CZ33363U1

CZ33363U1 - Potravinářský výrobek nebo výživový doplněk obsahující kmen mikroorganismu Lactobacillus plantarum

Info

Publication number: CZ33363U1
Application number: CZ2018-34733U
Authority: CZ
Inventors: Ladislav STROJNÝ; Alojz BOMBA
Original assignee: Univerzita Pavla Jozefa Šafárika V Košiciach; Centrum Vedecko-Technických Informácií Sr
Priority date: 2015-07-30
Filing date: 2016-07-30
Publication date: 2019-11-12
Also published as: SK542015A3; WO2017017662A4; SK500112018A3; CZ2018101A3; WO2017017662A1

Description

Potravinářský výrobek nebo výživový doplněk obsahující kmen mikroorganismu Lactobacillus plantarum

Oblast techniky

Technické řešení se týká přípravku, který obsahuje izolovaný kmen mikroorganismů Lactobacillus plantarum LS/07, sbírkové číslo CCM 7766, který je zároveň prostředkem pro přípravu preparátů a přídavků do potravin pro účely preventivního posílení střevní bariéry. Kmen Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766 byl vykultivovaný ze stolice zdravého člověka.

Dosavadní stav techniky

Zdraví lidské populace je jedním z hlavních atributů fungování lidské společnosti. Vysoké společenské nároky kladené na člověka přinášejí mnoho negativních dopadů na jeho celkové zdraví. Stres, nutričně nevyvážená potrava a nezdravé návyky mají nepříznivý dopad na střevní mikroflóru člověka, což se může později negativně projevit v celkovém zdraví lidské populace. Civilizační choroby vznikají v důsledku dlouhodobého působení uvedených faktorů. Léčba civilizačních chorob je dlouhodobá a finančně vysoce nákladná, proto se v současné době stále více prosazuje prevence v boji proti civilizačním chorobám. Použití vyselektovaných probiotických kmenů může ve velké míře zajistit stabilitu zdravé střevní mikroflóry s následným pozitivním efektem na zdraví jedince.

V současnosti se izolované kmeny laktobacilů ve velké míře využívají jako součást funkčních potravin nebo výživových doplňků. Některé probiotické kmeny využívány jako součást výživových doplňků mají příznivý vliv na mikroflóru trávicího traktu člověka, takovými kmeny jsou Lactobacillus plantarum 299 a Lactobacillus plantarum 299v DSM 9843, uvedené úzce související kmeny byly izolovány ze střevní sliznice zdravého člověka (Molin a kol. 1993 a Johanson a kol. 1993).

Evropský patentový spis EP 1904074 popisuje použití laktobacilů na zvýšení absorpce iontů železa, zinku a vápníku, týká se použití minimálně jednoho specifikovaného kmene Lactobacillus plantarum pro zvýšení absorpce iontů kovů u savců a farmaceutické kompozice, která obsahuje alespoň jeden specifikovaný kmen Lactobacillus plantarum, pro použití při léčení anémie. V patentu se uvádí využití již známých patentovaných kmenů Lactobacillus plantarum DSM 695, L. plantarum 299v, DSM 9843, L. plantarum Heal 9, DSM 153121, L. plantarum, Heal 19, DSM 15 313, pro zvýšení absorpce iontů železa.

Patentový spis WO 2015/067947 popisuje vynález týkající se kmene Lactobacillus plantarum a kompozice pro použití při modifikaci absorpce cholesterolu u jedince, nebo při léčbě srdečních onemocnění, cukrovky nebo obezity.

Zveřejněný spis RU 2491079 Cl popisuje komplexní probiotický preparát a způsob jeho užívání. Preparát sestává ze směsi laktobacilů (Lacobacillus plantarum, L. fermentum, L. acidophilus) a bifidobakterií (Bifidobacterium bifidum, B. longum). Tyto kmeny byly získány z rostlin.

