CZ229999A3 - 1-arylpyrazoly a jejich soli, způsob jejich výroby, pesticidní prostředky obsahující tyto sloučeniny jako účinné látky a způsob hubení škůdců - Google Patents

Description

Enzym tepelně stálé DNA polymerázy, způsob jeho přípravy a kit, který ho obsahuje

Ob1 ast techni ky

Vynález se týká tepelně stálých polymeráz DNA, které mají zlepšenou schopnost začleňovat ribonukleosidové trifosfáty. Vynález se týká způsobu izolování takových polymeráz a zařízení k provádění tohoto způsobu. Enzymy podle vynálezu se hodí pro četná použití a zejména pro sekvencování nukleových kyselin. Vynález se také týká způsobu analyzování sekvencí nukleových kyselin.

Dosavadní stav techniky

Sekvencování DNA obecně zahrnuje vytváření čtyř populací jednořetězcových fragmentů DNA, majících jedno vymezené zakončení a jedno proměnlivé zakončení. Proměnlivé zakončení končí obvykle u specifických nukleotidových bází (buď guaninu ( G) , adeninu (A), thymidinu (T), nebo cytosinu (Cl). Každý ze čtyř rozdílných souborů fragmentů je oddělen na základě své délky. V jednom takovém postupu se používá polyakry1 am idového gelu. Každý pruh takového gelu odpovídá specifickému nukleotidu v sekvenci DNA a tím identifikuje polohu v sekvenci.

Často používaným způsobem sekvencování DNA je dideoxy, nebo řetězec ukončující způsob sekvencování, který zahrnuje enzymatickou syntesu řetězce DNA (Sanger a kol. Proč. Nati. Acad. Sci. 74, str. 5463, 1977). Obvykle probíhají čtyři oddělené syntesy, přičemž každá reakce končí na specifické bázi (G, A, T nebo C) cestou začlenění jednohoho nukleotidu zakončujícího řetězec, jako je dideoxynukleotid. Produkty reakce lze snadno interpretovat, jelikož každá linie odpovídá pouze jedné z G, A, T nebo C.

Při způsobu sekvencování dideoxy ukončováním řetězce je teplotně připojen k jednoprovazcové matici krátký jednoprovazcový primer. Primer je prodloužen na svém 3 -konci začleněním deoxynukleotidů ( dNTP), dokud se nezačlení dideoxynukleotid (ddNTP). Jakmile se začlení ddNTP, prodlužování v této bázi ustane. K zaručení věrnosti replikace DNA, mají polymerázy velmi silný sklon začleňovat své normální substráty, tedy dNTP, a oproti začleňování nukleotidových analogů se označují jako neobvyklé nukleotidy. V případě syntes DNA se považují ribonukleotidy (rNTP) za neobvyklé nukleotidy, jelikož podobně jako ddNTP nejsou rNTP normálním substrátem polymerázy DNA in vivo. V buňce tlumí tato vlastnost začleňování abnormálních bází jako jsou deoxyinosintri fosfát (dITP) nebo rNTP v rostoucím řetězci DNA.

Dvěma často používanými automatizovanými způsoby sekvěncování jsou sekvencování dye-primer a dye-terminator. Tyto způsoby se hodí k použití s fluorescenčně značenými podíly. Ačkoli lze sekvencování provádět také s radioaktivně značenými podíly, dává se zvýšenou měrou přednost sekvencování založenému na fluorescenci. Stručně řečeno, při sekvencování způsobem dye-primer se používá fluorescenčně značeného primeru v kombinaci s neznačeným ddNTP. Postup vyžaduje čtyři syntesní reakce a sekvencování až 4 linií gelu pro každou matrici (z nichž jedna odpovídá každému koncovému produktu pro specifickou bázi). Po rozšíření primeru se rutinním způsobem analyzují sekvencující reakční směsi obsahující dideoxynukleotidy začleněné koncové produkty e1ektroforézou na gelu sekvencujícím DNA. Po separaci elektroforézou, se laserem vybudí fluorescenčně značené produkty na dně gelu a fluorescence se detekuje vhodným monitorem. V automatizovaných systémech detektor snímá dno gelu v průběhu e1ektroforézy ke zjištění, jak velkého množství značeného podílu bylo použito, když reakční směs prochází gelovou matricí (Smith a kol. Nature 321 str. 674 až 679, 1986). V modifikaci tohoto způsobu se každý ze čtyř primerů značí odlišným fluorescenčním značením. Když se ukončí čtyři oddělené sekvenční reakce, reakční směs se spojí a spojené reakční směsi se podrobí analyse gelu v jediné linii, přičemž se indivi duelně detekují rozdílné fluorescenční značky (z nichž jedna přísluší každému ze čtyř různých, pro bázi specifických koncových produktů).

Alternativně so používá způsobu dye - term inator” . Při tomto způsobu se používá polymerázy DNA k začlenění do dNTP a fluorescenčně značených ddNTP do rostoucího konce primeru DNA (Lee s kol. Nucleic Acid Research 20, str. 2471, 1992). Tento způsob má tu výhodu, že se nemusejí syntetizovat barevně značené primery. Kromě toho jsou dye-terminátové reakce výhodnější v tom, že všechny čtyři reakce lze provádět v téže zkumavce. Modifikované tepelně stálé polymerázy DNA se sníženou diskriminací vůči ddNTP byly popsány (zveřejněná evropská přihláška vynálezu číslo ΕΡ-Ά-655 506 a americká přihláška vynálezu číslo 08/448 223). Příkladně modifikovaná tepelně stálá polymeráza DNA je mutovanou formou polymerázy DNA od T. aquaticus mající tyrosi nový zbytek v poloze 667 (místo fenylalaninového zbytku), je to tak zvaná F667Y mutovaná forma polymerázy Taq DNA. Ampli Tag^RFS, vyráběná firmou Hoffmann-La Roche, obchodní produkt společností Perkin Elmer, redukuje množství ddNTP potřebné k účinnému sekvencování nukleové kyseliny se sto- až tisíci-násobným cílem. Ampli Taq^RFS je mutovanou formou polymerázy DNA od T. aquaticus mající mutaci F667Y a přídavně zbytek asparagové kyseliny v poloze 46 (místo glyci nového zbytku; mutace G46D).

Existuje tedy potřeba tepelně stálých polymeráz DNA, které umožní alternativní způsoby syntesy nukleových kyselin a levnou analysu sekvence nukleových kyselin DNA. Žádoucí by byly fluorescenční způsoby, které nevyžadují použití dideoxynukleotidu. Vynález je zaměřen na tyto potřeby.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je enzym tepelně stálé polymerázy DNA, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci SerGlni1eXaaLeuArgXaa (SEQ ID No:11, kden Xaa v poloze 4 této sekvence je jakýkoli aminokyselinový zbytek, nikoli však zbytek glutamové kyseliny (Glu) a “Xaa“ v poloze 7 této sekvence je val inový zbytek (Val) nebo isoleucinový zbytek (Ile).

Vynález se týká na matrici závislých tepelně stálých DNA polymerázových enzymu, které zahrnují motiv aminokyselinové sekvence SerGlni1eXaaLeuArgXaa (SEQ ID No:1), kde Xaa v poloze 4 této sekvence je jakýkoli aminokyselinový zbytek, nikoli však zbytek glutamové kyseliny (Glu) a Xaa v poloze 7 této sekvence je val inový zbytek (Val) nebo isoleucinový zbytek (Ile). Při použití jednopísměnového kódu muže být tento sekvenční motiv zapsán jako SQ I XLRV/I, kde X v poloze 4 této sekvence je jakýkoli aminokyselinový zbytek, nikoli však zbytek glutamové kyseliny. Tepelně stálé DNA polymerázové enzymy, mající aminokyselinovou sekvenci zahrnující tento sekvenční motiv, kde X v poloze 4 této sekvence není zbytek glutamové kyseliny, mají sníženou diskriminaci oproti začlenění ribonukleotidu v porovnání s dříve známými tepelně stálými polymerázami . V rostoucím řetězci DNA jsou ribonukleotidy neobvyklými nukleotidy. Tudíž, z prvního pohledu, začleňují nové enzymy podle vynálezu neobvyklé základní analogy, jako ribonukleot idy, do rostoucího řetězce DNA o několik řádů účinněji než dříve i dent ifinované tepeně stálé DNA syntetizující enzymy. Vynález se také t^ká genů kódujících tyto enzymy, stejně jako rekombinantních expresních vektorů a hostících buněk obsahujících tyto vektory. U takových transformovaných hostících buněk mohou být zajištěna velká množství vyčištěných tepelně stálých polymerázových enzymů.

Vynálezem je definována oblast nebo sekvenční motiv v aminokyselinové sekvenci tepelně stálých DNA polymeráz, která zlepšuje účinnost schopnosti polymerázy začleňovat ribonukleotidy při zachování schopnosti spolehlivě začleňovat deoxyribonukleotidy. Změny v této oblasti, například výměny jedné nebo několika kyselin (například zavedených mutagenesou specifickou pro místa), poskytují tepelně stálý polymerázový enzym, který je schopen syntetizovat chimérický nebo hybridní řetězec RNA nebo RNA/DNA na matrici DNA.

Vynález se dále týká zkepšených způsobů a prostředků k určování sekvence cílové nukleové kyseliny, přičemž je vyloučena potřeba ddNTP k ukončení řetězce. Zde poskytovaným způsobem jsou ribonukleotidy (rNTP) začleňovány do produktů primerní extense. Jelikož subjektové enzymy začleňují přesně a účinně rNTP nebo dNTP, mohou sekvenční reakce využít směsí obou nukleotidů. Po primerní extensi se mohou vklínit nově syntetizované oligonukleotidové produkty u začleněných rNTP způsoby známými ze stavu techniky, například hydrolysou, čímž vytvoří populaci fragmentů, vhodných pro fraktionaci a sekvenční analysu konvenčními prostředky, jako je gelová elektroforéza. Tyto způsoby využívají zde poskytovaných nových enzymů tepelně stálé polymerázy. Z tohoto hlediska se vynález týká tepelně stálých DNA polymerázových enzymů, které se vyznačují tím, že polymeráza obsahuje rozhodující motiv SerGlnIleXaaLeuArgXaa (SEQ ID No:D , kde Xaa” v poloze 4 této sekvence může být jakýkoli aminokyselinový zbytek, nikoli však zbytek glutamové kyseliny (Glu) a Xaa·' v poloze 7 této sekvence je valinový zbytek (Val) nebo isoleucinový zbytek (Ile).

Podle vynálezu poskytuje zde popsaná modifikovaná polymeráza prostředky k začleňování ribonukleotidů nebo analogu obsahujících hydroxylovou skupinu nebo jinou substituci v poloze 2 , která chybí v běžných deoxyribonukleotidech. Tyto nukleotidy mohou být odlišně značeny, což zajistí alternativy vůči běžnému použití dideoxynuk1eotidú pro aplikace sekvencování DNA.

Mutantní tepelně stálé polymerázové enzymy podle vynálezu se vyznačují schopností účinněji začleňovat nekonvenční nukleotidy, zejména ribonukleotidy, než odpovídající enzymy divokého typu. Ve výhodném provedení vynálezu, muže být nekonvenčním začleňovaným nukleotidem analog báze zakočující řetězec, jako je 2 -hydroxy-3 -deoxy ATP (kordycepin tri fosfát) riboterminátorový analog ATP, nebo řetězec nezakončující nukleotid jako je rNTP.

Vynález se dále týká mutantních tepelně stálých polymerázových enzymu, které se vyznačují schopností účinněji začleňovat nekonvenční nukleotidy, zejména ribonukleotidy, než odpovídající enzymy divokého typu. Z tohoto hlediska poskytuje vynález rekombinantní tepelně stálé DNA polymerázové enzymy, z nichž každý se vyznačuje tím, že (a) ve své nativní formě obsahuje polymeráza aminokyselinovou sekvenci SerGlnl1eGluLeuArgXaa (SEQ ID No=2), kde Xaa“ v poloze 7 této sekvence je valinový zbytek (Val) nebo isoleucinový zbytek (lie); (b) aminokyselinová sekvence je mutována na rekombinantní enzym, s výhodou v poloze 4 této sekvence, takže zbytek glutamové kyseliny v poloze 4 je jiným aminokyselinovým zbytkem, s výhodou glycinovým zbytkem; (c) rekombinantní enzym má sníženou diskriminaci vůči začleňování ribonukleotidu a ribonukleotidových analogu v porovnání s nativní formou uvedeného enzymu.

Vynález se dále týká tepelně stálé polymerázy jako vhodného prostředku k fragmentování produktů zesílení a příměrových extensních produktů; takové fragmentované produkty mohou být užitečné při metodologiích založených na hybridizaci a při řadě strategií detekce sekvencí.

Enzymy podle vynálezu a geny, které je kódují, mohou sloužit k zajištění prostředků pro použití v reakcích sekvencujících DNA, které představují směs běžných nukleotidů a nejméně jednoho ribonuk1eotidu nebo ribonukleotidového analogu. Ve výhodném provedení vynálezu je nekonvenčním nukleotidem ribonukleotid a koncentrace ribonuklotidu je nižší než odpovídající koncentrace deoxyribonukleotidu, tedy poměr rNTP:dNTP = 1:1 nebo menší. Enzymy podle vynálezu se hodí také ke komercializaci v podobě kitů, přičemž kity mohou také obsahovat kterýkoli z následujících prvků potřebných pro sekvenční reakce nukleové kyseliny, jako jsou například dNTP, rNTP, pufry a/nebo primery.

Vynález se týká nových a zlepšených tepelně stálých DNA polymerázových enzymů, prostředků a kitů dále definovaných. Enzymy podle vynálezu daleko účinněji začleňují nekonvenční nukleosidové tri fosfáty než dosud známé polymerázy nebo odpovídající polymerázové enzymy divokého typu odvozené z těchto nových polymeráz. Poskytovány jsou také sekvence DNA kódující tyto modifikované enzymy, vektory k expresování modifikovaných enzymů a buňky transferované takovými vektory. Enzymy podle vynálezu umožňují provádění způsobů sekvencování nových DNA, což je pokrok oproti sekvenčním postupům DNA známým ze stavu techn i ky.

Pro usnadnění pochopení vynálezu, jsou jednotlivé pojmy def i novány.

Pojem konvenční (obvyklý), použitý ve vztahu k bázím nukleových kyselin, nuk1eosidovým tri fosfátům, nebo nukleosidům se vztahuje k přírodně se vyskytujícím v popsaných polynukleotidech (například pro DNA to jsou dATP, dGTP, dCTP a dTTP). Přídavně se používají často v 7dGTP a dITP místo dGTP (ačkoli začleňované s nižší účinností) u in vitro DNA syntesních reakcí, jako je sekvencování. Souborně je lze nazývat jako deoxyribonukleotidové tri fosfáty (d(NTP)) .

Pojem expresní systém se týká DNA sekvencí, obsahujících požadované kódovací sekvence v operativní vazbě, takže hostící buňky, transformované těmito sekvencemi, jsou schopné produkovat zakódované proteiny. K provádění transformace může být expresní systém zahrnut ve vektoru, avšak relevantní DNA může být též integrována v chromosomu hostící buňky.

