of liposomal transfection systems. US Pat. US 9,393,200 B2, 2016.
• · · ·
Hassane, F. S.; Frisch, B.; Schuber, F., Targeted liposomes: Convenient coupling of ligands to preformed vesicles using click chemistry. Bioconjugate Chemistry 2006,17 (3), 849-854; (b) Heyes, J. A.; Niculescu-Duvaz, D.; Cooper, R. G.; Springer, C. J., Synthesis of novel cationic lipids: Effect of structural modification on the efficiency of gene transfer. Journal of Medicinal Chemistry 2002, 45 (1), 99-114.
Korvasova, Z.; Drasar, L.; Masek, J.; Knotigova, P. T.; Kulich, P.; Matiasovic, J.; Kovarcik, K.; Bartheldyova, E.; Koudelka, S.; Skrabalova, M.; Miller, A. D.; Holý, A.; Ledvina, M.; Turanek, J., Antiviral effect of HPMPC (Cidofovir (R)), entrapped in cationic liposomes: In vitro study on MDBK cell and BHV-l virus. Journal of Controlled Release 2012,160 (2), 330-338.
Koudelka, S; Mikulik, R; Masek, J; Raška, M; Knotigova, PT; Miller, AD; Turanek, J. Liposomal nanocarriers for plasminogen activators. Journal of Controlled Release 2016, 22, 45-577.
Kusumoto, S.; Inage, M.; Shiba, T.; Azuma, I.; Yamamura, Y., Synthesis of long-chain fatty-acid esters of normal-acetylmuramyl-l-alanyl-d-isoglutamine in relation to anti-tumor activity. Tetrahedron Letters 1978, (49), 4899-4902.
Leventis, R.; Silvius, J. R., Interactions of mammalian-cells with lipid dispersions containing novel metabolizable cationic amphiphiles. Biochimica Et Biophysica Acta 1990,1023 (1), 124-132.
Liu, Y.; Feizi, T.; Carnpanero-Rhodes, M. A.; Childs, R. A.; Zhang, Y. N.; Muiioy, B.; Evans, P. G.; Osborn, Η. Μ. I.; Otto, D.; Crocker, P. R.; Chai, W. C., Neoglycolipid probes prepared via oxime ligation for microarray analysis of oligosaccharide-protein interactions. Chemistry & Biology 2007,14 (7), 847859.
Lv, H.; Zhang, S.; Wang, B.; Cui, S.; Yan, J., Toxicity of cationic lipids and cationic polymers in gene delivery. Journal of Controlled Release 2006,114 (1), 100-109.
Marques-Gallego, P.; de Kroon, A., Ligation Strategies forTargeting Liposomal Nanocarriers. Biomed Research International 2014, 2014, 1-12.
Milller, A. D.; Keler, M.; Jorgensen, M.; Perouzel, E. US patent application publication, Pub. No. US 2005/0287202 Al.
Niculescu-Duvaz, D.; Heyes, J.; Springer, C. L, Structure-activity relationship in cationic lipid mediated gene transfection. Current Medicinal Chemistry 2003,10 (14), 1233-1261.
• · • · • · • · • · • ·
Tang, L.; Yin, Q.; Xu, Y.; Zhou, Q.; Cai, K.; Yen, J.; Dobrucki, L. W.; Cheng, J., Bioorthogonal Oxime
Ligation Mediated Cancer Targeting. Chem Sci 2015, 6 (4), 2182-2186.
Turánek, J.; Mašek, J.; Raška, M.; Ledvina, M., Application of Liposomesfor Construction of Vaccines.
In Biomedical Science, Engineering and Technology, Ghista, D. N., Ed. InTech, January, 2012: 2012;
pp 653-678.
Ulrich, S.; Boturyn, D.; Marra, A.; Renaudet, O.; Dumy, P., Oxime Ligation: A Chemoselective ClickType Reaction for Accessing Multifunctional Biomolecular Constructs. Chemistry-a EuropeanJournal
2014, 20 (1), 34-41.
Vabbilisetty, P.; Sun, X. L., Liposome surface functionalization based on different anchoring lipids via
Staudinger ligation. Organic & Biomolecular Chemistry 2014,12 (8), 1237-1244.
?V KM- Zřf

Claims (4)

