CZ219499A3

CZ219499A3 - Polypeptidy rodiny bHLH, odpovídající sekvence nukleových kyselin a farmaceutický přípravek, který je obsahuje

Info

Publication number: CZ219499A3
Application number: CZ992194A
Authority: CZ
Inventors: Christine Icard-Liepkalns; Jacques Mallet; Philippe Ravassard
Original assignee: Rhone-Poulenc Rorer S. A.
Priority date: 1996-12-19
Filing date: 1997-12-19
Publication date: 1999-10-13
Also published as: IL130302A0; BR9713968A; WO1998027206A2; JP2001510464A; AU732438B2; HUP0001184A3; WO1998027206A3; FR2757524A1; HU224305B1; EP0946724A2; FR2757524B1; NO993029L; ZA9711401B; CA2275454A1; HUP0001184A2; AU5667398A; US6998474B1; SK81899A3; KR20000057698A; NO993029D0

Description

Předkládaný vynález se týká nového proteinu typu bHLH a odpovídající kódující sekvence nukleové kyseliny. Týká se také expresních vektorů obsahujících uvedenou sekvenci a použití této sekvence nebo proteinu k léčebným účelům.

Dosavadní stav techniky

Embryonální nervová trubice je zpočátku tvořena po celé své - délce z nediferencovaného neuroepitelu. Později se buňky diferencují a v závislosti na jejich poloze k osám přední/zadní, dorzální/ventrální a mediální/laterální vytvářejí · různé nervové struktury. Tato diferenciace je do jisté míry řízena genetickými faktory, které rozdělují nervovou trubici do několika histogenních oblastí. Dne je známo, že se na tomto diferenciačním jevu podílejí mnohé transkripční faktory a zvláště produkty kódované tzv. geny bHLH (Basic Helix Loop Helix) (Caudy et al., 1988, Cell 55, 1061-67) . Proteiny této rodiny mají vysoce konzervativní úseky aminokyselin, zvláště základní doménu následovanou helixem 1 (šroubovicí) a helixem 2. Dvě šroubovicové jednotky jsou odděleny smyčkou proměnlivé délky. U obratlovců se určité produkty těchto bHLH genů podílejí na různých stadiích neurogeneze v průběhu neuronální determinace a diferenciace. Jako příklad reprezentativních proteinů tohoto typu lze uvést zvláště proteiny Math-1 (Akazawa et al., 1995, J. Bol. Chem., ·· ···· ·· 4444

44

4 4 4 4 4 4 44 4

4 4 4 4 4 44 4

44 4 4 4444444

4 4 « 4 4 4 • 4444 4 4 4 44 44

279,8730-38), Mash-1 (Johnson et al., 1990, 346, 858-61) a NeuroD (Leeet al., 1995, Sciences, 268, 836-44)/ Zjevně se neuronálního vývoje účastni i jiné proteiny obsahující doménu bHLH na úrovni dalších místa v různých časech. Identifikace nových proteinů typu bHLH by byla zvláště cenná pro zlepšení našeho porozumění neurogenezi a proto by byla výhodná také z léčebného hlediska.

Podstata vynálezu

Předmětem předkládaného vynálezu je . izolace, sekvencování a charakterizace cDNA kódující polypeptid, který patří do nové rodiny proteinů bHLH. Vynález dále popisuje rekombinantní DNA. a vektory obsahující tuto sekvenci a také jejich použití pro aktivaci exprese rekombinantních proteinů..

Původce identifikoval polypeptid, která má vysokou míru homologie s dosud identifikovanými proteiny bHLH, přičemž homologie je omezena na doménu bHLH. A skutečně, což je překvapivé, úseky obklopující tuto doménu bHLH nesdílejí žádnou sekvenční identitu s-úseky jiných proteinůtypu bHLH.

Tudíž prvním předmětem předkládaného vynálezu je polypeptid typu bHLH obdařený transkripční aktivitou, který sdílí sekvenční homologii s proteiny typu bHLH pouze na úrovni své domény bHLH.

Přesněji řečeno, předkládaný vynález se týká polýpeptidu, který má transkripční aktivitu, a který je představován zcela nebo částečně sekvencí id. č. 1 nebo některým z jejích derivátů.

Derivátem se pro ,účel této přihlášky rozumí produkt, obsahující např. modifikace na úrovni primární struktury, jako jsou např. delece jednoho nebo několika zbytků, • * 99 9 9 • 9 9999

9· · 99 9 99 9 9

99 9 9 9 99

9 9999 9 999 999 '9 9 9 9 « · 9

99999 99 9 '99 «9 substituce jednoho nebo několika zbytků a/nebo modifikace na úrovni jednoho nebo několika zbytků. Počet zbytků ovlivněných modifikacemi může být např. 1, 2 nebo 3 až 10, 20 nebo 30.

Termín derivát označuje také molekuly, které obsahují dodatečné vnitřní nebo koncové části, ať už peptidové' povahy nebo jiné. Mohou to být zvláště aktivní části, markéry nebo aminokyseliny' jako je např'. methionin v poloze -1. Termín.' .derivát také zahrnuje molekuly' obsahující modifikace na úrovni terciální struktury (N-koneová část apod.).

Tyto deriváty Se mohou připravovat pro, různé účely, např. zvláště s cílem zvýšit afinitu peptidu k místu jeho interakce, zvýšit produkční hladinu peptidu nebo · udělit peptidu nové farmakokinetické a/nebo biologické vlastnosti.

