CZ2024197A3 - Způsoby a kompozice pro detekci mutantních sekvencí nukleových kyselin - Google Patents
Způsoby a kompozice pro detekci mutantních sekvencí nukleových kyselin Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2024197A3 CZ2024197A3 CZ2024-197A CZ2024197A CZ2024197A3 CZ 2024197 A3 CZ2024197 A3 CZ 2024197A3 CZ 2024197 A CZ2024197 A CZ 2024197A CZ 2024197 A3 CZ2024197 A3 CZ 2024197A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- sequence
- primer
- hairpin
- hemiprobe
- approximately
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 117
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 52
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title abstract description 76
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title abstract description 30
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title description 12
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title description 12
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 139
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 110
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 105
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 101
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 90
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 75
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 75
- 238000011304 droplet digital PCR Methods 0.000 claims description 45
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 44
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 43
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 41
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 41
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 41
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 claims description 26
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 claims description 26
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 25
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 17
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 15
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical class NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 12
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 claims description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 7
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 claims description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 329
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 100
- 102100030708 GTPase KRas Human genes 0.000 description 64
- 101000584612 Homo sapiens GTPase KRas Proteins 0.000 description 64
- 101001106795 Homo sapiens Refilin-A Proteins 0.000 description 44
- 102100021329 Refilin-A Human genes 0.000 description 41
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 39
- 239000000047 product Substances 0.000 description 38
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 35
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 34
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 33
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 33
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 31
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 31
- 101000957297 Homo sapiens Coronin-6 Proteins 0.000 description 30
- 102100038810 Coronin-6 Human genes 0.000 description 29
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 29
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 27
- 102200006540 rs121913530 Human genes 0.000 description 24
- 238000013461 design Methods 0.000 description 22
- 238000007847 digital PCR Methods 0.000 description 22
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 22
- 102100039788 GTPase NRas Human genes 0.000 description 21
- 101000744505 Homo sapiens GTPase NRas Proteins 0.000 description 21
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 17
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 15
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 14
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 13
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 13
- 108091029430 CpG site Proteins 0.000 description 12
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 12
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 12
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 12
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 12
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical class CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 102100032956 Alpha-actinin-3 Human genes 0.000 description 11
- 101000797292 Homo sapiens Alpha-actinin-3 Proteins 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 11
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 11
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 11
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 210000005003 heart tissue Anatomy 0.000 description 8
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 8
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 8
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 8
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 8
- 108010014172 Factor V Proteins 0.000 description 7
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 7
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 6
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 6
- 239000002055 nanoplate Substances 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940126685 KRAS G12R Drugs 0.000 description 5
- CTMZLDSMFCVUNX-VMIOUTBZSA-N cytidylyl-(3'->5')-guanosine Chemical class O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=C(C(N=C(N)N3)=O)N=C2)O)[C@@H](CO)O1 CTMZLDSMFCVUNX-VMIOUTBZSA-N 0.000 description 5
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 5
- 230000036438 mutation frequency Effects 0.000 description 5
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 4
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 4
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 4
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 4
- 108091029523 CpG island Proteins 0.000 description 3
- -1 DTT Chemical compound 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 3
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 102200124924 rs11554290 Human genes 0.000 description 3
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- WQZIDRAQTRIQDX-UHFFFAOYSA-N 6-carboxy-x-rhodamine Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(C([O-])=O)C=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 WQZIDRAQTRIQDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N Betaine Natural products C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150110104 CORO6 gene Proteins 0.000 description 2
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 2
- 108091029795 Intergenic region Proteins 0.000 description 2
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O N,N,N-trimethylglycinium Chemical compound C[N+](C)(C)CC(O)=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 2
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 2
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000002199 base oil Substances 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 description 2
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 2
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 2
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 238000013079 data visualisation Methods 0.000 description 2
- 238000010252 digital analysis Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical class O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 2
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 2
- 238000012803 optimization experiment Methods 0.000 description 2
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 2
- 102200006531 rs121913529 Human genes 0.000 description 2
- 102200006537 rs121913529 Human genes 0.000 description 2
- 102200006538 rs121913530 Human genes 0.000 description 2
- 102200006541 rs121913530 Human genes 0.000 description 2
- 229910052594 sapphire Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010980 sapphire Substances 0.000 description 2
- 238000005382 thermal cycling Methods 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PJDOLCGOTSNFJM-UHFFFAOYSA-N 2,2,3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-pentadecafluorooctan-1-ol Chemical compound OCC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F PJDOLCGOTSNFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BPVHBBXCESDRKW-UHFFFAOYSA-N 5(6)-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C21OC(=O)C1=CC(C(=O)O)=CC=C21.C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BPVHBBXCESDRKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BUJRUSRXHJKUQE-UHFFFAOYSA-N 5-carboxy-X-rhodamine triethylammonium salt Chemical compound CC[NH+](CC)CC.[O-]C(=O)C1=CC(C(=O)[O-])=CC=C1C1=C(C=C2C3=C4CCCN3CCC2)C4=[O+]C2=C1C=C1CCCN3CCCC2=C13 BUJRUSRXHJKUQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YMZMTOFQCVHHFB-UHFFFAOYSA-N 5-carboxytetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=C(C(O)=O)C=C1C([O-])=O YMZMTOFQCVHHFB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150042778 ACTN3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 102000000119 Beta-lactoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical compound C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 102100029974 GTPase HRas Human genes 0.000 description 1
- 101100175482 Glycine max CG-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000584633 Homo sapiens GTPase HRas Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 206010069755 K-ras gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 108010060630 Lactoglobulins Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000316144 Macrodon ancylodon Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N Poloxamer Chemical compound C1CO1.CC1CO1 RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004721 Polyphenylene oxide Substances 0.000 description 1
- GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N Propylene oxide Chemical compound CC1CO1 GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150040459 RAS gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108020003224 Small Nucleolar RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042773 Small Nucleolar RNA Human genes 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229920002359 Tetronic® Polymers 0.000 description 1
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002820 assay format Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003876 biosurfactant Substances 0.000 description 1
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000007675 cardiac surgery Methods 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000009146 cooperative binding Effects 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 238000013211 curve analysis Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 238000007672 fourth generation sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000012212 insulator Substances 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000003680 myocardial damage Effects 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920001993 poloxamer 188 Polymers 0.000 description 1
- 229920000570 polyether Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000009598 prenatal testing Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 1
- 238000011935 selective methylation Methods 0.000 description 1
- 238000003375 selectivity assay Methods 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000010408 sweeping Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 238000007482 whole exome sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000012070 whole genome sequencing analysis Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/154—Methylation markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Popisují se způsoby a kompozice pro detekci mutantních sekvencí nukleové kyseliny. V některých případech zde používané způsoby a kompozice využívají dvoustranný primer v kombinaci s jedním nebo více kódujícími a antikódujícími primery konfigurovanými tak, aby hybridizovaly s konkrétními oblastmi dvoustranného primeru za účelem umožnění detekce mutantní sekvence s vysokou selektivitou.
Description
Zpûsoby a kompozice pro detekci mutantnich sekvenci nukleovych kyselin
ODKAZ
Tato pfihlâska nârokuje vÿhodu prozatimni pfihlâsky US c. 63/257,954, s nâzvem ZPÙSOBY A KOMPOZICE PRO DETEKCI MUTANTNÎCH SEKVENCi NUKLEOVYCH KYSELIN, podané 20. fijna 2021, kterâ je zde jako celek zahrnuta odkazem.
POZADi
Detekce mutantnich sekvenci pomoci amplifikace sondy specifické pro templât v kombinaci s kvantitativnimi metodami, jako je napf. kvantitativni polymerâzovâ fetezovâ reakce (qPCR), gelovâ elektroforéza nebo kapilârni elektroforéza se siroce vyuzivâ pro genotypizaci pacientù pro diagnostické a klinické ùcely.
SHRNUTi
Stâvajici schémata pro detekci mutantnich sekvenci pomoci amplifikace sondy specifické pro templât v kombinaci s kvantitativnimi metodami, jako je kvantitativni polymerâzovâ fetezovâ reakce (qPCR), trpi nedostatkem specificity pro detekci mutantnich sekvenci, zejména v pfitomnosti sekvenci divokého typu, které neobsahuji mutaci. Existuje potfeba navrhnout nové kompozice primerù a sond, které zlepsuji selektivitu detekce mutantnich sekvenci v pfitomnosti sekvenci divokého typu.
V souladu s tim v nekterÿch provedenich soucasnÿ popis poskytuje zpùsoby, kompozice, reakcni smesi, soupravy a systémy pro zpracovâni sekvencni varianty za vzniku detekovatelného produktu s vysokou selektivitou. Takové metody, kompozice, reakcni smesi, soupravy a systémy mohou bÿt uzitecné pfi neinvazivnim prenatâlnim testovâni (NIPT), bezbunecné analÿze deoxyribonukleové kyseliny (DNA), genotypizaci pacienta (napf. pro identifikaci nâdoru nebo diagnostiku autoimunitnich onemocneni), digitâlni polymerâzovâ fetezovâ reakce (digitâlni PCR), kapkovâ digitâlni PCR (ddPCR), pfiprave vzorku sekvenovânim nové generace (NGS) nebo detekci odmitnuti po transplantaci orgânu (napf. v pfipade transplantace srdce, plic, ledvin nebo jater).
V nekterÿch aspektech pfedklâdanÿ popis poskytuje zpùsob zpracovâni sekvence DNA, kterâ mâ nebo je v podezfeni, ze mâ sekvencni variantu vzhledem k sekvenci divokého typu, pficemz tento zpùsob zahrnuje: smichâni v reakcni smesi vhodné pro zpracovâni sekvence DNA: (i) sekvence DNA, kde sekvence DNA obsahuje variaci alespon jednoho nukleotidu vzhledem k sekvenci divokého typu; a (ii) primer vlâsenky se smyckou, kterÿ obsahuje: 5' hemisondovou sekvenci konfigurovanou tak, aby hybridizovala s komplementârnim prvnim koncovÿm ùsekem DNA sekvence; sekvenci vlâsenky se smyckou; a 3' hemisondovou sekvenci nakonfigurovanou tak, aby hybridizovala s druhou koncovou oblasti DNA sekvence, kde 3' koncovâ câst 3' hemisondové sekvence obsahuje nukleotid komplementârni k neshodâm v pârovâni, ale ne komplementârni k divokému typu sekvence. V nekterÿch provedenich zpùsob dâle zahrnuje inkubaci reakcni smesi za podminek vhodnÿch k prodlouzeni produktu obsahujiciho sekvenci 3' hemisondy. V nekterÿch provedenich zpùsob dâle zahrnuje kombinovâni v reakcni smesi vhodné pro zpracovâni produktu obsahujiciho 3' hemisondovou sekvenci:antikôdujici primer konfigurovanÿ tak, aby hybridizoval s genomovou oblasti 3' z nesprâvného pârovâni. V nekterÿch provedenich mâ antikôdujici primer Tm pfiblizne 50-70 stupnù Celsia. V nekterÿch provedenich zpùsob dâle zahrnuje inkubaci reakcni smesi vhodné pro zpracovâni produktu obsahujiciho sekvenci 3' hemisondy za podminek vhodnÿch pro produkci produktù prodlouzeni z antikôdujiciho primeru. V nekterÿch provedenich zpùsob dâle zahrnuje smichâni v reakcni smesi vhodné pro zpracovâni produktu obsahujiciho sekvenci antikôdujiciho primeru: produktu obsahujiciho sekvenci antikôdujiciho primeru; a kôdujici primer nakonfigurovanÿ tak, aby hybridizoval s: (i) alespon câsti sekvence 5' hemisondy; a (ii) alespon câst stopky sekvence vlâsenky se smyckou. V nekterÿch provedenich kôdujici primer obsahuje alespon pfiblizne 12 az pfiblizne 30 nukleotidù komplementârnich k sekvenci 5' hemisondy. V
- 1 CZ 2024 - 197 A3 nekterych provedenich kôdujici primer obsahuje alespon priblizne 9 az priblizne 35 nukleotidû komplementarnich ke stopce sekvence vlasenky se smyckou 3' k nukleotidûm komplementarnim k 5' sekvenci hemisondy. V nekterych provedenich ma pnmy primer Tm priblizne 50 az priblizne 70 stupnû Celsia. V nekterych provedenich zpûsob dale zahrnuje inkubaci reakcni smesi vhodné pro zpracovani produktu obsahujiciho sekvenci antikôdujiciho primeru za podminek vhodnych k produkci produktû prodlouzeni z kôdujiciho primeru. V nekterych provedenich jsou antikôdujici a kôdujici primer v prebytku nebo maji alespon priblizne 20nasobne, alespon priblizne 50nasobne, alespon priblizne 100nasobne, alespon priblizne 200nasobne, alespon priblizne 500nasobne alespon asi 1000nasobne vyssi koncentraci nez je koncentrace dvoustranného primeru. V nekterych provedenich je koncentrace dvoustranného primeru vyssi nez nebo ma alespon priblizne 20nasobne, alespon priblizne 50nasobne, alespon priblizne 100nasobne, alespon priblizne 200nasobne, alespon priblizne 500nasobne, alespon asi 1000nasobne vyssi koncentraci, nez je koncentrace sekvence DNA. V nekterych provedenich primer vlasenky se smyckou amplifikuje mutantni polynukleotidovou sekvenci alespon priblizne 10krat, alespon priblizne 100krat, alespon priblizne 1000krat, alespon priblizne 10 000krat, alespon priblizne 100 000krat, nebo alespon priblizne 1 000 000krat prednostne oproti polynukleotidové sekvenci divokého typu. V nekterych provedenich mutantni polynukleotidova sekvence nebo polynukleotidova sekvence divokého typu obsahuje genomovou DNA. V nekterych provedenich obsahuje sekvence 5' hemisondy délku priblizne 7 az priblizne 22 nukleotidû. V nekterych provedenich obsahuje sekvence 3' hemisondy délku priblizne 3 az priblizne 9 nukleotidû. V nekterych provedenich ma sekvence 3' hemisondy Tm priblizne 30 az 40 stupnû nebo sekvence 5' hemisondy ma Tm priblizne 60 az 75 stupnû. V nekterych provedenich sekvence vlasenky se smyckou obsahuje délku priblizne 15 nukleotidû nebo vice. V nekterych provedenich je sekvence vlasenky se smyckou konfigurovana tak, aby mela Tm priblizne 55 az priblizne 75 stupnû Celsia. V nekterych provedenich smycka sekvence kmenové smycky obsahuje alespon priblizne 1 az alespon priblizne 20 nukleotidû na délku. V nekterych provedenich smycka sekvence kmenové smycky obsahuje barkôd. V nekterych provedenich reakcni smes vhodna pro zpracovani produktu obsahujiciho sekvenci antikôdujiciho primeru za podminek vhodnych k produkci produktû extenze z primého primeru dale obsahuje oligonukleotidovou sondu obsahujici detekovatelnou skupinu, pricemz oligonukleotidova sonda je konfigurovana tak, aby hybridizovala s komplementem alespon cast zakladniho primeru vlasenky se smyckou. V nekterych provedenich alespon cast primeru vlasenky se smyckou a obsahuje alespon cast sekvence vlasenky se smyckou. V nekterych provedenich alespon cast sekvence vlasenky se smyckou obsahuje alespon cast sekvence vlasenky se smyckou. V nekterych provedenich detekovatelna skupina obsahuje 5' fluorofor. V nekterych provedenich oligonukleotidova sonda obsahujici detekovatelnou skupinu dale obsahuje zhasec.
V nekterych aspektech predkladany popis poskytuje soupravu pro zpracovani sekvence DNA, ktera obsahuje: (a) primer vlasenky se smyckou, ktery obsahuje: (i) sekvenci 5' hemisondy nakonfigurovanou tak, aby hybridizovala s komplementarni prvni koncovou oblasti sekvence DNA; (ii) sekvence vlasenky se smyckou; a (iii) 3' hemisondovou sekvenci nakonfigurovanou tak, aby hybridizovala s druhou koncovou oblasti DNA sekvence; (b) kôdujici primer konfigurovany pro hybridizaci s: (i) alespon casti sekvence 5' hemisondy; a (ii) alespon cast stopky sekvence vlasenky se smyckou; a (c) antikôdujici primer konfigurovany tak, aby hybridizoval s genomovou oblasti 3' z neshody. V nekterych provedenich sekvence DNA ma nebo je v podezreni, ze ma variaci alespon jednoho nukleotidu vzhledem k sekvenci divokého typu. V nekterych provedenich obsahuje 3' terminalni cast 3' sekvence hemisondy nukleotid komplementarni k variaci, ale ne komplementarni k sekvenci divokého typu. V nekterych provedenich souprava dale obsahuje oligonukleotidovou sondu obsahujici detekovatelnou skupinu, pricemz oligonukleotid je konfigurovan tak, aby hybridizoval s alespon casti primeru vlasenky se smyckou. V nekterych provedenich alespon cast primeru vlasenky se smyckou obsahuje alespon cast sekvence vlasenky se smyckou. V nekterych provedenich alespon cast sekvence vlasenky se smyckou obsahuje alespon cast sekvence smycky v sekvenci vlasenky se smyckou. V nekterych provedenich detekovatelna skupina obsahuje 5' fluorofor. V nekterych provedenich oligonukleotidova sonda obsahujici detekovatelnou skupinu dale obsahuje zhasec. V nekterych provedenich ma antikôdujici primer Tm priblizne 50 az 70 stupnû Celsia. V nekterych provedenich kôdujici primer obsahuje
- 2 CZ 2024 - 197 A3 alespon priblizne 12 az priblizne 30 nukleotidû komplementamich k sekvenci 5' hemisondy. V nekterÿch provedenich primÿ primer obsahuje alespon priblizne 9 az priblizne 35 nukleotidû komplementamich ke stopce sekvence vlasenky se smyckou 3' k nukleotidûm komplementarnim k 5' sekvenci hemisondy. V nekterÿch provedenich ma primÿ primer Tm priblizne 50 az priblizne 70 stupnû Celsia. V nekterÿch provedenich vlasenky se smyckou amplifikuje mutantni polynukleotidovou sekvenci alespon priblizne 10krat, alespon priblizne 100krat, alespon priblizne 1000krat, alespon priblizne 10 000krat, alespon priblizne 100 000krat, nebo alespon priblizne 1 000 000krat prednostne oproti polynukleotidové sekvenci divokého typu. V nekterÿch provedenich obsahuje sekvence 5' hemisondy délku priblizne 7 az priblizne 22 nukleotidû. V nekterÿch provedenich obsahuje sekvence 3' hemisondy délku priblizne 3 az priblizne 9 nukleotidû. V nekterÿch provedenich ma sekvence 3' hemisondy Tm priblizne 30 az 40 stupnû nebo sekvence 5' hemisondy ma Tm priblizne 60 az 75 stupnû. V nekterÿch provedenich sekvence vlasenky se smyckou obsahuje délku priblizne 15 nukleotidû nebo vice. V nekterÿch provedenich je sekvence vlasenky se smyckou konfigurovana tak, aby mela Tm priblizne 55 az priblizne 75 stupnû Celsia. V nekterÿch provedenich smycka sekvence vlasenky se smyckou obsahuje alespon priblizne 1 az alespon priblizne 20 nukleotidû na délku. V nekterÿch provedenich smycka sekvence vlasenky se smyckou obsahuje barkôd. V nekterÿch provedenich primer vlasenky se smyckou, kôdujici primer nebo antikôdujici primer obsahuje kteroukoli ze SEKV ID C: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 13, 14, 15, 16, 19, 20, 23, 24, 27, 28, 29, 30, 33, 34, 35, 36, 39, 40, 41, 42, 45, 46, 47, 48, 51, 52, 53, 54, 57, 58, 59, 60, 61, 64, 65, 66, 67, 68, 71 nebo 72. V nekterÿch aspektech predkladanÿ popis poskytuje kompozici pro zpracovani sekvence DNA, ktera obsahuje: (a) primer se vlasenky se smyckou, kterÿ obsahuje: (i) 5' hemisondovou sekvenci konfigurovanou tak, aby hybridizovala s komplementarnim prvnim koncovÿm ùsekem DNA sekvence; (ii) sekvence vlasenky se smyckou; a (iii) 3' hemisondovou sekvenci nakonfigurovanou tak, aby hybridizovala s druhou koncovou oblasti DNA sekvence; (b) kôdujici primer konfigurovanÿ pro hybridizaci s: (i) alespon casti sekvence 5' hemisondy; a (ii) alespon cast stopky sekvence vlasenky se smyckou; a (c) antikôdujici primer nakonfigurovanÿ tak, aby hybridizoval s genomickou oblasti 3' od neshody, pricemz koncentrace kôdujiciho primeru nebo koncentrace antikôdujiciho primeru jsou alespon 10krat vyssi nez koncentrace primeru vlasenky se smyckou. V nekterÿch provedenich sekvence DNA ma nebo je v podezreni, ze ma variaci alespon jednoho nukleotidu vzhledem k sekvenci divokého typu. V nekterÿch provedenich sekvence 3' hemisondy obsahuje nukleotid komplementarni k variaci, ale ne komplementarni k sekvenci divokého typu. V nekterÿch provedenich kompozice dale obsahuje oligonukleotidovou sondu obsahujici detekovatelnou skupinu, pricemz oligonukleotid je konfigurovan tak, aby hybridizoval s alespon casti primeru vlasenky se smyckou. V nekterÿch provedenich alespon cast primeru vlasenky se smyckou obsahuje alespon cast sekvence vlasenky se smyckou. V nekterÿch provedenich alespon cast sekvence vlasenky se smyckou obsahuje alespon cast sekvence smycky v sekvenci vlasenky se smyckou. V nekterÿch provedenich detekovatelna skupina obsahuje 5' fluorofor. V nekterÿch provedenich oligonukleotidova sonda obsahujici detekovatelnou skupinu dale obsahuje zhasec. V nekterÿch provedenich jsou koncentrace kôdujiciho primeru nebo koncentrace antikôdujiciho primeru vyssi nez nebo jsou alespon priblizne 20nasobné, alespon priblizne 50nasobné, alespon priblizne 100nasobné, alespon priblizne 200nasobné alespon priblizne 500krat, alespon priblizne 1000krat vyssi nez koncentrace primeru vlasenky se smyckou. V nekterÿch provedenich obsahuje 3' terminalni cast 3' sekvence hemisondy nukleotid komplementarni k neshodam v parovani, ale ne komplementarni k sekvenci divokého typu. V nekterÿch provedenich ma antikôdujici primer Tm priblizne 50-70 stupnû Celsia. V nekterÿch provedenich kôdujici primer obsahuje alespon priblizne 12 az priblizne 30 nukleotidû komplementamich k sekvenci 5' hemisondy. V nekterÿch provedenich kôdujici primer obsahuje alespon priblizne 9 az priblizne 35 nukleotidû komplementamich ke stopce sekvence vlasenky se smyckou 3' k nukleotidûm komplementarnim k 5' sekvenci hemisondy. V nekterÿch provedenich ma kôdujici primer Tm priblizne 50 az priblizne 70 stupnû Celsia. V nekterÿch provedenich primer vlasenky se smyckou amplifikuje mutantni polynukleotidovou sekvenci alespon priblizne 10krat, alespon priblizne 100krat, alespon priblizne 1000krat, alespon priblizne 10 000krat, alespon priblizne 100 000krat, nebo alespon priblizne 1 000 000krat prednostne oproti polynukleotidové sekvenci divokého typu. V nekterÿch provedenich obsahuje sekvence 5' hemisondy délku priblizne 7 az priblizne 22 nukleotidû. V nekterÿch provedenich obsahuje sekvence 3' hemisondy délku
- 3 CZ 2024 - 197 A3 priblizne 3 az priblizne 9 nukleotidû. V nekterych provedenich ma sekvence 3' hemisondy Tm priblizne 30 az 40 stupnû nebo sekvence 5' hemisondy ma Tm priblizne 60 az 75 stupnû. V nekterych provedenich sekvence vlâsenky se smyckou obsahuje délku priblizne 15 nukleotidû nebo vice. V nekterych provedenich je sekvence vlasenky se smyckou konfigurovâna tak, aby mela Tm priblizne 55 az priblizne 75 stupnû Celsia. V nekterych provedenich smycka sekvence vlasenky se smyckou obsahuje alespon priblizne 1 az alespon priblizne 20 nukleotidû na délku. V nekterych provedenich smycka sekvence vlasenky se smyckou obsahuje barkôd. V nekterych provedenich kôdujici primer nebo antikôdujici primer obsahuje kteroukoli ze SEKV ID C: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 13, 14, 15, 16, 19, 20, 23, 24, 27, 28, 29, 30, 33, 34, 35, 36, 39, 40, 41, 42, 45, 46, 47, 48, 51, 52, 53, 54, 57, 57 59, 60, 61, 64, 65, 66, 67, 68, 71 nebo 72. V nekterych provedenich inkubace zahrnuje PCR reakci, qPCR reakci, dPCR reakci, ddPCR reakci nebo sekvenacni reakci.
