CZ231292A3 - Proteins - Google Patents

Description

Ribotoxiny jsou účinné inhibitory syntézy bílkovin. Předpokládá se o nich, že působí jako enzymy na 28S rRNA eukaryotických ribosomú a mohou být rozděleny do dvou skupin a kol., 1985, Ann Rev Microbiol., 39, 649-672, a kol., 1990, publikované v Hill, W.H. a kol., Ribosome Structure, Function and Evolution,

American Society of Microbiology, Washington, DC, 203-214). Restriktocin, mitogillin a alfa-sarcin patří do třídy, která štěpí jednoduché fosfodiesterové vazby. Ricin patři do jiné třídy, která štěpí N-glykosidickou vazbu mezi basí a ribosou. Nukleotidovou sekvenci restriktocinového genu popsali Lamy, B. a Davies,J. v Nucleíc Acids Research, 1991, 19, 1001-1006.

Imunotoxiny jsou příkladem konjugátu, který je tvořen dvěma složkami, jmenovité toxinem a imunoglobulinem, nebo protilátkou. Složky jsou obvykle spojeny prostřednictvím chemické spojky, avšak mohou být též spojeny přímo. Ribotoxiny jako je například restriktocin, mohou být použity jako toxinová komponenta imunotoxinů, vázaná k protilátce prostřednictvím nejrůznéjších chemických spojek. Známé metody zahrnují derivatisaci restriktocinu činidly jako imínothíolan (ačkoli i jiná derivatisační činidla např. N-sukcinimidyl3-(2-pyridyldithio)propionát -zde dále pod zkratkou SPDP mohou být použita) k zavedení sulfhydrylové funkční skupiny a vytvoření struktury zesitněné disulfidovými můstky s vhodně derivatisovanou protilátkou. V důsledku přirozené nahodilosti chemické derivatisace na, primárně (ačkoli ne nezbytně), amínoskupinách jako jsou např. v molekule restriktocinu, z nichž 17 obsahuje alfa aminoskupinu, vzniká heterogenní produkt, obsahující nederivatisovaný restriktocin, mono, di,

V tri atd. derivatisované molekuly, které po konjugaci s protilátkou (1,2,3,atd. molů restriktocinu/mol protlátky nebo popř. 1,2, 3, atd. protilátky/mol restnktoc inu) může poskytnout komplexní škálu produktů. Takový heterogenní produkt se v jednotlivých vsádkách vyznačuje nežádoucí variabilitou, která snižuje celkový výtěžek. Taková variabilita mezi výrobními šaržemi je zejména nežádoucí ve farmaceutické oblasti, kde produktem může být např. imunotoxin, jehož protilátka je selektivní k nádorům a je používán k léčení rakoviny.

Navíc chemická derivatisace může modifikovat skupiny v blízkosti aktivního centra molekuly, a tak ovlivňovat biologickou aktivitu derivatisovaného toxinu.

Předkládaný vynález se snaží překonat tyto nevýhody poskytnutím proteinového analogu s obsahem vhodné sulfhydrylové funkční skupiny umístěné tak, že určitý aminokyselinový zbytek v bílkovinné sekvenci poskytuje jediné konjugační místo v definované poloze.

Jedním z aspektů předkládaného vynálezu je poskytnutí bílkovinného analogu přírodního ribotoxinu, kde jak proteinový analog, tak nativní ribotoxin mohou štěpit pouze jedinou fosfodiesterovou vazbu 28S rRNA v 60S ribosomální podjednotce, a kde proteinový analog obsahuje pouze jediný cystein dostupný pro vznik kovalentní vazby s druhou složkou, zatímco v přírodním ribotoxinu není cystein přítomen.

Výraz může štěpit pouze jedinou fosfodiesterovou vazbu 28S rRNA v 60Ξ ribosomální podjednotce, tak jak je zde používán, se vztahuje na mimořádné selektivní působení třídy ribotoxinu představovaných restriktocinem, mitogillinem a alfa-sarcinem (Wool, I.G., Jan 1984, Trends Biochem. Sci. 14-17). Proto si proteinové analogy, které jsou předmětem vynálezu zásadně podrží biologickou aktivitu ribotoxinů jako jsou restriktocin, mitogillin a alfa-sarcin. Předkládaný vynález pak dále zveřejňuje místa molekuly ribotoxinů, která mohou být modifikována podle předkládaného vynálezu bez podstatné ztráty biologické aktivity.

Nedotčené eukaryontní ribosomy mají sedimentační koeficient SOS a jsou složeny z podjednotek 60Ξ a 40S. 60S podjednotka obsahuje 23Ξ rRNA o délce asi 4700 nukleotidů. Alfa-sarcin poskytuje o 393 nukleotidech odvozený ze 3 konce 28S rRNA a štěpení poskytuje 3 fosfátové a 5 hydroxylové skupiny. Substrát nesmí být volná rRNA, neboť s volnou 28S rRNA toxin způsobuje rozsáhlou degradaci nukleové kyseliny. Fragment může také být vytvářen z intaktnich 80Ξ ribosomů, avšak nikoliv ze 40S ribosomálních podjednotek. Vzhledem k vysoce selektivnímu působení této struktura mimořádně konservativní.

jednotlivou fosfodiesterovou vazbu 28S rRNA v 60S ribosomální podjednotce muže být stanovována metodou podle Endo, Y. a Wool, I.G. (1982), J. Biol. Chem. 257, 9054-9060. Výhodně má proteinový analog nejméně 5% aktivity nativní sekvence ribotoxinů, ještě výhodněji má proteinový analog přinejmenším 10% aktivity nativní sekvence ribotoxinů a nejlépe má proteinový analog alespoň 12% aktivity nativní sekvence ribotoxinů. Aktivita je stanovována z inhibice synthesy bílkovin podle nížeuvedeného odstavce 8.

třídy ribotoxinů je Schopnost štěpit

Výraz jeden cystein dostupný pro kovalentní vazbu tak jak je 2de používán znamená, že zatímco proteinový analog může anebo také nemusí obsahovat jiné molekuly cysteinu, pouze jedna je snadno schopna vytvořit kovalentní vazbu s druhou složkou za použití konjugačních technik v oboru Obvykle nativní ribotoxin obsahuje další molekuly které nejsou snadno dostupné ke kovalentní vazbě nejsou dostupné ke mohou být například mohou být skryty ve běžných. cysteinu s druhou složkou. Cysteiny které kovalentní vazbě s druhou složkou součástí disulfidických můstků nebo středu bílkoviny nebo uvnitř hluboké povrchové štěrbiny. S výhodou je cystein dostupný pro kovalentní vazbu přítomen na povrchu bílkoviny a je výhodné nalézá-li se daleko od jakékoli oblasti spjaté s biologickou aktivitou bílkoviny jako je například aktivní centrum.