Deriváty výhodně sdílejí alespoň jednu strukturní homologii s proteinem podle předkládaného vynálezu, výhodněji alespoň na úrovni úseků obklopujících doménu bHLH, a uchovávají si aktivitu transkripčního aktivátoru. Deriváty mohou mít také ^: novou vlastnost ve srovnání s polypeptidy podle předkládaného vynálezu (mohou nést značku apod.) nebo mohou mít zlepšené vlastnosti (stabilitu, biologickou účinnost apod.).

Výhodně se jedná a polypeptid typu bHLH, který má.sekvenci uvedenou zde jako sekvence id. č. 1. Výhodněji se jedná o protein, který obsahuje otevřený čtecí rámec 214 aminokyselin, pro· který je exprese příslušné mRNA detekována v podélných pásech v krysím embryu. Tento protein byl proto nazván Relax, což je zkratka z Rat Embryonic Longitudinal Axis (podélná osa krysího embrya), a představuje jeden z předmětů předkládaného vynálezu.

Srovnání aminokyselinové sekvence proteinu Relax s dosud známými proteiny umožnilo stanovit sekvenční korelaci mezi proteiny typu bHLH. Kromě . toho, tato homologie byla

0000 09 0900 ·· ·9, • · 0 0 9 0 0 · 9 0 • 0 09 9 099 9

9 0 0 ·0 9 090090

9 9 9 0 9 0

0 9 9 0 90 0 09 90

-' -4 lokalizována pouze na úrovni domény bHLH. Doména proteinu Relax tedy sdílí 68%, , 57% a 40% homologii s bHLH doménami proteinů NeuroD, Math-1 a Mash-1 (v uvedeném pořadí).

Ná základě testů účinnosti, které byly provedeny s proteinem Relax, a které jsou podrobněji uvedeny v příkladech, je zřejmé, že tento protein je schopen se specificky vázat k sekvenci ' E boxu, ,v kotransfekčních pokusech se chová jako transkripční aktivátor a jeho ^aktivita je přísně závislá na přítomnosti intaktního E boxu. Všechna tato pozorování ukazují na to, že protein Relax podle předkládaného vynálezu je členem rodiny proteinů bHLH.

Předmětem předkládaného vynálezu je také sekvence nukleové kyseliny schopná- exprimovat polypeptid typu bHLH definovaný výše·.

Přesněji řečeno, předkládaný vynález- se týká sekvence nukleové kyseliny, která je představována částečně nebo úplně sekvencí id. č. 1, jejím komplementárním řetězcem nebo jejími deriváty.

Nukleové kyseliny podle vynálezu' mohou být fragmenty komplementární DNA (cDNA) , genomové DNA , (gDNA) nebo ŘNA. Zvláště to jsou cDNA nebo gDNA.

Pro účel tohoto vynálezu derivát znamená jakoukoliv sekvenci lišící se od dané sekvence v důsledku degenerace genetického kódu, sekvenci získanou jednou, nebo několika modifikacemi genetické a/nebo chemické povahy, a také jakoukoliv sekvenci hybridizující s těmito sekvencemi nebo jejich fragmenty, přičemž jejich produkty si udržují výše uvedené· vlastnosti.

Modifikacemi genetické a/nebo povahy se rozumí jakákoliv mutace, substituce, delece, adice a/nebo modifikace jednoho nebo několika zbytků. Takové deriváty se mohou připravovat pro různé účely, např. zvláště s cílem zvýšit produkční • 4 49··

4494 • ·4

44 ► 4 4 4 » 4 4 4

444 ·44 • 4 ♦ ♦ «· hladinu peptidu nebo modifikovat/zvýšit jeho aktivitu nebo biologické chimérické dodatečnou nukleové promotor, sekvence homologní udělit peptidu nové farmakokinetické a/nebo vlastnosti. K derivátům vzniklým adicí patří např sekvence ; nukleové kyseliny, které obsahtíjí heterologní část připojenou k jednomu z konců, např. se může jednat o hybridní konstrukt obsahující cDNA, se kterou se může být spojen jeden nebo .několik intronů.

Podobně pro účel předkládaného vynálezu, kyseliny, podle předkládaného vynálezu obsahují aktivační nebo regulační sekvence apod.

Termín derivát zahrnuje také s uvažovanou sekvencí, které jsou' získány z jiných buněčných zdrojů, zvláště z buněk lidského původu, nebo z jiných organismů, a přitom mají aktivitu stejného typu nebo v podstatě podobného typu. Takové homologní sekvence je možné získat hybrídizačnímí pokusy. Hybridizace se mohou provádět s knihovnami nukleových kyselin pomocí sondy, nativní sekvence nebo jejího, fragmentu, za obvyklých stringentních podmínek (Maniatis et al., viz také obecné techniky molekulární biologie) nebo výhodně za vysoce stringentních podmínek.

Výhodně, se jedná o sekvenci nukleové kyseliny uvedenou zde jako sekvence id. č. 1 nebo její komplementární řetězec.

Předkládaný vynález se také týká odpovídajících anti-sense sekvencí, jejichž exprese umožňuje kontrolovat transkripci buněčných mRNA. Takové, sekvence mohou obsahovat celou nebo část uvedené sekvence nukleové kyseliny, transkribovanou v opačné orientaci. Jsou komplemetární nebo významně komplementární se sekvencí nukleové kyseliny, celé nebo částečně..