V nekterych aspektech predklâdanÿ popis poskytuje zpûsob zpracovâni sekvence DNA, kterâ mâ nebo je v podezreni, ze mâ methylovany cytosin na konkrétnim zbytku, pricemz zpûsob zahrnuje: smichâni v reakcni smesi vhodné pro zpracovâni sekvence DNA: (i ) sekvence DNA, kde sekvence DNA byla osetrena bisulfitem a obsahuje uracil na cytosinovém zbytku, ktery byl pred bisulfitovym osetrenim nemethylovân; a (ii) prvni primer vlâsenky se smyckou, ktery obsahuje: 5' hemisondovou sekvenci konfigurovanou tak, aby hybridizovala s komplementârni prvni koncovou oblasti DNA sekvence; sekvence vlâsenky se smyckou; a 3' hemisondovou sekvenci nakonfigurovanou tak, aby hybridizovala s druhou koncovou oblasti DNA sekvence, kde 3' koncovâ câst 3' hemisondové sekvence obsahuje nukleotid komplementârni k uracilu, ale ne komplementârni k cytosinovému zbytku. V nekterych provedenich zpûsob dâle zahrnuje inkubaci reakcni smesi za podminek vhodnych k prodlouzeni produktu obsahujiciho sekvenci 3' hemisondy. V nekterych provedenich zpûsob dâle zahrnuje kombinovâni v reakcni smesi vhodné pro zpracovâni produktu obsahujiciho 3' hemisondovou sekvenci: antikôdujici primer konfigurovany tak, aby hybridizoval s genomovou oblasti 3' z neshody. V nekterych provedenich mâ antikôdujici primer Tm priblizne 50 az 70 stupnû Celsia. V nekterych provedenich zpûsob dâle zahrnuje inkubaci reakcni smesi vhodné pro zpracovâni produktu obsahujiciho sekvenci 3' hemisondy za podminek vhodnych pro produkci produktû prodlouzeni z antikôdujiciho primeru. V nekterych provedenich zpûsob dâle zahrnuje smichâni v reakcni smesi vhodné pro zpracovâni produktu obsahujiciho sekvenci antikôdujiciho primeru: produktu obsahujiciho sekvenci antikôdujiciho primeru; a kôdujici primer nakonfigurovany tak, aby hybridizoval s: (i) alespon câsti sekvence 5' hemisondy; a (ii) alespon câst stopky sekvence vlâsenky se smyckou. V nekterych provedenich kôdujici primer obsahuje alespon priblizne 12 az priblizne 30 nukleotidû komplementârnich k 5' hemisondové sekvenci. V nekterych provedenich kôdujici primer obsahuje alespon priblizne 9 az priblizne 35 nukleotidû komplementârnich ke stonku sekvence vlâsenky se smyckou 3' k nukleotidûm komplementârnim k 5' hemisondové sekvenci. V nekterych provedenich mâ kôdujici primer Tm priblizne 50 az priblizne 70 stupnû Celsia. V nekterych provedenich zpûsob dâle zahrnuje inkubaci reakcni smesi vhodné pro zpracovâni produktu obsahujiciho sekvenci antikôdujiciho primeru za podminek vhodnych k produkci produktû prodlouzeni z kôdujiciho primeru. V nekterych provedenich zpûsob dâle zahrnuje poskytnuti sekvence DNA. V nekterych provedenich zpûsob dâle zahrnuje osetreni DNA sekvence bisulfitem pred kombinovânim. V nekterych provedenich inkubace zahrnuje PCR reakci, qPCR reakci, dPCR reakci, ddPCR reakci nebo sekvenacni reakci.
Dalsi aspekty a vyhody predklâdaného reseni budou odbornikûm v tomto oboru snadno zrejmé z nâsledujiciho podrobného popisu, kde jsou ukâzâna a popsâna pouze ilustrativni provedeni predklâdaného vynâlezu. Bude porozumeno, ze predklâdany vynâlez je schopen dalsich a odlisnych provedeni a jeho rûzné detaily je mozné modifikovat v rûznych zrejmych ohledech, aniz by doslo k odchyleni se od popisu. V souladu s tim je treba vykresy a popis povazovat za ilustrativni a nikoli za omezujici.
- 4 CZ 2024 - 197 A3
ZACLENENÉ ODKAZY
Vsechny publikace, patenty a patentové pfihlâsky uvedené v této specifikaci jsou sem zahrnuty odkazem ve stejném rozsahu, jako kdyby kazdâ jednotlivâ publikace, patent nebo patentova pfihlâska byla konkrétne a individuâlne oznacena jako zahrnutâ odkazem.
BAREVNÉ VYKRESY
Patentovÿ spis nebo pfihlaska obsahuje alespon jeden barevnÿ vÿkres. Kopie tohoto patentu nebo zvefejneni patentové pfihlâsky s barevnÿm vÿkresem (kresbami) poskytne Ùfad na vyzâdâni a po zaplaceni nezbytného poplatku.
STRUCNY POPIS VYKRESÙ
Nové znaky vynâlezu jsou konkrétne pfedlozeny v pfipojenÿch patentovÿch nârocich. Lepsiho porozumeni rysûm a vÿhodâm tohoto vynâlezu bude dosazeno odkazem na nâsledujici podrobnÿ popis, kterÿ uvâdi ilustrativni provedeni, ve kterÿch jsou vyuzity principy tohoto vynâlezu, a pfipojené vÿkresy:
OBRAZEK 1 (OBR. 1) zobrazuje pfiklad detekcniho testu citlivého na mutanty s pouzitim primerû vlâsenka se smyckou podle nekterÿch provedeni tohoto popisu. V tomto testu pfitomnost mutantniho zbytku v napf. genomové DNA (zvÿraznena) umoznuje prodlouzeni 3' hemisondové oblasti primeru vlâsenka se smyckou v prvni prodluzovaci reakci. Ve druhé fâzi tohoto testu je prodlouzenÿ primer vlâsenka se smyckou kombinovân s antikôdujicim primerem, kterÿ se vâze na 3'genomovou oblast 3' hemisondy ve druhé prodluzovaci reakci, coz umoznuje produkci druhého vlâkna, které odpovidâ primeru vlâsenka se smyckou obsahujicimu sekvenci antikôdujiciho primeru. Nakonec je produkt obsahujici sekvenci antikôdujiciho primeru kombinovân ve 3. prodluzovaci reakci s kôdujicim primerem pokrÿvajicim câst 5' hemisondy a kmenovÿch oblasti; zahrnuti sondy vâzajici sekvenci 5' tohoto pfimého primeru pfipadne umoznuje detekci tohoto produktu napf. qPCR.
OBRAZEK 2 (OBR. 2) zobrazuje navrzené podminky (A) a kfivky qPCR (B) pro optimalizacni experiment popsanÿ v pfikladu 1 pro detekci mutantu ACTN3. Spodni panel (B) ukazuje stopy pro amplifikaci sekvenci obsahujicich mutantni ACTN3 s ACTN3 mutantnim detekcnim primerem vlâsenka se smyckou; Horni panel (B) ukazuje graf RFU pro amplifikaci z mutantniho detekcniho primeru vlâsenka se smyckou pro reakce obsahujici homozygotni sekvence WT, homozygotni mutanty a heterozygotni ACTN3, coz ukazuje, ze tyto 3 genotypy lze rozlisit pomoci PCR.
Obr. 3 (obr. 3) zobrazuje navrzené podminky (A) a kfivky qPCR (B) pro optimalizacni experiment popsanÿ v pfikladu 1 pro detekci mutantu NRAS. Spodni panel (B) ukazuje stopy pro amplifikaci sekvenci obsahujicich mutantni NRAS s primerem vlâsenka se smyckou detekujicim mutanty NRAS; Horni panel (B) ukazuje graf RFU pro amplifikaci z mutantniho detekcniho primeru vlâsenka se smyckou pro reakce obsahujici homozygotni WT, homozygotni mutantni a heterozygotni sekvence ACTN3, coz ukazuje, ze tyto 3 genotypy lze rozlisit pomoci PCR.
Obr. 4 (obr. 4) zobrazuje vÿsledky experimentu navrzeného pro hodnoceni selektivity primerû detekujicich mutantni ACTN3 a NRAS detekujicich primery vlâsenka se smyckou. (A) znâzornuje nâvrh reakce pro testy selektivity. Horni panel (B) zobrazuje hodnoty Cq pro sondy znacené FAM (mutant) a sondy znacené HEX (divokého typu), mefené v rûznÿch pomerech cilû (mutant/WT), jak je popsâno v (A) pro test ACTN3; Spodni panel (B) znâzornuje hodnoty Cq pro sondy znacené FAM (mutantni) a HEX znacené (divokého typu), mefené pro rûzné pomery cilû, jak je popsâno v (A) pro test NRAS.
- 5 CZ 2024 - 197 A3
OBRAZEK 5 (OBR. 5) znâzornuje pfiklady digitâlnich PCR dat testû primera vlâsenka se smyckou detekujicich SNP ze dvou rûznÿch experimentû. Panely (A-C) znâzornuji vÿsledky experimentu navrzeného k posouzeni citlivosti testu primera vlasenka se smyckou detekujiciho mutant G12R KRAS na vzorcich s rûznÿmi pomery WT/mutant cilovÿ templât (mezi 0,05 % a 50 % pomer mutant k WT) na QIAcuity Digital PCR systém. Panel (A) znazomuje numerickâ data z experimentu; panel (B) znazomuje 1D amplitudové grafy a panel (C) znazomuje pfiklady 2D amplitudovÿch grafû ze stejného experimentu, coz dokazuje, ze jen velmi malo tecek odpovidajicich sprâvné kategorii se chybne segreguje. Panel (D) znazomuje vÿsledky ze sady experimentû navrzenÿch pro hodnoceni funkce G12R KRAS mutantniho stanoveni primeru vlasenka se smyckou na rûznÿch platformach dPCR. Zobrazené vÿsledky jsou 2D amplitudové grafy a zkrâcené tabulky numerickÿch vÿsledkû ze stejného testu provâdeného na vzorcich s 50% WT a 50% mutantni cilovou sablonou na tfech rûznÿch platformach dPCR: QX200 Droplet Digital PCR System, Naica System pro Crystal Digital PCR a QIAcuity Digital PCR systém
OBRAZEK 6 (OBR. 6) znazomuje 2D amplifikacni grafy pro pet rûznÿch testû detekujicich vlasenku se smyckou mutantû KRAS, vsechny za pouziti stejnÿch generickÿch sekvenci vlasenky a komplementârnich sond jako v pfikladu 7.
OBRAZEK 7 (OBR. 7) ukazuje 2D grafy amplitudy pro experiment znazornenÿ v tabulce 14 a pfikladu 7.
OBRAZEK 8 (OBR. 8) znazomuje navrh primerû a methylacni diskriminaci pro experiment popsanÿ v pfikladu 8 pracujici na sekvencich CORO6. Obrâzek 8 panel A ukazuje schéma methylacne detekujiciho 2T-primeru (CORO6-2T.M) navrzeného pro cileni na gen CORO6, s hemisondami v cerném textu (tucne/podtrzené) a sekvenci vlasenka se smyckou a rameny v tmave sedÿch carach, cilovâ sekvence cernÿm textem, rozsifenâ sekvence 2T-primeru (sedÿm textem), sekvence antikôdujiciho a kôdujiciho primeru (cernou kurzivou). Sonda (nezobrazena) se selektivne vaze na komplement sekvence kmenové smycky a ramena 2T-primeru. Cilovâ DNA mâ na pûvodnich cytosinovÿch mistech malâ pismena, kterâ se bisulfitovou ùpravou mohou zmenit na uracil (reprezentované na obrâzku a v syntetickÿch sekvencich DNA jako thyminy), zatimco methylovanâ CpG mista maji sedé zvÿrazneni (které v nemethylované DNA mohou bÿt zastoupen pomoci TG). Obrâzek 8 panel B ukazuje alelickou diskriminacni ùcinnost 2T-testu s pouzitim slozek z panelu A v qPCR na syntetickÿch gBlock sekvencich pfedstavujicich methylovanou DNA, nemethylovanou DNA, smisenou methylovanou/nemethylovanou DNA a kontrolu bez templâtu (NTC).
OBRAZEK 9 (OBR. 9) znâzornuje nâvrh primerû a methylacni diskriminaci pro experiment popsanÿ v pfikladu 9 pracujici na sekvencich FAM101A. Obrâzek 9 panel A ukazuje schéma 2Tprimeru nedetekujiciho metylaci pro detekci methylacniho stavu genu FAM101A (FAM101A2T.NM s hemisondami v cerném textu (tucne/podtrzené) a sekvenci vlâsenka se smyckou a rameny v tmave sedÿch carâch , cilovou sekvenci v cerném textu, sekvenci antikôdujiciho a kôdujiciho primeru (cernou kurzivou) Sonda (neni ukâzâna) se selektivne vâze na komplement sekvence vlâsenky se smyckou a ramena 2T-primeru byla modifikovâna takze pûvodni ,jedinâ“ cytosinovâ mista jsou reprezentovâna thyminem (protoze bisulfitové osetfeni mûze takové cytosiny pfemenit na uracily), zatimco pûvodni CpG mista maji sedé zvÿrazneni (které v nemethylovaném templâtu DNA a na obrâzku jsou reprezentovâny TG) Obrâzek 9 panel B ukazuje alelickou diskriminaci 2Ttestu v qPCR na syntetickÿch sekvencich gBlock pfedstavujicich methylovanou DNA, nemethylovanou DNA, smisenou methylovanou/nemethylovanou DNA a kontrolu bez templâtu (NTC). Pfi anealizacni teplote pfiblizne 55-62 °C, test funguje robustne a je provedeno jasné rozliseni rûznÿch typû templâtové DNA pfi zachovâni velmi nizkého falesne pozitivniho a na FAM kanâl (detekce methylované DNA) omezeného signâlu.
OBRAZEK 10 (OBR. 10) ukazuje vÿsledky bialelické diskriminace methylace CORO6 a FAM101A na beznÿch vzorcich. Obrâzek 10 panel A zobrazuje vÿsledky alelické diskriminace qPCR pfi analÿze methylacnich/nemethylacnich reprezentativnich gBlockû genû CORO6 a
- 6 CZ 2024 - 197 A3
FAM101A, které byly synteticky vyrobeny (M.gB - methylovanÿ cil; NM.gB - nemethylovanÿ cil; Mix.gB - 50 /50 mix M/NM-gBlocks) spolu se dvema unikâtmmi bisulfitove upravenÿmi (BST) vzorky DNA extrahovanÿmi z bilÿch krvinek (WBC) a srdecni tkane (40 ng DNA/reakce (pred BST)). Primery CORO6 a FAM101A byly zkonstruovâny jako v predchozich prikladech a qPCR pro detekci obou markerû byla provedena jako v predchozich prikladech. HEX fluorofor je signal pro methylovanou sekvenci CORO6 a nemethylovanou FAM101A. Jak predpovida zdokumentované chovani CORO6 a FAM101A, WBC vykazuji signal v kanalu FAM, zatimco srdce ukazuji signal v kanalu HEX i FAM, coz ukazuje, ze oba testy mohou detekovat srdecni DNA na pozadi bilÿch krvinek (tzv. hlavni zdroj DNA v cfDNA). Obrazek 10 panel B znâzomuje vÿsledky, kdyz vzorky popsané na obrâzku 10 panel A byly analyzovâny pomoci FAM101A 2Ttestu pomoci digitâlni PCR (QIAcuity, Qiagen) misto qPCR. Vzorky srdce vykazuji smisenÿ signâl (FAM/HEX), zatimco WBC vykazuji signâl pro methylovanou DNA (FAM). NTC vykazuji relativne vysokou fluorescenci pozadi v NTC, ale signâl je omezen na kanâl FAM a jako takovâ neni ohrozena detekce signâlu specifického pro srdce (HEX).
OBRAZEK 11 (OBR. 11) znâzomuje vÿsledky experimentu genotypizace nezpracované krve z prikladu 11. Levÿ panel na obrâzku 11 ukazuje duplicitni mereni qPCR u homozygotû divokého typu (nahore), homozygotnich mutantû (uprostred) a heterozygotû (dole). Pravÿ panel ukazuje graf spojujici namerenâ data na zâklade intenzity fluorescence jasne rozlisujici duplikâty dvou homoduplexû a heteroduplexû. Graf na pravém panelu jasne ukazuje, ze divokÿ typ, heterozygotni a mutantni mohou bÿt odliseni od plné surové krve bez dalsich krokû cisteni.
PODROBNY POPIS
Defmice
Zde pouzitâ terminologie slouzi pouze k popisu konkrétnich pripadû a neni zamÿslena jako omezujici. Jak se zde pouzivâ, tvary jednotného cisla „a“, „an“ a „the“ v pûvodnim textu v anglickém jazyce, maji zahrnovat také tvary v mnozném cisle, pokud z kontextu jasne nevyplÿvâ neco jiného. Krome toho, v rozsahu, v jakém jsou v podrobném popisu a/nebo nârocich pouzity vÿrazy „vcetne“, „zahrnuje“, „mit“, „mâ“, „s“ nebo jejich varianty, jsou takové vÿrazy zamÿsleny jako vcetne zpûsobem podobnÿm pojmu „zahrnujici“.
Vÿraz „pnblizne“ nebo „kolem“ obecne oznacuje mnozstvi, které je blizko receného mnozstvi o priblizne 10 %, 5 % nebo 1 %, vcetne jeho prirûstkû. Napriklad „priblizne“ nebo „kolem“ mûze znamenat rozsah zahrnujici konkrétni hodnotu a pohybujici se od 10 % pod touto konkrétni hodnotou az po 10 % nad touto konkrétni hodnotou.
Praxe nekterÿch zpûsobû zde popsanÿch vyuzivâ, pokud neni uvedeno jinak, techniky imunologie, biochemie, chemie, molekulârni biologie, mikrobiologie, bunecné biologie, genomiky a rekombinantni DNA. Viz napriklad Sambrook a Green, Molecular Cloning: A Laboratory Manuâl, 4. vydâni (2012); série Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. eds.); série Methods In Enzymology (Academic Press, Inc.), PCR 2: A Practical Approach (M. J. MacPherson, B. D. Hames a G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow a Lane, ed. (1988) Protilâtky, laboratorni prirucka a kultura zivocisnÿch bunek: prirucka zâkladni techniky a specializovanÿch aplikaci, 6. vydâni (R.I. Freshney, ed. (2010)) (které je zde celé zahrnuto odkazem).
Terminy polynukleotid, nukleovâ kyselina a oligonukleotid, jak se zde pouzivaji, obecne oznacuji polymerni formu nukleotidû jakékoli délky, bud deoxyribonukleotidy nebo ribonukleotidy nebo jejich analogy. Polynukleotidy mohou mit jakoukoli trojrozmernou strukturu a mohou vykonâvat jakoukoli funkci, znâmou nebo neznâmou. Nâsleduji neomezujici priklady polynukleotidû: kôdujici nebo nekôdujici oblasti genu nebo genového fragmentu, intergenovâ DNA, lokusy (lokus) definované z vazebné analÿzy, exony, introny, messenger RNA (mRNA), transferovâ RNA, ribozomâlni RNA , krâtkâ interferujici RNA (siRNA), krâtkâ vlâsenkovâ RNA (shRNA), mikro-RNA (miRNA), malâ nukleolârni RNA, ribozymy, cDNA, rekombinantni
- 7 CZ 2024 - 197 A3 polynukleotidy, rozvetvené polynukleotidy, plazmidy, vektory, izolovanâ DNA libovolné sekvence, izolovana RNA jakâkoli sekvence, sondy nukleové kyseliny, adaptéry a primery. Polynukleotid mûze obsahovat modifikované nukleotidy, jako jsou methylované nukleotidy a analogy nukleotidû. Pokud jsou pntomny, modifikace nukleotidové struktury mohou bÿt provedeny pred nebo po sestaveni polymeru. Sekvence nukleotidû mûze bÿt prerusena nenukleotidovÿmi slozkami. Polynukleotid mûze bÿt dale modifikovan po polymeraci, jako napriklad konjugaci se znacici slozkou, znackou, reaktivni skupinou nebo vazebnÿm partnerem. Polynukleotidové sekvence, pokud jsou poskytnuty, jsou uvedeny ve smeru 5' ke 3', pokud neni uvedeno jinak.
Hybridizuje a annealing, jak se zde pouzivâ, obecne oznacuje reakci, ve které jeden nebo vice polynukleotidû interaguje za vzniku komplexu, kterÿ je stabilizovan vodikovou vazbou mezi bazemi nukleotidovÿch zbytkû. K vodikové vazbe mûze dojit Watsonovÿm Crickovÿm pârovanim bâzi, Hoogsteinovou vazbou nebo jakÿmkoli jinÿm sekvencne citlivÿm nebo specifickÿm zpûsobem. Komplex mûze obsahovat dve vlakna tvorici duplexni strukturu, tri nebo vice vlaken tvoricich viceretezcovÿ komplex, jediné autohybridizujici vlakno nebo jakoukoli jejich kombinaci. Hybridizacni reakce mûze predstavovat krok v rozsahlejsim procesu, jako je iniciace PCR nebo enzymatické stepeni polynukleotidu ribozymem. O prvni sekvenci, kterâ mûze bÿt stabilizovâna pomoci vodikovÿch vazeb s bâzemi nukleotidovÿch zbytkû druhé sekvence, lze obecne rici, ze je hybridizovatelnâ s druhou sekvenci. V takovém pripade o druhé sekvenci lze také rici, ze je hybridizovatelnâ s prvni sekvenci.
Terminy komplement, komplementy, komplementârni a komplementarita, jak se zde pouzivaji, obecne oznacuji sekvenci, kterâ plne doplnuje danou sekvenci a je s ni hybridizovatelnâ. V nekterÿch pripadech je prvni sekvence, kterâ je hybridizovatelnâ s druhou sekvenci nebo sadou druhÿch sekvenci, specificky nebo selektivne hybridizovatelnâ s druhou sekvenci nebo sadou druhÿch sekvenci, takze se pouzivâ hybridizace s druhou sekvenci nebo sadou druhÿch sekvenci. Hybridizovatelné sekvence mohou sdilet urcitÿ stupen komplementarity sekvenci pres celou nebo câst jejich prislusnÿch délek, jako je komplementarita mezi 25 % az 100 %, vcetne alespon priblizne 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 % a 100% sekvencni komplementarita.
Jak se zde pouzivâ, termin homologie obecne odkazuje na nukleotid se sekvence, kterâ je homologni s referencni nukleotidovou sekvenci. Stupen homologie a komplementarity se mûze lisit v souladu s danou aplikaci a mûze bÿt vice nez 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, nebo vice nez 95 %.
Jak se zde pouzivâ, vÿrazy „amplifikovat“, „amplifikovat“, „amplifikovat“, „amplifikace“ a „amplikon“ obecne oznacuji jakÿkoli zpûsob replikace nukleové kyseliny s pouzitim polymerâzy zâvislé na primeru a/nebo produkty techto procesû. V nekterÿch pripadech je amplifikace uskutecnena pomoci PCR s pouzitim pâru primerû obsahujicich prvni a druhÿ primer, jak je popsâno vÿse. Amplifikované produkty mohou bÿt podrobeny subsekvencnim analÿzâm, vcetne, aniz by byl vÿcet omezujici, analÿzy krivky tâni, sekvenovâni nukleotidû, testu polymorfismu jednovlâknové konformace, alelove specifické oligonukleotidové hybridizace, analÿzy Southern blot a stepeni restrikcni endonukleâzou.
Amplifikacni produkty mohou bÿt detekovâny pouzitim sondy. Jak se zde pouzivâ, termin sonda obecne oznacuje polynukleotid, kterÿ nese detekovatelnÿ clen a mâ komplementaritu k cilové nukleové kyseline, takze je schopen hybridizovat s uvedenÿm cilem a bÿt detekovân uvedenÿm detekovatelnÿm clenem. V urcitÿch provedenich mûze sonda zahrnovat Watsonovy-Crickovy bâze nebo modifikované bâze. Modifikované bâze zahrnuji, ale nejsou omezeny na, AEGIS bâze popsané napr. v U.S. c. 5,432,272; 5,965,364; a 6,001,983, z nichz kazdÿ je zde celÿ zahrnut jako odkaz. V urcitÿch aspektech jsou bâze spojeny prirozenou fosfodiesterovou vazbou nebo odlisnou chemickou vazbou. Rûzné chemické vazby zahrnuji, ale nejsou omezeny na, peptidovou vazbu, LNA vazbu nebo fosforothioâtovou vazbu.