Patentové nároky
1. Aminooxylipidy obecného vzorce I kde ni = 5 - 30 a X je polymethylénová spojka obecného vzorce II kde Π2 = 2 -10, nebo X je polyethylenglykolová spojka obecného vzorce III
Ό
O kde n^= 1-14.
2. Aminooxylipidy obecného vzorce I podle nároku 1, vyznačující se tím, že ni = 13 a X je polymethylénová spojka obecného vzorce II uvedeného v nároku 1, kde n2 = 2 či 3, nebo X je polyethylenglykolová spojka obecného vzorce III uvedeného v nároku 1, kde n3 = 1.
3. Způsob přípravy aminooxylipidů obecného vzorce I, popsaného v nároku 1, vyznačující se tím, že acylací /V-terc-butoxykarbonyl-polymethylendiaminu {(CH3)3C-O-(C=O)-HN-(CH2)n-NH2, n - 2 13}, či /V-terc-butoxykarbonyl-polyethyleglykoldiaminu {(CH3)3C-O-(C=O)-HN-(CH2)2-[O-(CH2)]nO-(CH2)2NH2, η = 1 -14} symetricky v poloze C(2) větvenou mastnou kyselinou obecného vzorce IV
IV
4 · • · · · kde ni = 5 - 30, organickém aprotickém rozpouštědle (s výhodou v DMF a promotovanou HATU), nebo od kyseliny I odvozeným acylchloridem obecného vzorce V kde ni = 5 - 30, v organickém aprotickém rozpouštědle a v přítomnosti organické báze (s výhodou dichlormethanu v přítomnosti /V-etyldiisopropylaminu) se získají /V-Boc-aminolipidy obecného vzorce VI
Boc—NH
X kde ni = 5 - 30 a X je polymethylénová spojka obecného vzorce II popsaného v nároku 1 nebo polyethylenglykolová spojka obecného vzorce III popsaného v nároku 1, ty se v následujícím stupni převedou hydrolytickým odštěpením Boc-skupiny chránící (s výhodou kyselinou trifluoroctovou v dichlormethanu) na aminolipidy obecného vzorce VII kde ni = 5 - 30 a X je polymethylénová spojka výše uvedeného obecného vzorce II nebo polyethylenglykolová spojka výše uvedeného obecného vzorce III, které se kondenzací s kyselinou /V-terc-butoxykarbonylaminooxyoctovou v organickém aprotické rozpouštědle (s výhodou v dichlormethanu) a v přítomnosti kondenzačního činidla (s výhodou N,N'diisopropylkarbodiimidu) převedou na /V-Boc-aminooxylipidy obecného vzorce Vlil • · · · kde ni = 5 - 30 a X je polymethylénová spojka výše uvedeného obecného vzorce II popsaného v nároku 1 nebo polyethylenglykolová spojka výše uvedeného obecného vzorce III popsaného v nároku 1, ty následným hydrolytickým odštěpením Boc-skupiny poskytnou cílové aminooxylipidy obecného vzorce I popsaného v nároku 1, přičemž acylchloridy obecného vzorce
V se připraví reakcí kyselin obecného vzorce IV s oxalylchloridem v přítomnosti katalytického množství Λ/,/V-dimethylformamidu v organickém aprotickém rozpouštědle (s výhodou v dichlormethanu).
4. Použití netoxických aminooxylipidů obecného vzorce I pro konstrukci konstrukci netoxických samoskladných liposomálních nosičů léčiv prezentujících aminooxyskupiny a takzvaná „postliposomální modifikace těchto nosičů biologicky funkčními molekulami za použití oximové ligační techniky (vazebné páry: aminooxyskupina a aldehydová skupina nebo ketoskupina).
CZ2016-685A 2016-11-03 2016-11-03 Aminooxylipidy pro konstrukci samoskladných liposomálních systémů umožňujících jejich následnou modifikaci biologicky funkčními molekulami CZ307452B6 (cs)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2016-685A CZ307452B6 (cs) 2016-11-03 2016-11-03 Aminooxylipidy pro konstrukci samoskladných liposomálních systémů umožňujících jejich následnou modifikaci biologicky funkčními molekulami
PCT/CZ2017/050054 WO2018082723A1 (en) 2016-11-03 2017-11-02 Aminooxylipids for the construction of self-assembling liposomal systems enabling their subsequent modification by biologically functional molecules
US16/336,844 US11492327B2 (en) 2016-11-03 2017-11-02 Aminooxylipids for the construction of self-assembling liposomal systems enabling their subsequent modification by biologically functional molecules
EP17832461.2A EP3535238B1 (en) 2016-11-03 2017-11-02 Aminooxylipids for the construction of self-assembling liposomal systems enabling their subsequent modification by biologically functional molecules
CA3039404A CA3039404C (en) 2016-11-03 2017-11-02 Aminooxylipids for construction of self-assembling liposomal systems enabling their subsequent modification by biologically functional molecules

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2016-685A CZ307452B6 (cs) 2016-11-03 2016-11-03 Aminooxylipidy pro konstrukci samoskladných liposomálních systémů umožňujících jejich následnou modifikaci biologicky funkčními molekulami

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2016685A3 true CZ2016685A3 (cs) 2018-05-16
CZ307452B6 CZ307452B6 (cs) 2018-09-05

