CZ20996A3 - Epstein-barr virus sequences encoding diagnostically relevant viral capside antigen, expression clones obtained by polymerase chain reaction and the use of such recombinant antigen in diagnostic tests - Google Patents
Epstein-barr virus sequences encoding diagnostically relevant viral capside antigen, expression clones obtained by polymerase chain reaction and the use of such recombinant antigen in diagnostic tests Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20996A3 CZ20996A3 CZ96209A CZ20996A CZ20996A3 CZ 20996 A3 CZ20996 A3 CZ 20996A3 CZ 96209 A CZ96209 A CZ 96209A CZ 20996 A CZ20996 A CZ 20996A CZ 20996 A3 CZ20996 A3 CZ 20996A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- ebv
- protein
- sequence
- antigen
- dna sequence
- Prior art date
Links
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 45
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 45
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 45
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 title claims description 16
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 title claims description 7
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 title abstract description 75
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 title 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 57
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 17
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 13
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims abstract 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 42
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 25
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 21
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 19
- 208000002454 Nasopharyngeal Carcinoma Diseases 0.000 claims description 18
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 15
- 206010061306 Nasopharyngeal cancer Diseases 0.000 claims description 14
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 14
- 201000011216 nasopharynx carcinoma Diseases 0.000 claims description 14
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 12
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 12
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 10
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims description 10
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 8
- 208000011691 Burkitt lymphomas Diseases 0.000 claims description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 6
- 201000006747 infectious mononucleosis Diseases 0.000 claims description 6
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 5
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 5
- 206010015108 Epstein-Barr virus infection Diseases 0.000 claims description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 4
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 claims description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 3
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 3
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 claims description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 3
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 2
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 2
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims 2
- 241000282461 Canis lupus Species 0.000 claims 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 claims 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims 1
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 claims 1
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 claims 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 claims 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 claims 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 claims 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 claims 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 claims 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 10
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 9
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 9
- 101710088758 23kDa protein Proteins 0.000 description 6
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 6
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 6
- AEMBWNDIEFEPTH-UHFFFAOYSA-N n-tert-butyl-n-ethylnitrous amide Chemical compound CCN(N=O)C(C)(C)C AEMBWNDIEFEPTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 4
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 4
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 101150112338 BLRF2 gene Proteins 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 108010005054 Deoxyribonuclease BamHI Proteins 0.000 description 3
- 101100293261 Mus musculus Naa15 gene Proteins 0.000 description 3
- 101150082943 NAT1 gene Proteins 0.000 description 3
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 3
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 3
- QENJLXATANVWMR-UHFFFAOYSA-N 2-[(3-amino-3-imino-2-methylpropanethioyl)amino]acetic acid Chemical compound NC(=N)C(C)C(=S)NCC(O)=O QENJLXATANVWMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150036640 BLLF2 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 2
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 2
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 2
- 210000005155 neural progenitor cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 2
- 101150089516 BLLF1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100036301 C-C chemokine receptor type 7 Human genes 0.000 description 1
- 208000034657 Convalescence Diseases 0.000 description 1
- 102400000125 Cyclin-dependent kinase 5 activator 1, p25 Human genes 0.000 description 1
- 101150040913 DUT gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 101710181478 Envelope glycoprotein GP350 Proteins 0.000 description 1
- 101100544567 Epstein-Barr virus (strain P3HR-1) BLRF3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 101150065273 GN gene Proteins 0.000 description 1
- 206010019842 Hepatomegaly Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000716065 Homo sapiens C-C chemokine receptor type 7 Proteins 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 102000019040 Nuclear Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010051791 Nuclear Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 206010039587 Scarlet Fever Diseases 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010041660 Splenomegaly Diseases 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 201000005485 Toxoplasmosis Diseases 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 108700010919 epstein-barr-virus proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 208000021760 high fever Diseases 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000002480 immunoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000002741 leukoplakia Diseases 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 208000004995 necrotizing enterocolitis Diseases 0.000 description 1
- 201000002120 neuroendocrine carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 210000003300 oropharynx Anatomy 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 208000037920 primary disease Diseases 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 208000037921 secondary disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 208000012498 virus associated tumor Diseases 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/705—Specific hybridization probes for herpetoviridae, e.g. herpes simplex, varicella zoster
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16211—Lymphocryptovirus, e.g. human herpesvirus 4, Epstein-Barr Virus
- C12N2710/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Oncology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
Oblast techniky
Předložený vynález se týká DNA sekvence EBV genomu, kódující s EBV-související antigen, který muže být použit v metodách a diagnostických a farmaceutických prostředcích uvedených dále a metodách lokalizace a izolace alespoň části z příslušných DNA sekvencí. Dále se tento vynález týká metoda kompozic nebo kitú, pro rychlé, jednoduché, velmi citlivé a vysoce specifické stanovení protilátek řízených k tomuto s EBV-souvisejícímu antigenu. V těchto testech uvedený antigen EBV podstatně zlepšuje detekci specifické třídy protilátek v pacientově séru. Tato detekce umožňuje spolehlivé závěry jak o stavu infekce u dárce jako je preinfekce, čerstvá infekce, chronická infekce, rekonvalescence a neoplastický stav.
Oblast techniky
Infekce virem Epstein-Barrové (EBV) a jejich následky
EBV vyvolává infekční mononukleosu jako primární chorobu. Predominantně postihuje děti nebo mladé dospělce. Více než 90 % průměrné dospělé populace je infikováno EBV, který přetrvává po celou dobu života u těchto nosičů. Tento virus je produkován celoživotně do orofarynxu a šíří se orální cestou.
Zatímco infekce malých dětí často vede k téměř symptomu prosté serokonverzi, infekce dospělých často působí vážné choroby s vysokou horečkou, dramatickým zvýšením počtu bílých krvinek, bolestivý jícen, zvětšená játra a slezinu. Šarlatová horečka, toxoplasmosa, difterie a leukemie by měly být vyloučeny diagnostickými prostředky.