Předmětem předkládaného vynálezu je také použití polypeptidu podle vynálezu k řízení a/nebo k účasti v genové

- 6 99 999« • 99* 9

9 9 9

I 9 9 9 > 9 9 9

9 9 9 « 9

9 «9 expresi. Takové transkripční aktivátory mohou být zvláště výhodné pro zaměřování exprese , proteinu do centrálního nervového systému.. —

Polypeptid podle předkládaného vynálezu může být získán v buněčném hostiteli expresí nukleotidové sekvence popsané výše, vložené do rekombinantní DNA, pomocí technik známých odborníkovi nebo kombinací těchto způsobů.

Výhodně nukleová kyselina podle předkládaného vynálezu tvoří část vektoru vhodného pro indukci in vivo, ex vivo a/nebo in vitro exprese polypeptidu podle vynálezu. Použitý vektor může být různého původu, za předpokladu že je schopen transformovat živočišnou buňku, výhodně lidskou nervovou buňku. Ve výhodném provedení vynálezu byl použit virový vektor, který může být odvozen adeno-asociovaných virů (AAV), z adenovirů, řetrovirů, herpetického viru, cytomegaloviru (CMV), viru vakcinie apod. Vektory odvozené z adenovirů, retrovirů- .nebo AAV obsahující heterologní sekvence nukleové kyseliny byly popsány v odborné literatuře (Akli et al., Nátuře Genetics 3 , (1993) 224; StratfordPerricaudet et al., Human Gene Therapy 1 (1990) 241; EP 185 573, Levrero et al. , Gene 101 (1991) 195; Le Gal la Sallé et al., Science 259 (1993) 988; Roemer and Friedraann, Eur. J. Biochem. 208 (1992). 211; Dobson et al., Neuron 5 (1990) 353; Chiocca et al., New Biol.' 2 (1990) 739; Miyanohara . et al., New Biol. 4 (1992) 238; WO91/18088).

Předkládaný vynález se proto také týká jakéhokoliv rekombinantního viru, který obsahuje nukleovóu kyselinu, definovanou výše, vloženou do svého genomu.

Rekombinantní virus podle předkládaného vynálezu je výhodně defektní virus. Termín defektní virus označuje virus, který není schopen replikace v cílové buňce. Obecně řečeno, genom takového defekťního viru použitého podle ·♦ ···» ·· 9 9 • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 ··'.»» 9 9 9 9 9 » 9 9999 · 999 999

9-9 9 9 9 9 9

99999 99 9 9 9 99 předkládaného vynálezu, postrádá, přinejmenším sekvence nezbytné pro replikaci uvedeného viru v infikované buňce.

Tyto úseky mohou být buďto odstraněny (úplně nebo částečně), nebo změněny na nefunkční, nebo nahrazeny jinými sekvencemi, zvláště nukleovou kyselinou podle vynálezu. Avšak defektní virus si výhodně uchovává sekvence svého genomu, které jsou nezbytné pro enkapsidaci virových částic.

Zvláště výhodné je užít sekvence nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu ve formě· vložené do adenoviru, AAV nebo rekombínantního retroviru, které jsou defektní. Ve výhodném provedení vynálezu, se jedná o adenovirus ..

Existují adenoviry různých, séroťypů,¹ jejichž strukturaa vlastnosti se poněkud, odlišují. Podle předkládaného vynálezu je výhodné použití lidských adenovirů typu 2. nebo 5 (Ad 2 nebo Ad 5) nebo adenovirů živočišného původu (viz patentová přihláška WO94/26914). K adenovirům živočišného původu, které se mohou použít podle předkládaného vynálezu, patří např. adenoviry psího, hovězího nebo myšího původu (např. Mávl, -Beard etal., Virology-75 (1990) 81), ovčího, prasečího, ptačího nebo opičího původu (např. SAV) . Výhodně je adenovirus živočišného původu psí adenovirus, výhodněji adenovirus CAV2 (např. kmen Manhattan nebo A26/61, ATCC <

VR-800). Výhodně se podle předkládaného vynálezu užije adenovirus lidského, psího nebo smíšeného původu. Výhodně je v genomu adenoviru podle předkládaného vynálezu nefunkční alespoň úsek El. Funkce tohoto virového genu může být vyřazena . jakýmkoliv způsobem známým odborníkovi, zvláště úplnou supresí, substitucí nebo částečnou delecí nebo adicí jedné nebo několika baží v uvedeném genu (genech) . Také jiné úseky mohou být modifikovány, zvláště úseky E3 (WO95/02697),

E2 (WO94/28938), E4 (WO94/28152, WO94/12649, W095/02697.) a L5 (WO95/02697) .

- 8 •9 9999 •9 »999

999 9 9

9

9 9

9

99

9 9 9

999 999

9

99

Ve výhodném provedení vynálezu obsahuje adenovirus deleci v úsecích El a E4. ,

V dalším výhodném provedení vynálezu obsahuje deleci v úseku El na úrovni místa vložení úseku E4 a kódující sekvence. Ve virech podle předkládaného vynálezu delece výhodně obsahuje nukleotidy 455 až 3329 v sekvencí adenoviru Ad5. Podle jiného výhodného provedení je exogenní nukleová kyselina je vložena na úrovni delece. v úseku El.

