CZ202189A3

CZ202189A3 - Způsob výroby směsného pigmentu na bázi červeného, fialového, oranžového a hnědého barviva s antioxidačním účinkem a tento směsný pigmen

Info

Publication number: CZ202189A3
Application number: CZ2021-89A
Authority: CZ
Inventors: Gurgen SARDARYAN; Gurgen Sardaryan; Garegin Sardaryan
Original assignee: Gurgen SARDARYAN; Gurgen Sardaryan; Gesmed Biotec s.r.o.
Priority date: 2021-02-28
Filing date: 2021-02-28
Publication date: 2022-05-18
Also published as: CZ309205B6; US20240294765A1; EP4298202A1; WO2022179646A1; CN117203322A

Abstract

Řešení se týká způsobu výroby směsného pigmentu na bázi červeného, fialového, oranžového a hnědého barviva s antioxidačním účinkem z kultivační biomasy kmenů mikroorganismů Penicillium oxalicum var. Armeniaca CCM 8242 a CCM 8374, zejména pro potravinářství, farmacii a kosmetiku, který je charakterizován tím, že výchozí biomasa obsahuje minimálně 10 % hmotn. směsi α a β glukanů, 3 % hmotn. niacinu, 7 % hmotn. kyseliny pantothenové a 1,5 % hmotn. pyridoxinu v sušině. Získaný směsný pigment vykazuje charakteristická maxima na spektrofotometrickém grafu z molekulové absorpční spektrofotometrie ve viditelné oblasti spektra při rozsahu vlnových délek 400 nm až 800 nm, a to ve vodném roztoku o hodnotě pH 7 až 7,5 dvě maxima, kdy první maximum na Lambda max1 je A = 494 nm a druhé nejvyšší maximum na Lambda max2 je A = 420 nm, a dvě maxima v roztoku alkoholu, kdy první maximum na Lambda max1 je A = 502 nm a druhé nejvyšší maximum na Lambda max2 je A = 415 nm.

Description

Způsob výroby směsného pigmentu na bázi červeného, fialového, oranžového a hnědého barviva s antioxidačním účinkem a tento směsný pigment

Oblast techniky

Řešení se týká způsobu výroby směsného pigmentu na bázi červeného, fialového, oranžového a hnědého barviva s antioxidačním účinkem, který se používá zejména v potravinářství, farmacii a kosmetice.

Dosavadní stav techniky

V českém patentu 285721 je popsána mikroskopická houba Penicillium oxalicum var. Armeniaca CCM 8242, získaná z půdy z údolí pod horou Ararat a v patentu 302696 se jedná o mikroskopickou houbu CCM 8374, obě produkující exogenní červený pigment s různými možnostmi použití v potravinářství, farmacii, kosmetice.

Při dosavadním využívání uvedených kmenů je dosahován výsledek nižších výnosností pigmentu a nestabilní kvality, což je nežádoucí.

Oba výše uvedené kmeny byly uloženy v mezinárodním ukládacím místě CCM, Česká sbírka mikroorganismů Masarykovy univerzity v Brně, CZ.

Podstata vynálezu

Výše uvedené nedostatky odstraňuje způsob přípravy směsného pigmentu na bázi červeného, fialového, oranžového a hnědého barviva s antioxidačním účinkem z kultivační biomasy kmenů mikroorganismů Penicillium oxalicum var. Armeniaca CCM 8242 a CCM 8374, podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že výchozí biomasa obsahuje minimálně 10 % hmota, směsi a a β glukanů, 3 % hmota, niacinu, 7 % hmota, kyseliny pantothenové a 1,5 % hmota, pyridoxinu v sušině.

Směsný pigment na bázi červeného, fialového, oranžového a hnědého barviva s antioxidačním účinkem, připravený z biomasy kmenů mikroorganismů Penicillium oxalicum var. Armeniaca CCM 8242 a CCM 8374, zejména pro potravinářství, farmacii a kosmetiku, podle vynálezu, je také podstatou vynálezu, která spočívá v tom, že vykazuje charakteristická maxima na spektrofotometrickém grafů z molekulové absorpční spektrofotometrie ve viditelné oblasti spektra při rozsahu vlnových délek 400 nm až 800 nm, a to ve vodném roztoku o hodnotě pH 7 až 7,5 dvě maxima, kdy první maximum na Lambda maxi je A = 494 nm a druhé nejvyšší maximum na Lambda max2 je A = 420 nm, a dvě maxima v roztoku alkoholu, kdy první maximum na Lambda maxi je A = 502 nm a druhé nejvyšší maximum na Lambda max2 je A = 415 nm.

