CZ36679U1 - Probiotická směs pro novorozená selata - Google Patents

Description

Probiotická směs pro novorozená selata

Oblast techniky

Předkládané technické řešení poskytuje probiotický přípravek pro zlepšení fyziologických a imunitních vlastností trávicího traktu prasete domácího Sus scrofa prostřednictvím osídlení směsí prospěšných baktérií.

Dosavadní stav techniky

Selata v produkčních chovech ihned po narození přichází do styku s mikroflórou prasnice a stájového prostředí. Součástí této mikroflóry jsou jak komenzální, tak patogenní baktérie. Časná interakce mezi komenzálními a patogenními baktériemi může anebo nemusí vést k úhynům v prvních dnech života. Skladba střevní mikroflóry sajících selat je do značné míry předurčena jejich mléčnou výživou. Baktérií vhodných pro trávení mléčné diety je však v trusu prasnic a stájovém prostředí málo, a proto osídlení trávicího traktu selat vhodnou mikroflórou trvá i několik dní. Po tuto dobu nejsou selata přirozeným způsobem chráněna a v trávícím traktu může dojít k pomnožení nežádoucích baktérií jako například Clostridioides difficile a Clostridium perfringens. Nežádoucí je i vysoký podíl Escherichia coli, z nichž některé kmeny mohou enteropatogenní. Výsledkem pak jsou průjmovitá onemocnění spojená se zvýšenými úhyny.

K předcházení klinických příznaků průjmových onemocnění novorozených selat se často používá preventivní aplikace antibiotik ihned po narození. To je v rozporu se současným trendem snižování spotřeby antibiotik. Proto se hledají jiné cesty, jak zabezpečit správný rozvoj střevní mikroflóry selat, který přirozeným způsobem potlačí multiplikaci nežádoucí flóry.

Podstata technického řešení

Cílem bylo vybrat, připravit a otestovat účinnost probiotické směsi snižující úhyny novorozených selat a potlačující výskyt patogenních klostridií aE. coli ve střevním obsahu sajících selat. V rámci předkládaného technického řešení bylo studováno více než 100 různých baktérií, které původci technického řešení postupně izolovali z trávicího traktu prasat a stanovili u nich kompletní sekvenci genomu. Z nich původci technického řešení vybrali zástupce rodu Bacteroides, a to takové druhy, které jsou charakteristické pro střevní mikroflóru sajících selat a současně jsou velmi nízce zastoupeni ve střevní mikroflóře dospělých prasat včetně prasnic.

Při studiu rozvoje střevní mikroflóry sajících selat původci zjistili, že první 3 až 4 dny života se ve střevní mikroflóře selat i bez zjevných klinických příznaků běžně vyskytují patogenní klostridie. Ke snížení jejich výskytu docházelo okolo 4. dne života, právě v době, kdy docházelo ke zvýšení přítomnosti zástupců rodu Bacteroides. Negativní korelace mezi přítomností patogenních klostridií a. Bacteroides původce proto vedla k myšlence využít zástupce rodu Bacteroides jako probiotika pro osídlení novorozených selat. Navíc prasnice ve své střevní mikroflóře mají nízké zastoupení baktérií z rodu Bacteroides (nahrazují je zástupci příbuzného rodu P re vote Ha) a proto se nemusí chovat jako optimální zdroj těchto baktérií pro sající selata. Podání směsi bakteriálních kultur několika zástupců rodu Bacteroides novorozeným selatům tak povede k rychlejšímu vývoji žádoucí střevní mikroflóry sajících selat, která by zabránila pomnožení patogenních mikroorganizmů.

Předkládané technické řešení proto předkládá probiotický přípravek, který vyhovuje výše uvedeným požadavkům. Obsahuje více než jednu baktérii, které jsou charakteristické pro sající selata, ale přesto si zachovává jednoduché, technicky realizovatelné, složení. Přitom zajistí efektivní osídlení trávicího traktu selat od prvních dnů života, sníží přítomnost nežádoucích

- 1 CZ 36679 UI bakterií v trávicím traktu, sníží úhyny a sníží potřebu terapeutického použití antibiotik pro korekci zdravotního stavu selat.

Předmětem předkládaného technického řešení je tedy probiotická směs vhodná pro podání novorozeným selatům, která obsahuje jako účinnou složku čtyři různé baktérie, a to Bacteroides fragilis, Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides vulgatus a Bacteroides xylanisolvens.

Ve výhodném provedení je předmětem předkládaného technického řešení probiotická směs vhodná pro podání novorozeným selatům, která obsahuje jako účinnou složku čtyři různé baktérie, a to Bacteroides fragilis CAPM 7018, Bacteroides thetaiotaomicron CAPM 7019, Bacteroides vulgatus CAPM 7020 a Bacteroides xylanisolvens CAPM 7021. Všechny uvedené kmeny byly uloženy ve Sbírce zoopatogenních mikroorganismů (Collection of Zoopathogenic Microorganisms, CAMP), Hudcova 70, 621 00 Brno.