Pojem gen se vztahuje k sekvenci DNA, která obsahuje řídicí a kódující sekvence, potřebné pro produkci získatelného bioaktivního polypeptidu nebo prekurzoru. Polypeptid může být zakódován genovou sekvencí plné délky nebo částí kódovací sekvence, tak dlouhé jak je zachována enzymatická aktivita.

Pojem hostující buňka (nebo buňky) se týká jak jednobuněčného prokaryotového tak eukaryotového organismu, jako jsou bakterie, kvasinky, a aktinomycetes, tak jednotlivých buněk rostlin nebo živočichu vyššího řádu, pěstovaných v buněčné kultuře.

Zde používané označení DNA sekvencující reakční směs se týká reakční směsi, jež obsahuje prvky potřebné pro sekvenční reakci DNA. DNA sekvencující reakční směs je tedy vhodná k použití v sekvenční metodě DNA k určení sekvence nukleových kyselin cíle, ačkoli reakční směs může být zpočátku neúplná, takže iniciaci sekvenční reakce ovládá uživatel. Při tomto způsobu může být reakce iniciována, jakmile se přidá koncový element, například enzym, k zajištění úplnosti DNA sekvencující reakční směsi. DNA sekvencující reakce obsahuje zpravidla pufr, vhodný pro polymerizačni aktivitu, nukleosidové trifosfáty a alespoň jeden neobvyklý nukleotid. Reakční směs může také obsahovat primer vhodný k extensi cíle polymerázovým enzymem, polymerázu a cílovou nukleovou kyselinu. Buď primer nebo jeden z nukleotidů je obvykle značen detekovate1ným podílem jako je fluorescenční značení. Obecně je reakční směs směsí obsahující čtyři obvyklé nukleotidy a alespoň jeden neobvyklý nukleotid. Ve vhodném provedení vynálezu je polymeráza tepelně stálá polymeráza DNA a neobvyklým nukleotidem je ribonukleotid

Zde používaný pojem oligonukleotid je definován jako molekula sestavená ze dvou nebo z několika deoxyribonukleotidu nebo ribonuk1eotidů, s výhodou z více než bří a obvykle z méně než 10. Přesná velikost. ol igonukleotidu závisí na mnoha činitelích, včetně koncové funkce nebo použití oligonukleotidu.

igonukleotidy se mohou připravovat vhodným způsobem, včetně například klonováním, nebo restrikcí příslušných sekvencí a přímou chemickou syntesou způsobem, jako je fosfotriesterový způsob (Narang a kol. Meth.Enzymol. 68, str. 90 až 99, 1979), fosfodi esterový způosb (Brown a kol . MeLh. Enzymol. 68, str. 109 až 151, 1979), způsob diethylfosforamiditový (Beaucage a kol. Tetrahedron Lett.22, str. 1859 až 1862, 1981), tri esterový způsob (Mateucci a kol. J. Am. Cbem. Soc. 103,str. 3185 až 3191, 1981) způsob automatizované syntézy nebo způsob pevné podložky (americký patentový spis číslo 4 458 066).

Zde používané označení primer se vztahuje k oligonukleotidu, ať přírodnímu nebo syntetickému, který je schopen působit jako místo iniciace syntesy, je-li umístěn za podmínek, ve kterých se extense primeru iniciuje. Primerem je s výhodou oligodeoxyribonuk1eotid s jedním řetězcem. Přiměřená délka primeru závisí na záměru použití primeru, avšak obvykle je 15 až 35 nukleotidů. Krátké primerové molekuly vyžadují obvykle nižší teploty k vytvoření dostatečně stabilního komplexu hybridů s matricí. Primer nemusí reflektovat přesnou sekvenci matrice, avšak musí být dostatečně komplementární k vytváření hybridů s matricí, aby mohlo nastat prodloužení primeru.

Primer může být popřípadě značen vnesením značkovacího činidla detekovatelného spektroskopicky, fotochemicky, biochemicky, imunochemicky, nebo chemicky. Vhodným značkovacím činidlem jsou například 32p, fluorescenční barviva, reakční činidla s hustými elektrony, enzymy (jako běžně používané v ELISA), biotin nebo hapteny a proteiny, pro něž jsou k disposici antiséra nebo nonoklonální protilátky.

Označení tepelně stálá polymeráza se vztahuje k enzymu, který je stálý za tepla, je odolný vůči teplu a zachovává si postačující aktivitu k ovlivnění reakcí extense primeru pokud je podroben zvýšeným teplotám po dobu potřebnou k ovlivnění denaturace nukleových kyselin se dvěma řetězci. Jak je zde použita, je tepelně stálá polymeráza vhodná k použití v reakcích cyklicky měnících teplotu, jako je polymerázová řetězcová reakce (PCR = polymerase chain reaction). U tepelně stálé polymerázy enzymatická aktivita znamená katalysu kombinace nukleotidu správným způsobem k vytvoření produktů extense primeru, které jsou komplementární s řetězcem matricové nukleové kyse1 i ny.

Tepelné podmínky nutné k denaturaci nukleové kyseliny závisejí například na koncentraci soli v pufru a na složení a délce nukleových kyselin, jež jsou denaturovány, avšak typickým rozmezím teplot je přibližně 90 až přibližně 105 C, s výhodou 90 až 100 C po dobu závisející hlavně na teplotě a na délce nukleové kyseliny, obvykle několik sekund až čtyři minuty.

Výrazy jako neobvyklý nebo modifikovaný, jsou-li použit.y k definování báze nukleové kyseliny, nukl eos i dového tri fosfátu, nebo nukleotidu, zahrnují modifikaci, derivaci nebo analogy obvyklých bází, nebo nukleotidů, které se přirozeně vyskytují v DNA. Blíže, jak je zde použito, jsou neobvyklé nukleotidy modifikovány v poloze 2 ribosového cukru v porovnání s obvyklými dNTP. Tudíž, ačkoli pro RNA jsou přírodně se vyskytujícími nukleotididy ribonukleotidy (například ATP, GTP, CTP, UTP kolektivně rNTP), jelikož tyto nukleotidy mají hydroxylovou skupinu v poloze 2 cukru, která pro porovnání v dNTP chybí, jak zde použito, jsou ribonukleotidy neobvyklými nukleotidy. Do rozsahu vynálezu spadají ribonukleidové analogy ma jící substituce v poloze 2 , jako jsou 2 -fluoro- nebo 2 -aminosubstituované analogy. Přídavně mohou být ribonukleotidové analogy modifikovány v poloze 3 , například nahražením normální hydroxylové skupiny vodíkovou skupinou (3 -deoxy), poskytující terminátor ribonukleového analogu. Takové nukleotidy jsou do rozsahu vynálezu také zahrnuty pod pojmem neobvyklé nukleotidy.

Jelikož DNA se obvykle skládá 2 dNTP, začlenění rNTP by bylo neobvyklé a tudíž rNTP by byla neobvyklá báze. V důsledku toho, ve vhodném provedení vynálezu, pro metody extense primeru DNA včetně metod sekvencování DNA, obsahují produkty nukleových kyselin jak obvyklé, tak neobvyklé nukleotidy, kterými jsou rNTP.

Neobvyklé báze mohou být fluorescenčně značeny, například f1uoresceinem nebo rhodaminem; nefluorescenčně značené, například biotinem; isotopicky značené například 32p33p nebo ³⁵S; nebo neznačené.

K lepšímu pochopení vynálezu je dále pojednáno o specifických tepelně stálých DNA polymerázových enzymech, kterých se vynález týká; avšak toto pojednání rozsah vynálezu nijak neovlivňuje. Polde výhodného provedení vynálezu je tepelně stálých enzymu použito v různých způsobech sekvencování nukleových kyselin, ačkoli je možno zde popsaných nových tepelně stálých polymeráz použít k jakémukoli účelu, kdy je aktivita takového enzymu nutná nebo žádoucí. Enzymů lze také použít v zesilovacích reakcích, jako je PCR.

Tepelně stálé polymerázy podle vynálezu se vyznačují tím, že každá obsahuje rozhodující motiv SerGlni1eXaaLeuArgXaa (SEQ ID No:1), kde Xaa v poloze 4 této sekvence je jakýkoli aminokyselinový zbytek, nikoli však zbytek glutamové kyseliny (Glu) a “Xaa v poloze 7 této sekvence je valinový zbytek (Val) nebo isoleucinový zbytek (lie). Geny kódující tepelně stálé polymerázy, které mají zbytek glutamové kyseliny v poloze 4 uvedeného motivu, mohou být modifikovány, jak je zde popsáno k zajištění vhodně modifikovaných polymerázových enzymu. Uvedené tepelně stálé polymerázové enzymy se vyznačují tím, že ve srovnání s odpovádajícími nativními enzymy nebo s enzymy divokého typu, mají modifikaci v motivu aminokyselin SerGlnIleGluLeuArgXaa (SEQ ID No:2), kde Xaa v poloze 7 této sekvence je val i nový zbytek (Val) nebo isoleucinový zbytek (lie), tedy motiv byl modifikován nahražením zbytku glutamové kyseliny v poloze 4 jiným aminokyselinovým zbytkem. Rozhodující motiv tepelně stálé DNA polymerázy podle vynálezu je vyznačen dále pomocí konvenčního jednopísměnkového kódu (Lehninger, Biochemistry, New York, New York, Worth Publishers, Inc. str. 67, 1970).

SEQ ID No :1 SerGlni1eXaaLeuArgXaa kde Xaa v poloze 4 této sekvence je jakýkoli aminokyselinový zbytek, nikoli však zbytek glutamové kyseliny (Glu) a Xaa“ v poloze 7 této sekvence je valinový zbytek (Val) nebo isoleucinový zbytek (Tle).

Jak kódující genové sekvence, tak proteiny obsahující tuto rozhodující aminokyselinovou sekvenci, kde Xaa v poloze 4 této sekvence není zbytek glutamové kyseliny (Glu), poskytují polymerázu mající klesající diskriminaci vůči rNTP a jsou v rozsahu vynálezu. Uvnitř rozhodujícího motivu mohou být provedeny další modifikace, pokud jde o jiné aminokyselinové zbytky v tomto rozhodujícím motivu, s výhodou vzhledem k aminokyselinovým zbytkům ze skupiny glutaminu (Glu neboli Q), leucinu (Leu neboli L), nebo argininu (Arg neboli R).

Vynález se hodí k přípravě tepelně stálých DNA polymerázových enzymů s vynikajícími vlastnostmi příslušnou modifikací genové sekvence kódující tepelně stálou DNA polymerázu. Ve výhodném provedení vynálezu jsou genová sekvence a zakódovaný enzym odvozeny od druhů Thermus, ačkoli vynález zahrnuje eubakterie non-Thermus, jak bude dále popsáno. Obdobně s ohledem na vysoce konzervovanou povahu nyní identifikovaného rozhodujícího motivu, se mohou identifikovat nové tepelně stálé DNA polymerázy na základě své homologie, například polymeráza Taq. Takové tepelně stálé polymerázy jsou v rozsahu vynálezu, pokud jejich sekvence obsahuje motiv SQ I X L R V/I, kde X je jakýkoli aminokyselinový zbytek, nikoli však zbytek kyseliny glutamové a jejichž aminokyselinové sekvence činí nejméně přibližně 39 %, s výhodou nejméně přibližně 60 %, výhodněji alespoň přibližně 80 % celkové homologie (sekvencové identity) ve srovnání s aminokyselinovou sekvencí nativní polymerázy Tag. Úplná délka sekvence uvedené polymerázy Tag je uvedena ve W0 89/06691 a je dostupná pod číslen P90556 v databance patentovaných sekvencí GENESCO nebo pod číslem M26480 v databance patentovaných sekvencí EMBL a pod číslem 133530 v databance patentovaných sekvencí PIR.

Příkladně jsou tepelně stálé DNA polymerázy podle vynálezu rekombinantními deriváty nativních polymeráz organismu, jejichž seznam je v tabulkce I. Tabulka I vyznačuje jednotlivé sekvence rozhodujícího motivu a polohu zbytku X pro každou z těchto nativních polymeráz. Jelikož každá tepelně stálá polymeráza DNA je jedinečná, je poloha aminokyseliny v rozhodujícím motivu odlišná pro každý enzym. U polymeráz, jejichž seznam je dále uveden, je aminokyselinovým zbytkem v poloze X rozhodujícího motivu S Q I X L R V/I glutamová kyselina. Výhodné polymerázy podle vynálezu mají molekulovou hmotnost 85 OOO až 105 000, s výhodou 90 000 až 95 000. Aminokyselinová sekvence těchto polymeráz sestává přibližně ze 750 až 950 aminokyselinových zbytků, s výhodou z 800 až 850 aminokyselinových zbytků. Polymerázy podle vynálezu mohou také sestávat z 540 nebo z více aminokyselin a zahrnovat nejméně polymerázovou doménu a část odpovídající 3 až 5 exonukleázové domény (výsledná polymeráza může mít popřípadě exonukleázovou aktivitu 3 až 5 ) a případně části 5 až 3 exonuk1eázové domény, která je obsažena v první třetině aminokyselinové sekvence mnoha tepelně stálých polymerázových enzymů s plnou délkou.

U tepelně stálých DNA polymeráz, jež nejsou uvedeny v tabulce I, je identifikace příslušné glutamové kyseliny pro modifikaci snadná, jakmile je identifikován rozhodující motiv nebo dohodnutý motiv aminokyselinové sekvence.

Bez ohledu na přesné umístění uvnitř tepelně stálé polymerázy DNA, slouží nahražování zbytku glutamové kyseliny (Glu) zbytkem jiné kyseliny v sekvenčním motivu SerGlni1eGluLeuArgXaa (SEQ ID NO: 2), kde Xaa v poloze 7 této sekvence je váli nový zbytek (Val) nebo isoleucinový zbytek (lie) polymerázové domény, k zajištění tepelně stálých polymeráz majících schopnost účinně začleňovat neobvyklé nukleotidy. Ve výhodném provedení je glutamová kyselina nahražena aminokyselinou maj í cí nenabitou polární skupinu R, jako je serin, glycin, cystein, threonin nebo aminokyselinou mající malou nepolární skupinu R, jako například alanin. V nejvýhodnějším provedení je zbytek glutamové kyseliny nahražen glycinovým zbytkem (G) Programy seřazení aminokyselin a nukleových kyselin jsou k dostání od Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin. Při daném zvláštním, zde identifikovaném motivu, slouží tyto programy, včetně například GAP”, BESTFIT a PILEUP k nápomoci při identifikaci přesného úseku sekvence, který má být modifikován.

Jak vyplývá z tabulky I, jsou v podstatě dve formy konzervovaného sekvenčního motivu SerGlní1eGluLeuArgXaa (SEQ ID NO: 2) v polymerázové doméně enzymů tepelně stálých polymeráz DNA z termofilních organismů. Sekvenční motiv SerGlnlleGluLeuArgVal (SEQ ID N0'-3) je přítomen v nativních tepelně stálých polymerázách z druhu Thermus, jako například Thermus aquaticus, Thermus ca1dophilus, Thermus thermophilus, Thermus flavus a Thermus filiformis stejně jako z druhů Thermus sps 17 a Z05.

