CZ2021199A3 - Probiotický přípravek pro drůbež a jeho použití - Google Patents

Abstract

Předkládané řešení poskytuje probiotický přípravek pro drůbež, který obsahuje jako účinnou složku směs bakterií Bacteroides caecicola, Bacteroides caecigallinarum, Megasphaera sp.a Mediterranea sp. Přípravek je určen pro léčebné či preventivní zlepšení fyziologických vlastností střevního traktu drůbeže.

Description

Probiotický přípravek pro drůbež a jeho použití

Oblast techniky

Předkládaný vynález poskytuje probiotický přípravek pro zlepšení fýziologických a imunitních vlastností trávicího traktu drůbeže Gallus gallus prostřednictvím osídlení směsí probiotických baktérií.

Dosavadní stav techniky

Střevní mikroflóra podstatným způsobem ovlivňuje a charakterizuje zdravotní stav hostitele. Střevní mikroflóra každého jedince se sestává z přibližně 1000 různých bakteriálních druhů a asi desetkrát více různých bakteriálních klonů a izolátů. Střevní mikroflóra teplokrevných zvířat se sestává zejména z baktérií náležících mezi Gram pozitivní Firmicutes a Gram negativní Bacteroidetes. Minoritní baktérie kolonizující trávicí trakt pochází z kmenů Proteobacteria a Actinobacteria. U hrabavé drůbeže se jako probiotické preparáty nejčastěji používají laktobacily (patří mezi Firmicutes') a bifidobaktérie (patří mezi Actinobacteria). Experimenty původců tohoto vynálezu však ukazují, že podání čistých kultur laktobacilů nebo Actinobacteria jednodenním kuřatům nevede k jejich usídlení v trávicím traktu kuřat. Identifikovat jiné baktérie schopné účinně kolonizovat trávicí trakt drůbeže mezi desítkami tisíc variant je však velmi složitý úkol a prostá znalost baktérií přítomných ve střevní mikroflóře drůbeže nebo lidí neposkytuje vůbec žádnou užitečnou informaci ohledně jejich vhodnosti pro osídlování trávicího traktu kuřat v prvních dnech života. V případě studia střevní mikroflóry kúra domácího se navíc různí autoři uchylují ke studiu střevní mikroflóry v prvních týdnech života přibližně odpovídající délce výkrmu brojlerů (cca 35 dnů). To je však značně problematický a zavádějící přístup poskytující výsledky velmi diskutabilní kvality. Důvod pro toto tvrzení je, že kuřata se líhnou v líhních, bez kontaktu s dospělou slepicí a jejich počáteční mikroflóra pochází výlučně z prostředí. Střevní mikroflóra mladých kuřat proto není vůbec reprezentativní pro kúra domácího a mikrobiální kultivací z trávicího traktu brojlerů se v naprosté většině případů získají bakteriální kultury nevhodné pro použití jako probiotika, včetně např. laktobacilů. Evoluce naopak selektovala kuřata tak, aby se hned v prvních hodinách po vylíhnutí v hnízdě osídlily mikroflórou matky. Nerespektování této skutečnosti při selekci nových probiotických kmenů vede k zcela mylným konceptům a závěrům. Nadto je jasné, že slepice nepředává kuřatům jednu jedinou baktérii a v souladu s tím, experimentální podání jednotlivých bakteriálních kultur nechrání kuřata před infekcí salmonelami nebo zvýšenými úhyny v prvních dnech života. Pokud některé studie tvrdí opak, neuvádí kriticky vyhodnocené výsledky, což lze snadno doložit reálným stavem v chovech drůbeže. V těch se pro nefunkčnost stávajících jednodruhových probiotik používají antibiotika s veškerými nežádoucími důsledky.

Naopak panuje shoda, že podání komplexní mikroflóry kuřatům, např. extraktem trusu dospělých slepic vede k jejich okamžité ochraně před infekcí salmonelami, zcela v souladu se skutečností, že takové experimenty mimikují přirozený přenos komplexní mikroflóry mezi slepicí a kuřetem. Tato varianta ovšem naráží na legislativní opatření, protože se tímto způsobem mohou přenášet i nezjištěná infekční agens bakteriálního, virového nebo protozoámího původu. Je tedy známo, že jednotlivé baktérie nezvyšují zásadním způsobem odolnost kuřat proti salmonelám, zatímco komplexní mikroflóra, která má ale omezené použití, před salmonelami chrání. Řešení ochrany trávicího traktu tedy existuje, ale není jasné, zdaje nutné podat vždy všech 1000 baktérií současně s rizikem nekontrolovaného přenosu i nežádoucích baktérií, anebo zda lze ochranu redukovat na menší počet baktérií. A pokud by bylo možné redukovat počet baktérií, není jasné, které baktérie z tisíců různých vybrat do účinného, ale současně z pohledu reálné produkce co nejjednoduššího preparátu.

- 1 CZ 2021 - 199 A3

Předkládaný vynález proto předkládá výstup, probiotický přípravek, který vyhovuje výše uvedeným požadavkům. Obsahuje více než jednu baktérii, ale přesto má relativně jednoduché složení, které je technicky realizovatelné. Přitom zajistí efektivní osídlení trávicího traktu drůbeže od prvních dnů života, sníží přítomnost nežádoucích bakterií v trávicím traktu kuřat a ochrání kuřata před salmonelovou infekcí.

Podstata vynálezu

V rámci předkládaného vynálezu bylo studováno více než 500 různých baktérií, které původci vynálezu postupně izolovali z trávicího traktu kuřat v čistých kulturách a stanovili u nich kompletní sekvenci genomu. Z nich jen malá část účinně kolonizovala trávicí trakt drůbeže. Klíčovým zjištěním bylo, že mezi baktériemi schopnými kolonizovat trávicí trakt kuřat po jednorázové aplikaci nebyl jediný zástupce rodů Lactobacillus, Enterococcus nebo Bacillus, které se dosud v chovech drůbeže používají jako probiotika. Předkládaná probiotická směs je svým složení zcela unikátní a odlišná od jakéhokoliv jiného produktu.

