JPH07265085A - 組換えポックスウイルス - Google Patents
組換えポックスウイルスInfo
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- JPH07265085A JPH07265085A JP7030352A JP3035295A JPH07265085A JP H07265085 A JPH07265085 A JP H07265085A JP 7030352 A JP7030352 A JP 7030352A JP 3035295 A JP3035295 A JP 3035295A JP H07265085 A JPH07265085 A JP H07265085A
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
- C07K14/445—Plasmodium
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0026—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5)
- C12N9/0028—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5) with NAD or NADP as acceptor (1.5.1)
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
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- C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
- C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明は外来遺伝子の発現が可能な感染性組
換えポックスウイルスを提供する。 【構成】 本発明は、転写調節配列またはそのサブユニ
ット、あるいは上記転写配列の機能を保持した変異配列
およびこれらに機能的に結合している原核細胞または真
核細胞ポリペプチドをコードする外来遺伝子からなるキ
メラ遺伝子を含有し、そしてこの外来遺伝子の発現が可
能な感染性組換えポックスウイルスに関する。
換えポックスウイルスを提供する。 【構成】 本発明は、転写調節配列またはそのサブユニ
ット、あるいは上記転写配列の機能を保持した変異配列
およびこれらに機能的に結合している原核細胞または真
核細胞ポリペプチドをコードする外来遺伝子からなるキ
メラ遺伝子を含有し、そしてこの外来遺伝子の発現が可
能な感染性組換えポックスウイルスに関する。
Description
【０００１】ワクシニアウイルスはポックスウイルス群
のオルトポックスウイルスのプロトタイプである。本ウ
イルスの生物学および複製に関してはモス（B.Moss) に
より詳細に記載されている〔ポックスウイルス（"Poxvi
ruses"、Comprehensive Virology) 、フレンケル−コン
ラート（H.Fraenkel-Conrat)およびワグナー（R.Wagne
r) 編集、Rlenum Press, New York、第４巻、４０５〜
４７４頁〔１９７４年〕〕：ポックスウイルス（"Poxvi
ruses"、Molecular Biology of Animal Viruses)、ナヤ
ク（D.P.Nayak)編集、Marcel Dekker, New York 、第２
巻、８４９〜８９０頁〔１９７８年〕：“キャッピング
およびメチル化酵素による５′末端のラベル化”、Gene
Amplification and Analysis 、キリキアン（J.G. Chi
rikjian)およびパプクス（T.S. Papcs) 編集、Elsevie
r, Narth-Holland 、第２巻、２５４〜２６６頁〔１９
８１年〕）。アデノウイルス、ヘルペスシンプレックス
ウイルスおよびワクシニアウイルスなどのように遺伝子
の大きい動物ＤＮＡウイルスのいくつかのものがクロー
ニング用ベクターとして使われてきているが、後者の組
換え体のみが完全な感染性を保持したままで外来遺伝子
を発現している。一方、ワクシニアウイルスを生ワクチ
ンとして使用する多くの経験も蓄積している。宿主範囲
が広いこと、外来遺伝子に対する能力が大きいことおよ
びガン遺伝子形質転換の誘導がないことなどがワクシニ
アウイルス組換え体の生ワクチンとしての可能性を高め
ている。組換えワクシニアウイルスの生ワクチンとして
の利用についての最新の総説はスミス（G.L.Smith)ら
（バイオテクノロジー（Biotechnology and genetic En
gineering Reviws) 、２巻、３８３〜４０７頁〔１９８
４年〕）により、組換えワクシニアウイルスの生物学お
よびワクシニアのプロモーター制御下による外来遺伝子
の発現を含め、述べられている。
のオルトポックスウイルスのプロトタイプである。本ウ
イルスの生物学および複製に関してはモス（B.Moss) に
より詳細に記載されている〔ポックスウイルス（"Poxvi
ruses"、Comprehensive Virology) 、フレンケル−コン
ラート（H.Fraenkel-Conrat)およびワグナー（R.Wagne
r) 編集、Rlenum Press, New York、第４巻、４０５〜
４７４頁〔１９７４年〕〕：ポックスウイルス（"Poxvi
ruses"、Molecular Biology of Animal Viruses)、ナヤ
ク（D.P.Nayak)編集、Marcel Dekker, New York 、第２
巻、８４９〜８９０頁〔１９７８年〕：“キャッピング
およびメチル化酵素による５′末端のラベル化”、Gene
Amplification and Analysis 、キリキアン（J.G. Chi
rikjian)およびパプクス（T.S. Papcs) 編集、Elsevie
r, Narth-Holland 、第２巻、２５４〜２６６頁〔１９
８１年〕）。アデノウイルス、ヘルペスシンプレックス
ウイルスおよびワクシニアウイルスなどのように遺伝子
の大きい動物ＤＮＡウイルスのいくつかのものがクロー
ニング用ベクターとして使われてきているが、後者の組
換え体のみが完全な感染性を保持したままで外来遺伝子
を発現している。一方、ワクシニアウイルスを生ワクチ
ンとして使用する多くの経験も蓄積している。宿主範囲
が広いこと、外来遺伝子に対する能力が大きいことおよ
びガン遺伝子形質転換の誘導がないことなどがワクシニ
アウイルス組換え体の生ワクチンとしての可能性を高め
ている。組換えワクシニアウイルスの生ワクチンとして
の利用についての最新の総説はスミス（G.L.Smith)ら
（バイオテクノロジー（Biotechnology and genetic En
gineering Reviws) 、２巻、３８３〜４０７頁〔１９８
４年〕）により、組換えワクシニアウイルスの生物学お
よびワクシニアのプロモーター制御下による外来遺伝子
の発現を含め、述べられている。
【０００２】本発明は、ワクシニアＤＮＡ、好ましくは
分子量１１０００（１１ｋＤａ）の塩基性ポリペプチド
をコードするワクシニアウイルスの後期発現遺伝子の
５′に結合する転写調節配列、外来遺伝子をポックスウ
イルスに挿入するのに有効な組換えベクターに関し、特
に、そのような転写調節配列に機能的に外来遺伝子が結
合し、対応するポリペプチドの発現を可能とする感染性
組換えポックスウイルスおよびその製造方法に関する。
本発明で使用する好ましいポックスウイルスはワクシニ
アウイルスである。
分子量１１０００（１１ｋＤａ）の塩基性ポリペプチド
をコードするワクシニアウイルスの後期発現遺伝子の
５′に結合する転写調節配列、外来遺伝子をポックスウ
イルスに挿入するのに有効な組換えベクターに関し、特
に、そのような転写調節配列に機能的に外来遺伝子が結
合し、対応するポリペプチドの発現を可能とする感染性
組換えポックスウイルスおよびその製造方法に関する。
本発明で使用する好ましいポックスウイルスはワクシニ
アウイルスである。
【０００３】ウイテク（R.Wittek) ら（ビロロジー（J.
Virol.) ４９巻、３７１〜３７８頁〔１９８４年〕）に
よりマップされているワクシニアウイルスの１１ｋＤａ
の主要構造ポリペプチドをコードする遺伝子はその５′
−領域を含めて配列が決定されている。上記遺伝子のＤ
ＮＡ配列およびそれに由来するアミノ酸配列を以下に示
す。
Virol.) ４９巻、３７１〜３７８頁〔１９８４年〕）に
よりマップされているワクシニアウイルスの１１ｋＤａ
の主要構造ポリペプチドをコードする遺伝子はその５′
−領域を含めて配列が決定されている。上記遺伝子のＤ
ＮＡ配列およびそれに由来するアミノ酸配列を以下に示
す。
【化３】
【０００４】５′−側の領域はワクシニアの初期遺伝子
の相当する領域（ワイアー（J.P.Weir) およびモス（B.
Moss) 、ビロロジー（J.Virol.) ５１巻、６６２〜６６
９頁〔１９８４年〕）或いは多くの真核細胞遺伝子に特
有な共通配列とはほとんど相同性がない。さらに、１１
ｋＤａ遺伝子の５′−側領域からおよそ１００塩基対以
下のＤＮＡ断片内にワクシニアウイルスの後期遺伝子発
現の正しい制御に必要な全ての転写調節シグナルが存在
することがわかった。
の相当する領域（ワイアー（J.P.Weir) およびモス（B.
Moss) 、ビロロジー（J.Virol.) ５１巻、６６２〜６６
９頁〔１９８４年〕）或いは多くの真核細胞遺伝子に特
有な共通配列とはほとんど相同性がない。さらに、１１
ｋＤａ遺伝子の５′−側領域からおよそ１００塩基対以
下のＤＮＡ断片内にワクシニアウイルスの後期遺伝子発
現の正しい制御に必要な全ての転写調節シグナルが存在
することがわかった。
【０００５】従って、本発明は次の式で示す転写調節配
列、またはそのサブユニット（断片）で外来遺伝子を制
御下で発現可能なものより成る。
列、またはそのサブユニット（断片）で外来遺伝子を制
御下で発現可能なものより成る。
【化４】
【０００６】さらに、上記転写調節配列の３′末端の２
番目の位置から数えて１３塩基対以内のＤＮＡ断片がワ
クシニアウイルスの後期遺伝子の発現の正しい制御にと
って好ましい要素であることがわかった。従って、その
ような３′末端転写調節配列（断片）も本発明に属する
ものであり、本出願に包含される。
番目の位置から数えて１３塩基対以内のＤＮＡ断片がワ
クシニアウイルスの後期遺伝子の発現の正しい制御にと
って好ましい要素であることがわかった。従って、その
ような３′末端転写調節配列（断片）も本発明に属する
ものであり、本出願に包含される。
【０００７】さらに、本発明は前述の転写調節配列の、
欠失、挿入、置換、一個またはいくつかのヌクレオチド
の転換およびそれらの組み合わせを含む変異であってポ
ックスウイルスの後期プロモーター（機能的変異）とし
て機能するものを含む。
欠失、挿入、置換、一個またはいくつかのヌクレオチド
の転換およびそれらの組み合わせを含む変異であってポ
ックスウイルスの後期プロモーター（機能的変異）とし
て機能するものを含む。
【０００８】上述の転写調節配列の機能的変異の具体例
は以下に示す式で代表される。
は以下に示す式で代表される。
【化５】
【０００９】本発明はさらに、原核細胞或いは真核細胞
ポリペプチドをコードする外来遺伝子に作用できるよう
に結合したワクシニアの主要後期１１ｋＤａ遺伝子の転
写調節配列の少なくとも一つにより成るキメラ遺伝子
と、そのキメラ遺伝子に結合したポックスウイルスゲノ
ムの非必須部分と、ベクターの複製原点および抗生物質
耐性遺伝子を含む組換えベクターをも含む。キメラ遺伝
子の翻訳開始部位はワクシニアの主要１１ｋＤａ遺伝子
の転写調節配列或いは原核細胞または真核細胞ポリペプ
チドをコードする外来遺伝子が有している。外来遺伝子
の翻訳開始部位を利用することによりコドン形成や融合
たん白の生物活性に伴なう問題を回避できる。ワクシニ
アの主要１１ｋＤａ遺伝子の転写調節配列の翻訳開始部
位或いは外来遺伝子の翻訳開始部位を用いた好ましい組
換えベクターは実施例１〜４に例示している。
ポリペプチドをコードする外来遺伝子に作用できるよう
に結合したワクシニアの主要後期１１ｋＤａ遺伝子の転
写調節配列の少なくとも一つにより成るキメラ遺伝子
と、そのキメラ遺伝子に結合したポックスウイルスゲノ
ムの非必須部分と、ベクターの複製原点および抗生物質
耐性遺伝子を含む組換えベクターをも含む。キメラ遺伝
子の翻訳開始部位はワクシニアの主要１１ｋＤａ遺伝子
の転写調節配列或いは原核細胞または真核細胞ポリペプ
チドをコードする外来遺伝子が有している。外来遺伝子
の翻訳開始部位を利用することによりコドン形成や融合
たん白の生物活性に伴なう問題を回避できる。ワクシニ
アの主要１１ｋＤａ遺伝子の転写調節配列の翻訳開始部
位或いは外来遺伝子の翻訳開始部位を用いた好ましい組
換えベクターは実施例１〜４に例示している。
【００１０】本発明の組換えベクターは文献によく知ら
れている方法（パニカリ（D.Panicali) およびパオレッ
ティ（E.Paoletti) 、ＰＮＡＳ、７９巻、４９２７〜４
９３１頁〔１９８３年〕；パニカリ（D.Panicali) ら、
ＰＮＡＳ、８０巻、５３６４〜５３６８頁〔１９８４
年〕；スミス（G.L.Smith)ら、上述；マケット（M.Mack
ett)ら、ビロロジー（J.Virol.) ４９巻、８５７〜８６
４頁〔１９８４年〕）により以下のステップに従って構
築される。 （ａ）ポックスウイルスＤＮＡを含むベクターを調整す
る。該ＤＮＡは （ｉ）少なくとも一つの制限酵素部位に隣接して少なく
とも一つの転写調節配列、および（ii) 上記調節配列お
よび制限酵素部位に結合したポックスウイルスゲノムの
非必須部分からのＤＮＡとから成る。 （ｂ）原核細胞又は真核細胞ポリペプチドをコードする
少なくとも一個の外来遺伝子を上記転写調節配列に隣接
する上記制限酵素部位に挿入する。
れている方法（パニカリ（D.Panicali) およびパオレッ
ティ（E.Paoletti) 、ＰＮＡＳ、７９巻、４９２７〜４
９３１頁〔１９８３年〕；パニカリ（D.Panicali) ら、
ＰＮＡＳ、８０巻、５３６４〜５３６８頁〔１９８４
年〕；スミス（G.L.Smith)ら、上述；マケット（M.Mack
ett)ら、ビロロジー（J.Virol.) ４９巻、８５７〜８６
４頁〔１９８４年〕）により以下のステップに従って構
築される。 （ａ）ポックスウイルスＤＮＡを含むベクターを調整す
る。該ＤＮＡは （ｉ）少なくとも一つの制限酵素部位に隣接して少なく
とも一つの転写調節配列、および（ii) 上記調節配列お
よび制限酵素部位に結合したポックスウイルスゲノムの
非必須部分からのＤＮＡとから成る。 （ｂ）原核細胞又は真核細胞ポリペプチドをコードする
少なくとも一個の外来遺伝子を上記転写調節配列に隣接
する上記制限酵素部位に挿入する。
【００１１】原核細胞又は真核細胞ポリペプチドをコー
ドする外来遺伝子をまだ持たないで、ワクシニアの主要
後期１１ｋＤａ遺伝子の少なくとも一個の転写調節配列
より成る組換えベクター中間体も本発明の目的であり、
上述のステップ（ａ）に従い、ワクシニアの主要後期１
１ｋＤａ遺伝子の転写調節配列が、１１ｋＤａ遺伝子の
翻訳開始部位を含み、或いはさらに加えて、１１ｋＤａ
遺伝子の翻訳開始部位とｍＲＮＡの開始点との間の領域
で終結している。
ドする外来遺伝子をまだ持たないで、ワクシニアの主要
後期１１ｋＤａ遺伝子の少なくとも一個の転写調節配列
より成る組換えベクター中間体も本発明の目的であり、
上述のステップ（ａ）に従い、ワクシニアの主要後期１
１ｋＤａ遺伝子の転写調節配列が、１１ｋＤａ遺伝子の
翻訳開始部位を含み、或いはさらに加えて、１１ｋＤａ
遺伝子の翻訳開始部位とｍＲＮＡの開始点との間の領域