- 8 CZ 2024 - 197 A3
Amplifikace mùze bÿt provedena jakÿmkoliv vhodnÿm zpùsobem. Nukleové kyseliny mohou bÿt amplifikovâny polymerâzovou retezovou reakci (PCR), jak je popsâno napriklad v U.S. c. 5,928,907 a 6,015,674, z nichz kazdÿ je zde uveden jako odkaz pro jakÿkoli ùcel. Jiné zpùsoby amplifikace nukleové kyseliny mohou zahrnovat napriklad ligâzovou retezovou reakci, test ligace oligonukleotidù a test hybridizace, jak je podrobneji popsano v U.S. c. 5,928,907 a 6,015,674, z nichz kazdÿ je zde zahrnut odkazem ve své ùplnosti. Metody mohou zahrnovat optické detekcni systémy v reâlném case popsané podrobneji napriklad v U.S. c. 5,928,907 a 6,015,674, které jsou zde zahrnuty odkazem. Dalsi zpùsoby amplifikace, které lze pouzit podle nekterÿch zpùsobù podle tohoto vynâlezu, zahrnuji zpùsoby popsané v U.S. c. 5,242,794; 5,494,810; 4,988,617; a 6,582,938, z nichz kazdÿ je zde zahrnut jako celek.
Priklady provedeni
V nekterÿch aspektech predklâdanÿ popis poskytuje zpùsob zpracovâni sekvence nukleové kyseliny. V nekterÿch pripadech mâ sekvence nebo je v podezreni, ze mâ sekvencni variaci vzhledem k sekvenci divokého typu. V nekterÿch pripadech sekvence nukleové kyseliny obsahuje DNA. Sekvence nukleové kyseliny mùze obsahovat v podstate jakÿkoli typ sekvence. V nekterÿch pripadech sekvence, kterâ mâ nebo je v podezreni, ze mâ mutaci obsahujici dvouvlâknovou DNA, jako je genomovâ DNA. V nekterÿch pripadech sekvence kterâ mâ nebo je v podezreni, ze mâ mutaci obsahuje genovou oblast, jako je otevrenÿ cteci râmec, exon, intron nebo sestrihové spojeni. V nekterÿch pripadech sekvence kterâ mâ nebo je v podezreni, ze mâ obsahuje intergenovou oblast, jako je oblast promotoru, zesilovace nebo izolâtoru. V nekterÿch pripadech sekvence, kterâ mâ nebo je v podezreni, ze mâ obsahuje oblast konkrétniho genu, jako je oblast genu RAS (napr. KRAS, NRAS, HRAS) nebo oblast genu ACTN3.
V nekterÿch provedenich zpùsob zahrnuje: smichâni v reakcni smesi vhodné pro zpracovâni sekvence nukleové kyseliny: (i) sekvence nukleové kyseliny, kde sekvence nukleové kyseliny obsahuje neshodu alespon jednoho nukleotidu vzhledem k divokému posloupnost typù; a (ii) primer vlâsenka se smyckou. V nekterÿch provedenich zpracovâni zahrnuje amplifikaci a zahrnuje pndâni pomocnÿch enzymù (napr. polymerâz), dNTP, pufrù nebo chemickÿch stabilizâtorù (napr. DMSO, DTT, mannitol, betain) nezbytnÿch k provedeni amplifikacni reakce. V nekterÿch provedenich primer vlâsenka se smyckou obsahuje: 5' hemisondovou sekvenci konfigurovanou tak, aby hybridizovala s komplementârni prvni koncovou oblasti sekvence nukleové kyseliny; se sekvenci vlâsenky se smyckou; a s 3' hemisondovou sekvenci. V nekterÿch provedenich je 3' hemisondovâ sekvence konfigurovâna tak, aby hybridizovala s druhou koncovou oblasti sekvence nukleové kyseliny. V nekterÿch provedenich 3' terminâlni câst 3' hemisondovâ sekvence obsahuje nukleotid komplementârni k neshodâm v pârovâni, ale ne komplementârni k sekvenci divokého typu. V nekterÿch provedenich zpùsob dâle zahrnuje inkubaci reakcni smesi za podminek vhodnÿch k prodlouzeni produktu obsahujiciho 3' hemisondové sekvenci. V nekterÿch provedenich zpùsob dâle zahrnuje kombinovâni v reakcni smesi vhodné pro zpracovâni produktu obsahujiciho 3' hemisondovou sekvenci: antikôdujici primer konfigurovanÿ tak, aby hybridizoval s genomovou oblasti 3' z nesprâvného pârovâni. V nekterÿch provedenich jsou v uvedené reakcni smesi uvedenÿ antikôdujici a kôdujici primer v prebytku nebo jsou v alespon priblizne 20nâsobne, v alespon priblizne 50nâsobne, v alespon priblizne 100nâsobne, v alespon priblizne 200nâsobne, v alespon priblizne 500nâsobne, v alespon priblizne 1000nâsobne vyssi koncentraci, nez je koncentrace uvedeného dvoustranného primeru. V nekterÿch provedenich je v uvedené reakcni smesi koncentrace uvedeného dvoustranného primeru vyssi nez nebo je v alespon priblizne 20nâsobne, v alespon priblizne 50nâsobne, v alespon priblizne 100nâsobne, v alespon priblizne 200nâsobne, v alespon priblizne 500nâsobne, v alespon priblizne 1000nâsobne vyssi koncentraci, nez je koncentrace uvedené sekvence DNA. V nekterÿch provedenich mâ antikôdujici primer Tm alespon priblizne 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66 nebo 68 stupnù Celsia. V nekterÿch provedenich mâ antikôdujici primer Tm nejvÿse priblizne 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68 nebo 70 stupnù Celsia. V nekterÿch provedenich mâantikôdujici primer Tm priblizne 50 az priblizne 70 stupnù Celsia. V nekterÿch provedenich zpùsob dâle zahrnuje inkubaci reakcni smesi vhodné pro zpracovâni
- 9 CZ 2024 - 197 A3 produktu obsahujiciho 3' hemisondovou sekvenci za podminek vhodnÿch pro produkci produktû prodlouzeni z antikôdujiciho primeru. V nekterÿch provedenich zpûsob dale zahrnuje smichani v reakcni smesi vhodné pro zpracovani produktu obsahujiciho sekvenci antikôdujiciho primeru: produktu obsahujiciho sekvenci antikôdujicicho primeru; a kôdujici primer nakonfigurovanÿ tak, aby hybridizoval s: (i) alespon casti sekvence 5' hemisondové sekvence; nebo (ii) alespon cast kmene ze sekvence vlasenky se smyckou. V nekterÿch provedenich kôdujici primer obsahuje alespon priblizne 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 nebo 29 nukleotidû na nejvice asi 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 nebo 30 nukleotidû komplementarnich k 5' hemisondové sekvenci. V nekterÿch provedenich kôdujici primer obsahuje alespon priblizne 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 nebo 34 nanejvÿs asi 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 nebo 35 nukleotidû komplementarnich ke stopce sekvence vlasenky se smyckou 3' k nukleotidûm komplementarnim k 5' hemisondové sekvence. V nekterÿch provedenich ma kôdujici primer Tm alespon priblizne 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66 nebo 68 stupnû Celsia. V nekterÿch provedenich ma kôdujici primer Tm nejvÿse priblizne 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68 nebo 70 stupnû Celsia. V nekterÿch provedenich ma kôdujici primer Tm priblizne 50 az priblizne 70 stupnû Celsia. V nekterÿch provedenich zpûsob dale zahrnuje inkubaci reakcm smesi vhodné pro zpracovani produktu obsahujiciho sekvenci antikôdujiciho primeru za podminek vhodnÿch k produkci produktû prodlouzeni z kôdujiciho primeru. V nekterÿch provedenich primer vlasenky se smyckou amplifikuje mutantni polynukleotidovou sekvenci alespon priblizne 10krat, alespon priblizne 100krat, alespon priblizne 1000krat, alespon priblizne 10 000krat, alespon priblizne 100 000krat, nebo alespon priblizne 1 000 000krat prednostne oproti polynukleotidové sekvenci divokého typu. V nekterÿch provedenich mutantni polynukleotidova sekvence nebo polynukleotidova sekvence divokého typu obsahuje genomovou DNA. V nekterÿch provedenich 5' hemisondové sekvence obsahuje alespon priblizne 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 nebo 22 az nanejvÿs priblizne 8 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 nebo 22 nukleotidû na délku. V nekterÿch provedenich 3' hemisondové sekvence obsahuje alespon priblizne 3, 4, 5, 6, 7 nebo 8 nukleotidû az nanejvÿs priblizne 4, 5, 6, 7, 8 nebo 9 nukleotidû na délku. V nekterÿch provedenich ma 3' hemisondova sekvence Tm alespon priblizne 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 nebo 39 stupnû Celsia az nanejvÿs priblizne 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 nebo 40 stupnû Celsia. V nekterÿch provedenich ma 5'hemisondova sekvence Tm alespon priblizne 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 nebo 74 stupnû Celsia do nejvice asi 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74 nebo 75 stupnû Celsia. V nekterÿch provedenich sekvence vlasenky se smyckou obsahuje priblizne 5, 8, 10, 12 nebo 15 nukleotidû na délku nebo vice. V nekterÿch provedenich je sekvence vlasenky se smyckou nakonfigurovana tak, aby mela Tm alespon priblizne 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71 nebo 72 stupnû Celsia az nanejvÿs priblizne 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71 nebo 75 stupnû Celsia. V nekterÿch provedenich smycka sekvence vlasenky se smyckou obsahuje alespon priblizne 1 az alespon priblizne 20 nukleotidû na délku. V nekterÿch provedenich smycka sekvence vlasenky se smyckou obsahuje barkôd. V nekterÿch provedenich uvedena reakcni smes vhodna pro zpracovani uvedeného produktu obsahujiciho sekvenci antikôdujiciho primeru za podminek vhodnÿch k produkci produktû prodlouzeni z uvedeného kôdujiciho primeru dale obsahuje oligonukleotidovou sondu obsahujici detekovatelnou skupinu, pricemz uvedena oligonukleotidova sonda je konfigurovana tak, aby hybridizovala s komplementem alespon cast uvedeného primeru vlasenky se smyckou. V nekterÿch provedenich uvedena oligonukleotidova sonda obsahuje sekvenci homologni s alespon casti uvedeného primeru vlasenka se smyckou. V nekterÿch provedenich uvedena alespon cast uvedeného primeru vlasenka se smyckou obsahuje alespon cast uvedené vlasenky se smyckou. V nekterÿch provedenich uvedena alespon cast uvedené sekvence vlasenky se smyckou obsahuje alespon cast sekvence smycky v uvedené sekvenci vlasenky se smyckou. V nekterÿch provedenich uvedena detekovatelna skupina obsahuje fluorofor. V nekterÿch provedenich je fluoroforem 5'-fluorofor. V nekterÿch provedenich uvedena oligonukleotidova sonda obsahujici uvedenou detekovatelnou skupinu dale obsahuje zhasec. V nekterÿch provedenich uvedenÿm zhasecem je 3' zhasec. V nekterÿch provedenich je uvedenÿm inhibitorem vnitrni zhasec (napr. pripojenÿ k vnitrnimu zbytku nebo nukleotidu uvedené oligonukleotidové sondy). V nekterÿch provedenich uvedena sekvence vlasenky se smyckou obsahuje nespravné pârovâni ve stonku uvedené sekvence vlasenky
- 10 CZ 2024 - 197 A3 se smyckou. V nekterém provedeni uvedenâ sekvence vlâsenky se smyckou obsahuje alespon 1, alespon 2, alespon 3, alespon 4, alespon 5 nebo alespon 6 neshod v pârovâni ve kmeni uvedené sekvence vlasenky se smyckou. V nekterych pripadech je stopka uvedené vlasenky se smyckou je konfigurovâna tak, aby mel Tm mezi 50 a 70 stupni Celsia. V nekterych pripadech uvedena kmenova smycka obsahuje alespon priblizne 40 az alespon priblizne 70 nukleotidû. V nekterych provedenich primeru vlasenky se smyckou, kôdujici primer nebo antikôdujici primer obsahuje kteroukoli ze SEKV ID C: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 13, 14, 15, 16, 19, 20, 23, 24, 27, 28, 29, 30, 33, 34, 35, 36, 39, 40, 41, 42, 45, 46, 47, 48, 51, 52, 53, 54, 57, 58, 59, 60, 61, 64, 65, 66, 67, 68, 71 nebo 72.
V nekterych pripadech uvedeny zpûsob zahrnuje kombinovani v uvedené reakcni smesi vhodné pro zpracovani sekvence nukleové kyseliny mnozstvi rûznych kmenû - primery vlasenky se smyckou obsahujici 5' nebo 3' oblasti se specificitou pro rûzné sekvence DNA. V nekterych pripadech, pri pouziti vetsiho poctu rûznych primerû vlasenky se smyckou obsahujicich 5' nebo 3' oblasti se specificitou pro rûzné sekvence DNA, mûze takové slozeni umoznit detekci vice rûznych sekvenci DNA bez jedinecnych molekularnich identifikatorû nebo UMI. (napr. detekci rûznych délek vlasenek se smyckou zaclenenych do primerû vlasenky se smyckou).
V nekterych aspektech predkladany popis poskytuje soupravu pro zpracovani sekvence nukleové kyseliny, kterâ mâ nebo je v podezreni z toho, ze mâ mutaci ve vztahu k sekvenci divokého typu. V nekterych provedenich souprava obsahuje (a) primer vlâsenky se smyckou, ktery obsahuje: (i) 5' hemisondovou sekvenci nakonfigurovanou tak, aby hybridizovala s komplementârni prvni koncovou oblasti sekvence nukleové kyseliny; (ii) sekvenci vlâsenky se smyckou; a (iii) 3' hemisondovou sekvenci nakonfigurovanou tak, aby hybridizovala s druhou koncovou oblasti sekvence nukleové kyseliny, kde 3' koncovâ câst 3' hemisondové sekvence obsahuje nukleotid komplementârni k neshodâm v pârovâni, ale ne komplementârni k sekvenci divokého typu; (b) kôdujici primer konfigurovany pro hybridizaci s: (i) alespon câsti 5' hemisondové sekvence; a (ii) alespon câsti stopky sekvence vlâsenky se smyckou; a (c) antikôdujici primer konfigurovany tak, aby hybridizoval s genomovou oblasti 3' z neshod v pârovâni. V nekterych provedenich souprava dâle obsahuje oligonukleotidovou sondu obsahujici detekovatelnou skupinu, pricemz uvedeny oligonukleotid je konfigurovân tak, aby hybridizoval s alespon câsti uvedeného primeru vlâsenky se smyckou. V nekterych provedenich uvedenâ alespon câst uvedeného primeru vlâsenky se smyckou obsahuje alespon câst uvedené sekvence vlâsenky se smyckou. V nekterych provedenich uvedenâ alespon câst uvedené sekvence vlâsenky se smyckou obsahuje alespon câst sekvence smycky v uvedené sekvenci vlâsenky se smyckou. V nekterych provedenich uvedenâ detekovatelnâ skupina obsahuje 5' fluorofor. V nekterych provedenich uvedenâ oligonukleotidovâ sonda obsahujici uvedenou detekovatelnou skupinu dâle obsahuje zhâsec. V nekterych provedenich uvedenym zhâsecem je 3' zhâsec. V nekterych provedenich uvedenym inhibitorem je vnitrni inhibitor (napr. spojeny s vnitrnim zbytkem nebo nukleotidem uvedené oligonukleotidové sondy). V nekterych provedenich uvedenâ sekvence vlâsenky se smyckou obsahuje neshodu v pârovâni ve stopce uvedené sekvence vlâsenky se smyckou. V nekterém provedeni uvedenâ sekvence vlâsenky se smyckou obsahuje alespon 1, alespon 2, alespon 3, alespon 4, alespon 5 nebo alespon 6 neshod v pârovâni ve stopce uvedené sekvence vlâsenky se smyckou. V nekterych pripadech je stopka uvedené vlâsenky se smyckou konfigurovâna tak, aby mela Tm alespon priblizne 50 az alespon priblizne 70 stupnû Celsia. V nekterych pripadech uvedenâ vlâsenky se smyckou obsahuje alespon priblizne 40 az alespon priblizne 70 nukleotidû. V nekterych pripadech uvedenâ souprava obsahuje mnozstvi rûznych primerû vlâsenky se smyckou obsahujicich 5' nebo 3' oblasti se specificitou pro rûzné sekvence DNA. V nekterych pripadech pri pouziti vetsiho poctu rûznych primerû vlâsenky se smyckou obsahujicich 5' nebo 3' oblasti se specificitou pro rûzné sekvence DNA, mûze takové slozeni umoznit detekci vice rûznych sekvenci DNA bez jedinecnych molekulârnich identifikâtorû nebo UMI. (napr. detekci rûznych délek vlâsenek se smyckou zaclenenych do primerû vlâsenky se smyckou). V nekterych provedenich mâ antikôdujici primer Tm priblizne 50 az 70 stupnû Celsia. V nekterych provedenich kôdujici primer obsahuje alespon priblizne 12 az priblizne 30 nukleotidû komplementârnich k sekvenci 5' hemisondy. V nekterych provedenich kôdujici primer obsahuje alespon priblizne 9 az priblizne 35 nukleotidû
- 11 CZ 2024 - 197 A3 komplementarnich ke stopce vlasenky se smyckou sekvence 3' k nukleotidùm komplementarnim k 5' hemisondové sekvenci. V nekterych provedenich ma kôdujici primer Tm priblizne 50 az priblizne 70 stupnù Celsia. V nekterych provedenich primer vlasenky se smyckou amplifikuje mutantni polynukleotidovou sekvenci alespon priblizne 10krat, alespon priblizne 100krat, alespon priblizne 1000krat, alespon priblizne 10 000krat, alespon priblizne 100 000krat, nebo alespon priblizne 1 000 000krat prednostne oproti polynukleotidové sekvenci divokého typu. V nekterych provedenich obsahuje 5' hemisondova sekvence délku priblizne 7 az priblizne 22 nukleotidù. V nekterych provedenich obsahuje 3'hemisondova sekvence délku priblizne 3 az priblizne 9 nukleotidù. V nekterych provedenich ma 3' hemisondova sekvence Tm priblizne 30-40 stupnù nebo 5' hemisondova sekvence ma Tm priblizne 60 az 75 stupnù. V nekterych provedenich sekvence vlasenky se smyckou obsahuje délku priblizne 15 nukleotidù nebo vice. V nekterych provedenich je sekvence vlasenky se smyckou konfigurovana tak, aby mela Tm priblizne 55 az priblizne 75 stupnù Celsia. V nekterych provedenich smycka sekvence vlasenky se smyckou obsahuje alespon priblizne 1 az alespon priblizne 20 nukleotidù na délku. V nekterych provedenich smycka sekvence vlasenky se smyckou obsahuje barkôd. V nekterych provedenich primer vlasenky se smyckou, kôdujici primer nebo antikôdujici primer obsahuje kteroukoli ze SEKV ID C: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 13, 14, 15, 16, 19, 20, 23, 24, 27, 28, 29, 30, 33, 34, 35, 36, 39, 40, 41, 42, 45, 46, 47, 48, 51, 52, 53, 54, 57, 58, 59, 60, 61, 64, 65, 66, 67, 68, 71 nebo 72.
V nekterych aspektech predkladany popis poskytuje kompozici pro zpracovani sekvence nukleové kyseliny, ktera ma nebo je v podezreni z toho, ze ma mutaci vzhledem k sekvenci divokého typu, obsahujici: (a) primer vlasenky se smyckou;, ktery obsahuje: (i) 5' hemisondovou sekvenci konfigurovanou tak, aby hybridizovala s komplementarni prvni koncovou oblasti sekvence nukleové kyseliny; (ii) sekvenci vlasenky se smyckou; a (iii) 3' hemisondovou sekvenci nakonfigurovanou tak, aby hybridizovala s druhou koncovou oblasti sekvence nukleové kyseliny; (b) kôdujici primer konfigurovany pro hybridizaci s: (i) alespon casti 5' hemisondové sekvence; a (ii) alespon cast stopky sekvence vlasenky se smyckou; a (c) antikôdujici primer nakonfigurovany tak, aby hybridizoval s genomovou oblasti 3' od neshody, pricemz koncentrace kôdujiciho primeru nebo koncentrace antikôdujiciho primeru jsou alespon 10krat vyssi nez koncentrace primeru vlasenky se smyckou. V nekterych provedenich uvedena kompozice dale obsahuje oligonukleotidovou sondu obsahujici detekovatelnou skupinu, pricemz uvedeny oligonukleotid je konfigurovan tak, aby hybridizoval s alespon câsti uvedeného primeru vlasenky se smyckou. V nekterych provedenich uvedena alespon cast uvedeného primeru vlasenky se smyckou obsahuje alespon cast uvedené sekvence vlasenky se smyckou. V nekterych provedenich uvedena alespon cast uvedené sekvence vlasenky se smyckou obsahuje alespon cast sekvence smycky v uvedené sekvenci vlasenky se smyckou. V nekterych provedenich uvedena detekovatelna skupina obsahuje 5' fluorofor. V nekterych provedenich uvedena oligonukleotidova sonda obsahujici uvedenou detekovatelnou skupinu dale obsahuje zhasec. V nekterych provedenich je uvedenym zhasecem je 3' zhasec. V nekterych provedenich je uvedenym inhibitorem vnitrni inhibitor (napr. spojeny s vnitrnim zbytkem nebo nukleotidem uvedené oligonukleotidové sondy). V nekterych provedenich uvedena sekvence vlasenky se smyckou obsahuje neshody v pârovâni ve stopce uvedené sekvence vlasenky se smyckou. V nekterém provedeni uvedena sekvence vlasenky se smyckou obsahuje alespon 1, alespon 2, alespon 3, alespon 4, alespon 5 nebo alespon 6 neshod v pârovâni ve stopce uvedené sekvence vlasenky se smyckou. V nekterych pripadech je stopka uvedené vlasenky se smyckou konfigurovana tak, aby mela Tm mezi 50 a 70 stupni Celsia. V nekterych pripadech uvedena vlasenka se smyckou obsahuje alespon priblizne 40 az alespon priblizne 70 nukleotidù. V nekterych pripadech uvedena kompozice obsahuje velké mnozstvi rùznych primerù vlasenky se smyckou obsahujicich 5' nebo 3' oblasti se specificitou pro rùzné sekvence DNA. V nekterych pripadech, pri pouziti vetsiho poctu rùznych primerù vlasenky se smyckou obsahujicich 5' nebo 3' oblasti se specificitou pro rùzné sekvence DNA, mùze takové slozeni umoznit detekci vice rùznych sekvenci DNA bez jedinecnych molekularnich identifikâtorù nebo UMI. (napr. detekci rùznych délek vlasenek se smyckou zaclenenych do primerù vlasenek se smyckou). V nekterych provedenich jsou koncentrace kôdujiciho primeru nebo koncentrace antikôdujiciho primeru alespon priblizne 20nasobne, alespon priblizne 50nasobne, alespon priblizne 100nasobne, alespon priblizne 200nasobne, alespon priblizne 500nasobne, alespon asi 1000nasobne vyssi nez je
- 12 CZ 2024- 197 A3 koncentrace priment vlâsenky se smyëkou. V nekterÿch provedenich obsahuje 3' terminalni cast 3' hemisondové sekvence nukleotid komplementami k neshodâm v pârovâni, ale ne komplementami k sekvenci divokého typu. V nekterÿch provedenich ma antikodujici primer Tm pfibliznë 50 az 70 stupnù Celsia. V nekterÿch provedenich kodujici primer obsahuje alespon pfiblizne 12 az pfiblizne 30 nukleotidù komplementamich k sekvenci 5' hemisondy. V nekterÿch provedenich kodujici primer obsahuje alespon pfiblizne 9 az pfiblizne 35 nukleotidù komplementamich ke stopce sekvence vlâsenky se smyckou 3' k nukleotidùm komplementâmim k 5' hemisondové sekvenci. V nekterÿch provedenich mâ kodujici primer Tm pfiblizne 50 az pfiblizne 70 stupnù Celsia. V nekterÿch provedenich primer vlâsenky se smyckou amplifikuje mutantni polynukleotidovou sekvenci alespon pfiblizne lOkrât, alespon pfiblizne lOOkrât, alespon pfiblizne lOOOkrât, alespon pfiblizne 10 OOOkrât, alespon pfiblizne 100 OOOkrât, nebo alespon pfiblizne 1 000 OOOkrât pfednostnë oproti polynukleotidové sekvenci divokého typu. V nëkterÿch provedenich obsahuje 5' hemisondovâ sekvence délku pfibliznë 7 az pfibliznë 22 nukleotidù. V nëkterÿch provedenich obsahuje 3' hemisondovâ sekvence délku pfibliznë 3 az pfibliznë 9 nukleotidù. V nëkterÿch provedenich mâ 3' hemisondovâ sekvence Tm pfibliznë 30 az 40 stupnù nebo 5' hemisondovâ sekvence mâ Tm pfibliznë 60 az 75 stupnù. V nëkterÿch provedenich sekvence vlâsenky se smyëkou obsahuje délku pfibliznë 15 nukleotidù nebo vice. V nëkterÿch provedenich je sekvence vlâsenky se smyëkou konfigurovâna tak, aby mêla Tm pfibliznë 55 az pfibliznë 75 stupnù Celsia. V nëkterÿch provedenich smyëka sekvence vlâsenky se smyëkou obsahuje alespon pfibliznë 1 az alespon pfibliznë 20 nukleotidù na délku. V nëkterÿch provedenich smyëka sekvence vlâsenky se smyëkou obsahuje barkôd. V nëkterÿch provedenich primer vlâsenky se smyëkou, kodujici primer nebo antikodujici primer obsahuje kteroukoli ze SEKV ID C: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 13, 14, 15, 16, 19, 20, 23, 24, 27, 28, 29, 30, 33, 34, 35, 36, 39, 40, 41, 42, 45, 46, 47, 48, 51, 52, 53, 54, 57, 58, 59, 60, 61, 64, 65, 66, 67, 68, 71 nebo 728 nebo kterâkoli ze sekvenci popsanÿch v tabuice 1.