Po identifikaci baktérií schopných účinné kolonizace trávicího traktu kuřat v dalším kroku původci vynálezu redukovali počet bakteriálních druhů vhodných do směsi identifikací takových baktérií, které jsou specifické pro drůbež. Tato úvaha dosud nebyla při přípravě probiotik pro drůbež používána. Toho bylo dosaženo porovnáním střevní mikroflóry kúra domácího, prasete domácího a člověka. Tato analýza ukázala, že z řádu Lactobacillales nebo čeledí Lachnospiraceae, Ruminococcaceae nebo Enterobacteriaceae se stejné druhy často vyskytují u všech tří hostitelů. Baktérie z těchto taxonomických jednotek jsou tedy původem z prostředí a nejsou vhodné jako hostitel-adaptovaná probiotika ve smyslu této přihlášky vynálezu. Uvedené zjištění potvrdila analýza střevní mikroflóry sedmidenních kuřat, která se sestávala zejména ze zástupců Lachnospiraceae, Ruminococcaceae nebo Enterobacteriaceae. Protože však tato kuřata nikdy nebyla v kontaktu s dospělou slepicí, baktérie v jejich trávicím traktu musely pocházet výlučně z prostředí. Další experimenty pak ukázaly, že jako vhodné baktérie pro zcela nový typ probiotik pro použití u kúra domácího se jevili zástupci čeledí Veillonellaceae, Prevotellaceae nebo Bacteroidaceae. Ze zástupců těchto taxonů byla připravena probiotická směs, která je předmětem této přihlášky vynálezu.

Předmětem předkládaného vynálezu je tedy probiotická směs vhodná pro podání kuřatům, která obsahuje jako účinnou složku baktérie Bacteroides caecicola, Bacteroides caecigallinarum, Megasphaera sp. a Mediterranea sp. Takto je poskytnuta přesně definovaná, bezpečná, snadno kultivovatelná a podatelná probiotická směs, vhodná pro masné i nosné linie drůbeže, která se sestává z baktérií striktně adaptovaných na kúra domácího, které ve vysoké účinnosti a dlouhodobě kolonizují trávicí trakt po jednorázové aplikaci. Všechny čtyři baktérie lze kultivovat současně, což významně zjednodušuje jejich průmyslovou přípravu. Probiotická směs je vhodná zejména pro podávání první den života drůbeže, ale lze ji podat i v pozdějších dnech.

Probiotická směs podle vynálezu má oproti všem podobným, doposud připraveným produktům, tyto technické výhody:

- Obsažené baktérie jsou adaptované na kuře a nevyskytují se ve střevní mikroflóře člověka nebo prasat.

- Všechny čtyři baktérie patří za předpokladu dodržení anaerobní kultivace mezi in vitro snadno kultivovatelné.

- Všechny čtyři baktérie lze souběžně fermentovat, protože mají podobné růstové rychlosti. Žádná z těchto baktérií tedy ve směsi nepřeroste ostatní.

- Všechny baktérie lze kultivovat v médiu bez přídavku jakýchkoli produktů živočišného původu.

-2CZ 2021 - 199 A3

- Všechny baktérie výhodného provedení byly celogenomově sekvenovány a bylo ověřeno, že ani jedna z nich nemá v genomu horizontálně přenositelné geny pro rezistence k antibiotikům.

- Baktérie ze směsi účinně osídlují trávicí trakt drůbeže po jednorázové aplikaci, a to tak odlišné genetické linie jako je masná linie Ross nebo nosná linie ISA Brown.

- Po aplikaci všechny čtyři baktérie kolonizují trávicí trakt nejméně po dobu 35 dnů.

- Po aplikaci jednodenním kuřatům a infekci Salmonella Enteritidis probiotická směs zvyšuje odolnost kuřat před salmonelami.

- U ošetřených kuřat se v menší míře vyskytují patogenní nebo oportunně patogenní baktérie původem z prostředí, jako je Escherichia coli, Campylobacter jejuni, Proteus vulgaris, Clostridiumperfringens nebo Clostridium difficile.

- V reálných hejnech aplikace směsi snižuje úhyny až na úroveň srovnatelnou s výkrmem (odchovem) kuřat za použití antibiotik. Aplikací probiotické směsi tak lze nahradit použití antibiotik v produkci drůbeže.

Probiotickou směs podle vynálezu lze podávat kuřatům kdykoliv v průběhu života. Nej výhodnější je však její podání kuřatům bezprostředně po vylíhnutí. Směs je proto určena zejména k aplikaci jednodenním kuřatům v líhních nebo bezprostředně po naskladnění kuřat na farmu, to je ve věku 1 až 5 dnů, výhodněji 1 až 3 dnů.

Směs lze podávat v pitné vodě nebo krmivu. Pro dosažení homogenního pokrytí celého hejna je však nejvhodnější sprejová aplikace v líhni. Probiotická směs byla otestována jako zcela bezpečná po sprejové aplikaci.

Předmětem předkládaného vynálezu je také krmivo obsahující probiotickou směs podle vynálezu.

Předmětem předkládaného vynálezu je dále formulace pro sprejovou aplikaci obsahující probiotickou směs podle vynálezu a alespoň jedno potravinářsky přijatelné rozpouštědlo.

