CZ2020527A3 - Azulenové hydrazido-hydrazony a jejich použití k léčbě onkologických onemocnění - Google Patents

Abstract

Azulenové hydrazido-hydrazony obecného vzorce I mají 2-hydroxyarylovou skupinu,kde R1, R2, R3, R4 jsou nezávisle H, OH, alkyl s 1 až 6 uhlíkovými atomy, C(CH3)3, allyl, benzyl, fenyl, F, Cl, Br, I, CH2OH, O(alkyl), CF3, OCF3, CN, COO(alkyl), CONH(alkyl), NO2, N(alkyl)2, NH(alkyl), NHCO(alkyl), kde alkyl má 1 až 6 uhlíkových atomů, nebo R1-R2 nebo R2-R3 nebo R3-R4 je -CH=CH-CH=CH-, tedy přikondenzované benzenové jádro. Tyto sloučeniny vykazují selektivní cytostatický efekt a mohou být využity pro přípravu léčiva pro léčbu onkologických onemocnění.

Description

Azulenové hydrazido-hydrazony a jejich použití k léčbě onkologických onemocnění

Oblast techniky

Vynález se týká azulenových derivátů s hydrazido-hydrazonovou skupinou a jejich použití jako selektivních cytostatik pro léčbu onkologických onemocnění (leukémií a nádorových onemocnění).

Dosavadní stav techniky

Rakovina je jednou z nejčastějších příčin úmrtí v rozvinutých zemích. V posledních letech se k dosažení lepší prognózy používá nová strategie kombinující terapii a diagnostiku, tzv. teranostika. Je známo, že železo je nezbytným prvkem pro člověka a mnoho dalších organismů. Železo hraje rozhodující úlohu v mnoha procesech, jako je transport kyslíku, energetické procesy, detoxikace chemických látek, syntéza DNA. Na druhou stranu hladina volného železa musí být přísně regulovaná, protože přebytek volného železa se může podílet na oxidativním stresu díky tvorbě volných radikálů (Fentonova reakce) a může tak vést k poškození tkání. Mezi procesy spojené s železem při rozvoji rakoviny a při růstu nádorových buněk patří buněčný metabolismus, replikace DNA, regulace buněčného cyklu, apoptóza, ferroptóza. Díky tomu je železo důležitým a slibným cílem terapeutických a diagnostických intervencí. Jednou z možností, jak regulovat hladinu železa je použití chelátorů. Chelátory jsou látky schopné silně vázat ionty kovů, např. železa. Tyto látky jsou schopny tvořit komplexy s intra- a extracelulámím železem. Na vazbě kovu se podílí kyslíkové a dusíkové donomí centra. V humánní medicíně se využívá několik schválených chelátorů. Jedním z nejčastěji užívaných je desferrioxamin (DFO), používaný k léčbě poruch a onemocnění spojených s chronickým přebytkem železa, např. thalassemie. Chelatace železa může být účinný přístup ke snížení tvorby vysoce toxických hydroxylových radikálů, což vede k oxidativnímu stresu. Chelátory mohou ovlivňovat také hladinu železa nezbytného pro růst a dělení buněk a mohou tak sloužit jako terapeutika pro léčbu onkologických onemocnění [T. F. Tam, R. Leung-Toung, W. Li, Y. Wang, K. Karimian, M. Spinoet: Iron Chelator Research: Past, Present, and Future Curr. Med. Chem. 2003, 10, 983-995; D. R. Richardson: Iron chelators as therapeutic agents for the treatment of cancer Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2002, 42, 267-81; J. L. Buss, B. T. Greene, J. Turner, F. M. Torti, S. V. Torti: Iron Chelators in Cancer Chemotherapy Curr. Top. Med. Chem. 2004, 4, 1623-1635; D. S. Kalinowski, D. R. Richardson: The Evolution of Iron Chelators for the Treatment of Iron Overload Disease and Cancer. Pharmacol. Rev. 2005, 57, 547-583; A. M. Merlot, D. S. Kalinowski, D. R. Richardson: Novel chelators for cancer treatment: where are we now? Antioxid. Redox Signal. 2013,18, 973-1006; Z. D. Liu, R. C. Hider: Design of iron chelators with therapeutic application Coord. Chem. Rev. 2002, 232, 151-171; H. Nick: Iron chelation, quo vadis? Curr. Opin. Chem. Biol. 2007, 11, 419-423], Další možností je ovlivnění metaloenzymů, zejména ribonukleotid reduktázy, která hraje klíčovou roli při syntéze DNA a dalších enzymů nutných pro energetický metabolismus buňek a ovlivňujících různé buněčné procesy, např. apoptózu. Vzhledem k výše uvedeným faktům je zřejmé, že chelátory mohou zcela zásadně ovlivňovat dělení a růst buněk a mohou sloužit k překonání rezistence při léčbě rakoviny.

Jedním ze slibných typů chelátorů jsou hydrazony. Tyto látky vykazují širokou škálu biologické aktivity, zahrnující antimikrobiální, antimykobakteriální, antivirální, fungicidní, antivirální, protimalarické účinky či mohou sloužit jako terapeutika k léčbě neurodegenerativních onemocnění. Hydrazony vykazují v mnoha případech výrazné cytostatické účinky [E. A. Malecki, J. R. Connor: The Case for Iron Chelation and/or Antioxidant Therapy in Alzheimer’s Disease. Drug Develop. Res. 2002, 56, 526-530; A. Gaeta, R. C. Hider: The crucial role of metal ions in neurodegeneration: the basis for a promising therapeutic strategy. Brit. J. Pharmacol. 2005, 146, 1041-1059; S. Rollas, §. G. Kůcůkgůzcl: Biological Activities of Hydrazone Derivatives. Molecules 2007, 12, 1910-1939; G. Verma, A. Marella, M. Shaquiquzzaman, M. Akhtar, M. R.