Tabulka 1: Sekvence zde popsanÿch slozek primeru nebo oligonukleotidu
| SEKV ID C: | NÀZEV | SEKVENCE (DNA) |
| 1 | 2T- ACTN3_Mut_052 | CAGCCTCGGGCAGTGTTGCCTTTTACGAAATGTTGGTACAGTGA GTACCAATATGAGGACCATTCGCTCTCA |
| 2 | 2T- ACTN3_WT_052 | CAGCCTCGGGCAGTGTTGCCTTTTACGAAATGCAGGTACAGTTG GTACCTGTCTCCACCTCGCTCTCG |
| 3 | 2T_ACTN3_Rv_0 3 | TGACAGCGCACGATCA |
| 4 | 2T_ACTN3_Fw_ 03 | CAGTGTTGCCTTTTACGAAAT |
| 5 | 2T- NRAS Mut 01 | GAGTACAGTGCCATGAGAGACTTACGAAATGCAGGTACAGTTGG TACCTGTCTCCACCAGCTGGACG |
| 6 | 2T- NRAS WT 01 | GAGTACAGTGCCATGAGAGACTTACGAAATGTTGGTACAGTGAG TACCAATATGAGGACCATCAGCTGGACA |
| 7 | 2T_NRAS_Rv_01 | GCAAATACACAGAGGAAGCC |
- 13 CZ 2024- 197 A3
| SEKV IDC: | NÀZEV | SEKVENCE (DNA) |
| 8 | 2TNRAS F wO 1 | TGCCATGAGAGACTTACGAAAT |
| 9 | 2T WT primer (pfiklad 3) | CTCCAACTACCACAAGTTTATTTACGAAATGTTGGTACAGTGAGT ACCAATATGAGGACCATCTACGCCACC |
| 10 | 2T Mut primer (pfiklad 3) | CTCCAACTACCACAAGTTTATTTACGAAATGCAGGTACAGTTGGT ACCTGTCTCCACCTACGCCACG |
| 11 | WT sonda (pfiklad 3) | TTGGTACAGTGAGTACCAATATGAGGACCATC |
| 12 | Mut sonda (pfiklad 3) | CAGGTACAGTTGGTACCTGTCTCCACC |
| 13 | Kodujici primer (pfiklad 3) | CCTGCTGAAAATGACTGAA |
| 14 | Antikddujicl primer (pfiklad 3) | CCAACTACCACAAGTTTATTTAC |
| 15 | 2T WT primer (pfiklad 4) | CTCCAACTACCACAAGTTTATTTACGAAATGTTGGTACAGTGAGT ACCAATATGAGGACCATCTACGCCACC |
| 16 | 2T Mut primer (KRAS 29T) (pfiklad 4) | CTCCAACTACCACAAGTTTATTTACGAAATGCAGGTACAGTTGGT ACCTGTCTCCACCTACGCCACA |
| 17 | WT sonda (pfiklad 4) | TTGGTACAGTGAGTACCAATATGAGGACCATC |
| 18 | Mut sonda (KRAS 29T) (pfiklad 4) | CAGGTACAGTTGGTACCTGTCTCCACC |
| 19 | Kodujici primer (pfiklad 4) | CCTGCTGAAAATGACTGAA |
| SEKV ID C: | NÀZEV | SEKVENCE (DNA) |
| 20 | Antikodujici primer (pfiklad 4) | CCAACTACCACAAGTTTATTTAC |
| 21 | obecnâ WT detekce sekvence vlâsenky se smyckou (pfiklad 5) | TTACGAAATGTTGGTACAGTGAGTACCAATATGAGGACCATC |
| 22 | Obecnâ niutantni detekce sekvence vlâsenky se smyckou (pfiklad 5) | TTACGAAATGCAGGTACAGTTGGTACCTGTCTCCACC |
| 23 | 2T WT primer KRAS29T | CTCCAACTACCACAAGTTTATTTACGAAATGTTGGTACAGTGAGT ACCAATATGAGGACCATCTACGCCACC |
| 24 | 2T Mut primer KRAS29T | CTCCAACTACCACAAGTTTATTTACGAAATGCAGGTACAGTTGGT ACCTGTCTCCACCTACGCCACA |
| 25 | WT sonda KRAS 29T | TTGGTACAGTGAGTACCAATATGAGGACCATC |
| 26 | Mut sonda KRAS 29T | CAGGTACAGTTGGTACCTGTCTCCACC |
| 27 | Kodujici primer KRAS29T | CCTGCTGAAAATGACTGAA |
| 28 | Antikodujici primer KRAS 29T | CCAACTACCACAAGTTTATTTAC |
- 14 CZ 2024- 197 A3
| SEKV IDC: | NÂZEV | SEKVENCE (DNA) |
| 29 | 2T WT primer KRAS29C | CTCCAACTACCACAAGTTTATTTACGAAATGTTGGTACAGTGAGT ACCAATATGAGGACCATCTACGCCACC |
| 30 | 2T Mut primer KRAS29C | CTCCAACTACCACAAGTTTATTTACGAAATGCAGGTACAGTTGGT ACCTGTCTCCACCTACGCCACG |
| 31 | WT sonda KRAS 29C | TTGGTACAGTGAGTACCAATATGAGGACCATC |
| 32 | Mut sonda KRAS 29C | CAGGTACAGTTGGTACCTGTCTCCACC |
| 33 | Kôdujici primer KRAS29C | CCTGCTGAAAATGACTGAA |
| 34 | Antikôdujici primer KRAS 29C | CCAACTACCACAAGTTTATTTAC |
| 35 | 2 T WT primer KRAS29A | CTCCAACTACCACAAGTTTATTTACGAAATGTTGGTACAGTGAGT ACCAATATGAGGACCATCTACGCCACC |
| 36 | 2 T Mut primer KRAS29A | CTCCAACTACCACAAGTTTATTTACGAAATGCAGGTACAGTTGGT ACCTGTCTCCACCTACGCCACT |
| 37 | WT sonda KRAS 29A | TTGGTACAGTGAGTACCAATATGAGGACCATC |
| 38 | Mut sonda KRAS 29A | CAGGTACAGTTGGTACCTGTCTCCACC |
| 39 | Kôdujici primer KRAS29A | CCTGCTGAAAATGACTGAA |
| 40 | Antikôdujici primer KRAS 29A | CCAACTACCACAAGTTTATTTAC |
| SEKV IDC: | NÂZEV | SEKVENCE (DNA) |
| 41 | 2T WT primer KRAS30T | CTCCAACTACCACAAGTTTATTTACGAAATGTTGGTACAGTGAGT ACCAATATGAGGACCATCTACGCCACC |
| 42 | 2T Mut primer KRAS30T | CTCCAACTACCACAAGTTTATTTACGAAATGCAGGTACAGTTGGT ACCTGTCTCCACCTACGCCAA |
| 43 | WT sonda KRAS 30T | TTGGTACAGTGAGTACCAATATGAGGACCATC |
| 44 | Mut sonda KRAS 30T | CAGGTACAGTTGGTACCTGTCTCCACC |
| 45 | Kôdujici primer KRAS30T | CCTGCTGAAAATGACTGAA |
| 46 | Antikôdujici primer KRAS 3OT | CCAACTACCACAAGTTTATTTAC |
| 47 | 2T WT primer (KRAS 30C) | CTCCAACTACCACAAGTTTATTTACGAAATGTTGGTACAGTGAGT ACCAATATGAGGACCATCTACGCCACC |
| 48 | 2T Mut primer (KRAS 30C) | CTCCAACTACCACAAGTTTATTTACGAAATGCAGGTACAGTTGGT ACCTGTCTCCACCTACGCCAG |
| 49 | WT sonda (KRAS 3OC) | TTGGTACAGTGAGTACCAATATGAGGACCATC |
| 50 | Mut sonda (KRAS 3OC) | CAGGTACAGTTGGTACCTGTCTCCACC |
| 51 | Kôdujici primer (KRAS 30C) | CCTGCTGAAAATGACTGAA |
| 52 | Antikôdujici primer (KRAS 3OC) | CCAACTACCACAAGTTTATTTAC |
- 15 CZ 2024- 197 A3
| SEKV IDC: | NÂZEV | SEKVENCE (DNA) |
| 53 | CORO6.2T-M | AATCTCCCCTAAACTCCAATTACGAAATGTACTAGCGGCAAGCTA GTGCTAGACTTGACACCGCTAAAACGACG |
| 54 | CORO6.2T-NM | AATCTCCCCTAAACTCCAATTACGAAATGCAGGTACAGTTGGTAC CTGTCTCCACCCTCCACTAAAACAACA |
| 55 | 2T-Universal HEX (metliylacni) sonda | TACTAGCGGCAAGCTAGTGCTAGACTT |
| 56 | 2T-Universal FAM (ne-methylacni) sonda | CAGGTACAGTTGGTACCTGTCTCCACC |
| 57 | CORO6.F | CCCTAAACTCCAATTACGAAATG |
| 58 | CORO6.R-M | CGCGGGAGATTAGAATTTTTG |
| 59 | CORO6.R-NM | TGTGGGAGATTAGAATTTTTGG |
| 60 | FAM101A.2T-M | ATCGCAAATAAAAACCGAACATTTCCTTACGAAATCÇAGGTACAG TTGGTACCTGTCTCCACCCAACGCACGATAAAACG |
| 61 | FAM101A.2TNM | ATCACAAATAAAAACCAAACATTTCCTTACGAAATCTACTAGCGG CAAGCTAGTGCTAGACTTCAACAACACACAATAAAACA |
| 62 | 2T-Universal HEX (non-methylacni) sonda | TACTAGCGGCAAGCTAGTGCTAGACTT |
| 63 | 2T-Universal FAM (metliylacni) sonda | CAGGTACAGTTGGTACCTGTCTCCACC |
| SEKV IDC: | NÂZEV | SEKVENCE (DNA) |
| 64 | FAM101A.F-M | CCGAACATTTCCTTACGAAATC |
| 65 | FAM101A.F-NM | AACCAAACATTTCCTTACGAAATC |
| 66 | FAM101A.R | GAAAAGTGTAGGTTTTATAGGTAGA |
| 67 | 2T-primer mutace faktoru V („ Leiden “) | GAATACAGGTATTTTGTCCTTGAAGTATTACGAAATGCAGGTACA GTTGGTACCTGTCTCCACCTGGACAGGCA |
| 68 | Faktor V WT 2Tprimer | GAATACAGGTATTTTGTCCTTGAAGTATTACGAAATGTTGGTACA GTGAGTACCAATATGAGGACCATCGGACAGGCG |
| 69 | sonda WT faktoru V | TTGGTACAGTGAGTACCAATATGAGGACCATC |
| 70 | Sonda mutantniho (leidenskà niutacé) faktoru V | CAGGTACAGTTGGTACCTGTCTCCACC |
| 71 | faktor V kôdujiciho prtmeru | AGGTATTTTGTCCTTGAAGTATTACG |
| 72 | faktor V antikôdujiciho prtmeru | CTAACATGTTCTAGCCAGAAGAA |
V nekterÿch pnpadech mûze bÿt RT reakce a/nebo DNA amplifikaëni reakce (napr. PCR) provedena v kapkâch, napriklad kapkovou digitâlni PCR. Zde pouzité kapky mohou zahmovat emulzni kompozice (nebo smësi dvou nebo vice nemisitelnÿch kapalin), jak se popisuje v patentu US ë. 7,622,280. Kapky mohou bÿt generovâny zafizenimi popsanÿmi ve WO/2010/036352. Termin emulze, jak se zde pouzivâ, mûze oznaëovat smës nemisitelnÿch kapalin (jako je olej a ίο voda). Emulze v olejové fâzi a/nebo voda v oleji umoznuji rozdëleni reakënich smësi do vodnich kapek. Emulze mohou obsahovat vodné kapky v kontinuâlni olejové fâzi. Zde poskytnuté emulze mohou bÿt emulze typu olej ve vodë, kde kapky mohou bÿt kapky oleje v kontinuâlni vodné fâzi. V nëkterÿch pnpadech jsou kapky uspofâdâny tak, aby se zabrânilo miseni mezi oddily, priëemz kazdÿ oddil chrâni svûj obsah pfed odpafovânim a splynutim s obsahem jinÿch oddilû.
-16 CZ 2024 - 197 A3
Rozdeleni vzorku do malÿch reakcnich objemû (napr. pro kapkovou digitalni PCR) mûze umoznit pouziti snizeného mnozstvi cinidel, cimz se snizi materialové naklady na analÿzu. Snizeni slozitosti vzorku rozdelenim také zlepsuje dynamickÿ rozsah detekce, protoze molekuly s vyssim vÿskytem jsou oddeleny od molekul s nizkÿm vÿskytem v rûznÿch oddelenich, coz umoznuje molekulam s nizsim vÿskytem vetsi proporcionalni pfistup k reakcnim cinidlûm, coz zase zlepsuje detekci molekul s nizsim vÿskytem.
Kapky mohou bÿt generovany s prûmernÿm prûmerem pfiblizne, mensi nez, alespon nebo vice nez 0,001, 0,01, 0,05, 0,1, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 100, 120, 130, 140, 150, 160, 180, 200, 300, 400 nebo 500 mikronû. Kapky mohou mit prûmernÿ prûmer pfiblizne 0,001 az pfiblizne 500, pfiblizne 0,01 az pfiblizne 500, pfiblizne 0,1 az pfiblizne 500, pfiblizne 0,1 az pfiblizne 100, pfiblizne 0,01 az pfiblizne 100 nebo pfiblizne 1 az pfiblizne 100 mikronû. Mikrofluidni zpûsoby vÿroby emulznich kapek pomoci mikrokanalové fokusace s pficnÿm tokem nebo fyzikalniho michani mohou produkovat bud monodisperzni nebo polydisperzni emulze. Kapky mohou bÿt monodisperzni kapky. Kapky mohou bÿt generovany tak, ze se velikost kapek nemeni o vice nez plus nebo minus 5 % prûmerné velikosti kapek. V nekterÿch pfipadech mohou bÿt kapky generovany tak, ze se velikost kapek nemeni o vice nez plus nebo minus 2 % prûmerné velikosti kapek. Generator kapek mûze generovat populaci kapek z jednoho vzorku, pficemz velikost zadné z kapek se nelisi o vice nez plus nebo minus asi 0,1 %, 0,5 %>, 1 %>, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 %, 4,5 %, 5 %, 5,5 %, 6 %, 6,5 %, 7 %, 7,5 %, 8 %, 8,5 %, 9 %, 9,5 % nebo 10 % prûmerné velikosti celkové populace kapek.
Kapka mûze bÿt vytvofena protékanim olejové faze vodnÿm vzorkem. Vodna faze mûze obsahovat pufrovanÿ roztok a cinidla pro provadeni PCR reakce, vcetne nukleotidû, primerû, sondy (sond) pro fluorescencni detekci, templatovÿch nukleovÿch kyselin, enzymu DNA polymerazy a pfipadne enzymu reverzni transkriptazy.
Vodna faze mûze obsahovat pufrovanÿ roztok a cinidla pro provadeni PCR reakce bez kulicek v pevné fazi, jako jsou magnetické kulicky.
Ve vodné fazi lze pouzit nespecifické blokovaci cinidlo, jako je BSA nebo zelatina z hovezi kûze, pficemz zelatina nebo BSA jsou pfitomny v koncentracnim rozmezi pfiblizne 0,1 az pfiblizne 0,9 % hmotn./obj. Dalsi mozna blokujici cinidla mohou zahrnovat betalaktoglobulin, kasein, susené mléko nebo jina bezna blokujici cinidla. V nekterÿch pfipadech jsou koncentrace BSA a zelatiny asi 0,1 % hmotn./obj.
V nekterÿch pfipadech mûze vodna faze také obsahovat aditiva vcetne, ale bez omezeni na ne, nespecifickÿch nespecifické zakladni/blokujici nukleové kyseliny (napf. DNA lososiho spermatu), biokonzervacnich latek (napf. azid sodnÿ), zesilovacû PCR (napf. betain, trehalôza, atd.) a inhibitorû (napf. inhibitory RNazy).
V nekterÿch pfipadech se do vodné faze pfidâvâ neiontovÿ blokovÿ kopolymer ethylenoxid/propylenoxid v koncentraci pfiblizne 0,1 %, 0,2 %, 0,3 %, 0,4 %, 0,5 %, 0,6 %, 0,7 %, 0,8 %), 0,9 %) nebo 1,0 %). Bezné biosurfaktanty mohou zahrnovat neiontové povrchove aktivni latky, jako je Pluronic F-68, Tetronics, Zonyl FSN.
Olejova faze mûze obsahovat fluorovanÿ zakladni olej, kterÿ mûze bÿt dodatecne stabilizovan kombinaci s fluorovanÿm povrchove aktivnim cinidlem, jako je perfluorovanÿ polyether. V nekterÿch pfipadech mûze bÿt zakladnim olejem jeden nebo vice z HFE 7500, FC-40, FC-43, FC70 nebo jinÿ beznÿ fluorovanÿ olej.
Olejova faze mûze dale obsahovat aditivum pro ladeni vlastnosti oleje, jako jsou tlak par nebo viskozita nebo povrchové napeti. Neomezujici pfiklady zahrnuji perfluoroktanol a 1H,1H,2H,2Hperfluordekanol.
- 17 CZ 2024 - 197 A3
V nekterÿch pripadech mohou bÿt kapky emulze generovâny pomoci komercne dostupného generâtoru kapek, jako je Bio-Rad QX100™ Droplet Generator. RT a kapkovâ PCR mohou bÿt provâdeny za pouziti komercne dostupného a kapka je analyzovâna za pouziti komercne dostupné ctecky kapek, jako je generator, jako je Bio-Rad QX100™ Droplet Reader.
V nekterÿch pripadech se krok amplifikace provâdi provâdenim digitâlni PCR, jako je digitâlni PCR na bazi mikrofluidû nebo kapkové digitâlni PCR.
V nekterÿch pripadech se digitâlni PCR provâdi v kapkâch, které maji objem mezi priblizne 1 pl a priblizne 100 nl.
V nekterÿch pripadech mûze tvorba kapek zahrnovat zavedeni zapouzdrujicich barviv, jako jsou fluorescencni molekuly, do kapek, napriklad se znâmou koncentraci barviv, kde jsou kapky suspendovâny v nemisitelné nosné tekutine, jako je olej, za vzniku emulze.
Priklady fluorescencnich barviv, kterâ lze pouzit s jakÿmikoli zpûsoby podle soucasného popisu, zahrnuji derivât fluoresceinu, jako je karboxyfluorescein (FAM) a barvivo PULSAR 650 (derivât Ru(bpy)3). FAM mâ relativne malÿ Stokesûv posun, zatimco barvivo Pulsar® 650 mâ velmi velkÿ Stokesûv posun. Barvivo FAM i PULSAR 650 lze excitovat svetlem priblizne 460-480 nm. FAM vyzaruje svetlo s maximem asi 520 nm (a ne v podstate pri 650 nm), zatimco barvivo PULSAR 650 emituje svetlo s maximem asi 650 nm (a ne v podstate pri 520 nm).
Karboxyfluorescein mûze bÿt v sonde napriklad spârovân s barvivem BLACK HOLE Quencher™ 1 a barvivo PULSAR 650 lze spârovat v sonde napriklad s barvivem BLACK HOLE.
Barvivo Quencher™ 2. Fluorescencni barviva napriklad zahrnuji, ale nejsou omezeny na DAPI, 5FAM, 6-FAM, 5(6)-FAM, 5-ROX, 6-ROX, 5,6-ROX, 5-TAMRA, 6- TAMRA, 5(6)-TAMRA SYBR, TET, JOE, VIC, HEX, R6G, Cy3, NED, Cy3.5, Texas Red, Cy5 a Cy5.5.
Zde poskytnuté zpûsoby jsou vhodné pro pouziti s technikou digitâlni analÿzy. Digitâlni analÿza mûze bÿt digitâlni polymerâzovâ retezovâ reakce (digitâlni PCR, DigitalPCR, dPCR nebo dePCR). dPCR mûze bÿt kapkovâ dPCR (ddPCR).
V nekterÿch pripadech zpûsoby zahrnuji pouziti kapkové dPCR (ddPCR), kde je dosazeno extrémne vysoké ùrovne zvÿseni citlivosti pomoci odstraneni templâtu pozadi prostrednictvim rozdeleni s vlastni citlivosti poskytnutou zde poskytnutÿm systémem s horkÿm startem pro amplifikaci primeru. Napriklad u hromadnÿch PCR reakci je citlivost priblizne 1/100 az 1/10 000 vcetne, nebo napr. 1/100 az 1/1 000, jak je definovâno jako mutant/ (mutant + divokÿ typ). Pri pouziti ddPCR se tato citlivost projevuje v kazdém oddilu, jako napriklad u 20 000 kapek je citlivost priblizne 1/1 000 az 1/100 000 vcetne.
Obecne mûze dPCR zahrnovat prostorovou izolaci (nebo rozdeleni) jednotlivÿch polynukleotidû ze vzorku a provedeni polymerâzové retezové reakce na kazdém rozdeleni. Prepâzka mûze bÿt napr. jamka (napr. jamky mikrotitracni desticky), kapilâra, dispergovanâ fâze emulze, komora (napr. komora v rade miniaturizovanÿch komor), kapka nebo vazba nukleové kyseliny. povrch. Vzorek mûze bÿt distribuovân tak, ze kazdÿ oddil mâ 0 nebo 1 polynukleotid. Po PCR amplifikaci lze vycislit pocet oddilû s nebo bez produktu PCR. Celkovÿ pocet oddilû mûze bÿt priblizne, alespon nebo vice nez 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 15,000, 16,000, 17,000, 18,000, 19,000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 60,000, 70,000, 80,000, 90,000, 100,000, 150,000, 200,000, 500,000, 750,000, 1,000,000,
2,500,000, 5,000,000, 7,500,000, 10,000,000, 25,000,000, 50,000,000, 75,000,000 nebo
100,000,000. Pozitivni a negativni kapky lze spocitat.
- 18 CZ 2024 - 197 A3
V nekterych pnpadech mùze bÿt detekovâno mène nez 0,00001, 0,00005, 0,00010, 0,00050, 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 6, 7, 8, 9 nebo 10 kopii cilového polynukleotidu. V nekterÿch pnpadech Ize detekovat mène nez asi 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 nebo 500 kopii cilového polynukleotidu. V nekterÿch pnpadech mohou bÿt zde popsanè kapky generovany rychlosti vyssi nez 1, 2, 3, 4, 5, 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2500, 5000, 10 000, 25 000, 50 000, 75 000, 100 000, 250 000, 500 000 nebo 1 000 000 kapek za sekundu. V nekterÿch pnpadech mohou bÿt zde popsanè kapky generovany rychlosti priblizne 1 az priblizne 10, priblizne 10 az priblizne 100, priblizne 100 az priblizne 1000, priblizne 1000 az priblizne 10 000, priblizne 10 000 az priblizne 100 000 nebo priblizne 100 000 az priblizne 1 000 000 kapek za sekundu.