で終結している。
【００１２】組換えベクターを構築するために用いられ
るベクターはいずれの便利なプラスミド、コスミド或い
はファージでもよい。便利なプラスミド、コスミド或い
はファージのビークルは、例えば実験書“モレキュラー
クローニング（Molecular Cloning)" 、マニアテイス
（Maniatis) ら、Cold Spiring Harbor Laboratory；１
９８２年に記載されている。本発明で組換えベクターの
構築に用いられるプラスミド源としての好ましいベクタ
ーはｐＢＲ３２２およびｐＵＣ８である。
るベクターはいずれの便利なプラスミド、コスミド或い
はファージでもよい。便利なプラスミド、コスミド或い
はファージのビークルは、例えば実験書“モレキュラー
クローニング（Molecular Cloning)" 、マニアテイス
（Maniatis) ら、Cold Spiring Harbor Laboratory；１
９８２年に記載されている。本発明で組換えベクターの
構築に用いられるプラスミド源としての好ましいベクタ
ーはｐＢＲ３２２およびｐＵＣ８である。
【００１３】キメラ遺伝子を結合するために使用される
ＤＮＡはポックスウイルスゲノムの非必須領域に由来す
る。そのような非必須領域の例はチミジンキナーゼ（Ｔ
Ｋ）遺伝子（ワイアー（J.P.Weir) およびモス（B.Mos
s) 、ジロロジー（J.Virol.)、４６巻、５３０〜５３７
頁〔１９８３年〕）である。本発明で用いられる好まし
い非必須領域はポックスウイルスのチミジンキナーゼ遺
伝子とチミジンキナーゼ遺伝子に隣接するＤＮＡの部分
とから成る。特に好ましいものはワクシニアウイルスの
チミジンキナーゼ遺伝子とそれに隣接するワクシニアＤ
ＮＡの断片である。非必須領域の調製法は実施例１に詳
細に記載されている。
ＤＮＡはポックスウイルスゲノムの非必須領域に由来す
る。そのような非必須領域の例はチミジンキナーゼ（Ｔ
Ｋ）遺伝子（ワイアー（J.P.Weir) およびモス（B.Mos
s) 、ジロロジー（J.Virol.)、４６巻、５３０〜５３７
頁〔１９８３年〕）である。本発明で用いられる好まし
い非必須領域はポックスウイルスのチミジンキナーゼ遺
伝子とチミジンキナーゼ遺伝子に隣接するＤＮＡの部分
とから成る。特に好ましいものはワクシニアウイルスの
チミジンキナーゼ遺伝子とそれに隣接するワクシニアＤ
ＮＡの断片である。非必須領域の調製法は実施例１に詳
細に記載されている。
【００１４】本発明の組換えベクターに挿入される外来
遺伝子は原核細胞または真核細胞ポリペプチドをコード
する広範囲の遺伝子（ＤＮＡ遺伝子或いはＲＮＡ遺伝子
のＤＮＡコピー）から選択される。例えば、外来遺伝子
は酵素、ホルモン、免疫調節、抗ウイルス性或いは抗癌
性を示すポリペプチド、抗体、抗原および原核細胞また
は真核細胞由来の他の有用なポリペプチドをコードす
る。本発明で用いられる好ましい外来遺伝子はマラリア
抗原、特にプラスモジウム（Plasmodium falciparum)の
５．１表面抗原（ホープ（I.A.Hope) ら、後述）をコー
ドする遺伝子およびマウスのジヒドロ葉酸レダクターゼ
（ＤＨＦＲ）遺伝子（チャン（A.C.Y.Chang)ら、"E.col
i におけるフェノタイプ発現（Phenotypic expression
in E.coliof a DNA sequence coding for mouse dihydr
ofolate reductase)"、ネイチャー（Nature) 、２７５
巻、６１７〜６２４頁〔１９７８年〕）である。
遺伝子は原核細胞または真核細胞ポリペプチドをコード
する広範囲の遺伝子（ＤＮＡ遺伝子或いはＲＮＡ遺伝子
のＤＮＡコピー）から選択される。例えば、外来遺伝子
は酵素、ホルモン、免疫調節、抗ウイルス性或いは抗癌
性を示すポリペプチド、抗体、抗原および原核細胞また
は真核細胞由来の他の有用なポリペプチドをコードす
る。本発明で用いられる好ましい外来遺伝子はマラリア
抗原、特にプラスモジウム（Plasmodium falciparum)の
５．１表面抗原（ホープ（I.A.Hope) ら、後述）をコー
ドする遺伝子およびマウスのジヒドロ葉酸レダクターゼ
（ＤＨＦＲ）遺伝子（チャン（A.C.Y.Chang)ら、"E.col
i におけるフェノタイプ発現（Phenotypic expression
in E.coliof a DNA sequence coding for mouse dihydr
ofolate reductase)"、ネイチャー（Nature) 、２７５
巻、６１７〜６２４頁〔１９７８年〕）である。
【００１５】ｐＨＧＳ群のプラスミドが本発明の組換え
プラスミドベクターの特有の実例である。その調整法は
実施例１〜４に詳細に記載している。本発明の組換えベ
クターを調整するのに有効なプラスミドを含有するE.co
li株は１９８５年２月２１日付けでドイツチエ サムル
ング（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen)（ＤＳ
Ｍ）に寄託番号をそれぞれＤＳＭ−３２４８およびＤＳ
Ｍ−３２４９として寄託されている。E.coli Ｃ６００
（E.coli ＤＨ１）およびE.coli ＲＲ１（ＡＴＣＣ−
３１３４３）のような他のグラム陰性宿主も利用でき、
マニアティス（Maniatis) らによる実験書“モレキュラ
ー クローニング（Molecular Colning)" （上述）に記
載されている。
プラスミドベクターの特有の実例である。その調整法は
実施例１〜４に詳細に記載している。本発明の組換えベ
クターを調整するのに有効なプラスミドを含有するE.co
li株は１９８５年２月２１日付けでドイツチエ サムル
ング（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen)（ＤＳ
Ｍ）に寄託番号をそれぞれＤＳＭ−３２４８およびＤＳ
Ｍ−３２４９として寄託されている。E.coli Ｃ６００
（E.coli ＤＨ１）およびE.coli ＲＲ１（ＡＴＣＣ−
３１３４３）のような他のグラム陰性宿主も利用でき、
マニアティス（Maniatis) らによる実験書“モレキュラ
ー クローニング（Molecular Colning)" （上述）に記
載されている。
【００１６】上に記載したキメラ遺伝子を含み、発現す
る適当な感染性組換えポックスウイルスは文献（スミス
（G.L.Smith)ら、バイオテクノロジー（Biotechnology
andGenetic Engineering Reviws) ２巻、３８３〜４０
７頁〔１９８４年〕；M.Mackett ら、上述）によく知ら
れる方法により得られ、次のステップより成る。 （ａ）ポックスウイルス属のウイルスに感染した少なく
とも一個の細胞を得る。 （ｂ）上述細胞を組換えベクターで形質導入し、ポック
スウイルスのＤＮＡと組換えベクターに含まれるポック
スウイルスＤＮＡの少なくとも一部分との間で相同組換
えを起こす。 （ｃ）上記細胞より原核細胞又は真核細胞ポリペプチド
をコードする上記外来遺伝子を発現することのできる感
染性組換えポックスウイルスを選択的方法により単離す
る。
る適当な感染性組換えポックスウイルスは文献（スミス
（G.L.Smith)ら、バイオテクノロジー（Biotechnology
andGenetic Engineering Reviws) ２巻、３８３〜４０
７頁〔１９８４年〕；M.Mackett ら、上述）によく知ら
れる方法により得られ、次のステップより成る。 （ａ）ポックスウイルス属のウイルスに感染した少なく
とも一個の細胞を得る。 （ｂ）上述細胞を組換えベクターで形質導入し、ポック
スウイルスのＤＮＡと組換えベクターに含まれるポック
スウイルスＤＮＡの少なくとも一部分との間で相同組換
えを起こす。 （ｃ）上記細胞より原核細胞又は真核細胞ポリペプチド
をコードする上記外来遺伝子を発現することのできる感
染性組換えポックスウイルスを選択的方法により単離す
る。
【００１７】感染性組換えポックスウイルスの調製に使
用できる適当な真核宿主細胞としてはＣＶ−１、ＲＫ−
１３、ＴＫ- １４３或いはその他の細胞がある。本発明
で使用される好ましい真核宿主細胞はＲＫ−１３であ
る。感染性組換えワクシニアウイルスＲＶＶ１からＲＶ
Ｖ８までが本発明の特有の例である。それらの調製およ
び単離の詳細は実施例１〜４に示されている。
用できる適当な真核宿主細胞としてはＣＶ−１、ＲＫ−
１３、ＴＫ- １４３或いはその他の細胞がある。本発明
で使用される好ましい真核宿主細胞はＲＫ−１３であ
る。感染性組換えワクシニアウイルスＲＶＶ１からＲＶ
Ｖ８までが本発明の特有の例である。それらの調製およ
び単離の詳細は実施例１〜４に示されている。
【００１８】本発明の感染性組換えワクシニアウイルス
を用いて発現されるたん白質の例はマウスジヒドロ葉酸
レダクターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランス
フェラーゼおよびマラリア表面抗原であり、特にプラス
モジウム（Plasmodium falciparum)の５．１表面抗原で
ある。
を用いて発現されるたん白質の例はマウスジヒドロ葉酸
レダクターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランス
フェラーゼおよびマラリア表面抗原であり、特にプラス
モジウム（Plasmodium falciparum)の５．１表面抗原で
ある。
【００１９】感染性組換えポックスウイルスを用いて原
核細胞又は真核細胞ポリペプチドをコードするキメラ遺
伝子を発現する方法はよく知られている（スミス（G.L.
Smith)ら、上述；キーニー（M.P.Kieny)ら、ネイチャー
（Nature) ３１２巻、１６３〜１６６巻〔１９８４
年〕）；スミス（G.L.Smith)ら、サイエンス（Scienc
e)、２２４巻、３９７〜３９９頁〔１９８４年〕：パオ
レッティ（E.Paoletti) ら、ＰＮＡＳ、８１巻、１９３
〜１９７頁〔１９８４年〕；パニカリ（D.Panicali)
ら、上述）。その方法は、目的の外来遺伝子がポックス
ウイルスの転写調節配列に対して有効に結合した感染性
組換えポックスウイルスを適当な宿主に感染し、宿主を
適当な条件下で培養し、目的ポリペプチドを免疫的、酵
素的および電気泳動的な方法により検出するものであ
る。
核細胞又は真核細胞ポリペプチドをコードするキメラ遺
伝子を発現する方法はよく知られている（スミス（G.L.
Smith)ら、上述；キーニー（M.P.Kieny)ら、ネイチャー
（Nature) ３１２巻、１６３〜１６６巻〔１９８４
年〕）；スミス（G.L.Smith)ら、サイエンス（Scienc
e)、２２４巻、３９７〜３９９頁〔１９８４年〕：パオ
レッティ（E.Paoletti) ら、ＰＮＡＳ、８１巻、１９３
〜１９７頁〔１９８４年〕；パニカリ（D.Panicali)
ら、上述）。その方法は、目的の外来遺伝子がポックス
ウイルスの転写調節配列に対して有効に結合した感染性
組換えポックスウイルスを適当な宿主に感染し、宿主を
適当な条件下で培養し、目的ポリペプチドを免疫的、酵
素的および電気泳動的な方法により検出するものであ
る。
【００２０】従って、感染性組換えポックスウイルスは
動物又はヒトで免疫応答を誘発し、該外来遺伝子により
コードされるたん白の少なくとも抗原部分に対する抗体
を生産するのに十分な組換えポックスウイルスの濃度を
含む種を動物又はヒトに接種することにより、生ワクチ
ンとして使用することも出来る。本発明に於いて防御用
免疫に使用する好ましい感染性組換えポックスウイルス
は感染性組換えワクシニアウイルスである。特に好まし
いものはマラリア表面抗原、特にプラスモジウム ファ
ルシパルム（Plasmodium falciparum)の５．１表面抗原
を発現するものである。
動物又はヒトで免疫応答を誘発し、該外来遺伝子により
コードされるたん白の少なくとも抗原部分に対する抗体
を生産するのに十分な組換えポックスウイルスの濃度を
含む種を動物又はヒトに接種することにより、生ワクチ
ンとして使用することも出来る。本発明に於いて防御用
免疫に使用する好ましい感染性組換えポックスウイルス
は感染性組換えワクシニアウイルスである。特に好まし
いものはマラリア表面抗原、特にプラスモジウム ファ
ルシパルム（Plasmodium falciparum)の５．１表面抗原
を発現するものである。
【００２１】ヒトに使用する感染性組換えワクシニアウ
イルスはカプラン（C.Kaplan) により（ブルメドオブレ
チン（Br.Med.Bull.) ２５巻、１３１〜１３５頁〔１９
６９年〕）記載されるように調製できる。ワクチン接種
に適した調製物は０．０５ｍｌ当たり１０6 〜１０8 個
のプラーク形成単位を含有していなければならない。ワ
クチンは４０〜５０％のグリセロール含有緩衝溶液中で
凍結し、或いは凍結乾燥状態で保存できる。後進地域で
の使用にはワクチンを凍結乾燥することが必須である。
ワクチン接種は皮下注射で行なう。ワクチンの一滴を消
毒した皮膚の小部分に塗り、表皮の下を直ちに鋭い消毒
針又はナイフで刺す。集団ワクチン接種の際は接種器を
使用する。
イルスはカプラン（C.Kaplan) により（ブルメドオブレ
チン（Br.Med.Bull.) ２５巻、１３１〜１３５頁〔１９
６９年〕）記載されるように調製できる。ワクチン接種
に適した調製物は０．０５ｍｌ当たり１０6 〜１０8 個
のプラーク形成単位を含有していなければならない。ワ
クチンは４０〜５０％のグリセロール含有緩衝溶液中で
凍結し、或いは凍結乾燥状態で保存できる。後進地域で
の使用にはワクチンを凍結乾燥することが必須である。
ワクチン接種は皮下注射で行なう。ワクチンの一滴を消
毒した皮膚の小部分に塗り、表皮の下を直ちに鋭い消毒
針又はナイフで刺す。集団ワクチン接種の際は接種器を
使用する。
【００２２】本発明の一般的記載は終り、以下に示す図
を参照に次の実施例によってさらによく本発明が理解さ
れる。 （図の説明）図に用いられる記号は：（イ）はワクシニ
アウイルスのＴＫ−遺伝子を示す。（ロ）はワクシニア
ウイルスの１１ｋＤａたん白の転写調節配列を示す。
（ハ）はPlasmodium falciparum の５．１抗原の遺伝子
を示す。（ニ）はマウスジヒドロ葉酸レダクターゼの遺
伝子を示す。
を参照に次の実施例によってさらによく本発明が理解さ
れる。 （図の説明）図に用いられる記号は：（イ）はワクシニ
アウイルスのＴＫ−遺伝子を示す。（ロ）はワクシニア
ウイルスの１１ｋＤａたん白の転写調節配列を示す。
（ハ）はPlasmodium falciparum の５．１抗原の遺伝子
を示す。（ニ）はマウスジヒドロ葉酸レダクターゼの遺
伝子を示す。
【００２３】図１ＡはｐＢＲ−３２２およびワクシニア
ウイルスのＨｉｎｄ III“Ｊ”断片より成り、ワクシニ
アウイルスのＴＫ−遺伝子を含むプラスミドｐＢＲ−Ｊ
の構築の概略を図示したものである。図１ＢはｐＢＲ−
３２２およびワクシニアウイルスのＨｉｎｄ III−Ｆ断
片の右側から成り、ワクシニアウイルスの１１ｋＤａた
ん白の転写調節配列を含むプラスミドｐＢＲ−Ｆ１の構
築の概略を図示したものである。
ウイルスのＨｉｎｄ III“Ｊ”断片より成り、ワクシニ
アウイルスのＴＫ−遺伝子を含むプラスミドｐＢＲ−Ｊ
の構築の概略を図示したものである。図１ＢはｐＢＲ−
３２２およびワクシニアウイルスのＨｉｎｄ III−Ｆ断
片の右側から成り、ワクシニアウイルスの１１ｋＤａた
ん白の転写調節配列を含むプラスミドｐＢＲ−Ｆ１の構
築の概略を図示したものである。
【００２４】図２はワクシニアウイルスのＴＫ−遺伝子
プラスその先行配列のプラスミドｐＵＣ−８へのサブク
ローニングによるプラスミドｐＵＣ−ＴＫ構築の概略を
図示したものである。図３はワクシニアウイルスの１１
ｋＤａたん白の転写調節配列のＴＫ−遺伝子への挿入に