Family

ID=61007406

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2016-685A CZ307452B6 (cs) 2016-11-03 2016-11-03 Aminooxylipidy pro konstrukci samoskladných liposomálních systémů umožňujících jejich následnou modifikaci biologicky funkčními molekulami

Country Status (5)

Country Link
US (1) US11492327B2 (cs)
EP (1) EP3535238B1 (cs)
CA (1) CA3039404C (cs)
CZ (1) CZ307452B6 (cs)
WO (1) WO2018082723A1 (cs)

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2290409C2 (ru) * 2000-12-12 2006-12-27 Митсубиси Кемикэл Корп. Способ получения соединений, композиция для приготовления лекарственного средства
US20050287202A1 (en) 2000-12-12 2005-12-29 Miller Andrew D Compound
GB0418172D0 (en) * 2004-08-13 2004-09-15 Ic Vec Ltd Vector
US9446147B2 (en) * 2011-02-24 2016-09-20 The Ohio State University Membrane stabilizing compositions and methods
CZ201220A3 (cs) 2012-01-13 2013-07-17 Ústav organické chemie a biochemie Akademie ved CR, v.v.i. Lipopolyaminy sperminového typu pro konstrukci liposomálních transfekcních systému
US9080144B2 (en) * 2012-05-10 2015-07-14 Muhammad Naveed Yousaf Compositions and methods for promoting liposomal and cellular adhesion
WO2013181697A1 (en) * 2012-06-05 2013-12-12 The University Of Melbourne Bicyclo[6.1.0]non-4-yne compounds suitable for use as linkers in biological applications
WO2014197991A1 (en) * 2013-06-12 2014-12-18 Muhammad Yousaf Compounds for promoting liposomal and cellular adhesion and compositions and methods of use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
WO2018082723A1 (en) 2018-05-11
CZ307452B6 (cs) 2018-09-05
US11492327B2 (en) 2022-11-08
CA3039404A1 (en) 2018-05-11
EP3535238B1 (en) 2021-04-21
EP3535238A1 (en) 2019-09-11
US20210292275A1 (en) 2021-09-23
CA3039404C (en) 2021-09-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5836394B2 (ja) 陽イオン性脂質を含む陰イオン性薬物伝達体およびその製造方法
CN105283441B (zh) 用于递送药剂的二硫化合物
JP2019527044A (ja) 抗菌ペプチド誘導体及びその使用
AU2021329702B2 (en) Lipid nanoparticle
JP7821776B2 (ja) 効率的な核酸送達のための担体
MX2010012326A (es) Metodos y composiciones que comprenden nuevos lipidos cationicos.
CN104023708A (zh) 包含聚合物缀合的脂质的脂质体和有关用途
US20250325491A1 (en) Polyvalent molecule based lipid nanoparticles for nucleic acid delivery
US20250354174A1 (en) Nanoparticle compositions containing sugar functionalized nucleic acid carriers
JP6605910B2 (ja) 巨大分子を含む細胞透過性ペプチドが導入された薬物送達担体
CN112891560B (zh) 一种mRNA递送载体及其制备方法和用途
WO2013140643A1 (ja) 機能性タンパク質を細胞内に送達するためのキャリア
JP5914418B2 (ja) 脂質粒子、核酸送達キャリア、核酸送達キャリア製造用組成物、脂質粒子の製造方法及び遺伝子導入方法
JP6238366B2 (ja) 非極性溶媒に分散性を有する細菌菌体成分を内封する脂質膜構造体およびその製造方法
CZ2016685A3 (cs) Aminooxylipidy pro konstrukci samoskladných liposomálních systémů umožňujících jejich následnou modifikaci biologicky funkčními molekulami
KR20260033596A (ko) 이온화 가능한 지질
CN102532259A (zh) 基于寡肽的阳离子脂质衍生物及在药剂制剂中的应用
WO2024120455A1 (zh) 含多个叔氨基结构的磷脂酰胺化合物及其组合物和用途
WO2012153616A1 (ja) 標的細胞移行能を有する脂質膜構造体、その製造方法および標的細胞において効果を示す物質のスクリーニング方法
CN105963708A (zh) 一种酶促响应释放的磷脂酰纳米前药及其制备方法和应用
JP2007210953A (ja) ｐＨ応答性分子集合体
WO2025063214A1 (ja) 核酸を内封したリガンド修飾脂質ナノ粒子の製造方法
CN110628011B (zh) 一种磷脂-聚乙二醇-冰片聚合物，其制备方法及应用
HK40060954A (en) Lipid nanoparticle
Zouharová et al. Hyaluronic acid surface modified liposomes prepared via orthogonal aminoxy coupling: synthesis of nontoxic aminoxylipids based on symmetrically α-branched fatty acids, preparation of liposomes by microfluidic mixing and targeting to cancer cells expressing CD44.