Sekvenční motiv SerGlnlleGluLeuArgVal (SEQ ID N0 = 3) je obsažen v doméně polymeráz jiných tepelně stálých DNA polymerázových enzymů, například z Thermosipho africanus a z různých kmenů Bacillus, jako je Bacillus caldotenax a Bacillus stearothermophi 1us. Sekvenční motiv SerGlni1eGluLeuArgl1e (SEQ ID NO ^; 4) je obsažen v nativních tepelně stálých polymerázách z Thermotoga maritima, z Thermotoga neapolitana a z Anaerocellum thermophi1 um .

Tabulka I

Organ i smus

Am i nokyse1 i nový dohodnutý motiv

Poloha glutamové kyseliny

	S Q I X L R V/I
Thermus aquaticus (Taq)	S QIELRV	615
Thermus caldophilus (Tea)	S QIELRV	617
Thermus thermophilus (Tth)	S QIELRV	617
Thermus flavus (Tfl)	SQIELRV	616
Thermus filiformis (Tfi)	S QIELRV	613
Thermus specie spsl7	SQIELRV	613
Thermus specie Z05	SQIELRV	617
Thermotoga maritima (Tma)	S QIELRI	678
Thermotoga neapolitana (Tne)	S QIELRI	678
Thermosipho africanus (Taf)	SQIELRV	677
Anaerocellum thermophilum (Ath)	S QIELRI	632
Bacillus caldotenax (Bca)	SQIELRV	659
Bacillus stearothermophilus (Bst)	SQIELRV	658, 661, or 736*

x v závislosti na zvolené aminokyselinové sekvenci (viz dále)

Úplné sekvence nukleových a aminokyselin pro každou polymerázu Taq, Tth, Z05, sps!7, Tma a Taf byly publikovány v americkém patentovém spise číslo 5 466 591. Sekvence DNA po16 lymerázy z Tea, Tfl, Tne, Ath, Bca a Bst byly publikovány takto: Tea v bance sekvencí EMBL pod číslem U62584 (viz též Kwon, Mol. Cells 7(2), str. 264 až 271, 1971), Tfl v článku Akmetzjanov a Vakhinov (Nucleic Acids Research 20 (21), str. 5839, 1992), Tne ve WO 97/09451 a WO 96/41014, Ath v bance sekvencí pod číslem X98575 (podrobnosti o řetězci Ath viz Rainey a kol. J. Bacteriol. 175 (15), str. 4772 až 2779, 1993), Bst (Uemori a kol. J.Biochem. 113, str. 401 až 410, 1993) a pod číslem U23149 v bance sekvencí EMBL (viz též Phang a kol. Gene 163, str. 65 až 68, 1995). Aminokyselinové sekvence polymerázy Bst, obsahující E v rozhodujícím motivu v poloze 658 jsou též popsány (japonský patentový spis číslo JP 05/3P4 964A, evropská zveřejněná přihláška vynálezu číslo EP-A-699 760 a Aliott a kol. Genet. Anal. 12, str. 185 až 195, 1996); sekvenci lze také získat v bance sekvencí EMBL pod číslem U 533536. Sekvence publikovaná v Gene 163, str.65 až 68 (1995) obsahuje E rozhodujícího motivu ve zbytku čísle 661. Bca v článku Uemori a kol. (J. Biochem. 113, str. 401 až 410, 1993) a v bance sekvencí EMBL pod číslem D 12982. Tepelně stálé DNA polymerázy od Thermus filiformis (FEMS Microbiol. Lett. 22, str. 149 až 153, 1994, také k dostání od ATCC depositní číslo 43280) lze získat způsobem podle amerického patentového spisu číslo 4 889 818 i na základě informace o sekvencích v tabulce I. Homologie sekvencí (identita sekvencí) mezi aminokyselinovou sekvencí nativní formy polymerázy Tag, jak je popisována ve W0 89/06691 u shora zmíněné polymerázy Tfl je nad 87,4 %. Odpovídající homologie vzhledem k polymeráze Tth je 87,4 %, vzhledem k polymeráze Tea je 86,6 %, vzhledem k polymeráze Bst (číslo U 23149) je 42 %, vvzhledem k polymeráze Bca je 42,6 % a vzhledem k polymeráze Ath je 39,7 %.

Jak tabulka I ukazuje, je rozhodující motiv pozoruhodně konzervován mezi tepelně stálými polymerázami . V případě, kdy znamená “X zbytek glutamové kyseliny, poskytuje záměna genu kódujícího polymerázový enzym podle vynálezu, který právě za17 čleňuje rNTP v porovnání například s polymeráaou Taq, kde rozhodující motiv není modifikován. Vynález se tedy týká tříd enzymu, které zahrnují například tepelně stálou DNA polymerázu a odpovídající genové a expresní vektory od Thermus oshimai (Williams a kol. Int. J. Sys. Bacteriol. 46 (2), str. 403 až

408, 1996); Thermus silvanus a Thermus chliarophi1us (Tenreiro a kol., Inst. J. Syst. Bacteriol. 45 (4),str.633 až 639, 1995); Thermus scotoductus (Tenreiro a kol., Res. Microbiol. 146 (4), str.315 až 324, 1986) a Thermus ruber, Loginov a kol. (Int. J. Sys. Bacteriol. 34, str. 498 až 499, také k dostání od ATCC deposit č. 35948). Přídavně vynález zahrnuje například modifikované formy tepelně stálých DNA polymeráz a odpovídající genové a expresní vektory od Thermotoga elf i i (Ravot a kol. , Inst. J. Syst. Bacteriol. 45 str. 312, 1995, také k dostání od ATCC deposit 9442) a Thermotoga thermarum (Windberger a kol. Inst. J. Syst. Bacteriol. 42 str. 327, 1992, také k dostání od ATCC deposit č.5069).

Ve výhodném provedení vynálezu je rozhodující motiv modifikován uvnitř aminokyselinové sekvence LeuAspTyrSerGlnlleGluLeuArgValLeuAlaHisLeuSer (SEQ UD N0:5). Vynález se tedy týká také generování mutantú tepelně stálé DNA polymerázy majících značně zvýšenou účinnost k začleňování neobvyklých nukleotidů způsobem závislým na matrici. V obzvlášť výhodném provedení zahrnuje polymerázová sekvence LeuAspTyrSerGlnlleGlyLeuArgValLeuAlaHisLeuSer (SEQ UD N0=6). Takové tepelně stálé DNA polymerázy se hodí obzvláště pro procesy jako je sekvencování DNA, syntesa RNA, řízení DNA, a in vitro syntesa rNTP substituované DNA.

Produkce tepelně stálých DNA polymeráz se zlepšenou účinností k začleňování neobvyklých bází se může uskutečnit procesy, jako je místně cílená mutageneze (například Sambrok a kol., Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, druhé vydání, kapitola 15.51,“01 igonucleotide-Médiated Mutagenesis 1989). Například mutace A na G ve druhé poloze kodon kódující glutamové kyseliny u zbytku 615 v genové sekvenci polymerázy DNA Thernus aquaticus (Taq) (viz SEQ ID NO:7) vede k více než 500-násobnému zvýšení účinnosti při začleňování neobvyklých nukleotidů, jak jsou zde definovány, při zachování schopnosti enzymu zprostředkovat PCR v přítomnosti obvyklých nukleotidů, například dNTP. Polymeráza DNA Taq této příslušné mutace vede ke změně aminokyseliny E (glutamové kyseliny) na G (glycin). Ačkoli tato příslušná změna aminokyseliny mění významně schopnost enzymu začleňovat neobvyklé nukleotidy, má se zato, že nahrazení zbytku glutamové kyseliny jinými zbytky aminokyselin jako například šeřinu, cysteinu, threoninu, alaninu, val inu nebo leucinu, má stejný účinek. Jiné substituce aminokyselin, které nahražují E615 jsou proto v rozsahu vynálezu, ačkoli E615G představuje výhodné provedení. Rozhodujícím význakem vynálezu tedy je, še ve čtyřech aminokyselinových zbytcích v motivu SEQ ID NO:1 není zbytek glutamové kyseliny.

Místně cílená mutageneze se můše provádět také mutagenezí cílenou na primer specifický pro místo. Tato technika je nyní v oboru standardní a provádí se použitím syntetického oligonukleotidového primeru komplementárního s jednořetězcovým fágem DNA podrobeným mutagenezi s výjimkou omezeného chybného uspořádání představujícího požadovanou mutaci. Stručně řečeno, syntetického oligonukleotidu se použije jako primeru k zacílení syntesy řetězce komplementárně na plasmid nebo fág a výsledná dvouřetězcová DNA je transformována na bakteriofág podporující hostující bakterie. Výsledné bakterie lze pak zkoumat například analysou sekvencí DNA nebo sondovou hybridizací k identifikování destiček nesoucích požadované sekvence mutovaného genu. Alternativně lze použít metod genového inženýrství, které jsou popsány v PCR Protocols, San Diego, Academic Press, vydavatelé Innis a koi. 1990 v kapitole 22 s názvem Recombinant PCR, Higuchi, str. 166 až 183.

Jak je v tabulce I ukázáno, je glutamová kyselina v rozhodujícím motivu polymerázy Taq konzervována v jiných tepelně stálých DNA polymerázách, muže však být umístěna v jiné, avšak sousední aminokyselinové sekvenci. Mutace konzervovené glutamové kyseliny uvnitř SEQ ID NO ’ 2 druhu Thermus tepelně stálých polymeráz DNA a příbuzných druhu Theromotoga, Thermospipho a Anaerocellum polymeráz DNA, bude mít stejný zlepšující účinek na schopnost polymerázy účinně začleňovat neobvyklé nukleotidy ve srovnání s polymerázou Taq obsahující SEQ ID NO:2.

Mutace zbytku glutamové kyseliny s rozhodujícím motivem, aby mohlo být dosaženo tepelně stálých polymeráz DNA, využívají principů a technik používaných v místně cílené mutagenese. Pro polymerázu DNA Bacillus stearothermophi1us je několik sekvencí v databázích GeneBank a SwissProt/PIR. Tyto sekvence jsou vysoce příbuzné, avšak poněkud se od sebe odlišují, avšak každá obsahuje identický rozhodující motiv sekvence SerGlnlleGluLeuArgXaa (SEQ ID NO: 2), kde “Xaa v poloze 7 této sekvence je val inový zbytek (Val) nebo isoleucinový zbytek (Ile), ačkoli v jiném místě sekvence.

Na základě veřejně dostupné informace o sekvencích aminokyselin a nukleových kyselin pro tepelně stálé DNA polymerázy, je možno běžnými rekombinantními metodami konstruovat chimérické polymerázy, které sestávají z domén odvozených od odlišných tepelně stálých polymeráz DNA. V amerických patentových spisech číslo 5 466 591 a 5 374 553 jsou popsány metody k zaměňování různých funkčních segmentů tepelně stálých polymeráz, jako 5 až 3 exonukleázovou doménu a 3 až 5 exonukleázovou doménu a po1ymerázovou doménu k vytváření nových enzymů. Výhodné enzymy chimérických tepelně stálých polymeráz obsahují 5 až 3 exonukleázovou doménu a 3 až 5 exonukleázovou doménu, přičemž jedna doména je odvozena od odlišné polymerázy a polymerázová doména obsahuje rozhodující motiv sekvence SerGlnlleXaaLeuArgXaa (SEQ ID NO:1), kde “Xaa” v poloze 4 této sekvence není glutamový zbytek (Glu) a Xaa v poloze 7 Léto sekvence je val inový zbytek (Val) nebo isoleucinový zbytek (Ile). Příklady takových chimérických molekul jsou chimérické enzymy Taq/Tma, které jsou složeny jak uvedeno v tabulce II. Jak z této tabulky vyplývá, obsahuje polymerázová doména těchto chimérických enzymu Taq/Tam mutaci v rozhodujícím shora uvedeném motivu.

Tabulka II

	5 až 3' exonukleázová doména	3 až 5' exonukleázová doména	polymerázová doména
Taq	aa.	1 -289	aa. 290-422	aa. 423-832
Tma	aa .	1 -291	aa. 292-484	aa. 485-893
Taq/Tma	aa.	1-289(Taq)	aa.292-484( Tma)	aa.423-632(Taq) s mutací E615G
Taq/Tma	aa.	1-289(Taq)	aa.292-484( Tma)	aa.485-893( Tma) s mutací E678G

Plasmid pCl byl uložen podle Budapešťské dohody s ATCC 17. července 1996 a bylo mu přiděleno depositní číslo 98107. Plasmid pCl obsahuje tepelně stálou DNA polymerázu kódující gen, která je mutována u kodonu kódujícím zbytek glutamové kyseliny v poloze 615 aminokyselinové sekvence nativní polymeráty Taq, vedoucí k mutované formě polymerázy Taq mající glycinový zbytek v poloze 615 (E615G mutovaná polymeráza Taq). Tento deposit poskytuje alternativní prostředky k zajištění tepelně stálých DNA polymeráz majících zlepšenou účinnost k začleňování analogu neobvyklých nukleotidů. Příklad 1 objasňuje použití lemovacích restrikčních míst, vhodných k subklonování mutace E615G k vytváření jiných enzymů tepelně stálých DNA polymeráz. Jelikož úplné genové sekvence četných tepelně stálých DNA polymeráz jsou známy, jsou pro pracovníky v oboru, na základě zde poskytnuté sekvenční informace o rozhodujícím motivu, snadno dostupné jiné prostředky k zavádění mutací kodonu kódujícího E615, jako je restrikční digesce a přemisťování fragmentů nebo specificky místně cílená mutagenese in vitro.

Modifikovaný gen nebo genový fragment, připravený specificky místně cílenou mutagenesí, muže být získán z plasmidu nebo bakteriofágu konvenčními prostředky a 1igací zaveden do expresního vektoru k další kultivaci a čištění výsledného enzymu. K provádění vynálezu se hodí četné klonovací a expresní vektory, včetně savčích a bakteriálních systému a jsou popsány například v knize Sambrook a kol . Molecular Cloning: ft Laboratory Manual, druhé vydání, Cold Spring Harbor 1989. Pro pohodlí je vynález doložen příkladem používajícím 1ambda-derivovaného promotoru PL (Shimatake a kol . Nature 292, str. 128, 1981). Použití tohoto promotoru je specificky popsáno v amerických patentových spisech číslo 4 711 845 a 5 079 352.

Tepelně stálé DNA polymerázy podle vynálezu se obvykle čistí od mikroorganismů, jako jsou například E.coli, které byly transformovány expresním vektorem operativně vázaným na gen kódující tepelně stálou polymerázu DNA divokého typu nebo modifikovanou tepelně stálou polymerázu DNA. Příkladem vhodného hostícího mikroorganismu je kmen E.coli DG116, který popsal Lawyer a kol. (PCR Methods and Application 2, str. 275 až 287, 1993), a který lze získat od American Type Culture Collection pod číslem ATCC 53601. Způsoby čištění tepelně stálé polymerázy jsou také popsal Lawyer a kol. (PCR Methods and Application 2, str. 275 až 287, 1993.