Chronické infekce.
Vzácněji vede EBV infekce k chronickým nebo chronicky fluktuačním symptomům srovnatelným s akutní primární infekcí
Vlasová leukoplakie
U imunitně postižených pacientů může EBV způsobit vážné léze na jazyku.
Reaktivace EBV u imunologicky deprivovaných individuí
Potlačení buněčně zprostředkované imunity vede k reaktivaci EBV. Zvýšené titry protilátek jsou následkem a byly popsány škodlivé účinky mnoha možností jako je rejch transplantátů.
X-spojený proliferativni syndrom
Určité genetické konstelace jsou odpovědné za infekci samčích sourozenců, vedoucí k fatální lymforetikulární chorobě.
Burkittův lymfom a EBV
Vývoj Burkittova lymfomu je spojen s chromosomálními uspořádáními. Ne všechny případy obsahují EBV genomy v nádorových buňkách. Nicméně alespoň v oblasteh s vysokých výskytem, je 97 % těchto neoplasii spojeno s EBV a kontrola EBV infekce pravděpodobně povede ke snížení rizika vývoje
Burkittova lymfomu.
Nasofaryngeální karcinom jako možná sekundární choroba spojená s EBV
Jinou chorobou, kde EBV vykazuje 100% spojení je nasofaryngeální karcinom (NPC) (The Biology of Nasofaryngeal Carcinoma, UICC technical report series, vol.71, M.J.Simons a
K.. Shanmugaratnam (vyd.), International Union Against Cancer, Zeneva, str.l (1982)). NPC nejčastěji začíná v Rosenmuel1erově fosse (Recessus pharyngeus) při postnasálním prostoru. Často jsou pacienti hospitalizováni teprve po vyvinutí prvních typických metastáz v cervikálních lymfatických uzlinách.
Kontrola s EBV-související neoplasie
Jsou zde možné tři základní strategie kontroly neoplasie:
1. Včasná detekce následovaná terapií,
2. odklad nástupu choroby ideálně za průměrnou dobu života a
3. prevence.
Těchto cílů je možno dosáhnout také u mnohofaktorových chorob jako jsou mnohé neoplasie. Výskyt choroby může být redukován eliminací jednoho nebo více z podstatných faktorů, které samy nejsou nutně schopny vyvolat chorobu, nebo redukcí faktorů, které promotují manifestaci neoplastických stavů. Použití specifických od viru odvozených antigenů podle tohoto vynálezu, protilátek nebo genetických materiálů jako nástrojů pro včasnou diagnosu s virem spojených nádorů, by mohlo usnadnit eliminaci základních faktorů.
Použití s EBV-souvisejících genových produktů pro diagnózu s EBV-souvisejících NPC
Před tím, než byly dostupné rekombinantní antigeny definovaného složení, většina běžných virově specifických testů byla založena na imunofluorescenčních testech využívajících EBV genomově pozitivní buňky s různými vlastnostmi a/nebo předchozího ošetření jako zdroje obvykle s buňkami spojených antigenu v imunofluorescenčních nebo imunoenzymatických testech. Tabulka I uvádí souhrn protilátek chorobných a virálních antigenů použitelných pro diagnózu.
Tabulka I
Vztah EBV-vyvolaných chorob a Ig-podtřídové specifické
| protilátkové reakce, který může být stanoven běžnými imunofluorescenčními testy | |||
| Choroba: VCA IgG | IgM | IgA | EA IgG EBNA IgG MAUgG |
| normální | |||
| dospělí + | - | - | + |
akutní dospělí
| (včas) | ++ | + | — | + | ||
| chronická | ||||||
| infekce | + | + | - | +/- | +/- | +/ |
| reakti- | ||||||
| vace | + | + | - | + | + | + |
| XLP2 | + | - | - | +/- | (+) | 7 |
| NPC | ++ | - | + (D) | + | ++ | |
| BL | ++ | - | - | + CR) | + | + |
VCA; virální kapsidový antigen; EA: časný antigen; EBNA;
Epstein-Barr nukleární antigen; ^stanoveno imunoprecipitací gp240/200; 2XLP jako příklad imunologicky deprivovaných hostitelů.
V současnosti používané s EBV související antigeny nejsou rozpoznávány u všech EBV infikovaných osob vzhledem k omezením imunitní odpovědi. Dále některé s EBV související antigeny se podílejí sekvenční homologií na proteinové hladině s jinými Herpes viry. Proto je technickým problémem ^chctu vynálezu poskytnout s EBV-související protein, který umožní správnější diagnózu EBV infekce. Řešení výše uvedeného technického problému se dosáhne poskytnutím provedení uvedeného v nárocích. Podle předloženého vynálezu je poskytnuta EBV-kodující sonda bez podstatné genetické variabi1 i ty.
Podstata vynálezu
Produkce EBV-specifických antigenů podle předloženého vynálezu
1. Výsledkem všech poznatků je jedním z objektů tohoto vynálezu zlepšení citlivosti testů pro detekci tříd protilátek a specifických protilátel ke třídě virových kapsidových antigenů a zlepšení systému, který umožňuje masové testování a lepší standardizaci.
2. Aplikace technologie rekombinantní DNA umožnila identifikaci polypeptidu důležitého pro zlepšení EBV antigenici ty. Produkce by mohlo být dosaženo vhodnými hostitelskými buňkami transformovanými rekombinantními DNA molekulami a narostlými ve vhodném kultivačním systému.
3. Podle předloženého vynálezu se používají rekombinantní DNA metody, zahrnující výběr modifikovaných primerů pro polymerásovou řetězovou reakci, pro expresi genetické informace genu nebo alespoň části genu, kódujícího EBV protein 23kDa (čteno od BLLF2) ve vhodných hostitelských buňkách jako jsou bakterie (např. rod E.coli, Salmonella, Pseudomonas nebo
Bacillus), kvasinky (např. rodu Candida nebo Saccharomyces), hmyzí buňky (např. Spodoptera frugiperda SF251) a savčí buňky (např. Vero-buňky, CHO-buňky nebo lymfoblastoidní buněčná ‘ : n i e ) .