Biomasa pro výrobu antioxidačních směsných pigmentů podle vynálezu při použití kmenů mikroorganismů Penicillium oxalicum var. Armeniaca CCM 8242 a CCM 8374 také obsahuje glukany v minimálním množství od 10 % hmota.

Uvedené nové směsné pigmenty se vyrábějí tak, že se fermentuje inokulum a z něj se izolují pigmenty s antioxidačními účinky.

Směsné pigmenty podle vynálezu se využívají zejména v potravinářství, např. v uzeninách, jako doplněk stravy, dále ve farmaceutickém a kosmetickém průmyslu, kde vyrobený produkt stabilizují a zbarvují. Antioxidační účinek těchto pigmentů podstatně prodlužuje použitelnost a

- 1 CZ 2021 - 89 A3 životnost všech výrobků, do kterých je přidán.

Směsné pigmenty podle vynálezu a jejich výroba umožňují získávat konečný produkt v opakovatelném stabilním složení, což dosud nebývá samozřejmé. Jejich výroba nyní probíhá za zvýšeného sycení fermentačního média vzduchem, úpravou fermentačního média pomocí kvasničného extraktu (např. HY YEST 412 Kerry) a úpravou velikosti pórů mikrofiltračního zařízení. Úpravou fermentačního procesu získáváme biomasu mycelia, která obsahuje zdraví prospěšné látky, neboť obsahuje minimálně 10 % hmotn. glukanů, viz obr. 2.

Objasnění výkresů

Na obr. 1 je znázorněno v grafu spektrofotometrické měření složení konečného základního výrobku (hmotnostní spektrofotometrie), což je červený pigment, a následující pigment fialový, oranžový, hnědý se stanoví chromatograficky.

Na obr. 2 jsou v grafů zobrazena FT-IR spektra houbového glukanu a mycelia Penicillium oxalicum a Pleurotus (hlíva ústřičná), kde plná linka znázorňuje glukany, ozdobná linka znázorňuje Penicillium oxalicum. Spektrum vzorku leží v rozsahu vlnočtů 4000 až 450 cm ¹s rozlišením 2 cm Jedná se o porovnání spektra houbového glukanu s glukany obsaženými v biomase Penicillium oxalicum var. Armeniaca.

Na obr. 3 je v grafů znázorněno spektrum z hmotnostního spektrofotometru z analýzy vzorku získaného z pokusné fermentace číslo 2 (natural red šarže 2 (NR)) provedené v Mikrobiologickém ústavu Akademie věd ČR, CZ.

Na obr. 4 je v grafů znázorněno spektrum z hmotnostního spektrofotometru z analýzy vzorku získaného z pokusné poloprovozní výroby z fermentace číslo 125 (natural red šarže 125 (NR)) stanovené ve Výzkumném ústavu potravinářském Praha, CZ.

Směsné pigmenty podle vynálezu byly v praxi ověřeny s dobrými výsledky v laboratořích Mikrobiologického ústavu A V ČR v Praze, CZ.

Příklady uskutečnění vynálezu

Příklad 1

Výroba směsných pigmentů podle vynálezu probíhá z biomasy obsahující minimálně 10 % hmotn. glukanů po fermentaci mikrobiálních kmenů Penicillium oxalicum var. Armeniaca CCM 8242 a CCM 8374 podle základního výrobního schématu:

• RO příprava DEMI vody pro výrobu • Vyvíječ páry a příprava ostré páry pro sterilizaci • Kompresor vzduchu pro výrobu • Sanitační zařízení • Chladicí systém • Mikrobiologická laboratoř, práce s kmenem a příprava inokula • Biotechnologický fermentor - získání účinné látky • Linka na zpracování produktu - odstředivka, MF, NF - Izolace účinné látky • Sprej ová sušárna - sušení produktu na vhodném nosiči

Celý fermentační proces probírá za sterilních podmínek.