Probiotická směs podle technického řešení má oproti všem podobným, doposud připraveným produktům, tyto technické výhody:

- Vybrané druhy odpovídají druhům, které se nejčastěji vyskytují ve střevní mikroflóře sajících selat.

- Všechny izoláty byly původně izolovány od selat a u všech kmenů byla stanovena úplná sekvence jejich chromozómu.

- Znalost úplné genomové sekvence umožnila zařadit do probiotického preparátu jen kmeny, které nepřenáší žádné známé geny pro rezistence k antibiotikům, které se vyskytují u baktérií rodu Bacteroides (zejména geny tetQ a UnA). Kmeny v probiotickém preparátu tedy nejsou přenašeči žádných známých, horizontálně přenositelných, rezistencí k antibiotikům.

- Znalost celogenomové sekvence umožnila připravit pro každý kmen přísně specifické PCR pro jejich detekci a kvantifikaci v trusu selat nebo libovolném dalším biologickém vzorku.

- Jedná se komplexní směs 4 jasně definovaných baktérií.

- Všechny baktérie patří za předpokladu dodržení anaerobní kultivace mezi in vitro poměrně snadno kultivovatelné.

- Všechny baktérie lze kultivovat v médiu bez přídavku jakýchkoli produktů živočišného původu.

- Jejich striktně anaerobní povaha je činí relativně bezpečnými, protože po 24hodinové inkubaci na vzduchu se jejich životaschopnost blíží k nule.

- Baktérie ze směsi účinně osídlují trávicí trakt selat po jednorázové aplikaci.

- U ošetřených selat se v menší míře vyskytují patogenní nebo oportunně patogenní baktérie původem z prostředí, jako je Escherichia coli nebo Clostridium perfringens.

- U ošetřených selat je nižší potřeba terapeutického užití antibiotik za účelem korekce zdravotního stavu.

Probiotickou směs podle technického řešení lze podávat selatům kdykoli v průběhu života. Nejvýhodnější je však její podání selatům bezprostředně po narození. Směs je proto určena zejména k aplikaci jednodenním selatům nebo selatům ve věku 1 až 5 dnů, výhodněji 1 až 3 dnů. Směs lze podávat orálně v pitné vodě. Probiotická směs byla otestována jako zcela bezpečná pro novorozená selata. Při testování bylo zjištěno, že po orálním podání novorozeným selatům tvoří

-2CZ 36679 UI baktérie z probiotické směsi přibližně 20 % z celkové střevní mikroflóry čtyřdenních selat. Baktérie z probiotické směsi ze střevní mikroflóry vytlačily baktérie, které mohou způsobovat záněty a nežádoucí fyziologické stavy, jako je E. coli Clostridium perfringens nebo Clostridium difficile. Probiotická směs podle technického řešení při testování nevykazovala žádné negativní vlastnosti, a naopak chránila selata před úhyny a snižovala potřebu terapeutického užití antibiotik. Předkládaná probiotická směs je proto velmi vhodná pro použití jako probiotický preparát pro selata, který účinně zlepšuje zdravotní stav a fýziologické vlastnosti selat bez nežádoucích vedlejších účinků a omezuje tak potřebu použití antibiotik.

Přípravek je s výhodou formulován pro orální podání, a obsahuje tedy kapalný nosič na bázi vody. Kapalným nosičem může být voda, fýziologický roztok nebo růstové médium pro baktérie. Růstové médium pro pomnožení a fermentaci neobsahuje žádné ingredience živočišného původů a sestává se pouze z peptonu ze sójových bobů (enzymatický digestát), kyselého hydrolyzátu sójových proteinů a kvasnicového extraktu.

Probiotický přípravek s výhodou obsahuje alespoň 10⁷ CFU, výhodněji 10⁷ až 10⁹ CFU, na mililitr tekutého produktu každé z obsažených baktérií. Předmětem předkládaného technického řešení je tedy probiotický přípravek obsahující baktérie pro použití jako probiotický preparát pro léčebné či preventivní zlepšení imunity a/nebo fyziologických vlastností střevního traktu prasat Sus scrofa. Zlepšení imunity a/nebo fýziologických vlastností s výhodou zahrnuje prevenci infekcí trávicího traktu drůbeže patogeny, zejména patogeny E. coli anebo Clostridium perfringens anebo Clostridium difficile.

Přípravek je možno podávat jednorázově v jedné jednotkové dávce nebo opakovaně v několika jednotkových dávkách rozložených v čase. S výhodou se však poprvé podává během prvního dne života selat s výhodou mezi 8 až 12 hodinami po porodu.