Druhá složka odpovídá molekule, která může být individuální molekulou nebo součástí makromolekuly, polymeru nebo pevné fáze. S výhodou je druhou složkou činidlo jako je například imunoglobulin nebo interleukin 2, které jsou schopné vázat se selektivně k tumorům, výhodněji protein který se selektivně váže k tumorům, imunoglobulin, který se váže selektivně k tumorům a zejména imunoglobulin třídy vázat selektivně k tumorům, pro selektivní vazbu ke kolorektálním tumorům je monoklonální protilátka C242 jak je popsána v mezinárodní patentové přihlášce WO 92/01470. Imunoglobulinem či protilátkou jsou zde míněny jak celé molekuly, tak i jejich fragmenty, například známé fragmenty Fab, Fv a jednoduchý řetězec Fv (Methods in Enzymology 178, Academie Press 1989 a Bio/Technology 9, 545-551, 1991).

G který je Preferovanou schopen se protilátkou

Výraz nativní ribotoxin zahrnuje ribotoxiny jak jsou nacházeny v přírodě nebo jejich rekombinantní verse a analogy takových ribotoxinů které nemají cysteiny dostupné pro kovalentní vazbu s jinou složkou nebo nemají více než jeden cystein dostupný pro kovalentní vazbu ke druhé složce.

S výhodou jsou nativními ribotoxiny restriktocin, mitogillin a alfa-sarcin, ještě lépe restriktocin a mitogillin a zejména restriktocin. Proteinový analog může být odvozen od nativního ribotoxinu nebo od jjiného analogu nativního ribotoxinu pomocí metod genového inženýrství jako například řízenou mutagenezí. Například pokud nativní ribotoxin obsahuje více než jednu molekulu cysteinu dostupnou pro kovalentní vazbu s druhou složkou, pak derivatizace analogu bude zahrnovat odstranění cysteinů až zbude pouze jeden. S výhodou však v případě, že nativní ribotoxin neobsahuje žádné cysteiny dostupné pro vazbu, derivatizace zahrnuje zabudování cysteinu. Odstranění nebo přidání cysteinu může zahrnovat substituci některé již přítomné aminokyseliny v nativním ribotoxinu. Tak může býtcystein dostupný pro kovalentní vazbu získán například substitucí jednoho z cysteinů v některém neesenciálním disulfidovém můstku, čímž se druhý cystein stane dostupným pro kovalentní vazbu druhé složky. Obecně však disulfidové můstky nepředstavují .preferované místo k substituci. Cystein může být také přidán prodloužením N- nebo C-konce nativního ribotoxinu či z jiného analogu nativního ribotoxinu, s výhodou o 1-50 aminokyselinách, ještě lépe o 1-40 aminokyselinách, ještě lépe o 1-30 aminokyselinách, ještě lépe o 1-20 aminokyselinách, ješté lépe o 1-10 aminokyselinách, ještě lépe o 1-5 aminokyselinách a nejlépe o dvou aminokyselinách. Proteinový analog může být také připraven prostřednictvím totální genové synthesy* z oligonukleotidů. Poznatky o synthese oligonukleotidů byly shrnuty R.J. Gaitem v Oligonicleotide Synthesis, IRL Press

1984. Totální genová synthesa byla popsána M. Edvardsem v International Biotechnology Lab. 5(3) 19-25, 1987.

Výhodné anslnnv γογ*·-;,.!.,.,., ^γ- — —představují;

¹⁵ analogy restriktocinu, v nichž kterýkoliv z následujících aminokyselinových zbytků zahrnuje _cystein: Lys 13, tys 20, Lys 28, Lys 60, Lys ₆₃, _Lys ₆₉, _SeJ_ ₈₂ 88, Lys 106, Lys 110 a Lys i2š; a ii) nativní restriktocin obsahující c-koncové prodloužení Cys 150-Gly 151; _a iii> nativní restriktocin ·- tuxíocin obsahující N-koncové prodloužení Gly-Cys restriktocinu.

Obzvláště výhodné analogy restriktocinu představují·

i) analogy restriktocinu v _nlch_ž kterýkoliv z následujících aminokyselinových zbytků zahrnuje cystein: Lys 13, Ser 82, Lys 106, Lys 110; a

11) nativní restriktocin obsahující C-koncové prodloužení Cys 150-Gly 151.

Výhodné analogy mitogillinu představují: í) analogy mitogillinu v nichž kterýkoliv z následujících aminokyselinových zbytků zahrnuje cystein: Lys 13, Lys 20, Lys 28, Lys 63, Lys 69, Ser 82, Lys 88, Lys 106, Lys 110 a Lys 128; a ii) nativní mitogillín obsahující c-koncové prodloužení Cys 150-Gly 151; a iil) nativní mitogillín obsahující _N-ko„cové prodloužení Gly-Cys mitogillinu.

Ί

Obzvláště výhodné analogy mitogillinu představují;

i) analogy mitogillinu v nichž kterýkoliv následujících aminokyselinových zbytků zahrnuje cystein: Lys 13, Ser 82, Lys 106, Lys 110; a ii) nativní mitogillin obsahující C-koncové prodloužení Cys 150-Gly 151.

Výhodné analogy alfa-sarcinu představují:

i) analogy alfa-sarcinu v nichž kterýkoliv z následujících aminokyselinových zbytků zahrnuje cystein: Lys 14, Lys 21, Lys 29, Lys 61, Lys 64, Lys 70, Ser 83, Lys 89, Lys 107, Lys 111 a Lys 129; a ii) nativní alfa-sarcin obsahující C-koncové prodloužení Cys 151-Gly 152; a iii) nativní alfa-sarcin obsahující N-koncové prodloužení Gly-Cys alfa-sarcinu.

Obzvláště výhodné analogy alfa-sarcinu představují:

i) analogy alfa-sarcinu v nichž kterýkoliv z následujících aminokyselinových zbytků zahrnuje cystein: Lys 14, Ser 83, Lys 107, Lys lil; a ii) nativní mitogillin obsahující C-koncové prodloužení Cys 151-Gly 152.

Z jiného hlediska předkládaný vynález poskytuje konjugát obsahující složku kovalentně vázanou k proteinovému analogu jak je uvedeno výše. S výhodou je konjugátem imunotoxin a zejména imunotoxin selektivní k tumorům. S výhodou má konjugát účinnost měřenou prostřednictvím in vitro stanovení cytotoxicity popsaného v sekci 9.1, jako 10E-7M nebo méně, ještě lépe konjugát má účinnost 10E-8M nebo méně a nejlépe má konjugát účinnost 10E-9M nebo méně.

Z jiného hlediska předkládaný vynález poskytuje sekvenci polynukleotidů schopnou kočovat bílkovinný analog jak je popsáno výše. Výraz schopný kodovat odpovídá degeneraci genetického kódu, kde některe aminokyseliny jsou kočovány více než jedním tripletem nukleotidů či kodonem.

Z jiného hlediska předkládaný vynález poskytuje replikativní klonovací vektor skládající se z polynukleotidové sekvence popsané výše jako je například plasmid.