よるプラスミドｐＵＣ−ＴＫ／１１ｋＤａの構築の概略
を図示したものである。
プラスその先行配列のプラスミドｐＵＣ−８へのサブク
ローニングによるプラスミドｐＵＣ−ＴＫ構築の概略を
図示したものである。図３はワクシニアウイルスの１１
ｋＤａたん白の転写調節配列のＴＫ−遺伝子への挿入に
よるプラスミドｐＵＣ−ＴＫ／１１ｋＤａの構築の概略
を図示したものである。
【００２５】図４は１１ｋＤａたん白の転写調節配列の
ＥｃｏＲＩ制限酵素部位の上流をＸｍｎＩ制限酵素部へ
と変換し、プラスミドｐＨＧＳ−１を得る概略を図示し
たものである。図５ＡはＴＫ−遺伝子に挿入した１１ｋ
Ｄａたん白の転写調節配列で開始する転写物のためのヌ
クレアーゼＳ１プローブの単離および放射標識の概略を
図示したものである。図５ＢはＴＫ−遺伝子の調節配列
で開始する転写物のためのヌクレアーゼＳ１の単離およ
び放射性ラベル標識の概略を図示したものである。
ＥｃｏＲＩ制限酵素部位の上流をＸｍｎＩ制限酵素部へ
と変換し、プラスミドｐＨＧＳ−１を得る概略を図示し
たものである。図５ＡはＴＫ−遺伝子に挿入した１１ｋ
Ｄａたん白の転写調節配列で開始する転写物のためのヌ
クレアーゼＳ１プローブの単離および放射標識の概略を
図示したものである。図５ＢはＴＫ−遺伝子の調節配列
で開始する転写物のためのヌクレアーゼＳ１の単離およ
び放射性ラベル標識の概略を図示したものである。
【００２６】図６の上部はヌクレアーゼＳ１によるＲＮ
Ａ転写物（ホ）のマッピングの概略図を図示したもので
ある。下部はＴＫ−転写物（２５０ｂｐ）および１１ｋ
Ｄａ転写物（２６０ｂｐ）のヌクレアーゼＳ１マッピン
グのＸ線写真である。感染細胞からのＲＮＡを感染後、
３時間目（１列目と２列目）および７時間目（３列目と
４列目）に採取した。
Ａ転写物（ホ）のマッピングの概略図を図示したもので
ある。下部はＴＫ−転写物（２５０ｂｐ）および１１ｋ
Ｄａ転写物（２６０ｂｐ）のヌクレアーゼＳ１マッピン
グのＸ線写真である。感染細胞からのＲＮＡを感染後、
３時間目（１列目と２列目）および７時間目（３列目と
４列目）に採取した。
【００２７】図７上部はヌクレアーゼＳ１によるＲＮＡ
転写物のマッピングの概略を示す。下部はそれぞれＲＶ
Ｖ−２（ｐＨＧＳ−２、１列目および２列目）およびＲ
ＶＶ−３（ｐＨＧＳ−２△１５、３列目と４列目）に感
染した細胞から得たＲＮＡ転写物のヌクレアーゼＳ１マ
ッピングのＸ線フィルム現像である。ＲＮＡは感染後、
４時間目（１列目と４列目）および８時間目（２列目と
３列目）に抽出した。“Ｍ”と記した列はｐＢＲ−３２
２のＨｐａ II断片の32Ｐラベル標識物の夫々示した長
さ（ｂｐ）のものを含むものである。ＴＫ遺伝子或いは
挿入した１１ｋＤａの調節配列で開始するそれぞれのＲ
ＮＡ転写物に相当する位置も示した。
転写物のマッピングの概略を示す。下部はそれぞれＲＶ
Ｖ−２（ｐＨＧＳ−２、１列目および２列目）およびＲ
ＶＶ−３（ｐＨＧＳ−２△１５、３列目と４列目）に感
染した細胞から得たＲＮＡ転写物のヌクレアーゼＳ１マ
ッピングのＸ線フィルム現像である。ＲＮＡは感染後、
４時間目（１列目と４列目）および８時間目（２列目と
３列目）に抽出した。“Ｍ”と記した列はｐＢＲ−３２
２のＨｐａ II断片の32Ｐラベル標識物の夫々示した長
さ（ｂｐ）のものを含むものである。ＴＫ遺伝子或いは
挿入した１１ｋＤａの調節配列で開始するそれぞれのＲ
ＮＡ転写物に相当する位置も示した。
【００２８】図８はプラスモジウム（Plasmodium falci
parum)５．１抗原（Hopeら、上述）のプラスミドｐＨＧ
Ｓ−２へのクローニングと構築されるプラスミドｐＨＧ
Ｓ−２／５．１の概略の図示である。
parum)５．１抗原（Hopeら、上述）のプラスミドｐＨＧ
Ｓ−２へのクローニングと構築されるプラスミドｐＨＧ
Ｓ−２／５．１の概略の図示である。
【００２９】図９はプラスモジウム（Plasmodium falci
parum)５．１抗原を含むウイルスＲＶＶ−４で感染した
細胞の間接免疫蛍光を示す。Ａの細胞は４５０〜４９０
ｎｍで撮影し、Ｂは位相差で撮影したものである。
parum)５．１抗原を含むウイルスＲＶＶ−４で感染した
細胞の間接免疫蛍光を示す。Ａの細胞は４５０〜４９０
ｎｍで撮影し、Ｂは位相差で撮影したものである。
【００３０】図１０はプラスミドｐＨＧＳ−２／ＤＨＦ
Ｒの構築の概略を図示したものである。図１１はプラス
ミドｐＨＧＳ−２／ＤＨＦＲ−Ｅの構築の概略を図示し
たものである。図１２はプラスミドｐＨＧＳ−Ａ／ＤＨ
ＦＲの構築の概略を図示したものである。図１３はプラ
スミドｐＨＧＳ−Ｆ／ＤＨＦＲの構築の概略を図示した
ものである。
Ｒの構築の概略を図示したものである。図１１はプラス
ミドｐＨＧＳ−２／ＤＨＦＲ−Ｅの構築の概略を図示し
たものである。図１２はプラスミドｐＨＧＳ−Ａ／ＤＨ
ＦＲの構築の概略を図示したものである。図１３はプラ
スミドｐＨＧＳ−Ｆ／ＤＨＦＲの構築の概略を図示した
ものである。
【００３１】図１４上部はＲＮＡ転写物（ホ）のヌクレ
アーゼＳ１によるマッピングの概略を示す。予想される
バンドの長さ（３５０ｂｐ）を示した。下部はＲＶＶ−
６（ｐＨＧＳ−２／ＤＨＦＲ）、ＲＶＶ−７（ｐＨＧＳ
−Ａ／ＤＨＦＲ）およびＲＶＶ−８（ｐＨＧＳ−Ｆ／Ｄ
ＨＦＲ）に感染した細胞からのＲＮＡ転写物のヌクレア
ーゼＳ１マッピングのＸ線写真である。初期ＲＮＡはそ
れぞれのウイルスで感染させた細胞を１００μｇ／ｍｌ
のシクロヘキシミド存在下（＋と表記した列）でインキ
ュベート後６時間目に抽出した。後期ＲＮＡは感染後８
時間および２４時間目（それぞれ８および２４と記した
列）に抽出した。“Ｍ”と記した列はｐＢＲ−３２２の
Ｈｐａ II 断片の32Ｐ放射標識物より成り、図に示した
長さ（ｂｐ）である。転位（変異）した１１ｋＤａ調節
配列から開始するＲＮＡ転写物に対応するＳ１保護バン
ドの位置を図に示してある。
アーゼＳ１によるマッピングの概略を示す。予想される
バンドの長さ（３５０ｂｐ）を示した。下部はＲＶＶ−
６（ｐＨＧＳ−２／ＤＨＦＲ）、ＲＶＶ−７（ｐＨＧＳ
−Ａ／ＤＨＦＲ）およびＲＶＶ−８（ｐＨＧＳ−Ｆ／Ｄ
ＨＦＲ）に感染した細胞からのＲＮＡ転写物のヌクレア
ーゼＳ１マッピングのＸ線写真である。初期ＲＮＡはそ
れぞれのウイルスで感染させた細胞を１００μｇ／ｍｌ
のシクロヘキシミド存在下（＋と表記した列）でインキ
ュベート後６時間目に抽出した。後期ＲＮＡは感染後８
時間および２４時間目（それぞれ８および２４と記した
列）に抽出した。“Ｍ”と記した列はｐＢＲ−３２２の
Ｈｐａ II 断片の32Ｐ放射標識物より成り、図に示した
長さ（ｂｐ）である。転位（変異）した１１ｋＤａ調節
配列から開始するＲＮＡ転写物に対応するＳ１保護バン
ドの位置を図に示してある。
【００３２】一般的方法 以下の操作は別に記載しない限り、マニアティス（Mani
atis) ら（上述）に述べられているように行なった。３
７℃に於ける制限酵素消化（１００〜１０１頁）；３７
℃に於けるバクテリアアルカリフォスファターゼ（ＢＡ
Ｐ）による脱りん酸（１３３〜１３４頁）：１４℃での
Ｔ４ＤＮＡリガーゼによるライゲーション（３９０〜３
９１頁）；１００μｇ／ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ−
培地寒天プレート上でのE.coli ＨＢ１０１塩化カルシ
ュウム処理細胞へのＤＮＡ導入および形質転換株の選択
（２５０〜２５１頁）；ＤＮＡプラスミドの調製（８６
〜９４頁）；１４℃に於けるＤＮＡポリメラーゼＩの大
断片（クレナウ断片）による一本鎖ＤＮＡ部分の修復
（１１３〜１１４頁）；アガロースゲルからのＤＮＡの
分離および断片の精製（１６４〜１６７頁）；サブクロ
ーニングへの合成ＤＮＡリンカーの使用（３９２〜３９
７頁）；室温に於ける一本鎖ＤＮＡ部分のヌクレアーゼ
Ｓ１による除去（１４０頁）；動物細胞からのｍＲＮＡ
の単離（１９１〜１９３頁）；ｍＲＮＡのヌクレアーゼ
Ｓ１マッピング（２０７〜２０９頁）；マクサム−ギル
バート法によるＤＮＡ配列決定（４７５〜４７８頁）。
培養細胞：ウサギ腎（ＲＫ−１３）（クリストフィニス
（G.J.Christofinis) およびビール(A.J.Beale) ；ジエ
ーパス バクト（J.Path.Bact.) ９５巻、３７７〜３８
１頁〔１９６８年〕）；ネズミ肉腫ウイルスによりトラ
ンスフォームされたヒト骨髄肉腫細胞（ヒトＴＫ- １４
３細胞、寄託番号ＧＭ５８８７、ヒューマン ジエネテ
イク ミュータントセル レポジトリー（Human Geneti
c Mutant Cell Repository, Institute for Medical Re
search, Copewood St., Camber) 、Ｎ．Ｊ．０８１０
３，ＵＳＡ）。細胞の維持は５％ウシ胎児血清、１００
μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび１００ＩＵ／ｍ
ｌのペニシリン添加イーグル最少必須培地（Ｅ−ＭＥ
Ｍ）中、湿度８０％、５％ＣＯ2 下にて記載した温度で
行なった。
atis) ら（上述）に述べられているように行なった。３
７℃に於ける制限酵素消化（１００〜１０１頁）；３７
℃に於けるバクテリアアルカリフォスファターゼ（ＢＡ
Ｐ）による脱りん酸（１３３〜１３４頁）：１４℃での
Ｔ４ＤＮＡリガーゼによるライゲーション（３９０〜３
９１頁）；１００μｇ／ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ−
培地寒天プレート上でのE.coli ＨＢ１０１塩化カルシ
ュウム処理細胞へのＤＮＡ導入および形質転換株の選択
（２５０〜２５１頁）；ＤＮＡプラスミドの調製（８６
〜９４頁）；１４℃に於けるＤＮＡポリメラーゼＩの大
断片（クレナウ断片）による一本鎖ＤＮＡ部分の修復
（１１３〜１１４頁）；アガロースゲルからのＤＮＡの
分離および断片の精製（１６４〜１６７頁）；サブクロ
ーニングへの合成ＤＮＡリンカーの使用（３９２〜３９
７頁）；室温に於ける一本鎖ＤＮＡ部分のヌクレアーゼ
Ｓ１による除去（１４０頁）；動物細胞からのｍＲＮＡ
の単離（１９１〜１９３頁）；ｍＲＮＡのヌクレアーゼ
Ｓ１マッピング（２０７〜２０９頁）；マクサム−ギル
バート法によるＤＮＡ配列決定（４７５〜４７８頁）。
培養細胞：ウサギ腎（ＲＫ−１３）（クリストフィニス
（G.J.Christofinis) およびビール(A.J.Beale) ；ジエ
ーパス バクト（J.Path.Bact.) ９５巻、３７７〜３８
１頁〔１９６８年〕）；ネズミ肉腫ウイルスによりトラ
ンスフォームされたヒト骨髄肉腫細胞（ヒトＴＫ- １４
３細胞、寄託番号ＧＭ５８８７、ヒューマン ジエネテ
イク ミュータントセル レポジトリー（Human Geneti
c Mutant Cell Repository, Institute for Medical Re
search, Copewood St., Camber) 、Ｎ．Ｊ．０８１０
３，ＵＳＡ）。細胞の維持は５％ウシ胎児血清、１００
μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび１００ＩＵ／ｍ
ｌのペニシリン添加イーグル最少必須培地（Ｅ−ＭＥ
Ｍ）中、湿度８０％、５％ＣＯ2 下にて記載した温度で
行なった。
【００３３】実施例１１１ｋＤａ転写調節配列を保有する組換えワクシニアウ
イルスＲＶＶ−１の構築 Ａ．プラスミドｐＢＲ−ＪおよびｐＢＲ−Ｆ１の構築
（図１Ａおよび図１Ｂ） ワクシニアウイルス（ＶＶ）ＤＮＡ（ＷＲ株）１０μｇ
を１００単位の制限酵素Ｈｉｎｄ IIIで完全に消化す
る。ＶＶのチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子（ワイアー
（J.P.Weir) およびモス（B.Moss) 、ビロロジー（J.Vi
rology) ４６巻、５３０〜５３７頁〔１９８３年〕）を
含むＨｉｎｄ III Ｊ−断片（およそ５ｋｂ）およびＦ
−断片（およそ１４ｋｂ）をアガロースより分離する。
１μｇのプラスミドｐＢＲ−３２２ (サチフェ（J.G.Su
tcliffe)、“完全ヌクレオチド配列（Complete nucleot
ide sequence of the Escherichia coli plasmid ｐＢ
Ｒ−３２２）”、Cold Spring Harbor Symp. Quant Bio
l.、４３巻、７７〜９０頁〔１９７９年〕）を１単位の
制限酵素Ｈｉｎｄ IIIで完全に消化し、遊離末端を１単
位のバクテリアアルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）で
１時間脱りん酸する。
イルスＲＶＶ−１の構築 Ａ．プラスミドｐＢＲ−ＪおよびｐＢＲ−Ｆ１の構築
（図１Ａおよび図１Ｂ） ワクシニアウイルス（ＶＶ）ＤＮＡ（ＷＲ株）１０μｇ
を１００単位の制限酵素Ｈｉｎｄ IIIで完全に消化す
る。ＶＶのチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子（ワイアー
（J.P.Weir) およびモス（B.Moss) 、ビロロジー（J.Vi
rology) ４６巻、５３０〜５３７頁〔１９８３年〕）を
含むＨｉｎｄ III Ｊ−断片（およそ５ｋｂ）およびＦ
−断片（およそ１４ｋｂ）をアガロースより分離する。
１μｇのプラスミドｐＢＲ−３２２ (サチフェ（J.G.Su
tcliffe)、“完全ヌクレオチド配列（Complete nucleot
ide sequence of the Escherichia coli plasmid ｐＢ
Ｒ−３２２）”、Cold Spring Harbor Symp. Quant Bio
l.、４３巻、７７〜９０頁〔１９７９年〕）を１単位の
制限酵素Ｈｉｎｄ IIIで完全に消化し、遊離末端を１単
位のバクテリアアルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）で
１時間脱りん酸する。
【００３４】２０ｎｇのＨｉｎｄ III切断線状ｐＢＲ−
３２２と１００ｎｇのＨｉｎｄ IIIＪ−断片とＦ−断片
とそれぞれとを１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼで結合し、
E.coli ＨＢ１０１細胞に導入する。アンピシリン耐性
の形質転換株それぞれ４株を運び、１００μｇ／ｍｌの
アンピシリン含有ＬＢ−培地で生育させる。これらの培
養物よりＤＮＡを標準法により単離し、その大きさおよ
びＪ−断片の場合はＨｉｎｄ III、ＥｃｏＲＩおよびＫ
ｐｎＩの、又Ｆ−断片の場合はＨｉｎｄ III、ＳａｌＩ
およびＢｇｌＩの制限酵素切断部位の存在を分析する。
アガロースゲル電気泳動後、予想されるパターンを示し
たプラスミドをそれぞれｐＢＲ−ＪおよびｐＢＲ−Ｆと
命名した。
３２２と１００ｎｇのＨｉｎｄ IIIＪ−断片とＦ−断片
とそれぞれとを１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼで結合し、
E.coli ＨＢ１０１細胞に導入する。アンピシリン耐性
の形質転換株それぞれ４株を運び、１００μｇ／ｍｌの
アンピシリン含有ＬＢ−培地で生育させる。これらの培
養物よりＤＮＡを標準法により単離し、その大きさおよ
びＪ−断片の場合はＨｉｎｄ III、ＥｃｏＲＩおよびＫ
ｐｎＩの、又Ｆ−断片の場合はＨｉｎｄ III、ＳａｌＩ
およびＢｇｌＩの制限酵素切断部位の存在を分析する。
アガロースゲル電気泳動後、予想されるパターンを示し
たプラスミドをそれぞれｐＢＲ−ＪおよびｐＢＲ−Ｆと
命名した。
【００３５】プラスミドｐＢＲ−Ｆ１μｇを２単位の制
限酵素ＣｌａＩで完全に消し、ＤＮＡを０．８％アガロ
ースゲルにのせる。５．６ｋｂの断片（プラスミドｐＢ
Ｒ−３２２および１．２５ｋｂの挿入部分より成る）を