Defektní rekombinantní viry podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny, homologní rekombinací mezi defektním virem a plazmidem nesoucím, kromě jiného,- nukleotidovou sekvenci definovanou výše (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; Graham, EMBO J. 3(12) (1984) 2917). K homologní rekombinací dochází po kotransfekci uvedeného viru a plazmidu do vhodné buněčné linie. Vhodná buněčná linie má výhodně I) být transformovatelná uvedenými prvky a II) obsahovat sekvence schopné komplementace defektních částí virového genomu, výhodně v integrované formě, aby se zabránilo riziku rekombinace. Jako příklad linie, která se může užít pro přípravu defektních rekombinantních adenoviru, je možné uvést linii 293 lidských embryonálních' ledvin (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), která zvláště obsahuje levou část genomu adenoviru Ad5 (12 %) inetegrovanou do buněčného genomu. Jako příklad linie, která' může být užita,pro přípravu defektního ' rekombinantního retroviru lze uvést linii CRIP (Danos and Mulligan, PNAS 85 (1938) 6460) . A dále se viry, které se namnožily, izolují a purifikují technikami známými v oboru molekulární biologie.

Vektor, nukleová kyselina nebo polypeptid podle předkládaného vynálezu mohou být v izolované nebo purifikované formě.

- 9 99 9999 • 9 ···· • 9 • 9 99 • ·

9 ·

999« 9

9 9

I 9 9 9

999 999

Předmětem předkládaného vynálezu je také farmaceutický přípravek obsahující alespoň jednu nukleotidovou sekvenci, vektor nebo polypeptid podle vynálezu.

Předkládaný vynález se také týká jakéhokoliv použití vektoru podle vynálezu pro přípravu přípravku k léčení patologických stavů ovlivňujících nervovou soustavu.

Kromě toho vynález zahrnuje i jakékoliv použití polypeptidů podle vynálezu k řízení a/nebo k účasti v genové sekvence nebo farmaceutického expresi.

Následuj ící příklady a obrázky slouží k ilustraci vynálezu a dále charakterizují a demonstrují výhody vynálezu, aniž by ho jakkoliv omezovaly.

Popis obrázků

Obr. 1: Nukleotidová sekvence cDNA CIG235. V této sekvenci jsou ukázány různé oligonukleotidy použité k izolaci úplné cDNA. Šipky, ukazují orientaci těchto oligonukleotidů ve směru od 5'ke 3'.

Obr. 2: Srovnání aminokyselinových sekvencí domény bHLH proteinu Relax s ostatními proteiny z rodiny. Homologní aminokyseliny jsou označeny černě a aminokyseliny s podobnou strukturou jsou označeny šedě.

- 10 •4 4444 ' * 4

4

4» 4

4 4 4

444 444

4

44

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1

Přímá PCR amplifikace sekvencí mezi základními doménami a helixem. II pomocí degenerovaných oligonukleotidů

Izolace cDNA kódující nové transkripční faktory rodiny laboratorních potkanů horní krční nervová této rodiny mají· (Rat uzlina vysoce zvláště vybrány různé bHLH byla provedena z SCG Superior Cervical Ganglia, potkana). Jelikož proteiny konzervativní jednotky aminokyselinových sekvencí, základní doménu a helix I a helix II, byly degenerované oligonukleotidy kódující tyto konzertvativní úseky. Byly vybrány proto, aby konzervovaly základní úseky a doménu helixu· II komplexu achaete-scute drozofily a bHLH savčích genů'jako jsou Mash-1, Mash-2 a MTwist. Tyto oligonukleotidy byly užity jako sense a antisense (přímé a zpětné) primery na jedné straně pro provádění přímého screeiningu knihovny SCG · konstruované pomocí PCR a na druhé straně i pro PCR na ss-cDNA z SCG.

Přímý (sense) oligonukleotid byl’ vybrán ze základní domény proteinů bHLH, konkrétně ·. je to oligonukleotid odpovídájící , nás ledujícímu polypeptidovému' fragmentu:

5'-AATKHGMGIGAGCGCIDKCGCRYG-3' (sekvence id. č. 2).

Zpětný (anti-sense) oligonukleotid byl částečně určen z domény helixu II stejných proteinů oligonukleotid odpovídající následujícímu fragmentu:

5'-GGCSRDTYTCAGGGTSYBGAYCTT-3' (sekvence id. č. 3).

Jednořetězcová cDNA (ss-cDNA) byla připravena z 500 ng denaturované polyA⁺RNA získané . ze SCG dva dny starých potkanů.

bHLH. Je to polypeptidovému ·· ···· » · • ·

PCR amplifikace byla provedena v reakční směsi obsahující·, kromě PCR pufru (10 mM Tris, pH 8,3, 50 mM KC1,

2,5 mM MgCl₂) , 200 μΜ dNTP, 12,5 μΜ každého z oligonukleotidů a 20 ng ss-cDNA. PCR byla provedena tak, že se postupně provedla 3minutová denaturace v 94°C, pak 2 cykly (94 °C po 30 s; 50 °C po 45 s; 72 °C po 1,5 min) a nakonec 38 cyklů (94 °C po 30 s; . 62 °C po 45 s; 72 °C po 1,5 min). Produkty PCR byly klonovány do místa Srna I plazmidu pUC19 a takto získaných 1500 klonů bylo analyzováno sekvencováním. Hledala se ' přítomnost jednotky helixu I v aminokyselinové sekvenci dedukované z nukleotidové sekvence těchto různých cDNA. Velký podíl z těchto cDNA (670) obsahoval takovou jednotku a z nich pouze jedna odpovídala případnému, novému členu rodiny bHLH. Ostatní izolované cDNA odpovídaly známým proteinům bHLH.