Objasnění výkresů

Obrázek 1. Druhové složení 11 nezávislých šarží probiotického preparátu.

Obrázek 2. Účinnost kolonizace trávicího traktu sajících selat baktériemi z probiotického preparátu. Selata ošetřená dávkou probiotických baktérií první den života měla 5 dní po aplikaci zvýšené množství probiotických baktérií v trusu.

Obrázek 3. Výskyt Clostridium perfringens a Clostridium difficile u sajících selat přes všech šest nezávislých opakování. Aplikace probiotického preparátu snižovala výskyt patogenních klostridií ve srovnání s kontrolními neošetřenými selaty.

Obrázek 4. Výskyt Escherichia coli ve střevní mikroflóře sajících selat. Nejvyšší zastoupení E. coli bylo zaznamenáno u kontrolních selat. Podání probiotického preparátu vedlo ke snížení zastoupení E. coli ve střevní mikroflóře sajících selat.

Obrázek 5. Terapeutické užití antibiotik u probiotických a kontrolních selat. Zdravotní stav kontrolních selat vyžadoval u 58 % z nich použití antibiotik. Podání probiotické směsi snížilo nutnost použití antibiotik ve všech sledovaných tumusech. V průměru se i u probiotiky-ošetřených selat použila antibiotika ve 29 % případů. To však představuje snížení spotřeby antibiotik na polovinu.

CZ 36679 UI

Příklady uskutečnění technického řešení

Příklad 1: Identifikace a izolace vhodných bakteriálních druhů specifických pro mikroflóru selat

Na základě předběžných poznatků a úvah byly baktérie adaptované na novorozená selata vybírány ze zástupců rodu Bacteroides. Na druhy z tohoto rodu se zaměřila následná kultivace, která byla prováděna z trusu selat naředěného ve sterilním ředicím roztoku (0,1 g síran hořečnatý heptahydrát, 0,2 g monobazický fosforečnan draselný, 0,2 g chlorid draselný, 1,15 g dibazický fosforečnan sodný, 3,0 g chlorid sodný, 1,0 g thioglykolát sodný, 0,5 g L-cystein, 1000 ml destilovaná voda, pH 7,5 při 25 °C). Jednotlivá ředění byla vyseta na Wilkins-Chalgren (WCHA) agar a inkubace probíhala v anaerobní atmosféře sestávající se z 10% CO2, 5% H2 a 85% N2 po dobu 72 hodin při 37 °C. Z narostlých kolonií byl alikvot resuspendován v 1,0 ml BHI bujónu s 10% glycerolem a zamražen při -70 °C pro další použití. Z jiného alikvotu byla izolována DNA, která byla využita pro stanovení kompletní sekvence bakteriální DNA a následnou druhovou identifikaci. Se znalostí celogenomové sekvence byly identifikovány geny specifické pro každou z uvedených baktérií a na ně byly zacíleny Sybr Green real time PCR pro detekci a kvantifikaci cílových baktérií v libovolném typu vzorků, zejména však v trusu ošetřených selat s využitím následujících specifických primerů:

Cílový druh	Forward primer	Reverse primer
Bacteroides vulgatus CAPM7020	atagttggtgcaagcggagg (SEQ ID NO. 1)	tcctgagcattccaagtcgg (SEQ ID NO. 2)
Bacteroides fragilis CAPM7018	caacgacacaacagcttccg (SEQ ID NO. 3)	tcgagtccattcgtcccaac (SEQ ID NO. 4)
Bacteroides thetaiotaomicron CAPM7019	gttgctcccatgttgacgag (SEQ ID NO. 5)	gccataagccgagcaatgag (SEQ ID NO. 6)
Bacteroides xylanisolvens CAPM7021	ctaccgttatcgcaacctcg (SEQ ID NO. 7)	gacagctcccacatccatacg (SEQ ID NO. 8)
Eubakteriální 16S rRNA	tcctacgggaggcagcag (SEQ ID NO. 9)	cgtattaccgcggctgct (SEQ ID NO. 10)

Cílové sekvence pro primery jsou následující (místa, kde primery přiléhají, jsou vyznačena tučnými velkými písmeny):

