CZ2018101A3

CZ2018101A3 - Kmeny mikroorganismů Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766, výrobek obsahující tyto kmeny

Info

Publication number: CZ2018101A3
Application number: CZ2018-101A
Authority: CZ
Inventors: Ladislav Strojný; Alojz Bomba
Original assignee: Univerzita Pavla Jozefa Šafárika V Košiciach; Centrum Vedecko-Technických Informácií Sr
Priority date: 2015-07-30
Filing date: 2016-07-30
Publication date: 2018-10-31
Also published as: SK500112018A3; SK542015A3; CZ33363U1; WO2017017662A1; WO2017017662A4

Abstract

Kmeny mikroorganismů Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766, výrobek obsahující tyto kmeny a způsob jejich využití určený pro úpravu a stabilizaci zdraví prospěšné střevní mikroflóry člověka. Kmen mikroorganismů Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766 je izolován z člověka a je aplikován do potravin jako energetické cereální tyčinky, fortifikované nápoje, mléčné a masné výrobky, výhodně pasterizovaná brynza, které jsou také předmětem řešení jako výrobky obsahující tento kmen. Výhodou nového kmene mikroorganismů Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766 je modulační efekt použitého kmene, což se projevuje zvýšením počtu bakterií mléčného kvašení a snížením počtu koliformních mikroorganismů ve střevním obsahu tlustého střeva. Aplikace kmene má vliv nejen na střevní mikroflóru, ale i na metabolické aktivity s příznivým účinkem na lipidový profil. Kmen Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766 neprodukuje enzym G-glukuronidáza, který může mít karcinogenní účinky, ale současně i snižuje jeho aktivitu ve střevním obsahu, zejména při akutním nebo chronickém zánětu tlustého střeva.

Description

CZ 2018 -101 A3

Kmeny mikroorganismů Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766, výrobek obsahující tyto kmeny

Oblast techniky

Vynález se týká izolovaného kmene mikroorganismů Lactobacillus plantarum LS/07, sbírkové číslo CCM 7766, který je zároveň prostředkem pro přípravu preparátů a přídavků do potravin pro účely preventivního posílení střevní bariéry. Kmen Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766 byl vykultivovaný ze stolice zdravého člověka. Vynález také popisuje potravinářské výrobky obsahující Lactobacillus plantarum LS/07, CCM 7766.

Dosavadní stav techniky

Zdraví lidské populace je jedním z hlavních atributů fungování lidské společnosti. Vysoké společenské nároky kladené na člověka přinášejí mnoho negativních dopadů na jeho celkové zdraví. Stres, nutričně nevyvážená potrava a nezdravé návyky mají nepříznivý dopad na střevní mikroflóru člověka, což se může později negativně projevit v celkovém zdraví lidské populace. Civilizační choroby vznikají v důsledku dlouhodobého působení uvedených faktorů. Léčba civilizačních chorob je dlouhodobá a finančně vysoce nákladná, proto se v současné době stále více prosazuje prevence v boji proti civilizačním chorobám. Použití vyselektováných probiotických kmenů může ve velké míře zajistit stabilitu zdravé střevní mikroflóry s následným pozitivním efektem na zdraví jedince.

V současnosti se izolované kmeny laktobacilů ve velké míře využívají jako součást funkčních potravin nebo výživových doplňků. Některé probiotické kmeny využívány jako součást výživových doplňků mají příznivý vliv na mikroflóru trávicího traktu člověka, takovými kmeny jsou Lactobacillus plantarum 299 a Lactobacillus plantarum 299v DSM 9843, uvedené úzce související kmeny byly izolovány ze střevní sliznice zdravého člověka (Molin a kol. 1993 a Johanson a kol. 1993).

Evropský patentový spis EP 1 904 074 popisuje použití laktobacilů na zvýšení absorpce iontů železa, zinku a vápníku, týká se použití minimálně jednoho specifikovaného kmene Lactobacillus plantarum pro zvýšení absorpce iontů kovů u savců a farmaceutické kompozice, která obsahuje alespoň jeden specifikovaný kmen Lactobacillus plantarum, pro použití při léčení anémie. V patentu se uvádí využití již známých patentovaných kmenů Lactobacillus plantarum DSM 695, L. plantarum 299v, DSM 9843, L. plantarum Heal 9, DSM 153121 L. plantarum, Heal 19, DSM 15 313, pro zvýšení absorpce iontů železa.