Při testování bylo zjištěno, že po orálním podání jednodenním kuřatům tvoří baktérie z probiotické směsi více než 25 % z celkové střevní mikroflóry u sedmidenních kuřat a okolo 50 % z celkové střevní mikroflóry u kuřat 29. den života, což je v podstatě délka života brojlerů ve výkrmu. Ve střevní mikroflóře kontrolních kuřat, kterým nebyla probiotická směs podávána, se baktérie probiotické směsi nenacházely. Baktérie z probiotické směsi ze střevní mikroflóry vytlačily baktérie, které mohou způsobovat záněty a nežádoucí fyziologické stavy, jako je E. coli, Proteus vulgaris, Campylobacter jejuni, Clostridium perfringens nebo Clostridium difficile. Probiotická směs podle vynálezu při testování nevykazovala žádné negativní vlastnosti, a naopak chránila kuřata před experimentální infekcí Salmonella Enteritidis, a to jak při orální čelenži, tak i po čelenži s využitím modelu „seeder bird“. U osídlených kuřat navíc klesal podíl E. coli na 1 až 2 % z celkové mikroflóry, signifikantně méně než u kontrolních neosídlených kuřat, u kterých se podíl E. coli na celkové mikroflóře pohyboval v desítkách procent. Předkládaná probiotická směs je proto velmi vhodná pro použití jako probiotický preparát u kuřat, který účinně zlepšuje zdravotní stav a fýziologické vlastnosti kuřat bez nežádoucích vedlejších účinků a omezuje tak potřebu použití antibiotik.

Ve výhodném provedení se probiotická směs sestává z bakterií Bacteroides caecicola CCM 9131, Bacteroides caecigallinarum CCM 9132, Megasphaera sp. CCM 9129 a Mediterranea sp. CCM 9130. Tyto bakteriální kmeny jsou uloženy v České sbírce mikroorganismů (CCM), adresa: Kamenice 5/budova A25, 625 00 Brno, Czech Republic.

CZ 2021 - 199 A3

Přípravek je s výhodou formulován pro orální nebo sprejové podání, a obsahuje tedy kapalný nosič na bázi vody. Kapalným nosičem může být voda, fýziologický roztok nebo růstové médium pro baktérie. Růstové médium pro pomnožení a fermentaci neobsahuje žádné ingredience živočišného původů a sestává se pouze z peptonu ze sójových bobů (enzymatický digestát), kyselého hydrolyzátu sójových proteinů a kvasnicového extraktu.

Probiotický přípravek s výhodou obsahuje alespoň 10⁷ CFU na mililitr tekutého produktu každé ze čtyř obsažených baktérií. Předmětem předkládaného vynálezu je tedy probiotický přípravek obsahující baktérie pro použití jako probiotický preparát pro léčebné či preventivní zlepšení imunity a/nebo fýziologických vlastností střevního traktu drůbeže Gallus gallus. Zlepšení imunity a/nebo fyziologických vlastností s výhodou zahrnuje prevenci infekcí trávicího traktu drůbeže patogeny, zejména patogeny E. coli a/nebo Salmonella, anebo Proteus vulgaris,

Campylobacter jejuni, Clostridium perfringens a Clostridium difficile. Dále je předmětem předkládaného vynálezu použití probiotického přípravku pro neléčebné zlepšení fýziologických vlastností střevního traktu drůbeže Gallus gallus.

Přípravek je možno podávat jednorázově v jedné jednotkové dávce nebo opakovaně v několika jednotkových dávkách rozložených v čase. S výhodou se však poprvé podává sprej ováním v dolíhni den před transportem nebo sprejováním kuřat při třídění před transportem na farmu. Třetí dávku je možné distribuovat kuřatům po naskladnění na farmu orálně, a to jak pitnou vodou, tak jako příměs do krmivá.

Objasnění výkresů

Obrázek 1. Výskyt hostitelsky adaptovaných a všeobecně přítomných členů střevní mikroflóry u člověka, prasete a drůbeže. Horní panel, šedá barva, počet druhů v daném taxonu, které se vyskytují u více než jednoho hostitele. Černá, šachovnice a šrafování, počet druhů, které se daného taxonu vyskytují pouze u kuřete, člověka, resp. prasete. Spodní panel, procentuální zastoupení daného taxonu v mikroflóře sedmidenních kuřat. Pří vývoji probiotické směsi pro kuřata jsme striktně vybírali z baktérií adaptovaných na kuře.

Obrázek 2. Grafý znázorňují počty salmonel ve slepém střevě kuřat 4, 14 a 21 dní po infekci. U každé skupiny je uveden i věk kuřat ve dnech. S. Enteritidis byla kvantifikována kultivačně (panel A) nebo pomocí real-time PCR (Panel B). Hvězdičkou jsou označeny signifikantní rozdíly (t-test, p<0,05), kdy nižší počty salmonel byly vždy zaznamenány u kuřat ošetřených probiotickou směsí.

Obrázek 3. Schopnost probiotické směsi zvyšovat odolnost kuřat před spontánním osídlením E. coli z prostředí. Hvězdičkou jsou označeny signifikantní rozdíly (t-test, p<0,05), kdy nižší počty E. coli byly vždy zaznamenány u kuřat ošetřených probiotickou směsí.

Obrázek 4. Vliv podání probiotické směsi pitnou vodou po naskladnění na úhyny po celou dobu výkrmu brojlerů. Černé čtverečky, úhyny ve třech hejnech, ve kterých byla podávána antibiotika. Šedé kroužky, úhyny v hejnech s probiotickou směsí. Bílé trojúhelníky, úhyny v hejnech bez antibiotik a bez probiotické směsi.

Obrázek 5. Vliv podání probiotik sprejováním v dolíhni na úhyny po celou dobu výkrmu brojlerů. Čtverečky, úhyny v hejnu, ve kterém byla podávána antibiotika. Kroužky, úhyny v hejnu ošetřeném probiotickou směsí.