-1 CZ 2020 - 527 A3

Ali, Μ. M. Alam: A review exploring biological activities of hydrazones. J. Pharm. Bioallied Sci. 6 (2014) 69-80; B. Narasimhan, P. Kumar, D. Sharma: Biological activities of hydrazide derivatives in the new millennium. Acta Pharm. Sci. 2010, 52, 169-180; G. Uppal, S. Bala, S. Kamboj, M. Saini: Therapeutic Review Exploring Antimicrobial Potential of Hydrazones as Promising Lead. Pharma Chern. 2011, 3, 250-268; P. Kumar, B. Narasimhan: Hydrazides/Hydrazones as Antimicrobial and Anticancer Agents in the New Millennium. MiniRev. Med. Chern. 2013,13, 971-987; R. León, A. G. Garcia, J. Marco-Contelles: Recent Advances in the Multitarget-Directed Ligands Approach for theTreatment of Alzheimer’s Disease. Med. Res. Rev. 2013, 33, 139-189; R. Kaplánek, M. Havlík, B. Dolenský, J. Rak, P. Džubák, P. Konečný, M. Hajdúch, J. Králová, V. Král: Synthesis and biological activity evaluation of hydrazone derivatives based on a Troger's base skeleton. Bioorg. Med. Chern. 23 (2015) 1651-1659; R. Kaplánek, M. Jakubek, J. Rak, Z. Kejík, M. Havlík, B. Dolenský, I. Frydrych, M. Hajdúch, M. Kolář, K. Bogdanová, J. Králová, P. Džubák, V. Král: Caffeine-hydrazones as anticancer agents with pronounced selectivity toward T-lymphoblastic leukaemia cells. Bioorg. Chern. 60 (2015) 19-29],

Azulenové hydrazido-hydrazony a využití těchto látek jako cytostatik pro léčbu onkologických onemocnění jsou předmětem tohoto patentu.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu jsou 7-isopropyl-3-methylazulen-l-karbohydrazony mající substituovanou 2-hydroxyarylovou skupinu (azulenové hydrazido-hydrazony obecného vzorce I,

(I) kde R1.R2, R3, R4 jsou nezávisle H, OH, alkyl s 1 až 6 uhlíkovými atomy, C(CH3)3, allyl, benzyl, fenyl, F, Cl, Br, I, CH₂OH, O(alkyl), CF₃, OCF₃, CN, COO(alkyl), CONH(alkyl), NO₂, N(alkyl)₂, NH(alkyl), NHCO(alkyl), kde alkyl má 1 až 6 uhlíkových atomů, nebo R1-R2 nebo R2-R3 nebo R3-R4 je -CH=CH-CH=CH-, tedy přikondenzované benzenové jádro.

Látky obecného vzorce I mají cytostatické účinky a lze je použít pro přípravu terapeutických systémů k léčbě onkologických onemocnění.

Příprava azulenových hydrazido-hydrazonů majících 2-hydroxyarylovou skupinu obecného vzorce I a jejich cytostatické vlastnosti jsou doloženy následujícími příklady, aniž by jimi byly jakkoliv omezeny.

Objasnění výkresů

Obrázek 1 znázorňuje titrační křivky pro titraci chelátoru 13 železitými a železnatými ionty

Obrázek 2 znázorňuje titrační křivky pro titraci chelátoru 14 železitými a železnatými ionty

Obrázek 3 znázorňuje titrační křivky pro titraci chelátoru 15 železitými a železnatými ionty

- 2 CZ 2020 - 527 A3

Obrázek 4 znázorňuje intracelulámí lokalizaci chelátorů 13 (A), 14 (B) a 15 (C) v živých HF buňkách. Panely mikroskopických snímků: 1) chelátor v koncentraci 1 μΜ; 2) LysoTracker™ v koncentraci 300 nM; 3) MitoTracker™ v koncentraci 50 nm; 4) překryv

Obrázek 5 znázorňuje změny exprese proteinů NDRG1 (N-myc downstream regulovaný gen 1), TfRl (transferinový receptor), HIF-l-alfa (hypoxií indukovaný faktor 1 alfa) pro kontrolní vzorek, standardní chelátory DFO (100 μΜ), DP44mT (5 μΜ), Dpc (5 μΜ) achelátory 13, 14 a 15 (5 μΜ).

Příklady uskutečnění vynálezu

Příklad 1. Příprava výchozích látek

Příprava azulenového esteru: 5-Isopropyl-3-(methoxykarbonyl)-2H-cyklohepta[ň]fůran-2-on (1232 mg; 5 mmol) byl rozpuštěn v isopropanolu (16 ml). Do roztoku byl přidán propionaldehyd (1,1 ml; 15 mmol) následovaný morfolinem (1,35 ml; 15,3 mmol). Reakční směs byla míchána při 75 °C po dobu 4 h (kontrola TLC: petrolether/ethyl acetát 8:1 v/v). Po skončení reakce byly těkavé látky odpařeny za sníženého tlaku a surový produkt byl čištěn pomocí kolonové chromatografíe (silikagel; eluent petrolether/ethyl acetát 5:1 v/v). Bylo získáno 975 mg (výtěžek 80%) methyl 7isopropyl-3-methylazulen-l-karboxylátu ve formě tmavě modré pevné látky.