Z jiného hlediska předkládaný vynález popisuje replikativní expresní vektor tvořený výše popsanou polynukieotidovou sekvencí jako je například plasmid.

Z jiného hlediska předkládaný vynález poskytuje rekombinantní hostitelské buňky transformované, jak je výše popsáno, replikativním expresním vektorem. Hostitelské buňky mohou být buňkami prokaryotními nebo eukaryotními, jako jsou například buňky bakteriální, kvasnióné nebo savčí.

Z jiného hlediska předkládaný vynález popisuje metodu pro produkci bílkovinného analogu, která zahrnuje kultivaci výše popsaných rekombinantních hostitelských buněk. Rekombinantní restriktocin exprimovaný v E.coli může být produkován bud v rozpustné formě (zvláště po úpravě expresního konstruktu a růstových podmínek), nebo v nerozpustných inklusních částicích. Exprese eukaryotických polypeptidů v E.coli je známa z literatury a byla popsána Martsonem F.A.O. v Biochem,J, 1986, 240, s.1-12 a v Methods in Enzymology 185, Academie Press 1990. Purifikace bílkovin akumulujících se v rozpustné formě může být provedena po promýváním frakcí pelet činidlem, solubilisací v buněčné lysy {po sonikaci nebo homogenisací za vysokého tlaku), odstředěni, ionexovou chromatografii, gelovou chromatografii, srážením pomocí síranu amonného, chromatografii využívající triazinová barviva, a to i různou kombinací těchto metod. Renaturace a purifikace nerozpustného restriktocinu může být po buněčné lysy (po sonikaci nebo homogenizaci za vysokého tlaku) a odstředění provedena pufrem nebo mírným chaotropním chaotropních činidlech (např. 6M guanidin.HC1, 8M močovina, detergenty bez nebo s redukujícími látkami), za niž následuje kontrolované odstranění chaotropniho činidla (zředěním nebo dialýsou) a vytvořením disulfidových vazeb oxidačními reakcemi (např. s použitím rozpuštěného vzduchu, glutathionových redoxních pufrů atd.) Výsledný solubilisovaný renaturovaný restriktocin může být dále purifikován.

Alternativně může být restriktocin exprimován vhodným kvasničným systémem s vylučováním dohotovené bílkoviny do kultivačního media za použití již známých postupů (Methods in Enzymology 194, Academie Press 1991 a Methods in Yeast genetics od Rose, M. Winston, F. a Hieter, Ρ. , Cold Spring Harbour Press 1990). Expressni systém může zahrnovat sekreční sekvence z kvasinek nebo sekreční sekvence z Aspergilu, jako například restriktocinovou presekvenci k podpoře vylučování aktivní bílkoviny do media efektivním způsobem. Purifikace z kvasničných supernatantů lze dosáhnout za použití standardních metod.

Podle jiného hlediska předkládaný vynález poskytuje farmaceutickou komposicí obsahující bílkovinný analog kovalentné vázaný k partnerské molekule jako aktivní složka ve spojení s farmaceutickým excipientem nebo přenašečem. S výhodou komposice obsahuje účinné množství řečené aktivní složky.

Podle jiného hlediska předkládaný vynález poskytuje farmaceutickou komposici obsahující výšepopsaný konjugát jako aktivní složku ve spojeni s farmaceutickým excipientem nabo přenašečem. S výhodou je konjugátem imunotoxin a zejména imunotoxin selektivní vůči tumorům. s výhodou komposice obsahuje účinné množství řečené aktivní složky.

Farmaceutické komposice, které jsou předmětem předkládaného vynálezu mohou mít celou skálu dávkovačích komposice, které jsou mohou být dávkovány Zvláštní nitrosvalová forem. Obecně řečeno farmaceutické předmětem předkládaného vynálezu nitrosvalová, s výhodou nitrožilně.

farmaceutická komposice je taková, která je připravena ve formě jednotkové dávky vhodné pro injekční aplikaci. Takže zejména vhodnými komposicemi jsou roztoky, emulse či suspense imunokonjugátu nebo bílkovinného analoga vázaného ke druhé složce ve shodě s farmaceuticky přijatelným nosným mediem či ředící látkou. Vhodné přenašeče nebo ředící látky zahrnují vodná nosná media, například vodu či fysiologický roztok, a nevodná media, například fixované oleje či liposomy. Komposice múze zahrnovat činidla zvyšující stabilitu. Například může komposice obsahovat pufr. Koncentrace aktivní složky se mění, ale obecně bývá aktivní složka formulována v koncentracích kolem 1 až 10 mg/kg.

Podle jiného aspektu předkládaného vynálezu je zde poskytována metoda ošetření tumoru nebo tumorů, které se skládá z potřebného ošetření člověka nebo zvířete

I 1 farmaceuticky aktivním množstvím konjugátu popsaného výše. Ξ výhodou je tímto konjugátem imunotoxin, a zejména imunotoxin selektivní vůči tumorům.

Podle jiného aspektu předkládaného vynálezu je zde poskytován konjugát, jak je popsáno výše, určený k využiti jako aktivní terapeutická substance. Ξ výhodou je tímto konjugátem imunotoxin, a zejména imunotoxin selektivní vůči tumorům.

Podle jiného aspektu předkládaného vynálezu je zde poskytován využití bílkovinného analogu k přípravě konjugátu jakým je například imunotoxin.

Podle jiného aspektu předkládaného vynálezu je zde poskytován metoda přípravy konjugátu, kterážto metoda sestává z vazby bílkovinného analogu ke druhé složce jak je popsáno výše.

Vynález bude nyni ilustrován , ale nikoliv omezován odkazem na následující příklady.

PŘÍKLAD l - Struktura bílkovinného analogu.

Struktury restriktocinu, mitogillinu a byly srovnávány, Lamy, B. a Davies, J. v Research, 1991, 19, 1001-1006. restriktocin o 149 aminokyselinách produkovaná organismem restriktus. Obsahuje 4 cysteinové zbytky alfa-sarcinu Nucleic Acid je bílkovina

Aspergillus o nichž se předpokládá, že vytváří dvě disulfidové vazby. Mitogillin je identický s restriktocinem s výjimkou polohy 52 kde je serin restriktocinu zaměněn asparaginem v mitogillinu. Restriktocin

2 a alfa-sarcin aminokyselin. bílkovin byla jsou z 86% homologni ve své Díky extrémně selektivnímu účinku jejich struktura vysoce konservována sekvenci této třídy

Bílkovinné analogy předkládaného vynálezu zahrnují restriktocin a mitogillin v nichž je na C-konci přidáno prodloužení o Cys 150-Gly 151 a alfa-sarcin v němž je přidáno r> i r*_V r\ r* i 1 nu van π Γ*\τ^ Ί R 1 - Γ Ί v 1 R O R i 1 V/mU i nnó Λ η 1 CvT U

----— * * ---J <-----předkládaného vynálezu zahrnují restriktocin a mitogillin v nichž je Lys 13 zaměněn za cystein a alfa-sarcin v němž je Lys 14 zaměněn za cystein.