-4CZ 2021 - 199 A3

Příklady uskutečnění vynálezu

Příklad 1: Identifikace a izolace vhodných bakteriálních druhů specifických pro mikroflóru kuřat

Při návrhu nových probiotik je klíčové selektovat z bakteriálních druhů adaptovaných na daného hostitele a vyhnout se sdíleným druhům, jejichž původ je nejasný. Při návrhu nových probiotik jsme porovnali bakteriální druhy vyskytující se u člověka, prasete a kúra domácího, a zaměřili se jen na druhy, které jsou přísně hostitelsky adaptované na kuře. Porozumění a plné uvědomění si všech důsledků této skutečnosti je pro návrh nových generací probiotik klíčové. Baktérie adaptované pro kuře jsme vybírali z čeledí Veillonellaceae, Prevotellaceae a Bacteroidaceae (obr. 1). Na druhy z těchto čeledí jsme zaměřili následnou kultivaci, která byla prováděna z obsahů slepých střev dospělých slepic naředěných ve sterilním ředicím roztoku (0,1 g síran hořečnatý heptahydrát, 0,2 g monobazický fosforečnan draselný, 0,2 g chlorid draselný, 1,15 g dibazický fosforečnan sodný, 3,0 g chlorid sodný, 1,0 g thioglykolát sodný, 0,5 g /.-cystein. 1000 ml destilovaná voda, pH 7,5 při 25 °C). Jednotlivá ředění byla vyseta na Wilkins-Chalgren (WCHA) agar a inkubace probíhala v anaerobní atmosféře sestávající se z 10 % CO2, 5 % H2 a 85 % N2 při 37 °C po dobu 72 hodin. Z narostlých kolonií byl alikvot resuspendován v 1,0 ml BHI bujónu s 10% glycerolem a zamražen při -70 °C pro další použití. Z jiného alikvotu byla izolována DNA, která byla využita pro stanovení kompletní sekvence bakteriální DNA a následnou druhovou identifikaci. Bacteroides caecigallinarum a Mediterranea sp. patří mezi Gram negativní baktérie čeledi Bacteroidaceae. Konečným produktem jejich metabolismu je acetát, propionát a sukcinát. Bacteroides caecicola patří mezi Gram negativní baktérie čeledi Prevotellaceae a konečným produktem jeho metabolismu je acetát, propionát a sukcinát. Megasphaera sp. náleží do čeledi Veillonellaceae, která fýlogeneticky patří do kmene Firmicutes. Megasphaera sp. je butyrát produkující baktérie. Se znalostí celogenomové sekvence byly identifikovány geny specifické pro každou z uvedených baktérií a na ně byly zacíleny Sybr Green real time PCR pro detekci a kvantifikaci v libovolném typu vzorků, zejména však trusu ošetřených kuřat s využitím následujících specifických primerů:

Cílová baktérie	forward primer	reverse primer
Bacteroides caecicola	tataccatgcacgatgaacc (SEQ ID NO. 1)	aaataccttcttccctcacg (SEQ ID NO. 2)
Bacteroides caecigallinarum	gatgcggtccgtgtaaagtt (SEQ ID NO. 3)	gtcggcagtgaggaatttgt (SEQ ID NO. 4)
Megasphaera sp.	Acgtcaacgaagccgaatac (SEQ ID NO. 5)	Cgacgaccatgaactgaatg (SEQ ID NO. 6)
Mediterranea sp.	Gggcatttccccgtatttat (SEQ ID NO. 7)	Gtatactcgcccaggttcca (SEQ ID NO. 8)

Jednotlivé izolované kmeny bakterií byly charakterizovány i podle sekvence genu pro 16S rRNA. Taje pro jednotlivé izoláty baktérií používané v dalších testech následující:

Bacteroides caecicola CCM 9131

ATTTTACAATGAAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTAGCTACAGGCTTAAC ACATGCAAGTCGAGGGGCAGCATGTATCTGGCTTGCCAGATACGATGGCGACCGGC GCACGGGTGAGTAACGCGTATCCAACCTGCCCCGTACACGGGGATAGCCTTCCGAA AGGGAGATTAATACCCGATGATGTCAGGAGTTCGCATGTAAACCTGACTAAAGTTAT TACGGTACGGGAGGGGGGTGCGTTCCATTAGGTAGTAGGCGGGGTAACGGCCCACC TAGCCGACGATGGATAGGGGTTCTGAGAGGAAGGTCCCCCACATTGGAACTGAGAC ACGGTCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGCCGGGAG GCTGAACCAGCCAAGTAGCGTGAAGGATGACGGCCCTACGGGTTGTAAACTTCTTTT ATGCGGGATTAACGTGAGGTACGTGTACCTTCTTGCAGGTACCGCATGAATAAGCAT CGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATGCAGGCGTTATCCGGAT

-5CZ 2021 - 199 A3

TTATTGGGTTTAAAGGGAGCGCAGACGGCATGTCAAGTCAGCTGTGAAAGTTCGGGG CTCAACCTTGGAATTGCAGTTGAAACTGGCGTGCTTGAGTTCGGTCGAGGCAGGCGG AATTCGTGGTGTAGCGGTGAAATGCTTAGATATCACGAAGAACCCCGATTGCGAAGG CAGCTTGCCAGGCCTGGACTGACGTTGAGGCTCGAAGGTGCGGGTATCGAACAGGA TTAGATACCCTGGTAGTCCGCACGGTAAACGATGGATACTCGCTGTCGGCGATACAC GGTCGGCGGCCAAGCGAAAGCGTTAAGTATCCCACCTGGGGAGTACGCCGGCAACG GTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGAGGAACATGTGGTTTAA TTCGATGATACGCGAGGAACCTTACCCGGGCTTGAACTGTGCCTGACTGCCTCAGAG ATGGGGCTTCCAGCAATGGCAGGCATGGAGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTG CCGTGAGGTGTCGGCTTAAGTGCCATAACGAGCGCAACCCCTCCCGCCAGTTGCCAT CAGGTAAAGCTGGGCACTCTGGGGGCACTGCCACCGCAAGGTGTGAGGAAGGTGGG GATGACGTCAAATCAGCACGGCCCTTACGTCCGGGGCTACACACGTGTTACAATGGG AGGTCACAGAGGGCTGCTACCCGGCGACGGGACGCCAATCCCCAAACCCTCCCTCA GTACGGACTGGAGTCTGCAACCCGACTCCACGAAGCTGGATTCGCTAGTAATCGCGC ATCAGCCACGGCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGCC ATGAAAGCCGGCGGTGCCTGAAGTGCGTAACCGCAAGGGGCGCCCTAGGGTAAAGC CGGTGATTGGGGCTAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCGGCTGGAAC AC (SEQ ID NO. 9)