Bacteroides vulgatus CAPM 7020

FIG00407595: hypotetický protein atgaaacgaaaaacacttaaaagaaaaatttctattgttggcattttagtttttgtcagtatgatagtttattcatgttggcaagatgaatggtcctcc aatgtaactgatgaagttatttttgacagcaataaagaattgaccattgctaaagcagaacaatggtataatgccaccaatccctcagctactac agttagatccttaagtgctgacgggcgaattccagcaaagcctaattggaacaaggctaaagaaagtagaaaaggagatttagaggtagttg aaacgactctaatgacaagcggtagtacattttttatggataacgaaacaaaagaaaaatatgaactacaagatgatttggataaaatatataat gtagtacgcatggtaatattgaagaatctagaaacaggtgagatttacaacttcatcatggtattcataggtacttatgattatttgatgcatacca cctcttttgaaaacaattcttatttacatcgtgaagctgattttgatggaaaagttttattctacaatttcaattatggattggtaaatggttggaaatat gaatcagggaaaataacagcctccatttctccgggaacagaggaaggataccgtatgagtttgcaaagaggaagaggacaatccgtatgta atacggaaatagactggatggaaaagcggaattgtcataatgatatcgtttgggatcatgaactggggctgcccggcatcgatgtaatttgcg acaagtatttacatcctgagtatcatgaagtttgcgtttcattggatgatgacgaaatggatggcggaggtggtggatataatcctccttcaaatc ctcctgaaacacctcctactccttgtaaacgtgctaaaacattgtcgcaggacgcagcatttaaatcgcgtataaaagatgtgtatagaaaaac attttctgcaggcaatactgtggagcaaggctttatacagacttcagacgggcaaactattttcccgaacgtacaagaatcaggaagtgccaa attcacaaatgatcaaatagcaggaaaagaaatcatggaatggtaccattcccaccctacaggctctatgattacttcatgggcagatttaaag gctttagctatacgataccaacagggatatgtgagatcagagaattttacttatggaattgtttcaacgtttggatgtctgagtatcatgataacttc tccggtagatttcaatgcttttgctactaaagttagaaatggtgaactttccgaaagttggaacgcttatATAGTTGGTGCAAGC

-4CZ 36679 UI

GGAGGgggagttgatgaatgtataggtcagttgcttaaatttttagatcgcaataactccggtctgtcagtgatgtttagttcgaatattgatg aaagcaatCCGACTTGGAATGCTCAGGAactagcttctaatgggaaatctgtaaatatggaatgtaaccaataa (SEQ ID NO. 11)

Bacteroides fragilis CAPM 7018

Fe(III) ABC transportér, periplasmatický železo-vážící protein (Iron(III) ABC transporter periplasmic iron-binding protein)

Atgatgaaccgatcttcttttattctttttgtactaatatcatttctgctcactgcttgcaaagaaaagcagaaagcaacactcactgtcgaagaag gtgttccggcccctctttcatatgcagaaggattcggaataacacattctcctgaatacactacagtaacagtatataatccctggaaa ccgggagagacctatgatatctattatcttgtgaaaaccgaagatcagcctgtccctgccaacggtcacaaaatagtgatcccactaaaaagt attatgaccaactcagctactcatttggggtttcttgaacttctgggggaattgcataaagtgacaggggtgtgcaactcggcctatatttacaat cctaccattctgcaaggtgtcaaagagggtaaaataaaagatttgggcgatgctttcaatctggacatagaaaacttacttttattacacccaca ggccgtaatgacttctgcctacaataccgaagacgaaaacagccgacgtatgaaacaaacgggattgcctatcctatataatattgaatggca agaaaaatctattctgggacgtgcagaatggattaaatttgtcggagcccttttcgacaaagaagcattggctgacagcattttcgggcaaata gcaaaacaatacaatgaagtaaaaaagagtgccgagaaattttcatatgcgccttctatactttccgggcaagattacaggggaacctggtct atgccgggaggaagaagctatagtgcacaactcttccgcgatgcaggtgccaattactattatgcCAACGACACAACAGCT TCC Ggtagtatatccagcaatattgaagaagctctgatacatttcaaccaagctgacatatgggtaggcgtacaagccaatactttggaag aGTTGGGAC GAAT GGACTC GAaatacaaactattcaaatcatataaagacggcaatgtataccatataaacaagcggg caaatgctactggtggaaatgactattgggaaagtggagtagctcgtccggatctattattgagtgatatgatcaagatcgttcatccgacacta ttgcctgactacgagttaacttacatggataaattaagaagtgaatga (SEQ ID NO. 12)