Nově izolovaná cDNA nazvaná CIG235 a uvedená zde na obr. 1, odpovídá fragmentu 76 nukleotidů (kromě sekvencí odpovídajících oligonukleotidům vneseným při PCR). Srovnávací přiřazení aminokyselinových sekvencí bylo provedeno s tím, že nebyla povolena ani inzerce ani delece. Tato srovnání ukázala, že uvedený fragment kóduje jednotku homologní k jednotce helixu I proteinů bHLH. Pak byla provedena izolace úplné cDNA. .

Příklad 2

Izolace úplné cDNA odpovídající CIG235

Izolace úplné cDNA odpovídající CIG235 byla extrémně obtížná, protože mRNA odpovídající CIG235 je v SCG exprimována velmi slabě. Zdá se, že úroveň její exprese je blízká .úrovni nelegitimní transkripce. Zvolený způsob spočíval, v tom, že na jedné straně se izoloval 3'konec cDNA ·· 9999

- 12 99 9999

9 9 9 9 • t 9 9 9

9 9 9 9 9

9 9 9 9

9999 9 99 9

99

9 9 9

999 999 • · ·· 99 odpovídající CIG235 .pomocí zakotvené PCR a na druhé· straně 5'konec této cDNA se izoloval z míchy embryí potkana ve stadiu E12.5. ,

1. 3'extenze cDNA CIG235 pomocí zakotveně (anchored)PCR

Pro tento účel byla připravena SCG ss-cDNA pomocí RA.3'NV primeru (náhodný primer pro reverzní transkripci nesoucí kotvu 3'NV) metodou podle Dumas Milné Edwards et al. (1995, A Practical Approach Ed McPherson et al., pp89-118, IRL PressOxford U.K.). Byly vybrány dva specifické hnízdové primery v bHLH pozitivním klonu 7 6 nukleotidů:

CI,G5’ -1: 5’ -AACCTTAACTCCGCGCTGGATGCGC-3' (sekvence id. č. 4) a CIG5'-2.· 5'-CGCGGTGTCCTGCCCACC-3' (sekvence id. č. 5).

3'konec CIG235 byl pak amplifikován ve dvou hnízdových PCR s páry oligonukleotidů CIG5'-1 a A3'-l a pak CIG5'-2 a A3'-2. Stejná PCR reakční směs ja'ko je popsána-v příkladu 1 byla použita pouze s 0,8 μΜ každého oligonukleotidu s denaturačním krokem 94 °C, 30 s a prodlužúvacím krokem °C, 1,5 min. Nasednutí primeru annealing) bylo provedeno při různých teplotách po dobu 45 s. Během prvních deseti cyklů byla po každých dvou cyklech teplota snížena o 1° C ze 70 °C na 65° C. a pak udržována na 65 °C během 30 cyklů. Výsledné produkty byly klonovány do pUC19 a sekvencovány. Byla tak získána cDNA délky 717 nukleotidů, nazvaná CIG3', jejíž 5'část odpovídala 3'konci klonu CIG235. Analýza otevřených čtecích rámců ukázala, že byla izolována celá sekvence- kódující karboxylový konec proteinu ještě s nekódujícím 3'koncovým úsekem 321 nukleotidů.

·· 9999 ·· 9999

9 ·

9..9

9999 9

99

9 9 *

9 9 9

999 999

9

99

- .13 2.. Izolace 5' konce odpovídajícího CIG3'z míchy embrya potkana ve stadiu E12.5

Expresní vzorec mRNA odpovídající CIG3' byl vyhledán pomocí hybridizace in šitu. Exprese byla stanovena v různých stadiích embryonálního vývoje. Byla vybrána taková metoda, že byla provedena hybridizace in šitu na tlustých řezech embryí potkanů se sondou značenou dioxygeninem. Tato metoda je v podstatě adaptací metody hybridizace in toto (1994, A Pratical Approach, Ed Wilkinson et al., pp75-83, IRL Press Oxford U.K.) a umožňuje rychlý screening celých embryí v mnoha různých stadiích.

Vysoká exprese byla detekována v míše, den 12.5 embryonálního vývoje (E12.5)·. Byla proto připravena mRNA. z míchy v tomto vývojovém stadiu a pak byl izolován 5'konec metodou SLIC. Produkt PCR velikosti 893 bp byl nakonec izolován a nazván CIG5'..

CIG3'a CIG5'se překrývají v úseku 120 nukleotidů a vytvářejí celkovou cDNA, jejíž velikost je 1491 nukleotidů.

Avšak vzhledem k tomu, že uvedené CIG3'a CIG5' nebyly izolovány ze stejné tkáně, bylo třeba ukázat, že kontig vytvořený . přiřazením těchto klonů odpovídá skutečně existující mRNA. a že se nejedná o chiméru vytvořenou PCR. Pomocí PCR po reverzní transkripci jsme proto ověřili, že celá mRNA je přítomna v míše· ve stadiu E12.5. V této tkáni jediná amplifikace PCR umožnila vizualizovat celou tuto mRNA. Navíc analýza mRNA pomocí northernového přenosu ukázala, že všechny tři sondy, t j . CIG3', CIG5'a celková cDNA detekovaly jedinou cDNA velokosti 3,1 kb. A nakonec časoprostorové vzorce exprese získané hybridizací in šitu s CIG3' nebo celkovou CDNA jsou naprosto shodné. Tyto výsledky jsou přesvědčivým dokladem toho, že CIG3' ..a CIG5' opravdu odpovídají fragmentům jedné a téže mRNA.