記載どおり単離した。このプラスミド５０ｎｇを１単位
のＴ４リガーゼを用いて再び環状化してＨＢ１０１に記
載どおりに導入する。アンピシリンに耐性な４個の形質
転換株を選び、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン含有Ｌ
Ｂ−培地に生育させる。これらの株からＤＮＡを常法に
より単離し、その大きさおよびＨｉｎｄ III、ＣｌａＩ
およびＥｃｏＲＩの制限酵素部位の存在を分析する。ア
ガロースゲルによる電気泳動後で予想されるパターンを
示した一つのプラスミドをｐＢＲ−Ｆ１と命名した。
限酵素ＣｌａＩで完全に消し、ＤＮＡを０．８％アガロ
ースゲルにのせる。５．６ｋｂの断片（プラスミドｐＢ
Ｒ−３２２および１．２５ｋｂの挿入部分より成る）を
記載どおり単離した。このプラスミド５０ｎｇを１単位
のＴ４リガーゼを用いて再び環状化してＨＢ１０１に記
載どおりに導入する。アンピシリンに耐性な４個の形質
転換株を選び、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン含有Ｌ
Ｂ−培地に生育させる。これらの株からＤＮＡを常法に
より単離し、その大きさおよびＨｉｎｄ III、ＣｌａＩ
およびＥｃｏＲＩの制限酵素部位の存在を分析する。ア
ガロースゲルによる電気泳動後で予想されるパターンを
示した一つのプラスミドをｐＢＲ−Ｆ１と命名した。
【００３６】Ｂ．プラスミドｐＵＣ−ＴＫの構築（図
２） ２μｇのプラスミドｐＢＲ−Ｊを５単位の制限酵素Ｈｐ
ａ II で完全消化し、一本鎖ＤＮＡ末端を４単位のＤＮ
ＡポリメラーゼＩ大断片（クレナウ断片）で修復する。
続いてそのＤＮＡを５単位の制限酵素Ｈｉｎｄ IIIで完
全消化し、ＤＮＡを０．８アガロースゲルで分離し、１
３１０ｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲルから単離す
る。２μｇのプラスミドｐＵＣ−８（ビエラ（J.Vierr
a) およびメッシング（J.Messing)、“ｐＵＣプラスミ
ド（The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for
insertion mutagenesis and sequencing with sytheti
c universal primers)" 、ジーン（Gene) １９巻、２５
９〜２６８頁〔１９８２年〕）を５単位の制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩで完全消化し、一本鎖ＤＮＡ末端をＳ１緩衝液中
２単位のヌクレアーゼＳ１で室温１時間処理して除去す
る。
２） ２μｇのプラスミドｐＢＲ−Ｊを５単位の制限酵素Ｈｐ
ａ II で完全消化し、一本鎖ＤＮＡ末端を４単位のＤＮ
ＡポリメラーゼＩ大断片（クレナウ断片）で修復する。
続いてそのＤＮＡを５単位の制限酵素Ｈｉｎｄ IIIで完
全消化し、ＤＮＡを０．８アガロースゲルで分離し、１
３１０ｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲルから単離す
る。２μｇのプラスミドｐＵＣ−８（ビエラ（J.Vierr
a) およびメッシング（J.Messing)、“ｐＵＣプラスミ
ド（The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for
insertion mutagenesis and sequencing with sytheti
c universal primers)" 、ジーン（Gene) １９巻、２５
９〜２６８頁〔１９８２年〕）を５単位の制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩで完全消化し、一本鎖ＤＮＡ末端をＳ１緩衝液中
２単位のヌクレアーゼＳ１で室温１時間処理して除去す
る。
【００３７】続いてこのＤＮＡを５単位の制限酵素Ｈｉ
ｎｄ IIIで完全消化し、遊離末端を２単位のＢＡＰで１
時間脱りん酸化し、ＤＮＡを０．８％アガロースゲルで
分離し、２．７ｋｂの断片を前述の如くアガロースゲル
より単離する。５０ｎｇのこのｐＵＣ−８断片を２００
ｎｇの精製１３１０ｂｐＶＶ断片と１単位のＴ４ＤＮＡ
リガーゼを用いて環状化し、環状ＤＮＡをＨＢ１０１に
導入する。アンピシリンに耐性な８個の形質転換株を選
択し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ−培
地で培養する。これらの株よりＤＮＡを常法に従って単
離し、その大きさおよび制限酵素Ｈｉｎｄ III、Ｅｃｏ
ＲＩおよびＸｂａＩ切断部位の存在を分析した。アガロ
ースゲル電気泳動で予想されるパターンを示した一つの
プラスミドをｐＵＣ−ＴＫと命名した。
ｎｄ IIIで完全消化し、遊離末端を２単位のＢＡＰで１
時間脱りん酸化し、ＤＮＡを０．８％アガロースゲルで
分離し、２．７ｋｂの断片を前述の如くアガロースゲル
より単離する。５０ｎｇのこのｐＵＣ−８断片を２００
ｎｇの精製１３１０ｂｐＶＶ断片と１単位のＴ４ＤＮＡ
リガーゼを用いて環状化し、環状ＤＮＡをＨＢ１０１に
導入する。アンピシリンに耐性な８個の形質転換株を選
択し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ−培
地で培養する。これらの株よりＤＮＡを常法に従って単
離し、その大きさおよび制限酵素Ｈｉｎｄ III、Ｅｃｏ
ＲＩおよびＸｂａＩ切断部位の存在を分析した。アガロ
ースゲル電気泳動で予想されるパターンを示した一つの
プラスミドをｐＵＣ−ＴＫと命名した。
【００３８】Ｃ．プラスミドｐＵＣ−ＴＫ／１１ｋＤａ
の構築（図３） ５０μｇのプラスミドｐＢＲ−Ｆ１を制限酵素ＥｃｏＲ
ＩおよびＸｂａＩのそれぞれ２００単位で完全消化し、
１．２％アガロースゲルでＤＮＡを分離する。１０４ｂ
ｐのＤＮＡ断片を単離し、一本鎖ＤＮＡ末端を４単位の
クレナウ断片で修復し、合成ＥｃｏＲＩリンカー（ＣＧ
ＡＡＴＴＣＧ）をつける。ＥｃｏＲＩリンカーをつけた
この新しいＤＮＡ断片（１１０ｂｐ）はＶＶの１１ｋＤ
ａ転写調節配列より成る。１０μｇのプラスミドｐＵＣ
−ＴＫを５単位の制限酵素ＥｃｏＲＩで完全消化し、遊
離末端を２単位のＢＡＰで脱りん酸化した後、ＤＮＡを
０．８％アガロースゲルで分離し、４ｋｂの線状ＤＮＡ
断片を単離抽出する。
の構築（図３） ５０μｇのプラスミドｐＢＲ−Ｆ１を制限酵素ＥｃｏＲ
ＩおよびＸｂａＩのそれぞれ２００単位で完全消化し、
１．２％アガロースゲルでＤＮＡを分離する。１０４ｂ
ｐのＤＮＡ断片を単離し、一本鎖ＤＮＡ末端を４単位の
クレナウ断片で修復し、合成ＥｃｏＲＩリンカー（ＣＧ
ＡＡＴＴＣＧ）をつける。ＥｃｏＲＩリンカーをつけた
この新しいＤＮＡ断片（１１０ｂｐ）はＶＶの１１ｋＤ
ａ転写調節配列より成る。１０μｇのプラスミドｐＵＣ
−ＴＫを５単位の制限酵素ＥｃｏＲＩで完全消化し、遊
離末端を２単位のＢＡＰで脱りん酸化した後、ＤＮＡを
０．８％アガロースゲルで分離し、４ｋｂの線状ＤＮＡ
断片を単離抽出する。
【００３９】５０ｎｇのＥｃｏＲＩで線状化したｐＵＣ
−ＴＫベクターを１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて
１０ｎｇの１００ｂｐプロモーター断片と結合し、ＨＢ
１０１に導入する。アンピシリンに耐性な８個の形質転
換株を選択し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン含有Ｌ
Ｂ−培地で培養する。これらの株からＤＮＡを単離し、
その大きさおよびＥｃｏＲＩおよびＨｐｈＩ制限酵素部
位の存在を分析した。６％アクリルアミドゲル上での電
気泳動で予想されるパターンを示した一つのプラスミド
をｐＵＣ−ＴＫ／１１ｋＤａと命名した。
−ＴＫベクターを１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて
１０ｎｇの１００ｂｐプロモーター断片と結合し、ＨＢ
１０１に導入する。アンピシリンに耐性な８個の形質転
換株を選択し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン含有Ｌ
Ｂ−培地で培養する。これらの株からＤＮＡを単離し、
その大きさおよびＥｃｏＲＩおよびＨｐｈＩ制限酵素部
位の存在を分析した。６％アクリルアミドゲル上での電
気泳動で予想されるパターンを示した一つのプラスミド
をｐＵＣ−ＴＫ／１１ｋＤａと命名した。
【００４０】Ｄ．プラスミドｐＨＧＳ−１の構築（図
４） １０μｇのｐＵＣ−ＴＫ／１１ｋＤａを１単位の制限酵
素ＥｃｏＲＩ ３７℃３０分間の処理で部分消化（５％
まで）行ない、一本鎖ＤＮＡ末端を４単位のクレナウ断
片を用い、１４℃で修復する。ＤＮＡを０．８％アガロ
ースゲルで分離し、ｐＵＣ−ＴＫ／１１ｋＤａプラスミ
ド（４１０４ｂｐ）の線状型を単離した後、その１０ｎ
ｇを２単位のＴ４ＤＮＡリガーゼで環状化し、ＨＢ１０
１に導入する。アンピシリン耐性の形質転換株８株を選
択し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ−培地
中で生育させる。これらの培養物からＤＮＡを単離し、
その大きさおよび制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＸｍｎＩおよび
Ｈｉｎｄ III切断部位の存在を分析する。アガロースゲ
ルの電気泳動で予想されるパターンを示したプラスミド
を選択し、１４８ｂｐのＣｌａＩ−ＥｃｏＲＩ断片を塩
基配列決定した。第３頁（本和英１２頁）に記載する配
列を示し、ＥｃｏＲＩの切断部位を含むプラスミドをｐ
ＨＧＳ−１と命名した。
４） １０μｇのｐＵＣ−ＴＫ／１１ｋＤａを１単位の制限酵
素ＥｃｏＲＩ ３７℃３０分間の処理で部分消化（５％
まで）行ない、一本鎖ＤＮＡ末端を４単位のクレナウ断
片を用い、１４℃で修復する。ＤＮＡを０．８％アガロ
ースゲルで分離し、ｐＵＣ−ＴＫ／１１ｋＤａプラスミ
ド（４１０４ｂｐ）の線状型を単離した後、その１０ｎ
ｇを２単位のＴ４ＤＮＡリガーゼで環状化し、ＨＢ１０
１に導入する。アンピシリン耐性の形質転換株８株を選
択し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ−培地
中で生育させる。これらの培養物からＤＮＡを単離し、
その大きさおよび制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＸｍｎＩおよび
Ｈｉｎｄ III切断部位の存在を分析する。アガロースゲ
ルの電気泳動で予想されるパターンを示したプラスミド
を選択し、１４８ｂｐのＣｌａＩ−ＥｃｏＲＩ断片を塩
基配列決定した。第３頁（本和英１２頁）に記載する配
列を示し、ＥｃｏＲＩの切断部位を含むプラスミドをｐ
ＨＧＳ−１と命名した。
【００４１】Ｅ．組換えワクシニアウイルス（ＲＶＶ−
１）の構築 ３３℃に適応させたＲＫ−細胞に細胞当り０．１プラー
ク形成単位（ｐｆｕ）のワクシニアウイルス温度感受性
変異株ｔｓ７（ドリリエン（R.Drilien)およびスペナー
（D.Spehnar)、ビロロジー（Virology) １３１巻、３８
５〜３９３頁〔１９８３年〕）を感染させる。３３℃の
許容温度下２時間後、細胞をカルシウムりん酸ＤＮＡ沈
でん物で記載されるようにトランスフェクトする（ワイ
アー（J.P.Weir) ら、プロク ナショナルアカデミー
サイエンス（Proc. Natl. Acad.Sci.) ＵＳＡ７９巻１
２１０〜１２１４頁〔１９８２年〕）。ワクシニアウイ
ルスの１１ｋＤａの遺伝子の転写調節配列がＴＫ−遺伝
子の中に挿入して保有する適当な組換えプラスミド（ｐ
ＨＧＳ−１）２０ｎｇと共沈でんさせたワクシニア野生
株ＤＮＡ（ＷＲ株）を２×１０6 個の細胞当り６０ｎｇ
を用いた。３９．５℃で２日間インキュベートした後、
細胞を超音波処理で破壊し、ウイルス粒子中のＴＫ陰性
（ＴＫ- ）の数を１００μｇ／ｍｌの臭化デオキシウリ
ジン存在下ヒトＴＫ- １４３細胞で滴定して測定する。
１）の構築 ３３℃に適応させたＲＫ−細胞に細胞当り０．１プラー
ク形成単位（ｐｆｕ）のワクシニアウイルス温度感受性
変異株ｔｓ７（ドリリエン（R.Drilien)およびスペナー
（D.Spehnar)、ビロロジー（Virology) １３１巻、３８
５〜３９３頁〔１９８３年〕）を感染させる。３３℃の
許容温度下２時間後、細胞をカルシウムりん酸ＤＮＡ沈
でん物で記載されるようにトランスフェクトする（ワイ
アー（J.P.Weir) ら、プロク ナショナルアカデミー
サイエンス（Proc. Natl. Acad.Sci.) ＵＳＡ７９巻１
２１０〜１２１４頁〔１９８２年〕）。ワクシニアウイ
ルスの１１ｋＤａの遺伝子の転写調節配列がＴＫ−遺伝
子の中に挿入して保有する適当な組換えプラスミド（ｐ
ＨＧＳ−１）２０ｎｇと共沈でんさせたワクシニア野生
株ＤＮＡ（ＷＲ株）を２×１０6 個の細胞当り６０ｎｇ
を用いた。３９．５℃で２日間インキュベートした後、
細胞を超音波処理で破壊し、ウイルス粒子中のＴＫ陰性
（ＴＫ- ）の数を１００μｇ／ｍｌの臭化デオキシウリ
ジン存在下ヒトＴＫ- １４３細胞で滴定して測定する。
【００４２】野生型ＤＮＡと組換えプラスミドとでトラ
ンスフェクトした細胞中の方が野生株ＤＮＡのみでトラ
ンスフェクトした細胞の約２００倍ＴＫ- 表現型ウイル
スが増加していた。プラークをとり、ウイルスを再度３
０μｇ／ｍｌ臭化デオキシウリジン存在下でヒト−ＴＫ
- １４３−細胞で精製する。保存ウイルスを臭化デオキ
シウリジン非存在下でＲＫ−１３細胞で作製する。ＲＶ
Ｖ−１ウイルスをブロット−ハイブリダトゼーションに
よりＴＫ−遺伝子中に挿入された１１ｋＤａプロモータ
ーの存在をマーカーとして選択する（マケット（M.Mack
ett)ら、Proc.Natl. Acad. Sci. USA、７９巻７４１５
〜７４１９頁〔１９８２年〕）。
ンスフェクトした細胞中の方が野生株ＤＮＡのみでトラ
ンスフェクトした細胞の約２００倍ＴＫ- 表現型ウイル
スが増加していた。プラークをとり、ウイルスを再度３
０μｇ／ｍｌ臭化デオキシウリジン存在下でヒト−ＴＫ
- １４３−細胞で精製する。保存ウイルスを臭化デオキ
シウリジン非存在下でＲＫ−１３細胞で作製する。ＲＶ
Ｖ−１ウイルスをブロット−ハイブリダトゼーションに
よりＴＫ−遺伝子中に挿入された１１ｋＤａプロモータ
ーの存在をマーカーとして選択する（マケット（M.Mack
ett)ら、Proc.Natl. Acad. Sci. USA、７９巻７４１５
〜７４１９頁〔１９８２年〕）。
【００４３】Ｆ．クローニングおよびヌクレアーゼＳ１
プローブの作製 ａ．ＴＫ遺伝子に挿入した１１ｋＤａの転写調節配列の
転写物のためのヌクレアーゼＳ１プローブ（図５Ａ） プラスミドｐＨＧＳ−１の１０μｇを２単位の制限酵素
ＴａｑＩで部分消化する（１０％まで）。続いてＤＮＡ
を２０単位の制限酵素Ｈｉｎｄ IIIで完全消化し、アガ
ロースゲル上で分離した後、１１３５ｂｐのＤＮＡ断片
を単離する。この断片１００ｎｇを１単位のＴ４ＤＮＡ
リガーゼを用い、それぞれ１単位のＨｉｎｄ IIIとＣｌ
ａＩで完全消化したプラスミドｐＢＲ３２２ ２５ｎｇ
と結合し、ＨＢ１０１に導入する。アンピシリンに耐性
な８個の形質転換株を選択し、１００μｇ／ｍｌのアン
ピシリン含有ＬＢ−培地に生育させる。これらの株から
のＤＮＡを単離し、その大きさおよび制限酵素Ｈｉｎｄ
III、ＥｃｏＲＩおよびＣｌａＩ切断部位の存在の有無
を分析する。アガロースゲル上で予想されるパターンを
示すプラスミドを選び、次の方法でヌクレアーゼＳ１
ＤＮＡプローブ作製するのに用いる。１０μｇのプラス
ミドをそれぞれ２０単位のＣｌａＩおよびＨｉｎｄ III
で完全に消化し、遊離末端を１０単位のＢＡＰで脱りん
酸してから１．６ｋｂのＤＮＡ断片を単離し、その０．