Patentový spis WO2015067947 popisuje vynález týkající se kmene Lactobacillus plantarum a kompozice pro použití při modifikaci absorpce cholesterolu u jedince, nebo při léčbě srdečních onemocnění, cukrovky nebo obezity.

Zveřejněný spis RU 2491079 Cl Komplexní probiotický preparát a způsob jeho užívání. Preparát sestává ze směsi laktobacilů (Lacobacillus plantarum, L. fermentum, L. acidophilus) a bifidobakterií (Bifidobacterium bifidum, B. longum). Tyto kmeny byly získány z rostlin.

Zveřejněný spis EP 2 309 870, Izolovaný kmen Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21 380 jako antimikrobiální a antihypertenzní probiotikum, potravinový produkt a kompozice obsahující uvedený mikroorganismus pro přípravu antihypertenzního léku a způsob potlačení patogenů a neštartérových patogenů v potravinových produktech.

Tento kmen byl izolován ze stolice zdravého dítěte v rámci srovnávací studie provedené u estonských a švédských dětí.

- 1 CZ 2018 -101 A3

Podstata vynálezu

Vynález se týká kmene mikroorganismů Lactobacillus plantarum LS/07 deponovaného ve sbírce mikroorganismů pod pořadovým číslem CCM 77 66 v České sbírce mikroorganismů Brno dne 2.7.2009 podle podmínek Budapešťské smlouvy, který metabolizuje zdraví prospěšné substance, které jej odlišují od jiných kmenů mikroorganismů rodu Lactobacillus izolovaných z člověka, zvířat a rostlin. Kmen mikroorganismů Lactobacillus plantarum LS/07 byl uložen pod číslem CCM 7766 v České sbírce mikroorganismů, Masarykova univerzita, Přírodovědecká fakulta, Tvrdého 14 (aktuálně Kamenice 5, budova A25), 602 00 (aktuálně 625 00) Brno, Česká republika.

Nový izolovaný kmen, podle vynálezu, v laboratorních testech prokázal vysokou schopnost antibakteriální aktivity vůči patogennímu kmenu Escherichia coli (CNTC Eck 63/59 uložený v Československé sbírce mikroorganismů Praha). Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766 patří do skupiny bakterií mléčného kvašení produkující kyselinu mléčnou a další organické kyseliny. Provedené enzymatické testy poukázaly, že kmen Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766 neprodukuje enzym B-glukuronidázu, který se u člověka považuje za důležitý markér vývoje karcinogeneze.

Uvedený kmen mikroorganismů je aplikován jako samostatný výživový doplněk, výhodně ve formě tobolek nebo jako přídavek do výživových doplňků pro účely preventivního posílení střevní bariéry a střevní mikroflóry vůči toxickým mutagenům a infekčním patogenům.

Variantou vynálezu je, že Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 77 66 izolovaný z člověka a ne ze zvířat je aplikován do funkčních potravin, jako jsou energetické cereální tyčinky, fortifikované nápoje, mléčné a masné výrobky, výhodně pasterizovaná brynza. V případě využití Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766 do pasterizované brynzy je navrácen požadovaný probiotický účinek funkční potraviny, která je pasterizací zbavena živé mikroflóry laktobacilů pocházejících ze zvířat.

Výhodou nového kmene mikroorganismů Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766, podle podstaty vynálezu, je modulační efekt použitého kmene, který se projevuje zvýšením počtu bakterií mléčného kvašení a snížením počtu koliformních mikroorganismů ve střevním obsahu tlustého střeva. Aplikace kmene má vliv nejen na střevní mikroflóru, ale i na metabolické aktivity s příznivým účinkem na lipidový profil.

Laktobacilový kmen Lactobacillus plantarum LS/07 byl původci charakterizován v klinických studiích na potkanech, přičemž byly zjištěny následující výhody kmene podle vynálezu:

Kmen Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766 nejen že neprodukuje enzym B-glukuronidáza, který může mít karcinogenní účinky, ale současně i snižuje jeho aktivitu ve střevním obsahu při experimentálně chemicky vyvolaném akutním a chronickém zánětu tlustého střeva u laboratorních potkanů.