4. Dále genomické regiony kódující EBV protein 23 kDa byly identifikovány a jejich relevance pro diagnostické účely demonstrována. Proto je v předloženém vynálezu také popsána klíčová informace pro produkci těchto proteinů nebo jejich antigenních determinantů.
DNA sekvence hybridizuje k DNA sekvenci získané z jakéhokoliv zdroje, zahrnující přirozený, syntetický nebo polosyntetický zdroj, který je odvozen mutacemi, zahrnuji ifo? nukleotidové substituce, nukleotidové delece, nukleotidové inzerce a inverze nukleotidové natažení k DNA sekvenci,která kóduje alespoň část proteinu vztaženého ke 23 kDa proteinu., kódovaného čtecím rámcem BLFR2 B95-8 proteinu viru
Epstein-Barrové. Výhodně jsou hybridizační podmínky v rozmezí 15 až 27 °C pod teplotou tání homodimerní DNA molekuly. Předložený vynález se týká produkce EBV-specifického antigenu rekombinantní DNA technologií a jeho použití v diagnóze, profylaxi a terapii chorob spojených s EBV. Proto je objektem tohoto vynálezu identifikovat nový Epstein-Barr virový antigen, který je spojen s chorobami spojenými svirem Epstein-Barr jako je nasofaryngeální karcinom (NPC), infekční mononukleosa a Burkittúv lymfom (viz legenda u tabulky I) imunologickými metodami. Dalším objektem předloženého vynálezu je lokalizace a identifikace genomických regionů EBV, například jak byly klonovány z B95-8 buněk (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA (ATCC) CRL1612)(Skere J. a Strominger J.L. Clonning and mapping of BamHI endonuclease fragments of the DNA from transforming B95-8 strain of Epstein-Barr virus. Proč.Nat1.Acad.Sci . USA
77:3860(1980)), které kódují uvedené antigeny diagnosticky důležité a relevantní pro medikální účely. Toho se dosáhne použitím hybridní selekční metody kombinované s imunosrážením s pacientovým sérem (obr.l). Dalším objektem předloženého vynálezu je subklonování genomického regionu EBV, např. z existujících knihoven EBV,klonovaného z B95-8 buněk, který kóduje alespoň část vhodného antigenu p23. Toho se dosáhne polymerásovou řetězovou reakcí (PCR), která amplifikuje gnomické DNA fragmenty bez vyžadování vhodných restrikčních enzymových míst štěpení na koncích čtecího rámce a inzertování takových amplifikovaných genů, obsahujících systet izované konce od příměrových sekvencí po vhodných klonovacích postupech do expresních plasmidů. Je zřejmé, že stejného klonovacíh postupu lze dosáhnout amplifikaci požadovaného genu z jiných virových izolátů, které se mohou lišit od B95-8 kódujících sekvencí. Jiné primery mohou být nezbytné pro tento účel, selekci a produkci, které jsou známé v oboru. Výběr primerů s dalšími sekvencemi 5' ze sekvencí komplementárních ke kódujícímu regionu (5' primery) nebo 3' sekvencí komplementárních ke kódujícím regionům je možný bez nutnosti rozsáhlého subklonování pro dosažení klonů přímo z produktu polymerásové řetězové reakce, které jsou optimalizovány pro další kontrolní signály. Dalším objektem tohoto vynálezu je produkce proteinů expresí případné genetické informace ve vhodných hostitelských buňkách, jako jsou bakterie (např. rodu Escherichia, Salmonella, Pseudomonas nebo Bacillus), kvasinky (např. rodu Candida nebo Saccharomyces), zvířecí buňky a lidské buňky (např. vero-buňky; CHO-dhfr-buňky; v kombinaci se vhodným selekčním systémem, popřípadě plasrnidem nesoucím funkční dhrf gen jakož i genetickou informaci pro EBV gen pod kontrolou vhodné regulační sekvence; nebo lymfoblastoidní buněčné linie). Proteiny produkované těmito hostitelskými buňkami obsahují 23kDa-spřízněné antigenní determinanty (epitopy) a jsou, v závislosti na expresním systému, syntetizovány bud jako fuzní protein nebo nefuzní protein, Pro produkc i fuzního proteinu bakteriemi byla exprese genomi ckých aubfragmentů, kódujících p23 EBV B95-8 zavedena do známého plasmidu pUC8 a indukována např.
isopropyΙ-β-D-thiogalakto-pyranosidem (IPTG). Příslušné expresní produkty byly identifikovány imunologickými metodami. Pro produkci nefuzních proteinů, které v podstatě obsahují aminokyselinové sekvence přirozeně se vyskytujících proteinů nebo jejich částí mohou být rekombinantní plasmidy podle předloženého vynálezu modifikovány. Jestliže je o 1igonukleotidový linker inzertován mezi bakteriální protein, kódující region a EBV-související protein, kódující region expresního vektoru, stává se aminokyselinová sekvence, odpovídající oligonukleotidovému linkeru částí exprimovaného fuzního proteinu. Po izolaci tohoto fuzního proteinu z transformantů, které jej exprimují, je tento štěpen bud proteásami specifickými pro aminokyselinové sekvence v zavdeném aminokyselinovém linkeru nebo, jestliže aminokyselinový linker obsahuje peptidové vazby citlivé ke kyselému štěpení, zpracováním s kyselinami, např. kyselinou mravenči.