１ｐｍｏｌを使用前に１単位のポリヌクレオチドキナー
ゼ（ＰＮＫ）および１ｐｍｏｌのγ−32Ｐ−デオキシア
デノシン三りん酸で標識する。続いてＤＮＡを１単位の
制限酵素ＲａＡＩで完全に消化する。
プローブの作製 ａ．ＴＫ遺伝子に挿入した１１ｋＤａの転写調節配列の
転写物のためのヌクレアーゼＳ１プローブ（図５Ａ） プラスミドｐＨＧＳ−１の１０μｇを２単位の制限酵素
ＴａｑＩで部分消化する（１０％まで）。続いてＤＮＡ
を２０単位の制限酵素Ｈｉｎｄ IIIで完全消化し、アガ
ロースゲル上で分離した後、１１３５ｂｐのＤＮＡ断片
を単離する。この断片１００ｎｇを１単位のＴ４ＤＮＡ
リガーゼを用い、それぞれ１単位のＨｉｎｄ IIIとＣｌ
ａＩで完全消化したプラスミドｐＢＲ３２２ ２５ｎｇ
と結合し、ＨＢ１０１に導入する。アンピシリンに耐性
な８個の形質転換株を選択し、１００μｇ／ｍｌのアン
ピシリン含有ＬＢ−培地に生育させる。これらの株から
のＤＮＡを単離し、その大きさおよび制限酵素Ｈｉｎｄ
III、ＥｃｏＲＩおよびＣｌａＩ切断部位の存在の有無
を分析する。アガロースゲル上で予想されるパターンを
示すプラスミドを選び、次の方法でヌクレアーゼＳ１
ＤＮＡプローブ作製するのに用いる。１０μｇのプラス
ミドをそれぞれ２０単位のＣｌａＩおよびＨｉｎｄ III
で完全に消化し、遊離末端を１０単位のＢＡＰで脱りん
酸してから１．６ｋｂのＤＮＡ断片を単離し、その０．
１ｐｍｏｌを使用前に１単位のポリヌクレオチドキナー
ゼ（ＰＮＫ）および１ｐｍｏｌのγ−32Ｐ−デオキシア
デノシン三りん酸で標識する。続いてＤＮＡを１単位の
制限酵素ＲａＡＩで完全に消化する。
【００４４】ｂ．ＴＫ転写物のためのヌクレアーゼＳ１
プローブ（図５Ｂ） プラスミドｐＵＣ−ＴＫ５μｇを制限酵素ＣｌａＩで完
全に消化し、遊離末端を５単位のＢＡＰで脱りん酸後、
ＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｄ IIIで完全消化する。ＤＮＡ
を０．８％の低温融解アガロース上で分離し、７３７ｂ
ｐのＤＮＡを断片を単離する。Ｓ１プローブをＰＮＫお
よびγ−32Ｐ−デオキシアデノシン三りん酸で常法で標
識する。
プローブ（図５Ｂ） プラスミドｐＵＣ−ＴＫ５μｇを制限酵素ＣｌａＩで完
全に消化し、遊離末端を５単位のＢＡＰで脱りん酸後、
ＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｄ IIIで完全消化する。ＤＮＡ
を０．８％の低温融解アガロース上で分離し、７３７ｂ
ｐのＤＮＡを断片を単離する。Ｓ１プローブをＰＮＫお
よびγ−32Ｐ−デオキシアデノシン三りん酸で常法で標
識する。
【００４５】Ｇ．ＲＮＡ転写物の５′Ｓ１マッピング ＲＫ−１３の集密単層細胞ペトリ皿（直径５ｃｍ）二枚
をそれぞれ細胞当り１０ｐｆｕの組換えＲＶＶ−１ウイ
ルスで感染し、それぞれ３時間および７時間後にＲＮＡ
を抽出する。ＲＮＡを１００μｌの０．２％ＳＤＳにけ
ん濁し、２等分してそれぞれＴＫ−遺伝子の32Ｐ−標識
Ｓ１プローブ２０，０００ｃｐｍおよび１１ｋＤａ転写
調節配列を添加し、１／１０容量のＮａＯＡｃおよび２
１／２容量のエタノールで沈でんさせる。ペレットを
５０μｌのＳ１ハイブリダイゼーション用緩衝液に再溶
解し、１００℃３分間加熱後１６時間４２℃でインキュ
ベートする。インキュベート後４５０μｌの１倍ヌクレ
アーゼＳ１緩衝液およびヌクレアーゼＳ１ ２５単位を
加える。消化は１時間後にＥＤＴＡ（最終濃度５０ｍ
Ｍ）およびＳＤＳ（最終濃度０．５％）で停止させる。
水酸化ナトリウムを終濃度０．２５Ｎとなるように添加
し、４５℃１時間後に反応液を３Ｍ酢酸でｐＨ７に中和
する。
をそれぞれ細胞当り１０ｐｆｕの組換えＲＶＶ−１ウイ
ルスで感染し、それぞれ３時間および７時間後にＲＮＡ
を抽出する。ＲＮＡを１００μｌの０．２％ＳＤＳにけ
ん濁し、２等分してそれぞれＴＫ−遺伝子の32Ｐ−標識
Ｓ１プローブ２０，０００ｃｐｍおよび１１ｋＤａ転写
調節配列を添加し、１／１０容量のＮａＯＡｃおよび２
１／２容量のエタノールで沈でんさせる。ペレットを
５０μｌのＳ１ハイブリダイゼーション用緩衝液に再溶
解し、１００℃３分間加熱後１６時間４２℃でインキュ
ベートする。インキュベート後４５０μｌの１倍ヌクレ
アーゼＳ１緩衝液およびヌクレアーゼＳ１ ２５単位を
加える。消化は１時間後にＥＤＴＡ（最終濃度５０ｍ
Ｍ）およびＳＤＳ（最終濃度０．５％）で停止させる。
水酸化ナトリウムを終濃度０．２５Ｎとなるように添加
し、４５℃１時間後に反応液を３Ｍ酢酸でｐＨ７に中和
する。
【００４６】残留するＤＮＡを５μｇのｔＲＮＡを担体
として用いて沈でんさせ、８０％エタノールで洗滌後、
２０μｌのフォルムアミド緩衝液に溶解し、８％アクリ
ルアミド−８Ｍ尿素配列決定ゲルにのせる。ゲルはコダ
ツク社製Ｘ線フィルムを用いて２４時間強化スクリーン
で感光する。Ｘ線写真を図６に示す。感染後３時間目で
はＴＫプロモーターからの転写物のみ検出される（スロ
ット１）が、感染後７時間目では挿入した１１ｋＤａプ
ロモーターから開始したＳ１保護バンド（２６０ｂｐ）
が強く検出され、ＴＫ転写物は微量にしか検出できな
い。従って、挿入した１１ｋＤａ調節配列は感染後期に
作用すると結論できる。
として用いて沈でんさせ、８０％エタノールで洗滌後、
２０μｌのフォルムアミド緩衝液に溶解し、８％アクリ
ルアミド−８Ｍ尿素配列決定ゲルにのせる。ゲルはコダ
ツク社製Ｘ線フィルムを用いて２４時間強化スクリーン
で感光する。Ｘ線写真を図６に示す。感染後３時間目で
はＴＫプロモーターからの転写物のみ検出される（スロ
ット１）が、感染後７時間目では挿入した１１ｋＤａプ
ロモーターから開始したＳ１保護バンド（２６０ｂｐ）
が強く検出され、ＴＫ転写物は微量にしか検出できな
い。従って、挿入した１１ｋＤａ調節配列は感染後期に
作用すると結論できる。
【００４７】実施例２ワクシニアウイルスの１１ｋＤａ転写調節配列のサブユ
ニットを保有する組換えワクシニアウイルスＲＶＶ−２
およびＲＶＶ−３の構築 Ａ．プラスミドｐＨＧＳ−２およびｐＨＧＳ−２△１５
の構築 プラスミドｐＨＧＳ−１ ３μｇを１０単位の制限酵素
ＥｃｏＲＩで完全に消化し、デオキシチミジン三りん酸
を終濃度１００μＭを含有するＴ４ポリメラーゼ緩衝液
（マニアティス（Maniatis) ら、上述）中でＤＮＡを１
単位のＴ４ＤＮＡポリメラーゼと３７℃でインキュベー
トする。３０分後に６５℃１０分に加熱して反応を停止
する。反応液をヌクレアーゼＳ１緩衝液で１０倍に希釈
し、一本鎖ＤＮＡ末端を２単位のヌクレアーゼＳ１で１
時間処理して除去する。合成ＢａｍＨＩリンカー（5'-A
AAGGATCCTTT-3') をＤＮＡの平滑末端に結合し、１００
ｎｇのＤＮＡを１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼにて自己結
合させた後１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩを用いて１時
間消化し、ＨＢ１０１に導入する。アンピシリン耐性の
８０個の形質転換株を選択し、１００μｇ／ｍｌのアン
ピシリン含有ＬＢ−培地中で培養する。
ニットを保有する組換えワクシニアウイルスＲＶＶ−２
およびＲＶＶ−３の構築 Ａ．プラスミドｐＨＧＳ−２およびｐＨＧＳ−２△１５
の構築 プラスミドｐＨＧＳ−１ ３μｇを１０単位の制限酵素
ＥｃｏＲＩで完全に消化し、デオキシチミジン三りん酸
を終濃度１００μＭを含有するＴ４ポリメラーゼ緩衝液
（マニアティス（Maniatis) ら、上述）中でＤＮＡを１
単位のＴ４ＤＮＡポリメラーゼと３７℃でインキュベー
トする。３０分後に６５℃１０分に加熱して反応を停止
する。反応液をヌクレアーゼＳ１緩衝液で１０倍に希釈
し、一本鎖ＤＮＡ末端を２単位のヌクレアーゼＳ１で１
時間処理して除去する。合成ＢａｍＨＩリンカー（5'-A
AAGGATCCTTT-3') をＤＮＡの平滑末端に結合し、１００
ｎｇのＤＮＡを１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼにて自己結
合させた後１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩを用いて１時
間消化し、ＨＢ１０１に導入する。アンピシリン耐性の
８０個の形質転換株を選択し、１００μｇ／ｍｌのアン
ピシリン含有ＬＢ−培地中で培養する。
【００４８】これらの株からＤＮＡを単離し、その大き
さおよび制限酵素ＢａｍＨＩの切断部位の有無を分析す
る。制限酵素ＢａｍＨＩ切断部位を有するＤＮＡを選
び、それぞれのＤＮＡ２０μｇをそれぞれ５０単位のＢ
ａｍＨＩおよびＣｌａＩで完全に消化する。ＤＮＡをア
クリルアミドゲルで分離し、それぞれ１５６および１４
１ｂｐのＤＮＡ断片を単離して各断片を１単位のクレナ
ウ断片およびα−32Ｐ−テオキシグアニジン三りん酸を
用いてＢａｍＩ部位で標識してマキサムーギルバート法
で配列決定を行なった。
さおよび制限酵素ＢａｍＨＩの切断部位の有無を分析す
る。制限酵素ＢａｍＨＩ切断部位を有するＤＮＡを選
び、それぞれのＤＮＡ２０μｇをそれぞれ５０単位のＢ
ａｍＨＩおよびＣｌａＩで完全に消化する。ＤＮＡをア
クリルアミドゲルで分離し、それぞれ１５６および１４
１ｂｐのＤＮＡ断片を単離して各断片を１単位のクレナ
ウ断片およびα−32Ｐ−テオキシグアニジン三りん酸を
用いてＢａｍＩ部位で標識してマキサムーギルバート法
で配列決定を行なった。
【００４９】５′−ＡＡＡＧＧＡＴＣＣ−３′（Ｂａｍ
ＨＩリンカーを示す）の配列の前に次のような配列を有
するＤＮＡを選択した。
ＨＩリンカーを示す）の配列の前に次のような配列を有
するＤＮＡを選択した。
【化６】
【化７】
【００５０】Ｎｏ．１およびＮｏ．２の配列を有するＤ
ＮＡ５μｇをそれぞれ１０単位の制限酵素ＢａｍＨＩお
よびＨｉｎｄ IIIを用いて完全に消化する。ＤＮＡをア
ガロースゲルで分離し、それぞれ８８８および８７３ｂ
ｐのＤＮＡ断片を単離する。各１００ｎｇを１単位のＴ
４ＤＮＡリガーゼを用い、それぞれ５０−モル過剰の合
成ＤＮＡ断片５′−ＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧ−３′および
５′−ＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧ−３′と結合する。続いて
ＤＮＡを３００単位の制限酵素ＥｃｏＲＩで８時間消化
し、６％アクリルアミドゲルにかけてそれぞれ８９８お
よび８８３ｂｐの断片を単離する。
ＮＡ５μｇをそれぞれ１０単位の制限酵素ＢａｍＨＩお
よびＨｉｎｄ IIIを用いて完全に消化する。ＤＮＡをア
ガロースゲルで分離し、それぞれ８８８および８７３ｂ
ｐのＤＮＡ断片を単離する。各１００ｎｇを１単位のＴ
４ＤＮＡリガーゼを用い、それぞれ５０−モル過剰の合
成ＤＮＡ断片５′−ＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧ−３′および
５′−ＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧ−３′と結合する。続いて
ＤＮＡを３００単位の制限酵素ＥｃｏＲＩで８時間消化
し、６％アクリルアミドゲルにかけてそれぞれ８９８お
よび８８３ｂｐの断片を単離する。
【００５１】２μｇのプラスミドｐＨＧＳ−１をそれぞ
れ５単位の制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄ IIIで完
全消化し、ＤＮＡをアガロースゲルで分離して３．２ｋ
ｂの断片を単離する。この３．２ｋｂの断片２５ｎｇを
５０ｎｇの８９８および８８３ｂｐ断片を１単位のＴ４
ＤＮＡリガーゼを用いてそれぞれ結合し、ＤＮＡをＨＢ
１０１に導入する。各々アンピシリン耐性形質転換株４
株を選択し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ
−培地で培養する。これらの株からＤＮＡを単離し、そ
の大きさおよび制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＳｍａＩおよびＢ
ａｍＨＩの切断部位の有無を分析する。各々アガロース
ゲル電気泳動後、予想するパターンを示すプラスミドを
それぞれｐＨＧＳ−２（Ｎｏ．１配列を含むもの）およ
びｐＨＧＳ−２△１５（Ｎｏ．２）と命名した。
れ５単位の制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄ IIIで完
全消化し、ＤＮＡをアガロースゲルで分離して３．２ｋ
ｂの断片を単離する。この３．２ｋｂの断片２５ｎｇを
５０ｎｇの８９８および８８３ｂｐ断片を１単位のＴ４
ＤＮＡリガーゼを用いてそれぞれ結合し、ＤＮＡをＨＢ
１０１に導入する。各々アンピシリン耐性形質転換株４
株を選択し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ
−培地で培養する。これらの株からＤＮＡを単離し、そ
の大きさおよび制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＳｍａＩおよびＢ
ａｍＨＩの切断部位の有無を分析する。各々アガロース
ゲル電気泳動後、予想するパターンを示すプラスミドを
それぞれｐＨＧＳ−２（Ｎｏ．１配列を含むもの）およ
びｐＨＧＳ−２△１５（Ｎｏ．２）と命名した。
【００５２】Ｂ．組換えウイルスＲＶＶ−２およびＲＶ
Ｖ−３の構築 組換えウイルスＲＶＶ−２およびＲＶＶ−３をそれぞれ
プラスミドｐＨＧＳ−２およびｐＨＧＳ−２△１５を用
いて前述のように構築する。それぞれ一個のウイルスに
ついて変異した１１ｋＤａ転写調節配列（それぞれＮ
ｏ．１およびＮｏ．２）がＴＫ−遺伝子中に挿入した状
態で存在することをブロット−ハイブリダイゼーション
（マケット（Mackett)ら、上述）により確認した。
Ｖ−３の構築 組換えウイルスＲＶＶ−２およびＲＶＶ−３をそれぞれ
プラスミドｐＨＧＳ−２およびｐＨＧＳ−２△１５を用
いて前述のように構築する。それぞれ一個のウイルスに
ついて変異した１１ｋＤａ転写調節配列（それぞれＮ
ｏ．１およびＮｏ．２）がＴＫ−遺伝子中に挿入した状
態で存在することをブロット−ハイブリダイゼーション
（マケット（Mackett)ら、上述）により確認した。
【００５３】Ｃ．ヌクレアーゼＳ１プローブのクローニ
ング ＴＫ−遺伝子に挿入した転写調節配列Ｎｏ．１およびＮ
ｏ．２の転写物のためのヌクレアーゼＳ１プローブの調
製はそれぞれプラスミドｐＨＧＳ−２およびｐＨＧＳ−
２△１５を用い、実施例１のＦ，ａに記載したとおりに
行なった。 Ｄ．ＲＮＡ転写物の５′Ｓ１マッピング ウイルス感染後それぞれ４時間目および８時間目のＲＮ
Ａ転写物はそれぞれウイルスＲＶＶ−２およびＲＶＶ−
３、およびそれぞれの１１ｋＤａ転写調節配列（それぞ
れＮｏ．１およびＮｏ．２配列含有）のＴＫプロモータ
ーからのＲＮＡ転写物のＳ１プローブを用い、前述のと
おり調製する。
ング ＴＫ−遺伝子に挿入した転写調節配列Ｎｏ．１およびＮ
ｏ．２の転写物のためのヌクレアーゼＳ１プローブの調
製はそれぞれプラスミドｐＨＧＳ−２およびｐＨＧＳ−
２△１５を用い、実施例１のＦ，ａに記載したとおりに
行なった。 Ｄ．ＲＮＡ転写物の５′Ｓ１マッピング ウイルス感染後それぞれ４時間目および８時間目のＲＮ
Ａ転写物はそれぞれウイルスＲＶＶ−２およびＲＶＶ−
３、およびそれぞれの１１ｋＤａ転写調節配列（それぞ
れＮｏ．１およびＮｏ．２配列含有）のＴＫプロモータ
ーからのＲＮＡ転写物のＳ１プローブを用い、前述のと
おり調製する。
【００５４】Ｘ線フィルムを図７に示す。感染後４時間
目では（スロット１および４）ＴＫプロモーターからの
転写物のみ検出される。これらの転写物は感染後８時間
目には検出できない。一方、ウイルスＲＶＶ−２（ｐＨ