Ve zpùsobech podle tohoto popisu mùze bÿt pouzito integrovanè, rychlè, prùtokovè zarizeni tepelnèho cyklovace. Viz napr. mezinârodni prihlaska c. PCT/US2009/005317, podana 23.9.2009. V takovèm integrovanèm zarizeni je kapilara navinuta kolem valce, kterÿ udrzuje 2, 3 nebo 4 teplotni zôny. Kdyz kapky protèkaji kapilarou, jsou vystaveny rùznÿm teplotnim zônam, aby se dosahlo tepelnèho cyklovani. Malÿ objem kazdé kapky ma za nasledek extrémne rychlÿ teplotni prechod pri vstupu kapky do kazdé teplotni zôny.
Digitâlni PCR zarizeni pro pouziti se zde popsanÿmi zpùsoby, kompozicemi a soupravami mùze detekovat vice signâlù (viz napr. PCT publikace c. WO2012109500A2, ktera je zde v celèm rozsahu zahrnuta odkazem).
V nekterÿch zpùsobech podle tohoto popisu je detekce DNA amplifikaci tzv. metodami „amplifikaci v reâlném case“ také znamÿmi jako kvantitativni PCR (qPCR) nebo Taqman. Zaklad pro tento zpùsob monitorovâni tvorby produktu amplifikace vytvoreného behem PCR reakce s templatem s pouzitim oligonukleotidovÿch sond/oligo specifickÿch pro oblast templatu, ktera ma bÿt detekovana. V nekterÿch provedenich jsou qPCR nebo Taqman pouzity bezprostredne po reakci reverzni transkriptazy provedené na izolované bunecné mRNA; tento druh slouzi ke kvantifikaci hladin jednotlivÿch mRNA behem qPCR.
Taqman pouziva dualne znacenou fluorogenni oligonukleotidovou sondu. Dualne znacena fluorogenni sonda pouzivanâ v takovÿch testech je typicky kratkÿ (cca 20-25 bazi) polynukleotid, kterÿ je znacen dvema rùznÿmi fluorescencnimi barvivy. 5' konec sondy je typicky pripojen k reportérovému barvivu a 3' konec je pripojen ke zhâsecimu barvivu. Af se bere ohled na znaceni nebo ne, qPCR sonda je navrzena tak, aby mela alespon podstatnou sekvencni komplementaritu s mistem na cilové mRNA nebo odvozené nukleové kyseline. Upstream a downstream PCR primery, které se vazou na lemujici oblasti lokusu, jsou také pridany do reakcni smesi. Kdyz je sonda neporusena, dochazi k prenosu energie mezi dvema fluorofory a zhasec zhâsi emisi z reportéru. Behem extenzni faze PCR je sonda stepena 5' nukleazovou aktivitou polymerazy nukleové kyseliny, jako je Taq polymeraza, cimz se uvolni reportér od polynukleotidového zhasece a vÿsledkem je zvÿseni reportérové emisni intenzity, coz se mùze merit pomoci vhodného detektoru. Zaznamenané hodnoty pak mohou bÿt pouzity k vÿpoctu narùstu normalizované reportérové emisni intenzity na kontinuâlnim zaklade a nakonec kvantifikovat mnozstvi amplifikované mRNA. Hladiny mRNA mohou bÿt také mereny bez amplifikace hybridizaci se sondou, napriklad s pouzitim sondy s rozvetvenou nukleovou kyselinou, jako je QuantiGene® Reagent System od Panomics. Tento format testu je zvlaste uzitecnÿ pro multiplexni detekci vice genù z reakce jednoho vzorku, protoze kazdÿ par fluorofor/zhasec pripojenÿ k jednotlivé sonde mùze bÿt spektralne ortogonâlni k ostatnim sondam pouzitÿm v reakci, takze vice sond (kazdâ smerovanâ proti odlisnému genovému produktu) mohou bÿt detekovâny behem amplifikacni/detekcni reakce.
qPCR lze také provést bez duâlne znacené fluorogenni sondy s pouzitim fluorescencniho barviva (napr. SYBR Green) specifického pro dsDNA, které odrâzi akumulaci dsDNA amplifikovanÿch specifickÿch upstream a downstream oligonukleotidovÿch primerù. Nârûst fluorescence behem
- 19 CZ 2024 - 197 A3 amplifikacni reakce je sledovân kontinuâlne a mùze bÿt pouzit pro urceni mnozstvi amplifikované mRNA.
V nekterÿch provedenich se pro qPCR nebo Taqman detekci provâdi krok „predamplifikace“ na cDNA transkribované z bunecné RNA pred kvantitativne monitorovanou PCR reakci. To slouzi ke zvÿseni signâlu v podminkach, kdy je prirozenâ hladina RNA/cDNA, kterâ ma bÿt detekovâna, velmi nizkâ. Vhodné zpùsoby predamplifikace zahrnuji, ale nejsou omezenâ LM-PCR, PCR s nâhodnÿmi oligonukleotidovÿmi primery (napr. nâhodnâ hexamerni PCR), PCR s poly-A specifickÿmi primery a jakakoli jejich kombinace.
V nekterÿch provedenich se pro detekci qPCR nebo Taqman nejprve provede krok RT-PCR, aby se vytvorila cDNA z bunecné RNA. Takova amplifikace pomoci RT-PCR mùze bÿt bud obecna (napr. amplifikace s castecne/zcela degenerovanÿmi oligonukleotidovÿmi primery) nebo cilena (napr. amplifikace s oligonukleotidovÿmi primery zamerenÿmi proti specifickÿm genùm, které maji bÿt analyzovany v pozdejsim kroku).
V nekterÿch pripadech mùze kterÿkoli ze zde popsanÿch zpùsobù dale zahrnovat provedeni sekvenacniho testu na extenzi, amplifikaci nebo zpracovani produktù vyrobenÿch podle kteréhokoli ze zde popsanÿch zpùsobù. Sekvenacni test mùze zahrnovat (i) sekvenovani exomu, (ii) sekvenovani panelu genù, (iii) sekvenovani celého genomu, (iv) sekvenovani syntézou za pouziti chemie reverzibilnich terminâtorù, (v) pyrosekvenovani, (vi) sekvenovani nanopôrù, (vii) sekvenovani jedné molekuly v reâlném case, (viii) Sangerovo sekvenovani nebo jakakoli jejich kombinace. Sekvenovani lze provadet rùznÿmi v soucasnosti dostupnÿmi systémy, jako je, bez omezeni, sekvenacni systém od Illumina®, Pacific Biosciences (PacBio®), Oxford Nanopore® nebo Life Technologies (Ion Torrent®) nebo jiné technologie „sekvenovâni nové generace“.
PRÎKLADY
Priklad 1. - Optimalizace koncentrace primeru pro testy ACTN3 a NRAS mutantniho primeru vlâsenky se smyckou qPCR
Pro nalezeni optimâlni koncentrace primerù vlâsenky se smyckou byly hodnoceny rùzné koncentrace od 10 nM do 200 nM primerù. Rùzné koncentrace primerù byly hodnoceny na 100 % divokého typu, 100 % mutantu, 50 % divokého typu / 50 % mutantu, na genomové DNA a na negativni kontrole. Nâvrhy pro ACTN3 a NRAS v tabulce 1 byly posuzovâny samostatne. Reakce obsahovala 400 nM kôdujicich a antikôdujicich primerù, 5 - 25 nM mutantnich primerù a primerù divokého typu vlâsenky se smyckou a 200 nM mutantnich a standardnich sond. qPCR probihala pri 95 °C po dobu 60 sekund, nâsledovalo 45 cyklù po 5 sekundâch pri 95 °C a 30 sekundâch pri 95 °C. Pro lepsi vizualizaci dat byla vsem negativnim vzorkùm prirazena hodnota Cq 45. Data byla vyhodnocena namerenÿm rozdilem mezi hodnotami Cq pro testy divokého typu a testy mutantù (ACq) a rozptylovÿmi grafy hodnot koncového bodu fluorescence. Vÿsledky tohoto experimentu jsou uvedeny na OBRAZKU 2 a OBRAZKU 3.
Priklad 2.- Hodnoceni selektivity ACTN3 a NRAS mutantnich primerù vlâsenky se smyckou qPCR testù
Pro vyhodnoceni citlivosti a specificnosti nâvrhù byly vyhodnoceny rùzné pomery mutantni gBlock DNA oproti DNA divokého typu pri konstantnim celkovém mnozstvi gBlock DNA. Pro srovnâni byla rovnez zahrnuta 100 % genomovâ DNA divokého typu, 100 % mutantni genomovâ DNA a negativni kontrola. Nâvrhy pro ACTN3 a NRAS v tabulce 1 byly posuzovâny samostatne. Reakce obsahovala 400 nM kôdujicich a antikôdujicich primerù, 25 nM mutantnich primerù a primerù vlâsenky se smyckou divokého typu a 200 nM mutantnich a standardnich sond. qPCR probihala pri 95 °C po dobu 60 sekund, nâsledovalo 45 cyklù po 5 sekundâch pri 95 °C a 30 sekundâch pri 95 °C. Pro lepsi vizualizaci dat byla vsem negativnim vzorkùm prirazena hodnota Cq 45. Vÿsledky tohoto experimentu jsou uvedeny na OBRAZKU 4.
- 20 CZ 2024 - 197 A3
Priklad 3.- Detekce vzâcné sekvencni varianty KRAS pro mutaci KRAS G12R
Reagencie/Postup
Pro cilovÿ test byly zkonstruovâny syntetické templâty pro divokÿ typ (WT) KRAS a mutantni KRAS (KRAS G12R) (gBlocksTM, zakâzkove objednané od IDT), jeden obsahujici sekvenci WT a jeden obsahujici mutantni (KRAS G12R) sekvenci. Tyto dva templaty byly smichâny v rùznÿch pomerech, aby se simulovaly rùzné frekvence mutaci. Frekvence simulovanÿch mutaci byly: 50 %, 5 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 % a 0,05 % mutantù.
Podil WT a mutantni DNA v kazdé smesi byl hodnocen pomoci dPCR s pouzitim nâvrhù primerù a schémat amplifikace, jak je zde popsano podle obrâzku 1 (viz tabulka 2). Kazda dPCR reakce byla 40 μl a obsahovala 10 μl QIAcuity Sonda Mastermix, 800 nM doprednÿ primer, 800 nMantikôdujici primer, 400 nM sondu WT (HEX), 400 nM Mut sondu (FAM), 50 nM WT TwoTail primer, 50 nM primer Mutant/0106 kopie syntetickÿ templat (celkova koncentrace mutantu a templatu WT ve vzorku, koncentrace jednotlivÿch templatù se u jednotlivÿch vzorkù lisi na zaklade frekvence simulované mutace)
Tabulka 2: Navrhy primerû pouzité v prikladu 3
| nàzev | sekvence (DNA) |
| 2T WT primer | CTCCAACTACCACAAGTTTATTTACGAAATGTTGGTACAGTGAGTA CCAATATGAGGACCATCTACGCCACC |
| 2T Mut primer | CTCCAACTACCACAAGTTTATTTACGAAATGCAGGTACAGTTGGTA CCTGTCTCCACCTACGCCACG |
| WT sonda | TTGGTACAGTGAGTACCAATATGAGGACCATC |
| Mut sonda | CAGGTACAGTTGGTACCTGTCTCCACC |
| Kôdujici primer | CCTGCTGAAAATGACTGAA |
| Antikôdujici primer | CCAACTACCACAAGTTTATTTAC |
Reakce dPCR byly vlozeny do QIAcuity Nanoplate 26K a cyklovany na QIAcuity Digital PCR System za nasledujicich podminek: 3 minuty pri 95 °C, 45 cyklù, z nichz kazdÿ zahrnoval 15 sekundovou denaturaci pri 95 °C nasledovanou 55 ° C prodlouzeni na 30 sekund. Akvizice obrazu byla provedena v kanalu FAM a HEX. Data byla analyzovana pomoci QIAcuity Software Suite za pouziti manualniho prahovani.
Vÿsledek
OBRAZEK 5 znazomuje priklady digitalnich PCR dat testù primerù vlasenky se smyckou detekujicich SNP ze dvou rùznÿch experimentù. Panely (A-C) a tabulka 3 nize zobrazuji vÿsledky experimentu navrzeného k posouzeni citlivosti testu primeru vlasenky se smyckou detekujiciho mutant G12R KRAS na vzorcich s rùznÿmi pomery WT/mutantni cilovÿ templat (mezi 0,05 % a 50 % pomer mutant k WT) na digitalnim PCR systému QIAcuity. (A) zobrazuje ciselna data z experimentu, kterâ jsou reprodukovâna v tabulce 3 nize:
Tabulka 3: Vÿsledky dPCR na sablonach WT a KRAS s pouzitim navrhû primerû podle tohoto popisu
- 21 CZ 2024 - 197 A3
| vzorek | test | reportér | koncentrace (kopie/μΐ) | CI (95%) | Prijaté oddily | Pozitivni oddily | Negativni oddily | % detekovanych mutantu |
| 50% | KRAS G12R | Mut | 940,4 | 1,4% | 25500 | 13722 | 11778 | 52,19% |
| WT | 861,5 | 1,5% | 25500 | 12933 | 12567 | |||
| 5% | KRAS G12R | Mut | 86,5 | 4,6% | 25480 | 1747 | 23733 | 4,84% |
| WT | 1701,2 | 1,1% | 24333 | 18317 | 6016 | |||
| 1,0% | KRAS G12R | Mut | 16,1 | 10,7% | 25486 | 335 | 25151 | 0,98% |
| WT | 1623,9 | 1,1% | 25269 | 18612 | 6657 | |||
| 0,5% | KRAS G12R | Mut | 9,2 | 14,2% | 25461 | 192 | 25269 | 0,55% |
| WT | 1654,2 | 1,1% | 25461 | 18918 | 6543 | |||
| 0,1% | KRAS G12R | Mut | 2,3 | 28,3% | 25475 | 49 | 25426 | 0,14% |
| WT | 1706,1 | 1,0% | 25475 | 19202 | 6273 | |||
| 0,05% | KRAS G12R | Mut | 1,4 | 36,3% | 25500 | 30 | 25470 | 0,08% |
| WT | 1730,5 | 1,0% | 25500 | 19345 | 6155 |
Priklad 4. - Detekce vzacné sekvencni varianty KRAS pro mutaci KRAS 29T
Po vyhodnoceni schopnosti 2T designu podle obrazku 1 detekovat jedinou mutaci KRAS v prikladu 3 byla hodnocena vÿkonnost metody s rûznÿmi platformami dPCR (QX200, Naica a QIAcuity).
Reagencie/Postup
Amplifikacni vzorky pouzité v experimentu obsahovaly syntetické templaty (gBlocksTM, zakazkove objednané od IDT) pro mutanty (KRAS 29T) a WT KRAS. V experimentu byly pouzity dva templaty na jeden test, jeden obsahujici sekvenci WT a jeden obsahujici mutantni sekvenci pro cilovÿ test.
Pro platformu QX200: Kazdâ dPCR reakce byla 20μl a obsahovala 10 μl ddPCR Supermix pro sondy (bez dUTP), 800 nM kôdujiciho primeru, 800 nM antikôdujiciho primeru, 400 nM sondy WT (HEX), 400 nM sondy Mut (FAM), 25 nM WT Two Tail primeru, 25nM Mutant TwoTail primeru, 500 kopii^l syntetického templatu WT a 500 kopii^l syntetického templatu Mutant. Reakcni smes dPCR byla vlozena do generatoru kapek Bio-Rad QX100 spolu s olejem pro generovani kapek pro sondy a podle pokynû vÿrobce byly vytvoreny kapky. Kapky byly preneseny na 96jamkovou reakcni desticku a tepelne utesneny propichnutelnou fôlii. Utesnena deska byla cyklovana v termocykleru podle nasledujicich podminek: 4 minuty pri 95 °C, 45 cyklû, z nichz kazdÿ zahrnoval 30sekundovou denaturaci pri 94 °C nasledovanou prodlouzenim 53 °C po dobu 60 sekund a zaverecnÿ krok 10 minut pri 95 °C. Desticka byla inkubovana pri 4 °C po dobu 1 hodiny pred detekci pomoci ctecky kapek QX200 v akvizicnich kanalech FAM a HEX. Data byla analyzovana pomoci softwaru QuantaSoftTM Analysis Pro s pouzitim manualniho stanoveni prahû.
- 22 CZ 2024- 197 A3
Pro platformu Naica: Kazda dPCR reakce byla 25μ1 a obsahovala 12,5 μΐ TATAA Sonda Grandmaster Mix, 600 nM kodujiciho primeru, 600 nM antikôdujiciho primeru, 400 nM sondy WT (HEX), 400 nM Mut sondy (FAM), 25 nM WT Two Tail primeru, 25 nM Mutant TwoTail primeru, lOOnM fluoresceinu, 1000 kopii/μΐ syntetického template WT a 1000 kopii/μΐ syntetického template Mutant. Reakcni smës dPCR byla vlozena do cipu Sapphire a cyklovâna na cyklovaci jednotce systému Naica podle nasledujicich podminek: 4 minuty pri 95 °C, 45 cyklù, z nichz kazdÿ zahmoval lOsekundovou denaturaci pri 95 °C nâsledovanou 55 ° C prodlouzeni na 30 sekund. Safirovÿ cip byl pfenesen do cteci jednotky systému Naica a detekovân v kanâlech FAM a HEX. Data byla analyzovâna pomoci Naica Crystal Reader a Nacia Crystal Miner Software za pouziti manualniho stanoveni prahové hodnoty.
Platforma QIAcuity: Kazda reakce dPCR byla 40 μΐ a obsahovala 10 μΐ QIAcuity Sonda Mastermix, 800 nM kodujiciho primeru, 800 nM antikôdujiciho primeru, 400 nM sondy WT (HEX), 400 nM sondy Mut (FAM), 25 nM WT Two Tail primeru, 25 nM Mutant Two Tail primeru a 800 kopii/μΐ syntetického template WT a 800 kopii/μΐ syntetického template Mutant. Reakcni smës dPCR byla vlozena do QIAcuity Nanoplate 26K a cyklovâna na QIAcuity Digital PCR System s nâsledujicimi podminkami: 3 minuty pri 95 °C, 45 cyklù, z nichz kazdÿ zahmoval 15 sekundovou denaturaci pri 95 °C s nâslednou extenzi pri 56 °C po dobu 30 sekund. Akvizice obrazu byla provedena v kanâlu FAM a HEX. Data byla analyzovâna pomoci manuâlniho prahovâni QIAcuity Software Suite.
Tabulka 4: Nâvrhy primeru pouzité v prikladu 4
| nàzev | sekvence (DNA! |
| 2TWT primer | CTCCAACTACCACAAGTTTATTTACGAAATGTTGGTACAGTGAGTACCA ATATGAGGACCATCTACGCCACC |
| 2TMut primer (KRAS29T) | CTCCAACTACCACAAGTTTATTTACGAAATGCAGGTACAGTTGGTACCT GTCTCCACCTACGCCACA |
| WT sonda | TTGGTACAGTGAGTACCAATATGAGGACCATC |
| Mut sonda (KRAS 29T) | CAGGTACAGTTGGTACCTGTCTCCACC |
| Kôdujici primer | CCTGCTGAAAATGACTGAA |
| Antikôdujici primer | CCAACTACCACAAGTTTATTTAC |
Vÿsledky
Obrâzek 5 panel (D) znâzornuje vÿsledky ze sady expérimente navrzenÿch pro hodnoceni fonkce teste primeru s kmenovou smyckou detekujiciho G12R KRAS na rùznÿch platformâch dPCR. Zobrazené vÿsledky jsou 2D grafy amplitudy a zkrâcené tabulky numerickÿch vÿsledkù ze stejného teste provâdëného na vzorcich s 50 % WT a 50 % mutantniho cilového templâte na tfech rùznÿch platformâch dPCR: QX200 Droplet Digital PCR System, Naica System for Crystal Digital PCR a QIAcuity Digital PCR systém. Jak je vidët z porovnâni grafù a souvisejicich dat, 2T nâvrhové schéma mëlo podobnÿ vÿkon mezi vsemi tfemi platformami.
-23 CZ 2024 - 197 A3
Priklad 5.- Posouzeni vÿkonnosti generickÿch sekvenci s kmenovou smyckou pro 2T primery
Po vyhodnoceni uzitecnosti 2T designu v jednom pripade detekce WT/mutantni DNA byla vyhodnocena obecna vÿkonnost dvou rûznÿch sekvenci kmenové smycky s radou rûznÿch 5' a 3' hemisond (viz obr. 4 panel A). Pro detekci divokého typu byla pouzita genericka 2T primerova sekvence 5'-hemisonda- TTACGAAATGTTGGTACAGTGAGTACCAATATGAGGACCATC3'hemisonda (SEKV ID C: 21), zatimco genericka sekvence primeru byla pouzita CCACC 3'hemisonda (SEKV ID C: 22). Byla provedena hodnoceni pro detekci KRAS G12R a NRAS Q61R.
Reagencie/Postup
Pro detekci KRAS G12R byly provedeny postupy jako v prikladu 3 a primery byly popsany v prikladu 3.
Pro detekci NRAS Q61R obsahovaly vzorky NRAS pro amplifikaci syntetické templaty (gBlocksTM, objednané na zakazku od IDT). V experimentu byly pouzity dva templaty, jeden obsahujici sekvenci WT a jeden obsahujici mutantni sekvenci pro cilovÿ test. Tyto dva templaty byly smichany v rûznÿch pomerech, aby se simulovaly rûzné frekvence mutaci. Frekvence simulovanÿch mutaci byly: 50 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1,0 %, 0,5 % a 0,1 % mutantû.
Kazda dPCR reakce byla 40 μl a obsahovala 10 μl QIAcuity Sonda Mastermix, 400 nM kôdujiciho primeru, 400 nM antikôdujiciho primeru, 200 nM sondy WT (HEX), 200 nM sondy Mut (FAM), 25 nM WT TwoTail primeru a 24nM 24nM Mutant TwoTail primeru a 2400 kopii/ μl syntetického templatu (celkova koncentrace mutantniho a WT templatu ve vzorku, koncentrace jednotlivÿch templatû se u kazdého vzorku lisi v zavislosti na frekvenci simulované mutace).
Reakcni smes dPCR byla vlozena do QIAcuity Nanoplate 26K a cyklovana na QIAcuity Digital PCR System za nasledujicich podminek: 3 minuty pri 95 °C, 45 cyklû, z nichz kazdÿ zahrnoval 15sekundovou denaturaci pri 95 °C nasledovanou 60°C prodlouzenim na 30 sekund. Akvizice obrazu byla provedena v kanalu FAM a HEX. Data byla analyzovana pomoci QIAcuity Software Suite s pouzitim manualniho prahovani.
Tabulka 5: Navrhy primeru pouzité v prikladu 5 pro detekci NRAS Q61R
| nàzev | sekvence (DNA) |
| 2T WTprimer | GAGTACAGTGCCATGAGAGACTTACGAAATGTTGGTACAGTGAGT ACCAATATGAGGACCATCAGCTGGACA |
| 2T Mut primer | GAGTACAGTGCCATGAGAGACTTACGAAATGCAGGTACAGTTGGT ACCTGTCTCCACCAGCTGGACG |
| WT sonda | TTGGTACAGTGAGTACCAATATGAGGACCATC |
| Mut sonda | CAGGTACAGTTGGTACCTGTCTCCACC |
| Kôdujici primer | GCAAATACACAGAGGAAGCC |
| Antikôdujici primer | TGCCATGAGAGACTTACGAAAT |
Vysledky
Pro detekci KRAS WT a mutantu jsou vÿsledky uvedeny v tabulce 6 nize
Tabulka 6: Detekce mutantu KRAS WT/G12R s generickymi sekvencemi kmenové smycky
- 24 CZ 2024- 197 A3
| vzorek | test | reportér | Koncentrace (kopie / μΐ) | CI (95%) | Pfijaté oddily | Pozitivni odddily | Negativni oddily | % detekovanÿch mutantü |
| 50% | KRAS G12R | Mut | 940,4 | 1,4% | 25500 | 13722 | 11778 | 52,19% |
| WT | 861,5 | 1,5% | 25500 | 12933 | 12567 | |||
| 5% | KRAS G12R | Mut | 86,5 | 4,6% | 25480 | 1747 | 23733 | 4,84% |
| WT | 1701.2 | 1.1% | 24333 | 18317 | 6016 | |||
| 1.0% | KRAS G12R | Mut | 16,1 | 10,7% | 25486 | 335 | 25151 | 0,98% |
| WT | 1623,9 | 1,1% | 25269 | 18612 | 6657 | |||
| 0,5% | KRAS G12R | Mut | 9,2 | 14,2% | 25461 | 192 | 25269 | 0,55% |
| WT | 1654,2 | 1,1% | 25461 | 18918 | 6543 | |||
| 0,1% | KRAS G12R | Mut | 2,3 | 28,3% | 25475 | 49 | 25426 | 0,14% |
| WT | 1706,1 | 1,0% | 25475 | 19202 | 6273 | |||
| 0,05% | KRAS G12R | Mut | 1,4 | 36,3% | 25500 | 30 | 25470 | 0,08% |
| WT | 1730,5 | 1,0% | 25500 | 19345 | 6155 |
Jak je vidèt z vÿsledkû v tabulée 6, % detekované mutanty bylo tèsnè zarovnâno (napr. v râmci 10 %) s mnozstvim umistènÿm ve vzorku (srovnejte sloupce „vzorek“ a „% detekované mutanty“).