Ή NMR (300 MHz; CDCh) 1,41 (d, J = 6,9 Hz, 6H); 2,58 (s, 3H); 3,20 (hept, J = 6,9 Hz, 1H); 3,94 (s, 1H); 7,34 (m, 1H); 7,69 (d, J = 10,2 Hz, 1H); 8,16 (s, 1H); 8,23 (dd, J = 9,8, 0,6 Hz, 1H); 9,67 (d, J = l,9Hz, 1H), ¹³C NMR (75 MHz, CDCh) 12,6; 24,8; 39,2; 51,1; 113,5; 124,3; 125,3; 133,6; 137,1; 137,8; 140,8; 141,2; 141,6; 148,2; 166,1

Příprava 7-isopropyl-3-methylazulen-l-karbohydrazidu: Methyl 7-isopropyl-3-methylazulen-lkarboxylát (952 mg; 3,93 mmol) byl rozpuštěn v isopropanolu (30 ml) a do roztoku byl přidán hydrazin hydrát (10 ml; 200 mmol). Reakční směs byla míchána při 75 °C přes noc. Po skončení reakce byly těkavé látky odpařeny za sníženého tlaku a surový produkt byl čištěn pomocí kolonové chromatografíe (silikagel; eluent ethyl acetát). Bylo získáno 876 mg (výtěžek 92%) 7-isopropyl-3methylazulen-l-karbohydrazidu ve formě tmavě modré pevné látky.

Ή NMR (300 MHz; CDCh) 1,39 (d, J = 6,9 Hz, 6H); 2,57 (s, 3H); 3,18 (hept, J = 6,9 Hz, 1H); 4,20 (s, 2H); 7,29 (m, 1H); 7,39 (s, 1H); 7,67 (m, 1H); 7,79 (s, 1H); 8,21 (dd, J = 9,9, 1,0 Hz, 1H); 9,66 (d, J=l,9Hz, 1H), ¹³C NMR (75 MHz; CDCh) 12,6; 24,8; 39,1; 115,2; 124,1; 124,5; 133,8; 135,7; 137,8; 138,1; 140,0; 140,3; 147,3; 167,7

Příklad 2. Příprava azulenových hydrazido-hydrazonů, spadajících pod obecný vzorec I. Obecný postup.

7-isopropyl-3-methylazulen-l-karbohydrazid (46 mg; 0,19 mmol) a substituovaný 2hydroxybenzaldehyd (0,20 mmol) byly rozpuštěny v isopropanolu (10 ml). Reakční směs byla míchána při 75 °C po dobu 2 dnů. Po skončení reakce byly těkavé látky odpařeny za sníženého tlaku a surový produkt byl suspendován ve směsi diethyl ether / petrolether (1:1 v/v; 30 ml). Pevný produkt byl odfiltrován na fritě S4, promyt další porcí směsi diethyl ether / petrolether (1:1 v/v; 3x 20 ml) a usušen za vakua při 50 °C. Výtěžek produktu byl 60-97%.

Příklady připravených struktur, struktury výchozích 2-hydroxybenzaldehydů, preparativní výtěžky azulenových hydrazido-hydrazonů a jejich Ή NMR analýza jsou uvedeny v Tabulce 1.

Tabulka 1. Struktury, výtěžky a Ή NMR azulenových hydrazido-hydrazonů

-3CZ 2020 - 527 A3

Azulenový hydrazido-hydrazon spadající pod obecný vzorec I	Výchozí substituovaný benzaldehyd	Výtěžek	‘HNMR (300 MHz, DMSOd6)
__Η /? \ Α ,Ν \ % J * If J JV-(2-hydroxybenzyliden)-7isopropyl-3 -methylazulen-1 karbohydrazid	HO-to····· 2-hydroxybenzaldehyd	48 mg (73%)	1,35 (d, J = 6,6Hz, 6H);2,61 (s, 3H); 3,17 (m, 1H); 6,93 (m, 2H); 7,28 (m, 1H); 7,47 (m, 2H);7,85 (d,J=10,2 Hz, 1H); 8,30 (s, 1H); 8,39 (d, J = 9,8 Hz, 1H); 8,60 (s, 1H); 9,73 (s, 1H); 11,64 (s, 1H); 11,92 (s, 1H)
V. ,___/ Ίΐ Η 4 \-Κ V ί ϊ *· Ί) Ί η hg' γ M-(2-hydroxy-3methylbenzyliden)-7-isopropyl3 -methylazulen-1 karbohydrazid	w “γ ύ HO' Y 2-hydroxy-3methylbenzaldehyd	46 mg (67%)	1,36 (d, J = 6,8Hz, 6H); 2,23 (s, 3H); 2,61 (s, 3H); 3,18 (m, 1H); 6,85 (m, 1H); 7,20 (d, J = 7,3 Hz, 1H); 7,27 (d, J = 7,8 Hz, 1H); 7,45 (m, 1H); 7,87 (d, J = 10,2 Hz, 1H); 8,30 (s, 1H); 8,41 (d, J = 9,7 Hz, 1H); 8,54 (s, 1H); 9,75 (s, 1H); 11,99 (s, 1H); 12,25 (s, 1H)
Y ϋ ηοΛΥ V-(2-hydroxy-3methoxybenzyliden) -7isopropyl-3 -methylazulen-1 -	°YÚi ι-ίο- γ Y 2-hydroxy-3- methoxybenzaldehyd	60 mg (84%)	1,35 (d, J = 6,8Hz, 6H);2,61 (s, 3H); 3,17 (m, 1H); 3,83 (s, 3H); 6,87 (m, 1H); 7,03 (d, J = 8,lHz, 1H); 7,11 (d, J = 7,8 Hz, 1H); 7,44 (m, 1H); 7,85 (d, J =