ＧＳ−２挿入）が感染した細胞では強いＳ１保護バンド
が検出される。しかしＲＶＶ−３（ｐＨＧＳ−２△１５
挿入）ではＳ１保護バンドは見られない。この事は、Ａ
ＴＧから５′に１５ｂｐ削除すると変異転写調節配列か
ら開始する転写が不活化することを示している。
目では（スロット１および４）ＴＫプロモーターからの
転写物のみ検出される。これらの転写物は感染後８時間
目には検出できない。一方、ウイルスＲＶＶ−２（ｐＨ
ＧＳ−２挿入）が感染した細胞では強いＳ１保護バンド
が検出される。しかしＲＶＶ−３（ｐＨＧＳ−２△１５
挿入）ではＳ１保護バンドは見られない。この事は、Ａ
ＴＧから５′に１５ｂｐ削除すると変異転写調節配列か
ら開始する転写が不活化することを示している。
【００５５】実施例３メロゾイト５．１表面抗原をワクシニアウイルス１１ｋ
Ｄａ転写調節配列に作用できるように結合して含有して
いる組換えワクシニアウイルスＲＶＶ−４およびＲＶＶ
−５の構築 Ａ．プラスモジウム（Plasmodium falciparum)５．１抗
原のクローニング（図８） プラスモジウム（Plasmodium falciparum)のメロゾイト
５．１表面抗原（ホープ（I.A.Hope) ら、核酸研究（Nu
cleic Acids Research) 、１３巻，３６９〜３７９頁
〔１９８５年〕）を含むプラスモジウム（Plasumodium
falciparum) ｃＤＮＡ断片にＥｃｏＲＩリンカーを結合
したもの１００ｎｇと、制限酵素ＥｃｏＲＩで完全消化
し、遊離末端を１単位のＢＡＰで脱りん酸したプラスミ
ドｐＨＧＳ−２およびｐＨＧＳ−２△１５のそれぞれ５
０ｎｇとを１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合
し、得られるＤＮＡをＨＢ１０１に導入する。それぞれ
で４個のアンピシリン耐性形質転換株を選択し、それら
を１００μｇ／ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ−培地で培
養する。これらの株からＤＮＡを単離し、その大きさお
よび制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄ IIの部位の存
在を分析する。アガロースゲル電気泳動で予想されるパ
ターンを示すプラスミドをそれぞれｐＨＧＳ−２／５．
１およびｐＨＧＳ−２△１５／５．１と命名した。
Ｄａ転写調節配列に作用できるように結合して含有して
いる組換えワクシニアウイルスＲＶＶ−４およびＲＶＶ
−５の構築 Ａ．プラスモジウム（Plasmodium falciparum)５．１抗
原のクローニング（図８） プラスモジウム（Plasmodium falciparum)のメロゾイト
５．１表面抗原（ホープ（I.A.Hope) ら、核酸研究（Nu
cleic Acids Research) 、１３巻，３６９〜３７９頁
〔１９８５年〕）を含むプラスモジウム（Plasumodium
falciparum) ｃＤＮＡ断片にＥｃｏＲＩリンカーを結合
したもの１００ｎｇと、制限酵素ＥｃｏＲＩで完全消化
し、遊離末端を１単位のＢＡＰで脱りん酸したプラスミ
ドｐＨＧＳ−２およびｐＨＧＳ−２△１５のそれぞれ５
０ｎｇとを１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合
し、得られるＤＮＡをＨＢ１０１に導入する。それぞれ
で４個のアンピシリン耐性形質転換株を選択し、それら
を１００μｇ／ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ−培地で培
養する。これらの株からＤＮＡを単離し、その大きさお
よび制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄ IIの部位の存
在を分析する。アガロースゲル電気泳動で予想されるパ
ターンを示すプラスミドをそれぞれｐＨＧＳ−２／５．
１およびｐＨＧＳ−２△１５／５．１と命名した。
【００５６】Ｂ．組換えワクシニアウイルスＲＶＶ−４
およびＲＶＶ−５の構築 組換えウイルスＲＶＶ−４およびＲＶＶ−５はそれぞれ
プラスミドｐＨＧＳ−２／５．１およびｐＨＧＳ−２△
１５／５．１を用いて既に述べた通りに構築し、選択す
る。
およびＲＶＶ−５の構築 組換えウイルスＲＶＶ−４およびＲＶＶ−５はそれぞれ
プラスミドｐＨＧＳ−２／５．１およびｐＨＧＳ−２△
１５／５．１を用いて既に述べた通りに構築し、選択す
る。
【００５７】Ｃ．間接的免疫蛍光法 ＲＫ−１３細胞を８０％の集密度まで生育させ、マラリ
ア５．１抗原を相同組換えによりウイルスゲノムに安定
に組込んだ組換えワクシニアウイルスＲＶＶ−４或いは
ＲＶＶ−５を細胞当り０．１プラーク形成単位（ｐｆ
ｕ）で感染させる。感染１時間後に細胞をりん酸緩衝食
塩水（ＰＢＳ）で洗滌し、新しい培地を添加する。ウイ
ルス感染をさらに１６時間続ける。細胞を培養皿からか
き取り、２０００×ｇの遠心分離にて集めてＰＢＳで一
回洗滌する。およそ１０4 個の細胞をスライドグラスに
のせ、風乾後−２０℃のアセトンで１０分間固定し、風
乾する。固定した細胞をＰＢＳで希釈したウサギの抗
５．１抗原と３７℃２０分間インキュベートする。続い
てＰＢＳで３回洗滌し、再び風乾する。次に固定した細
胞をＰＢＳで希釈したヤギ抗ウサギＦ１ＴＣ血清と３７
℃と２０分インキュベートし、ＰＢＳで３回、蒸留水で
１回洗滌した後風乾する。細胞にＰＢＳ−グリセリン
（１：１）をのせ、カバーグラスで覆う。細胞を４５０
〜４９０ｎｍ顕微鏡下で蛍光を分析する。結果を図９に
示す。写真ａはウイルスＲＶＶ−４で感染した蛍光細胞
を示し、写真ｂは可視光線下の感染細胞を示す。ウイル
スＲＶＶ−５で感染した細胞は蛍光を示さず、１１ｋＤ
ａ−ＡＴＧの上流の欠失により調節配列が失活すること
を表わしている。しかしＡＴＧのＧ残基を除去しても転
写或いは翻訳に影響はない。
ア５．１抗原を相同組換えによりウイルスゲノムに安定
に組込んだ組換えワクシニアウイルスＲＶＶ−４或いは
ＲＶＶ−５を細胞当り０．１プラーク形成単位（ｐｆ
ｕ）で感染させる。感染１時間後に細胞をりん酸緩衝食
塩水（ＰＢＳ）で洗滌し、新しい培地を添加する。ウイ
ルス感染をさらに１６時間続ける。細胞を培養皿からか
き取り、２０００×ｇの遠心分離にて集めてＰＢＳで一
回洗滌する。およそ１０4 個の細胞をスライドグラスに
のせ、風乾後−２０℃のアセトンで１０分間固定し、風
乾する。固定した細胞をＰＢＳで希釈したウサギの抗
５．１抗原と３７℃２０分間インキュベートする。続い
てＰＢＳで３回洗滌し、再び風乾する。次に固定した細
胞をＰＢＳで希釈したヤギ抗ウサギＦ１ＴＣ血清と３７
℃と２０分インキュベートし、ＰＢＳで３回、蒸留水で
１回洗滌した後風乾する。細胞にＰＢＳ−グリセリン
（１：１）をのせ、カバーグラスで覆う。細胞を４５０
〜４９０ｎｍ顕微鏡下で蛍光を分析する。結果を図９に
示す。写真ａはウイルスＲＶＶ−４で感染した蛍光細胞
を示し、写真ｂは可視光線下の感染細胞を示す。ウイル
スＲＶＶ−５で感染した細胞は蛍光を示さず、１１ｋＤ
ａ−ＡＴＧの上流の欠失により調節配列が失活すること
を表わしている。しかしＡＴＧのＧ残基を除去しても転
写或いは翻訳に影響はない。
【００５８】実施例４マウスジヒドロ葉酸レダクターゼがワクシニアウイルス
の変異１１ｋＤａ転写調節配列に機能的に結合して含有
する組換えワクシニアウイルスＲＶＶ−６、ＲＶＶ−７
およびＲＶＶ−８の構築 Ａ．プラスミドｐＨＧＳ−２／ＤＨＦＲの構築（図１
０） プラスミドｐＨＧＳ−２ ２μｇを２単位の制限酵素Ｂ
ａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで完全に消化する。ＤＮＡを
０．８％アガロースゲルで分離しＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲ
Ｉベクター（〜４ｋｂ）を単離する。プラスミドｐＤＳ
−１、ｔｏ１+ （１９８４年１２月１１日付けでゲッチ
ンゲン ドイツチエサムルンク（Deutsche Sammlung Vo
n Mikroorganismen)（ＤＳＭ）にＤＳＭ−３１３５番と
して寄託されている）２μｇをそれぞれ２単位の制限酵
素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで完全消化し、マウスジ
ヒドロ葉酸、レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子を含むお
よそ９２０ｂｐの断片を単離する。ＢａｍＨＩおよびＥ
ｃｏＲＩで消化したｐＨＧＳ−２ ２０μｇとマウスジ
ヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を含むＢａｍＨＩ−Ｅｃ
ｏＲＩ断片１００μｇとを１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ
を用いて結合し、得られるＤＮＡをＨＢ１０１に導入す
る。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンに耐性な８個の形
質転換株を選び、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン含有
ＬＢ−培地で培養する。これらの菌からＤＮＡを単離
し、その大きさおよび制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ
およびＳａｃＩの部位の存在を分析する。予想されるパ
ターンを示す一つのプラスミドをｐＨＧＳ−２／ＤＨＦ
Ｒと命名した。
の変異１１ｋＤａ転写調節配列に機能的に結合して含有
する組換えワクシニアウイルスＲＶＶ−６、ＲＶＶ−７
およびＲＶＶ−８の構築 Ａ．プラスミドｐＨＧＳ−２／ＤＨＦＲの構築（図１
０） プラスミドｐＨＧＳ−２ ２μｇを２単位の制限酵素Ｂ
ａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで完全に消化する。ＤＮＡを
０．８％アガロースゲルで分離しＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲ
Ｉベクター（〜４ｋｂ）を単離する。プラスミドｐＤＳ
−１、ｔｏ１+ （１９８４年１２月１１日付けでゲッチ
ンゲン ドイツチエサムルンク（Deutsche Sammlung Vo
n Mikroorganismen)（ＤＳＭ）にＤＳＭ−３１３５番と
して寄託されている）２μｇをそれぞれ２単位の制限酵
素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで完全消化し、マウスジ
ヒドロ葉酸、レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子を含むお
よそ９２０ｂｐの断片を単離する。ＢａｍＨＩおよびＥ
ｃｏＲＩで消化したｐＨＧＳ−２ ２０μｇとマウスジ
ヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を含むＢａｍＨＩ−Ｅｃ
ｏＲＩ断片１００μｇとを１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ
を用いて結合し、得られるＤＮＡをＨＢ１０１に導入す
る。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンに耐性な８個の形
質転換株を選び、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン含有
ＬＢ−培地で培養する。これらの菌からＤＮＡを単離
し、その大きさおよび制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ
およびＳａｃＩの部位の存在を分析する。予想されるパ
ターンを示す一つのプラスミドをｐＨＧＳ−２／ＤＨＦ
Ｒと命名した。
【００５９】Ｂ．プラスミドｐＨＧＳ−２／ＤＨＦＲ−
Ｅの構築（図１１） ２μｇのプラスミドｐＨＧＳ−２を２単位の制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩで完全消化し、遊離末端を１単位のバクテリア
アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）で脱りん酸す
る。ＥｃｏＲＩ消化ベクターを低融点（ＬＭ）アガロー
スで単離する。２μｇのプラスミドｐＤＳ−１、ｔｏ１
+ を２単位の制限酵素ＥｃｏＲＩで完全消化し、マウス
ＤＨＦＲ遺伝子を含むおよそ９２０ｂｐの断片をＬＭア
ガロースから単離する。２０μｇのＥｃｏＲＩ消化ベク
ターｐＨＧＳ−２および１００μｇのＥｃｏＲＩ−断片
を１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼで結合し、ＤＮＡをＨＢ
１０１に導入する。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンに
耐性な８個の形成転換株を選び、１００μｇ／ｍｌのア
ンピシリン含有ＬＢ培地中で培養する。これらの株から
ＤＮＡを単離し、その大きさおよび制限酵素ＥｃｏＲＩ
およびＳａｃＩの切断部位の存在を分析する。アガロー
スゲル電気泳動で予想されるパターンを示す一つのプラ
スミドをｐＨＧＳ−２／ＤＨＦＲ−Ｅ（図１１）と命名
した。
Ｅの構築（図１１） ２μｇのプラスミドｐＨＧＳ−２を２単位の制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩで完全消化し、遊離末端を１単位のバクテリア
アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）で脱りん酸す
る。ＥｃｏＲＩ消化ベクターを低融点（ＬＭ）アガロー
スで単離する。２μｇのプラスミドｐＤＳ−１、ｔｏ１
+ を２単位の制限酵素ＥｃｏＲＩで完全消化し、マウス
ＤＨＦＲ遺伝子を含むおよそ９２０ｂｐの断片をＬＭア
ガロースから単離する。２０μｇのＥｃｏＲＩ消化ベク
ターｐＨＧＳ−２および１００μｇのＥｃｏＲＩ−断片
を１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼで結合し、ＤＮＡをＨＢ
１０１に導入する。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンに
耐性な８個の形成転換株を選び、１００μｇ／ｍｌのア
ンピシリン含有ＬＢ培地中で培養する。これらの株から
ＤＮＡを単離し、その大きさおよび制限酵素ＥｃｏＲＩ
およびＳａｃＩの切断部位の存在を分析する。アガロー
スゲル電気泳動で予想されるパターンを示す一つのプラ
スミドをｐＨＧＳ−２／ＤＨＦＲ−Ｅ（図１１）と命名
した。
【００６０】Ｃ．プラスミドｐＨＧＳ−Ａ／ＤＨＦＲの
構築（図１２） プラスミドｐＨＧＳ−２／ＤＨＦＲ−Ｅ１０μｇをそれ
ぞれ１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩで完
全消化し、およそ２７５ｂｐの断片を８％アクリルアミ
ドゲルより単離する。２７５ｂｐのＥｃｏＲＩ−Ｓａｃ
Ｉ断片をそれぞれ５０ｐｍｏｌの合成断片５′−ＴＡＴ
ＡＡＡＴＡ−３′および５′−ＡＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴ
Ａ−３′と５０ｍＭ ＮａＣｌ含有のリガーゼ緩衝液中
で１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合する。１４
℃２時間の反応の後、ＤＮＡを１単位の制限酵素Ｓａｃ
Ｉで完全消化し、上記合成配列を含有する２８３ｂｐの
断片を単離する。プラスミドｐＨＧＳ−２△１５ ２μ
ｇを４単位の制限酵素ＢａｍＨＩで完全消化し、５′の