Bacteroides caecigallinarum CCM 9132

ATTTTACAATGAAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTAGCTACAGGCTTAAC ACATGCAAGTCGAGGGGCAGCGGGAAGGAAGCTTGCTGAAATTGCCGGCGACCGGC GCACGGGTGAGTAACGCGTATCCAACCTTCCGTTTACTCAGGGATAGCCTTTCGAAA GAAAGATTAATACCTGATAGTATGGTAAGATTGCATGATAGTACCATTAAAGATTCA TCGGTAAACGATGGGGATGCGTTCCATTAGGTAGTAGGCGGGGTAACGGCCCACCTA GCCTACGATGGATAGGGGTTCTGAGAGGAAGGTCCCCCACATTGGAACTGAGACAC GGTCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGGCGCGAGCC TGAACCAGCCAAGTAGCGTGAAGGATGAAGGTTCTATGGATTGTAAACTTCTTTTAT AAGGGAATAAAGTGCTTTACGTGTAGAGTTTTGTATGTACCTTATGAATAAGCATCG GCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATGCGAGCGTTATCCGGATTT ATTGGGTTTAAAGGGAGCGTAGACGGGATGTTAAGTCAGCTGTGAAAGTTTGGGGCT CAACCTTAAAATTGCAGTTGAAACTGGCGTTCTTGAGTGCGGTAGAGGCAGGCGGAA TTCGTGGTGTAGCGGTGAAATGCTTAGATATCACGAAGAACTCCAATTGCGAAGGCA GCTTGCTGGAGCGTAACTGACGTTGATGCTCGAAAGTGTGGGTATCAAACAGGATTA GATACCCTGGTAGTCCACACGGTAAACGATGGATACTCGCTGTTGGCGATATACGGT CAGCGGCCAAGCGAAAGCATTAAGTATCCCACCTGGGGAGTACGCCGGCAACGGTG AAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGAGGAACATGTGGTTTAATTC GATGATACGCGAGGAACCTTACCCGGGCTTAAATTATGCATGAATGATCTGGAGACA GATCAGCCGCAAGGCATGTATGAAGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGCCGTG AGGTGTCGGCTTAAGTGCCATAACGAGCGCAACCCTTTCTGCCAGTTACTAACAGGC AATGCTGAGGACTCTGGCGGTACTGCCATCGTAAGATGTGAGGAAGGTGGGGATGA CGTCAAATCAGCACGGCCCTTACGTCCGGGGCTACACACGTGTTACAATGGGGGGTA CAGAAGGCAGCTTACCGGCGACGGTTGGCCAATCCCGAAAGCCCCTCTCAGTTCGGA CTGGAGTCTGCAACCCGACTCCACGAAGCTGGATTCGCTAGTAATCGCGCATCAGCC ACGGCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGCCATGAAAG CCGGGAGTACCTGAAGTGCGTAACCGCAAGGAGCGCCCTAGGGTAACACTGGTAAT TGGGGCTAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCGGCTGGAACAC (SEQ ID NO. 10)

Megasphaera sp. CCM 9129

TATCATGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACAT GCAAGTCGAACGGGAGGACATGGGAAGCTTGCTTCCTATGGACTCTAGTGGCAAAC GGGTGAGTAACGCGTAAGCAACCTGCCCTCCGGATGGGGACAACAGCTGGAAACGG

-6CZ 2021 - 199 A3

CTGCTAATACCGAATACGTTTCCACTGCCGCATGGCAGTGGGAAGAAAGGTGGCCTC TGAATATGCTACCGCCGGGGGAGGGGCTTGCGTCTGATTAGCTAGTTGGAGGGGTAA CGGCCCACCAAGGCGACGATCAGTAGCCGGTCTGAGAGGATGAACGGCCACATTGG AACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATCTTCCGCAAT GGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGCGAAGACGGCCTTCGGGTTGTAA AGCTCTGTTATACGGGACGAACGGCTAGTGTGCCAATACCACATTAGAATGACGGTA CCGTAAGAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTG GCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCGCGCAGGCGGTTTCATAAGTCT GTCTTAAAAGTGCGGGGCTTAACCCCGTGAGGGGACGGAAACTGTGAGACTGGAGT GTCGGAGAGGAAAGCGGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATTAGGAG GAACACCAGTGGCGAAAGCGGCTTTCTGGACGACAACTGACGCTGAGGCGCGAAAG CCAGGGGAGCGAACGGGATTAGATACCCCGGTAGTCCTGGCCGTAAACGATGGATA CTAGGTGTAGGGGGTATCGACCCCTCCTGTGCCGGAGTTAACGCAATAAGTATCCCG CCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACA AGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGCCTTGA CATTGAGTGCTATCCTCAGAGATGAGGAGTTCTTCTTCGGAAGACGCGAAAACAGGT GGTGCACGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAG CGCAACCCCTATCTTCTGTTGCCAGCGCGTCATGGCGGGGACTCAGGAGAGACTGCC GCAGACAATGCGGAGGAAGGCGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGGCT TGGGCTACACACGTACTACAATGGCTCTTAATAGAGGGAAGCGAAGGAGCGATCCG GAGCAAACCCCAAAAACAGAGTCCCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACCCGCCTGCA TGAAGCAGGAATCGCTAGTAATCGCAGGTCAGCATACTGCGGTGAATACGTTCCCGG GCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAAAGTCATTCACACCCGAAGCCGGTGAG GTAACCTTACGGAGCCAGCCGTCGAAGGTGGGGGCGATGATTGGGGTGAAGTCGTA ACAAGGTAGCCGTATCG (SEQ ID NO. 11)