-2CZ 2021 - 89 A3

Výroba začíná v mikrobiologické laboratoři, kde se aktivuje kmen mikroskopické houby Penicillium oxalicum var. Armeniaca CCM 8242 a CCM 8374 z lyofilizovaného stavu. Rozočkuje se na Petriho misky a v termostatu při teplotě 28 až 29 °C kultivujeme po dobu 5 dnů.

Kritéria pro posouzení mycelia jsou • jednotný sametový povrch mycelia • mycelium v zelené barvě • bohatá sporulace • barva agaru pod myceliem sytě červená.

Z povrchu Petriho misky se seškrábne laboratorní kličkou stejnorodá hmota spor s myceliem a sterilně se přenese do erlenmeyerovy baňky o objemu 500 ml. Inokulum v baňkách se kultivuje na třepačce při otáčkách 220 až 240 ot./min po dobu 36 hodin až 48 hodin

Fermentační půdu pro inokulaci tvoří kvasničný extrakt (např. HY YEST 412 Kerry) v množství 6 g/1 půdy, řepný cukr - sacharóza v množství 18 g/1 půdy a hmota Agar-agar v množství 20 g/1 půdy.

Získané vybrané inokulum se sterilně přenese do inokulačního fermentoru. Objem vsádky inokulačního fermentoru činí cca 0,1 % až 2 % objemu výrobního fermentoru.

Podmínky procesu v inokulačním fermentoru jsou následující:

Teplota uvnitř jednotky je 28 až 29 °C, tlak v jednotce je 0,02 až 0,03 MPa, spotřeba vzduchu činí 15 až 30 m³ vzduchu/m³ fermentačního média/h, míchání lopatkovým míchadlem rychlostí 250 ot./min, hodnota pH půdy 5,8 až 6,2. Fermentační půdu pro inokulaci tvoří kvasničný extrakt HY YEST 412 Kerry v množství 6 g/1 půdy, řepný cukr - sacharóza v množství 18 g/1 půdy.

Je nutné zachovat činnost houby (aktivitu) v pravidelném očkovacím cyklu ve zkumavkách každé 3 měsíce. Houba musí být uchovávána při teplotě 3 až 5 °C.

Inokulum se kultivuje 36 až 48 hodin, mycelium musí být vato vité struktury s dlouhými vlákny a bohatou sporulací, rovnoměrně suspendované ve fermentačním médiu. Během fermentace se sleduje hodnota pH, množství barviva, množství biomasy mycelia a mikrobiální čistota vzorku monokultura, plísně. Po uplynutí výše uvedené doby se sterilně převede inokulum do vysterilizované fermentační půdy ve výrobním fermentoru.

Podmínky procesu ve výrobním fermentoru jsou následující:

Objem inokula pro výrobní fermentor činí cca 0,1 % až 3 % objemu výrobního fermentoru.

Teplota uvnitř jednotky je 28 až 29 °C, tlak v jednotce je 0,07 až 0,08 MPa, spotřeba vzduchu činí 30 až 50 m³ vzduchu/m³ fermentačního média/h, míchání lopatkovým míchadlem rychlostí 250 až 400 ot./min, hodnota pH půdy 5,8 až 6,2, rozpustnost kyslíku 80 až 100 %.

Fermentační půdu pro inokulaci tvoří kvasničný extrakt v množství 6 g/litr půdy HY YEST 412 Kerry, řepný cukr - sacharóza v množství 18 g/1 půdy, odpěňovač PPG dle potřeby.

Mycelium se takto kultivuje 68 až 72 hodin, do vyčerpání sacharózy z živné půdy a během fermentace se sleduje hodnota pH, množství zbytkové sacharózy, množství barviva, množství biomasy mycelia a mikrobiální čistota vzorku - monokultura, plísně.

Po ukončení fermentace se zvýší skokově teplota ve fermentoru až na 45 °C až 50 °C a hodnota pH se upraví čpavkovou vodou na hodnotu pH 8,5 až 9,5 a míchá se rychlostí 35 až 40 ot./min.