Zveřejněný spis EP 2309870 popisuje izolovaný kmen Lactobacillus plantarum Tensia DSM 21 380 jako antimikrobiální a antihypertenzní probiotikum, potravinový produkt. Dále popisuje kompozici obsahující uvedený mikroorganismus pro přípravu antihypertenzního léku a způsob potlačení patogenů a nestartérových patogenů v potravinových produktech. Tento kmen byl izolován ze stolice zdravého dítěte v rámci srovnávací studie provedené u estonských a švédských dětí.

- 1 CZ 33363 UI

Podstata technického řešení

Technické řešení se týká přípravku obsahujícího kmen mikroorganismů Lactobacillus Plantarum LS/07 deponovaného ve sbírce mikroorganismů pod pořadovým číslem CCM 7766 v České sbírce mikroorganismů Brno dne 2.7.2009 podle podmínek Budapešťské smlouvy, který metabolizuje zdraví prospěšné substance, které jej odlišují od jiných kmenů mikroorganismů rodu Lactobacillus izolovaných z člověka, zvířat a rostlin. Kmen mikroorganismů Lactobacillus plantarum LS/07 byl uložen pod číslem CCM 7766 v České sbírce mikroorganismů, Masarykova univerzita, Přírodovědecká fakulta, Tvrdého 14 (aktuálně Kamenice 5, budova A25), 602 00 (aktuálně 625 00) Brno, Česká republika.

Nový izolovaný kmen, podle technického řešení, v laboratorních testech prokázal vysokou schopnost antibakteriální aktivity vůči patogennímu kmenu Escherichia coli (CNTC Eck 63/59 uložený v Československé sbírce mikroorganismů Praha). Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766 patří do skupiny bakterií mléčného kvašení produkující kyselinu mléčnou a další organické kyseliny. Provedené enzymatické testy poukázaly, že kmen Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766 neprodukuje enzym β-glukuronidázu, který se u člověka považuje za důležitý marker vývoje karcinogeneze.

Uvedený kmen mikroorganismů je aplikován jako samostatný výživový doplněk, výhodně ve formě tobolek nebo jako přídavek do výživových doplňků pro účely preventivního posílení střevní bariéry a střevní mikroflóry vůči toxickým mutagenům a infekčním patogenům.

Variantou technického řešení je, že Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766 izolovaný z člověka, a ne ze zvířat je aplikován do funkčních potravin, jako jsou energetické cereální tyčinky, fortifikované nápoje, mléčné a masné výrobky, výhodně pasterizovaná brynza. V případě využití Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766 do pasterizované brynzy je navrácen požadovaný probiotický účinek funkční potraviny, která je pasterizací zbavena živé mikroflóry laktobacilů pocházejících ze zvířat.

Výhodou nového kmene mikroorganismů Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766, podle podstaty technického řešení, je modulační efekt použitého kmene, který se projevuje zvýšením počtu bakterií mléčného kvašení a snížením počtu koliformních mikroorganismů ve střevním obsahu tlustého střeva. Aplikace kmene má vliv nejen na střevní mikroflóru, ale i na metabolické aktivity s příznivým účinkem na lipidový profil.

Laktobacilový kmen Lactobacillus plantarum LS/07 byl původci charakterizován v klinických studiích na potkanech, přičemž byly zjištěny následující výhody kmene podle vynálezu technického řešení:

Kmen Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766 nejen že neprodukuje enzym β - glukuronidáza, který může mít karcinogenní účinky, ale současně i snižuje jeho aktivitu ve střevním obsahu při experimentálně chemicky vyvolaném akutním a chronickém zánětu tlustého střeva u laboratorních potkanů.

Histologické výsledky prokázaly, že ve skupinách zvířat, kde byly podávány kmeny Lactobacillus plantarum LS/07, došlo k výraznému snížení a tlumení zánětu ve fixované tkáni kolonu potkanů ve srovnání s kontrolní skupinou, kde uvedený kmen nebyl podáván.