Mediterranea sp. CCM 9130

ACTTTTACAATGAAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTAGCTACAGGCTTAA CACATGCAAGTCGAGGGGCAGCGGGATTGTAGCAATACAATTGCCGGCGACCGGCG CACGGGTGAGTAACACGTATCCAACCTTCCGGTTACTCGGGGATAGCCTTTCGAAAG AAAGATTAATACCCGATAGTATAAGATTTCCGCATGGTTTTCTTATTAAAGATTCATC GGTAACCGATGGGGATGCGTTCCATTAGATAGTAGGCGGGGTAACGGCCCACCTAGT CGACGATGGATAGGGGTTCTGAGAGGAAGGTCCCCCACATTGGAACTGAGACACGG TCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGGCGAGAGCCTG AACCAGCCAAGTAGCGTGAAGGATGACTGCCCTATGGGTTGTAAACTTCTTTTATAC GGGAATAACATCATCCACGTGTGGGTGTCTGCATGTACCGTATGAATAAGCATCGGC TAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATGCGAGCGTTATCCGGATTTAT TGGGTTTAAAGGGAGCGTAGACGGGTCCTTAAGTCAGTTGTGAAAGTTTGCGGCTCA ACCGTAAAATTGCAGTTGATACTGGGGACCTTGAGTGCGGCAGAGGCAGGCGGAAT TCGTGGTGTAGCGGTGAAATGCTTAGATATCACGAAGAACTCCGATTGCGAAGGCAG CTTGCTGGACCGTAACTGACGTTGATGCTCGAAAGTGCGGGTATCAAACAGGATTAG ATACCCTGGTAGTCCGCACAGTAAACGATGAATACTCGCTGTTGGCGATATACTGCC AGCGGCCAAGCGAAAGCGTTAAGTATTCCACCTGGGGAGTACGCCGGCAACGGTGA AACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGAGGAACATGTGGTTTAATTCG ATGATACGCGAGGAACCTTACCCGGGCTTGAACTGCAGCGGAATGGCGTGGAAACA TGTCAGCGAGCAATCGCCGCTGTGGAGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGCCG TGAGGTGTCGGCTTAAGTGCCATAACGAGCGCAACCCTTACCGATAGTTGCCATCAG GTAACGCTGGGGACTCTATCGGGACTGCCGTCGTAAGATGTGAGGAAGGTGGGGAT GACGTCAAATCAGCACGGCCCTTACGTCCGGGGCTACACACGTGTTACAATGGGGGG TACAGCAGGCCGCTACCGGGCGACCGGATGCCAATCCCTAAAACCCCTCTCAGTTCG GACTGGAGTCTGCAACCCGACTCCACGAAGCTGGATTCGCTAGTAATCGCGCATCAG CCACGGCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGCCATGAA AGCCGGGGGTACCTGAAGTGCGTAACCGCAAGGAGCGCCCTAGGGTAAAACTGGTG

-7 CZ 2021 - 199 A3

ATTGGGGCTAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCGGCTGGAACACCTC CTTTCT (SEQ ID NO. 12)

Příklad 2: Příprava probiotické směsi

Jednotlivé čisté kultury výše uvedených izolátů se skladují vBHI médiu s 10% glycerolem při -70 °C. Při pomnožení se jednotlivé kultury vysejí na WCHA agar a kultivují se 36 hodin při 37 °C v anaerobní atmosféře. Poté se jednotlivé kultury samostatně resuspendují v 5 ml BHI média s 10% glycerolem do ODeoonm = 1, což odpovídá 1 x 10⁹ CFU/ml. Následně se pětimililitrové objemy smíchají a rozplní do jednomililitrových master inokulí. V případě přípravy probiotické směsi se 1 ml master inokula použije k zaočkování tří litrů kultivační půdy a inkubuje se anaerobně v médiu bez živočišných proteinů (Pepton ze sójových bobů (enzymatický digestát), kyselý hydrolyzát sójového proteinu, kvasnicový extrakt) při 37 °C po dobu 24 hodin. Výsledná koncentrace směsného fermentátu dosahuje hodnot 1 x 10⁹ CFU/ml. Vzhledem k procentuálnímu zastoupení jednotlivých baktérií (tab. 1) se jejich počty pohybovaly v rozmezí od 3,2 x 10⁷ CFU/ml pro Bacteroides caecigallinarum až do 4,9 x 10⁸ CFU/ml pro Bacteroides caecicola.

Tabulka 1. Procentuální zastoupení baktérií probiotické směsi po společné fermentaci. Pro průmyslovou fermentaci je důležité, aby baktérie ve směsi měly podobnou růstovou rychlost. Kombinace 4 vybraných baktérií tuto podmínku splnila. Baktérie byly ve směsi zamrazeny jako master seed při -70 °C. Jednotlivá master inokula byla použita pro zaočkování živného média a po 24 hodinové fermentaci byly stanoveny poměry jednotlivých baktérií pomocí kvantitativní real time PCR. Vybrané baktérie rostou podobnou rychlostí a lze je s výhodou kultivovat současně.

	Bact. caecicola	Bact. caecigallinarum	Mediterranea sp.	Megasphaera sp.
Inokulum	61,72	18,35	14,40	5,53
24 hod kultivace poprvé	49,13	3,24	14,91	32,72
24 hod kultivace podruhé	49,40	3,81	25,28	21,50

Příklad 3: Schopnost baktérií z probiotické směsi dlouhodobě kolonizovat slepé střevo drůbeže po jednorázové orální aplikaci

Kuřata masné nebo nosné linie se první den života orálně inokulovala v 0,1 ml probiotické směsi, která obsahovala minimálně 10⁷ CFU/ml každé ze čtyř baktérií a týden po osídlení se stanovilo zastoupení probiotických kultur ve slepém střevě kuřat sekvenováním V3 a V4 variabilní oblasti genu pro 16S rRNA (Vídenská et al., Succession and replacement of bacterial populations in the caecum of egg laying hens over their whole life. PLoS One 2014;9:ell5142). (Tab. 2). V opakovaném pokusu se kuřata nosné linie utratila ve věku 8, 12, 22 a 29 dní (Tab. 3) a bylo stanoveno složení bakteriální mikroflóry sekvenováním V3 a V4 variabilní oblasti genu pro 16S rRNA.