一本鎖をE.coli ＤＮＡポリメラーゼＩの大断片（クレ
ナウ断片）で修復し、酵素を６５℃１０分間加熱して失
活させる。続いてＤＮＡを１単位のＣｌａＩで完全消化
し１５２ｂｐの断片を８％アクリルアミドゲルで単離す
る。
構築（図１２） プラスミドｐＨＧＳ−２／ＤＨＦＲ−Ｅ１０μｇをそれ
ぞれ１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩで完
全消化し、およそ２７５ｂｐの断片を８％アクリルアミ
ドゲルより単離する。２７５ｂｐのＥｃｏＲＩ−Ｓａｃ
Ｉ断片をそれぞれ５０ｐｍｏｌの合成断片５′−ＴＡＴ
ＡＡＡＴＡ−３′および５′−ＡＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴ
Ａ−３′と５０ｍＭ ＮａＣｌ含有のリガーゼ緩衝液中
で１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合する。１４
℃２時間の反応の後、ＤＮＡを１単位の制限酵素Ｓａｃ
Ｉで完全消化し、上記合成配列を含有する２８３ｂｐの
断片を単離する。プラスミドｐＨＧＳ−２△１５ ２μ
ｇを４単位の制限酵素ＢａｍＨＩで完全消化し、５′の
一本鎖をE.coli ＤＮＡポリメラーゼＩの大断片（クレ
ナウ断片）で修復し、酵素を６５℃１０分間加熱して失
活させる。続いてＤＮＡを１単位のＣｌａＩで完全消化
し１５２ｂｐの断片を８％アクリルアミドゲルで単離す
る。
【００６１】プラスミドｐＨＧＳ−２／ＤＨＦＲ ２μ
ｇをそれぞれ２単位の制限酵素ＣｌａＩおよびＳａｃＩ
で完全消化し、およそ４．６ｋｂのベクターをＬＭアガ
ロースで単離する。上述の合成断片を含むＥｃｏＲＩ−
ＳａｃＩ断片１００μｇと１１ｋＤａの転写調節配列の
一部を含むＣｌａＩ−ＢａｍＨＩ断片１００μｇとを１
単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて２０μｇのＣｌａＩ
−ＳａｃＩ消化ベクターｐＨＧＳ−２／ＤＨＦＲと結合
し、得られるＤＮＡをＨＢ１０１に導入する。アンピシ
リン耐性の１６個の形質転換株を選択し、１００μｇ／
ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ培地中で生育させる。これ
らの株よりＤＮＡを単離し、その大きさおよび制限酵素
ＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩの部位を分析する。アクリル
アミドゲル電気泳動後予想されるパターンを示した一つ
のプラスミドを配列決定した。プラスミドは次の配列を
有し、ｐＨＧＳ−Ａ／ＤＨＦＲと命名した。
ｇをそれぞれ２単位の制限酵素ＣｌａＩおよびＳａｃＩ
で完全消化し、およそ４．６ｋｂのベクターをＬＭアガ
ロースで単離する。上述の合成断片を含むＥｃｏＲＩ−
ＳａｃＩ断片１００μｇと１１ｋＤａの転写調節配列の
一部を含むＣｌａＩ−ＢａｍＨＩ断片１００μｇとを１
単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて２０μｇのＣｌａＩ
−ＳａｃＩ消化ベクターｐＨＧＳ−２／ＤＨＦＲと結合
し、得られるＤＮＡをＨＢ１０１に導入する。アンピシ
リン耐性の１６個の形質転換株を選択し、１００μｇ／
ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ培地中で生育させる。これ
らの株よりＤＮＡを単離し、その大きさおよび制限酵素
ＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩの部位を分析する。アクリル
アミドゲル電気泳動後予想されるパターンを示した一つ
のプラスミドを配列決定した。プラスミドは次の配列を
有し、ｐＨＧＳ−Ａ／ＤＨＦＲと命名した。
【化８】
【００６２】Ｄ．プラスミドｐＨＧＳ−Ｆ／ＤＨＦＲの
構築（図１３） プラスミドｐＨＧＳ−２／ＤＨＦＲ １０μｇをそれぞ
れ１０単位の制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩで完全
消化し、２６８ｂｐの断片を８％アクリルアミドゲルで
単離する。２００μｇのＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片を各
１ｐｍｏｌの合成ＤＮＡ断片５′−ＴＣＴＡＴＣＧＡＴ
ＴＡＡＡＴＡＡＡ−３′および５′−ＧＡＴＣＴＴＴＡ
ＴＴＴＡＡＴＣＧＡＴＡＧＡ−３′と、終濃度５０ｍＭ
のＮａＣｌ含有リガーゼ緩衝液中１単位のＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを用いて結合する。１４℃で２時間反応後、ＤＮ
Ａを１単位の制限酵素ＳａｃＩで消化し、上記配列を含
む２９０ｂｐの断片を単離する。プラスミドｐＨＧＳ−
２△１５ １０μｇをそれぞれ１０単位の制限酵素Ｃｌ
ａＩおよびＤｒａＩで完全消化し、１３０ｂｐの断片を
８％アクリルアミドゲルより単離する。
構築（図１３） プラスミドｐＨＧＳ−２／ＤＨＦＲ １０μｇをそれぞ
れ１０単位の制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩで完全
消化し、２６８ｂｐの断片を８％アクリルアミドゲルで
単離する。２００μｇのＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片を各
１ｐｍｏｌの合成ＤＮＡ断片５′−ＴＣＴＡＴＣＧＡＴ
ＴＡＡＡＴＡＡＡ−３′および５′−ＧＡＴＣＴＴＴＡ
ＴＴＴＡＡＴＣＧＡＴＡＧＡ−３′と、終濃度５０ｍＭ
のＮａＣｌ含有リガーゼ緩衝液中１単位のＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを用いて結合する。１４℃で２時間反応後、ＤＮ
Ａを１単位の制限酵素ＳａｃＩで消化し、上記配列を含
む２９０ｂｐの断片を単離する。プラスミドｐＨＧＳ−
２△１５ １０μｇをそれぞれ１０単位の制限酵素Ｃｌ
ａＩおよびＤｒａＩで完全消化し、１３０ｂｐの断片を
８％アクリルアミドゲルより単離する。
【００６３】上述の合成断片を含むＢａｍＨＩ−Ｓａｃ
Ｉ断片および１１ｋＤａ転写調節配列を含むＣｌａＩ−
ＤｒａＩ断片それぞれ１００μｇを１単位のＴ４ＤＮＡ
リガーゼを用いてＣｌａＩ−ＳａｃＩ消化ベクターｐＨ
ＧＳ−２／ＤＨＦＲ５０μｇと結合し、ＤＮＡをＨＢ１
０１へ導入する。アンピシリン耐性の１６個の形質転換
株を選び、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ−
培地で培養する。これらの菌よりＤＮＡを単離し、その
大きさおよび制限酵素ＳａｃＩおよびＣｌａＩの部位の
存在を分析する。アクリルアミドゲルの電気泳動で予想
するパターンを示す一つのプラスミドを配列決定し、Ｈ
ＧＳ−Ｆ／ＤＨＦＲと命名した。以下の配列を含有す
る。
Ｉ断片および１１ｋＤａ転写調節配列を含むＣｌａＩ−
ＤｒａＩ断片それぞれ１００μｇを１単位のＴ４ＤＮＡ
リガーゼを用いてＣｌａＩ−ＳａｃＩ消化ベクターｐＨ
ＧＳ−２／ＤＨＦＲ５０μｇと結合し、ＤＮＡをＨＢ１
０１へ導入する。アンピシリン耐性の１６個の形質転換
株を選び、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ−
培地で培養する。これらの菌よりＤＮＡを単離し、その
大きさおよび制限酵素ＳａｃＩおよびＣｌａＩの部位の
存在を分析する。アクリルアミドゲルの電気泳動で予想
するパターンを示す一つのプラスミドを配列決定し、Ｈ
ＧＳ−Ｆ／ＤＨＦＲと命名した。以下の配列を含有す
る。
【化９】
【００６４】Ｅ．組換えウイルスＲＶＶ−６、ＲＶＶ−
７およびＲＶＶ−８の構築 組換えウイルスＲＶＶ−６、ＲＶＶ−７およびＲＶＶ−
８を前述のとおり、それぞれのプラスミドｐＨＧＳ−２
／ＤＨＦＲ、ｐＨＧＳ−Ａ／ＤＨＦＲおよびｐＨＧＳ−
Ｆ／ＤＨＦＲを用いて構築する。それぞれより一つのウ
イルスを選び、変異１１ｋＤａ転写調節配列（それぞれ
Ｎｏ．１、Ｎｏ．３およびＮｏ．４）およびＶＶＴＫ−
遺伝子に挿入されたＤＨＦＲ遺伝子より成るキメラ遺伝
子の存在をプロット−ハイブダイゼーション（Mackett
ら、前述）により確認した。
７およびＲＶＶ−８の構築 組換えウイルスＲＶＶ−６、ＲＶＶ−７およびＲＶＶ−
８を前述のとおり、それぞれのプラスミドｐＨＧＳ−２
／ＤＨＦＲ、ｐＨＧＳ−Ａ／ＤＨＦＲおよびｐＨＧＳ−
Ｆ／ＤＨＦＲを用いて構築する。それぞれより一つのウ
イルスを選び、変異１１ｋＤａ転写調節配列（それぞれ
Ｎｏ．１、Ｎｏ．３およびＮｏ．４）およびＶＶＴＫ−
遺伝子に挿入されたＤＨＦＲ遺伝子より成るキメラ遺伝
子の存在をプロット−ハイブダイゼーション（Mackett
ら、前述）により確認した。
【００６５】Ｆ．ヌクレアーゼＳ１プローブの調製 プラスミドｐＨＧＳ−２／ＤＨＦＲ、ｐＨＧＳ−Ａ／Ｄ
ＨＦＲおよびｐＨＧＳ−Ｆ／ＤＨＦＲのそれぞれ１０μ
ｇを１０単位の制限酵素ＡｃｃＩで完全に消化し、遊離
末端を１単位のＢＡＰを用いて脱りん酸してから酵素を
フェノール、フェノール−クロロホルム（１：１、ｖ／
ｖ）およびクロロホルムで抽出して除去する。ＤＮＡを
沈でん化し、遊離末端を２倍モル量過剰の32Ｐ−γ−Ａ
ＴＰ存在下でポリヌクレオチドキナーゼを用いてりん酸
化する。酵素を６５℃１０分処理して失活させ、ＤＮＡ
を５単位の制限酵素Ｈｉｎｄ IIIで完全消化する。およ
そ１２００ｂｐの断片をＬＭアガロースより単離し、Ａ
ｃｃＩ部位が対称に標識されたＳ１プローブとする。
ＨＦＲおよびｐＨＧＳ−Ｆ／ＤＨＦＲのそれぞれ１０μ
ｇを１０単位の制限酵素ＡｃｃＩで完全に消化し、遊離
末端を１単位のＢＡＰを用いて脱りん酸してから酵素を
フェノール、フェノール−クロロホルム（１：１、ｖ／
ｖ）およびクロロホルムで抽出して除去する。ＤＮＡを
沈でん化し、遊離末端を２倍モル量過剰の32Ｐ−γ−Ａ
ＴＰ存在下でポリヌクレオチドキナーゼを用いてりん酸
化する。酵素を６５℃１０分処理して失活させ、ＤＮＡ
を５単位の制限酵素Ｈｉｎｄ IIIで完全消化する。およ
そ１２００ｂｐの断片をＬＭアガロースより単離し、Ａ
ｃｃＩ部位が対称に標識されたＳ１プローブとする。
【００６６】Ｇ．ＲＮＡ転写物の５′Ｓ１マッピング ＲＫ−１３単層細胞に細胞当り５ｐｆｕの組換えウイル
スＲＶＶ−６、ＲＶＶ−７およびＲＶＶ−８をそれぞれ
感染させる。１００μｇ／ｍｌのシクロヘキシミド（シ
グマ社製）を含有する培地中で、培養した感染後６時間
目の細胞より初期ＲＮＡを調製する。後期ＲＮＡは感染
後８時間および２４時間目のウイルス感染細胞より単位
する。Ｓ１マッピングは上記Ｆ項記載のとおり調製した
ＤＨＦＲ転写物に対する標識Ｓ１プローブを用い、実施
例１、Ｇ項に記載したとおりに行なう。Ｘ線写真を図１
４に示す。ＤＨＦＲ転写物はシクロヘキシド存在下で培
養した感染細胞から調製のＲＮＡには検出されない。こ
れは１１ｋＤａ調節配列Ｎｏ．１、３および４は転写の
初期には活性がないことを示す（図１４＋と表示の
列）。
スＲＶＶ−６、ＲＶＶ−７およびＲＶＶ−８をそれぞれ
感染させる。１００μｇ／ｍｌのシクロヘキシミド（シ
グマ社製）を含有する培地中で、培養した感染後６時間
目の細胞より初期ＲＮＡを調製する。後期ＲＮＡは感染
後８時間および２４時間目のウイルス感染細胞より単位
する。Ｓ１マッピングは上記Ｆ項記載のとおり調製した
ＤＨＦＲ転写物に対する標識Ｓ１プローブを用い、実施
例１、Ｇ項に記載したとおりに行なう。Ｘ線写真を図１
４に示す。ＤＨＦＲ転写物はシクロヘキシド存在下で培
養した感染細胞から調製のＲＮＡには検出されない。こ
れは１１ｋＤａ調節配列Ｎｏ．１、３および４は転写の
初期には活性がないことを示す（図１４＋と表示の
列）。
【００６７】それぞれＲＶＶ−６、ＲＶＶ−７およびＲ
ＶＶ−８のウイルスを感染した細胞で感染後８および２
４時間目ではＤＨＦＲ転写物（矢印で示す）は検出され
る（図１４、それぞれ８および２４と示している）。ｐ
ＨＧＳ−Ａ／ＤＨＦＲおよびｐＨＧＳ−Ｆ／ＤＨＦＲそ
れぞれの挿入ベクターに存在する変異１１ｋＤａ調節配
列由来のＤＨＦＲ転写物の量は挿入ベクターｐＨＧＳ−
２／ＤＨＦＲに存在する１１ｋＤａ調節配列Ｎｏ．１に
由来するＤＨＦＲ転写物と比較して少なくとも３〜４倍
増加している。
ＶＶ−８のウイルスを感染した細胞で感染後８および２
４時間目ではＤＨＦＲ転写物（矢印で示す）は検出され
る（図１４、それぞれ８および２４と示している）。ｐ
ＨＧＳ−Ａ／ＤＨＦＲおよびｐＨＧＳ−Ｆ／ＤＨＦＲそ
れぞれの挿入ベクターに存在する変異１１ｋＤａ調節配
列由来のＤＨＦＲ転写物の量は挿入ベクターｐＨＧＳ−
２／ＤＨＦＲに存在する１１ｋＤａ調節配列Ｎｏ．１に
由来するＤＨＦＲ転写物と比較して少なくとも３〜４倍
増加している。
【図１Ａ】ｐＢＲ−３２２およびワクシニアウイルスの
Ｈｉｎｄ III“Ｊ”断片より成り、ワクシニアウイルス
のＴＫ−遺伝子を含むプラスミドｐＢＲ−Ｊの構築の概
略を示す模式図である。
Ｈｉｎｄ III“Ｊ”断片より成り、ワクシニアウイルス
のＴＫ−遺伝子を含むプラスミドｐＢＲ−Ｊの構築の概
略を示す模式図である。
【図１Ｂ】ｐＢＲ−３２２およびワクシニアウイルスの
Ｈｉｎｄ III−Ｆ断片の右側から成り、ワクシニアウイ
ルスの１１ｋＤａたん白の転写調節配列を含むプラスミ
ドｐＢＲ−Ｆ１の構築の概略を示す模式図である。
Ｈｉｎｄ III−Ｆ断片の右側から成り、ワクシニアウイ
ルスの１１ｋＤａたん白の転写調節配列を含むプラスミ
ドｐＢＲ−Ｆ１の構築の概略を示す模式図である。
【図２】ワクシニアウイルスのＴＫ−遺伝子プラスその
先行配列のプラスミドｐＵＣ−８へのサブクローニング
によるプラスミドｐＵＣ−ＴＫ構築の概略を示す模式図
である。
先行配列のプラスミドｐＵＣ−８へのサブクローニング
によるプラスミドｐＵＣ−ＴＫ構築の概略を示す模式図
である。
【図３】ワクシニアウイルスの１１ｋＤａたん白の転写
調節配列のＴＫ−遺伝子への挿入によるプラスミドｐＵ
Ｃ−ＴＫ−／１１ｋＤａの構築の概略を示す模式図であ
る。
調節配列のＴＫ−遺伝子への挿入によるプラスミドｐＵ
Ｃ−ＴＫ−／１１ｋＤａの構築の概略を示す模式図であ
る。
【図４】１１ｋＤａたん白の転写調節配列のＥｃｏＲＩ
制限酵素部位の上流をＸｍｎＩ制限酵素部へと変換し、
プラスミドｐＨＧＳ−１を得る概略を示す模式図であ
る。
制限酵素部位の上流をＸｍｎＩ制限酵素部へと変換し、
プラスミドｐＨＧＳ−１を得る概略を示す模式図であ
る。
【図５Ａ】ＴＫ−遺伝子に挿入した１１ｋＤａたん白の
転写調節配列で開始する転写物のためのヌクレアーゼＳ
１プローブの単離および放射標識の概略を示す模式図で
ある。
転写調節配列で開始する転写物のためのヌクレアーゼＳ
１プローブの単離および放射標識の概略を示す模式図で
ある。
【図５Ｂ】ＴＫ−遺伝子の調節配列で開始する転写物の
ためのヌクレアーゼＳ１の単離および放射性ラベル標識
の概略を示す模式図である。
ためのヌクレアーゼＳ１の単離および放射性ラベル標識
の概略を示す模式図である。
【図６】上部はヌクレアーゼＳ１によるＲＮＡ転写物
（ホ）のマッピングの概略を図示したものである。下部
はＴＫ−転写物（２５０ｂｐ）および１１ｋＤａ転写物
（２６０ｂｐ）のヌクレアーゼＳ１マッピングのＸ線写
真である。感染細胞からのＲＮＡを感染後３時間目（１
列目と２列目）および７時間目（３列目と４列目）に採
取した。
（ホ）のマッピングの概略を図示したものである。下部
はＴＫ−転写物（２５０ｂｐ）および１１ｋＤａ転写物
（２６０ｂｐ）のヌクレアーゼＳ１マッピングのＸ線写
真である。感染細胞からのＲＮＡを感染後３時間目（１
列目と２列目）および７時間目（３列目と４列目）に採
取した。
【図７】上部はヌクレアーゼＳ１によるＲＮＡ転写物の
マッピングの概略を示す。下部はそれぞれＲＶＶ−２
（ｐＨＧＳ−２、１列目および２列目）およびＲＶＶ−