Aplikováním kmene Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766 došlo k signifikantní inhibici (P<0,05) prozánětlivých cytokinů IL-2, IL-17 a TNF-α, a mírnému nárůstu protizánětlivých regulačních cytokinů IL-10 a TGF- β oproti pozitivní kontrolní skupině zvířat.

Ve skupinách zvířat, kde byl aplikován Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766, byl zjištěn výrazně snížený počet populace gramnegativních koliformních bakterií (4,96 ± 0,32 CFU/g) ve

-2CZ 33363 Ul srovnání s kontrolní skupinou (5,45 ±0,11 CFU/g).

Příklady uskutečnění technického řešení

Příklad 1

V tomto příkladu provedení technického řešení je kmen ve formě biologicky čisté kultury.

Příklad 2

Příklad 3

Uvedený kmen Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766 je aplikován do potravin, jako jsou energetické cereální tyčinky, fortifikované nápoje, mléčné a masné výrobky nebo pasterizovaná brynza. Brynza (nazývaná také jako Brimsen, Liptauer Kase, vulgo Burenda) je měkký, hnětený a solený ovčí sýrový produkt vyráběný z hrudkového ovčího sýra. Brynza obsahuje mnoho probiotik, snižuje cholesterol, snižuje cukr v krvi a zánětlivé parametry. Pasterizace však mnohé tyto účinky podstatně oslabuje. Přidáním kmene Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766 do brynzy po skončení pasterizace se dosahuje aktivita bakterií mléčného kvašení při zachování její trvanlivosti.

Příklad 4

V tomto příkladu byl kmen mikroorganismů rodu Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 6677 kultivovaný podle následujícího postupu.

Pracovní postup přípravy kmene:

Pomocí sterilní odběrové soupravy je převeden výtěr z konečníku člověka. Odběrový tampon je ponořen do zásobní zkumavky s fyziologickým roztokem o objemu 5 ml. Ze zásobní zkumavky je odebrán vzorek o objemu 1 ml pomocí pipety a přenesen pipetou do zkumavky s fyziologickým roztokem o objemu 9 ml. Výsledkem ředění je lOnásobné zředění vzorku. Následuje pokračování tohoto postupu do zředění vzorku od 10^-2 až do stupně zředění 10^-5. Ze zkumavek s jednotlivými ředěními jsou odebrány vzorky 0,1 ml a aplikovány na Petriho misky se selektivní půdou pro laktobacily pro růst bakterií mléčného kvašení. Naočkované desky jsou uloženy do speciálních inkubačních nádob, ve kterých je vyvíječ zabezpečující anaerobní kultivační prostředí. Vzduchotěsně uzavřené nádoby jsou uloženy v biologickém termostatu.

Kultivace laktobacilů je realizována při teplotě 37 °C po dobu 48 hodin. Po 48 hodinové inkubaci je posouzena velikost a tvar porostlých kolonií, přičemž porost je tvořen drobnými, okrouhlými, nízko vypouklými koloniemi bílé barvy do velikosti až 2 mm.

Izolace laktobacilového kmene je provedena dle postupu:

Sterilní očkovací kličkou je opatrně (pod lupou) odebrána jedna kolonie bakterií z Petriho misky a naočkována do zkumavky s laktobacilo-selektivním LS bujónem v množství 5 ml. Uvedený postup je několikrát zopakován, přičemž každá odebraná kolonie je naočkovaná do samostatné zkumavky s bujónem. Přeočkovány kolonie jsou inkubovány v termostatu při teplotě 37 °C po dobu 18 hodin.