Dalším objektem předloženého vynálezu je využití s EBV-souvisejícího proteinu 23 kDa nebo jeho subregionů nebo, je-li to vhodné,s EBV-souvisejicich DNA fragmentů nebo klonů, pro produkci diagnostických kompozic (kitú) vhodných v klinické diagnóze nebo vědeckém výzkumu. Tyto testy jsou založeny na známých principech jako je ELISA, RIA (Rádio immunoassay) nebo nepřímé hemag1uti načni zkoušce. Dále s EBV-souvisejici protein může být použit např. pro sledování vakcinačních programů, analýzu epidemiologických problémů, pro léčení pacienta (složka) medikace) a pro produkci vakcin jako míra profylaxe v terapii EBV-souvisejících chorob, jako je mononukleosa, Burkittův lymfom a nasofaryngeální karcinom. Konečně je protein vhodný pro profylaxi a terapii s EBV-souvisejících chorob, protože je schopen modulovat imunitní odezvu u pacientu postižených chorobami jako je NEC, chronická infekční mononukleosa nebo s EBV-související Burkittův lymfom.
Popis obrázků na připojených výkresech
Obr.1:Autoradiografie in vitro translačních produktů z RNA hybridu vybraného s BamHI DNA fragment EBV genomu.
Pro imunoprec ipi tac i byl použit pool EB.V-spec i f i ckého séra od pacientů postižených NPC. Imunoprecipitované 35S-značené proteiny byly separovány SDS-polyakrylamidovou gelovou e1ektroforézou a rentgenový film byl vystaven gelu. Kontrola, označená (pool) obsahuje všechny z imhnosrážitelných EBV-specifických proteinů. Z autoradiografie je možno konstatovat, že protilátky ke 23kDa jsou přítomny v EBV-ροζ itivním séru. Je také zřejmé, že RNA z forbo 1esterem indukovaných P3HR1 buněk byla hybridizována proti BamHI restrikčním fragmentům EBV DNA, eluována a trans 1atována in vitro. Translační produkty byly imunoprecipitovány s poolem EBV reaktivního séra předadsorbovaného s EBV genomové negativními BJAB buňkami jak bylo již popsáno (SeiblR. a Wolf H., Mapping of Epstein-Barr virus proteins on the genome by translation of hvbrid-selected RNA from induced P3HR1 cells and induced Ráji cells. Virology 141:1-13 (1985)).
Obr. 2 Jemné mapování mRNA souvisejících s EBV B95-8 genomem BamHI restrikční místa EBV B95-8 genomu jsou u\$dena na spodku obrázku a příslušné restrikční fragmenty jsou označeny nahoře většími a menšími písmeny. mRNA z proteinů lokalizovaných hybrid-selekcí k jednotlivým BamHI restrikčním fragmentům jsou označeny čísly a čarami. Z jemného mapování je zřejmé, že protilátky ke 23kDa jsou přítomny v EBV-rekonvalescentníít séru.
Obr.3 A) Lokalizace čtecích rámců v BamHI-L fragmentu
EBV-antigen o velikosti 23kDa byl mapován hybridní selekční translací. BLLF1 kóduje EBV hlavní membránový antigen, BLLF2, BLRFl a BLRF3 kódují proteiny s vypočtenými molekulovými hmotnostmi 31,11 kDa a 12 kDa. BLLF3 také mapuje v sousedním BamHI-S fragmentu, zatímco 23 kDa antigen kódující region byl nalezen pouze v BamJI-L. Proto se nejpravděpodobnějším kandidátem pro kódování 23kDa antigeuu jeví být BLR2 kódující protein.
B) Prodloužení 5' a 3' konce BLRF2 s jak řetězci tak oligodeoxynukleotidovými primery použitými v PCR.
Primer 1 hybridizuje k DNA sekvencím, kódujícím N-kt ......
23-kDa proteinu. Komplementární sekvence začíná po druhém kodonů. Region kolem startu translace byl změněn na BspHI místo pro klonování do ATG-expresniho vektoru. Tento zahrnuje změnu druhého kodonů z TCA na AGC, oba kódující serin.
Oligodeoxynukleotidová sekvence proti směru od ATG start kodonů kóduje BamHI restrikční místo a několik málo dalších nt pro usnadnění restrikčního enzymového štěpení a klonování. Primer 2 hybridizuje při translačním stop 23-kDa a obsahuje HindlII místo na svém 5' konci pro inzerci do vektorů. Protože nehybridizující 5' konce příměrů nejsou syntetizovány během prvního běhu PCR na komplementárním řetězci, ale v následujících bězích, kdy se nově generované PCR produkty použijí jako templát.
Obr.4 Generování amplifikované DNA a klonování
1
01igodeoxynukleotidové příměry uvedené v 1 (B) byly syntetizovány na 8700 DNA syntezátoru (Biosearch/MILLIGEN) v 1 mol kolonách. Protože syntéza byla velmi účinná, byly primery použity bez dalšího čištění v PCR po odštěpení z kolony. Páté PCR reakce, obsahující paralelně stejné složení 100 μΐ každá, byly provedeny s 0,25 % celkového příměrového výtěžku, 4 ng plasmidu, obsahujícího BamHI-L fragment EBV (Skare J. a Strominger J.L Cloning and mapping of BamHI endonuclease fragments of DNA from transforming B95-8 strain of
Epstein-Barr virus. Proč.Nat1.Acad.Sci. USA 77:3860 (1980)), nukleotidy, pfr a Taq-polymerasu podle instrukcí výrobce. ř
Reakce byla provedena v Ricomp teplotním cyklo. s 50 °C ř zahřívací teploty po 2 min, prodloužení při 72 °C po 4 min a 1 min při 94 °C pro denaturaci. Bylo provedeno padesát cyklu, výsledná DNA byla odebrána, vysrážena ethanolem a sušena. Po resuspendování ve 200 1 H2O byla DNA štěpena s BamHI a
HindlII. DNA fragmenty byly čištěny přes 1,5% agarozovou gelovou elektroforézu, izolovány a ligovány s pUR289
1inearizovaným s BamIII v HindlII. Po transformaci do E.coli
JM109 (Yarnish-Perron a spol. Improved M13 phage cloning vectors and host strains nucleotide sequences of M13mpl8 and pUC19 vectors. Gene 33:103-119 (1985)) byly plasmidy z kolonií screenovány na 23kDa antigen, kódující fragment restrukčním enzymovým štěpením. Produkce EBV antigenu byla vizualizována
IPTG indukcí pozitivních klonu, PAGE proteinů a bud vybarvením
Coomassie modří nebo Western bloty (obr.5). Z produkčního j i
klonu pUR23k, byl opět izolován 23kDa kódující segment Ϊ štěpením s BamHI a HindlII a inzertován do pDS (pD523k). Ve !
třetím stupni byl fragment izolován BspHI a HindlII štěpením a ligován s pKK233-2 1 inearizovaným s Ncol a HindlII (pKK23k) .