Bacteroides thetaiotaomicron CAPM 7019 pravděpodobná sulfatáza atsG (probable sulfatase atsG) atgaataattcaaatctaattaaaataGTTGCTC C CAT GTTGAC GAGtattttatcgtgcagcaaaccgagtgaagagata gtcatcaatcatcccaaggaggtgagaagtactccaaatatattgtttgtcattgctgacgatcaatctttcc CTC ATT GCTCGGC TTATGGCaattcttttgttaagactccggcatttgattatatagctagccagggatgcttgtttcagaatgcttatgtgacatctccgggtag tagtccttccagagcatctattttatcaggaatgtatccttggcaaataaaggaggcaggaactcattgttcatattttccaaaagatatagtttgct atacagatattctgactgctaatggttataacgtaggttatactggtaaggggtgggcaccaggcgattgtaaggaaagaggggtaaatcccg caggaaaagcttttaataagaaaaaactgacccctccctatagtggcatatccaatatagactatgttgaaaactttaaattgttttatcaagatag cgataaaaaacaaccattctgtttttgggtaggctttaatgaaccacatagaggttttgaacgtgattcatggcagaaagagaataaatcactct caatcgttagtgtaccgggtttcttgcctaatcatgatgttgttaaaggtgatttattggactattcggtagaaatagaatatcaggatgcacaatta caaaagataattgattttctgaaggaaaaaggtttgtttgataatacattgattatagtgactgctgataacggtatggcttttccaaatgcaaaag ctacctgttacgatgccggggtacatgttccattagccatctgttggggagacaagataaaaagaaagaatactagcgaaattgttagttctgta gattttgctccaacgatgttggacgcagcaggtataaatcgttcttcctatgggcacatgtcaggcaaaagtatgttgcctttcttaatggaaaac aaagaacagaaaagagaagctgtctattttggaagagaaagacatagctcttcacggtatgcaaacttaggttatccaataagaagccttaga aaaggaaattatttgtatataaggaactttcatccggaaagatggccagcaggtgatccgacacctttggataaaaacaacaatttggcaaag gcccattctggttatttcgatatagacggttcacctactaagcagttttttattaataacagggagaatggcgatggtgtacaatatttcatccgtac tgtcggtttcagaccttatgaggagttatataacattgagaatgatccctgttgtcttgataattgtattgaaaaaccagaatataagggtgtattgt cagagttaagaggcagattggatcagttactatatcagacgaatgatgtaagagtaacttccgaaaagggggacagtatttgggaatcatatc cacgaatagatagtataaggaattttcctccctatgagtag (SEQ ID NO. 13)

Bacteroides xylanisolvens CAPM 7021

C-terminální část dvoukomponentního systémového senzoru hybridního regulátoru odpovědi / histidin kinázy (C-terminal part of two-component system sensor histidine kinase/response regulator hy brid)

Atgaccaaagctaaatttcttgttgtttattgcctgttcatatcgggactttgttgcatggcaaatgtgacgaaggatatcaatatgcgctttaagg acgtaaggcagggactttctcatcaaacagtcaattgtttctatcaggatgaattcggatttttgtggatcggcactcaagacgggctgaaccg atttgacggacgtaagtttgaagtattcaaaccggataacgctaatccttattccatcaatatcaataatatcaggcaggtttgcggaaataaagc cggattgctctttatccgtagtttgcagagcgtgactctttatgatatgcgtttgaatcgttttagggtgttgcgtgaaggagaagttgcgggaatc tgttatgcgcacgatgcattatggatagctaccggaaaggaaatCTAC C GTTAT C GC AAC CTC Gaccaggcgcccgag

-5CZ 36679 UI ttattcttttcatttccttcggatgaggaggatgtattgatgaacagtctcatggttcgtcagaatcagacagtggtggtgggtacttcttcgaaag gtgtatactgcatcgaccagtctgcacatatcacccggCGTAT GGAT GT GGGAGCT