-4CZ 2020 - 527 A3

karbohydrazid			10,0 Hz, 1H); 8,30 (s, 1H); 8,40 (d, J = 9,7 Hz, 1H); 8,60 (s, 1H); 9,73 (s, 1H); 11,39 (s, 1H); 11,89 (s, 1H)
Λ N .-X. ΐ F r ¥ ¥ O . Λ { HO' T OH V-(2,3 -dihydroxybenzyliden)-7 isopropyl-3 -methylazulen-1 karbohydrazid	HO^ OH 2,3- dihydroxybenzaldehyd	44 mg (64%)	1,35 (d, J = 6,9 Hz, 6H); 2,61 (s, 3H);3,17(m, 1H); 6,74 (m, 1H); 6,84 (dd, J = 7,9, 1,6 Hz, 1H); 6,93 (dd, J = 7,9, 1,6 Hz, 1H); 7,44 (m, 1H); 7.86 (d, J = 10,9 Hz, 1H); 8.29 (s, 1H); 8,40 (d, J = 9,1 Hz, 1H); 8,55 (s, 1H); 9,14 (s, 1H); 9,73 (s, 1H); 11,52 (s, 1H); 11,90 (s, 1H)
V ,___// Η H // \Α, ,N. If ϊ N Ί 1 ° HO'“^ V-(3-allyl-2hydroxybenzyliden) -7isopropyl-3 -methylazulen-1 karbohydrazid	HO 'γ' 3-allyl-2- hydroxybenzaldehyd	49 mg (67%)	1,36 (d, J = 6,8 Hz, 6H); 2,61 (s, 3H); 3,17 (m, 1H); 3,41 (d, J = 6,9 Hz, 1H); 5,07 (m, 2H); 6,01 (m, 1H); 6,89 (m, 1H); 7,18 (d, J = 7,4 Hz, 1H); 7,30 (d, J = 6,4 Hz, 1H); 7,45 (m, 1H); 7,86 (d, J = 10,6 Hz, 1H); 8,30 (s, 1H); 8,41 (d, J = 9,7 Hz, 1H); 8,55 (s, 1H); 9,75 (s, 1H); 12,02 (s, 1H); 12,37 (s, 1H)

-5CZ 2020 - 527 A3

X X _Π η ta \ tak Ν tav t 1 r 'Ν' IΊ ^'--2-- -ta Ό ta% v-ůta-. JV-(2-hydroxy-4methoxybenzyliden) -7isopropyl-3 -methylazulen-1 karbohydrazid	2-hydroxy-4methoxybenzaldehyd	63 mg (88%)	1,35 (d, J = 6,8 Hz, 6H); 2,60 (s, 3H); 3,15 (m, 1H); 3,78 (s, 3H); 6,52 (m, 2H); 7,41 (m, 2H); 7,84 (d, J = 9,9 Hz, 1H); 8,28 (s, 1H); 8,39 (d, J = 9,6 Hz, 1H); 8,51 (s, 1H); 9,72 (s, 1H); 11,80 (s, 1H); 11,96 (s, 1H)
HA W J N 11 γ oh JV-(2,4-dihydroxybenzyliden)-7isopropyl-3 -methylazulen-1 karbohydrazid	HO 2,4- dihydroxybenzaldehyd	60 mg (87%)	1,34 (d, J = 6,9 Hz, 6H); 2,60 (s, 3H); 3,16 (m, 1H); 6,32 (d, J = 2,2 Hz, 1H); 6,36 (dd, J = 8,4, 2,2 Hz, 1H); 7,27 (d, J = 8,4 Hz, 1H); 7,42 (s, 1H); 7,83 (d, J = 10,7 Hz, 1H); 8,27 (s, 1H); 8,38 (d, J = 9,5 Hz, 1H); 8,47 (s, 1H); 9,71 (s, 1H); 9,91 (s, 1H); 11,72 (s, 1H); 11,77 (s, 1H)
__1'1 H Uv A n J ψ ° JV-(4-(diethylamino)-2hydroxybenzyliden) -7isopropyl-3 -methylazulen-1 karbohydrazid	4-(diethylamino)-2hydroxybenzaldehyd	65 mg (82%)	1,11 (t, J = 7,0 Hz, 6H); 1,35 (d, J = 6,8 Hz, 6H); 2,60 (s, 3H);3,16(m, 1H); 3,36 (q, J = 7,0 Hz, 4H); 6,14 (s, 1H); 6,26 (d, J = 9,0 Hz, 1H); 7,17 (d, J = 9,0 Hz, 1H); 7,40 (m, 1H); 7,83 (d, J= 10,6 Hz, 1H); 8,26 (s, 1H); 8,38 (m, 2H); 9,71 (s, 1H); 11,59 (s, 1H); 11,73 (s, 1H)