-3CZ 33363 UI

Po inkubaci je z každé zkumavky odebrána porostlá bujónová kultura v množství 0,1 ml a přeočkována na Petriho misky obsahující selektivní LS agar. Desky jsou následně kultivovány v termostatu za anaerobních podmínek při teplotě 37 °C po dobu 48 hodin. Po inkubaci je provedeno posuzování kolonií laktobacilů. Označené kolonie jsou odebrány za účelem zjištění jejich morfologie mikroskopicky barvicí technikou Grama. Barvení je provedeno následovně podle schématu:

Nasazení kultury na podložní sklíčko

Vysušení a fixace nad plamenem

Aplikace

Φ

Krystalvioleť - 30 sek

Φ

Opláchnutí destilovanou vodou

Aplikace

Lugolův roztok - 30 sekund

Φ

Opláchnutí destilovanou vodou

Aplikace

Etanol 96% - 20 sekund¹

Φ

Opláchnutí destilovanou vodou

Aplikace

Karbolfuchsín - 30 sekund

Φ

Opláchnutí destilovanou vodou Vysušení filtračním papírem

Očkovací půdy, spotřební materiál a nástroje použité k izolaci kmene jsou sterilní. Všechny úkony týkající se práce s mikrobiální kulturou, jsou provedeny ve sterilním očkovacím boxu.

Detekce laktobacilů světelným mikroskopem:

Pro posouzení morfologie laktobacilů je použitý světelný mikroskop Olympus s lOOOx násobným zvětšením. Laktobacily jsou pozorovány jako modré grampozitivní (G+) barvicí se středně silné a středně dlouhé nepohyblivé mikroorganismy ve tvaru tyčinky.

Detekce inhibičních zón kmene Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766 proti patogennímu Escherichia coli CNTC Eck 63/59 agar difuzním testem:

Připravená bujónová kultura kmene Lactobacillus plantarum LS/07 je inkubována přibližně 18 hodin a je změřena její turbidimetrická hodnota na stupeň 0,5 McFarlanda, což odpovídá hodnotě l,5xl0⁸ mikroorganismů. Z bujónové kultury je mikropipetou odebrána bujónová kultura o objemu 0,050 ml a aplikovaná do jamky o velikosti 4 mm (vyřezané do středu desky) selektivního LS agaru. Naočkované Petriho misky jsou uloženy do inkubačních nádob (GASPAK

-4CZ 33363 UI patent USA) a inkubovány v biologickém termostatu při teplotě 37 °C po dobu 48 hodin. Po 48 hodinách je na povrch agarových desek navrstven agar ve složení: pepton 0,5 g, kvasniěný autolyzát 1 g, glukóza 1 g, agar 1,8 g, 100 ml destilovaná voda, pH 6,9, o objemu 3 ml, ve kterém je rozpuštěn bujón o objemu 0,3 ml obsahující noční kulturu porostlého kmene Escherichia coli serotyp O6:K2:H1 ATC 1938 CNTC Eck 63/59. Po aplikací kmene jsou Petriho misky vloženy do termostatu a inkubovány při teplotě 37 °C po dobu 18 hodin. Po inkubaci je změřena velikost inhibičních zón, přičemž průměrný výsledek je získán součtem naměřených hodnot jednotlivých měření vydělených počtem testovaných desek. V příkladu provedení jsou použity odečtené hodnoty měření ze tří desek.

Molekulově genetická detekce kmene Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766:

Na molekulově genetickou detekci izolovaného kmene je použita vysoce citlivá a specifická metoda techniky polymerázové řetězové reakce (PCR). PCR směs, použité specifické primery, amplifikace templátu a elektroforéza v agarózovém gelu jsou provedeny podle literárních zdrojů (Berthier a Ehrlich 1998). Amplifikační PCR produkty jsou obarvené etídium bromidem a detekovány ultrafialovým světlem, přičemž je získaný specifický PCR produkt o velikosti 265 bázových párů.

Stanovení organických kyselin:

Koncentrace organických kyselin (kyselina mléčná a octová) jsou stanoveny pomocí přístroje (CS ISOTACHOPHORETIC ANALYSER) technikou kapilární izotachoforézy. Izolovaný kmen Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766 nejvíce produkoval kyselinu mléčnou ve srovnání s kyselinou octovou. Hodnoty jsou naměřené po 24 hodinové (kyselina mléčná - 78,66 mmol/1, kyselina octová -7,91 mmol/1) a 48 hodinové (kyselina mléčná - 226,31 mmol/1, kyselina octová 95,44 mmol/1) inkubaci v termostatu při teplotě 37 °C.