·»·· ·» ···· ···· « ·· 99 » 9 · · » · · ·

9 · ·♦ 9 • 9 • 9 99

Abychom, eliminovali vliv bodových mutací vnesených při PCR ' polymerázou Taq, byly provedeny čtyři nezávislé amplifikace celé cDNA z ss-cDNA z míchy E12.5. Byli jsme tak schopni přesně stanovit sekvenci cDNA, která je zde uvedena jako sekvence id. č. 1.

Analýza sekvence cDNA ukázala, že byl izolován celý kódující úsek, nekódující úsek 5' konce netranslatovaného 3' úseku. Kromě toho odpovídající mRNA detekována v embryu ve formě podélných pásů.· Tato charakteristika byla důvodem, že tato cDNA. byla nazvána Relax.(z Rat-embryonic longitudinal axis).

a také část byla· exprese

Příklad 3

68% - identitu 1995) . Kromě

Srovnání aminokyselinových sekvencí domény bHLH proteinu Relax s jinými proteiny rodiny bHLH .

Analýza aminokyselinové sekvence dedukované z cDNA Relax jasně ukazuje, že tento protein patří do rodiny bHLH proteinů. Doména bHLH proteinu Relax sdílí s bHLH jednotkou proteinu NeuroD (Lee et al.

toho je zjevné,že Relax .sdílí více sekvenčních, identit s proteiny homologními k ato (Math-1, Akazawa et al., 1995) než s proteiny homologními k AS-C (Mash-1, Johnson· et al., 1990), viz obr. 2. Avšak úplná nepřítomnost sekvenční identity'mimo doménu bHLH s ostatními členy rodiny ukazuje na to, že Relax není paralogemf již existujícího proteinu. Z tohoto důvodu je Relax pravděpodobně prvním členem nové podrodíny proteinů bHLH.

φφ φφφφ ·· φ» • φ · φ φ φ · φ φφφ φφφ φ φ φφ φφ

- 15 Příklad 4

Charakteristika transkripční aktivity protein Relax

Analýzy aminokyselinových sekvencí ukázaly, že Relax sdílí společnou strukturu s proteiny rodiny bHLH. Tyto proteiny jsou transkripční faktory. Bylo proto důležité prokázat, že Relax cDNA kóduje protein, který má vlastnosti transkripčního faktoru·, čili že' Relax je schopen vázat se na DNA v cílovém místě bHLH faktorů a že je schopen regulovat transkripci.

1. Proteiny rodiny bHLH vytvářejí homo- a het.erodim.ery a váží se specificky na DNA (Murre et al.-, 1989, CE11, 558, 537-44). Charakterizace vazebných- míst in vitro umožnila identifikovat konvenční (konsensuální) hexanukleotidovou sekvenci CANNTG, nazývanou Ξ box (Murre et al., 1939). V pokusech s retardovanou migrací v gelu jsme prokázali, že purifikovaný rekombinantní protein Relax je schopen vázat se specificky na sekvenci , obsahující E box. Pro tento průkaz byla DNA kódující protein Relax vložena do míst Ndel a KpnI ve vektoru pFLAG-CTC. Po expresi proteinu v E. coli byl na afinitní koloně purifikován fúzrií protein Relax-Flag a pak byl užit ve vazebné reakcí za přítomnosti oligonukleotidu obsahujícího E box.

2. Transkripční aktivita proteinu Relax nebo jeho části byla testována pomocí kotransfekčních pokusů s buněčnou linií PC12 z f eoch-romocytomů potkana.

V těchto pokusech byl užit^ luciferázový reportérový - gen umístěný pod kontrolu promotoru obsahujícího jednak E box (5· kb TH promotoru) a nebo stejného, promotoru obsahujícího mutovaný E box.

• 949 9·· • 9 • 9 99 • 9 4 9

9 9 9

- Paralelně byl připraven vektor pro expresi proteinu Relax následujícím způsobem:

cDNA kóduj ící protein Relax (od polohy 389 do 1235) byla vložena do míst EcoRI a Xhol expresního, vektoru pcDNA3 downstream (po směru transkripce) od promotoru CMV. Promotor TH potkana nesoucí E box CAGGTC (sekvence id. č. 6) v poloze 197 na 5 kb fragmentu byl vložen do zatupeného místa HindlII plazmidu pKSLuc, čímž vznikl plazmid 5kbTH-Luc. Místo bylo mutováno 'na TCCGTG (sekvence id. č. 7) a. výsledný plazmid byl nazván 5kbTH(Delta E)-Luc.

Plazmid pcDNA3-Relax byl kotransfekován v různých množstvích od 0 do 5 pmol, po doplnění do 5 pmol prázdným vektorem pcDNA3, do buněk PC12 (10' buněk na misku) ve směsi s 1 pmol plazmidu 5kbTH-Luc, 5kbTH(Delta E)-Luc nebo pKSLuc. Kvůli vyhodnocení transfekční účinnosti bylo ’ použito ke kotransfekci také 0,2 pmol vektoru exprimujícíno gen kódující CAT (chloramfenikolacetylťransferázu) pod kontrolou promotoru

RSV.