Tabulka 2. Procentuální zastoupení baktérií probiotické směsi po osídlení jednodenních kuřat masného nebo nosného typu. Aby vytipovaná probiotická směs chránila drůbež univerzálně, ověřili jsme kolonizační schopnosti u dvou odlišných linií, u masné linie Ross a nosné linie ISA Brown. Jednodenní kuřata masné a nosné linie byla orálně osídlena probiotickou směsí a jejich přítomnost ve slepém střevě byla stanovena o týden později. Probiotická směs úspěšně osídlovala obě geneticky krajně odlišné linie.

-8CZ 2021 - 199 A3

	Brojleři	Nosnice
Bacteroides caecicola	9,88	3,57
Bacteroides caecigallinarum	12,55	54,07
Mediterranea sp.	7,69	4,06
Megasphaera sp.	3,21	1,19

Tabulka 3. Procentuální zastoupení jednotlivých baktérií zprobiotické směsi ve slepém střevě kuřat. Probiotická směs byla podána kuřatům linie ISA Brown první den života a procentuální zastoupení jednotlivých baktérií z probiotické směsi na celkové mikroflóře slepého střeva bylo stanoveno sekvenováním části genu pro 16S rRNA 8., 12., 22. a 29. den života.

Kontrolní kuřata Osídlená kuřata

	Den 8	Den 12	Den 22	Den 29	Den 8	Den 12	Den 22	Den 29
Bacteroides caecicola	0,024	0,124	0,149	0,234	18,04	12,48	14,08	16,14
Bacteroides
caecigallinarum	0,016	0,11	0,191	0,568	2,95	18,44	32,76	28,15
Mediterranea sp.	0,009	0,027	0,037	0,047	4,13	2,53	2,83	3,07
Megasphaera sp.	0,004	0,029	0,051	0,045	1,13	1,97	0,74	1,25
Suma	0,053	0,290	0,428	0,894	26,25	35,42	50,41	48,61

Příklad 4: Průkaz nepatogenní povahy baktérií v probiotické směsi

Pět kuřat bylo první den života osídleno probiotickou směsí. Dalších pět neosídlených kuřat bylo použito jako negativní kontrola. Po sedmi dnech byla kuřata utracena a byly odebrány vzorky tkáně slepého střeva, ze kterých byla izolovaná RNA s využitím RNeasy Mini kitu podle instrukcí výrobce (Qiagen). Ta byla přepsána do cDNA s využitím oligo(dT) primerů. Získaná cDNA byla využita pro kvantifikaci exprese genu pro matrix metalloproteinase 7 (MMP7) a avidin (AVD) pomocí SybrGreen real time PCR, jejichž zvýšená exprese by indikovala nežádoucí zánětlivou odpověď kuřat na podávaná probiotika. Exprese těchto genů byla normalizována na průměrnou expresi genů GAPDH, UB a TBP (jak je popsáno např. v PV 2015-753 nebo v publikaci Varmuzova et al., Immune protection of chickens conferred by a vaccine consisting of attenuated strains of Salmonella Enteritidis, Typhimurium and Infantis. Vet Res 2016;47:94). Mezi kontrolní a osídlenou skupinou nebyl zaznamenán signifikantní rozdíl v expresi AVD nebo MMP7. Osídlení slepého střeva vysokými počty baktérií z probiotické směsi proto nevyvolává zánět ve střevě a nemá negativní vliv na funkci střevního traktu (tab. 4). Probiotická směs tedy prokazatelně nevyvolávala negativní zánětlivou reakci a sestává se ze skutečně nepatogenních, komensálních baktérií.

Tabulka 4. Exprese znaků zánětu (AVD - avidin a MMP7 - matrix metalloproteinase 7) ve slepém střevě kontrolních kuřat a kuřat osídlených probiotickou směsí. Tabulka ukazuje průměrnou expresi AVD a MMP7 ve slepém střevě pěti osmidenních kuřat z kontrolní a pěti osmidenních kuřat z experimentální skupiny po osídlení probiotickou směsí první den života. Osídlení slepého střeva probiotickou směsí nevyvolalo zánětlivou reakci.

Kontrola Probiotika

AVD	17,71 ±16,27	13,98 ±9,51
MMP7	0,034 ±0,034	0,013 ±0,008

Příklad 5: Schopnost probiotické směsi zvyšovat odolnost kuřat před experimentální infekcí Salmonella Enteritidis

-9CZ 2021 - 199 A3

Probiotická směs byla orálně podána jednodenním kuřatům linie ISA Brown. O týden později, tedy ve věku 8 dní, bylo patnáct kontrolních kuřat neosídlených probiotickou směsí a 15 kuřat osídlených probiotickou směsí orálně čelenžováno divokým kmenem Salmonella Enteritidis (10⁷ CFU v 0,1 ml). K dalším dvěma kontrolním, resp. osídleným, skupinám sestávajícím se z 15 kuřat bylo přidáno jedno řádně označené kuře, které bylo orálně infikováno Salmonella Enteritidis (infekce s využitím seeder bird). Kuřata byla utrácena 4, 14 a 21 dní po čelenži, přičemž ve skupinách se seeder bird zůstalo toto kuře ve skupině po celou dobu experimentu a bylo utraceno až 21. den po infekci. Počty salmonel byly stanoveny jak kultivačně po desítkovém ředění obsahu slepých střev a výsevu na XLD agar, tak i pomocí Salmonella-speciňcké kvantitativní real-time PCR. Osídlení kuřat probiotickou směsí snižovalo počty salmonel ve slepém střevě jak po orální čelenži, tak i ve skupině kuřat infikovaných kontaktem (seeder bird) (obr. 2).