Pracovníkům v oboru je zřejmé, že uvedené tepelně stálé DNA polymerázy se zlepšenou účinností začleňování neobvyklých nukleotidů se nejsnáze připraví způsoby rekombinantní technologie DNA. Pokud je snahou připravit některý enzym podle vynálezu, derivát nebo homolog těchto enzymů, zahrnuje produkce rekombinantní formy zpravidla konstrukci expresního vektoru, transformaci hostící buňky Limbo vektorem a kultivaci transformované hostící buňky za podmínek, při kterých se exprese uskuteční. Prostředky k přípravě expresních vektorů, transformování a kultivaci transformovaných hostících buněk jsou v oboru dobře známy a podrobně je popsal například Sambrook a kol. (Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, druhé vydání, kapitola 15.51,01igonucleotide-Mediated Mutagenesis” 1989, jak shora uvedeno).

Vynález poskytuje tepelně stálé polymerázy DNA vhodné k použiti s ribonukleosidovými trifosfáty pro četné aplikace, včetně zesilování nukleových kyselin, způsobů detekce a sekvencování DNA. Použití ribonukleotidů při sekvencování vylučuje velmi nákladné koncové analogy v řetězcích, jako jsou ddNTP a především usnadňuje přípravu nových zesilovacích produktů, vhodných nejenom pro analysu sekvencí DNA, ale také pro analysy jiného typu, jako je e1ektroforéza nebo hybridizace bez nutnosti zavádění následných reakcí sekvencujicich DNA.

Ukázalo se, že pyrofosfatáza zlepšuje výsledky sekvencování za použití jak mesofi 1 ických polymeráz, tak tepelně stálých DNA polymeráz snižováním množství pyrofosforolysy při akumulaci produktů extense. Dosavadní cyklus sekvencující metody vyžadují, aby byl do sekvenční reakce zahrnut přídavný enzym. Avšak velmi užitečná a pokroková je možnost sekvencování DNA bez použití pyrofosfatázy. Použiti nových enzymů podle vynálezu tudíž eliminuje nutnost přídavných nákladů, souvisejících s přidáváním druhého enzymu do sekvenční reakční směsi.

Při použití enzymů podle vynálezu se zesilovací a sekvencující reakce kombinují, což spoří čas i materiál a zjednodušuje celou analysu. Tyto a další přednosti se uplatňují, jelikož začleňování jak obvyklých nukleotidů, tak ribonukleotidů a analogů ribonukleotidů do primerního extensního produktu zajišťuje chimérický řetězec RNA/DNA, který je schopen hydrolysy

RNA. Postup neovlivňuje kostru DNA a poskytuje populaci fragmentů nukleových kyselin, z nichž každý končí v poloze, kde je místo odpovídající dNTP vsazen ribonukleotid Hydrolysa se snadno uskuteční různými prostředky včetně alkalií (například zpracováním hydroxidem sodným například s konečnou koncentrací O,2M, jak uvedeno dále v příkladě 6), tepelným nebo enzymatickým zpracováním RNase (Vogel a kol . Informational Macromolecular, Nev York, Academic Press, kapitola, kterou zpracoval Berg a kol. s názvem The Synthesis of Mixed Polynucleotides Containing Ribo- and Deoxyribonukleotide by Purified Preparation of DNA Polymerase from E.coli, str. 467 až 483).

Ve výhodném provedení poskytuje vynález nové a zlepšené sloučeniny obzvlášť užitečné pro způsoby sekvencování DNA. Nové, zde popisované enzymy jsou pokrokové ve způsobech sekvencování nukleových kyselin používajících buď barevných terminátorů nebo barevných primerů stejne jako jiných metod sekvencování. Jak bylo výše popsáno, vyžadují způsoby zakončování řetězců obecně extensi primeru závislou na matrici v přítomnosti nukleotidů zakončujících řetězec, což vede k rozdělení parciálních fragmentů, které se pak oddělí velikostí. Standardní dideoxy sekvencování používá dideoxynuk1eosidových trifosfátů k ukončování řetězců DNA polymerázy, jako je Klenowův fragment E.coli Pol I (Sanger a kol. Proc. Natl. Acad. Sci. 74, str. 5463, 1977)

Základní dideoxy sekvenční potup tedy zahrnuje (i) tepelné př i poj en í r ibonuk1eot i dového pr i meru k matr i c i > ( i i) rozsí ření primeru polymerázou DNA ve čtyřech oddělených reakcích, z nichž každá obsahuje jeden značený nukleotid, nebo značený primer, směs neznačených dNTP, jeden řetězec zakončující ddNTP, (iii) rozlišení čtyř souborů reakčních produktů například e1ektroforézou denaturačního gelu polyakrylam id/močovina s vysokým rozlišením, kapilární separací nebo jinými rozlišujícími prostředky; a (iv) vyt.voření autoradiograf ického obrazce gelu, který může být zkoumán k posouzení sekvence. Alternativně lze k odvození informace o sekvenci DNA použít metod hmotové spektroskopie nebo metod založených na hybridizaci, za použití značených primeru nebo nukleotidů

Dostupnost tepelné stálých polymeráz, jako jsou Taq polymerázy vedla ke zlepšeným metodám sekvecování (americký patentový spis číslo 5 075 216) a k jejich modifikaci nazývanou cycle sequencing (cyklové sekvecování). Při cyklovém sekvencování se opakuje ohřev a ochlazení, což umožňuje vytvoření četných extensních produktů z každé cílové molekuly (Murray Nucleic Acids Research 17, str. 8889, 1989). Toto asymetrické zesilování cílových sekvencí komplementárních s matricovou sekvencí v přítomnosti di deoxy řetězcových terminátorů produkuje populaci produktů extense všech možných délek.

Po denaturaci produktů ext.ensní reakce od matrice DNA nastane několik cyklů teplotní hybridizace a extense primeru v přítomnosti dideoxy terminátorů. Tepelně stálé DNA polymerázy mají četné přednosti v cyklovém sekvencování; vymezují přísné teploty teplotní hybridizace, jež jsou požadovány pro specifickou hybridizaci primeru na cíle nukleové kyseliny stejně jako vymezují několikeré cykly vysokoteplotní denaturace, ke které dochází v každém cyklu, například 90 až 95 C. Z toho důvodu byly do kitů sekvencujících cyklus Taq prodávaných společností Perkin Elmer, Norwalk, CT, zařazeny různé formy AmpliTaq^R DNA polymerázy.

Nicméně vlastnosti Taq polymerázy DNA, k odlišení od začleňování neobvyklých nukleotidů, jako jsou ddNTP, představují problém, použije-li se jí k cyklovému sekvencování, kde ddNTP nebo fluorescenčně značené ppNTP mousejí být začleněny jako terminátory řetězců. Před vynálezem vyžadovalo obecně dříve sekvencování DNA tepelně stálými DNA polymerázami směs řetězec ukončujících nukleotidů ve velké koncentraci k zajištění vy tvoří populace extensních produktů představující všechny možné délky fragmentů v délce několika set bází. Často, k provedení tohoto nákladného postupu, činily protokoly používající velmi nízkých koncentrací obvyklých dNTP, reakce neúčinnými. Tyto reakční směsi mající nízkou koncentraci dNTP a vysokou koncentraci ddNTP, vytvářejí prostředí, ve kterém je tepelně stálá polymeráza v podstatě spotřebována na nukleotidové substráty.

I s příchodem modifikovaných enzymů, jako je AmpliTaq^RDNA polymeráza FS, které umožňují zvyšování koncentrace dNRP na optimálnější úrovně, spoléhají dřívější enzymy stále na přítomnost nákladných ddNTP pro sekvencování DNA. Na rozdíl od toho poskytuje vynález enzymy, které umožňují nejenom zvyšování koncentrace dNRP, ale zabraňují používání nákladných ddNTP používáním místo toho rNTP k začleňování do rostoucího řetězce. Schopnost nových enzymů účinně ovlivňovat částečnou ribonukleidovou substituci usnadňuje generaci sekvencujících žebříků DNA při vyloučení separátní reakce k začlenění koncového nukleot i du.

Volba analogů neobvyklých nukleotidů vhodných pro použití v sekvenčních metodách DNA byla dříve diktována schopností tepelně stálé DNA polymerázy začleňovat takové analogy. Naneštěstí jsou takové nukleotidové analogy dosti drahé. Například cena ddNTP je přibližně 25x vyšší než cena rNTP nebo dNTP. Jelikož dřívější tepelně stálé polymerázy DNA nebyly schopny účinně začleňovat rNTP do rostoucí DNA způsobem řízeným matricí, nebyly takové ribonukleotidy, které jsou snadno dostupné a jsou levné, možností pro použití v sekvencování DNA tepelně stálou polymerázou. Vynález vylučuje potřebu ddNTP v sekvenčních reakcích DNA. Vynález tedy také poskytuje metodu pro analysu sekvencí DNA, která je podstatně levnější než dřívější metody ukončování řetězců.

Přítomnost manganu v extensní reakci primeru může ovliv nit schopnost polymerázy vložit přesně správně založený pár nukleotidů. Manganu lze použít k vynucení nesprávného párování bází nebo k usnadnění diskriminace proti začlenění nukleotidového analogu. Manganu bylo použito při výzkumech k zavedení mutageneze v procesech replikace nebo zesilování DNA. Mangan může tudíž ovlivnit věrnost polymerizační reakce i výtěžek reakce. Výsledná sekvence může být nesprávná, nebo může být v sekvenční metodě DNA výsledná informace dvojznačná. Způsoby podle vynálezu nepotřebují zavádění manganu jako dvojmocného kat iontu v sekvenční reakční směsi k přinucení polymerázy, aby začlenila neobvyklý nukleotid. Na rozdíl od dosavadních DNA polymeráz, identifikuje vynález rozhodující motiv v polymerázové doméně k ovládání schopnosti enzymu rozlišit mezi 2 -substituovanými a nesubstituovanými nukleotidy bez potřeby manganu .

Enzymy podle vynálezu nevyžadují k sekvencování vysoké koncentrace nekonvenční báze analogů. Před vynálezem byly obecně obsaženy báze nekonvenčních analogů a odpovídající neobvyklé báze v poměru (například ddATP=dATP) od 1,3:4 do 24:1 pro sekvenční metody terminálů řetězců DNA (viz též americký patentový spis číslo 5 175 216, Innis a kol . 1 . V porovnání umožňují tepelně stálé polymerázy podle vynálezu snížení poměru nekonvenční báze analogů k obvyklým bázím z několika stonásobků na několik tisícinásobků. Poměr rNTP:dNTP 1:1 nebo menší, v konmbinaci s novými enzymy podle vynálezu je postačující pro analysu sekvence DNA. Ve výhodném provedení vynálezu je poměr rNTP:dNTP snížen na méně než 1:8. Poměr 2 -substituovaného nukleotidu k odpovídajícímu přírodnímu dNTP může být 1:80 až 1=200, v závislosti na příslušné experimentální konstrukci a na požadované délce fragmentů.

Jelikož tedy enzymy podle vynálezu pohotově začleňují neobvyklé nukleotidy, jako jsou 2 -substituované nukleotidy, není nutné vynucovat, začlenění rNTP pomocí vysoké koncentrace

2.7 rNTP a onezováníém koncentrace odpovídajících dNTP. Proto způsob podle vynálezu umožňuje použití optimálních koncentrací dNTP v kombinaci s nízkým množstvím rNTP.

Jestliže se modifikovaných polymerázových enzymů podle vynálezu použije ve vhodné sekvencovací metodé, jako je například dye-primer sequvencing, dosahuje se dobrých sekvenčních výsledků s koncentrací dNTP v rozsahu 50 až 500 uM každého dNTP. S výhodou je koncentrace dNTP 10 až 300 uM. Při tomto rozsahu mohou být příslušné rNTP obsaženy v koncentraci přibližně stejné jako dNTP nebo menší. S výhodou je rNTP obsažen v koncentraci 0,1 u až 10 uM, nejvýhodněji přibližně 2,5 až 25 uM.

Koncentraci rNTP, vhodnou pro použití s enzymy podle vynálezu, lze snadno zjistit titrací a optimalizací experimentů pracovníky v oboru. Potřebné množství rNTP nebo analogu se určí při typu experimentu a může být ovlivněno cílovou velikostí a čistotou i volbou pufru a jednotí ivými druhy enzymů.

Poměr rNTP:dNTP určuje frekvenci, se kterou se rNTP začleňují do rostoucího oligonukleotidu. Jelikož při každém začleněném rNTP nastane hydrolysa, může se poměr rNTP:dNTP nastavit tak, aby uživatele vybavila flexibilitou ke zvyšování nebo snižování velikosti výsledných fragmentů.

Jak známo, je DNA polymer syntetizovaný z dNTP. Každý deoxynukleosidový tri fosfát představuje ribosový cukr, který obsahuje hydroxylovou skupinu v poloze 3 a atom vodíku v poloze 2 Ribonukleotidy obsahují také hadroxylovou skupinu v podílu 3 cukru. Avšak rNTP se odlišují od dNTP v poloze 2 cukru, kde druhá hydroxylová skupina nahražuje atom vodíku. V této souvislosti je rNTP příkladem schopnosti enzymů podle vynálezu přesně začleňovat nukleotidy substituované v poloze 2 . Sloučeniny podle vynálezu nejsou však omezeny na použití neobvyk28 lých nukleotidů, kterými jsou ribonukleotidy. Modifikace sekvence tepelně stálé polymeráty v rozhodující doméně, zde identifikovné, umožňuje matricí cílené začlenění alternativy v poloze 2 substituovaných nukleotidů, jako jsou 2 -hydroxylová skupina a 3 -deoxynukleotidy a v poloze 2 substituované fluoronukleotidy nebo aminonukleotidy.

Jak je popsáno v příkladech, začlenění 3 -deoxy, 2 -hydroxy ATP, zde označované jako cordycepintrifosfát, je usnadněno obsahem druhé mutace v tepelně stálé polymeráte, která redukuje diskriminaci proti začlenění nukleotidu obsahující deoxyskupinu v poloze 3 ribosy. Takové enzymy byly už popsány například v evropském patentovém spise číslo EP-A-655506 a americké přihlášce vynálezu čéslo 08/448 223 z 23.května 1995. ATCC deposit No.69820, uložený podle Budapešťské konvence 10. května 1995, poskytuje gen kódující modifikovanou tepelně stálou DNA polymerázu Thermus aquaticus, která má sníženou diskriminaci vůči začleňování analogů, jako jsou ddNTP. Dideoxynuk1eotidy mají substituovanou polohu 3 na rozdíl od obvyklých dNTP. Tudíž v kombinaci s vynálezem, poskytuje dvojitá mutace, jejímž příkladem je zde polymerázový mutant E615G,F667YTag, prostředek k využití analogů nukleotidů, jež jsou substituovány v poloze 3 a 2 ribosy, ve srovnání s dNTP (viz příklady 3 a 5) .