-6CZ 2020 - 527 A3

s ,...../ jl H f γά' / o A ,/ γ ho - V-(2-hydroxy-5methylbenzyliden)-7-isopropyl3 -methylazulen-1 karbohydrazid	°ΎΎ HO- 2-hydroxy-5 methylbenzaldehyd	53 mg (77%)	1,35 (d, J = 6,9 Hz, 6H); 2,26 (s, 3H); 2,61 (s, 3H); 3,17 (m, 1H); 6,84 (d, J = 8,3 Hz, 1H); 7,09 (d, J = 8,4 Hz, 1H); 7,31 (m, 1H); 7,44 (m, 1H); 7,85 (d, J = 9,8 Hz, 1H); 8,30 (s, 1H); 8,39 (d, J = 9,7 Hz, 1H); 8,55 (s, 1H); 9,73 (s, 1H); 11,36 (s, 1H); 11,89 (s, 1H)
_/ ϋ H / l\A xc ll 11 1 ' 'j * HOX V-(2-hydroxy-5methoxybenzyliden) -7isopropyl-3 -methylazulen-1 karbohydrazid	ο - ψ ' HO- 2-hydroxy-5 methoxybenzaldehyd	60 mg (83%)	1,35 (d, J = 6,9 Hz, 6H); 2,61 (s, 3H); 3,17 (m, 1H); 3,75 (s, 3H); 6,87 (m, 2H); 7,11 (d, J = 2,5 Hz, 1H); 7,44 (m, 1H); 7,85 (d, J = 10,5 Hz, 1H); 8,31 (s, 1H); 8,40 (d, J = 9,5 Hz, 1H); 8,58 (s, 1H); 9,73 (s, 1H); 10,99 (s, 1H); 11,90 (s, 1H)
.____H / \ X K ,CI \ // r N 1 T 3 HQ V-(5-chlor-2hydroxybenzyliden) -7isopropyl-3 -methylazulen-1 karbohydrazid	Xf °’ Í T HO' 2-hydroxy-5 chlorbenzaldehyd	54 mg (75%)	1,35 (d, J = 6,8 Hz, 6H); 2,60 (s, 3H);3,17(m, 1H); 6,96 (m, 1H); 7,29 (m, 1H); 7,46 (m, 1H); 7,66 (m, 1H); 7,86 (d, J = 10,8 Hz, 1H); 8,31 (s, 1H); 8,40 (d, J = 9,7 Hz, 1H); 8,57 (s, 1H); 9,73 (s, 1H); 11,60 (s, 1H); 12,01 (s, 1H)

-7 CZ 2020 - 527 A3

v Η W ο A J Τ HQ Ν-(5 -brom-2- hydroxybenzyliden) -7isopropyl-3 -methylazulen-1 - karbohydrazid	.Bf °' Ϊ J HC: '··' 2-hydroxy-5 brombenzaldehyd	64 mg (79%)	1,35 (d, J = 6,8 Hz, 6H); 2,60 (s, 3H); 3,17 (m, 1H); 6,91 (d, J = 8,7 Hz, 1H); 7,43 (m, 2H); 7,78 (d, J = 2,4 Hz, 1H); 7,86 (d, J = 10,7 Hz, 1H); 8,31 (s, 1H); 8,40 (d, J = 9,7 Hz, 1H); 8,56 (s, 1H); 9,73 (s, 1H); 11,60 (s, 1H); 12,01 (s, 1H)
\ η ; .. A \X ť ť if N Ji Ί 0 Λ M 7 HO' M-(5-(/i7'c-butyl)-2hydroxybenzyliden) -7isopropyl-3 -methylazulen-1 karbohydrazid	HO 2-hydroxy-5-(tercbutyl)benzaldehyd	62 mg (80%)	1,29 (s, 9H); 1,35 (d, J = 6,8 Hz, 6H);2,61 (s, 3H);3,17(m, 1H); 6,88 (d, J = 8,6 Hz, 1H); 7,33 (d, J = 8,6 Hz, 1H); 7,44 (m, 2H); 7,85 (d, J =10,1 Hz, 1H); 8,31 (s, 1H); 8,40 (d, J = 9,8 Hz, 1H); 8,60 (s, 1H); 9,73 (s, 1H); 11,38 (s, 1H); 11,89 (s, 1H)
J% h a · A ,N. OH t f Fl I ''y ho N-(2,5 -dihydroxybenzyliden)-7 isopropyl-3 -methylazulen-1 karbohydrazid	,OH ° I 1 HO 2,5- dihydroxybenzaldehyd	62 mg (90%)	1,35 (d, J = 6,8 Hz, 6H); 2,60 (s, 3H);3,16(m, 1H); 6,74 (m, 2H); 6,91 (m, 1H); 7,44 (m, 1H); 7,85 (d, J = 10,1Hz, 1H); 8,29 (s, 1H); 8,39 (d, J = 9,8 Hz, 1H); 8,51 (s, 1H); 8,97 (s, 1H); 9,72 (s, 1H); 10,74 (s, 1H); 11,81 (s, 1H)

-8CZ 2020 - 527 A3

Z \ Jk .k zx ,NOf ( > Ϊ N I J ' JV-(2-hydroxy-5nitrobenzyliden)-7-isopropyl-3 methylazulen-1 -karbohydrazid	AU °' o HO -· 2-hydroxy-5 nitrobenzaldehyd	64 mg (86%)	1,36 (d, J = 6,8 Hz, 6H); 2,61 (s, 3H); 3,17 (m, 1H); 7,12 (d, J = 9,1 Hz, 1H); 7,45 (m, 1H); 7,86 (d, J =10,3 Hz, 1H); 8,16 (dd, J = 9,1, 2,9 Hz, 1H); 8,33 (s, 1H); 8,40 (d, J = 9,8 Hz, 1H); 8,58 (d, J = 2,7 Hz, 1H); 8,69 (s, 1H); 9,74 (s, 1H); 12,11 (s, 1H); 12,64 (s, 1H)
\ ,—b H |i t // 1, 1 γ Μ' methyl 4-hydroxy-3-((2-(7- isopropyl-3-methylazulen-1 karbonyl)hydrazinylidene)meth yl) benzoát	-¾ Jv O >j f θ 2-hydroxy-5 - (karboxymethyl)benza Idehyd	53 mg (69%)	1,35 (d, J = 6,8 Hz, 6H); 2,61 (s, 3H); 3,17 (m, 1H); 3,85 (s, 3H); 7,04 (d, J = 8,6 Hz, 1H); 7,44 (m, 1H); 7,86 (m, 2H); 8,26 (d, J = 2,1 Hz, 1H); 8,32 (s, 1H); 8,40 (d, J = 9,7 Hz, 1H); 8,66 (s, 1H); 9,74 (s, 1H); 12,00 (s, 1H); 12,13 (s, 1H)
H f \A z-X. xx o x -Ά X H0' X) N-((1 -hydroxynafthalen-2yl)methylen)-7-isopropyl-3 methylazulen-1 -karbohydrazid	HO 'f' 1 -hydroxynaftalen-2karbaldehyd	55 mg (73%)	1,37 (d, J = 6,8 Hz, 6H); 2,63 (s, 3H);3,19(m, 1H); 7,52 (m, 5H); 7,87 (m, 2H); 8,31 (m, 1H); 8,33 (s, 1H); 8,42 (d, J = 9,6 Hz, 1H); 8,70 (s, 1H); 9,78 (s, 1H); 12,10 (s, 1H); 13,28 (s, 1H)