Tabulka 7: Detekce NRAS WT/mutanta s generickÿmi sekvencemi kmenové smycky
| vzorek | test | reportér | Koncentrace (kopie ! pl) | CI (95%) | Pfijaté oddily | Pozitivni odddily | Negativni oddily | % detekovanÿch mutantû |
| 50% | NRAS | Mut | 1318 | 1,30% | 25477 | 15531 | 9946 | 52,74% |
| WT | 1181,1 | 1,30% | 25477 | 14510 | 10967 |
-25 CZ 2024- 197 A3
| vzorek | test | reporter | Koncentrace (kopie / μΐ) | CI (95%) | Pfijaté oddily | Pozitiviii odddily | Negativni oddily | % detekovanÿch mutautii |
| 10% | NRAS | Mut | 241,3 | 3,00% | 25469 | 3985 | 21484 | 9,18% |
| WT | 2386,5 | 0,90% | 25469 | 20736 | 4733 | |||
| 5% | NRAS | Mut | 122,8 | 4,20% | 25476 | 2131 | 23345 | 4,41% |
| WT | 2664,3 | 0,90% | 25476 | 21645 | 3831 | |||
| 2.5% | NRAS | Mut | 64,23 | 5,70% | 25480 | 1140 | 24340 | 2,44% |
| WT | 2573 | 0,90% | 25480 | 21407 | 4073 | |||
| 1,0% | NRAS | Mut | 28,19 | 8,60% | 25472 | 512 | 24960 | 1,08% |
| WT | 2588,7 | 0,90% | 25460 | 21514 | 3946 | |||
| 0,5% | NRAS | Mut | 22,18 | 9,60% | 25449 | 415 | 25034 | 0,78% |
| WT | 2813,2 | 0,90% | 25436 | 22276 | 3160 | |||
| 0,1% | NRAS | Mut | 8,232 | 16,00% | 25493 | 150 | 25343 | 0,30% |
| WT | 2774,5 | 0,90% | 25493 | 22005 | 3488 |
Jak je vidët z vÿsledkû v tabulée 7, % detekovanÿch mutantû bylo tësnë odpovidalo (napr. v râmci 10 %) mnozstvi umistënÿm ve vzorku (srovnejte sloupce „vzorek“ a „% detekované mutanty“).
Priklad 6.- Detekce vice rûznÿch mutantû KRAS v single-plex testech
Po prokâzâni, ze 2T design z obrâzku 1 byl vysoce ûëinnÿ pro detekci jedné mutanty KRAS, byly navrzeny atestovâny kombinace sond pro detekci vice rûznÿch mutantû KRAS.
Reagencie/Postup
Vzorky pouzité v expérimenta pro amplifikaci nesouci WT, 29T, 29C, 29A, 30T, 30C obsahovaly syntetické sablony (gBlocksTM, objednané na zakâzku od IDT). V expérimenta na test byly pouzity dva templâty, jeden obsahujici sekvenci WT a jeden obsahujici mutantni sekvenci pro cil testa.
Kazdâ dPCR reakce byla 12 pl a obsahovala 3 μΐ QIAcuity Sonda Mastermix, 800 nM kôdujiciho primeru, 800 nM antikôdujiciho primeru, 400 nM sondy WT (HEX), 400 nM sondy Mut (FAM), 100 nM WT TwoTail primeru, 50 nM Mutant TwoTail primeru, 500 kopii/μΐ syntetického Mutant templâtu.
Reakëni smës dPCR byla vlozena do QIAcuity Nanoplate 8,5K a cyklovâna na QIAcuity Digital PCR System za nâsledujicich podminek: 3 minuty pri 95 °C, 45 cyklû, z nichz kazdÿ zahmoval 15sekundovou denaturaci pfi 95 °C s nâslednÿm 55°C prodlouzenim na 30 sekund. Akvizice obrazu byla provedena v kanâlu FAM a HEX. Data byla analyzovâna pomoci QIAcuity Software Suite s pouzitim manuâlniho prahovâni.
-26 CZ 2024- 197 A3
Tabulka 8: Nâvrhy primerû pouzitÿch v prikladu 6 pro detekci KRAS 29T
| nàzev | sekvence (DNA) |
| 2 T WT primer KRAS29T | CTCCAACTACCACAAGTTTATTTACGAAATGTTGGTACAGTGAGTACCAATAT GAGGACCATCTACGCCACC |
| 2T Mut primer KRAS 29T | CTCCAACTACCACAAGTTTATTTACGAAATGCAGGTACAGTTGGTACCTGTCT CCACCTACGCCACA |
| WT sonda KRAS29T | TTGGTACAGTGAGTACCAATATGAGGACCATC |
| Mut sonda KRAS29T | CAGGTACAGTTGGTACCTGTCTCCACC |
| Kôdujici primer KRAS29T | CCTGCTGAAAATGACTGAA |
| Antikôdujici primer KRAS 29T | CCAACTACCACAAGTTTATTTAC |
Tabulka 9: Nâvrhy primerû pouzitÿch v prikladu 6 pro detekci KRAS 29C
| nâzev | sekvence (DNA) |
| 2T WT primer KRAS 29C | CTCCAACTACCACAAGTTTATTTACGAAATGTTGGTACAGTGAGTACCA ATATGAGGACCATCTACGCCACC |
| 2 T Mut primer KRAS 29C | CTCCAACTACCACAAGTTTATTTACGAAATGCAGGTACAGTTGGTACCT GTCTCCACCTACGCCACG |
| WT sonda KRAS 29C | TTGGTACAGTGAGTACCAATATGAGGACCATC |
| Mut sonda KRAS29C | CAGGTACAGTTGGTACCTGTCTCCACC |
| Kôdujici primer KRAS 29C | CCTGCTGAAAATGACTGAA |
| Antikôdujici primer KRAS 29C | CCAACTACCACAAGTTTATTTAC |
Tabulka 10: Nâvrhy primerû pouzitÿch v prikladu 6 pro detekci KRAS 29A
-27 CZ 2024- 197 A3
| nazev | sekvence (DNA) |
| 2T WT primer | CTCCAACTACCACAAGTTTATTTACGAAATGTTGGTACAGTGAGTACCA |
| KRAS29A | ATATGAGGACCATCTACGCCACC |
| 2 T Mut primer | CTCCAACTACCACAAGTTTATTTACGAAATGCAGGTACAGTTGGTACCT |
| KRAS29A | GTCTCCACCTACGCCACT |
| WT sonda KRAS29A | TTGGTACAGTGAGTACCAATATGAGGACCATC |
| Mut sonda KRAS29A | CAGGTACAGTTGGTACCTGTCTCCACC |
| Kôdujici primer KRAS 29A | CCTGCTGAAAATGACTGAA |
| Antikôdujici primer KRAS 29A | CCAACTACCACAAGTTTATTTAC |
Tabulka 11: Nâvrhy primerû pouzitÿch v prikladu 6 pro detekci KRAS 30T
| nâzev | sekvence (DNA) |
| 2TWT primer KRAS30T | CTCCAACTACCACAAGTTTATTTACGAAATGTTGGTACAGTGAGTACCA ATATGAGGACCATCTACGCCACC |
| 2T Mut primer KRAS30T | CTCCAACTACCACAAGTTTATTTACGAAATGCAGGTACAGTTGGTACCT GTCTCCACCTACGCCAA |
| WT sonda KRAS30T | TTGGTACAGTGAGTACCAATATGAGGACCATC |
| Mut sonda KRAS30T | CAGGTACAGTTGGTACCTGTCTCCACC |
| Kôdujici primer KRAS 30T | CCTGCTGAAAATGACTGAA |
| Antikôdujici primer KRAS 30T | CCAACTACCACAAGTTTATTTAC |
Tabulka 12: Nâvrhy primerû pouzitÿch v prikladu 6 pro detekci KRAS 30C
-28 CZ 2024- 197 A3
| nàzev | sekvence (DNA) |
| 2T WTprimer (KRAS 30Q | CTCCAACTACCACAAGTTTATTTACGAAATGTTGGTACAGTGAGTACCA ATATGAGGACCATCTACGCCACC |
| 2T Mut primer (KRAS 30C) | CTCCAACTACCACAAGTTTATTTACGAAATGCAGGTACAGTTGGTACCT GTCTCCACCTACGCCAG |
| WT sonda (KRAS 30Q | TTGGTACAGTGAGTACCAATATGAGGACCATC |
| Mut sonda (KRAS 30Q | CAGGTACAGTTGGTACCTGTCTCCACC |
| Kôdujici primer (KRAS 30C) | CCTGCTGAAAATGACTGAA |
| Anükàflujici primer (KRAS 30C) | CCAACTACCACAAGTTTATTTAC |
Vÿsledky
Obrazek 6 znazomuje 2D amplifikacni grafy pro pet rùznÿch testû detekujicich vlâsenku se smyckou mutantû KRAS, vsechny pouzivajici stejné generické sekvence vlâsenky a komplementami sondy. Jak Ize vidët na segregaci bodû na grafech, vsech pet testû detekce mutantû fünguje velmi dobfe s minimalnim nesprâvnÿm pfekrÿvânim bodû.
Pfiklad 7.- Detekce vice rùznÿch mutantû KRAS za pouziti spolecné sekvence s kmenovou smyckou
Po prokâzâni, ze 2T design z obrâzku 1 byl vysoce ûcinnÿ pro detekci mnoha rùznÿch mutaci pro KRAS jednotlivë, byla hodnocena schopnost rozlisit mnohocetné mutace pomoci spolecné sekvence vlâsenky se smyckou.
Reagencie/Postup
Vzorky pouzité v experimentu pro amplifikaci obsahovaly syntetické templâty (gBlocksTM, objednané na zakâzku od IDT). Bylo pouzito sest templâtû, jeden obsahujici sekvenci WT a pet samostatnÿch fragmenta, z nichz kazdÿ obsahuje jednu mutantai sekvenci (mutace G12C, G12R, G12S, G12V a G12A).
Kazdâ dPCR reakce byla 12μ1 a obsahovala 3 μΐ QIAcuity Sonda Mastermix, 800 nM kôdujiciho primeru, 800 nM antikôdujiciho primeru, 400 nM WT sondy (HEX), 400 nM Mut sondy (FAM), 50 nM WT TwoTail primeru, 20nM 29T Mutant TwoTail primeru, 20nM 29C Mutant TwoTail primeru, 20nM 30T Mutant TwoTail primer, 20nM 30C Mutant TwoTail primer, 1000 kopii/μΐ WT templâtu (WT vzorek) nebo 500 kopii/μΐ syntetického WT templâtu a 500 kopii/μΐ jednoho z peti syntetickÿch mutantnich templâtû (50 % vzorkù - nâzvy vzorkù udâvaji, kterÿ mutantai templât byl pouzit pro pfislusné vzorky).
Reakce dPCR byly vlozeny do QIAcuity Nanoplate 8,5K a cyklovâny na QIAcuity Digital PCR System za nâsledujicich podminek: 3 minuty pfi 95 °C, 45 cyklù, z nichz kazdÿ zahmoval 15sekundovou denaturaci pfi 95 °C nâsledovanou 55 °C prodlouzenim na 30 sekund. Akvizice
-29 CZ 2024 - 197 A3 obrazu byla provedena v kanalu FAM a HEX. Data byla analyzovana pomoci QIAcuity Software Suite s pouzitim manualniho prahovani.
Tabulka 13: Nâvrhy primerû pouzitych v prikladu 7 pro detekci vice rûznych mutantû KRAS 5 pomoci bezné sekvence vlâsenky se smyckou
| nàzev | sekvence (DNA) |
| 2T WT primer | CTCCAACTACCACAAGTTTATTTACGAAATGTTGGTACAGTGAGTACC AATATGAGGACCATCTACGCCACC |
| 2T 29T Mut primer | CTCCAACTACCACAAGTTTATTTACGAAATGCAGGTACAGTTGGTAC CTGTCTCCACCTACGCCACA |
| 2T 29C Mut primer | CTCCAACTACCACAAGTTTATTTACGAAATGCAGGTACAGTTGGTAC CTGTCTCCACCTACGCCACG |
| 2T 29A Mut primer | CTCCAACTACCACAAGTTTATTTACGAAATGCAGGTACAGTTGGTAC CTGTCTCCACCTACGCCACT |
| 2T 30T Mut primer | CTCCAACTACCACAAGTTTATTTACGAAATGCAGGTACAGTTGGTAC CTGTCTCCACCTACGCCAA |
| 2T 30C Mut primer | CTCCAACTACCACAAGTTTATTTACGAAATGCAGGTACAGTTGGTAC CTGTCTCCACCTACGCCAG |
| WT sonda | TTGGTACAGTGAGTACCAATATGAGGACCATC |
| Mut sonda | CAGGTACAGTTGGTACCTGTCTCCACC |
| Kôdujic i primer | CCTGCTGAAAATGACTGAA |
| Antikôd ujici primer | CCAACTACCACAAGTTTATTTAC |
Vysledky
Vysledky jsou uvedeny v tabulce 14 nize.
Tabulka 14: Detekce vice mutantû KRAS s generickymi sekvencemi vlâsenky se smyckou
| vzorek | test | reportér | Koncentrace (kopie / pl) | CI (95%) | Prijaté oddily | Pozitivni odddily | Negativni oddily | % detekovanych mutantû |
| WT | Skriningovy test KRAS | Mut | 0,39 | 274,40% | 8253 | 1 | 8252 | 0,04% |
| WT | 976,4 | 3,90% | 8253 | 2161 | 6092 | |||
| 50% G12C | Skriningovy test KRAS | Mut | 467,7 | 5,70% | 8257 | 1101 | 7156 | 47,37% |
| WT | 519,7 | 5,40% | 8257 | 1214 | 7043 | |||
| 50% G12R | Skriningovy test KRAS | Mut | 528,1 | 5,30% | 8262 | 1245 | 7017 | 50,11% |
| WT | 525,8 | 5,30% | 8262 | 1240 | 7022 | |||
| Mut | 529,1 | 5,20% | 8225 | 1290 | 6935 | 48,44% |
- 30 CZ 2024 - 197 A3
| vzorek | test | reportér | Koncentrace (kopie / μΐ) | CI (95%) | Prijaté oddily | Pozitivni odddily | Negativni oddily | % detekovanÿch mutantû |
| 50% G12S | Skriningovÿ test KRAS | WT | 563,2 | 5,10% | 8225 | 1366 | 6859 | |
| 50% G12V | Skriningovÿ test KRAS | Mut | 258,6 | 7,70% | 8274 | 620 | 7654 | 32,48% |
| WT | 537,7 | 5,40% | 8274 | 1237 | 7037 | |||
| 50% G12A | Skriningovÿ test KRAS | Mut | 460,6 | 5,60% | 8242 | 1126 | 7116 | 46,43% |
| WT | 531,5 | 5,20% | 8242 | 1285 | 6957 |
Jak je patrné ze souhrnnÿch ùdajû, mnozstvi detekovanÿch mutantû pro kazdou z mutaci se tesne shoduje se skutecnou hodnotou 50 %, coz dokazuje, ze sady primerû s beznÿmi sekvencemi vlâsenky se smyckou jsou vysoce ùcinné pro detekci vsech mutaci v tabulce 14. OBRAZEK 7 ukazuje 2D grafy amplitudy pro stejnÿ experiment, coz graficky dokazuje, ze metoda 2T s beznÿmi primery vlasenky se smyckou funguje dobre pro rozliseni vice mutantû.
Priklad 8.- Rozliseni mezi methylovanou a nemethylovanou DNA za pouziti 2-strannÿch primerû
Poté, co bylo pozorovano, ze 2-strannÿ design z obrâzku 1 byl ùcinnÿ pro detekci mutantni DNA, byly primery navrzeny tak, aby rozlisovaly mezi nemethylovanou a methylovanou DNA na zâklade standardniho protokolu s pouzitim bisulfitového osetreni, které také zavâdi zmeny pârù bâzi v DNA pomoci konverze methylovanÿch cytosinû na uracil (napr. zpûsobujici zmenu z GC pâru bâzi na AT pâr bâzi v nâsledné PCR reakci). Methylované cytosiny se v eukaryotické DNA nachâzeji v 5'CG-3' dinukleotidovÿch repeticich, které jsou zvlâste bohaté v mnoha oblastech zâjmu znâmÿch jako CpG-ostrovy.
Vzhledem k tomu, ze 2T-primery se zameruji na samotné CG-dinukleotidové kroky, jejichz methylacni stav je zkoumân, metoda dvoustranné hemisondy predstavuje zjevné vÿhody oproti tradicni PCR amplifikaci.
CORO6 je gen, o kterém bylo zdokumentovâno, ze obsahuje ostrûvky CpG, které jsou hypermethylované v kardiomyocytech (viz napr. “Heart-specific DNA methylation analysis in plasma for the investigation of myocardial damage”, Ren et al., 2022, jenz je zaclenen odkazem v celém rozsahu zde). Jako takovou lze DNA specifickou pro srdce odlisit od DNA z jinÿch tkâni napriklad v cfDNA z krve - pomoci testu PCR citlivého na metylaci.
Obrâzek 8 panel A ukazuje schéma metylaci detekujiciho 2T-primeru (CORO6-2T.M) navrzeného k cileni na gen CORO6, s hemisondami cernÿm textem (tucne/podtrzenÿm) a sekvenci vlâsenky se smyckou a rameny tmavÿmi sedé câry, cilovou sekvenci cernÿm textem, rozsirenou sekvenci 2T-primerem (sedÿm textem), sekvenci antikôdujiciho a kôdujiciho primeru (cernou kurzivou). Sonda (neni ukâzâna) se selektivne vâze na komplement sekvence kmenové smycky a ramena 2Tprimeru. Cilovâ DNA mâ na pûvodnich cytosinovÿch mistech malâ pismena, kterâ se bisulfitovou ùpravou mohou zmenit na uracil (reprezentované na obrâzku a v syntetickÿch sekvencich DNA jako thyminy), zatimco methylovanâ CpG mista maji sedé zvÿrazneni (které v nemethylované DNA mohou bÿt zastoupen TG).
3' hemisonda 2T-primerû byla navrzena ke zkoumâni tri CpG mist v CpG ostrûvku CORO6 (cârkovanÿ râmecek). Protoze 3' hemisonda je velmi krâtkâ (13 bp pro 2T-primer detekujici methylovanou DNA, 16 bp pro 2T primer detekujici nemethylovanou DNA (viz CORO6-2T.NM 3'-hemisonda na obrâzku)), délka zkoumané sekvence DNA mûze bÿt krâtkâ, coz je vÿhodou pri prâci s vysoce fragmentovanÿm materiâlem DNA, jako je cfDNA a bisulfitove upravenâ DNA. Krome toho krâtkâ 3' hemisonda poskytuje rozliseni mezi methylovanou a nemethylovanou sekvenci, zejména proto, ze zahrnuje tri CpG mista.
- 31 CZ 2024- 197 A3
Reagenie/Postup
Byl proveden experiment k vyhodnoceni navrzeného testa CORO6, jehoz vÿsledek je znazomen na obr. 8 panel B. Templât pouzitÿ v expérimenta obsahoval syntetické templâty (gBlocksTM, IDT), jeden pfedstavajici methylovanoa sekvenci CORO6 (Methylated gBlock, ctverecky na obrâzkn) a jeden obsahnjici nemethylovanon sekvenci CORO6 (nemethylovanÿ gBlock). Templâtovâ DNA byla nspofâdâna takovÿm zpùsobem, ze vsechny cytosiny objevnjici se samostatne (nikoli v CpG dimikleotidn) v sekvenci byly pfevedeny na thymin, kterÿ pfedstavnje nracil vytvofenÿ po bisnlfitovém osetfeni. Cytosiny vyskytnjici se v CpG-dimikleotidech byly ponechâny nezmënëné v sekvenci pfedstavajici methylovanÿ gBlock, zatimco byly zmënëny na thyminy v sekvenci pfedstavajici nemethylovanÿ gBlock. Tyto dva templâty byly smichâny v pomëm 50/50 (Mixed gBlock, trojùhelniky na obrâzkn), aby se simnlovala tkân se smisenÿm methylaënim vzorem, jako je srdeëni tkân (viz Ren et al.). Byla také zahrmita kontrola bez sablony (NTC (H2O), kfizky na obrâzkn). Mnozstvi templâtn bylo 2E5 kopii/reakci na cilovon sekvenci.
Reakëni objem byl 10 pl a obsahoval TATAA Sonda GrandMaster Mix (lx), 400 nM kodnjiciho a antikôdnjiciho primera, 25 nM primera CORO6.2T-M (detekce methylace), 25 nM primera CORO6.2T-NM (ne-detekce methylace), 200 nM HEX sondy (vazba na komplement 2T-M primera), 200 nM FAM sondy (vazba na komplement 2T-NM primera).
Reakce qPCRbyly cyklovâny na BioRad CFX384 s nâslednjicim termocyklovacim programem: 1 minnta pfi 95 °C, 45 cyklù, z nichz kazdÿ zahmoval 5seknndovon denatnraci pfi 95 °C s nâslednon extenzi pfi 60 °C po dobn 30 seknnd. Akvizice obrazn byla provedena v kanâln FAM a HEX. Data byla analyzovâna pomoci softwam CFX Maestro g antomatické prahovâni (jedinÿ prâh) a ùprava zâkladni linie (prolozeni odeëtené kfivky zâkladni linie).
Oligonnkleotidové sekvence (5'->3') ponzité v expérimenta json nvedeny v tabnlce nize, sekvence komplementâmi k vazebnÿm mistùm sondy j son nvedeny pro 2T-primer podtrzenÿm textem:
| oligo | sekvence |
| CORO6.2T-M | AATCTCCCCTAAACTCCAATTACGAAATGTACTAGCGGC AAGCTAGTGCTAGACTTGACACCGCTAAAACGACG |
| CORO6.2T-NM | AATCTCCCCTAAACTCCAATTACGAAATGCAGGTACAGT TGGTACCTGTCTCCACCCTCCACTAAAACAACA |
| 2T-Universal HEX (methylacni) sonda | TACTAGCGGCAAGCTAGTGCTAGACTT |
| 2T-Universal FAM (ne methylacni) sonda | CAGGTACAGTTGGTACCTGTCTCCACC |
| CORO6.F | CCCTAAACTCCAATTACGAAATG |
| CORO6.RM | CGCGGGAGATTAGAATTTTTG |
| CORO6.RNM | TGTGGGAGATTAGAATTTTTGG |
Vÿsledky
-32 CZ 2024 - 197 A3
Graf na obrâzku 8 panel B ukazuje alelickou diskriminacm ùcinnost 2T-testu s pouzitim slozek z panelu A v qPCR na syntetickÿch sekvencich gBlock predstavujicich methylovanou DNA, nemethylovanou DNA, smisenou methylovanou/nemethylovanou DNA a ne ovlâdâni sablony (NTC). Pri teplote anealingu 60 °C se jasne odlisi jinÿ typ templâtové DNA, zatimco omezenÿ falesne pozitivni signal pozorovanÿ v NTC je omezen na kanal FAM (detekce nemethylované DNA), kterÿ nemusi interferovat s detekci metylované DNA.
Priklad 9.- Zkoumani stavu methylace FAM101A pomoci 2T-PCR
FAM101A je gen, kterÿ obsahuje CpG mista, ktera maji nizkÿ stupen methylace v srdecni tkani ve srovnani s jinÿmi tkanemi (viz napr. “Non-invasive detection of human cardiomyocyte death using methylation patterns of circulating DNA”, Zemmour et al., 2018, kterÿ je zde v celém svém rozsahu zahrnut odkazem). Jako takova mûze bÿt FAM101A srdce specificka DNA odlisena v cfDNA od krve pomoci testu PCR citlivého na methylaci.