Měření luciferázové aktivity, po kotransfekci těchto vektorů s rostoucím množstvím vektoru pro expresi protein

Relax, ukázala, že Relax aktivuje transkripci reportérového genu v závislosti na množství - použitého expresního vektoru, a že tato aktivace striktně vyžaduje přítomnost intaktního E boxu. '

Příklad 5

Charakterizace míst exprese Relax mRNA během embryonálního vývoje

Pomocí hybridizace in šitu jsme systematicky charakterizovali distribuci Relax mRNA v průběhu embryonálního vývoje u potkanů. Pro^ tento účel byla • · 4

4

Wilkinsona do. na řezech

44

4 •

• 4 ·' 4

4444 4

- 17 hybridizace ín šitu- prováděna' metodou dle s antí-sense ribosondami, a to buďto, ín toto net o síle 250- μη. Ribosohdy byly připraveny v přítomnosti 1 pg linearizovaného plazmidu a v přítomnosti 3,5 nmol'dioxygenin11-UTP pomocí soupravy pro ribosondy firmy Promega. Tyto podrobné analýzy ukázaly, že exprese Relax mRNA je- přechodná .a prostorově omezená.

Tato. mRNA je přítomna pouze v embryu, a .sice mezi vývojovými dny 11.5 a 18.5. Exprese ,je omezena na centrální nervový sytém. ,A skutečně žádná exprese nebyla detekována ani v periferním nervovém systému ani mimo nervový systém. V rámci CNS' je Relax mRNA exprimována pouze v míšea v předním a zadním mozku.

Podroběji lze říci, že Relax mRNA je exprimována v podélných kompartmentech míchy a zadního mozku. Distribuce v míše je·omezena na dva souvislé pásy s bilaterální symetrií podélně organizované.a omezené, v.ose D/V, na bazální vrstvu, a sice jeden na břišní a druhý na zádové straně.

V předním mozku je Relax mRNA lokalizována ve dvou skupinách buněk · na každé ' straně optického výběžku, na ventrální straně hypotalamu a v preoptické oblasti. Hlavní skupina buněk' exprimujících Relax je situována v bazální části. Pouze několik buněk v preoptické oblasti je situováno v křídlové oblasti. Situace v předním mozku je velmi podobná situaci v míše a zadním mozku. Buňky exprimující Relax jsou skutečně omezeny pouze na ventrikulární oblast.

44

4 4 4

444 444

- 18 * · · 4 4444·« • · 4 · « *'· 4 44 ··

Příklad 6

Charakterizace doby exprese Relax mRNA v průběhu embryonálního vývoje

Všechna místa 'exprese současně patří do období .Eli.5. Progresivně mizí z míchy mezi E16.5 a 18.5, podle ventrodorzálního gradientu, který sleduje progresivní redukci ventrikulární zóny. V zadním mozku exprese Relax mRNA ustává ve stejný okamžik jako ve středním pásu míchy. A konečně v předním mozku exprese Relax mRNA mizí po E18.5. Je důležité zdůraznit, že exprese Relax je vázána na ^: ventrikulární zónu a že časové období přechodné exprese souhlasí s. vytvářením neuronů v těchto různých strukturách.

• · ·· · · • ·

- 19 • · · • Μ ···

SEZNAM SEKVENCÍ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1491 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární '(ií) TYP MOLEKULY: cDNA (i-ii) HYPOTETICKÁ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A)ORGANISMUS: potkan • · ····

99

«» · · (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S. IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:

gcaggtagcgagaggagcagtccctgggccqccgttgctgattggaccgtggcacaggcagcagcccggcag 72 gcocgctcctggtccgggcagagcagataaagegtgccoggggacacocgattagctigctcogaógtccctc 144 tgggtctcaccactgcacagaggccgaggacccccřccgagcttctttgctgcctccagacgcaatttactc 216 caggagagggcgectgcggeteagcaaaacttcgaogcgagcagaggggttcagctatecaccgctgcttga 288 atctgaGcacccgaagctctctgttettttgagcccggagtaactaggtaacatttaggaacctccaaaggg 360 togaagaggggagtgggCgggčgtoctctagtcGGgcgtggagtgacctctaagtcagagacCgtcacaccc 432

M

A

P

H

P

L

P

A

P

T

I

11

GCCttGC:

attttttC'

ATC i

GCG

CCT CAT CCC

TTC GAT GCG i

CCC ACC 1

ATC

491

n

v

S

q

E

T

Q

í

f

P

G

A

3

P

H

Σ

V

29

CAA

GTC

TCC

CAA

GAG

ACC

CAG

CAA

ccc

TTT

CCC

GGA

GCC

TCG

'GAC

CAC

GAA

GTC

545

L

3

H

3

T

P

3

P

T

L

V

P

R

P

C

3

47

CTC

AGT

TCC

AAT

ICC

ACC

CCA

CCT

AGC

CCC

ACT

CTC

GTA

CCG

AGG

GAC

TCC

599

Σ

A

E

A

G

P

C

R

G

T

3

R

K

L

R

A

R

65

GAA

GCA

GAA

GCA

GGT

GAC

TCC

CGA

GGG

ACA

TCG

AGG

AAG

CTC

CGT

GCG

CGG

CGC

653

G

R

H

R

P

K

3

E

T,

A

L

3

K

0 '