Nakonec z pDS23k byl získán NlalV/HindlII fragment se 370 bp a ligován s pUC8 1inearizovaným s HindlII v rámci translační funkce z vektorových sekvencích do EBV souvisejícího f ragmentu.
Obr.5 Identifikace 23kDa expresního produktu v E.coli
Proteiny IPTG indukovaných klonu (1 mM IPTG po 3 h pří 37 °C) byly analyzovány SDS-17,5 PAGE a vybarvením Coomassie modří (levý panel) nebo přes Western blot a imunovybarvením s vysoce titrovaným sérovým poolem od NPC pacientů. Dráha 1: pUR2S9, β-Gal exprese; dráha 2: pUR23k; dráha 3; pDS23k; dráha 4: pKK23k; dráha 5: pUCN23k. β-Gal::23kDa fuzní protein v dráze 2 je větší než BGal v dráze 1 (116 kDa), což indikuje přečtení amplifikovaného DNA fragmentu. 23kDa expresní produkt ve dráze 3 má velikost asi 24 kDa a je syntetizován ve velkém | rozsahu. Nicméně autentický 23kDa expresní produkt z ATG vektoru ve dráze 4 není produkován účinně. C-koncový 23kDa antigenový fragment z pUCN23 ve dráze 5 se jeví být stabilní a produkován velmi účinně. Všechny antigeny reagují s NPC sérovým poolem, což velmi silně indikuje antigenicitu toh*í''. proteinu během virové infekce.
Obr.6 DNA a aminokyselinová sekvence 23kDa antigenu ze čtecího rámce BLRF2 viru Epstein-Barrové
Následující příklady ilustrují vynález.
Příklady provedení vynálezu r
Příklad 1 í ?
Amplifikace 23kDa protein kódujícího regionu.
Možný kódující region pro 23kDa protein (BLRF2) na
BamHI-L fragmentu EBV obsahuje 162 aminokyselin, Nejsou dostupná žádná vhodná restrikční enzymová místa na 51 a 3’ koncích pro přímé klonování plné délky čtecího rámce. Pro tento účel byly syntetizovány dva o 1 igonuk1eotidy komplementární k 5’ a 3' koncům kódujícího regionu a použity jako primery v PCR. Každý primer obsahuje další sekvence na 5' konci pro restrikční místa použitelná v klonování amlifikované DNA (Obr.l) a několik dalších nukleotidů pro usnadnění rozřezání těmito restrikčními enzymy. Po PCR byly amplifikované DNA segmenty štěpeny s BamHI a Hindill. čištěny elektroforézou na agarosovém gelu a použity pro klonování s plasmidovými vektory. Plasmid, obsahující celý BamHI-L fragment z B95-8 izolátu EBV (Skare J. a Strominger J.L., Cloning and mapping BamHI endonuclease fragments of the DNA from transforming B95-8 strain of Epstein-Barr virus.
Proč.Nat1.Acad.Sci. USA 77:3860 (1980) byl použit jako templát.
Příklad 2
Exprese 23kDa VCA v E.coli jako β-galaktosidasového fuzního proteinu
Protože mnoho rekombinantních antigenů není stabilně exprimováno jako nefuzní antigeny v E.coli, byla provedena první hodnocení produkcí (3-galaktos idásových fuzních proteinů, kde velký bakteriální protein teoreticky chrání nestabilní proteinové segmenty před degradací.Proto byla amplifikovaná DNA štěpená s BamHI a Hindill klonována v rámci 3' lacZ genu BGal expresního vektoru pUR289 (Růther a Múller, Easy Identification of cDNA dones. EMBO J.
2(1983)1791-1794)(obr.4.). E.coli klon, obsahující tento vektor byl indukován s IPTG za účelem exprese 3Gal::23kDa fuzního proteinu. Obr.5 demonstruje, že byl syntetizován produkt s molekulovou hmotností vyšší než má autentický BGal. Fuzní protein reaguje specificky se šerem, obsahujícím vysoké EBV protilátkové titry. Toto indikuje, že proběhla správná translace,, nebyly zavedeny žádné podstatné chyby nebo stop kodony při PCR a že byl produkován imunogenický EBV antigen.
Příklad 3
Exprese 23kDa jako autentického proteinu
Z pUR289-23k byl izolován EBV kódující region s BamHI a HindlII a klonován do pDS12/RBSI1-2, který byl přejmenován na pDS3 pro tuto prezentaci (Bujard H. a spol. The T5 promotor-based transcripti on translation systém for the analysis in vitro and in vivo. Meth.Enzymol. 155:416 (1987)), který doplňuje stejný translační rámec jak je uveden ve 23kDa j f
kódujícím regionu (obr.4). Po indukci s ITPG se objevuje ncvý » t
proteinový pruh se 23 kDa v Coomassie vybarvené PAGE.