Bílkovinné analogy předkládaného vynálezu zahrnují restriktocin a mitogillin v nichž je Lys 106 zaměněn za cystein a alfa-sarcin v němž je Lys 107 zaměněn za cystein.

Bílkovinné analogy předkládaného vynálezu zahrnují restriktocin a mitogillin v nichž je Lys 110 zaměněn za cystein a alfa-sarcin, v němž je Lys 111 zaměněn za cystein.

Bílkovinné analogy předkládaného vynálezu zahrnují restriktocin a mitogillin v nichž je Ser 82 zaměněn za cystein a alfa-sarcin v němž je Ser 83 zaměněn za cystein.

Oblasti bílkovin, které jsou nevhodné pro přípravu analogů tohoto vynálezu jsou popsány níže. Smyčka tvořená zbytky 34-43 je velmi tudíž změna Lys 42 bílkoviny s podobnou blízko aktivního místa restriktocinu a na cystein by mohla vést ke vzniku aktivitou. Podobné závěry jsou platné pro odpovídající zbytky v alfa-sarcinu.

3

Dále změna případných katalytických zbytků His 136 a Glu 95 v restriktocinu může vést ke vzniku neaktivní bílkoviny. Náhrada cysteinovými zbytky přiléhajícími k již existujícím v molekule zbytkům cysteinu by mohla vest ke vzniku nesprávných disulfidových můstků, které opět mohou způsobit vznik neaktivní molekulární struktury. Podobné závěry jsou platné pro odpovídající zbytky v alfa-sarcinu.

Substituce zbytků, která může být důležitá k udržení celkové strukturní konformace (včetně výše popsaných míst přiléhajících k cysteinu) by mohla vést ke vzniku neaktivní bílkoviny, a to vzhledem k deformaci oblasti aktivního místa nebo větších konformačních nebo strukturálních změn, které brání vytvoření aktivní struktury. Takové zbytky v případě restriktocinu by mohly zahrnovat residua prolinu (např. Pro 97, Pro 100, Pro 112, Pro 118, Pro 126 atd.) nebo residua ve struktuře alfa helixu molekuly (zbytky 15-28). Podobné závěry jsou platné pro odpovídající zbytky v alfa-sarcinu.

Příklad 2 - Příprava genů kódujících analogy restriktocinu

Všechny metodologické postupy, není-li uvedeno jinak, představují standardní techniky používané v molekulární biologii popsané v publikaci Maniatis, T. a kol. (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring harbour Press, New York.

2.1 Klonování sekvence kódující restriktocin z mikroorganismu Aspergillus restrictus.

Aspergillus restrictus byl získán ze sbírky American

4

Type Culture Collection (ATCC 34475). Spory plísně byly použity k inokulaci media, které obsahovalo 2% w/v sojové moučky, 2% w/v kukuřičné moučky, 1% w/v kukuřičného výluhu, 0,5% uhličitan vápenatý, 1% pepton a 0,5% odpěňovače obsahuiíciho oktadekanol v živočišném oleii. 50 ml kulturv byly kultivovány v 250 ml konických baňkách za třepání při 30°C po dobu 48 hodin.

conrimnuá πμδ isolována z Aspergi1lus resfrictus.

jak je níže popsáno. Obsah devíti třepaných baněk jak uvedeno výše byl zfiltrován přes filtr s velikostí pórů 2 mikrometry.

Z materiálu zadrženého na filtru byly pomocí lžičky přeneseny dávky o přibližném objemu asi 5 centimetrů krychlových do tekutého dusíku a homogenizovány (deseti pulsy o 15 sekundách) v homogemzátoru Waring při nastavení na vysoké otáčky. Homogenizovaný materiál byl přenesen do kádinky a zbylý tekutý dusík ponechán volně odpařit. K této směsi bylo přidáno 150 ml 0,3M octanu sodného, 15 ml 20% w/v dodecylsulfátu sodného a 15 ml směsi fenol/chloroform (připravené podle: Maniatis a kol., Molecular Cloning;

A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press pp. 458-459, 1982). Směs byla míchána po dobu 5 minut. Získaná emulse byla odstředěna při 20000 g po 5 minut. DNA byla srážena z vodné fáze přídavkem etanolu (450 ml) a odstředěním při 20 OOOg po dobu 5 minut. Pelet byl promyt 70% etanolem v/v, vysušen ve vakuu a resuspendován v TE-pufru pH8,0 (2 ml, připravený dle Maniatis a kol., Molecular Cloning;

A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press p. 448, 1982) s obsahem ribonukleasy A (25 ul s obsahem 100 mikrogramů na ml v TE jak uvedeno výše, zahřátém na 100°C na 5 minut). Pufr TE obsahuje 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pří pH 8. Výsledný roztok byl inkubován při 37°C po 150 minut, potom

5 byla přidána voda (7ml) a 3,OM octan sodný (lni). DNA byla sražena přídavkem etanolu (30 ml) a odstředěna při 12 OOOg jednu minutu. Pelet byl resuspendován v 0,3M octanu sodném {10 ml) a extrahován směsí fenol/chloroform (5ml, jak uvedeno výše). Výsledná emulse byla odstředěna při 12 OOOg po 5 minut. DNA byla sražena z vodné fáze přídavkem etanolu (30ml) a odstředěním při 12 OOOg po dobu 1 minuty. Pelet byl promyt 70% v/v etanolem (40ml), vysušen ve vakuu a resuspendován v pufru TE pH8,0 (řml, připravený jak uvedeno výše). Tento roztok genomové DNA Aspergillus restrictus byl skladován při -20°C.

Část DNA připravená výšepopsaným postupem, obsahující kódující sekvence pro hotový restriktocin byla zmnožena za použití řetězové polymerasové reakce (PCR), jak je popsáno v: Kleppe a kol., J. Mol. Biol., 56, 341-361, (1971), a Saiki a kol., Science, 239, 487-491, (1988). Řetězová polymerásová reakce (PCR) byla prováděna za použití termostabilní DNA polymerasy z bakterie Thermus aquaticus popsané v: Chien a kol., Biochemistry, 27, 1550-1557, (1976).

Oligodeoxyribonukleotidové (dále jen jako oligonukleotidové) primery byly navrženy pro polymerasovou řetězovou reakci podle možných kódujících sekvencí DNA restriktocinu. Toto bylo učiněno s pomocí primární (sekvence aminokyselin) struktury restriktocinu, popsané LOpez-Otinem a kol., (Eur. J. Biochem. 143, p621-634). Nukleotidové sekvence oligonukleotidových primerů byly variabilní ve spocifických polohách za účelem umožnění degenerace genetického kódu. Zvláštní vlastnosti byly zavedeny do sekvencí oligonukleotidových primerů, avšak tak, že ne úplně všechny kodony pro danou aminokyselinu byly přítomny. Účelem bylo maximalisovat využití kodonů pro ty kodony, které se nalézají ve vysoce exprimovaných genech v E. coli. Předpokládá se, že toto je obzvláště důležité na 5 konci kódující sekvence. Další vlastnosti návrhu oligonukleotidového primeru (nikoliv ihned využitou) bylo zavedeni schopnosti primeru generovat analogy proteinu zakcdovanéhc oligonukleotidovými primery polymerásové reakci (PCR). oligonukleotidového primeru vdhaiic .--.---X -- - . - — -- x co l. x r\L,n χ enzym óa při použití v řetězové

Další vlastností návrhu bylo zavedení rozpoznávací ubciem umožněni Klonovaní produktů řetězové polymerásové reakce (PCR) získaných při použití polynukleotidových primerů.