-3 CZ 2021 - 89 A3

Následují kroky finalizace, tj. odstranění mycelia pomocí odstředivky rychlostí 15 000 ot/min., případně na filtračním lisu, z fermentační kapaliny s žádaným produktem - červenými pigmenty. Obsah mycelia tvoří cca 3 až 5 % objemu vsádky. Následuje dočištění média od fragmentů mycelia a nerozpustných látek na mikrofiltračním zařízení (velikost pórů membrány je 0,45 až 0,60 pm) a v konečné fázi zkoncentrování produktu do objemu 1/10 objemu vsádky na nanofiltrační jednotce (velikost pórů 300 až 350 Daltonů).

Zkoncentrovaný produkt se následně sprejově suší na vhodném nosiči. Teplota nastřikovaného materiálu je 35 až 45 °C a hodnota jeho pH je 9,0 až 9,5. Teplota vzduchu na vstupu do sušicí komory je 200 °C a na výstupu ze sušicí komory 98 °C.

Výsledkem je červený prášek nahořklé chuti, současně s pigmentem fialovým, oranžovým a hnědým, které se stanoví chromatograficky.

Analýzou konečného výrobku - červeného pigmentu po fermentaci kmene Penicillium oxalicum var. Armeniaca CCM 8242 a CCM 8374 při zachování optimálních podmínek fermentace byl zjištěn výtěžek 6 až 10 g červeného pigmentu/1 média. Hodnota absorpce v souladu s metodou výpočtu navrhovaným FAO odpovídá hodnotě 1,05. V tomto případě se pro určení koncentrace červeného pigmentu používá vzorec lOOxAx 100

1,05 xW kde značí

A hodnotu Lambda max. absorpce při 494 nm,

W hmotnost vzorku krystalického pigmentu 100 mg,

1,05 konstantní hodnotu absorpce.

Získaný červený pigment byl určen spektrometricky, a to použitím molekulové absorpční spektrofotometrie ve viditelné oblasti elektromagnetického spektra s frekvenčním rozsahem 400 nm až 800 nm, kdy byla získána dvě charakteristická maxima ve vodném roztoku o hodnotě pH 7 až 7,5, přičemž první maximum na Lambda maxi je A = 494, druhé nejvyšší maximum na Lambda max2 je A = 420 nm.

Další spektrometrie byla provedena s alkoholovým roztokem červeného pigmentu, kdy první maximum na Lambda maxi bylo A = 502 nm, druhé nejvyšší maximum na Lambda max2 bylo A = 415 nm.

Na kvalitu (čistotu) pigmentu ukazuje hodnota A1/A2 = 1,3 až 1,5, při které je hodnota antioxidační aktivity AK = 2,65.

Kvalitu vyrobeného červeného prášku nahořklé chuti, současně s pigmentem fialovým, oranžovým a hnědým, dokládá graf na obr. 1.

Příklad 2

Výroba probíhala podle příkladu 1, ale s následujícími úpravami:

Jako zdroj dusíkatých látek ve fermentační půdě sloužil kvasničný extrakt HY-YEST 412 Kerry, při vzdušnění během fermentačního procesu bylo použito 30 až 50 m³ vzduchu/m³ fermentačního

-4CZ 2021 - 89 A3 média/h, při teplotě 28 až 29 °C a míchání při fermentaci rychlostí 250 až 400 ot./min, fermentované médium již po 22 hodinách vykazuje červené zbarvení. K ukončení fermentace dochází v 68. až 72. hodině. Pro finalizaci a zpracování produktu byla použita mikrofiltrace na membránách o velikosti pórů 0,45 až 0,60 pm a nanofiltrace na membránách o velikosti pórů 300 až 350 Daltonů.

Příklad 3

Biomasa pro výrobu směsných pigmentů podle vynálezu musí obsahovat minimálně 10 % hmota, glukanů, aby měla očekávané dobré využití ve výživě pro zvýšený obsah glukanů.

Složení mycelia = biomasy (možno použít pro komplexní sušení) je zobrazeno v tabulce 1.