Obrazek 9 panel A ukazuje schéma 2T-primeru nedetekujiciho methylaci pro detekci stavu methylace genu FAM101A (FAM101A-2T.NM s hemisondami v cerném textu (tucne/podtrzené) a sekvenci kmenové smycky a rameny v tmave sedÿch carach, cilova sekvence v cerném textu, sekvence antikôdujiciho a kôdujiciho primeru (cernou kurzivou) Sonda (neni ukazana) se selektivne vaze na komplement vlâsenky se smyckou sekvence a ramena 2T-primeru DNA byla upravena tak, ze pûvodni ,jedinâ“ cytosinovâ mista jsou reprezentovâna thyminem (protoze bisulfitové osetreni mûze takové cytosiny promenit na uracily), zatimco pûvodni CpG mista maji sedé zvÿrazneni (které v nemethylovaném templâtu DNA a na obrâzku jsou zastoupeny TG).
Hemisonda 3' 2T-primerû byla navrzena tak, aby zkoumala tri CpG-mista, zatimco 5' konec dotazovala dve CpG-mista FAM101A. Diky konstrukci 2T-testu mûze bÿt délka dotazované sekvence DNA krâtkâ, coz je vÿhodou pri prâci s vysoce fragmentovanÿm materiâlem DNA, jako je cfDNA a bisulfitove upravenâ DNA. Krome toho relativne krâtkâ 3' hemisonda (20 bp) poskytuje vynikajici rozliseni mezi methylovanou a nemethylovanou sekvenci, zejména proto, ze zahrnuje tri CpG mista. V tomto provedeni testu také 5' hemisonda zvysuje specificitu testu, protoze kooperativni vazebnâ sila 2T testu bude slabsi, pokud nebudou vsechna CpG mista methylovâna/nemethylovâna ve stejnou dobu.
Reagencie/Postup
Byl proveden experiment k vyhodnoceni navrzeného testu FAM101A, jehoz vÿsledek je znâzornen na obr. 9 panel B. Templât pouzitÿ v experimentu obsahuje syntetické templâty (gBlocksTM, IDT), z nichz jeden predstavuje methylovanou sekvenci FAM101A (metylovanÿ gBlock, kruhy na obrâzku) a jeden obsahujici nemethylovanou sekvenci FAM101A (nemethylovanÿ gBlock, ctverce na obrâzku). Templâtovâ DNA byla usporâdâna takovÿm zpûsobem, ze vsechny cytosiny objevujici se samostatne (nikoli v CpG dinukleotidu) v sekvenci byly prevedeny na thymin, kterÿ predstavuje uracil vytvorenÿ po bisulfitovém osetreni. Cytosiny vyskytujici se v CpGdinukleotidech byly ponechâny nezmenené v sekvenci predstavujici methylovanÿ gBlock, zatimco byly zmeneny na thyminy v sekvenci predstavujici nemethylovanÿ gBlock. Tyto dva templâty byly smichâny v pomeru 50/50 (Mixed gBlock, trojùhelniky na obrâzku), aby se simulovala tkân se smisenÿm methylacnim vzorem, jako je srdecni tkân (viz Ren et al.). Byla také zahrnuta kontrola bez sablony (NTC (H2O), krizky na obrâzku). Mnozstvi templâtu bylo 2E5 kopii/reakci na cilovou sekvenci.
Reakcni objem byl 10 μl a obsahoval TATAA Sondu GrandMaster Mix (1x), 400 nM kôdujiciho a antikôdujiciho primeru, 25 nM primeru FAM101A.2T-M (detekce methylace), 25 nM primeru FAM101A.2T-NM (ne-detekce methylace), 200 nM HEX sondu (vazba na komplement 2T-M primeru), 200 nM FAM sondu (vazba na komplement 2T-NM primeru).
- 33 CZ 2024- 197 A3
Reakce qPCRbyly cyklovâny na BioRad CFX384 s nasledujicim termocyklovacim programem: 1 minuta pfi 95 °C, 45 cyklû, z nichz kazdÿ zahmoval 5sekundovou denaturaci pfi 95 °C nâsledovanou zihanim/prodluzovanim pfi 55,2 az 61,8 °C po dobu 30 sekundy. Akvizice obrazu byla provedena v kanâlu FAM a HEX. Data byla analyzovâna pomoci CFX Maestro Software za pouziti automatického prahovâni (jedinÿ prâh) a ùpravy zâkladni linie (prolozeni odectené kfivky zakladni linie).
Oligonukleotidové sekvence (5'->3') pouzité v experimentu jsou uvedeny v tabuice nize, sekvence komplementami k vazebnÿm mistùm sondy jsou uvedeny pro 2T-primer v podtrzeném textu:
| oligo | Sekvence |
| FAM101A.2T-M | ATCGCAAAIAAAAACCGAACATTTCCTTACGAAATC CAGGTACAGTTGGTACCTGTCTCCACCCAACGCACGATAAAACG |
| FAM101A.2T NM | ATCACAAAIAAAAACCAAACATTTCCTTACGAAATC TACTAGCGGCAAGCTAGTGCTAGACTTCAACAACACACAATAAAACA |
| 2 T-Universal HEX (ne methylacni) sonda | TACTAGCGGCAAGCFAGTGCTAGACTT |
| 2T-Universal FAM (methylacni) sonda | CAGGTACAGTTGGTACCTGTCTCCACC |
| FAM101A.F-M | CCGAACATTTCCTTACGAAATC |
| FAM101A.F-NM | AACCAAACATTTCCTTACGAAATC |
| FAM101A.R | GAAAAGTGTAGGTTTTATAGGTAGA |
Vÿsledky
Obrâzek 9 panel B ukazuje alelickou diskriminacni ùëinnost 2T-testu v qPCR na syntetickÿch sekvencich gBlock pfedstavujicich methylovanou DNA, nemethylovanou DNA, smisenou methylovanou/nemethylovanou DNA a kontrolu bez template (NTC). Pfi teplotâch anealingu kolem 55 az 62 °C test probihâ robustnë a je provedeno jasné rozliseni rùznÿch typù templâtové DNA, pficemz se falesnë pozitivni signal udrzuje velmi nizkÿ a je omezen na kanâl FAM (detekce methylované DNA).
Pfiklad 10.- Detekce tkânovë specifické DNA zacilenim na selektivni methylaëni vzor
U CG-ostrovù CORO6 aFAMIOlAbylo zdokumentovâno, ze maji, v tomto pofadi, vysokÿ a nizkÿ stupen methylace v srdeëni tkâni, v protikladu k vzorùm pozorovanÿm v jinÿch tkânich, jako jsou bilé krvinky (viz napf. Ren et al. 2022, Zemmour et al. 2018, kterÿ je zde zahmut jako odkaz v celém rozsahu). Po prokâzâni ùëinnosti dvoustranného pfistupu z obrâzku 1 pro CORO6 a FAM101A v pfedchozich pfikladech jsme pfedpoklâdali, ze je mozné rozlisit srdeëni DNA v bezbunëëné DNA pfitomné v plazmë.
Reagencie/postup
-34 CZ 2024 - 197 A3
Za ùcelem vyhodnoceni testû tkanové diskriminacm kapacity byly testy pouzity k analyze DNA extrahované ze srdecni tkane a bilych krvinek (WBC). Diagram na obrazku 10 Panel A predstavuje grafy alelické diskriminace zalozené na konecné relativni fluorescenci (RFU) ziskané v experimentu qPCR, ve kterém drive popsané 2T-PCR testy CORO6 a FAM101A byly pouzity k rozliseni mezi methylovanou a nemethylovanou DNA.
Pouzité syntetické templaty byly stejné, jak jsou uvedeny v casti metody pro obrazek 8 a 9: predstavujici methylovanou sekvenci CORO6/FAM101A (M.gBlock) a nemethylovanou sekvenci CORO6/FAM101A (NM.gBlock). Templaty byly smichany v pomeru 50/50 (Mixed gBlock), aby se simulovala tkan se smisenym methylacnim vzorem, jako je srdecni tkan (Ren et al. 2022, ktery je zde cely zahrnuta odkazem). Mnozstvi templatu bylo 2E5 kopii/reakci na cilovou sekvenci. Byla také zahrnuta kontrola bez sablony (NTC).
Vzorky odvozené od cloveka pochazeji ze dvou jedinecnych vzorkû WBC odebranych ze shromazdenych vzorkû krve v EDTA zkumavkach od 20-30 jedincû a dvou vzorkû srdce ziskanych od dvou jedinecnych pacientû podstupujicich operaci srdce. DNA byla extrahovana z bunek/tkani pomoci soupravy DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, art no 69504). 200 ng kazdého extrahovaného vzorku DNA bylo poté osetreno bisulfitem (BST) pomoci soupravy EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Zymo Research, art no. D5030) a eluovano v 10 μl elucniho pufru. 2 μl eluatu bylo pouzito jako templat pro naslednou qPCR analyzu, coz odpovida 40 ng BST-DNA. Ocekâvâ se, ze bisulfitové osetreni degraduje DNA na ùroven 60-90 % (Zemmour et al. 2018).
Reakcni objem byl 10 μl a obsahoval TATAA Sonda GrandMaster Mix (1x), 400 nM kôdujici a antikôdujici primer, 25 nM primer CORO6/FAM101A.2T-M (detekce methylace), 25 nM CORO6/FAM101A.2T- NM primer (nemethylacni detekce), 200 nM HEX sonda (vazba na komplement 2T-M (CORO6) nebo 2T-NM (FAM101A) primeru), 200 nM FAM sonda (vazba na komplement 2T-NM (CORO6) popr. 2T-M (FAM101A) primer). Oligonukleotidové sekvence pouzité v experimentu byly stejné jako ty, které jsou uvedeny v casti reagencie/postup v prikladu 8 a 9.
Reakce qPCR byly cyklovany na BioRad CFX384 s nasledujicim termocyklovacim programem: 1 minuta pri 95 °C, 45 cyklû, z nichz kazdy zahrnoval 5sekundovou denaturaci pri 95 °C nasledovanou zihânim/prodluzovânim pri 60 °C po dobu 30 sekund. Ziskavani snimkû bylo provadeno pomoci kanalu FAM a HEX. Data byla analyzovana pomoci CFX Maestro Software za pouziti automatického prahovani (jediny prah) a ùpravy zakladni linie (prolozeni odectené krivky zakladni linie).
Vzorky popsané ve zpûsobu vyse pro obrazek 10 Panel A byly také analyzovany v digitalnim PCR experimentu s pouzitim testovaciho oligonukleotidu FAM101A popsaného v reagenciich/postupu pro priklad 9. Kazda dPCR reakce byla 12 μl a obsahovala QIAcuity Sonda Mastermix (1x), 800 nM kôdujici a antikôdujici primer, 25 nM primer FAM101A.2T-M (detekce methylace), 25 nM primer FAM101A.2T-NM (detekce nemethylace), 200 nM sonda HEX (vazba na komplement 2TNM primeru), 200 nM sonda FAM (vazba na komplement 2T-M primeru). Ke kazdé reakci byly pridany 4 μl templatu. U syntetickych vzorkû gBlock mel zasobni roztok koncentraci 1E4 cp/μ! (celkové zatizeni na reakci: 40 000 kopii na cil), zatimco tkanova DNA mela pred osetrenim BST koncentraci 20 ng/μ! (celkové zatizeni na reakci, 80 ng, coz odpovida pfiblizne 24 000 kopii genomu). Oligonukleotidové sekvence pouzité v experimentu byly stejné, jak jsou uvedeny v tabulce 1 a 2.
Reakce dPCR byly vlozeny do QIAcuity Nanoplate 26K a cyklovany na QIAcuity Digital PCR System za nasledujicich podminek: 3 minuty pri 95 °C, 45 cyklû, kazdy obsahujici 15sekundovou denaturaci pri 95 °C a nasledné prodlouzeni pri 55 °C po dobu 30 sekund. Akvizice obrazu byla provedena v kanalu FAM a HEX. Data byla analyzovana pomoci QIAcuity Software Suite za pouziti manualniho prahovani.
- 35 CZ 2024 - 197 A3
Vysledky Obrazek 10 panel A znazornuje vÿsledky alelické diskriminace pomoci qPCR pri analyze methylacmch/nemethylacnich reprezentativnich gBlokû genû CORO6 a FAM101A synteticky vyrobenÿch (2E5 cp/reakce) (M.gB - methylovanÿ cil; NM.gB - nemethylovanÿ target; Mix.gB 50/50 mix M/NM-gBlocks) spolu se dvema unikâtnimi bisulfitove osetrenÿmi (BST) vzorky DNA extrahovanÿmi z bilÿch krvinek (WBC) a srdecni tkane (40 ng DNA/reakce (pred BST)). Primery CORO6 a FAM101A byly zkonstruovâny jako v predchozich prikladech a pro detekci obou markerû byla provedena qPCR jako v predchozich prikladech. HEX fluorofor je signal pro methylovanou sekvenci CORO6 a nemethylovanou FAM101A. Jak se ocekâvâ na zaklade zdokumentovaného chovani CORO6 a FAM101A, vykazuji WBC signal v kanalu FAM, zatimco srdce vykazuje signal v kanalu HEX i FAM, coz ukazuje, ze oba testy mohou detekovat srdecni DNA na pozadi bilÿch krvinek (tzv. hlavni zdroj DNA v cfDNA).
Obrazek 10 panel B znazornuje vÿsledky, kdyz vzorky popsané na obrâzku 10 panel A byly analyzovany pomoci FAM101A 2T-testu za pouziti digitâlni PCR (QIAcuity, Qiagen) misto qPCR. Vzorky srdce vykazuji smisenÿ signâl (FAM/HEX), zatimco WBC vykazuji signâl pro methylovanou DNA (FAM). NTC vykazuji relativne vysokou fluorescenci pozadi v NTC, ale signâl je omezen na kanâl FAM a jako takovâ neni ohrozena detekce signâlu specifického pro srdce (HEX). Tyto vÿsledky naznacuji, ze 2T-PCR bude ùcinnâ pro kvantifikaci celkové cilové DNA v kontextu methylace (nemethylované/methylované), coz je pnnosné pro analÿzu cfDNA, kde je analÿza tkâne pûvodu pro cfDNA biologicky informativni.
Priklad 11. Primâ krevni genotypizace
Po pozorovâni vysoké ùcinnosti dvoustranné metody z obrâzku 1 pro detekci mutaci v rûznÿch kontextech jsme se zeptali, zda mûze bÿt metoda ùcinnâ pro genotypizaci ze vzorkû nezpracované krve. V souladu s tim byl vzorek nezpracované krve (napr. bez extrakce nebo cisteni nukleové kyseliny) genotypovân na mutaci faktoru V (Leiden) pomoci 2T-qPCR. Primery byly navrzeny podle schématu zobrazeného na obrâzku 1 a predchozich prikladû pro vytvoreni SEKV ID C: 6772. Tri standardni vzorky krve (homozygot divokého typu, homozygotni mutant a heterozygot) byly ziskâny od Equalis. byl inkubovân 1 μl kazdého krevniho vzorku s 24 μl lyzacniho pufru pri 96 °C po dobu 10 minut. Vzorek byl za ùcelem odstraneni bunecnÿch zbytkû centrifugovân. Supernatant byl poté smichân se stejnÿm mnozstvim vody a 2 μl byly pouzity jako templât v qPCR za podminek popsanÿch v predchozich prikladech.
Obrâzek 11 znâzornuje vÿsledky tohoto experimentu. Levÿ panel na obrâzku 11 ukazuje duplicitni mereni qPCR u homozygotu divokého typu (nahore), homozygotniho mutantu (uprostred) a heterozygotu (dole). Pravÿ panel ukazuje graf shromazdujici namerenâ data na zâklade intenzity fluorescence jasne rozlisujici duplikâty dvou homoduplexû a heteroduplexû. Graf na pravém panelu jasne ukazuje, ze divokÿ typ, heterozygot a mutant mohou bÿt odliseni od plné nezpracované krve bez dalsich krokû cisteni.
I kdyz zde byla ukâzâna a popsâna vÿhodnâ provedeni predklâdaného vynâlezu, bude odbornikûm v oboru zrejmé, ze takovâ provedeni jsou poskytnuta pouze jako priklad. Odbornikûm v oboru nyni vyvstanou cetné variace, zmeny a substituce, aniz by doslo k odchÿleni se od vynâlezu. Melo by bÿt zrejmé, ze pri provâdeni vynâlezu mohou bÿt pouzity rûzné alternativy ke zde popsanÿm provedenim vynâlezu. Je zamÿsleno, ze nâsledujici nâroky definuji rozsah vynâlezu a ze zpûsoby a struktury v rozsahu techto nârokû a jejich ekvivalenty jsou v nich zahrnuty.
Claims (84)
1. Zpùsob zpracovâni sekvence DNA majici nebo je v podezreni, ze ji mâ, sekvencni variantu vzhledem k sekvenci divokého typu, kde tento zpùsob zahrnuje:
v reakcni smesi vhodné pro zpracovani uvedené sekvence DNA se spoji:
(i) uvedenâ sekvence DNA, kde uvedenâ sekvence DNA obsahuje variaci alespon jednoho nukleotidu vzhledem k uvedené sekvenci divokého typu; a (ii) primer vlâsenka se smyckou, kterÿ obsahuje:
5' hemisondovou sekvenci nakonfigurovanou tak, aby hybridizovala s prvni koncovou oblasti komplementârni k uvedené DNA sekvenci;
sekvence vlâsenky se smyckou; a
3' hemisondovâ sekvence konfigurovanâ tak, aby hybridizovala s druhou koncovou oblasti uvedené sekvence DNA, kde 3' terminâlni câst uvedené 3' hemisondové sekvence obsahuje nukleotid komplementârni k uvedené neshode, ale ne komplementârni k uvedené sekvenci divokého typu.
2. Zpùsob podle nâroku 1, vyznacujici se tim, ze dâle zahrnuje inkubaci uvedené reakcni smesi za podminek vhodnÿch k prodlouzeni produktu obsahujiciho uvedenou 3' hemisondovou sekvenci.
3. Zpùsob podle nâroku 2, vyznacujici se tim, ze dâle zahrnuje spojeni v uvedené reakcni smesi vhodné pro zpracovâni uvedeného produktu obsahujiciho uvedenou 3' hemisondovou sekvenci: antikôdujiciho primeru konfigurovaného tak, aby hybridizoval s genomickou oblasti 3' z uvedené neshody.
4. Zpùsob podle nâroku 3, vyznacujici se tim, ze antikôdujici primer mâ Tm priblizne 50 az 70 stupnù Celsia.
5. Zpùsob podle kteréhokoli z nârokù 3 az 4, vyznacujici se tim, ze dâle zahrnuje inkubaci uvedené reakcni smesi vhodné pro zpracovâni uvedeného produktu obsahujiciho uvedenou 3' hemisondovou sekvenci za podminek vhodnÿch k produkci produktù prodlouzeni z antikôdujiciho primeru.
6. Zpùsob podle nâroku 5, vyznacujici se tim, ze dâle zahrnuje spojeni v reakcni smesi vhodné pro zpracovâni uvedeného produktu obsahujiciho sekvenci antikôdujiciho primeru: uvedeného produktu obsahujiciho uvedenou sekvenci antikôdujiciho primeru; a kôdujiciho primeru konfigurovaného pro hybridizaci s: (i) alespon câsti uvedené 5' hemisondové sekvence; a (ii) alespon câsti stopky uvedené sekvence vlâsenky se smyckou.
7. Zpùsob podle nâroku 6, vyznacujici se tim, ze kôdujici primer obsahuje alespon priblizne 12 az priblizne 30 nukleotidù komplementârnich k uvedené 5' hemisondové sekvenci.
8. Zpùsob podle nâroku 7, vyznacujici se tim, ze kôdujici primer obsahuje alespon priblizne 9 az priblizne 35 nukleotidù komplementârnich k uvedené stopce uvedené 3'sekvence vlâsenky se smyckou k uvedenÿm nukleotidùm komplementârnim k uvedené 5' hemisondové sekvenci.
9. Zpùsob podle kteréhokoli z nârokù 6 az 8, vyznacujici se tim, ze uvedenÿ kôdujici primer mâ Tm priblizne 50 az priblizne 70 stupnù Celsia.
10. Zpùsob podle kteréhokoli z nârokù 6 az 9, vyznacujici se tim, ze dâle zahrnuje inkubaci uvedené reakcni smesi vhodné pro zpracovâni uvedeného produktu obsahujiciho sekvenci antikôdujiciho primeru za podminek vhodnÿch k produkci produktù prodlouzeni z uvedeného kôdujiciho primeru.
11. Zpùsob podle kteréhokoli z nârokù 6 az 10, vyznacujici se tim, ze uvedené antikôdujici a kôdujici primery jsou v prebytku nebo jsou alespon priblizne ve 20nâsobne, alespon priblizne v
- 37 CZ 2024 - 197 A3
50nâsobne, alespon priblizne ve 100nâsobne, alespon priblizne ve 200nâsobne, alespon priblizne v 500nâsobne, alespon priblizne v 1000nâsobne vyssi koncentraci, nez je koncentrace uvedeného dvoustranného primeru.
12. Zpûsob podle kteréhokoli z nârokû 6 az 11, vyznacujici se tim, ze koncentrace uvedeného dvoustranného primeru je vyssi nez nebo je alespon priblizne 20nâsobne, alespon priblizne 50nâsobne, alespon priblizne 100nâsobne pri alespon priblizne 200nâsobne, alespon priblizne 500nâsobne, alespon priblizne 1000nâsobne vyssi v koncentraci nez koncentrace uvedené sekvence DNA.
13. Zpûsob podle kteréhokoli z nârokû 1 az 12, vyznacujici se tim, ze uvedenâ vlâsenka se smyckou amplifikuje uvedenou mutantni polynukleotidovou sekvenci alespon priblizne 10krât, alespon priblizne 100krât, alespon priblizne 1000krât, alespon priblizne 10 OOOkrât, alespon priblizne 100 OOOkrât nebo alespon priblizne 1 000 OOOkrât prednostne oproti uvedené polynukleotidové sekvenci divokého typu.
14. Zpûsob podle kteréhokoli z nârokû 1 az 13, kde uvedenâ mutantni polynukleotidovâ sekvence nebo polynukleotidovâ sekvence divokého typu obsahuje genomovou DNA.
15. Zpûsob podle kteréhokoli z nârokû 1 az 14, vyznacujici se tim, ze uvedenâ 5' hemisondovâ sekvence obsahuje délku priblizne 7 az priblizne 22 nukleotidû.
16. Zpûsob podle kteréhokoliv z nârokû 1 az 15, vyznacujici se tim, ze uvedenâ 3' hemisondovâ sekvence obsahuje délku priblizne 3 az priblizne 9 nukleotidû.
17. Zpûsob podle kteréhokoli z nârokû 1 az 16, vyznacujici se tim, ze uvedenâ 3' hemisondovâ sekvence mâ Tm priblizne 30 az 40 stupnû nebo uvedenâ 5' hemisondovâ sekvence mâ Tm priblizne 6O az 75 stupnû.
18. Zpûsob podle kteréhokoliv z nârokû 1 az 17, kde uvedenâ sekvence vlâsenky se smyckou obsahuje délku priblizne 15 nukleotidû nebo vice.
19. Zpûsob podle kteréhokoliv z nârokû 1 az 18, vyznacujici se tim, ze uvedenâ sekvence vlâsenky se smyckou je konfigurovâna tak, aby mela Tm priblizne 55 az priblizne 75 stupnû Celsia.
20. Zpûsob podle kteréhokoli z nârokû 1 az 19, kde vlâsenka se smyckou obsahuje alespon priblizne 1 az alespon priblizne 20 nukleotidû na délku.
21. Zpûsob podle kteréhokoli z nârokû 1 az 20, vyznacujici se tim, ze smycka uvedené sekvence vlâsenky se smyckou obsahuje barkôd.
22. Zpûsob podle kteréhokoli z nârokû 10 az 21, vyznacujici se tim, ze uvedenâ reakcni smes vhodnâ pro zpracovâni uvedeného produktu obsahujiciho sekvenci antikôdujiciho primeru za podminek vhodnÿch pro produkci produktû prodlouzeni z uvedeného kôdujiciho primeru dâle obsahuje oligonukleotidovou sondu obsahujici detekovatelnou skupinu, pricemz uvedenâ oligonukleotidové sonda je konfigurovâna tak, aby hybridizovala s komplementem alespon câsti uvedeného primeru vlâsenky se smyckou.
23. Zpûsob podle nâroku 22, vyznacujici se tim, ze uvedenâ alespon câst uvedeného primeru vlâsenky se smyckou obsahuje alespon câst uvedené sekvence vlâsenky se smyckou.
24. Zpûsob podle nâroku 23, vyznacujici se tim, ze uvedenâ alespon câst uvedené sekvence vlâsenky se smyckou obsahuje alespon câst sekvence smycky v uvedené sekvenci vlâsenky se smyckou.
- 38 CZ 2024 - 197 A3
25. Zpûsob podle kteréhokoli z narokû 22 az 24, vyznacujici se tim, ze uvedena detekovatelna skupina obsahuje 5' fluorofor.