Histologické výsledky prokázaly, že ve skupinách zvířat, kde byly podávány kmeny Lactobacillus plantarum LS/07, došlo k výraznému snížení a tlumení zánětu ve fixované tkáni kolonu potkanů ve srovnání s kontrolní skupinou, kde uvedený kmen nebyl podáván.

Aplikováním kmene Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766 došlo k signifikantní inhibici (P <0,05) prozánětlivých cytokinů IL-2, IL-17 a TNF-α, a mírnému nárůstu protizánětlivých regulačních cytokinů IL-10 a TGF-B oproti pozitivní kontrolní skupině zvířat.

Ve skupinách zvířat, kde byl aplikován Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766 byl zjištěn

-2CZ 2018 -101 A3 výrazně snížený počet populace gramnegativních koliformních bakterií (4,96 ± 0,32 CFU/g) ve srovnání s kontrolní skupinou (5,45 ± 0,11 CFU/g).

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

V tomto příkladu provedení vynálezu je kmen ve formě biologicky čisté kultury.

Příklad 2

Příklad 3

Uvedený kmen Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766 je aplikován do potravin, jako jsou energetické cereální tyčinky, fortifikované nápoje, mléčné a masné výrobky nebo pasterizovaná brynza. Brynza (nazývaná také jako Brimsen, Liptauer Kase, vulgo Burenda) je měkký, hnětený a solený ovčí sýrový produkt vyráběný z hrudkového ovčího sýra. Brynza obsahuje mnoho probiotik, snižuje cholesterol, snižuje cukr v krvi a zánětlivé parametry. Pasterizace však mnohé tyto účinky podstatně oslabuje. Přidáním kmene Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766 do brynzy po skončení pasterizace se dosahuje aktivita bakterií mléčného kvašení při zachování její trvanlivosti.

Příklad 4

V tomto příkladu byl kmen mikroorganismů rodu Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 6677 kultivovaný podle následujícího postupu.

Pracovní postup přípravy kmene:

Pomocí sterilní odběrové soupravy je převeden výtěr z konečníku člověka. Odběrový tampon je ponořen do zásobní zkumavky s fyziologickým roztokem o objemu 5 ml. Ze zásobní zkumavky je odebrán vzorek o objemu 1 ml pomocí pipety a přenesen pipetou do zkumavky s fyziologickým roztokem o objemu 9 ml. Výsledkem ředění je 10 násobné zředění vzorku. Následuje pokračování tohoto postupu do zředění vzorku od 10-2 až do stupně zředění 10-5. Ze zkumavek s jednotlivými ředěními jsou odebrány vzorky 0,1 ml a aplikovány na Petriho misky se selektivní půdou pro laktobacily pro růst bakterií mléčného kvašení. Naočkované desky jsou uloženy do speciálních inkubačních nádob, ve kterých je vyvíječ zabezpečující anaerobní kultivační prostředí. Vzduchotěsně uzavřené nádoby jsou uloženy v biologickém termostatu.

Kultivace laktobacilů je realizována při teplotě 37 °C po dobu 48 hodin. Po 48 hodinové inkubaci je posouzena velikost a tvar porostlých kolonií, přičemž porost je tvořen drobnými, okrouhlými, nízko vypouklými koloniemi bílé barvy do velikosti až 2 mm.

Izolace laktobacilového kmene je provedena dle postupu:

-3 CZ 2018 -101 A3

Sterilní očkovací kličkou je opatrně (pod lupou) odebrána jedna kolonie bakterií z Petriho misky a naočkována do zkumavky s laktobacilo-selektivním LS bujónem v množství 5 ml. Uvedený postup je několikrát zopakován, přičemž každá odebraná kolonie je naočkovaná do samostatné zkumavky s bujónem. Přeočkovány kolonie jsou inkubovány v termostatu při teplotě 37 °C po dobu 18 hodin.