GTCaattcaataacagaagatagaaacgggagtatctggatagctaccagaaacagagggctcatacggttggatgaagatggaacact tactcatttcaagcataataaggtagctgaaaatacgattaaccataataatgtgcgtcatgtgacgcaagctaatgatagtctcctgtatatcgg aacctatgccggtttgcagactttaaacctgtttaccggagagtttacagattatgaatatgacttgaatgtggaggcggccgatatacgttccat tatttcgatgcattatgacacttcggggactttatggttggggactttctatcagggaatccaatattataatgtagcgaatgatgctttccattttta ccgctcgtctacggctgttggcggtcatttgaattcttatattatcagttccattgccgaagaccgttccggccggatctggtttgcaagtgaagg aagcgggttgaactattatgataaacataccaaacgctttttccctttaaaaaaggtctattctcaagagctttcttttaagatagtgaagtctcttta ttatgagaaagagccggattatctttgggtagcttctctttatcagggaatcaaccggattaatctgtcgaccggacatatagaatctatctcgga aaacatctatactccggaaggaaaaacagttgttgacagagcctataatctggtgaaaatgatagagtttgccggccacgattctttattgatag ctgccaagggaggattgcttgtattggataaaaaacaccttcgacttcatcatttcgaacacccttcgttggctgccaaacatctgtcgcaggttt gggatatgacgtttgacaaagacggggatttatggctgactacctcttttgatctgatacgagtcaacctcaaagcgggcactgcccatagtta tcctttttccaaaatagcgcagagcacagcgcagcatcacatcaaccacattttatgtgataagaaaggacgtatatggctgggatcgacagg ctcgggaatttatctatttgataagaagacagattcttttgtgggatacggagcgaaacagggattggaaaatggatttataaccggattggtgg agagtcctttggatggttctatctatgtggcaaccaatggtggtttctctaaattcaacctggcaacgactacattcgagaactataacagacag agtgattttcccttgaataatgtaaatgacggagggctgtatattgcgtccgaccacgatatttacgtgtgtggtctggcgggtattgtctctatcg cccaggaaaagctgaacaagcagtctgttgactatgatgtgtttgtaaaacgggtgcttgtggataatacggaaatacaaccgcttgattcgtt ggggcttatcaaagaaaccgtattgtatgaacatcggttagtattgccgcccagatattcttccgtcacttttgagatagcaagtaacaccctga ataatatttctaatatcggtctggaatataaacttgaaggctttgacaacgaatatatgaaggcgggcgataatacaatgattacctataccaatc ttcatccggggcattatactttccatgtccgtggcgaccaggtgggcgttcacggtcgggaagcaccttccgttagttttgagctgatagtgga ggctccggtttatcagcgggcatggtttattttgctgatggtgctgacagctatccttattgccggctatattatccgtatgttctggatacgaaaa actttgcggcactctttattggccgagaaacgggaaaaagagtatatcgaaagtgtgaaccagtccaaactgcgtttctttaccaatgtatcgc atgaattccgtactccgttaacacttatatccagccagctcgaaatgctcctgatgcataaggacattattcctgaagtatataataagattctgga tatttataaaaattcccgccggatgaataacctcgtggatgaagtcattgatatacgcaagcaggatcagggatacttgaaactaaagattttta aagagaatattgtggcggtgatagaggaaatttgtggttctttctatagttatgcccaactgaataagatagatctccgcttttcttccactctgaa agaagctgatttgtatattgacaaaacacagatagagaaagtattctataatttattgtccaacgcttttaagtatacgaagcctggtgactggatt tctgttgagctgtcagcggaaggagataatgacattgtgatttcagtcaacaacctgggggtaggcattgataaatccaagatcaaacatgtat ttgaacggttttggcaggatgattcggcaacaaccacacgaactgtcaaaggatcgggcattggattggcgatggcgaaaggaattgtaga gttgcatcagggaaccatcggagtggaaagcgaaccgaatggagttacctcttttaccgttactctccaccgggatgcgaatatgaatatgga agtctcttcctccgcagacgagcacgttgccgaacattatataatagagcctcaagaaatctcggaaatggtgaagccggataaaacggtga aaatactgattgtagaagataacccggaaatgcgtaaagtattgacgcagatttttgaacagatatatgaggtatatacggctgccgacgggc aggaaggattggaacgggcttcttcgctccaaccgcagatgattgtaagtgacgtcatgatgcctgtcatgtccggactggaaatgtgcgag aagttgaaaagtaatttgcagaccagccatatacctgttgtcttgctgacagcccgcaaccgggaagaacatactttggaaggcttgcagaca ggtgcggatgattatatctccaaaccttttaatatcaagatattggtagcccggtgcaacaatatcattcagactcgtaaactacttcaacaacgg tttgttcgaaacgacgaacctaaagtggaagaccttccgtttaatccgatcgataaaaagatgttgatggatgctacggcgattgtggaatctta tattgataacccagactttgacgtagctacttttgcacgagaaatgtgtatgagcagaacgttgcttttcactaaattgaaagcattgaccggaca gaccccgaatgactttattttatctttgagactgaaaaaagcaacagaaaaattgcggaatgaccccaatgccctgattgctgatatagcatttg attacggtttttctaatccaagttattttatccggtgttttaaaaatgcttatgatattactccggctgcttatagacggaaatatacaagctcttaa (SEQ ID NO. 14)

Pro normalizaci na celkový počet baktérií ve vzorku byla použita PCR s primery amplifikujícími část genu pro 16S rRNA všech baktérií. Po PCR se odečetla Ct hodnota amplifikace jednotlivých druhů Bacteroides od Ct hodnoty amplifikace bakteriální 16S rRNA (ACt). Následně se na tento rozdíl umocnil základ 2 (2^Mt), vypočetla se převrácená hodnota (l/2^ACt) a výsledek se pro přepočet na procentuální zastoupení vynásobil číslem 100 (100 x l/2^ACt). Na závěr se tato hodnota vynásobila koeficientem 7, který představoval přibližnou korekci mezi průměrným počtem kopií genů pro 16S rRNA v bakteriálních genomech (který jsme používali pro normalizaci) a skutečností, že cílové geny se vyskytovaly vgenomu Bacteroides pouze v jedné kopii. Tím se získalo zastoupení jednotlivých druhů rodu Bacteroides v celé bakteriální populaci v procentech.