Zmnožení genomové DNA Aspergillus restrictus pomocí řetězové polymerásové reakce (PCR) bylo uskutečněno smícháním 1 mikrolitru roztoku s oligonukleotidovým primerem

SEQ.ID NO SEQ.ID NO aquaticus

1, 116 pikomoly oligonukleotidového primeru as 1,25 jednotkami DNA polymerasy z Thermus (Cetus Amplitaq) ve 100 mikrolitrech roztoku, který také obsahoval (v konečné koncentraci) 100 mikromolů každého ze čtyř deoxynukleosidtrifosfátů, dATP, dTTP, dCTP a dGTP, l,2mM chloridu hořečnatého, lOmM Tris/HCl pH 8,3, 50mM chloridu draselného a 0.01% w/v želatiny. Tento roztok byl převrstven lehkým minerálním olejem (Sigma) a byla s nim provedena termální cyklace. Termální cyklace se skládala z 10 cyklů při 94°C po 1 minutu, 37°C po 2 minuty a 55°C po 2 minuty, následovaných 20 cykly při 94°C po 1 minutu, 60°C minuty a z konečné inkubace při 72°C Po gelové elektroforese byl hlavní produkt isolován s použitím DEAE eelulosové membrány (NA45 páper) jak je popsáno v: Maniatis a kol., (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Press, New po 2 minuty a 72°C po 2 prodloužené na 5 minut.

7

York. Metoda popsaná v Maniatisovx je založena na Dretzena a kol., (1981) Anal. Biochem. 112, 295. je membrána DEAE celulosy dodávaná firmou a Schull.

výsledcích NA4 5 páper Schleicher

Výchozím záměrem bylo klonovat produkt PCR do M13mpll přes místa PvuII a Sal I, neboř oligonukleotidy SEQ, ID NO.

a 2 obsahovaly tomu Sekvenování takových restriktocinový gen je odpovídající rozpoznávací sekvence, klonů M13 však ukázalo, že zkomolený, což bylo připisováno a později potvrzeno, jako důsledek přítomnosti rozpoznávací sekvence PvuII uvnitř genové sekvence restriktocinu, Proto byla provedena druhá reakce PCR k zavedení jiných klonovacích míst do produktu PCR, 5 k restriktocinovému genu. Přibližné 1 mikrolitr eluátu byl reamplifikován, jak je uvedeno výše, se 100 pikomoly každého z oligonukleotidových primerů SEQ.ID NO. 3 a 4. Termální cyklace se skládala z 5 cyklů prováděných při 94°C po dobu 1 minuty, 37°C po 2 minuty a 55°C po dobu 2 minut, následovaných 25 cykly při 94°C po dobu 1 minuty, 60°C po dobu 2 minut a 72°C po dobu 2 minut a z konečné inkubace při 72°C prodloužené na 5 minut. Hlavní produkt byl isolován po elektroforese v agarosovém gelu pomocí membrány NA45 páper jak je popsáno výše.

Purifikovaný produkt PCR byl štěpen BamHI a Sáli a ligován do M13mpll štěpeného pomocí Sáli a BamHI za použití T4 DNA ligasy. Ligační směsi byly použity k transfekci E.

coli, kmen TG1. TG1 s Oligonucleotide-Directed In-Vitro Version 2 dodávaný firmou Amersham vhodný pro postup řízené mutagenese avšak jiné hostitelské kmeny M13 byl poskytnut

Mutagenesis System (kód RPN-1523) a byl jak je popsáno níže, které jsou nositeli

F-pilusu mohou být také použity, jako například JM101 (ATCC No. 33876). Kmen TG1 má publikovaný genotyp K12, delta(lac-pro), supE,thi,hsdD5/F traD36, proA⁺B⁺,láci , lacZ delta M15 (Gibson 1984, Ph.D. thesis, University of

Cambridge, U.K.) a IGl je volné dostupný například z E. coli Genetic Stock Centre, Yaie University, USA. restriktocinové sekvence byly kontrolovány s použitím přístupu s terminací dideoxy řetězce, jako je například použití sekvenačního kitu •‘Sequenase version 2 dodávaného firmou United States Biochemicals. Nejprve byly použity sekvenční primery M13 a M13 reverse (SEQ. ID NO. 5a 6). Nejdříve byly použity primer M13 a M13 reversní sekvenační primer (SEQ. ID č.5 a 6). Sekvence restriktocinu byla dokončena za použití sekvenačních primerů s SEQ TD NOS. 7.8 a 9. Závěrem byla získána sekvence (SEQ. ID. NO. 10) kódující hotový divoký typ restriktocinu. Lemovací sekvence až ke klonovacím místům BamHI a Sáli měly následující uspořádání:

Na 5 konci sekvence kódující restriktocin:

- GGATCCTGCA GCT ACT TGG ACT ...........

Ala Thr Trp Thr

Na 3 konci sekvence kódující restriktocin:

...........CTG TGT AGC CAC TAA TAA TAG TCGAC-3

Leu Cys Ser His End End End

Klon M13-restriktocin byl dále štěpen restrikčními endonukleasami Sáli a HindlII, aby následující subklonování bylo jednodušší. Malý (přibližně 0,6Kb) fragment Sall-HindlII pocházející z pBR322 byl dále klonován do páteře

M13-restriktocinového klonu. To mělo za následek ztrátu Pstl rozpoznávacího místa přiléhajícího k místu Sáli ležícího na 3 konci restriktocinového genu.

Získaná sekvence kódující restriktocin byla shodná s publikovanou aminokyselinovou sekvencí hotového restriktocinu kromě posice 115. Publikovaná aminokyselinová sekvence obsahovala asparaginový zbytek v posici 115 (Lopez-Otin a kol. (1984), 143, s.621-634), avšak naše sekvenované PCR produkty naznačovaly v pozici 115 přítomnost zbytku kyseliny aspartové (GAC). Zveřejnění genomové sekvence restriktocinu (Lamy,B. a Davies, J. (1991) Nucleic acids Pes. 19 (5), s.1001-1006) podpořilo naši domněnku o tom, že původně publikovaná aminokyselinová sekvence byla nesprávná. Tudíž naše sekvence kódující restriktocin (sekvence ID no.10) kóduje tutéž bílkovinu, která byla předpovězena z genomové sekvence pro hotový restriktocin. Mělo by být však zdůrazněno, že nukleotidová sekvence byla odlišná na 5 (a 3 ) koncích vzhledem k použití metody PCR pro klonování genu.