Stanovení enzymové aktivity

Na studium enzymové aktivity kmene Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766 je použitý komerční kit API ZYM (BIOMÉRIEUX®SA, Francie). Z dosažených výsledků je zjištěno, že testovaný kmen neprodukuje enzym β-glukuronidázu, který je považován za důležitý marker v procesu vývoje karcinogeneze kolorektálního karcinomu.

Experimenty na animálních modelech

Izolovaný kmen Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766 je použit v in vivo experimentálních studiích na laboratorních potkanech. Experimentální práce na laboratorních zvířatech mají velký význam při studiu účinku izolovaných nových kmenů laktobacilů v podmínkách in vivo. Námi izolovaný kmen Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766 ze stolice zdravého člověka jsme použili v pokusu s laboratorními potkany. Potkani použity v pokusu (počet 51) pocházely z kmene Sprague Dawley, byli ve věku čtyř měsíců. Kmen jsme připravovali denně čerstvý v růstovém bujónu pro laktobacily (průměrná koncentrace 2,88 x 10⁹ CFU/ml) a podávali jsme je denně potkanům 5krát v týdnu. Jednou týdně (třetí až sedmý týden) jsme potkanům injekčně aplikovali chemický prokarcinogen 1,2 dimethylhydrazindihydrochlorid (1,2 DMH). Během celého experimentu (24 týdnů) jsme nezaznamenali žádné klinické změny (průjmy, úhyn) u pokusných skupin zvířat. Tím se potvrdilo, že kmen je bezpečný. Dosažené výsledky pokusu potvrzují, že modulační efekt použitého kmene se projevil zvýšením počtu bakterií mléčného kvašení a snížením počtu koliformních mikroorganismů ve střevním obsahu tlustého střeva. Aplikace kmene měla vliv nejen na střevní mikroflóru, ale i na metabolické aktivity s příznivým účinkem na lipidový profil. Jsou zaznamenány pozitivní změny imunitních a histologických laboratorních vyšetření pokusných zvířat.

-5CZ 33363 UI

Průmyslová využitelnost

Průmyslová využitelnost technického řešení je zjevná. Podle tohoto technického řešení je možné průmyslově a opakovaně produkovat Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766. Výše uvedené účinky kmene Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766 ho předurčují k využití při modulaci střevní mikroflóry, jakož i při prevenci zánětlivých chronických chorob lidí.

Claims

NÁROKY NA OCHRANU

1. Potravinářský výrobek nebo výživový doplněk pro modulaci střevní mikroflóry nebo pro prevenci zánětlivých chronických chorob lidí, vyznačující se tím, že obsahuje kmen Lactobacillus plantarum LS/07 CCM 7766, izolovaný z člověka, který je uložen v České sbírce mikroorganismů Přírodovědecké fakulty Masarykovy univerzity, Brno, Česká republika.
2. Potravinářský výrobek nebo výživový doplněk podle nároku 1, vyznačující se tím, že je ve vysušené formě.
3. Potravinářský výrobek nebo výživový doplněk podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že je ve formě lyofilizátu.
4. Potravinářský výrobek nebo výživový doplněk podle nároku 1, vyznačující se tím, že je jím fermentovaný mléčný produkt.
5. Potravinářský výrobek nebo výživový doplněk podle nároku 1 nebo 4, vyznačující se tím, že je jím sýr.
6. Potravinářský výrobek nebo výživový doplněk podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že je jím výživový doplněk ve formě tobolek.
7. Potravinářský výrobek nebo výživový doplněk podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že má podobu energetické cereální tyčinky, mléčného nebo masného výrobku.
8. Potravinářský výrobek nebo výživový doplněk podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že je jím pasterizovaná brynza.