Specificky reaguje s EBV šerem na Western biotech a představuje asi 10 % celkového E.coli proteinu jak může být stanoveno z Coomassie-vybarveného gelu (obr.5). Protože expresní produkt obsahuje málo aminokyselin odvozených od klonovacího místa a o 1 igonukl eo t idových sekvení, bylo exi··.;· autentického proteinu dosaženo izolací tohoto fragmentu s
BspHI a HindlII a jeho inzertováním do Ncol a HindlII misi ATG vektoru pKK233-2 (Amam E., a Brosius J., J.'ATG vectors1 for regulated high-level expression of cloned genes in Escherichia coli. Gene 40:183-190 (1985)). Avšak expresní výtěžek 23kDa antigenu z tohoto vektoru byl mnohem menší než z pDS vektoru, což může být způsobeno neúčinnou translací tohoto proteinu v
E.coli buňkách způsobenou změněnou N-koncovou sekvencí. í
I i
Další exprese bylo dosaženo z menšího fragmentu, i f
kódujícího C-koncovou část 23kDa antigenu. Z kódujícího regionu NIaIV/ΗindlII fragment byl izolován a inzertován do
HindlI/HindlII pUC8 (Vieira B. a Messing B. The pUC plasmids, a Ml3mp7-derived systém for insertion mutagenesis and seqencing with synthetic universal primers. Gene 19
5 ( 1982) 259-268) zgt účelem produkce pUCN23k. Opět byla nalezena velmi účinná produkce antigenu po ITPG indukci. Ale protože tento antigen neobsahuje N-konec autentického proteinu není použitelný pro další hodnocení.
Příklad 4
Reakce a spécifi ta 23kDa VCA
Počáteční hodnocení diagnostické hodnoty rekombinantního antigenu bylo provedeno s EBV pozitivním a negativním sérem získaným z různých sérových zdrojů, tj. pacientů s infekční mononukleosou, pacientů postižených NPC a z/ravých nosičů. Surové bakteriální lyzáty, obsahující 23kDa antigen z pD23k a lyzáty s necizími antigeny jako kontroly běžely odděleně na PAGE. Proteiny byly přeneseny na nitrocelulozové filtry a jejich pásy byly inkubovány se sérem. Výsledky imunovybarvených Western blot pásů jsou shrnuty v tabulce II. Při porovnání s běžnými imunofluorescenčními testy VCA pozitivního séra od zdravých nosičů a NPC pacientů byly jasně pozitivní pro 23kDa antigen. Pouze dvě séra reaktivní v IF testu nevykazují žádnou reakci. Tři séra od čerstvě infikovaných osob, stanoveno z IF, také nevykazují žádnou reakci a tři sera považovaná za EBV negativní byla nalezena jako pozitivní s p23kDa antigenem. Souhrnně, je možno vidět širokou korelaci IF a Western blot aktivity. Nicméně je nezbytné další testování pro zkoušení relevance a citlivosti tohoto antigenu ve srovnání s IF testy.
Tabulka II
Reaktivita 23kDa antigenu s různými séry ve srovnání s IF výsledky
| IF-reakt ivi ta | EBV status1 | č.t es tovaného séra | reaktivita s s rekombinant- ním 23k antige poz. neg. | |
| VCA+EBNA+ | zdravý nosič | 34 | 32 | 2 |
| VCA+EBNA+ | NPC pacient | 4 | 4 | 0 |
| VCA+EBNA- | čerstvá inf. | 9 | 6 | 3 |
| VCA-EBNA- | EBV negativní | 6 | 3 | 3 |
aEBV status byl stanoven rutinními diagnostikami s IF reaktivitou a dalšími klinickými údaji.
bReaktivita 23kDa antigenu byla stanovena Western blot analýzou.
Klasifikace séra podle IF testů byla: VCA+, EBNA+ = zdravý nosič; VCA+.EBNA+ klinické údaje = NPC; VCA+,ΕΒΝΑ-, klické údaje = čerstvá infekce; VCA-, EBNA-= negativní pro EBV.
Λ ntttoi vssthčka advokát
Claims (23)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. DNA sekvence EBV-genomu, vyznačující se tím, že odpovídá s EBV-souvisejícímu antigennímu proteinu, majícímu aminokyselinovou sekvenci jak je uvedena na obr. 6.
- 2. DNA sekvence podle nároku 1, vyznačující se tím, že kóduje s EBV-související antigenní protein o molekulové hmotnosti 23 kDa.
- 3. DNA sekvence hybridizující k DNA sekvenci podle nároku 1 nebo 2, z jakéhokoliv získaného zdroje, zahrnujícího přírodní, syntetické nebo polosyntetické zdroje, která je příbuzná mutacemi, zahrnujícími nukleotidové substituce, nukleotidové delece, nukleotidové inzerce a inverze nukleotidových pásů s DNA sekvencí podle nároku 1 a která kóduje protein, mající antigenní vlastnosti uvedeného 23 kDA E3V proteinu.
- 4. DNA sekvence podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že je inzertována do rekombinantního plasmidu pUR289-23k, pDS-23k, pUC8-N23, kde konstrukce uvedených plasmidů je uvedena na obr.4.
- 5. DNA sekvence podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že obsahuje na svém 5' konci oligonukleotid kódující oligopeptid, který slouží ve výsledném štěpící místo pro sekvenčně specifickou proteásu nebo který je štěpitelný zpracováním s kyselinou jako je kyselina mravenčí nebo který usnadňuje následné čištění.Io
- 6. Rekombinantní DNA molekula pro klonování, vyznačující se tím, že obsahuje DNA sekvenci podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5.
- 7. Rekombinantní DNA molekula pro expresi, vyznačující se tím, že obsahuje DNA sekvenci podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, která je operativně napojena k expresní kontrolní sekvenci.
- 8. Rekombinantní DNA molekula podle nároku 7, vyznačující se tím, že expresní kontrolní sekvence je E.coli lambda-promotorový systém, E.coli lac-systém, E.coli β-laktamásový systém, E.coli trp-systém, E.coli lipoproteinový promotorový systém, kvasinková expresní kontrolní sekvence nebo jiná eukaryotické expresní kontrolní sekvence.
- 9. Hostitel, vyznačující se tím, že je transformován alespoň jednou rekombinantní DNA molekulou podle kteréhokoliv z nároků 6 až 8.
- 10. Hostitel podle nároku 9, kterým je kmen E.coli, jiná bakterie, jiná kvasinka, jiná houba, živočišná nebo lidská buňka.
- 11. Protein, mající s EBV-související antigenní determinanty vhodné pro diagnózu a terapii s EBV-spojených chorob, vyznačující se tím, že je kódován DNA sekvencí pódia kteréhokoliv z nároků 1 až 5.