Zvláštní aplikací vynálezu je způsob sekvencování rNTP, kde sekvencující primer je detekovate1 ně označen rozlišitelnou fluorescenční nebo radioaktivní značkou. Na rozdíl od ddNTP, začleňování nemodifikovaného rNTP nevede k ukočení řetězce. Sekvenční reakce DNA zahrnující jak rNTP, tak dNTP v kombinaci s enzymem podle vynálezu, vytváří směs stat, i sticky substituovaných primer rozšiřujících produktů schopných rozštěpit v poloze 3 -5 fosfodiestrovou vazbu mezi ribo- a sousedním deoxynukl eot idem. Po extensi primeru. například PCR zesílením nebo cyklickým sekvencováním a před rozlišením produktu extense primeru, například gelovou e1ektroforézou, se reakční směs zpracuje buď alkalií, teplem, ribonukleázou nebo jinými prostředky k hydrolyzování produktů extense primeru u každého výskytu ribonukleoti du. Pro každý značený produkt extense primeru, je detekovate1ný pouze nejvýše 5 fragment, který je bezprostředním produktem extense značeného primeru, na sekvenčním gelu. Pro daný cíl, představuje analysa výsledných sekvenčních gelů sekvenční žebřík, tedy sérii neidentifikovatelných signálů v drahách G, A, T a C odpovídajících sekvenci nukleové kyseliny cíle. Výsledný sekvenční žebřík poskytuje stejnou informaci, ať metoda použije ddNTP konvenčními prostředky, nebo rNTP a nových zde popsaných tepelně stálých polymeráz. Použitím vynálezu tedy už se k sekvencování DNA nemusí používat drahých ddNTP (viz příklad 6).

V alternativní sekvenční analyse se používá ribonukleoti dů zakončujících řetězec. Při tomto provedení vynálezu se jako terminátorů používá 2 -hydroxy,3 -deoxynuk1eotidů, jako je kordycepintri fosfát. Tyto analogy rNTP mohou být fluorescenčně označeny a použity k sekvenční analyse DNA. Lee a kol.(Nucleic Acid Research 20, str. 2471, 1992) popsal použití dye-terminátoru ddMTP. V evropském patentovém spise číslo EP-A-655506 a v americké přihlášce vynálezu číslo 08/448 223 z 23.května

1995 jsou popsány modifikované enzymy pro použití s ddNTP. K účinnému začleňování značených analogů rNTP v sekvenční reakci zakončující řetězec je možno použít tepelně stálé polymerázy DNA obsahující jak modifikaci obsaženou v AmpliTaq^R DNA polymeráze ES (viz shora) a spécifi kovaných v SEQ ID NO:1, kde X není glutamová kyselina (E), jak zde popsáno. Tento proces může být automatizován a nevyžaduje syntesu barevně značených primerů. Kromě toho, jelikož reakce s barveným terminátorem umožňují provádění všech čtyř reakcí v téže zkumavce, jsou výhodnější než způsoby s barveným primerem. 2 -Hydroxy.3 -deoxynuk 1 eot i dy mohou být syntetizovány z obchodně dostupných 3 nukleotidů (3 dA, 3 dC, 3 dG a 3 dT například od Sigma Chemical Corporation, St.Louis, NO) a přidáním 5 -tri fosfátu (Ludwig,

Biophosphates and Their Synthesis Structure, Metabolism and Activity, vydavatelé Bruzik a Stec, Amsterdam, Elsevier Science Publishers, str. 201 až 204, 1987).

Kromě využití enzymů podle vynálezu v nových metodách sekvenční analysy, hodí se zde popsané modifikované enzymy v řadě aplikací molekulární biologie. V jednom provedení je modifikovaných enzymů použito v zesilovací reakci směsi obsahující obvyklé i neobvyklé nukleotidy, například dNTP a alespoň jeden detekovate1ně značený rNTP, přičemž značky mohou být například fluorescenční značky nebo radiosiotopy. Syntesa řízená matricí komplementárního řetězce poskytuje produkt DNA obsahující ribonuk1eosidmonofosfáty v různých polohách po své délce. Tepelné a nebo alkalické zpracování hydrolyzuje produkt extense nukleové kyseliny na každém ribonukleotidu. Získá se tak populace segmentů DNA, kde každý fragment obsahuje jeden značený podíl na konci 3 Velikost výsledných fragmentů nukleové kyseliny může být modifikována nastavením poměru a množství rNTP zahrnutých v reakci.

Zesilování štítu pomocí rNTP a enzymů podle vynálezu poskytuje četné přednosti v závislosti na jejich příslušné aplikaci. Ve shora popsaném způsobu se značenými rNTP, je výsledná populace fragmentů celá značená se stejnou intenzitou: jedna značka pro oligonukleotidový fragment. Postupy, jako detekce nukleových kyselin pomocí řady oligonuk1eotidové sondy fixované na křemíkový čip, optimálně vyžaduje, aby zesílený štít byl statisticky fragmentován v pevně reproduklovatelném rozmezí velikosti k omezení vytváření sekundárních struktur pro ovládání hybridizační kinetiky. Dále k detekci hybridizace na řadě tisíců sond na čipu, může být výhodné, jsou-li fragmenty nukleové kyseliny značeny se stejnou intenzitou. Vynález poskytuje prostředky k produkování popuplací fragmentů, které tomuto standardu vyhovují a tím usnadňuje použití alternativních detekčních forem jako jsou metody založené na čipu, které popsal například Corin a kol. (Human Mutation 7, str. 244 až 255, 1996).

V jiném provedení poskytuje použití značených a neznačených primeru v zesilovací reakci, která obsahuje tepelně stá 1ou polymerázu podle vynálezu a jak rNTP, tak dNTP, prostředky k současnému provádění zesilovacích a sekvenčních reakcí. Tento způsob vyžaduje provádění 4 oddělených zesilovacích reakcí, jedné pro každý rNTP. Tedy, jelikož například enzym podle vvnálezu je vhodný k cílenému zesílení například pomocí PCR, nebo jinými zesilovacími prostředky, může být výsledný produkt, pokud je obsažen, detekován konvenčními metodami jako je gelová e1ektroforéza nebo sondová hybridizace pomocí části produktu reakce. Tyto detekční metody se neprojeví v hydrolyse začleněných ribonuk1eotidů a chimérické řetězce RNA/DNA se budou chovat podle očekávání u běžných produktů zesílených nukleových kyselin. Je-li žádaný produkt detekován, může se zbývající část téže reakční směsi zpracovat alkalií a analyzovat elektroforézou gelu ke stanovení sekvence nukleové kyseliny. Po detekci produktu je tudíž následná sekvenční rekace zbytečná. Tento zjednodušený postup šetří čas a materiály a přináší zvýšenou přesnost odstraněním kroku; detekovaný produkt je sekvencovaný produkt.

Podobného způsobu se čtyřmi značenými rNTP a jedním bioLinylováným primerem lze také použít. Po zesílení se produkt rozštěpí alkalií a s primerem spojené produkty se odstraní reakcí s kuličkami povlečenými střepav idinem. Zachycené produkty se pak analyzují na sekvenčním gelu. Tato modifikace umožňuje provádět sekvenční reakci v jedné zkumavce, čímž se vylučuje nutnost čtyř samostatných zesílení.

Podle jiného význaku vynálezu se hodí zde popsané enzymy k přípravě RNA z matrice DNA nebo k vytváření substituovaných DNA pro alkalií zprostředkovanou sterilizaci bez použití

konvenčních sterilizačních činidel jako je uraci 1 -N-glykolsy1áza ( UNG) popsaná ve světovém patentovém spise číslo WO 92/ 01814.

V příkladném provedení obsahuje tepelně stálá polymeráza také mutaci v 5 -3 -exonukleázové doméně, která slouží k silnému utlumení exonuk1eázové aktivity. Modifikované formy Tag polymerázy jsou popsány v americkém patentovém spise číslo 5 466 591. V jednom provedení vynálezu byl nahražen kodon kódující glycinový ( G) zbytek v poloze 46 aminokyseliny kodonem kódujícím asparagovou kyselinu (Dl. Získaný enzym má podpořenou účinnost v cyklických sekvenčních reakcích v důsledku snížené 5 -3 -exonukleázové aktivity a je výhodným základem pro účely vynálezu. Polymerázová doména aminokyselinové sekvence a polymerázovou aktivita jsou nedotčeny přítomností (G46D) mutantu ve srovnání s divokým typem enzymu.

Vynález objasňují, nijak však neomezují následující příklady praktického provedení.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Exprese modifikovaného Tag polymerázového genu se sníženou diskriminací vůči neobvyklým nukleotidům

C-Koncová aminokyselinová část Tag DNA polymerázy DNA polymerázové aktivní místo domény (Lawyer a kol., PCR Methods and Applications 2, str. 275 až 287, 1993). Fragment DNA, který obsahuje tento úsek, byl izolován z genu Tag plné délky a mutagenizován zesílením PCR v přítomnosti manganu (Leung a kol. Technigue 1 (1), str. 11 až 15, 1989). Pro tento příklad byly opatřeny všechny restrikční enzymy od New England Biolabs, Beverly, MA. Mutagen izované fragmenty byly digestovány Pstl a

BglII a klonovány do expresního plasmidu Taq, zde plasmidu pLK102, který byl digestován Pstl a BglII. Plasmid pLK102 je modifikovanou formou Taq expresního plasmidu pSYC1578 (Lawyer a kol.1. Fragment HincII/EcoRV umístěný v poloze 3 k úseku kódujícím polymerázu se vyjme k vytvoření plasmidu pLKlOl. Pak se od pLKlOl oddělí fragment 898 páru báze Pstl-BglII a nahradí se krátkým oligonukleidovým duplexem Pstl-EcoRV-BglII k vytvoření plasmidu pLK102. Toto vymizení odstraní základový pár 900 z konce 3 genu TaqDNA pol a nahradí ho krátkým kusem DNA.

Výsledné expresní plasmidy se transformují do kmene E.coli N1624, který popsal Gottesman (J. Mol. Biol. 77, str. 531, 1973; též k dostání od E.coli Genetic Stock Center at Yale líni vers i ty pod číslem kmene CGSCW5066) a produkt výsledné transformace se skrínují se zřetelem na schopnost účinně začleňovat rNTP v porovnání s enzymem divokého typu. Tímto způsobem se identifikuje mutant Cl jako mající schopnost účinněji začleňovat rNTP.

Ke zjištění, která část genu Taq polymerázy byla zodpovědná za změněný fenotyp, byl digestován mutagenizovaný Taq expresní plasmid, pojmenovaný pCl, izolovaný z mutantu Cl s různými restrikčními enzymy a výsledné restrikční fragmenty byly subklonovány do genu pLKlOl TaqDNA polymerázy divokého typu, k nahrazení nemutagenizovaných restrikčních fragmentů. Analysa výsledných subklonů ukázala, že mutace, zodpovědná za fenotyp, je obsažena uvnitř restrikčního fragmentu páru báze 265 Nhel až BamHI.

Sekvenční analysa DNA byla provedena v tomto úseku pCl pomocí ABI PRISM^a Dye Terminator Cycle Sequencing Core Kit s AmpliTaq^R polymerázy DNA FS od Applied Biosystems, Foster City, CA a pomocí DNA sekvenčního systému Applied Biosystems model 373Ά. Sekvenční analysa identifikovala dvě mutace v genu polymerázy Taq mezi místy Nhel a BamHI. Mutace na aminokyseli nové pozici 615 způsobila, že zbytek glutamové (El kyseliny byl nahraěen glycinovým ( G) zbytkem a druhá mutace v poloze 653 nahradila alaninový (A) zbytek threoninem (T). Číslování začíná u kodonu kódujícího první methioninový zbytek přírodního proteinu jako v americkém patentovém spise číslo 5 079 352. Mutace E615G byla způsobena změnou GAG až GGG v kodonu 615. Mutace A653T byla způsobena změnou GCC na ACC u kodonu 653. Plasmid Cl v hostícím kmenu E.coli N1624 byl uložen podle Budapešťské konvence s ATCC 17. července 1996 a bylo mu přiděleno číslo dostupnosti 98107.

Dvoubodové mutace byly odděleně analyzovány subklonováním každé zvlášť do genu Tag polymerázy divokého typu, pomocí rekonmbinantní PCR (Innis a kol . , PCE Protocols San Diego, Academie Press kapitola 22 s názvem Recombinant PCR, Higuchi, str. 177 až 183, 1990). Výsledné expresní produkty byly analyzovány ke zjištění, zda mutace E615G nebo Ά653Τ nebo obě mutace jsou zodpovědné za začleněný ribonukleotidový fenotyp. Výsledky těchto pokusů ukázaly, že za mutantový fenotyp zodpovídá pouze mutace E615G.

K další analyse a ke kvantifikování začleňovací účinnosti nukleotidových analogů, byl základní párový fragment PCR 265 BamHT-Nhel obsahující E615G klonován do Tag expresního vektoru pRDA3-2. Expresní vektor pRDA3-2 obsahuje v plné délce gen Tag operativně ligovaný na fág lambda PL promotor. Exonukleázová doména Tag genu v tomto vektoru obsahuje bodovou mutaci na kodonu kódujícím glycin, aminokyselinový zbytek 46, který snižuje aktivitu 5 -3 exonukleázy. Avšak genová sekvence uvnitř polymerázové domény expresního vektoru pRDA3-2 je totožná s Tag genovou sekvencí divokého typu. Plasmid pRDA3-2 je úplně popsán v americkém patentovém spise číslo 5 466 591, kde je plasmid nazýván klon 3-2. Palsmid pRDA3-2 byl digestován s BamHI a Nhel a základní párový fragment PCR 265 byl ligován do vektoru obvyklými prostředky.

Výsledný plasmid pLKlOS byl transformován do kmene E.coli DG116 (Lawyer a kol., 1993, též k dostání od American Type Culture Collection pod číslem ATCC 53606). Plasmid pLKlOS kóduje tepelně stálou DNA polymerázu, zde nazývanou G46D.E615G Taq. Mutant G46D,E615G,F667Y Taq se vytvoří kombinováním mutací E615G a F667Y rekombinantní PCR do fragmentu BamHI-Nhel. Tento fragment byl klonován do plasmidu pRDA3-2 k vytvoření plasmidu pLK109. Expresovaný protein tepelně stálé polymerázy DNA z plasmidu pLKlOS a pLK109 se čistí způsobem, který popsal Lawyer 1993, ačkoli chromatografie byla vynechána. Sekvence insertů byla potvrzena sekvenční analysou DNA. Další mutace v sekvenci byla detekována v insertu pLK.108; tato mutace nemění aminokyselinovou sekvenci proteinu.

Po částečném vyčištění se zjistí aktivita modifikovaného enzymu zkouškou aktivity, kterou popsal Lawyer a kol .(J. Biol. Chem. 264, str. 6427 až 6437, 1989). Aktivita modifikovaného enzymu se vypočte takto: jedna jednotka enzymu odpovídá 10 nmol produktu syntetizovaného během 30 minut. Aktivita enzymu polymerázy DNA divokého typu je přímo úměrná koncentraci enzymu do 80 až 100 pmol začleněného dCMP (zředěný enzym s 0,12 až 0, 15 jednotek na reakci) . Aktivita mutantu E615G, G46D a E615G, F667Y, G46D je přímo úměrná koncentraci enzymu do 0,25 až 3 pmol začleněného dCMP (zředěný enzym při 6xl0“⁴ až 5xl0³ jednotek na reakci). Tento enzymový prostředek byl využit k začlenění a k sekvenčním reakcím popsným v příkladech 3 až 5. Pro příklady 2 a 6 byl enzym čištěn jak popsáno v literatuře Lawyer a kol. (J. Biol. Chem. 264, str. 6427 az 6437, 1989) Příklad 2

Test k porovnání účinnosti začleňování se

Relativní schopnost G46D a G46D,E615G Taq začleňovat rNTP zjistí měřením množství [alfa-³²P]rNTP, které je schopen každý enzym začlenit při omezené koncentraci enzymu do aktivované matrice DNA lososového sperma. K měření začlenění rATP se připraví reakční směs tak, že konečná koncentrace v 50 ul reakční směsi je: 12,5 qg aktivované DNA lososího sperma, připravené jak dále uvedeno, 200 uM každé dCTP, dGTP a dTTP (Perkin Elmer Norwalk, CT), 100 uM [alfa-³³P]rATP, 1 mN betamerkaptoetbanolu, 25 mH N-tris[hydroxymethyl]methy1 -3-aminopropansul f onové kyseliny (TAPS) pH 9,5, 20 C, 50 mM JC1 a 2,25 mM chloridu hořečnatého.