-9CZ 2020 - 527 A3

ζΓχ,Χ ΐ ί ϊ Ν ϊ ο . > y ho V-((2-hydroxynafthal yl)methylen) -7-isopro methylazulen-1 -karbo	en-1pyl-3hydrazid	HO' v 2-hydro' karbalde	<yna1 hyd	'talon-1-	64 mg (85%)	1,36 (d, J = 6,8 Hz, 6H); 2,66 (s, 3H); 3,19 (m, 1H); 7,26 (d, J = 9,0 Hz, 1H); 7,44 (m, 2H); 7,63 (m, 1H); 7,90 (m, 3H); 8,20 (d, J = 8,4 Hz, 1H); 8,33 (s, 1H); 8,42 (d, J = 9,7 Hz, 1H); 9,49 (s, 1H); 9,78 (s, 1H); 11,99 (s, 1H); 13,09 (s, 1H)
\ ....../1 H zN.„A. ., (- if v N V W δ 1 HO' x V-(3,5-di-terc-butyl-2 hydroxybenzyliden) -7 isopropyl-3-methylazi karbohydrazid	’A rlen-1-	3.5-di(/c hydroxy	rc-br 3cnz<	ityl)-2ildehyd	65 mg (75%)	1,30 (s, 9H); 1,36 (d, J = 6,8 Hz, 6H); 1,43 (s, 9H); 2,61 (s, 3H);3,17(m, 1H); 7,21 (d,J = 2,2 Hz, 1H); 7,30 (d, J = 2,2 Hz, 1H); 7,45 (m, 1H); 7,86 (d, J = 10,0 Hz, 1H); 8,30 (s, 1H); 8,41 (d, J = 9,6 Hz, 1H); 8,55 (s, 1H); 9,75 (s, 1H); 11,98 (s, 1H); 12,57 (s, 1H)
\ __.,/1 H z- N, ť J ¥ N' τ ° HOZ V-(3,5 -dichlor-2hydroxybenzyliden) -7 isopropyl-3-methylazi karbohydrazid	.X^CI rlen-1-	,CI Ο'· ho''X¥ Cl 3,5-dichlor-2hydroxybenzaldehyd	76 mg (96%)	1,35 (d, J = 6,8 Hz, 6H); 2,60 (s, 3H);3,18(m, 1H); 7,47 (m, 1H); 7,59 (d, J = 2,5 Hz, 1H); 7,64 (d, J = 2,5 Hz, 1H); 7,88 (d, J = 10,0 Hz, 1H); 8,31 (s, 1H); 8,41 (d, J = 9,6 Hz, 1H); 8,52 (s, 1H); 9,75 (s, 1H); 12,30 (s, 1H); 11,95 (s, 1H)

-10CZ 2020 - 527 A3

V V \X -N „ ..Br ť > K N A η' 'γ' u HO'' á ^-(3,5-dibrom-2hydroxybenzyliden) -7isopropyl-3-methylazulen-1 karbohydrazid	,Br HO' x'ý”' Bf 3,5-dibrom-2hydroxybenzaldehyd	74 mg (77%)	1,36 (d, J = 6,8 Hz, 6H); 2,60 (s, 3H);3,18(m, 1H); 7,47 (m, 1H); 7,79 (m, 2H); 7,88 (d, J = 9,8 Hz, 1H); 8,31 (s, 1H); 8,41 (d, J = 9,5 Hz, 1H); 8,49 (s, 1H); 9,75 (s, 1H); 12,32 (s, 1H); 13,15 (s, 1H)
N u r i n Ύ Hv 'ý' JV-(5 -allyl -2-hydroxy-3 methoxybenzyliden) -7isopropyl-3-methylazulen-1 karbohydrazid	5 -allyl-2-hydroxy-3 methoxybenzaldehyd	56 mg (71%)	1,35 (d, J = 6,8 Hz, 6H); 2,60 (s, 3H); 3,16 (m, 1H); 3,33 (d, J = 5,9 Hz, 2H); 3,81 (s, 3H); 5,09 (m, 2H); 5,97 (m, 1H); 6,85 (s, 1H); 6,95 (s, 1H); 7,43 (m, 1H); 7,85 (d, J = 10,0 Hz, 1H); 8,30 (s, 1H); 8,39 (d, J = 10,0 Hz, 1H); 8,58 (s, 1H); 9,72 (s, 1H); 11,05 (s, 1H); 11,86 (s, 1H)
k X jí M 4 \A t f J ) 1 Ύ Ηθ'”Χύ ,> . ,,.ó JV-(5 -brom-2-hydroxy-3 methoxybenzyliden) -7isopropyl-3-methylazulen-1 karbohydrazid	λ >·^ HO' 'Ý' .„0 5 -brom-2-hydroxy-3 methoxybenzaldehyd	52 mg (60%)	1,35 (d, J = 6,6 Hz, 6H); 2,60 (s, 3H); 3,15 (m, 1H); 3,85 (s, 3H); 7,15 (s, 1H); 7,43 (m, 2H); 7,85 (d,J= 10,1Hz, 1H); 8,30 (s, 1H); 8,39 (d, J = 9,4 Hz, 1H); 8,57 (s, 1H); 9,73 (s, 1H); 11,27 (s, 1H); 11,97 (s, 1H)