Po inkubaci je z každé zkumavky odebrána porostlá bujónová kultura v množství 0,1 ml a přeočkována na Petriho misky obsahující selektivní LS agar. Desky jsou následně kultivovány v termostatu za anaerobních podmínek při teplotě 37 °C po dobu 48 hodin. Po inkubaci je provedeno posuzování kolonií laktobacilů. Označené kolonie jsou odebrány za účelem zjištění jejich morfologie mikroskopicky barvicí technikou Grama. Barvení je provedeno následovně podle schématu:

Nasazení kultury na podložně sklíčko Vysušení a fixace nad plamenem Aplikace

Krystalvioleť - 30 sek

Opláchnutí destilovanou vodou

Aplikace Lugolův roztok - 30 sekund

Opláchnutí destilovanou vodou

Aplikace

Etanol 96% - 20 sekund

Opláchnutí destilovanou vodou

Aplikace

Karbolfuchsín - 30 sekund

Opláchnutí destilovanou vodou Vysušení filtračním papírem

Očkovací půdy, spotřební materiál a nástroje použité k izolaci kmene jsou sterilní. Všechny úkony týkající se práce s mikrobiální kulturou, jsou provedeny ve sterilním očkovacím boxu.

Detekce laktobacilů světelným mikroskopem:

Pro posouzení morfologie laktobacilů je použitý světelný mikroskop Olympus s lOOOx násobným zvětšením. Laktobacily jsou pozorovány jako modré grampozitivní (G+) barvicí se středně silné a středně dlouhé nepohyblivé mikroorganismy ve tvaru tyčinky.

Detekce inhibičních zón kmene Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766 proti patogennímu Escherichia coli CNTC Eck 63/59 agar difuznim testem:

Připravena bujónová kultura kmene Lactobacillus plantarum LS/07 je inkubována přibližně 18 hodin a změřena její turbidimetrická hodnota na stupeň 0,5 McFarlanda, což odpovídá hodnotě l,5xl0⁸ mikroorganismů. Z bujónové kultury je mikropipetou odebrána bujónová kultura o objemu 0,050 ml a aplikovaná do jamky o velikosti 4 mm (vyřezané do středu desky) selektivního LS agaru. Naočkované Petriho misky jsou uloženy do inkubačních nádob (GASPAK patent USA) a inkubovány v biologickém termostatu při teplotě 37 °C po dobu 48 hodin. Po 48 hodinách je na povrch agarových desek navrstven agar ve složení, pepton 0,5g, kvasničný

-4CZ 2018 -101 A3 autolyzát lg, glukóza lg, agar 1,8 g, 100 ml destilovaná voda, pH 6,9, o objemu 3 ml, ve kterém je rozpuštěn bujón o objemu 0,3 ml obsahující noční kulturu porostlého kmene Escherichia coli serotyp O6:K2:H1 ATC 1938 CNTC Eck 63/59. Po aplikaci kmene jsou Petriho misky vloženy do termostatu a inkubovány při teplotě 37 °C po dobu 18 hodin. Po inkubaci je změřena velikost inhibičních zón, přičemž průměrný výsledek je získán součtem naměřených hodnot jednotlivých měření vydělených počtem testovaných desek. V příkladu provedení jsou použity odečteny hodnoty měření ze tří desek.

Molekulově genetická detekce kmene Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766:

Na molekulově genetickou detekci izolovaného kmene je použita vysoce citlivá a specifická metoda techniky polymerázové řetězové reakce (PCR). PCR směs, použité specifické primery, amplifikace templátu a elektroforéza v agarózovém gelu jsou provedeny podle literárních zdrojů (Berthier a Ehrlich 1998). Amplifikační PCR produkty jsou obarvené etídium bromidem a detekovány ultrafialovým světlem, přičemž je získaný specifický PCR produkt o velikosti 265 bázových párů.

Stanovení organických kyselin:

Koncentrace organických kyselin (kyselina mléčná a octová) jsou stanoveny pomocí přístroje (CS ISOTACHOPHORETIC ANALYSER) technikou kapilární izotachoforézy. Izolovaný kmen Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766 nejvíce produkoval kyselinu mléčnou ve srovnání s kyselinou octovou. Hodnoty jsou naměřené po 24 hodinové (kyselina mléčná - 78,66 mmol/1, kyselina octová -7,91 mmol/1) a 48 hodinové (kyselina mléčná - 226,31 mmol/1, kyselina octová 95,44 mmol/1) inkubaci v termostatu při teplotě 37 °C.

Stanovení enzymové aktivity

Na studium enzymové aktivity kmene Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766 je použitý komerční kit API ZYM (BIOMÉRIEUX®SA, Francie). Z dosažených výsledků je zjištěno, že testovaný kmen neprodukuje enzym β-glukuronidázu, který je považován za důležitý markér v procesu vývoje karcinogeneze kolorektálního karcinomu.