- 12. Fuzní protein, vyznačující se tím, že obsahuje protein pcdle nároku 11.
- 13. Nefuzní protein, vyznačující se tím, že obsahuje protein podle nároku 11.
- 14. Způsob produkce proteinu podle kteréhokoliv z nároků 11 až 13, vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci hostitele podle nároku 9 nebo 10 za vhodných podmínek v médiu, akumulaci proteinu v kultuře a jeho získání z ní.
- 15. Diagnostická kompozice pro detekci anti-EBV-protilátek, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden protein podle kteréhokoliv z nároků 11 až 13 v množství dostačujícím k navázání uvedených anti-EBV-protilátek ve vzorku.
- 16. Způsob konstrukce klonovatelné a/nebo exprimovatelné DNA sekvence, zahrnující stupně anelace vhodných oligonukleotidových primerů k DNA sekvenci podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 a provedení polymerásové řetězové reakce (PCR), vyznačující se tím, že primery obsahují na svém 5'- a 3'-konci, další nehomologní sekvence, které představují klonovací a/nebo expresní kontrolní sekvence.
- 17. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že expresní kontrolní sekvence obsahuje transkripční a/nebo translační začátek a/nebo zvětšené místo a signály pro ukončení transkripce a/nebo translace nebo sekvence důležité pro zpracování kódovaného transkriptu.
- 18. Kit, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden protein podle kteréhokoliv z nároků 11 až 13.
- 19. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden protein podle kteréhokoliv z nároku 11 až 13 a farmaceuticky přijatelný nosič.
- 20. Vakcina, vyznačující se tím, že obsahuje protein podle kteréhokoliv z nároků 11 až 13.
- 21. Použití proteinu podle kteréhokoliv z nároků 11 až 13 pro přípravu farmaceutického přípravku pro profylaxi nebo terapii s EBV-souvisejících chorob, kde uvedenou s EBV-související chorobou je NPC, chronická infekční mononukleosa nebo s EBV-souvise jící Burkittům lymfom, Hodgkinova choroba, nasofaryngeální karcinom, EBV reaktivace v souvislosti s transplantací orgánu.
- 22. Způsob specifické detekce EBV infekcí, vyznačující se tím, že používá celé nebo fragmenty DNA sekvence podle* kteréhokoliv z nároků 1 až 5 pro detekci EBV DNA v klinických vzorcích při hybridizaci s nebo bez další amplifikace.
- 23. Primerový pár, který hybridizuje k 5' a 3' koncům kódující oblasti DNA sekvence podle nároku 1 nebo 2 a jeho komplementární řetězce.Zastupuje :Dr. Miloš Všetečka /L·Seznam sekvencí (1) Obecná informace:(i) přihlašovatel:(A) jméno: Wolf, Hans Joachim (3) ulice: Josef-Jaegerhuber-Strasse 9 (C) město: Starnberg (Ξ) země: DE (F) poštovní kod (ZIP): 82319 (A) jméno: Reischl Udo (B) ulice: Grosse Leite 7 (C) město: Grafenau (E) země: DE’ (F) poštovní kod (ZIP) : 94481 (A) ' jméno: Motz Manfred (B) ulice: Schachnerstrasse 7 (C) město: Mnichov (E) země: DE (F) poštovní kod (ZIP): 81379 (ii) Název vynálezu: Epstein-Barr virové sekvence, kódující diagnosticky relevantní virový kapsidový antigen, expresní klony získané polymerázovou řetězovou reakcí a použití tohoto rekombinantního antigenu v ...(iii) počet sekvencí: 2 (iv) poítačově čitelná forma:(A) typ media: floppy disk (B) počítač: IBM PC kompatibilní (C) operační systém: PC-DOS/MS-DOS (software): Patentln Release č.1,0, version č. 1,25 (EPO) (V) údaje o přihlášce:číslo přihlášky: PCT/E/94/02439 (vi) prioritní údaje o přihlášce:(A) číslo přihlášky: EP 93 11 1883.0 (B) datum podání: 23.7.1993 (2) informace o sekvenci ID NO:1 (i) charakteristiky sekvence:(A) délka: 489 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězec: jeden (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (ix): rysy:(A) jméno/klíč: CDS (B) lokace: 1..436 (xi) popis sekvence
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP93111883A EP0726315B1 (en) | 1993-07-23 | 1993-07-23 | Epstein-Barr virus DNA sequences encoding a diagnostically relevant virus capsid antigen, expression clones derived through polymerase chain reaction and the use of this recombinant antigen in diagnostic tests |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20996A3 true CZ20996A3 (en) | 1996-10-16 |
Family
ID=8213107
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ96209A CZ20996A3 (en) | 1993-07-23 | 1994-07-22 | Epstein-barr virus sequences encoding diagnostically relevant viral capside antigen, expression clones obtained by polymerase chain reaction and the use of such recombinant antigen in diagnostic tests |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5741656A (cs) |
| EP (1) | EP0726315B1 (cs) |
| JP (1) | JPH09502864A (cs) |
| CN (1) | CN1117150C (cs) |
| AT (1) | ATE207120T1 (cs) |
| AU (1) | AU7495494A (cs) |
| CZ (1) | CZ20996A3 (cs) |
| DE (1) | DE69330966T2 (cs) |
| ES (1) | ES2166757T3 (cs) |
| WO (1) | WO1995003415A2 (cs) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19526384C2 (de) * | 1995-07-19 | 1997-07-10 | Biotest Ag | Rekombinante autologe Fusionsproteine des Epstein-Barr-Virus, sowie diese enthaltende Testkits zum Nachweis von Epstein-Barr-Virus-spezifischen Antikörpern |