Podobné testovací směsi se připraví k měření začlenění rCTP, rGTP a rlJTP. V každém případě se rNTP označí radioizotopem a je obsažen ve 100 uM a tři zbývající rNTP (dATP, dGTP a dTTP pro rCTP, dATP, dCTP a dTTP pro rGTP a dATP, dCTP a dGTP pro rlJTP) jsou obsaženy každý při 200 uM. Jako standard se také změří začlenění odpovídajícího [alfa-³³P]dNTP každým enzymem. Testovací směs pro tyto testy je podobná se shora uvedeným testem začleňování rNTP, s tou výjimkou, že každý [alfa³²P]rNTP, je nahrazen odpovídajícím [alfa-³²P]dNTP. Surová DNA lososového mlíčí 1 g/1 od Worthington Biochemical, (Freehold, NJ) se aktivuje inkubací v 10 mM Tris-HCl, pH 7,2, 5 mM MgClz, při teplotě 2 až 8 C po dobu 96 hodin. Přidá se pak EDTA 12,5 mM a NaCl 0,lM. DNA se pak extrahuje systémem fenol/chloroform a pak se vysráží etbanolem a resuspenduje se v 10 mM Tris, ImM EDTA, pH 7,5. Aktivovaný prostředek DNA se dialyzuje proti stejnému pufru.

Do pěti 0,5 ml zkumavek (například Eppendorf) se vnese podíl 45 ul každé reakční směsi pro každý 5 -značený nukleotidový prekurzor. Testuje se tak každý G46D Tag a G46D, E615G Taq dvojmo, přičemž jedna zkumavka je ponechána pro negativní kontrolu. Polymerizační reakce ve dvou zkumavkách každé testované směsi se iniciuje 5 ul každé polymerázy G46D Taq (0,02 jednotek) nebo G46D,E615G Taq (0,002 jednotek). Do negativní kontrolní reakce se přidá jako kontrola na úroveň základu, 5 ul enzym ředicího pufru spíše než enzymu.

Každá reakční směs se krátce odstředí a inkubuje se 10 o minut při teplotě 75 C. Reakce se ukončí přísadou 10 ul 60 mM EDTA a uloží se k ledu. Pro každý vzorek se 50 ij 1 alikvot ze 60 ul reakční směsi zředí 1 ml 2 mM EDTA. 50 ug/ml DNA míchaného losového mlíčí. DNA se vysráží TCA standardním způsobem a zfiltruje se na filtračník kotoučcích GF/C (Whatman, Kent, Anglie) . Množství začleněného nukleotidu nebo ribonukleotidu, značeného [alfa-³²Pl se kvantifikuje kapalnou scintilační spektrometr!í a pak se vypočte množství začleněných pmol. Počet pmol každého rNTP začelněného každým enzymem se normaalizuje k počtu pmolů odpovídajícího [a1fa-³²P]dNTP začleněného každým enzymem Výsledky obsahuje následující tabulka.

Poměr začlenění rNTP do dNTP pro G46D a G46D,E615G Tag

Enzym

Počet, začleněných pmolů (procento)

	dATP	rATP	dCTP	rCTP	dGTP	rGTP	dTTP	rUTP
G46D	27,74	0,052	34,6	0,76	36,94	0,133	28,79	0
	(100%)	(0.18%)	(100%)	(0.22%)	(100%)	(0,36%)	(100%)	(0)
G46D, E615G	0.67	1.41	2,82	5,33	3;27	5.96 /	0.688 /	0,545
	(100%)	(210%)	(100%)	(189%)	(100%)	(181%)	(100%)	(79%)

Tyto výsledky ukazují, že G46D, E615G začleňují ribonukleotidy více než 500x účinněji než G46D (například u rDTP 181:0,36 =502x, u rCTP 189=0,22 =859x a u rATP 210:0,18 =1166x účinněji). Tudíž chybějící mutace v genu polymerázy u kodonu 615 poskytuje nový fenotyp: tepelně stálou polymerázu DNA schopnou účinně začleňovat ribonukleotidy přídavně k deoxyr i bonuk1eot i dům.

Příklad 3

Test porovnání účinnosti začleňování 3 -deoxyATP (kordycepin)

Relativní schopnost G46D; G46D,E615G; G46D,E615G,F667Y a G46D.F667Y Taq začleňovat 3'-deoxyadenosin-5 -trifosfát (kordycepintri fosfát) , se zjišťovala měřením [alfa-³²P]kordycepintrifosfátu, který každý enzym mohl začlenil v omezené koncentraci enzymu do aktivované matrice DNA lososového mlíčí. K měření začlenění [alfa-³²P]kordycepintrifosfátu probíhal test tak, že konečné koncentrace v 50 ul byly: 12,5 ug aktivovaného DNA lososového mlíčí, po 200 uM dCTP, dGTP a dTTP, 50 uM dATP (Perkin Elmer), 50 uM [alfa-³²P]-3 -dATP/3 -dATP (New England Nuclear, Sigma), 1 mM beta-merkaptoethanolu, 25 mM N-tris[hydroxymethy1]methy1-3-am inopropansulfonové kyseliny (TAPS) pH 9,5, 20 °C, 55 mM KC1 a 2,25 mM MgCl₂.

Do devíti 0,5 ml zkumavek se vnese podíl 45 14I každé reakční směsi, takže do každé reakce se vnese G46D; G46D,E615G; G46D,E615G,F667Y a G46D,F667Y Taq dvojmo, přičemž jedna zkumavka je ponechána pro kontrolu bez enzymu. Polymerizacní reakce ve dvou zkumavkách testované směsi se iniciuje 5 ul (0,058 jednotek) polymerázy G46D Taq. Totéž se provede s G46DE615G Taq (0,0025 jednotek), G46D,E615G,F667Y Taq (0,0034 jednotek) nebo G46D.F66.Y Taq (0,083 jednotek). Jako kontrola na základní úroveň začala jedna zkumavka s enzym ředicím pufrem místo s enzymem.

Každá reakční směs se krátce odstředí a inkubuje se 10 minut při teplotě 75 C. Reakce se ukončí přísadou 10 141 60 mM EDTA a uloží se k ledu. Pro každý vzorek se 50 ul podíl ze 60 u.l reakční směsi zředí 1 ml 2 mM EDTA, 50 ug/ml DNA míchaného losového mlíčí. DNA se vysráží TCA standardním způsobem a zfiltruje se na filtračních kotoučcích GF/C (Whatman, Kent, Anglie). Množství začleněného značeného [alfa-³²P] se kvantifikuje kapalnou scintilační spektrometrií a pak se vypočte množství začleněných pmol. Počet pmolů [alfa-³²P] kordycepintrifosfátu, začleněného každým enzymem, se podělí počtem jed39 notek každého v testu použitého enzymu k získání pmol začleněných na jednotku enzymu. Výsledky obsahuje následující tabulka.

Začlenění [alfa-32p]kordycepi nu G46D; G46D,E615G; G46D.E615G, F667Y a G46D,F667Y Taq

Enzym Počet pmol začleněných na jednotku enzymu

G46D0,221

G46D,E615G1,560

G46D,E615G, F667Y893,6

G46D,F667Y0,740

Výsledky ukazují, že k účinnému začleňování molekuly kordycepinu do DNA jsou zapotřebí mutace E615 G a F667Y.

Příklad 4

Sekvencování DNA alkalickým štěpením pomocí G46D, E615G Taq

DNA polymerázy

Tento příklad ukazuje použití modifikované polymerázy podle vynálezu k sekvencování alkalickým štěpením pomocí DNA částečně substituované rNTP. Poměr rNTP k dNTP v reakčních směsích byl 1:80 až 1=8. Reakce extense primeru se provádějí v pufru sestávajícím z 50 mM Bicinu (N,N-bis)-2-hydroxyethy1)glycin, pH 8,3), 25 mM KOAc a 2,5 mM MgCla. Provedou se čtyři reakce, jedna pro každý ze čtyř rNTP. Každá reakční směs (50 ul) obsahuje po 200 uM dATP, dCTP, dGTP, a dTTP (Perkin-Elmer) a 0,09 pmol M13mpl8 jednořetězcové matrice DNA (Perkin-Elmer) teplotně hybridizované na 5 -[³²P] značenou dG48 (Layxer a kol. PCR Methods and Applications 2, str. 275 až 287, 1993). Reakční směsi také obsahují 2,5 uM rATP, 2,5 uM rCTP, 2,5M rGTP a 2,5 uM rUTP.

Každá ze čtyř reakcí se iniciuje přidáním 7 jednotek po40 lymerázy DNA G46D E615 Taq a inkubuje se 10 minut při teplotě 75 °C. Reakce se ukončí přísadou 10 ul 60 mH EDTA a směs se dá k ledu. Přidá se 20 u reakční směsi do 80 ul 50 mM bicinu (pH 8,3), 25 mM KOAc a 2,5 mM MgCl₂. Produkty štěpení se vytvoří přidáním 7 ul 1N HC1. Každá reakční směs se vysráží přísadou 312 ul 95% ethanolu a 10 uj 3M acetátu sodného ( pH 4,8) . Reakční směs se mikroodstřeďuje 15 minut ke shromáždění precipitátu, supernatant se odstraní, pelety se promyjí 500 ul 70% ethanolu a vysuší se. Každá peleta se resuspenduje v 5 ul 0, 5X stop-pufru (k dostání od Perk in-Elmer, Norwalk CT, který obsahuje 95 % formamidu, 20 mH EDTA a 0,05 % bromfenolové modře), zahřeje se na 98 C s výdrží 3 minuty a přímo se vnese do předběžně e1ektroforezovaného 6% sekvenčního gelu DNA polyakrylamid/8M močovina a podrobí se elektroforéze. Gel se vysuší a exponuje se na rentgenovém film. Výsledný film ukazuje zřetelný sekvenční žebřík, který poskytuje v nadbytku 100 bází správné sekvence.

Příklad 5

Sekvencování DNA pomocí G46D,E615G,F667Y Taq DNA polymerázy a 3 -deoxy nuk1eotidtrifosfátu

Tento příklad ukazuje použití modifikované polymerázy G46D,E615G,F667Y Taq k sekvencování DNA pomocí 3 -deoxynukleotidtrifosfátu. Tento pokus byl proveden s 3 -eoxyATP: bylo by však možno rozšířit jeho použití stejně dobře na jiné 3 -deoxynukeotidy. Reakce extense primeru byly provedeny v pufru obsahujícím 50 mM bicinu, ( ph 8,3), 25 mM KOAc a 2,5 mM MgCls· Každá reakční směs (50 ul) obsahovala po 200 mM dATP, dCTP, dGTP a dTTP (Perkin-Elmer) teplotně hybridizovaných na

-[³²P] značené DG48 (Lawyer a kol., PCR Methods and Applications 2, str. 275 až 287, 1993). Reakční směsi obsahovaly také 0, 0,1, 0,25, 0,5, 1 nebo 5 uM 3 -deoxyATP.

Každá reakce se iniciuje přidáním 7 jednotek G46D, E615G,

F667Y Taq DNA polymerázy a inkubuje se 10 minut při teplotě 75 C. Reakce se ukončí přísadou 10 ql 60 mH EDTA a dá se k ledu.

Třicet ql každé reakční směsi se vysráží etbanolem a resuspenduje se ve stop pufru. zahřeje se na teplotu 98 C s výdrží 3 minuty a přímo se vnese do předběžně elektroforezovaného 6% sekvenčního gelu DNA polyakry1 am id/8M močovina a podrobí se e1ektroforéze. Gel se vysuší a exponuje se na rentgenový film. Dráhy, obsahující rekce provedené v přítomnosti kordycepinu, obsahují zřetelně rozeznatelné terminační žebříky. Dráhy obsahující nejvíce kordycepinu, například 5 uM vykázaly terminační žebříky, ve kterých, v průměru, byly pásy kratší než dráhy, ve kterých byly úrovně kordycepinu nižší. Dráha, obsahující reakci provedenou v nepřítomnosti kordycepinu, vykazovaly většinou produkt v plné délce a žádný term inačne žebřík. Tyto výsledky naznačují, že mutantní enzym je schopen začleňovat kordycepin a začlenění této molekuly do produktu extense primeru způsobuje terminaci. Tohoto způsobu by mohlo být použito také k vytváření sekvenčního žebříku NA s 3 -deoxyCTO, 3 -deoxyGTP a 3 -deoxy UTP.

Příklad 6

Sekvencování barvou značeného primeru PCR G46D E615G Taq DNA polymerázou

Tento příklad ukazuje použití modifikované polymerázy podle vynálezu na sekvencování značeného primeru, použitím ribonuk1eosidových tri fosfátů (rNTP) v PCR při poměru rNTP:dNTP nepřesahujícím 1:30. Provedou se čtyři individuální reakce, jedna pro každý rNTP. Sekvenční reakce PCR se provedou v pufru sestávajícím z 25 mM Tris -HC1 (pH 9), 5,0 mM MgCls a objemově 10 % glycerolu. Každá reakční směs obsahuje po 500 mM dATP_; dCTP, dGTP a dTTP (Perkin-Elmer) , matrici 5xl0⁶ copy/yl pBSMl3 + plasm id (Stratagene) 1inearizovanou restrikční endonukleázon XmnI a 0,05 jednotek/ql DNA polymerázy G46D E615 G Taq. Reakce ribo-ATP (10 ql ) obsahovaly 2,5 uM ΆΤΡ (Pharmacia

- 42 Biotech), 0,1 uM JOE M13 Reverse Dye Primer (Perkin Elmer) a 0,1 _UM primem ASC46 (5 -CGCCATTCGCCATTCAG). Rekace ribo-CTP (10 u.l) obsahovaly 2,5 uM CTP (Pharmacia Biotech), 0,1 uM FAM M13 Reverse Dye Primer (Perkin Elmer) a 0,1 uM primeru ASC46. Rekace ribo-GTP (20 yl ) obsahovaly 2,5 uM GTP (Pharmacia Biotech), 0,1 uM TAMRA M13 Reverse Dye Primer (Perkin Elmer) a 0,1 uM primeru ASC46. Rekace ribo-UTP (20 ul) obsahovaly 16 uM UTP (Pharmacia Biotech), 0,1 yM ROX Ml3 Reverse Dye Primer (Perkin Elmer) a 0,1 yM primeru ASC46.