Experimenty na animálních modelech

Izolovaný kmen Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766 je použit v in vivo experimentálních studiích na laboratorních potkanech. Experimentální práce na laboratorních zvířatech mají velký význam při studiu účinku izolovaných nových kmenů laktobacilů v podmínkách in vivo. Námi izolovaný kmen Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766 ze stolice zdravého člověka jsme použili v pokusu s laboratorními potkany. Potkani použity v pokusu (počet 51) pocházely z kmene Sprague Dawley, byli ve věku čtyř měsíců. Kmen jsme připravovali denně čerstvý v růstovém bujónu pro laktobacily (průměrná koncentrace 2,88 x 109 CFU/ml) a podávali jsme je denně potkanům 5 krát v týdnu. Jednou týdně (třetí až sedmý týden) jsme potkanům injekčně aplikovali chemický prokarcinogen 1,2 dimethylhydrazin-dihydrochlorid (1,2 DMH). Během celého experimentu (24 týdnů) jsme nezaznamenali žádné klinické změny (průjmy, úhyn) u pokusných skupin zvířat. Tím se potvrdilo, že kmen je bezpečný. Dosažené výsledky pokusu potvrzují, že modulační efekt použitého kmene se projevil zvýšením počtu bakterií mléčného kvašení a snížením počtu koliformních mikroorganismů ve střevním obsahu tlustého střeva. Aplikace kmene měla vliv nejen na střevní mikroflóru, ale i na metabolické aktivity s příznivým účinkem na lipidový profil. Jsou zaznamenány pozitivní změny imunitních a histologických laboratorních vyšetření pokusných zvířat.

-5 CZ 2018 -101 A3

Průmyslová využitelnost

Průmyslová využitelnost vynálezu je zjevná. Podle tohoto vynálezu je možné průmyslově a opakovaně produkovat Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766. Výše uvedené účinky kmene Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766 ho předurčují k 5 využití při modulaci střevní mikroflóry, jakož i při prevenci zánětlivých chronických chorob lidí.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Kmen mikroorganismů Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766, izolovaný z člověka, který je uložen v České sbírce mikroorganismů Přírodovědecké fakulty Masarykovy univerzity, Brno, Česká Republika na využití pro modulaci střevní mikroflóry a zároveň při prevenci zánětlivých chronických chorob lidí.

2. Kmen mikroorganismů Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766 podle nároku 1, pro použití při léčbě proti patogennímu kmenu Escherichia coli.

3. Kmen mikroorganismů Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766 podle nároku 1 nebo 2, pro metabolizaci zdraví prospěšných substancí bez produkce enzymu B- glukuronidázy.

4. Kmen mikroorganismů Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766 podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, na snížení aktivity enzymu B-glukuronidázy ve střevním obsahu, zejména při akutním a/nebo chronickém zánětu tlustého střeva.

5. Kmen mikroorganismů Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766 podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, na zvýšení počtu bakterií mléčného kvašení a zároveň snížení počtu koliformních mikroorganismů ve střevním obsahu tlustého střeva s příznivým účinkem na lipidový profil.

6. Kmen mikroorganismů Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766 podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, na inhibici prozánětlivých cytokinů IL-2, IL-17 a TNF- a.

7. Kmen mikroorganismů Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766 podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, na podporu nárůstu protizánětlivých regulačních cytokinů IL-10 a TGF-B.

8. Kmen mikroorganismů Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766 podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7 ve vysušené formě.

9. Kmen mikroorganismů Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766 podle nároku 8 ve formě lyofilizátu.

10. Výrobek obsahující kmen mikroorganismů Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766 podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9.

11. Výrobek podle nároku 10, vyznačující se tím, že je fermentovaný mléčný produkt.

12. Výrobek podle nároku 10, vyznačující se tím, že je sýr.

13. Výrobek podle nároku 10, vyznačující se tím, že je samostatný výživový doplněk, výhodně ve formě tobolek.

14. Výrobek podle nároku 10, vyznačující se tím, že má podobu energetické cereální tyčinky, fortifikováného nápoje, mléčného nebo masného výrobku.

-6CZ 2018 -101 A3

15. Výrobek podle kteréhokoliv z nároků 10, 11, 12, 14, vyznačující se tím, že je pasterizovaná brynza.