３（ｐＨＧＳ−２△１５、３列目と４列目）に感染した
細胞から得たＲＮＡ転写物のヌクレアーゼＳ１マッピン
グのＸ線写真である。ＲＮＡは感染後、４時間目（１列
目と４列目）および８時間目（２列目と３列目）に抽出
した。“Ｍ”と記した列はｐＢＲ−３２２のＨｐａ II
断片の32Ｐラベル標識物のそれぞれ示した長さ（ｂｐ）
のものを含むものである。ＴＫ−遺伝子或いは挿入した
１１ｋＤａの調節配列で開始するそれぞれのＲＮＡ転写
物に相当する位置も示した。
マッピングの概略を示す。下部はそれぞれＲＶＶ−２
（ｐＨＧＳ−２、１列目および２列目）およびＲＶＶ−
３（ｐＨＧＳ−２△１５、３列目と４列目）に感染した
細胞から得たＲＮＡ転写物のヌクレアーゼＳ１マッピン
グのＸ線写真である。ＲＮＡは感染後、４時間目（１列
目と４列目）および８時間目（２列目と３列目）に抽出
した。“Ｍ”と記した列はｐＢＲ−３２２のＨｐａ II
断片の32Ｐラベル標識物のそれぞれ示した長さ（ｂｐ）
のものを含むものである。ＴＫ−遺伝子或いは挿入した
１１ｋＤａの調節配列で開始するそれぞれのＲＮＡ転写
物に相当する位置も示した。
【図８】プラスモジウム（Plasmodium falciparum)５．
１抗原（Hopeら、上述）のプラスミドｐＨＧＳ−２への
クローニングと構築されるプラスミドｐＨＧＳ−２／
５．１の概略を示す模式図である。
１抗原（Hopeら、上述）のプラスミドｐＨＧＳ−２への
クローニングと構築されるプラスミドｐＨＧＳ−２／
５．１の概略を示す模式図である。
【図９】生物の形態を示す写真であって、プラスモジウ
ム（Plasmodium falciparum)５．１抗原を含むウイルス
ＲＶＶ−４で感染した細胞の間接免疫蛍光を示す。写真
ａの細胞は４５０〜４９０ｎｍで撮影し、写真ｂは位相
差で撮影したものである。
ム（Plasmodium falciparum)５．１抗原を含むウイルス
ＲＶＶ−４で感染した細胞の間接免疫蛍光を示す。写真
ａの細胞は４５０〜４９０ｎｍで撮影し、写真ｂは位相
差で撮影したものである。
【図１０】プラスミドｐＨＧＳ−２／ＤＨＦＲの構築の
概略を示す模式図である。
概略を示す模式図である。
【図１１】プラスミドｐＨＧＳ−２／ＤＨＦＲ−Ｅの構
築の概略を示す模式図である。
築の概略を示す模式図である。
【図１２】プラスミドｐＨＧＳ−Ａ／ＤＨＦＲの構築の
概略を示す模式図である。
概略を示す模式図である。
【図１３】プラスミドｐＨＧＳ−Ｆ／ＤＨＦＲの構築の
概略を示す模式図である。
概略を示す模式図である。
【図１４】上部はＲＮＡ転写物（ホ）のヌクレアーゼＳ
１によるマッピングの概略を示す模式図であり、予想さ
れるバンドの長さ（３５０ｂｐ）を示した。下部はＲＶ
Ｖ−６（ｐＨＧＳ−２／ＤＨＦＲ）、ＲＶＶ−７（ｐＨ
ＧＳ−Ａ／ＤＨＦＲ）およびＲＶＶ−８（ｐＨＧＳ−Ｆ
／ＤＨＦＲ）に感染した細胞からのＲＮＡ転写物ヌクレ
アーゼＳ１マッピングのＸ線写真である。初期ＲＮＡは
それぞれのウイルスで感染させた細胞を１００μｇ／ｍ
ｌのシクロヘキシミド存在下（＋と表記した列）でイン
キュベート後６時間目に抽出した。後期ＲＮＡは感染後
８時間および２４時間目（それぞれ８および２４と記し
た列）に抽出した。“Ｍ”と記した列はｐＢＲ−３２２
のＨｐａ II 断片の32Ｐ放射標識物より成り、図に示し
た長さ（ｂｐ）である。転位（変異）した１１ｋＤａ調
節配列から開始するＲＮＡ転写物に対応するＳ１保護バ
ンドの位置を図に示してある。
１によるマッピングの概略を示す模式図であり、予想さ
れるバンドの長さ（３５０ｂｐ）を示した。下部はＲＶ
Ｖ−６（ｐＨＧＳ−２／ＤＨＦＲ）、ＲＶＶ−７（ｐＨ
ＧＳ−Ａ／ＤＨＦＲ）およびＲＶＶ−８（ｐＨＧＳ−Ｆ
／ＤＨＦＲ）に感染した細胞からのＲＮＡ転写物ヌクレ
アーゼＳ１マッピングのＸ線写真である。初期ＲＮＡは
それぞれのウイルスで感染させた細胞を１００μｇ／ｍ
ｌのシクロヘキシミド存在下（＋と表記した列）でイン
キュベート後６時間目に抽出した。後期ＲＮＡは感染後
８時間および２４時間目（それぞれ８および２４と記し
た列）に抽出した。“Ｍ”と記した列はｐＢＲ−３２２
のＨｐａ II 断片の32Ｐ放射標識物より成り、図に示し
た長さ（ｂｐ）である。転位（変異）した１１ｋＤａ調
節配列から開始するＲＮＡ転写物に対応するＳ１保護バ
ンドの位置を図に示してある。
（イ） ワクシニアウイルスのＴＫ−遺伝子を示す。 （ロ） ワクシニアウイルスの１１ｋＤａたん白の転写
調節配列を示す。 （ハ） Plasmodium falciparum の５．１抗原の遺伝子
を示す。 （ニ） マウスジヒドロ葉酸レダクターゼの遺伝子を示
す。 （ホ） ＲＮＡ転写物を示す。
調節配列を示す。 （ハ） Plasmodium falciparum の５．１抗原の遺伝子
を示す。 （ニ） マウスジヒドロ葉酸レダクターゼの遺伝子を示
す。 （ホ） ＲＮＡ転写物を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 7/00 9281−4Ｂ // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (15)
- 【請求項１】 ポックスウイルスの後期プロモーターと
して機能する遺伝情報を含む以下の式で表わす転写調節
配列またはそのサブユニット、或いは上記転写調節配列
の一個又は数個のヌクレオチドの欠損、挿入、置換また
はそれらの組合せなどによる機能を保持した変異配列、 【化１】 が原核細胞又は真核細胞ポリペプチドをコードする外来
遺伝子と機能的に結合しているキメラ遺伝子を含み、該
外来遺伝子の発現が可能な感染性組換えポックスウイル
ス。 - 【請求項２】 キメラ遺伝子の翻訳開始部位がポックス
ウイルスの転写調節配列にある請求項１に記載の感染性
組換えポックスウイルス。 - 【請求項３】 キメラ遺伝子の翻訳開始部位が原核細胞
又は真核細胞ポリペプチドをコードする外来遺伝子にあ
る請求項１に記載の感染性組換えポックスウイルス。 - 【請求項４】 該外来遺伝子がマラリア抗原をコードす
る請求項１または３のいずれか一つに記載の感染性組換
えポックスウイルス。 - 【請求項５】 マラリア抗原がプラスモディウム・ファ
ルシパルム（Plasmodium falciparum)のスポロゾイドお
よび／またはメロゾイト表面抗原である請求項４に記載
の感染性組換えポックスウイルス。 - 【請求項６】 マラリア抗原が５．１抗原である請求項
５に記載の感染性組換えポックスウイルス。 - 【請求項７】 感染性組換えワクシニアウイルスである
請求項１〜６のいずれか一つに記載の感染性組換えポッ
クスウイルス。 - 【請求項８】 ＲＶＶ群の一つである感染性組換えワク
シニアウイルスである請求項７に記載の感染性組換えポ
ックスウイルス。 - 【請求項９】 ＲＶＶ−１である感染性ワクシニアウイ
ルスである請求項８に記載の感染性組換えポックスウイ
ルス。 - 【請求項１０】 ＲＶＶ−２である感染性ワクシニアウ
イルスである請求項８に記載の感染性組換えポックスウ
イルス。 - 【請求項１１】 ＲＶＶ−４である感染性ワクシニアウ
イルスである請求項８に記載の感染性組換えポックスウ
イルス。 - 【請求項１２】 ＲＶＶ−７である感染性ワクシニアウ
イルスである請求項８に記載の感染性組換えポックスウ
イルス。 - 【請求項１３】 ＲＶＶ−８である感染性ワクシニアウ
イルスである請求項８に記載の感染性組換えポックスウ
イルス。 - 【請求項１４】 ポックスウイルスの後期プロモーター
として機能する遺伝情報を含む以下の式で表わす転写調
節配列またはそのサブユニット、或いは上記転写調節配
列の一個又は数個のヌクレオチドの欠損、挿入、置換ま
たはそれらの組合せなどによる機能を保持した変異配
列、 【化２】 が原核細胞又は真核細胞ポリペプチドをコードする外来
遺伝子と機能的に結合しているキメラ遺伝子を含み、該
外来遺伝子の発現が可能な感染性組換えポックスウイル
スの製造方法において、 （１）（ａ）ポックスウイルスＤＮＡを含有するベクタ
ーを調製し、該ＤＮＡは（ｉ）少なくとも一つの制限酵
素切断部位に隣接して少なくとも一個の転写調節配列お
よび（ii）該調節配列および該制限酵素切断部位を結合
したポックスウイルスゲノムの非必須断片からのＤＮＡ
とから成り、 （ｂ）原核細胞又は真核細胞ポリペプチドをコードする
少なくとも一個の外来遺伝子を該転写調節配列に隣接す
る該制限酵素部位に挿入することにより組換えベクター
を調整し、 （２）ポックスウイルス属に属するウイルスにより感染
した少なくとも一個の細胞を得、 （３）該細胞を上記組換えベクターでトランスフェクシ
ョンし、そこで、該ポックスウイルスのＤＮＡと該組換
えベクターに含まれるポックスウイルスＤＮＡの少なく
とも一部分とに相同組換えを起こさせ、そして、 （４）原核細胞又は真核細胞ポリペプチドをコードする
該外来遺伝子を発現することの出来る感染性組換えポッ
クスウイルスを該細胞より選択的な方法により単離する
ことからなる感染性組換えポックスウイルスの製造方
法。 - 【請求項１５】 該ポックスウイルスＤＮＡがワクシニ
アウイルスＤＮＡである請求項１４に記載の方法。
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|---|---|---|---|
| GB8508845 | 1985-04-04 | ||
| GB858508845A GB8508845D0 (en) | 1985-04-04 | 1985-04-04 | Vaccinia dna |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61077534A Division JPS61289888A (ja) | 1985-04-04 | 1986-04-03 | ワクシニアｄｎａ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07265085A true JPH07265085A (ja) | 1995-10-17 |
Family
ID=10577216
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61077534A Pending JPS61289888A (ja) | 1985-04-04 | 1986-04-03 | ワクシニアｄｎａ |
| JP7030352A Pending JPH07265085A (ja) | 1985-04-04 | 1995-02-20 | 組換えポックスウイルス |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61077534A Pending JPS61289888A (ja) | 1985-04-04 | 1986-04-03 | ワクシニアｄｎａ |
Country Status (9)
| Country | Link |
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| JP (2) | JPS61289888A (ja) |
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| CA (1) | CA1316849C (ja) |
| DE (1) | DE3685833T2 (ja) |
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| GB (1) | GB8508845D0 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| US6222020B1 (en) * | 1987-01-07 | 2001-04-24 | Imperial Cancer Research Technology Limited | Antigens derived from the core protein of the human mammary epithelial mucin |
| US5348741A (en) * | 1987-02-03 | 1994-09-20 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Vector for recombinant poxvirus expressing rabies virus glycoprotein |
| US5443964A (en) * | 1987-08-10 | 1995-08-22 | Duke University | Poxvirus insertion/expression vector |
| US5578468A (en) * | 1987-08-10 | 1996-11-26 | Duke University | Site-specific RNA cleavage |
| CA1341245C (en) * | 1988-01-12 | 2001-06-05 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Recombinant vaccinia virus mva |
| US5691170A (en) * | 1989-04-18 | 1997-11-25 | Therion Biologics | Generation of hybrid genes and proteins by virus-mediated recombination |
| AU5948490A (en) * | 1989-06-21 | 1991-01-08 | Rockefeller University, The | Recombinant poxvirus and streptococcal m protein vaccine |
| DE69101634T4 (de) * | 1990-01-26 | 1994-12-01 | Immuno Ag | Rekombinant hergestellte blutfaktoren, verfahren zur exprimierung besagter blutfaktoren sowie in besagtem prozess verwendeter rekombinanter vaccina-virus. |
| US5756101A (en) | 1991-07-01 | 1998-05-26 | Pasteur Merieux Serums Et Vaccins | Malaria recombinant poxvirus |
| US5766597A (en) * | 1991-03-07 | 1998-06-16 | Virogenetics Corporation | Malaria recombinant poxviruses |
| CA2106464A1 (en) * | 1991-03-20 | 1992-09-21 | Enzo Paoletti | Malaria recombinant poxvirus vaccine |
| CA2102623C (en) * | 1991-05-06 | 2003-04-22 | Jeffrey Schlom | Recombinant virus expressing carcinoembryonic antigen and methods of use thereof |
| US5736378A (en) * | 1991-09-12 | 1998-04-07 | The Scripps Research Institute | Molecular cloning and characterization of the feline immunodeficiency virus isolate PPR |
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