Příklad 6: Snížení zastoupení E. co li v mikroflóře slepého střeva

Jednodenní kuřata linie ISA Brown byla první den života orálně inokulována 0,1 ml probiotické směsi, která obsahovala 10⁷ CFU každé ze čtyř baktérií. Kuřata byla utracena ve věku 8, 12, 22 a 29 dní a bylo stanoveno složení bakteriální mikroflóry ve slepém střevě sekvenováním V3 a V4 variabilní oblasti genu pro 16S rRNA (Vídenská et al., Succession and replacement of bacterial populations in the caecum of egg laying hens over their whole life. PUoS One 2014;9:ell5142). S využitím znalosti sekvence genů pro 16S rRNA jsme byli schopni stanovit zastoupení E. coli ve vyšetřených vzorcích. Zatímco u kontrolních kuřat ve věku 8 a 12 dní tvořila E. coli 35 a 65 % z celkové mikroflóry, u kuřat osídlených probiotickou směsí tvořila E. coli pouze 1 až 2 % z celkové mikroflóry (obr. 3). Aplikace probiotické směsi tedy snižovala procentuální zastoupení E. coli zejména v prvních dvou týdnech života. Stejně jako u E. coli, probiotická směs snižovala zastoupení Proteus vulgaris, Campylobacter jejuni, Clostridium perfringens nebo Clostridium difficile ve střevní mikroflóře ošetřených kuřat.

Příklad 7: Snížení úhynů v komerčních hejnech po orálním podání probiotické směsi kuřatům po naskladnění na farmu

Kuřatům masné linie ve věku jednoho dne byla bezprostředně po naskladnění podána probiotická směs pitnou vodou anebo jako příměs do krmivá. Jedno hejno se sestávalo z 18 000 kuřat a kuřata v kontrolních hejnech byla v prvních třech dnech života ošetřena antibiotiky, anebo zůstala bez jakéhokoliv ošetření. Administrace probiotické směsi po naskladnění kuřat vedla ke snížení úhynů ve srovnání se zcela neošetřenými hejny, ale nevedla k dosažení úrovně úhynů jako v hejnech ošetřených antibiotiky (obr. 4).

Příklad 8: Snížení úhynů v komerčních hejnech po sprejové aplikaci probiotické směsi kuřatům v dolíhni před naskladněním na farmu

Kuřata masné linie byla v dolíhni, tedy ve věku nižším než 24 hodin života, ošetřena sprej ováním probiotickou směsí. Kontrolní kuřata nebyla v dolíhni ošetřena a po naskladnění na farmu jim byla v prvních třech dnech života podána antibiotika pitnou vodou. Jedno hejno se sestávalo z 42 000 kuřat. Administrace probiotické směsi sprejováním v dolíhni vedla ke snížení úhynů na úroveň srovnatelnou s úhyny v hejnu ošetřeném antibiotiky (obr. 5). Podání sprejováním v dolíhni vede k časnějšímu a homogennějšímu osídlení všech kuřat v hejnu a je preferovaným způsobem podání probiotické směsi.

Závěry

Probiotická směs účinně osídluje slepé střevo kuřat od prvního dne života a po jednorázové administraci přetrvává ve slepém střevě minimálně do 29. dne života, což je téměř délka života u masných typů drůbeže ve výkrmu (porážka se obvykle provádí mezi 32. až 35. dnem života). Probiotická směs nemá žádné negativní účinky, po jejím podání nebyly zaznamenány žádné úhyny a nedošlo ani ke stimulaci zánětu ve slepém střevě. Probiotická směs naopak chrání kuřata před

-10 CZ 2021 - 199 A3 infekcí baktérií Salmonella Enterítídís a snižuje počty E. coli, Proteus vulgaris, Campylobacter jejuni, Clostridium perfringens nebo Clostridium difficile ve střevní mikroflóře. Proto se dá s výhodou použít jako probiotický preparát u kuřat.

-11 CZ 2021 - 199 A3

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (10)

1. Probiotický přípravek pro drůbež, vyznačující se tím, že obsahuje jako účinnou složku směs bakterií Bacteroides caecicola, Bacteroides caecigallinarum, Megasphaera sp. zMediterranea sp.

2. Probiotický přípravek pro drůbež podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje jako účinnou složku směs bakterií Bacteroides caecicola CCM 9131, Bacteroides caecigallinarum CCM 9132, Megasphaera sp. CCM 9129 aMediterranea sp. CCM 9130.

3. Probiotický přípravek podle nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím, že dále obsahuje kapalný nosič na bázi vody, s výhodou vybraný ze skupiny voda, fyziologický roztok nebo růstové médium pro baktérie sestávající se z peptonu ze sójových bobů, kyselého hydrolyzátu sójových proteinů a kvasnicového extraktu a produktů fermentace baktérií probiotické směsi.

4. Probiotický přípravek podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že obsahuje 10⁷ až 10⁹ CFU každé baktérie v jednom mililitru přípravku.

5. Krmivo pro drůbež, vyznačující se tím, že obsahuje probiotický přípravek podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4.

6. Probiotický přípravek podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 či krmivo podle nároku 5, pro použití pro léčebné či preventivní zlepšení fýziologických vlastností střevního traktu drůbeže.

7. Probiotický přípravek podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 či krmivo podle nároku 5, pro použití pro prevenci infekcí trávicího traktu drůbeže patogeny vybranými ze skupiny E. coli, Salmonella, Proteus vulgaris, Campylobacter jejuni, Clostridium perfringens a Clostridium difficile.

8. Probiotický přípravek pro použití podle nároku 6 nebo 7 s tím, že je pro podání sprej ováním.

9. Probiotický přípravek pro použití podle kteréhokoliv z nároků 6 až 8 s tím, že je pro podání kuřatům ve věku 1 až 3 dnů, s výhodou kuřatům ve věku 1 dne.

10. Použití probiotického přípravku podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 či krmivá podle nároku 5, pro neléčebné zlepšení fyziologických vlastností střevního traktu drůbeže.