2.2. Vznik sekvenci kódujících analogy restriktocinu

Důvodem klonování sekvence kódující restriktocin do vektoru M13 byla snaha umožnit řízenou mutagenezi a tím vytvářet analogy s požadovanými vlastnostmi. Mutageneze byla prováděna za pomoci soupravy Oligonucleotide-Directed In Vitro Mutagenesis System Version 2 dodávané firmou Amersham (kod RPN-1523). Tato souprava využívá metody popsané Sayersem a kol. (1988) Nucleic Acids Res., 16, s. 791-802).

fosforylovaný mutagenní oligonukleotid (viz dále) byl připojen k jednovláknovému templátu (M13 restriktocinový

0 plasmid popsaný výše) a v přítomnosti T4 DNA heteroduplexu.

bylo umožněno V L 3 3. Ϊ3 Č 1I C w, V

Selektivní inkorporací jako templát uzavřené kruhové molekuly a T4 DNA ligasy, kdy došlo i n. a 1 rozšířen Klenowovou polymerasou ligasy za vzniku mutantního odstranění nezmutovaného vlákna thionukleotidu do zmutovaného ýse popsaně syntézy prováděné m vitro. Štěpeni restrikční endonukleasou (Ncil), která není schopná štěpit fosforothioat DNA, vede ke vzniku zlomu pouze u vlákna templátů. Zlom představuje místo pro exonukleasu III, která byla použita pru štěpeni a odstranění nezmutovaného (neobsahujícího fosforothioat) vlákna sekvence restriktocinu. Zmutované vlákno bylo dále využito k rekonstrukci dvouvláknové působením DNA polymerasy I k vytvoření homoduplexní molekuly, Sekvence pr restriktocinu TR3 /TR4 /TR5 /TR6 /TRI, obsahující substituci Cys82 místo Ser82/ Cys 106 místo Lys 106/ Cysl3 místo Lysl3/ a C-koncové rozšíření Cvsl50-Glyl51/ substituci Cys 110 místo Lys 110, vznikla za použití 5 fosforylovaných mutagenních oligonukleotidů S SEQ ID NO.13: CCGAAGCACT GCCAGAACGG C / SEQ ID NO.14: CACGACTATT GCTTTGACTC G / SEQ. ID. NO. 15: CTGAATCCCT GCACAAACAA A / SEQ.ID NO. 16: CTGTGTAGCC ACTGCGGTTA ATAATAGTCG / SEQ ID NO. 41: TTT GACTCGT GCAAACCCAA G.

Příklad 3 - Exprese restriktocinu a analogů

3.1. Vznik expresního vektoru pro restriktocin

Vytvářeni expresního vektoru pro restriktocin, který obsahoval promotor lambda PL bylo započato s prekursorovými plasmidy pICI0074 a pICI1079. Vektor p!CI1079 byl podle Budapešťské dohody uložen ve sbírce National Collections of

Industrial and Marině Bacteria Limited (NCIMB), 23 St.Machar

Drive, v Aberdeenu, AB2 IRY, Skotsko, U.K. (NCIMB No. 4037), datum uložení 19. února 1991). Produkce vektoru pICI007O-— a pICI1079 jsou popsány v European Patent Publication No

459630A2 publikované 4, prosince 1991.

PICI0074 a pICI1079 byly štěpeny enzymy EcoRl a Sací. Potom byly fragmenty podrobeny ligaci a ligační reakční směs byla použita pro transformaci buněk E.coli. Restrikčním mapováním byl proveden výběr pomocí nějž byl identifikován rekombinantní plasmid v němž lambdaPL/CI857 represorový fragment z pICI1079 byl insertován do páteře fragmentu p±CI0074, která obsahuje tetracyklinové geny, cer stabilitní funkci, mnohačetná restrikční klonovací místa a T4 transkripční terminátor. Spojovací sekvence obsahující sekvenci místa pro vazbu ribosomu byla klonována mezi Sací a KpnI místa (tzn. do polylinkeru) výše vzniklého intermediárního vektoru. Spojka pro vznik expresního vektoru pICI 0122 (lambdaPL-RBS7) byla vytvořena hybridizací fosforylovaných oligonukleotidů, SEQ. ID. NOS. 11 a 12:

CAATCTAGAG GGTATTAATA ATGTTCCCAT TGGATGA TTAAATGGTA C TCGA GTTAGATCTC CCATAATTAT TACAAGGGTA ACCTCCTACT AATTTAC

Restriktocin kódující sekvence SEQ. ID. No. 10 a analogy restriktocinu popsané výše byly subklonovány z restriktocinových klonů M13 do lambdaPL-RBS7 pomocí subklonovací strategie nyní popsané v detailu tak, aby byly vytvořeny expresní vektory pro restriktocin. Vektor kódující divoký typ restriktocinu byl nazván pICI 1453 (lambdaPL-RBS7-RES), vektor kódující analogy se substitucí Cys82 místo Ser82 byl nazván picí 1485, vektor kódující analogy se substitucí Cysl06 místo LyslOS byl nazván pICI 1486, vektor kočující analogy se substitucí Cysl3 místo Lysl3 byl nazván pICI 1487, vektor kódující C-koncové prodloužení Cysl50-Glyl5l nazván pICI 1488 a vektor kódující analogy se substituci CysliG místo LysliG byl nazvan píci 1472 .

Nejprve byl pICI 0122 štepen pomocí KpnI a na převisu byl vytvořen tupý konec prostřednictvím T4 DNA polymerasy. Potom byl dále štěpen pomocí Xhol (podobně jako KpnI, umístěný v polylinkeru), ještě před působením alkalické fosfatasy z telecího střeva, aby se zabránilo zpětné ligaci fragmentů. Restriktocinové klony M13 obsahující buď divoký typ restriktocinu nebo restriktocinové analogy byly štěpeny pomocí Pstl a potom byly na převisech vytvořeny tupé konce pomocí T4 DNA polymerasy. Štěpeni pomoci Sáli uvolnilo sekvenci kódující restriktocin. Poté byla provedena ligační reakce pro inserci restriktocinového fragmentu do páteře pICI 0122. Na 5 konci restriktocinové sekvence je ligace s tupým koncem, avšak převis po Sáli na 3 konci je kompatibilní s oblastí Xhol. Reakce mezi Pstl/tupé zakončením poskytuje na 5 konci většinu basí restriktocinového fragmentu jako prvou basi prvého kodonu sekvence kódující restriktocin. Reakce mezi KpnI/tupé zakončení poskytuje na 3 konci páteře expresního vektoru triplet ATG, což byl iniciační kodon odpovídající sekvenci RBS přímo proti směru exprese. Tímto ligace poskytly spojení sekvencí kódujících restriktocin ve čtecím rámci s translačním iniciačním kodonem.