R

3

83

GGA

GGG

CGC

AAC

fGG

ccc

AAG

AGC

GAG

TTC

GCA

CTC

AGC

AAG

CAG

CGA

AGC

707

R

K

A

H

P

R

E-

R

N

R

M

H

N

L

H

3

101

CGG

CGC

AAG

GCC

AAC

GAC

CGG

GAG

CGC

AAC

CGC

ATG

CAC

AAC

CTT

AAC

TCC

761

A

L

P

A

L

R

G

V

L

P

T

E

P

A

K

L

119

GCG

CTC

GAT

GCG

CTC

CGC

GGT

GTC

CTC

CCC

ACC

TTC

CCG

GAT

GAC

GCC

AAA

CTT

815

Φ

K

I

E

T

L

R

r

A

K

N

Y

X ,

W

A

L

T

Q

137

AGA

AAG

ATC

GAG

fCC

CTC

CGC

TTC

GCC

CAC

AAC

TAC

ATT

TCG

GCA

CTG

ACT

CAG

869

T

L

R

I

A

P

H

3

r

G

P

r

P

V

P

C

155

ACG

CTG

CGC

ATA

GCG

GAC

CAC

AGC

TTC

TAC

GGC

CCC

GAG

CCC

CCT

GTC

CCC

TCT

923

G

I

L

G

3

P

G

3

G

P

w

G

3

r

Y

173

GGG

GAG

CTG

GGA

AGC

CCG

GGA

GGG

GGC

TCC

AGC

GGC

GAC

TCG

GGC

TCT

ATC

TAC

977

3

P

V

3

0

A

G

S

L

3

P

T

A

3

L

E

. r

191

TCO

CCA

GIT

TCC

CAA

GCT

GGT

AGC

CTC

AGC

CCC

ACA

GCC

TCA

TTG

GAG

GAG, TTC

1031

P

G

L

0

V

P

3

• P

3

C

L

P

G

T

L

7

209

CCT

GGC

CTG

CAG

GTC

CCC

AGC

TCC

CCA

TCC

TCT

CTG

CTC

CCG

GGC

ACC

CTC

GTC

1085

Γ 3 P E L . 214 TTC TCA GAC TTC TTC tgaagggcccaaacaggccctgggcggtgggcgctggcagaaagggaggga 1151 gtaogagctgtctgaaacggaaggtagtggaggcactcgagcatctcgccccttctggctttcattagtcag 1223 gtccatgatttaaccaggattcgcacagttcc ťtgctgctgtgcgtgcacaaagqaoattgcaggctgatct 1295 cctettaaccctcetcagtgtggccacctcaoactcecgctccaagcagaggagagoagtagcactaaatag 1367 ttgggogactGCGatacttcctggtgactccgccctatttcaaotctgcgggcctccaaccaccgGtttctG 1439 cagagtgacctaatccogtgttgcgtcttacctcactggctcttgttceato 1491 ·· ftt • ··

- 21 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM. 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:· (A) DÉLKA: 24 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) . TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM. 2:

AATKHGMGIG AGCGCIDKCG CRYG 24 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 párů baží (B) TYP:.nukleová kyselina . (O) TYP VLÁKNA: jednoduché· (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne . (xi)' POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

GGCSRDTYTC AGGGTSYBGA YCTT • · ·

- 22 ·· 4444 ·· • · 4 · · • « 4 4 •4 · 4 4 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: .1 (A) DÉLKA: 25 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (Dj TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA , (iii) HYPOTETICKÁ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:

AACCTTAACT CCGCGCTGGA TGCGC 25 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

' (A) DÉLKA: 18 párů· baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:

CGCGGTGTCC TGCCCACC • · ·

- 23 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 6 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:

CAGGTG

(.2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 6 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne

TCCGŤG (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:

'·· 9 90 0

0 0

• 900

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Polypeptid typu bHLH projevující transkripční aktivitu, který sdílí sekvenční homologii s proteiny typu bHLH pouze na úrovni domény bHLH.
2. Polypeptid mající transkripční aktivitu, který je představován zcela nebo částečně- sekvencí id. č. 1 nebo kterýmkoliv jejím derivátem.
3. Polypeptid podle nároku 1 nebo 2, který obsahuje sekvenci id. č. 1.
4. Polypeptid podle nároku 1, 2 nebo 3, kterým je protein

Relax.
5. Sekvence nukleové kyseliny, která kóduje polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4.
6. Sekvence nukleové kyseliny, která je zcela nebo částečně představována sekvencí id. č. 1, jejím komplementárním řetězcem nebo jejím derivátem.
7. Sekvence nukleové kyseliny podle nároku 6, která je reprezentována sekvencí id. č. 1 nebo jejím komplementárním řetězcem.
8. Vektor, který obsahuje nukleotidovou sekvenci podle kteréhokoliv z nároků 5 až 7.
9. Vektor podle nároku 8, který je virový vektor.

- 25 ·· 4444 •4 44 • 4 4 4 • 4 4 4 •44 444

4 4
10. Vektor podle- nároku 9, který je vektor odvozený z adenovirů, retrovirů, virů AAV, HSV nebo CMV, nebo viru vakcinie.
11. Vektor podle kteréhokoliv z nároků 9 a 10, kterým je replikačně defektní virus.
12. Použití polypeptidů podle kteréhokoliv z nároků 1 až '4' k řízení exprese genů a/nebo k účasti na expresi genů.
13. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že ' obsahuje alespoň jednu sekvenci nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 5 až 7,· nebo jeden či několik vektorů podle'kteréhokoliv z nároků 8 až 11.
14. Farmaceutický přípravek vyznačující se t í m, že obsahuje alespoň jeden polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4.
15. Použití sekvence podle kteréhokoliv z nároků 5 až 7 nebo vektoru obsahujícího uvedenou . sekvenci pro přípravu farmaceutického přípravku k léčení patologických stavů zasahujících nervový systém.