26. Zpûsob podle naroku 25, vyznacujici se tim, ze uvedena oligonukleotidova sonda obsahujici uvedenou detekovatelnou skupinu dale obsahuje zhasec.
27. Zpûsob podle kteréhokoliv z narokû 10 az 26, vyznacujici se tim, ze uvedena inkubace zahrnuje PCR reakci, qPCR reakci, dPCR reakci, ddPCR reakci nebo sekvenacni reakci.
28. Sada pro zpracovani sekvence DNA vyznacujici se tim, ze obsahuje:
a) primer vlasenky se smyckou, kterÿ obsahuje:
(i) 5' hemisondovou sekvenci konfigurovanou tak, aby hybridizovala s prvni koncovou oblasti komplementarni k uvedené DNA sekvenci;
(ii) sekvenci vlasenky se smyckou; a (iii) 3' hemisondovou sekvenci nakonfigurovanou tak, aby hybridizovala s druhou koncovou oblasti uvedené DNA sekvence;
(b) kôdujici primer konfigurovanÿ pro hybridizaci s: (i) alespon casti uvedené 5' hemisondové sekvence; a (ii) alespon cast kmene uvedené sekvence vlasenky se smyckou; a (c) antikôdujici primer konfigurovanÿ tak, aby hybridizoval s genomovou oblasti 3' z uvedené neshody.
29. Sada podle naroku 27, vyznacujici se tim, ze uvedena sekvence DNA ma nebo je v podezreni, ze ma variaci alespon jednoho nukleotidu vzhledem k sekvenci divokého typu.
30. Sada podle naroku 29, vyznacujici se tim, ze 3' terminalni cast uvedené 3' hemisondové sekvence obsahuje nukleotid komplementarni k uvedené variaci, ale ne komplementarni k uvedené sekvenci divokého typu.
31. Sada podle naroku 27, vyznacujici se tim, ze dale obsahuje:
(d) oligonukleotidovou sondu obsahujici detekovatelnou skupinu, kde uvedenÿ oligonukleotid je konfigurovan tak, aby hybridizoval s alespon casti uvedeného primeru vlasenky se smyckou.
32. Sada podle naroku 27 nebo naroku 29, vyznacujici se tim, ze uvedena alespon cast uvedeného primeru vlasenky se smyckou obsahuje alespon cast uvedené sekvence vlasenky se smyckou.
33. Sada podle kteréhokoli z narokû 27 az 32, vyznacujici se tim, ze uvedena alespon cast uvedené sekvence vlasenky se smyckou obsahuje v uvedené sekvenci vlasenky se smyckou alespon cast sekvence vlasenky se smyckou.
34. Sada podle kteréhokoli z narokû 27 az 33, vyznacujici se tim, ze uvedena detekovatelna skupina obsahuje 5' fluorofor.
35. Sada podle naroku 34, vyznacujici se tim, ze uvedena oligonukleotidova sonda obsahujici uvedenou detekovatelnou skupinu dale obsahuje zhasec.
36. Sada podle kteréhokoli z narokû 27 az 35, vyznacujici se tim, ze antikôdujici primer ma Tm priblizne 50 az 70 stupnû Celsia.
37. Sada podle kteréhokoli z narokû 27 az 36, kde uvedenÿ kôdujici primer obsahuje alespon priblizne 12 az priblizne 30 nukleotidû komplementamich k uvedené 5'hemisondové sekvenci.
38. Sada podle kteréhokoli z narokû 27 az 37, kde uvedenÿ kôdujici primer obsahuje alespon priblizne 9 az priblizne 35 nukleotidû komplementamich k uvedenému kmeni uvedené sekvence vlasenka se smyckou 3' k uvedenÿm nukleotidûm komplementarnim k uvedené 5' hemisondové sekvenci.
- 39 CZ 2024 - 197 A3
39. Sada podle kteréhokoli z narokû 27 az 38, kde uvedenÿ kôdujici primer ma Tm priblizne 50 az priblizne 70 stupnû Celsia.
40. Sada podle kteréhokoli z narokû 27 az 39, kde uvedenÿ primer vlasenky se smyckou amplifikuje uvedenou mutantni polynukleotidovou sekvenci alespon priblizne 10nasobne, alespon priblizne 100nasobne, alespon priblizne 1000nasobne, alespon priblizne 10 000nasobne, alespon priblizne 100 000nasobne nebo alespon priblizne 1 000 000nasobne prednostne oproti uvedené polynukleotidové sekvenci divokého typu.
41. Sada podle kteréhokoli z narokû 27 az 40, kde uvedena 5' hemisondova sekvence obsahuje délku priblizne 7 az priblizne 22 nukleotidû.
42. Sada podle kteréhokoli z narokû 27 az 41, kde uvedena 3' hemisondova sekvence obsahuj e délku priblizne 3 az priblizne 9 nukleotidû.
43. Sada podle kteréhokoli z narokû 27 az 42, vyznacujici se tim, ze uvedena 3' hemisondova sekvence ma Tm priblizne 30 az 40 stupnû nebo uvedena 5' hemisondova sekvence ma Tm priblizne 60 az 75 stupnû.
44. Sada podle kteréhokoli z narokû 27 az 43, kde uvedena sekvence vlasenky se smyckou obsahuje délku priblizne 15 nukleotidû nebo vice.
45. Sada podle kteréhokoli z narokû 27 az 44, vyznacujici se tim, ze uvedena sekvence vlasenky se smyckou je konfigurovana tak, aby mela Tm priblizne 55 az priblizne 75 stupnû Celsia.
46. Kit podle kteréhokoli z narokû 27 az 45, kde smycka uvedené sekvence vlasenky se smyckou obsahuje alespon priblizne 1 az alespon priblizne 20 nukleotidû na délku.
47. Kit podle kteréhokoli z narokû 27 az 46, vyznacujici se tim, ze smycka uvedené sekvence vlasenky se smyckou obsahuje barkôd.
48. Kit podle naroku 27, vyznacujici se tim, ze uvedenÿ primer vlasenky se smyckou, uvedenÿ kôdujici primer nebo uvedenÿ antikôdujici primer obsahuji kteroukoli ze SEKV ID C: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 13, 14, 15, 16, 19, 20, 23, 24, 27, 28, 29, 30, 33, 34, 35, 36, 39, 40, 41, 42, 45, 46, 47, 48, 51, 52, 53, 54, 53, 54 58, 59, 60, 61, 64, 65, 66, 67, 68, 71 nebo 72.
49. Kompozice pro zpracovani sekvence DNA, vyznacujici se tim, ze obsahuje (a) primer vlasenky se smyckou, kterÿ obsahuje:
(i) 5' hemisondovou sekvenci konfigurovanou tak, aby hybridizovala s prvni koncovou oblasti komplementarnim s uvedenou DNA sekvence;
(ii) sekvence vreteno-smycka; a (iii) 3' hemisondovou sekvenci nakonfigurovanou tak, aby hybridizovala s druhou koncovou oblasti uvedené DNA sekvence;
(b) kôdujici primer konfigurovanÿ pro hybridizaci s:(i) alespon cash uvedené 5' hemisondové sekvence; a (ii) alespon cast kmene uvedené sekvence vlasenky se smyckou; a (c) antikôdujici primer konfigurovanÿ tak, aby hybridizoval s genomickou oblasti 3' z uvedené neshody, pricemz koncentrace uvedeného kôdujiciho primeru nebo koncentrace uvedeného antikôdujiciho primeru jsou alespon 10krat vyssi nez koncentrace uvedeného primeru vlasenky se smyckou.
50. Kompozice podle naroku 49, vyznacujici se tim, ze uvedena sekvence DNA ma nebo je v podezreni, ze ma variaci alespon jednoho nukleotidu vzhledem k sekvenci divokého typu.
51. Kompozice podle naroku 50, vyznacujici se tim, ze 3' koncova cast uvedené 3' hemisondové sekvence obsahuje nukleotid komplementarni k uvedené variaci, ale ne komplementarni k uvedené sekvenci divokého typu.
- 40 CZ 2024 - 197 A3
52. Kompozice podle kteréhokoli z narokû 49 az 51, dale obsahujici:
(d) oligonukleotidovou sondu obsahujici detekovatelnou skupinu, kde uvedenÿ oligonukleotid je konfigurovan tak, aby hybridizoval s alespon câsti uvedeného primeru vlasenky se smyckou.
53. Kompozice podle naroku 52, vyznacujici se tim, ze uvedena alespon cast uvedeného primeru vlasenky se smyckou obsahuje alespon cast uvedené sekvence vlasenky se smyckou.
54. Kompozice podle naroku 53, vyznacujici se tim, ze uvedena alespon cast uvedené sekvence vlasenky se smyckou obsahuje v uvedené sekvenci vlasenky se smyckou alespon cast sekvence smycky.
55. Kompozice podle kteréhokoli z narokû 49 az 54, vyznacujici se tim, ze detekovatelna cast obsahuje 5' fluorofor.
56. Kompozice podle naroku 55, kde uvedena oligonukleotidova sonda obsahujici uvedenou detekovatelnou skupinu dale obsahuje zhasec.
57. Kompozice podle kteréhokoli z narokû 49 az 56, vyznacujici se tim, ze uvedena koncentrace uvedeného kôdujiciho primeru nebo uvedena koncentrace uvedeného antikôdujiciho primeru je vyssi nez nebo je alespon priblizne 20nasobne, alespon priblizne 50nasobne, alespon priblizne 100nasobne, alespon priblizne 200nasobne, alespon priblizne 500nasobne, alespon priblizne 1000nasobne vyssi nez je uvedena koncentrace uvedeného primeru vlasenky se smyckou.
58. Kompozice podle kteréhokoli z narokû 49 az 57, kde 3' terminalni cast uvedené 3' hemisondové sekvence obsahuje nukleotid komplementarni k uvedené neshode, ale ne komplementarni k uvedené sekvenci divokého typu.
59. Kompozice podle kteréhokoli z narokû 49 az 58, vyznacujici se tim, ze uvedenÿ antikôdujici primer ma Tm priblizne 50 az 70 stupnû Celsia.
60. Prostredek podle kteréhokoli z narokû 49 az 59, vyznacujici se tim, ze kôdujici primer obsahuje alespon priblizne 12 az priblizne 30 nukleotidû komplementarnich k uvedené 5' hemisondové sekvenci.
61. Kompozice podle kteréhokoli z narokû 49 az 60, kde uvedenÿ kôdujici primer obsahuje alespon priblizne 9 az priblizne 35 nukleotidû komplementarnich k uvedené stopce uvedené sekvence vlasenky se smyckou 3' k uvedenÿm nukleotidûm komplementarnim k uvedené 5' hemisondové sekvenci.
62. Kompozice podle kteréhokoliv z narokû 49 az 61, vyznacujici se tim, ze uvedenÿ kôdujici primer ma Tm priblizne 50 az priblizne 70 stupnû Celsia.
63. Kompozice podle kteréhokoli z narokû 49 az 62, kde uvedenÿ primer vlasenky se smyckou amplifikuje uvedenou mutantni polynukleotidovou sekvenci alespon priblizne 10nasobne, alespon priblizne 100nasobne, alespon priblizne 1000nasobne, alespon priblizne 10 000nasobne, alespon priblizne 100 000nasobne nebo alespon priblizne 1 000 000nasobne vÿhodne oproti uvedené polynukleotidové sekvenci divokého typu.
64. Kompozice podle kteréhokoli z narokû 49 az 63, kde uvedena 5'-hemisondova sekvence obsahuje délku priblizne 7 az priblizne 22 nukleotidû.
65. Kompozice podle kteréhokoli z narokû 49 az 64, kde uvedena 3' hemisondova sekvence obsahuje délku priblizne 3 az priblizne 9 nukleotidû.
- 41 CZ 2024 - 197 A3
66. Kompozice podle kteréhokoli z narokù 49 az 65, vyznacujici se tim, ze uvedena 3' hemisondovâ sekvence ma Tm pfiblizne 30 az 40 stupnù nebo uvedena 5' hemisondova sekvence ma Tm pfiblizne 60 az 75 stupnù.
67. Kompozice podle kteréhokoli z narokù 49 az 66, kde uvedena sekvence vlâsenky se smyckou obsahuje délku pfiblizne 15 nukleotidù nebo vice.
68. Kompozice podle kteréhokoli z nârokù 49 az 67, vyznacujici se tim, ze uvedenâ sekvence vlâsenky se smyckou je konfigurovâna tak, aby mela Tm pfiblizne 55 az pfiblizne 75 stupnù Celsia.
69. Kompozice podle kteréhokoli z nârokù 49 az 68, kde smycka uvedené sekvence vlâsenky se smyckou obsahuje alespon pfiblizne 1 az alespon pfiblizne 20 nukleotidù na délku.
70. Kompozice podle kteréhokoli z nârokù 49 az 69, vyznacujici se tim, ze smycka uvedené sekvence vlâsenky se smyckou obsahuje barkôd.
71. Kompozice podle nâroku 49, vyznacujici se tim, ze uvedeny primer vlâsenky se smyckou, uvedeny kôdujici primer nebo uvedeny antikôdujici primer obsahuje kteroukoli ze SEKV ID C: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 13, 14, 15, 16, 19, 20, 23, 24, 27, 28, 29, 30, 33, 34, 35, 36, 39, 40, 41, 42, 45, 46, 45, 48, 52, 53, 54, 57, 58, 59, 60, 61, 64, 65, 66, 67, 68, 71 nebo 72.
72. Zpùsob zpracovâni sekvence DNA, kterâ mâ nebo je v podezfeni z toho, ze mâ methylovany cytosin na konkrétnim zbytku, pficemz zpùsob zahrnuje:
spojeni v reakcni smesi vhodné pro zpracovâni uvedené sekvence DNA:
(i) uvedené sekvence DNA, kde uvedenâ sekvence DNA byla osetfena bisulfitem a obsahuje uracil na cytosinovém zbytku, ktery nebyl pfed uvedenym bisulfitovym osetfenim nemethylovân; a (ii) prvniho primeru vlâsenky se smyckou, ktery obsahuje:
5' hemisondovou sekvenci nakonfigurovanou tak, aby hybridizovala s komplementârnim prvnim koncovym regionem uvedené DNA sekvence;
sekvenci vlâsenky se smyckou; a
3' hemisondovou sekvenci nakonfigurovanou tak, aby hybridizovala s druhou koncovou oblasti uvedené DNA sekvence, kde 3' koncovâ câst uvedené 3' hemisondové sekvence obsahuje nukleotid komplementârni k uvedenému uracilu, ale ne komplementârni k uvedenému cytosinovému zbytku.
73. Zpùsob podle nâroku 72, vyznacujici se tim, ze dâle zahrnuje inkubaci uvedené reakcni smesi za podminek vhodnych k prodlouzeni produktu obsahujiciho uvedenou 3' hemisondové sekvence.
74. Zpùsob podle nâroku 73, vyznacujici se tim, ze dâle zahrnuje spojeni v uvedené reakcni smesi vhodné pro zpracovâni uvedeného produktu obsahujiciho uvedenou 3' hemisondovou sekvenci: antikôdujiciho primeru konfigurovaného tak, aby hybridizoval s 3'genomickou oblasti z uvedené neshody.
75. Zpùsob podle nâroku 74, vyznacujici se tim, ze antikôdujici primer mâ Tm pfiblizne 50 az 70 stupnù Celsia.
76. Zpùsob kteréhokoliv z nârokù 74 az 75, dâle zahrnujici inkubaci uvedené reakcni smesi vhodné pro zpracovâni uvedeného produktu obsahujiciho uvedenou 3'hemisondovou sekvenci 3' za podminek vhodnych pro produkci produktù prodlouzeni z antikôdujiciho primeru.
77. Zpùsob podle nâroku 76, vyznacujici se tim, ze dâle zahrnuje spojeni v reakcni smesi vhodné pro zpracovâni uvedeného produktu obsahujiciho sekvenci antikôdujiciho primeru: uvedeného produktu obsahujiciho uvedenou sekvenci antikôdujiciho primeru; a kôdujiciho primeru konfigurovaného pro hybridizaci s: (i) alespon câsti uvedené 5' hemiprobové sekvence; a s (ii) alespon câsti kmene uvedené sekvence vlâsenky se smyckou
- 42 CZ 2024 - 197 A3
78. Zpûsob podle naroku 77, vyznacujici se tim, ze kôdujici primer obsahuje alespon priblizne 12 az priblizne 30 nukleotidû komplementârnich k uvedené sekvenci 5' hemisondové sekvence.
79. Zpûsob podle naroku 78, vyznacujici se tim, ze kôdujici primer obsahuje alespon priblizne 9 az priblizne 35 nukleotidû komplementamich k uvedenému kmeni sekvence vlâsenky se smyckou 3'sekvence 3' k uvedenÿm nukleotidûm komplementârnim k uvedené sekvenci 5' hemisondy.
80. Zpûsob podle kteréhokoli z nârokû 77 az 79, vyznacujici se tim, ze kôdujici primer mâ Tm priblizne 50 az priblizne 70 stupnû Celsia.
81. Zpûsob podle kteréhokoli z nârokû 77 az 80, vyznacujici se tim, ze dâle zahrnuje inkubaci uvedené reakcni smesi vhodné pro zpracovâni uvedeného produktu obsahujiciho sekvenci antikôdujiciho primeru za podminek vhodnÿch pro produkci produktû prodlouzeni z uvedeného kôdujiciho primeru.
82. Zpûsob podle kteréhokoli z nârokû 72 az 81, vyznacujici se tim, ze dâle zahrnuje poskytnuti uvedené sekvence DNA.
83. Zpûsob podle nâroku 82, vyznacujici se tim, ze dâle zahrnuje osetreni uvedené sekvence DNA bisulfitem pred uvedenÿm spojenim.
84. Zpûsob podle kteréhokoli z nârokû 81 az 83, vyznacujici se tim, ze uvedenâ inkubace zahrnuje PCR reakci, qPCR reakci, dPCR reakci, ddPCR reakci nebo sekvenacni reakci.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US202163257954P | 2021-10-20 | 2021-10-20 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2024197A3 true CZ2024197A3 (cs) | 2024-10-23 |
Family
ID=84361445
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2024-197A CZ2024197A3 (cs) | 2021-10-20 | 2022-10-20 | Způsoby a kompozice pro detekci mutantních sekvencí nukleových kyselin |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20240368688A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ2024197A3 (cs) |
| DE (1) | DE112022005006T5 (cs) |
| GB (1) | GB2629912A (cs) |
| SE (1) | SE2450504A1 (cs) |
| WO (1) | WO2023067110A1 (cs) |
Family Cites Families (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5242794A (en) | 1984-12-13 | 1993-09-07 | Applied Biosystems, Inc. | Detection of specific sequences in nucleic acids |
| US4988617A (en) | 1988-03-25 | 1991-01-29 | California Institute Of Technology | Method of detecting a nucleotide change in nucleic acids |
| US5494810A (en) | 1990-05-03 | 1996-02-27 | Cornell Research Foundation, Inc. | Thermostable ligase-mediated DNA amplifications system for the detection of genetic disease |
| US5432272A (en) | 1990-10-09 | 1995-07-11 | Benner; Steven A. | Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases |
| US5965364A (en) | 1990-10-09 | 1999-10-12 | Benner; Steven Albert | Method for selecting functional deoxyribonucleotide derivatives |
| DE69519783T2 (de) | 1994-04-29 | 2001-06-07 | Perkin-Elmer Corp., Foster City | Verfahren und vorrichtung zur echtzeiterfassung der produkte von nukleinsäureamplifikation |
| US6117635A (en) * | 1996-07-16 | 2000-09-12 | Intergen Company | Nucleic acid amplification oligonucleotides with molecular energy transfer labels and methods based thereon |
| US6582938B1 (en) | 2001-05-11 | 2003-06-24 | Affymetrix, Inc. | Amplification of nucleic acids |
| GB0127564D0 (en) | 2001-11-16 | 2002-01-09 | Medical Res Council | Emulsion compositions |
| TWI305778B (en) | 2001-12-03 | 2009-02-01 | Nishida Teruo | Peptides of an expressing unit for igf-i minimal activity and their pharmaceutical use |
| EP4512526A3 (en) | 2008-09-23 | 2025-06-04 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Droplet-based assay system |
| AU2012214312A1 (en) | 2011-02-09 | 2013-08-22 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Analysis of nucleic acids |
| CA2863808C (en) * | 2012-02-20 | 2020-07-21 | Speedx Pty Ltd | Methods and oligonucleotides for amplifying and/or detecting nucleic acids |
| CA2983819A1 (en) * | 2015-04-24 | 2016-10-27 | Atila Biosystems Incorporated | Amplification with primers of limited nucleotide composition |
| WO2018093898A1 (en) * | 2016-11-15 | 2018-05-24 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University | Ultraspecific nucleic acid sensors for low-cost liquid biopsies |
| WO2019140298A1 (en) * | 2018-01-12 | 2019-07-18 | Natera, Inc. | Novel primers and uses thereof |
| KR20230098259A (ko) * | 2020-10-29 | 2023-07-03 | 비오까르띠 엔브이 | 멀티플렉스 핵산 검출을 위한 제네릭 카트리지 및 방법 |
| WO2022223561A1 (en) * | 2021-04-20 | 2022-10-27 | Simsen Diagnostics Ab | Compositions and methods for cell-free nucleic acid isolation |
-
2022
- 2022-10-20 WO PCT/EP2022/079299 patent/WO2023067110A1/en not_active Ceased
- 2022-10-20 DE DE112022005006.3T patent/DE112022005006T5/de active Pending
- 2022-10-20 GB GB2405402.5A patent/GB2629912A/en active Pending
- 2022-10-20 SE SE2450504A patent/SE2450504A1/en unknown
- 2022-10-20 CZ CZ2024-197A patent/CZ2024197A3/cs unknown
-
2024
- 2024-03-04 US US18/594,668 patent/US20240368688A1/en active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GB202405402D0 (en) | 2024-05-29 |
| GB2629912A (en) | 2024-11-13 |
| US20240368688A1 (en) | 2024-11-07 |
| WO2023067110A1 (en) | 2023-04-27 |
| SE2450504A1 (en) | 2024-05-10 |
| DE112022005006T5 (de) | 2024-08-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9909179B2 (en) | Single-cell nucleic acid analysis | |
| JP2019162102A (ja) | 末梢血中で、がんによって変化したｒｎａを検出するシステムおよび方法 | |
| EP2691775B1 (en) | Telomere length measurement in formalin-fixed, paraffin embedded (ffpe) samples by quantitative pcr | |
| JP2012235778A (ja) | アセトアルデヒド脱水素酵素２及びアルコール脱水素酵素２の遺伝子変異を同時に検出する方法 | |
| JP6144623B2 (ja) | 核酸測定用の核酸プローブ | |
| US20130084568A1 (en) | Probe, and polymorphism detection method using the same | |
| EP3353320B1 (en) | Improved detection of short homopolymeric repeats | |
| EP3234191B1 (en) | A method for the colorimetric detection of the amplification of a target nucleic acid sequence | |
| Wang et al. | Construction of a multiple ligation-driven exponentially symmetric T7-transcription machinery for single-molecule monitoring of diverse single-nucleotide polymorphisms in human cancers | |
| EP1266970B1 (en) | Detecting nucleic acid deletion sequences | |
| JP7618208B2 (ja) | 単一標的遺伝子の遺伝的変異のリアルタイム検出用の一本鎖核酸及びこれを用いた検出方法 | |
| EP4001433A1 (en) | A method for determining the level of dna integrity | |
| CZ2024197A3 (cs) | Způsoby a kompozice pro detekci mutantních sekvencí nukleových kyselin | |
| EP4516925A1 (en) | Dna detection method and dna detection kit under special consideration of fluorescence intensity measurement and melting curve analysis | |
| US20090263811A1 (en) | Target base discrimination method | |
| KR20140040022A (ko) | 변이 검출용 프로브, 변이 검출 방법, 약효 판정 방법 및 변이 검출용 키트 | |
| EP4541906A1 (en) | Primer, dna detection method, and dna detection kit | |
| EP2407560B1 (en) | Probe for detection of polymorphism in abl gene, and use thereof | |
| US20260043076A1 (en) | Detection of molecular analytes based on tailored probe competition | |
| JP2025187393A (ja) | Ｔ細胞受容体（ｔｃｒ）またはｂ細胞受容体（ｂｃｒ）の遺伝子検査方法および遺伝子検査キット | |
| HK1193647A (en) | Telomere length measurement in formalin-fixed, paraffin embedded (ffpe) samples by quantitative pcr | |
| HK1193647B (en) | Telomere length measurement in formalin-fixed, paraffin embedded (ffpe) samples by quantitative pcr |