-11 CZ 2020 - 527 A3

A N.-A. ,N. -X, „NO? \ ř κ N ιϊ 1 ' 0 A. X 1 ko y Ax /V-(2-hydroxy-3 -methoxy-5 nitrobenzyliden)-7-isopropyl-3 methylazulen-1 -karbohydrazid

O jf A 2-hydroxy-3 -methoxy5 -nitrobenzaldehyd

78 mg (97%)

1,36 (d, J = 6,8 Hz, 6H); 2,60 (s, 3H); 3,17 (m, 1H); 3,97 (s, 3H); 7,45 (m, 1H); 7,77 (d, J = 2,5 Hz, 1H); 7,86 (d, J = 9,6 Hz, 1H); 8,25 (d, J = 2,5 Hz, 1H); 8,32 (s, 1H); 8,40 (d, J = 9,6 Hz, 1H); 8,70 (s, 1H); 9,74 (s, 1H); 12,11 (s, 1H); 12,44 (s, 1H)

Příklad 3. Chelatační vlastnosti azulenových hydrazido-hydrazonů vůči železnatým a železitým iontům.

Chelatace iontů železa je jedním z možných mechanismů účinku hydrazido-hydrazonů. Byly proto provedeny testy chelatačních vlastností vybraných azulenových hydrazido-hydrazonů vůči Fe²⁺ a Fe³⁺ iontům ve vodném prostředí (voda-DMSO 99:1, v/v). Vazebné konstanty jsou výrazně ovlivněny použitým rozpouštědlem, proto byly všechny experimenty provedeny ve stejném systému (voda-DMSO). UV/Vis titrace /V-(2-hydroxy-3-methoxybenzyliden)-7-isopropyl-3methylazulen-l-karbohydrazidu (chelátor 13), V-((2-hydroxynafthalen-l-yl)methylen)-7isopropyl-3-methylazulen-l-karbohydrazidu (chelátor 14) a V-(4-(diethylamino)-2hydroxybenzyliden)-7-isopropyl-3-methylazulen-l-karbohydrazidu (chelátor 15), všechny spadající pod obecný vzorec I s Fe²⁺ a Fe³⁺ ionty ukazují, že látky mají k těmto iontům silnou afinitu (došlo k silné spektrální odpovědi po přidání iontů železa). Koncentrace chelátorů byla 10 μΜ, koncentrace Fe²⁺ nebo Fe³⁺ byla v rozsahu 0-0,5 mM. UV spektra byla měřena v rozsahu 300600 nm.

Obrázky 1-3 znázorňují titrační křivky pro titraci chelátorů 13, 14 a 15 žele žitými a železnatými ionty

Příklad 4. Protirakovinné vlastnosti azulenových hydrazido-hydrazonů.

Cytotoxické vlastnosti azulenových hydrazido-hydrazonů byly testovány na dvou buněčných liniích karcinomu pankreatu: MIA Paca a PANC-1 a na linii HF (lidské fibroblasty). V Tabulkách 2 a 3 jsou uvedeny příklady struktur a koncentrace azulenových hydrazido-hydrazonů, inhibující buněčnou viabilitu buněčných linií na 50% uvedená jako hodnoty IC50 [μΜ nebo pg/ml]. Hodnoty IC50 byly naměřeny po 48hodinové inkubaci buněk s látkami.

Testované látky vykazují hodnoty IC50 v rozsahu 0,195 až 2,073 pM (0,07 pg/ml až 0,87 pg/ml). Výrazná cytotoxicita byla prokázaná u V-((2-hydroxynafthalen-l-yl)methylen)-7-isopropyl-3methylazulen-l-karbohydrazidu (chelátor 14), spadajícího pod obecný vzorec I pro pankreatickou nádorovou linii MIA Paca, viz tabulka 3. Z naměřených dat je zřejmé, že chelátory mají velký cytotoxický potenciál.

-12 CZ 2020 - 527 A3

Tabulka 2. IC50 [M] pro vybrané azulenové hydrazido-hydrazony

Chelátor	IC50 [μΜ]
	HF	MIA PaCa	PANC-1
N-(2-hydroxy-3 -methoxybenzyliden) -7isopropyl-3 -methylazulen-1 -karbohydrazid, spadající pod obecný vzorec I (chelátor 13)	0,338	0,558	0,527
A'-((2-hydroxynaftalen-1 -yl)methylen)-7isopropyl-3 -methylazulen-1 -karbohydrazid, spadající pod obecný vzorec I (chelátor 14)	0,595	0,195	0,552
N-(4-(diethylamino) -2-hydroxybenzyliden) -7isopropyl-3 -methylazulen-1 -karbohydrazid, spadající pod obecný vzorec I (chelátor 15)	1,073	0,407	2,073