Tabulka 1

Obsah/faktor	mycelium
		g/100 g sušiny
sušina
popel		6,5
tuk		3,9
bílkoviny		32,1
celková vláknina potravy		37,0
rozpustná vláknina potravy		26,8
nerozpustná vláknina potravy		10,3
Obsah/faktor	mycelium
vitamíny v biomase		g/100 g sušiny
niacin		3,7
kyselina pantothenová		7,10
pyridoxin		1,81

Poznámka:

Tuk - původ odpěňovač

Bílkoviny - pravděpodobně mírně ovlivněny přídavkem amoniaku

Antioxidační aktivita (mg AK/1 g sušiny) (DPPH) = 2,65

Porovnání obsahu glukanů v biomase - viz obr. 2 - zobrazuje tabulka 2.

-5CZ 2021 - 89 A3

Tabulka 2

Obsah/faktor	mycelium
		g/100 g sušiny
sušina
celkové glukany		13,25
a - glukany		3,40
β- glukany		9,85

houby rodu Pleurotus (lyofilizát mycelia)
celkové glukany	17 %
a - glukany	3 %
β- glukany	14 %

Na obr. 2 jsou znázorněna FT-IR spektra houbového glukanu a mycelia Penicillium oxalicum. Bylo změřeno FT-IR spektrum vzorku v rozsahu vlnočtů 4000 až 450 cm¹ s rozlišením 2 cm¹ a porovnána spektra se spektrem houbového glukanu, kdy byla potvrzena přítomnost glukanu, který obsahuje 1,3 a 1,6 vazby, vzorek dále obsahuje tuky (oblast 3000 cm¹) a bílkoviny (oblast 1700 cm¹). Získané směsné pigmenty podle vynálezu ve formě červeného pigmentu byly podrobeny analýze, jak zobrazuje obr. 2.

Byly testovány vzorky směsných pigmentů (Natural Red) označené jako crude extract a original sample buněčně-biologickými technikami (fluorescenční mikroskopie, průtoková cytometrie) na primárních lidských kožních fibroblastech. Experiment byl proveden 2x pro oba vzorky, získaná data nejevila žádný signifikantní rozptyl, jedná se o biologický duplikát.

Metodika:

Buňky byly pro dosažení optimálního fyziologického stavu rozmraženy ze zásobních kultur uchovávaných v tekutém dusíku týden před experimentem. Následně byly Ix pasážovány do optimální buněčné hustoty (konfluence cca 50 %) v 24-jamkových destičkách s vloženým krycím sklíčkem (Nunc). Pro testování bioaktivity/toxicity byly reagencie skladované v koncentraci 50 mg/ml (4 °C) naředěny za sterilních podmínek v médiu pro tkáňové kultury (D-MEM, 10% FCS) a přidány v požadovaných koncentracích k testovaným fibroblastům. Test probíhal 24 h/72 h při 37 °C, v 5% CO2 v atmosféře.

Pro průtokovou cytometrii FACS (dále jen FACS) byly buňky odděleny od kultivační destičky pomocí 0,1% roztoku trypsinu, bezprostředně označeny fluorescenčním barvivém DAPI identifikujícím nekrotické a apoptotické buňky (HY YEST 412 Kerry) a následně analyzovány FACS Aria (Becton Dickinson). Data byla analyzována pomocí software FlowJo.

Pro fluorescenční mikroskopii byly buňky fixovány 4% PFA v PBS 10 min, permeabilizovány 0,01% Tritonem X-100 v PBS, RT, blokovány 5% BSA v PBS a značeny pomocí monoklonální protilátky k Lamp-3 (MEM 259) a fluorescenčně značeným ftaloidinem-Alexa 594. Myší monoklonální protilátka byla následně identifikována pomocí sekundární GAM-Alexa 488

-6CZ 2021 - 89 A3 protilátky. Vizualizace byla provedena pomocí invertovaného fluorescenčního mikroskopu Olympus s využitím citlivé barevné kamery DP50 (objektiv 40x).

Průtoková cytometric:

Dot-plotová analýza ukazuje výsledek jednoho z duplikátů pro 24h inkubaci s koncentracemi pokrývajícími rozmezí 8 až 1000 mikrogramů/ml.

Závěr:

Pomocí průtokové cytometrie nebyla detekována signifikantní cytotoxicita v koncentračním rozpětí 8 až 1000 mikrogramů/ml. Nej vyšší testovaná koncentrace je extrémní, jen málo látek typu sekundárních metabolitů je takto bio-neutrálních. Obdobná data byla získána u 24h i 72h experimentu v biologickém duplikátu.