Každá ze čtyř reakčních směsí byla umístěna do předehřátého (75 C) tepelného cyklovače Perkin Elmer GenaAmp^PCR systém 9600 a podrobena 30 cyklům po 95 C 10 sekund, 55 C 10 sekund, 1 minutu na 65 C a 65 C 5 minut. Každá reakce rATP a rCTP vytvořila 6x10¹¹ kopií značeného zesíleného produktu 300 páru bází a každá reakce rGTP a UTP l,2xl0¹² kopií značeného zesíleného produktu 300 páru bází

K určení sekvence DNA zesílených produktů PCR bez požadování separátní enzymatické reakce sekvencující DNA, se reakční směsi shromáždí, zpracují se bází a teplem, neutralizují se a vysrážejí se. Shromáždí se 4 ul z každé reakční směsi ATP a CTP a 8 ul z každé reakční směsi GTP a UTP. Do spojené reakční směsi se přidají 2 u 0,25 M EDTA (pH 8,0) (10 mM konečné), 1O ul IM NaOH (200 mM konečné) a 14 ul vody a inkubují se 5 minut při teplotě 95 °C v tepelném cyklovači GenaAmpRPCR systém 9600 a neutralizjí se 10 ul IM HC1. Spojené reakční směsi se pak vysrážejí přísadou 150 ul 95% ethanolu s následnou inkubací 15 minut při teplotě 4 C. Pak se provede 15-minutové mikroodstředění při teplotě 4 C ke shromáždění sraženiny a supernatant se odsaje. Pelety se promyjí 300 ul 70% ethanolu, mikroodstředí se 5 minut, supernatant se odsaje a pelety se vysuší. Pelety se resuspendují v 6 yl formamidu, 50 mg/ml dextranové modři (ve 25 mM EDTA) 5:1 (objemově) a 3 minuty se udržují na teplotě 90 C. Iw ul resuspendovaných pelet se pří43 mo naloží na předem e1ektroforezovaný 5% Long Ranger 6M močoví nový sekvenční gel (EMC BioProducts). Pak se provede elektrof oréza a analýza na sekvenceru DNA Perkin Elmer ABI Prism™ podle výrobcových pokynů. Výsledkem softveru automatizovaného vyvolávání bází je větší než 99% přesnost k určení sekvence DNA PCR zesíleného 300 páru bází.

Pl^ůmys lov á y yuž i tel nos t

Enzym tepelně stálé DNA polymerázy vykazující sníženou diskriminaci proti začleňování neobvyklého nukleotidu v porovnání s přírodně se vyskytující tepelně stálou DNA polymerázou do řetězců DNA různé sekvence se zvýšenou účinností a výhodný v mnoha aplikacích syntesy in vitro.

(1) Obecná informace (i) Přihlašovatel·' (A) F. Hoffmann-La Roche Ltd (B) ulice: Grenzacherstrasse 124 (C) město: Basel (Dl stát: BS (E) země: BS (F) poštovní kód (ZIP): CH-4070 (G) telefon: (0)61 688 24 03 (H) telefax: (0)61 688 13 95 (I) telex: 962292/965512 hlr ch (ii ) Název vynálezu: Enzym tepelně stálé DNA polymerázy, způsob jeho přípravy a kit, který ho obsahuje (ii i) Počet sekvencí: 13 (iv ) Počítačem čitelná forma: (A) typ prostředí: floppy disk (B) počítač: IBM PC kompatibilní (C) operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) software: PatentInRe1 ease tt 1,0, verse # 1,30 ( ΕΡ0) (vi) Současné údaje o přihlášce vynálezu: (A) číslo přihlášky vynálezu: US 60/023,376 (B) datum podání: 06-AUG-1996 (2) Informace pro SEQ ID NO:1:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) délka: 7 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Charakteristiky (A) jméno/klíč: peptid (B) 1okace 4 ( D) jiná informace:/označení = Xaa /poznámka* kde Xaa je jakákoliv aminokyselina s výjimkou Glu (ix) Charakteristiky (A) jméno/klíč: paptid (B) lokace’· 7 ( D) jiná informace:/označení = Xaa /poznámka* kde Xaa je lie nebo Val (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:1: Ser Gin lie Xaa Leu Arg Xaa 1 5 (2) Informace pro SEQ ID NO:2:

(i) Charakteristiky sekvence’· (A) délka: 7 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (Dl topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Charakteristiky (A) jméno/klíč: peptid ( B) 1okace: 7 (D) jiná informace:/označení = Xaa /poznámka* kde Xaa je lie nebo Val (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:2: Ser Gin lie Glu Leu Arg Xaa 1 5 (2) Informace pro SEQ ID NO:3 (i) Charakteristiky sekvence:

(A) délka: 7 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární (i i) Typ molekuly: peptid (xi) Popis sekvence’· SEQ ID NO : 3 : Ser Gin lie Glu Leu Arg Val 1 5 (2) Informace pro SEQ ID NO:4 (i) Charakteristiky sekvence'· (A) délka: 7 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie'· lineární ( i i) Typ molekuly: pept i d (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO·4:

Ser Gin He Glu Leu Arg lie

5 (2) Informace pro SEQ ID NO '· 5:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) délka: 15 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (Dl topologie: lineární (i i) Typ molekuly: peptid (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:5·

Leu Asp Tyr Ser Gin lie Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Se 1 í) x U (2) Informace pro SEQ ID NO : 6 '· (i) Charakteristiky sekvence:

(A) délka: 15 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární ( i i) Typ molekuly: peptid (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:6:

Leu Asp Tyr Ser Gin lie Gly Leu Arg Val Leu Ala His Leu S 15 10 1 σι φ (2) Informace pro SEQ ID NO7 (i) Charakteristiky sekvence:

(A) délka: 2626 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (D) topologie'· lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomická)

- 47 ( i i i) Hypotet i cká : ne (iv) Antisens: ne (vi) Originální zdroj:

(A) organ ismus·Thermus aquaticus (ix) Charakteristiky (A) jméno/klíč: CDS (B) 1okace: 121..2616 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:7:

AAGCTCAGAT CTACCTGCCT GAGGGCGTCC GGTTCCAGCT GGCCCTTCCC GAGGGGGAGA •GGAGGCGTT TCTAAAAGCC CTTCAGGACG CTACCC^<jG<j

GCGGGTGGTG GAAGGciAAC

ATG AGG GGG ATG CTG CCC CTC TTT

Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Pne

GTG GAC GGC CAC CAC CTG GCCTAC

Val Asp Gly His His Leu AlaTyr

CTC ACC ACC AGC CGG GGG GAGCCG

Leu Thr Thr Ser Arg Gly GluPro

3540

AAG AGC CTC CTC AAG GCC CTCAAG

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leurys

5055

GAG CCC AAG GGC CGG GTC CTC Cj.G Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu 10

CGC ACC TTC CAC GCC CTG AAGGGC

Ara Thr Phe His Ala Leu LysGly

2530

GTG CAG GCG GTC TAC GGC TTCGCC

Val Gin Ala Val Tyr Gly PheAla

GAG GAC GGG GAC GCG GTG ATCGTG

Glu Asp Gly Asp Ala Val TleVal

GTC TTT GAC GCC

Val Phe Asp Ala 65

TAC AAG GCG GGC Tyr Lys Ara Gly

AAG GCC CCC TCC Lys Ala Pro Ser 70

CGG GCC CCC ACG Arg Ala Pro Thr 85

TTC CGC CAC GAG Phe Aro His Glu 75

CCG GAG GAC TTT Pro Glu Aso Phe 90

GCC TAC GGG GGG Ala Tyr Gly Gly 80

CCC CGG CAA CTC ^?ro Arg Gin Leu 95

GCC CTC ATC AAG GAG CTG GTG GAC

Ala Leu lie Lys Glu Leu Val Asp

100

GTC CCG GGC TAC GAG GCG GAC GAC

Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp

115 120

CTC CTG GGG CTG GCG CGC CTC GAG

Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu

105 H°

GTC CTG GCC AGC CTG GCC AAG AAG

Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys

125

120

168

216

264 '312

360

408

456

504

552

GCG GAA AAG GAG GGC TAC GAG GTC CGC

Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg 130 135

ATC CTC ACC GCC GAC AAA GAC Tle Leu Thr Ala Asp Lys Asp 140

CTT TAG CAG CTC CTT TCC GAC CGC ATC CAC GTC CTC CAC CCC GAG GGG

Leu Tyr Gin Leu Leu Ser Asp Arg lie His Vai Leu His Pro Glu Gly

145 150 155160

TAG CTC ATC ACC CCG GCC TGG CTT TGG GAA AAG TAC GGC CTG AGGCCC

Tyr Leu lie Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu ArgPro

165 170175

GAC CAG TGG GCC GAC TAC CGG GCC CTG ACC GGG GAC GAG TCC GACAAC

Asp Gin Trp Ala Aso Tyr Ara Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser 'AspAsn

180 ‘ 185190

CTT CCC GGG GTC AAG GGC ATC GGG GAG AAG ACG GCG AGG AAG CTTCTG

Leu Pro Gly Vai Lys Glv He Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys LeuLeu

195 ' 220205

GAG GAG TGG GGG AGC CTG GAA GCC CTC CTC AAG AAC CTG GAC CGGCTG

Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp ArgLeu

210 215220

AAG CCC GCC ATC CGG GAG AAG ATC CTG GCC CAC ATG GAC GAT CTGAAG

Lvs Pro Ala He Arg Glu Lvs He Leu Ala His Men Asp Asp LeuLys

225 230 ' 235240

600

648

696

744

792

840

CTC TCC TGG GAC CTG GCC AAG GTG

Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Vai

245

GAC TTC GCC AAA AGG CGG GAG CCC

Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro

260

CTG GAG AGG CTT GAG TTT GGC AGC

Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser

275280 . GAA AGC CCC AAG GCC CTG GAGGAG

Glu Ser Pro Lys Ala Leu GluGlu

290 '295

GCC TTC GTG GGC TTT GTG CTTTCC

Ala Phe Val Gly Phe Vai LeuSer

305310

CTT CTG GCC CTG GCC GCC GCC AGG

Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg

325

GAG CCT TAT AAA GCC CTC AGG GAC

Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp

340

CGC ACC GAC CTG CCC CTG GAG GTG

Arg Thr Asp Leu Pro Leu GluVai

250255

GAC CGG GAG AGG CTT AGG GCCTTT

Asp Arg Glu Arg Leu Arg AlaPhe

265270

CTC CTC CAC GAG TTC GGC CTT CTG

Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu

285

GCC CCC TGG CCC CCG CCG GAA GGG

Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly

300

CGC AAG GAG CCC ATG TGG GCC GAT

Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp

315320

GGG GGC CGG GTC CAC CGG GCCCCC

Gly Gly Arg Vai His Arg AlaPro

330335

CTG AAG GAG GCG CGG GGG CTTCTC

Leu Lys Glu Ala Arg Gly LeuLeu

345350

888

936

984

1032

1080

1128

117 6

GCC Ala

AAA Lys

GAC Asp 355

CTG AGC

GTT Vai

CTG Leu

GCC Ala 360

CTG Leu

AGG Arg

GAA Glu

GGC Gly

CTT Leu 365

GGC Gly

CTC Leu

CCG Pro

1224

Leu

Ser

CCC

GGC

GAC

GAC

CCC

ATG

CTC

CTC

GCC

TAC

CTC

CTG

GAC

CCT

TCC

AAC

1272

Pro

Gly 370

Asp

Asp

Pro

Met

Leu 375

Leu

Ala

Tyr

Leu

Leu 380

Asp

Pro

Ser

Asn

ACC

ACC

CCC

GAG

GGG

GTG

GCC

CGG

CGC

TAC

GGC

GGG

GAG

TGG

ACG

GAG

1320

Thr 385

Thr

Pro

Glu

Gly

Vai 390

Ala

Arg

Arg

Tyr

Gly 395

Gly

Glu

Trp

Thr

Glu 4 00

GAG

GCG

GGG

GAG

CGG

GCC

GCC

CTT

TCC

GAG

AGG

CTC

TTC

GCC

AAC

CTG

1368

Glu

Ala

Gly

Glu

Arg 405

Ala

Ala

Leu

Ser

Glu 410

Arg

Leu

Phe

Ala

Asn 415

Leu

TGG

GGG

AGG

CTT

GAG

GGG

GAG

GAG

AGG

CTC

CTT

TGG

CTT

TAC

CGG

GAG

1416

Trp

Gly

Arg

Leu 420

Glu

Gly

Glu

Glu

Arg 425

Leu

Leu

Trp

Leu

Tyr. 430

Arg

Glu

GTG

GAG

AGG

CCC

CTT

TCC

GCT

GTC

CTG

GCC

CAC

ATG

GAG

GCC

ACG

GGG

1464

Vai

Glu

Arg 435

Pro

Leu

Ser

Ala

\ a 1 -:4 0

Leu

Ala

His

Met

Glu 445

Ala

Thr

Gly

GTG

CGC

CTG

GAC

GTG

GCC

TAT

q—q

AGG

GCC

TTG

TCC

CTG

GAG

GTG

GCC

1512

Vai

Arg 4 50

Leu

Asp

Vai

Ala

Tyr 4 55

:. ο π

Arg

Ala

Leu

Ser 460

Leu

Glu

Vai

Ala

GAG GAG ATC GCC CGC CTC GAG GTC

Glu Glu lie Ala Arg Leu Glu Ala

465 470

CCC TTC AAC CTC AAC TCC CGG GAC

Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp

485

GAG CTA GGG CTT CCC GCC ATC GC-C

Glu Leu Gly Leu Pro Ala He Gly

500

TCC ACC AGC GCC GCC GTC CTG GAG

Ser Thr Ser Ala Ala Vai Leu Glu

515520

GTG GAG AAG ATC CTG CAG TAGCGG

Vai Glu Lys He Leu Gin TyrArg

530535

TAG ATT GAC CCC TTG CCG GACCTC

Tyr He Asp Pro Leu Pro AspLeu

545550

GAG GTC TTC CGC CTG GCC GGCCAC

Glu Vai Phe Arg Leu Ala GlyHis

475480

CAG CTG GAA AGG GTC CTC TTTGAC

Gin Leu Glu Arg Vai Leu PheAsp

490495

AAG ACG GAG AAG ACC GGC AAGCGC

Lys Thr Glu Lys Thr Gly LysArg

505510

GCC CTC CGC GAG GCC CAC CCCATC

Ala Leu Arg Glu Ala His Prolie

525

GAG CTC ACC AAG CTG AAG AGCACC

Glu Leu Thr Lys Leu Lys SerThr

540

ATC CAC CCC AGG ACG GGC CGCCTC

He His Pro Arg Thr Gly ArgLeu

555560

CAC ACC CGC TTC AAC CAG ACG GCC His Thr Arg Phe Asn Gin Thr Ala 565

TCC GAT CCC AAC CTC CAG AAC ATC

Ser Asp Pro Asn Leu Gin Asn He

580

AGG ATC CGC CGG GCC TTC ATCGCC

Arq He Arg Arg Ala Phe HeAla

595600

CTG GAC TAT AGC CAG ATA GGGCTC

Leu Asp Tyr Ser Gin He GlyLeu

610615

GAC GAG AAC CTG ATC CGG GTCTTC

Asp Glu Asn Leu He Arg VaiPhe

625630

GAG ACC GCC AGC TGG ATG TTCGGC

Glu Thr Ala Ser Trp Met PheGly

645

CTG ATG CGC CGG GCG GCC AAGACC

Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys T.nr

660

ATG TCG GCC CAC CGC CTC TCC CATMet Ser Ala His Arg Leu Ser G_n

675 6=0

GCC CAG GCC TTC ATT GAG CGC TAC

Ala Gin Ala Phe He Glu Arg Tyr

90

ACG GCC ACG GGC AGG CTA AGT AGC Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser 570