Tabulka 3. IC50 [pg/ml] pro vybrané azulenové hydrazido-hydrazony

Chelátor	IC50 [pg/ml]
	HF	MIA Paca	PANC-1
Ν'-(2-hydroxy-3 -methoxybenzyliden) -7isopropyl-3-methylazulen-l-karbohydrazid, spadající pod obecný vzorec I (chelátor 13)	0,127	0,210	0,527
M-((2-hydroxynaftalcn -1 -yl)methylen)-7 isopropyl-3-methylazulen-l-karbohydrazid, spadající pod obecný vzorec I (chelátor 14)	0,236	0,077	0,219
Ν'-(4-(diethylamino) -2-hydroxybenzyliden) 7-isopropyl-3 -methylazulen-1 -karbohydrazid, spadající pod obecný vzorec I (chelátor 15)	0,448	0,170	0,865

Příklad 5. Intracelulámí lokalizace azulenových hydrazido-hydrazonů

Pro testování intracelulámí lokalizace látek byly použity lidské fíbroblasty (linie HF). Pro mikroskopické experimenty bylo inokulováno 5000 buněk na kultivační misku. Buňky byly inkubovány 24h v inkubátoru a následně dvakrát promyty PBS pufrem. Poté bylo přidáno DMEM medium (Dulbecco's Modified Eagle Medium) s chelátory v koncentraci 1 μΜ, s MitoTracker™ Red v koncentraci 50 nM a s LysoTracker™ Green v koncentraci 300 nM. Po přidání směsi byly buňky inkubovány 15 min (37 °C; 5% CO2), protože intracelulámí průnik chelátorů je velmi rychlý. Po inkubaci byly buňky dvakrát promyty PBS pufrem. Pro real-time fluorescenční mikroskopii živých buněk byl použit mikroskop Leica TCS SP8 WLL SMD-FLIM s objektivem HC PL APO CS2 63x (NA1,2) a třech vlnových délkách (405 nm, 504 nm a 579 nm) s HyD detektorem (400 720 nm); měření probíhalo v atmosféře s 5% CO2 při 37 °C. Intracelulámí lokalizace měřených látek byla porovnána s lokalizací komerčních prób MitoTracker™ a LysoTracker™. Z měření jasně vyplývá, že látky jsou schopny rychle procházet buněčnou membránou a jsou následně lokalizovány převážně v lysozomech (Obr. 4).

Příklad 6. Western Blot

Na AcPCl buňkách byly po inkubaci s chelátory studovány změny v expresi proteinů (NDRG1, TfRl, Hif-l-alpha). Účinek nových chelátorů na expresi proteinů byl porovnáván s účinkem komerčně dostupných standardů (chelátorů), DFO (100 μΜ), Dpc (5 μΜ) and DP44mT (5 μΜ). AsPCl buňky byly naočkovány v počtu 600 000 buněk na jamku a byly ponechány adherovat alespoň 24 h, dokud konfluence nebyla 70%. Bylo použito médium RPMI 1640 (20% FBS, 1% streptomycin). Po inkubaci se odstranilo veškeré médium a přidala se směs média a chelátorů a nechala se inkubovat 24 hodin. Po 24 hodinách byla provedena buněčná lýza. Z buněčného lyzátu

-13 CZ 2020 - 527 A3 byl určen zvyšující se nebo snižující účinek na protein v buňkách ve srovnání s kontrolou (buňky bez přidaného chelátorů).

Pro testované proteiny byly provedeny tři replikace experimentů k ověření výsledku. Změna exprese proteinů byla testována pro tři proteiny (NDRG1, TfRl, HIF-1-alfa), jejichž proteiny jsou důležité pro rakovinné buněčné linie (obr. 5). TfRl (transferinový receptor) je protein, který se podílí na buněčné absorpci železa a také na regulaci buněčného růstu.

Exprese TfRl je regulována hlavně na post-transkripční úrovni a její odpovědi na intracelulámí hladinu železa (obr. 8). NDRG1 (N-myc downstream regulovaný gen 1) je supresorový protein metastázy regulovaný železem. Je to protein, který se podílí hlavně na růstu buněk, diferenciaci, reparaci DNA a také na buněčné adhezi. HIF-l-alfa (hypoxií indukovaný faktor 1 alfa) je důležitý v angiogenezi nádoru. Je aktivován nízkým obsahem kyslíku a genetickými odpověďmi spojenými s nádorovým onemocněním. Při hypoxii se HiF-l-alfa stává stabilním a působí jako důležitý regulátor četných hypoxií indukovatelných genů, které souvisejí s angiogenezi, proliferací buněk a metabolismem glukózy a železa.

Průmyslová využitelnost

Vynález je využitelný ve farmaceutickém průmyslu, k přípravě nových léčiv a k léčbě onkologických onemocnění.

Claims (2)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Azulenové hydrazido-hydrazony mající 2-hydroxyarylovou skupinu obecného vzorce I,

   X

   AU δ A γ w f r?

   A (i) kde R1.R2, R3, R4 jsou nezávisle H, OH, alkyl s 1 až 6 uhlíkovými atomy, C(CH₃)₃, allyl, benzyl, fenyl, F, Cl, Br, I, CH₂OH, O(alkyl), CF₃, OCF₃, CN, COO(alkyl), CONH(alkyl), NO₂, N(alkyl)₂, NH(alkyl), NHCO(alkyl), kde alkyl má 1 až 6 uhlíkových atomů, nebo R1-R2 nebo R2-R3 nebo R3-R4 je -CH=CH-CH=CH-, tedy přikondenzované benzenové jádro.
2. 2. Použití látek obecného vzorce I podle nároku 1 pro přípravu léčiva k léčbě onkologických onemocnění.