Fluore scenční mikroskopie:

Primární kožní fibroblasty byly testovány pro koncentrační rozmezí Natural Red extraktů v koncentraci 1 až 500 mikrogramů/ml. Byla vizualizována integrita a struktura aktinového cytoskeletu (ten je extrémně citlivý pro environmentální vlivy), pozdně endosomálm/lysosomální vezikulámí systém a jádra.

Závěr:

Zvolená kombinace znaků je vhodná pro citlivou identifikaci narušení buněčné fyziologie. Ta nebyla zaznamenána, snad s výjimkou koncentrace nejvyšší, která vedla k mírné změně adheze a protažení buněk, endozomálně/lysosomální systém nebyl ovlivněn, nebyla pozorována ani nekróza, ani apoptóza (při obou časových ovlivněních - 24 a 72 h), u obou frakcí v biologickém duplikátu.

Studované frakce Natural Red vykazují mimořádnou biokompatibilitu/absenci cytotoxicity k primární buněčné linii lidských kožních fibroblastů. Signifikantní buněčná patologie nebyla zaznamenána v širokém koncentračním rozpětí aplikovaných ve vícedenním formátu, testovaná pomocí citlivých kvantitativních (průtoková cytometrie) i kvalitativních technik (fluorescenční mikroskopie).

Průmyslová využitelnost

Řešení se týká nového způsobu výroby směsných pigmentů červených, fialových, oranžových a hnědých s antioxidačním účinkem, vzniklých po kultivaci a fermentaci biomasy z kmenů Penicillium oxalicum var. Armeniaca CCM 8242 a CCM 8374, dále se týká i těchto nových směsných pigmentů, pro použití v potravinářském, farmaceutickém a kosmetickém průmyslu.

Seznam zkratek, které jsou použity v textu

FT-IR spektra - fluorescenční detektor infračerveného spektra

RO - reverzní osmóza

DEMI - demineralizovaná

MF- mikrofiltrace

NF - nanofiltrace

PPG - polypropylenglykol

DPPH - difenylpikrylhydrazil

CO2 - oxid uhličitý

FCS - fluorescenčně korelační spektroskopie

-7 CZ 2021 - 89 A3

FACS - fluorescenční průtoková cytometric DAPI - 4,6-diamidin-2-fenylindol - fluorescenční barvivo PFA - plazmatické bílkoviny

PBS - pufr (fosforečnany) na tkáňové kultury

Triton X-100 - neionogenní tenzid RT - reversní transkriptáza BSA - bovinní sérový albumin MEM - monoklonální protilátka GAM-Alexa 488 - název protilátky

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob výroby směsného pigmentu na bázi červeného, fialového, oranžového a hnědého barviva s antioxidačním účinkem z kultivační biomasy kmenů mikroorganismů Penicillium 5 oxalicum var. Armeniaca CCM 8242 a CCM 8374, vyznačující se tím, že výchozí biomasa obsahuje minimálně 10 % hmota, směsi a a β glukanů, 3 % hmota, niacinu, 7 % hmota, kyseliny pantothenové a 1,5 % hmota, pyridoxinu v sušině.
2. Směsný pigment na bázi červeného, fialového, oranžového a hnědého barviva s antioxidačním účinkem připravený z biomasy kmenů mikroorganismů Penicillium oxalicum var. Armeniaca CCM ίο 8242 a CCM 8374 podle nároku 1, zejména pro potravinářství, farmacii a kosmetiku, vyznačující se tím, že vykazuje charakteristická maxima na spektrofotometrickém grafu z molekulové absorpční spektrofotometrie ve viditelné oblasti spektra při rozsahu vlnových délek 400 nm až 800 nm, a to ve vodném roztoku o hodnotě pH 7 až 7,5 dvě maxima, kdy první maximum na Lambda maxi je A = 494 nm a druhé nejvyšší maximum na Lambda max2 je A = 420 nm, a dvě maxima 15 v roztoku alkoholu, kdy první maximum na Lambda maxi je A = 502 nm a druhé nejvyšší maximum na Lambda max2 je A = 415 nm.