Příklad 2. Příprava probiotické směsi

Všechny kmeny byly kultivovány 24 hodin na WCHA agaru (Wilkins Chalgren Agar, Oxoid) při 37 °C v anaerobním kabinetu v atmosféře N2, CO2 a H2. Po kultivaci byly jednotlivé bakteriální kultury smyty z povrchu agaru WCHB bujónem s 10% glycerolem. Kultury jednotlivých druhů

-6CZ 36679 UI

Bacteroides byly rozplněny v objemu 1 ml do 2ml kryozkumavek a zamraženy při -80 °C jako master inokula pro další použití. Složení master inokula bylo postupně zkontrolováno negativním růstem v aerobním prostředí a sadou PCR specifickou pro všechny 4 druhy Bacteroides. Tím byla zajištěna absolutní kontrola nad složením master inokula všech probiotických kmenů.

V případě přípravy probiotické směsi se 1 ml master inokula každého druhu Bacteroides použil k zaočkování 750 ml kultivační půdy a inkuboval anaerobně v médiu bez živočišných proteinů (Pepton ze sójových bobů (enzymatický digestát), kyselý hydrolyzát sójového proteinu, kvasnicový extrakt) při 37 °C po dobu 48 hodin. Výsledná koncentrace baktérií ve fermentátu dosahovala hodnot 1 x 10⁸ CFU/ml. Po fermentaci se spojily objemy všech 4 druhů a společně se poletovaly centrifugací při 8000 x g po dobu 20 min. Získaný pelet se v anaerobním boxu resuspendoval ve 100 ml veganBHI média s 10 % glycerolu. Z malého alikvotu (100 μΐ) se izolovala DNA za účelem stanovení poměrového složení jednotlivých druhů v probiotickém preparátu pomocí real time PCR (Obr. 1). Zbytek suspenze byl rozdělen do jednomililitrových alikvotů, které obsahovaly dostatečné množství probiotických baktérií pro ošetření 30 selat, tedy přibližně dvou vrhů, a byl uschován při -70 °C až do použití. Vzhledem k mírně odlišným růstovým schopnostem jednotlivých kmenů po spojení všech 4 samostatných kultur B. thetaiotaomicron tvořil okolo 21 %, B. fragilis 67 %, B. vulgatus 1 % aB. xylanisolvens 11 %.

Příklad 3: Schopnost baktérií z probiotické směsi osídlovat trávicí trakt selat po jednorázové orální aplikaci

Probiotická směs se skladuje a transportuje v zamraženém stavu při -70 °C. Před aplikací se směs rozmrazí a doplní 29 ml fýziologického roztoku. Novorozeným selatům se sterilní injekční stříkačkou aplikuje 1 ml probiotické směsi na kořen jazyka. O týden později byla v trusu pokusných a kontrolních selat stanovena přítomnost všech 4 kmenů rodu Bacteroides z probiotického preparátu a současně Clostridioides difficile, Clostridium perfringens a Escherichia coli pomocí real-time PCR.

Na farmě A bylo probiotickou směsí ošetřeno celkem 94 selat v šesti různých tumusech. Dalších 37 selat nebylo probiotiky ošetřeno. Selata, která byla ošetřena dávkou probiotických baktérií krátce po porodu, měla zvýšené množství probiotických baktérií v trusu (Obr. 2). Probiotické baktérie tedy po jednorázové aplikaci kolonizovaly trávicí trakt selat. Celkové množství (součet hodnot všech čtyř probiotických baktérií) bylo oproti neošetřené kontrole statisticky významně vyšší. Individuální rozdíly u sledovaných druhů Bacteroides však nebyly statisticky významné nebo byly na hranici významnosti. V prostředí stájí se běžně vyskytoval B. vulgatus, B. thetaiotaomicron a B. fragilis, kteří se nacházeli i u kontrolních selat. B. xylanisolvens kolonizoval všechna selata v nejmenším rozsahu a byl jen v malé míře detekován v trusu kontrolních selat (Obr. 2).

Příklad 4: Schopnost probiotické směsi snižovat výskyt patogenních klostridií v trávícím traktu selat ošetřených probiotickým preparátem

Množství patogenních baktérií Clostridioides difficile a Clostridium perfringens bylo stanoveno 5. den po porodu v rektálním výtěru selat pomocí real-time PCR. U kontrolních selat bylo zaznamenáno vyšší zastoupení patogenních klostridií než u selat po podání probiotického preparátu (Obr. 3). Díky značné variabilitě dosáhlo toto srovnání signifikance pouze v jednom z šesti nezávislých tumusů. Jako statisticky nevýznamné dopadlo zhodnocení testování přes všech šest opakování. V terénních podmínkách však ne vždy musí být kontrolní skupina infikovaná patogenními klostridiemi a v případě kdy se Clostridioides difficile nebo Clostridium perfringens shodou okolností nevyskytnou v prostředí, nemůže se ochranný efekt probiotického preparátu projevit. I numerické snížení výskytu patogenních klostridií u ošetřených selat tak považujeme za pozitivní výsledek.