| JP4472171B2 (ja) | 1998-03-04 | 2010-06-02 | アクゾ・ノベル・エヌ・ベー | エプスタイン−バーウイルス（ｅｂｖ）核酸の増幅と検出のためのオリゴヌクレオチド |
| US7455844B2 (en) | 2006-03-29 | 2008-11-25 | Merial Limited | Vaccine against streptococci |
| CN104139155A (zh) * | 2013-05-06 | 2014-11-12 | 福特汽车公司 | 用于生成模具组件的模的添加制备方法 |
| CN117233397B (zh) * | 2023-05-26 | 2026-02-03 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种鼻咽癌生物标志物及其应用 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3583564D1 (de) * | 1984-08-23 | 1991-08-29 | Hans Joachim Wolf | Dna-sequenzen des ebv-genoms, rekombinante dna-molekuele, verfahren zur herstellung von ebv-verwandten antigenen sowie diagnostische zusammensetzungen und pharmazeutische zusammensetzungen, die die genannten antigene enthalten. |
| US4683195A (en) * | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| AU6164890A (en) * | 1989-08-10 | 1991-03-11 | Northwestern University | Method of identifying herpesviruses and oligonucleotides for use therein |
| EP0585216A1 (en) * | 1989-11-24 | 1994-03-09 | The Council Of The Queensland Institue Of Medical Research | Im peptides |
| MX9203409A (es) * | 1989-12-20 | 1992-07-01 | Schering Corp | Proteinas bcrfi como inhibidores de la gama interferona. |
| DE69332197T2 (de) * | 1992-03-13 | 2003-04-17 | Organon Teknika B.V., Boxtel | Epstein-Barr-Virus verwandte Peptide und Nukleinsäuresegmenten |
-
1993
- 1993-07-23 AT AT93111883T patent/ATE207120T1/de active
- 1993-07-23 ES ES93111883T patent/ES2166757T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-23 EP EP93111883A patent/EP0726315B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-23 DE DE69330966T patent/DE69330966T2/de not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-07-22 CZ CZ96209A patent/CZ20996A3/cs unknown
- 1994-07-22 JP JP7504952A patent/JPH09502864A/ja active Pending
- 1994-07-22 CN CN94193098A patent/CN1117150C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1994-07-22 WO PCT/EP1994/002436 patent/WO1995003415A2/en not_active Ceased
- 1994-07-22 US US08/586,640 patent/US5741656A/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-07-22 AU AU74954/94A patent/AU7495494A/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0726315A1 (en) | 1996-08-14 |
| EP0726315B1 (en) | 2001-10-17 |
| JPH09502864A (ja) | 1997-03-25 |
| CN1129460A (zh) | 1996-08-21 |
| DE69330966D1 (de) | 2001-11-22 |
| CN1117150C (zh) | 2003-08-06 |
| WO1995003415A2 (en) | 1995-02-02 |
| DE69330966T2 (de) | 2002-06-06 |
| US5741656A (en) | 1998-04-21 |
| ATE207120T1 (de) | 2001-11-15 |
| WO1995003415A3 (en) | 1995-03-16 |
| ES2166757T3 (es) | 2002-05-01 |
| AU7495494A (en) | 1995-02-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111218459B (zh) | 一种以人复制缺陷腺病毒为载体的重组新型冠状病毒疫苗 | |
| US5316910A (en) | Bioassay for influenza A and B nucleoprotein | |
| EP0173254B1 (en) | Dna sequences of the ebv genome, recombinant dna molecules, processes for producing ebv-related antigens, diagnostic compositions and pharmaceutical compositions containing said antigens | |
| JP2001514518A (ja) | 発現の向上したベクター並びにその製造および使用方法 | |
| CN115160413B (zh) | 一种新型冠状病毒疫苗 | |
| JP2003506039A (ja) | ｃＤＮＡからの流行性耳下腺炎ウイルスのレスキュー | |
| AU732254B2 (en) | A human cytomegalovirus combined antigen and its use | |
| JP3435574B2 (ja) | 外来ｄｎａを含有するウマのヘルペスウイルス（ｅｈｖ）、その調製方法およびワクチンにおけるその使用 | |
| JP3061196B2 (ja) | パルボウイルスｂ１９の免疫学的に活性なペプチドまたはポリペプチド | |
| JPH0314840B2 (cs) | ||
| EP0769056B1 (en) | NON-SPLICING VARIANTS OF gp350/220 | |
| EP0117063A1 (en) | Methods and materials for development of parvovirus vaccine | |
| Motz et al. | Expression of the Epstein-Barr virus 138-kDa early protein in Escherichia coli for the use as antigen in diagnostic tests | |
| US6274307B1 (en) | Immunologically active peptides or polypeptides from the parvovirus B19 | |
| US5741656A (en) | Epstein-Barr virus sequences encoding a diagnostically relevant virus capsid antigen, expression clones derived through polymerase chain reaction and the use of this recombinant antigen in diagnostic tests | |
| CN115772230A (zh) | 一种rsv重组抗原、其制备方法及应用 | |
| JP3529134B2 (ja) | 組換えネコヘルペスウイルスのベクターワクチン | |
| MXPA02005655A (es) | Virus centinela (sv1) del virus de la hepatitis. | |
| EP0238893B1 (en) | Recombinant parvovirus ra-1 products and methods of use thereof | |
| EP1074624B1 (en) | Attenuated chicken-pox virus oka strain gene 62 and method for identifying virus strain for attenuated live chicken-pox vaccine by using the gene | |
| Liu et al. | Antibody against the Epstein‐Barr virus BHRF1 protein, a homologue of Bcl‐2, in patients with nasopharyngeal carcinoma | |
| EP1331270B1 (en) | Novel recombinant feline herpesvirus 1 and polyvalent vaccine with the use of the same | |
| Gretch et al. | Expression of a human cytomegalovirus glycoprotein multigene family | |
| WO1988006182A1 (fr) | Vaccin contre le virus de la leucemie bovine prepare en utilisant le virus recombinant de la vaccine | |
| CA1341100C (en) | Determined dna sequences derived from a papilloma virus genome, their uses for in vitro diagnostic purposes and the production of antigenic compositions |