CCC GTC CGC ACC CCG CTT GGGCAG

Pro Vai Arg Thr Pro Leu GlyGin

585

GAG GAG GGG TGG CTA TTG GTGGCC

Glu Glu Gly Trp Leu Leu Vai Ala

605

AGG GTG CTG GCC CAC CTC TCC GGC

A-g Vai Leu Ala His Leu Ser Gly

620

CAG GAG GGG CGG GAC ATC CAC ACG

Gin Glu Gly Arg Asp He His Thr

635640

GTC CCC CGG GAG GCC GTG GACCCC

Vai Pro Arg Glu Ala Vai AspPro

650· 655 r-c AAC TTC GGG GTC CTC TACGGC

Asn Phe Gly Vai Leu TyrGly

665670 iq C·“. GCC -ATC CCT TA.C GAG GAG

Gl” L^au Ala He Pro Tyr Glu Glu

685

TTT CAG AGC TTC CCC AAG GTG CGG “ne Gin Ser Phe Pro Lys Vai Arg

700

184 8

1896

194 4

1992

2040

2088

2136

2184

2232

C-OC GG ITT GAG A-AG A.CC CTG GAG GA.G GGC A.GG AGG CGG GGG TAC GTG

Ti_e Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly TyrVai • 705 ‘ 710 715720

GAG A.CC CTC TTC GGC CGC CGC CGC TA.C GTG CCA GAC CTA GAG GCCCGG

- G'u Hr L-u Phe Gly Arg Arg A.rg Tyr Vai Pro Asp Leu Glu AlaArg

725 730735

2260

2328

GTG AAG AGC GTG

Val Lys Ser Vai

740

CGG GAG GCG GCC GAG CGC ATG GCC TTC AAC ATG CCC Arq Glu Ala Ala Glu A.rg Met Ala Phe Asn Met Pro 745 750

2376

GTC CAG GGC ACC GCC GCC GAC CTC ATG

Vai Gin Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met

755760

TTC CCC AGG CTG GAG GAA ATG GGGGCC

Phe Pro A.rg Leu Glu Glu Met GlyAla

770775

AAG CTG GCT ATG GTG AAG CTC Lys Leu Ala Met Vai Lys Leu 765

A.GG ATG CTC CTT CAG GTC CAC Arg Met Leu Leu Gin Vai His 780

2424

2472

GAC Asp 785

GAG Glu

CTG Leu

GTC Val

CTC Leu

GAG Glu 790

GCC Ala

CCA Pro

AAA Lys

GAG Glu

AGG Arg 795

GCG Ala

GAG Glu

GCC Ala

GTG Val

GCC Ala 800

2520

CGG

CTG

GCC

AAG

GAG

GTC

ATG

GAG

GGG

GTG

TAT

CCC

CTG

GCC

GTG

CCC

2568

Arg

Leu

Ala

Lys

Glu 805

Val

Met

Glu

Gly

Val 810

Tyr

Pro

Leu

Ala

Val 815

Pro

CTG

GAG

GTG

GAG

GTG

GGG

ATA

GGG

GAG

GAC

TGG

CTC

TCC

GCC

AAG

GAG

2616

Leu

Glu

Val

Glu 820

Val

Gly

Ile

Gly

Glu 825

Asp

Trp

Leu

Ser

Ala 830

Lys

Glu

2626

TGATACCACC (2) Informace pro SEQ ID NO:8:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) délka: 832 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologie: lineární ( i i) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:8:

Met Arc Gly Met Leu 1 . 5

Val Aso Gly His His 20

Leu Thr Thr Ser Arg 35

Pro Leu Phe Glu Pro 10

Leu Ala Tyr Arg Thr 2 5

Gly Glu Pro Val Gin

Lvs Gly Arg Val Leu Leu 15

Phe His Ala Leu Lys Gly 30

Ala Val Tyr Gly Phe Ala 45 r/s

Ser Leu Leu Lys Ala Leu

0 * 55

Lvs Glu Aso Glv Asp Ala Val 60

Ile Val

Val 65

Phe Asp

Ala

Lys

Ala 70

Pro

Ser

Phe

Arg

His 7 3

Glu

Ala

Tyr

Tyr

Lys Ala

Gly

Arg 85

Ala

Pro

Thr

P ro

Glu 90

Aso

Phe

Pro

Arg

Ala

Leu Ile

Lys 100

Glu

Leu

Val

Asp

Leu 105

Leu

Gly

Leu

Ala

Arg 110

Val

Pro Gly 115

Tyr

Glu

Ala

Asp

Aso 120

Val

Leu

Ala

Ser

Leu 125

Ala

Ala

Glu Lys 130

Glu

Gly

Tyr

Glu 135

Val

Arg

Ile

Leu

Thr 140

Ala

Asp

Gly Gly 80

Gin Leu 95

Leu Glu

Lys Lys

Lys Asp

Leu Tyr Gin Leu Leu Ser Asp 145 150

Tyr Leu lie Thr Pro Ala Trp 165

Aso Gin Trp Ala Asp Tyr Arg 180

Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile 195

Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu 210 215

Lys Pro Ala Ile Arg Glu Lys 225 230

Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys 245

Asp Pne Ala Lys Arg Arg Glu 260

Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly 275

Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu 290 295

Ala Phe Val Gly Phe Val Leu 305 310

Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala 325

Glu ?r; Tvr Lys Ala Leu Arg 340

Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu 355

Pre Gly Asp Asp Pro Met Leu 3~3 ‘375

Ile His Val Leu His Pro Glu Gly 155160

Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro 170175

Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn 185190

Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu 205

Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu 220

Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys 235240

Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val 250255

Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe 265270

Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu 285

Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly 300

Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp

315 '320

Gly Gly Aru Val His Arg Ala Pro 330 335

Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu 345 '350

Leu Arg Glu Glv Leu Gly Leu Pro 365

Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn 380

Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala 385390

Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala 405

Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu 395400

Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu

410415

Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu 420 425 430

Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val 435440

Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu 450455

Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala 465470

Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp 485

Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly 500

Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu 515520

Val Glu Lys Ile Leu Gin Tyr Arg 530535

Tyr lie Asp Pro Leu Pro Asp Leu 545550

His Thr Arg Phe Asn Gin Thr Ala 565

Ser Asp Pro Asn Leu Gin Asn Ile 580

Arg lie Arg Arg Ala Phe Ile Ala 595600

Leu Asp Tyr Ser Gin Ile Gly Leu 610615

Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe

625630

Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly 645

Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr 660

Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gin 675 680

Ala Gin Ala Phe Ile Glu Arg Tyr 690 695

Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly 445

Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala 460

Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His 475480

Gin Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp 490495

Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg

505510

Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile 525

Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr 540 lie His Pro Arg Thr Gly Arg Leu 555560

Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser 570575

Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gin

585590

Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala 605

Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly 620

Gin Glu Gly Arg Asp Ile His Thr 635 ·640

Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro 650655

Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly

665670

Glu Leu Ala lie Pro Tyr Glu Glu 685

Phe Gin Ser Phe Pro Lys Val Arg 700

Ala Trp lie Glu Lys 705

Glu Thr Leu Phe Gly 725

Val Lys Ser Vai Arg 740

Vai Gin Gly Thr Ala 755

Phe Pro Arg Leu Glu 770

Asp Glu Leu Vai Leu 785

Arg Leu Ala Lvs Glu 805

Leu Glu Val Glu Vai 820

Thr Leu Glu Glu Gly Arg 710 715

Arg Arg Arg Tyr Vai Pro 730

Glu Ala Ala Glu Arg Met 745

Ala Asp Leu Met Lys Leu 760

Glu Met Gly Ala Arg Met 775

Glu Ala Pro Lys Glu Arg 790 795

Vai Met Glu Gly Vai Tyr 810

Gly Ile Gly Glu Asp Trp 825

Arg Arg Gly Tyr Vai 720

Asp Leu Glu Ala Arg 735

Ala Phe Asn Met Pro 750

Ala Met Vai Lys Leu 765

Leu Leu Gin Vai His 780

Ala Glu Ala Vai Ala 800

Pro Leu Ala Vai Pro 815

Leu Ser Ala Lys Glu 830

Claims (22)

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Enzym tepelně stálé DNA polymerázy, který obsahuje sek- venci aminokyselin SerGlni1eXaaLeuArgXaa (SEQ ID No:1), kde Xaa v poloze 4 této sekvence je jakýkoli aminokyselinový zbytek, nikoli však zbytek glutamové kyseliny (Glu) a Xaa v poloze 7 této sekvence je val inový zbytek (Val) nebo isoleucinový zbytek ( 11e) .

2. Enzym tepelně stálé DNA polymerázy, podle nároku 1, který je rekombinantním derivátem přírodně se vyskytující tepelně stálé polymerázy DNA, kde přírodně se vyskytující tepelně stálá DNA polymeráza obsahuje motiv aminokyselinové sekvence SerGlni1eGluLeuArgXaa (SEQ ID No:2), kde Xaa v poloze 7 této sekvence je valinnový zbytek (Val) nebo isoleucinový zbytek ( lie) .

3. Enzym tepelně stálé DNA polymerázy, podle nároku 2, vykazující sníženou diskriminaci proti začleňování neobvyklého nukleotidu v porovnání s přírodně se vyskytující tepelně stálou DNA polymerázou.

4. Tepelně stálá DNA polymeráza podle nároku 3, vykazující schopnost začleňovat neobvyklé nukleotidy je oproti schopnosti odpovídající nativní formy polymerázy začleňovat takové neobvyklé nukleotidy zvýšenou nejméně 20x.

5. Tepelně stálá DNA polymeráza podle nároku 1 až 4, mající postačující aktivitu k použití v sekvenční reakci DNA, která obsahuje neobvyklý nukleotid, kterým je s výhodou ribonuk1eosidtrifosfát a odpovídající obvyklý nukleotid v poměru 1:1 nebo menším.

6. Tepelně stálá DNA polymeráza podle nároku 1 až 4, mající postačující aktivitu k použití v sekvenční reakci DNA, která obsahuje neobvyklý nukleotid, kterým je s výhodou ribonuk1eosidtrifosfát obsažený v koncentraci méně než 100 uM a odpovídající obvyklý nukleotid, který je obsažen v koncentaci vyšší než 100 uM.

7. Tepelně stálý DNA polymerázový enzym podle nároku 1 až 4, který je rekombinantním derivátem enzymu přírodně se vyskytující tepelně stálé DNA polymerázy z organismu voleného ze souboru zahrnujícího Thermus aquaticus, Thermus caldophlilus, Thermus chliarophilus, Thermus filiformis, Thermus flavus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species Z05, Thermus species sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Anaerocellum thermophi1um, Bačilus caldotenax a Bačilus stearothermophi1us.

8. Tepelně stálý DNA polymerázový enzym podle nároku 2 až 6, který je rekombinantním derivátem přírodně se vyskytující tepelně stálé Thermus species DNA polymerázy, s výhodou Tag DNA polymerázy DNA nebo její homologické polymerázy, nejvýhodněji tepelně stálé DNA polymerázy obsahující aminokyselinovou sekvenci LeuAspTyrSerG1 ni1eGluLeuArgValLeuAlaHisLeuSer (SEQ ID NO:5).

9. Tepelně stálý DNA polymerázový enzym podle nároku 1 až 6, mající nejméně 39 %, výhodně 60 %, výhodněji alespoň 80 % homologu sekvence k aminokyselinové sekvenci Tag DNA polymerázy (SEQ ID NO:7).

10. Sekvence nukleové kyseliny kódující enzym tepelně stálé DNA polymerázy podle nároku 1 až 9.

11. Vektor obsahující sekvenci nukleové kyseliny kódující enzym tepelně stálé DNA polymerázy podle nároku 1 až 9.

12. Hostící buňka obsahující sekvenci nukleové kyseliny kódující enzym tepelně stálé DNA polymerázy podle nároku 1 až 9.

13. Způsob přípravy tepelně stálé DNA polymerázy podle ná- roku 1 až 9, vyznačující se tím, že (a) se kultivuje hostící buňka podle nároku 12 za podmínek, které podporují expresi enzymu tepelně stálé DNA polymerázy a (b) se izoluje enzym tepelně stálé DNA polymerázy z hostící buňky nebo z kultivačního prostředí.

14. Tepelně stálý DNA polymerázový enzym připravítelný způsobem podle nároku 13.

15. Použití tepelně stálého DNA polymerázového enzymu podle nároku 1 až 9 k zesilování nukleových kyselin nebo v sekvenčních reakcích.

16. Prostředek pro použití v DNA sekvenční reakci, v yznačující se tím, že ho tvoří matrice nukleové kyseliny, oligonukleotidový primer komplementární k uvedené matrici, tepelně stálá DNA polymeráza podle nároku 1 až 9, směs obvyklých dNTP a alespoň jeden neobvyklý nukleotid, kde poměr neobvyklého nukleotidu k obvyklému nukleotidu je 1:1 nebo menší.

17. Prostředek podle nároku 16, vyznačuj íci se t i m, že neobyklým nukleotidem je ribonukleotid, přičemž je tento ribonukleotid s výhodou obsažen v koncentraci nižší než 100 uM a odpovídající obvyklý nukleotid je obsažen v koncentraci vyšší než 100 14M.

18. Prostředek podle nároku 17, vyznačuj íci se t i m, že neobvyklý nukleotid je neznačený.

19.

Způsob sekvenční analysy terčové nukleové kyseliny, vyznačující se tím, že se (a) zajišťuje neobvyklý nukleotid a příslušný obvyklý nukleotid v sekvenční reakci DNA, kde neobvyklý nukleotid a odpovídající obvyklý nukleotid jsou v poměru nižším než 1 '· 1 , (b) zpracovává se reakční směs ze stupně (a) v přítomnosti tepelně stálé DNA polymerázy podle nároku 1 až 9 za podmínek extense primeru k zajištění produktu extense primeru obsahujících neobvyklý nukleotid, (cl zpracovávají se produkty extense primeru ze stupně (b) za podmínek pro hydrolysu produktu extense primeru, (dl štěpí se produkty reakce ze stupně (cl a (e) stanoví se sekvence terčové nukleové kyseliny.

20. Způsob sekvenční analysy podle nároku 19, v y z n a- čující se tím, že neobvyklým nukleotidem je ribonukleotid, obsažený s výhodou v koncentraci 0,1 qM až 100 uM.

21 Způsob sekvenční analysy podle nároku 19, v y z n a- čující se tím, že odpovídající obvyklý nukleotid je obsažen v koncentraci 50 qM až 500 ijM .

22. Kit pro sekvenční analysu nukleové kyseliny obsahující tepelně stálou DNA polymerázu podle nároku 1 až 9, vyznačující se tím, že obsahuje další reakční činidla užitečná při takové sekvenční analyse, jako je například několik o1 igonuk1eotidových primerů, směs obvyklých dNTP a alespoň jeden neobvyklý nukleotid, kde poměr neobvyklého nukleotidu k obvyklému nukleotidu je s výhodou menší než 1.