-7 CZ 36679 UI

Příklad 5: Schopnost probiotické směsi snižovat výskyt E. coli v trávícím traktu selat ošetřených probiotickým preparátem

Podobně jako v případě klostridií byla zaznamenána i tendence ke snížení množství E. coli ve srovnání s kontrolní skupinou selat, přestože tento rozdíl nebyl statisticky významný za celé sledované období ani vjednotlivýchtumusech (Obr. 4).

Příklad 6: Schopnost probiotické směsi zlepšovat zdravotní stav a v důsledku snižovat spotřebu antibiotik

Na farmě B byl sledován celkový zdravotní stav nepřímo přes potřebu korigovat nežádoucí zdravotní stav terapeutickým užitím antibiotik. Spotřeba antibiotik byla sledována ve 4 tumusech u kontrolních selat a u selat po podání probiotické směsi. V probiotické skupině bylo potřeba upravit zdravotní stav dodatečnou antibiotickou terapií u 29 % selat. U kontrolních selat v závislosti na tumusu se potřeba antibiotické terapie pohybovala v průměru na 58 %. Podání probiotické směsi tedy zlepšilo zdravotní stav selat na farmě B do takové míry, že to vedlo ke snížení spotřeby antibiotik na polovinu (Obr. 5).

Závěry

Použitá probiotická směs pro novorozená selata podle předkládaného technického řešení je založena na vlastním pozorování negativní korelace mezi přítomností baktérií rodu Bacteroides u sajících selat a patogenních klostridií. Preparát se podává jednorázově, přirozenou orální cestou a vychází z poznatků o přirozeném osídlování trávicího traktu selat. V souladu stím nebyly zaznamenány žádné negativní reakce selat na podání preparátu, přestože byl podáván selatům v den porodu. Probiotický preparát nepředstavuje žádný lidmi uměle připravený produkt. Preparát urychluje a garantuje rozvoj střevní mikroflóry sajících selat správným a přirozeným směrem. Sající selata by dosáhla osídlení baktériemi rodu Bacteroides i bez podání probiotického preparátu, což se každodenně v produkci prasat děje. Tuto skutečnost jsme zaznamenali i během testování, kdy v 5 z 6 nedošlo k signifikantnímu snížení patogenních klostridií. Přesto nastávají situace, kdy se vývoj střevní mikroflóry selat opozdí a umožní rozvoj nežádoucí mikroflóry spojené s úhyny selat. V takovém případě podání probiotického preparátu na bázi baktérií rodu Bacteroides účinně chrání selata a snižuje ekonomické ztráty chovatelů. Preparát tak nabízí alternativu k podávání antibiotik. Protože se preparát sestává ze striktně anaerobních baktérií, je i bezpečný pro životní prostředí. Baktérie z preparátu ztrácejí životaschopnost během 24hodinové expozice aerobnímu prostředí, atak jejich nekontrolovatelné šíření v prostředí, včetně přenosu nanecílové druhy, je jen velmi málo pravděpodobné.

Claims (6)

1. NÁROKY NA OCHRANU

   1. Probiotický přípravek pro novorozená selata, vyznačující se tím, že obsahuje jako účinnou složku směs bakterií Bacteroides fragilis, Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides vulgatus a Bacteroides xylanisolvens.
2. 2. Probiotický přípravek pro selata podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje jako účinnou složku směs bakterií Bacteroides fragilis CAPM 7018, Bacteroides thetaiotaomicron CAPM 7019, Bacteroides vulgatus CAPM 7020 a Bacteroides xylanisolvens CAPM 7021.
3. 3. Probiotický přípravek podle nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím, že dále obsahuje kapalný nosič na bázi vody, s výhodou vybraný ze skupiny voda, fyziologický roztok nebo růstové médium pro baktérie sestávající z peptonu ze sójových bobů, kyselého hydrolyzátu sójových proteinů a kvasnicového extraktu a produktů fermentace baktérií probiotické směsi.
4. 4. Probiotický přípravek podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň 10⁷ CFU, s výhodou 10⁷ až 10⁹ CFU, každé baktérie v jednom mililitru přípravku.
5. 5. Probiotický přípravek podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 pro použití pro léčebné či preventivní zlepšení fyziologických vlastností střevního traktu sajících selat.
6. 6. Probiotický přípravek podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 pro použití pro prevenci infekcí trávicího traktu sajících selata patogeny vybranými ze skupiny E. coli, Clostridium difficile a Clostridium perfringens.