3.2 Studium exprese.

Nejprve, po charakterisaci, byl pICI1453 (lambaPL-RBS7-PES) transformován do E. coli MSD 462. 75 ml media M9 doplněného 0,02¾ kyselého hydrolysátu kaseinu (Oxoid L41) a 15ug/ml tetracyklinu bylo inokulováno jednotlivou kolonií z čerstvé misky a kultivováno přes noc při jemném třepáni. Medium M9 obsahuje 6g/l hydrogenorthofosforečnanu dvojsodného, 3g/l dihydrogenorthofosforečnanu draselného, 0,5g/l chloridu sodného, l,0g/l chloridu amonného, lmM síranu hořečnatého, 0,lmM chloridu vápenatého, 2g/l glukosy a 4ug/ml thiaminu. Bylo měřeno OD^^q a kultura zředěna tímtéž mediem na výsledný objem 75 ml

OD

550 =0,1. Tato kultura byla pěstována při 37°C při jemném třepání dokud OD_55Q=0,4-0,6 (přibližné 3-4 hodiny).Teplota inkubátoru byla poté zvýšena na 42°C a růst pokračoval další 3 hodiny, aby došlo k indukci exprese restriktocinu. SDS-PAGE gely lysátu celých buněk však nevykázaly žádnou expresi restriktocinu. Následně byla použita metoda pulse chase labeling s využitím 35-S methioninu k průkazu toho, že akumulaci restriktocinu drasticky omezuje jeho krátký poločas.

nestability můžeme překonat použitím s deficiencí proteasy. Růst a indukční protokol jsou stejné jako u MSD462, s tím rozdílem, že medium M9 je dále doplněno 45mg/l methioninu. MSD460(pICI1453) poskytuje akumulaci restriktocinu na úrovni 5-10% celkové buněčné bílkoviny a podobné akumulace analogů restriktocinu jsou získány s expresními vektory analogů restriktocinu pICI 1485, pICI 1486, picí 1487, pICI 1488 a pICI 1472.

Tento problém kmene MSD460

Mohou být použity jiné promotorové systémy založené na standardních postupech.

3.4. Odvození restriktocinu).

MSD460 (hostitelský kmen pro expresi

Allela Ion byla zavedena do MSD 101 (E. coli W3110) pomocí transdukce Pl z SG2ů25z (Trislar a Gottesman (1984) J. Bacteriol, 160, 184-191) a selekce na tetracyklinovou resistenci, následované výběrem k nitrofurantoinu. SG20252 měl podle citlivosti transposon TnlO s teLiacykiinovou resisrenci těsně spjatý s allelou lonlOO. Citlivost k nitrofurantoinu byla charakteristická pro lon-kmeny. Jeden z výsledných klonů byl označen MSD310. Přítomnost transposonu v tomto kmeni byla nežádoucí a derivát postrádající tento element byl isolován vyhledáváním spontánně se objevcujicich klonů které ztratily resistenci vůči tetracykiinu. Jeden z nich, označený MSD413 byl isolován a bylo prokázáno že si podržel citlivost k nitrofurantoinu. Tento kmen byl mukoidní, charakteristicky pro kmeny Lon“. K eliminaci tohoto fenotypu, způsobenému nadprodukcí kapsulárních polysacharidů fágu Mu byla použita mutagenese vycházející z derivátu fágu Mu označeného Mu cts dl Apr lac. Následně po infekci MSD413 fágem Mu cts dlApr lac byly selektovány klony resistentní vůči ampícilinu na miskách L-amp a byly vyhledávány nemukoidni fenotypy. Jeden takový klon označený MSD413*2 byl isolován a bylo ověřeno, že si podržel citlivost vůči nitrofurantoinu. Mutace v tomto kmeni, která potlačuje nadprodukci kapsulárního polysacharidů, byla nazvána som-6. Přítomnost Mu cts dl Apr lac v tomto kmeni není žádoucí. Derivát, který ztratil defektní fág, ale podržel si som-6, byl isolován konvenčním tepelným ošetřením a výběrem na ztrátu resistence vůči ampícilinu. Jeden takový klon, u kterého bylo prokázáno zachování som-6, a který byl citlivý k nitrofurantoinu, byl označen MSD460.

Při rozsáhlejší charakterisaci bylo shledáno, že MSD46Q vyžaduje k růstu methionin, avšak nikolov histidin (čili je Met^-) a není schopný růstu, pokud je jediným zdrojem uhlíku arabinosa, avšak zachoval si schopnost růstu na glycerolu. Nejpravděpodobnější vysvětlení těchto údajů je, že MSD460 je nositelem delece sahající přes metG a araFG v minuté 45 genetické mapy E. coli, která však nezasahuje přes operon his v minuté 44 a přes operon glp v minuté 48,5.

MSD460 byl deponován podle Budapeštské dohody u National Collection of Industrial and Marině Bacteria Limited (NCIMB), 23 St Machar Drive, Aberdeen AB2 IRY, Scotland, United Kingdom. Je dostupný pod accession number NCIMB 40469 a datum uložení je 9. ledna 1992.

PŘÍKLAD 4 - Tvorba a exprese analogů alfa-sarcinu.

4.1 Tvorba syntetického genu kódujícího alfa-sarcin.

Konstrukce syntetického genu pro alfa-sarcin a jeho exprese v E. coli již byla popsána (Henze a kol., (1990) Eur. J. Biochem., 192, pl27-131). Avšak po úspěšné intracelulární expresi restriktocinu se nejeví jako nutné sledovat publikovanou strategii používající sekreční vektory k překonání potenciálních problémů s toxicitou.

Syntetický gen pro alfa-sarcin (kódující sekvence) je konstruován stejným způsobem jako ten popsaný v Henzeho publikaci, s tím rozdílem, že oligonukleotidové páry použité ke konstrukci 5 a 3 konců genu jsou rozdílné a pár baží v jednom z vnitřních oligonukleotidových párů je odlišný. Další návod stran synthesy synthetických genů je dostupný v :

Edwards, M. (1987) International Biotechnology Lab 5(3),

19-25.

Oligonukleotidové páry použité ke konstrukci 5 konce genu jsou označeny SEQ ID No. 26 a 27 (nahrazují oligonukleotidy 1 a 2 v publikaci). Tento oligonukleotidový pár dává vzniknout převisu Pstl za kódující sekvencí.

Oligonukleotidové páry použité ke konstrukci 3 konce genu jsou označeny SEQ ID No. 28 a 29 (nahrazují oligonukleotidy 18 a 19 v publikaci). Tento oligonukleotidový pár dává vzniknout převisu Bam HI a zavádí štěpící místo pro salT uvnitř tohoto převisu po směru exprese genu od ston kodonu alfa-sarcinu.

Oligonukleotidy označené v publikaci jako číslo 6 a 7 jsou nahrazeny SEQ ID No. 37 a 38. Toto odstraňuje štěpící místo BamHI, avšak nemění sekvenci kódující aminokyseliny.

Sestavený gen je poté klonován do Pstl a BamHI míst M13mpl0 prostřednictvím výše zmíněných převisů Pstl a BamHI.

4.2 Příprava sekvence kódující analog alfa-sarcinu.

Analogy alfa-sarcinu jsou připravovány za použití stejné usměrněné mutagenese na M13 jak je popsáno v případě restriktocinu. Analogy zde popsané a mutantní oligonukleotidy fosforylované v poloze 5 , použité k jejich přípravě jsou označeny následujícím způsobem:

Lys 14 na Cys 14: seq ID no, 35

Ser 82 na Cys 82: seq ID no. 31

Lys 107 na Cys 107: seq

C-koncové prodloužení o

Lys 111 na Cys 111: seq

ID no. 34

Cys 151 -Gly 152

TD no. 42 seq ID no. 36

4.3 Konstrukce expresního vektoru alfa-sarcinu a exprese

Následně po mutagenese a charakterisaci je alfa-sarcinový analog klonován do expresního vektoru, pICI0122 (LambdaPL-RBS7) jak je popsáno pro restriktocin a jeho analogy, v souhrnu, klon M13 - alfa-sarcinový analog je štěpen pomocí Pstl, tupé konce jsou vytvořeny pomocí T4 DNA polymerasy, a potom je štěpen Sáli. pICI0122 je štěpen pomocí KpnI, tupé konce jsou vytvořeny pomocí T4 DNA polymerasy, a potom je štěpen Xhol. Poté je provedena ligační reakce na zavedení sekvence kódující alfa-sarcin do otevřeného vektorového polylinkeru. Výsledkem tohoto je, že ATG iniciační kodon ve vektoru je připojen tupým koncem a má shodný čtecí rámec jako první kodon alfa-sarcinu.

Expresní vektor alfa-sarcinu je potom zaveden do kmene MSD460, deficientního na proteasu, a je provedena indukce exprese, jak je popsáno výše, pro restriktocin a analogy.

PŘÍKLAD 5 - Růst E. coli ve fermentorech a exprese restriktocinu a analogů restriktocinu

Kmen E. coli MSD460 byl transformován plasmidem pICI 1453 a výsledný rekombinant byl puntíkován a uchováván v glycerolu při -80°C. Byl odebrán alikvotní díl kultury a rozčárkován na agarové misky s L-tetracykiinem aby byly odděleny jednotlivé kolonie po kultivaci přes noc při 37°C. Jednotlivá kolonie MSD460 pICI1453 byla odebrána a resuspendována v 10 ml L-tetracyklinově půdy a 100 ul bylo neprodlené inokulováno do každé z deseti 250 ml Erlenmeyerových baněk s obsahem 75 ml tetracyklinové půdy. Po sestnáctihodinové kultivaci při 37°C na reciproké třepačce byl obsah baněk shromážděn a použit na inokulaci fermentoru s obsahem media popsaného níže.

Fermentace probíhala při teplotě 37°C a pH bylo automatickými přídavky roztoku 6M hydroxidu sodného udržováno na hodnotě 6,7. Hodnota parciálního tlaku rozpuštěného kyslíku (dOT) byla nastavena na úroveň 50% saturace vzduchem a byla automaticky regulována nastavením rychlosti míchání. Průtok vzduchu, který byl zpočátku 20 1/min (odpovídající 1 WM) byl zvýšen na hodnotu 2,5 WM, když rychlost otáčení míchadla dosáhla přibližně 80-90% svého maxima. 4,5 hodiny po provedení inokulace bylo do fermentoru započato dávkování roztoku kvasničného extraktu rychlosti l,7g/l/h 4,5 hodiny po inokulaci, a to až do chvíle , kdy OD₅₅₀ kultury dosáhla hodnoty 50. Pak byla rychlost zvýšena na hodnotu 3,4g/l/h.

Mezi 7-8 hodinou po provedení inokulace, v době kdy zásoba zdroje uhlíku (glycerolu) během fermentace byla vyčerpána a vedla k rychlému vzrůstu dOT z hodnoty 50% vzdušné saturace, byl do fermentoru přítokován glycerol (714g/i) a síran amonný (143g/l) rychlosti, která snižovala rychlost spotřeby kyslíku bakteriemi na hodnotu přibližné 80% maximální rychlosti přestupu kyslíku (OTR) ve fermentoru (za výše popsaných podmínek). Kultura byla indukována zvýšením teploty z 37°C na 42°C, kdy OD^^q=80. Fermentace probíhala při teplotě 42°C po dobu 5 hodin. Bakterie byly získány po odstředění v 11 centrifugačních kyvetách v odstředivce Sorvall RC-3B (7000 x g, 4°C, 30 min.) a buněčná pasta byla zmrazená při -80°C.

Podstatně tentýž protokol byl použit při růstu E.coli exprimující analogy restriktocinu.

Růstové medium g/1 (deionizované vody) dihydrogenorthofosforečnan draselný hydrogenorthofosforečnan dvoj sodný chlorid sodný hydrolyzát kaseinu (Oxoid L.41) síran amonný glycerol kvasničný extrakt (Difco) hepta-hydrát síranu hořečnatého di-hydrát chloridu vápenatého thiamin hepta-hydrát síranu železnatého/kys

3,0 6,0 0,5 2,0

10,0

35,0

20,0

0,5

0,03

0,008 citrónová roztok stopových prvků (TES) tetracyklin

0,04/0,02 (0,5ml/l) (10mg/l)

Složení roztoku stopových prvků (TES) mg/lOml (deioníz.vody)

A1C13.6H2O	2,0
CoC12.6H2O	0,8
KCr(S04)2.12H2O	0,2
CuC12.2H2O	0,2
h3bo3	0,1
KI	2,0
MnSO4.H2o	2,0
NíSO4.6H2O	0,09
Na2Mo04.2H2O	0,4
ZnSO„ . 7H-iO t «L	0,4

Příklad 6: Čištění bílkovinných analogů

Odstředěná biomasa E.coli, ve formě pasty, byla za použití homogenizátoru (Polytron) resuspendována v pufru pro lyži buněk (1 g vlhkých biomasy v 10 ml pufru). Pufr se skládá z 50 mM Tris hydrochloridu, 2 mM ethylen (EDTA), 0,02% azidu sodného , (hydroxymethyl) aminomethan di- aminotetraoctové kyseliny pH 8,2. Resuspendované buňky byly potom lyžovány při 4°C vysokotlakou homogenizací (4 x opakovaně přes Manton Galin homogenizátor) nebo sonikací (5 x 45 vteřin) a získaná suspenze lyžovaných buněk byla odstředěna při 25 000 g po dobu 20 minut.

pH supernatantu, který obsahoval rozpustný toxin, bylo upraveno přídavkem naředěné kyseliny chlorovodíkové a potom byl supernatant nanesen na kolonu s ionexovou náplni na bázi karboxymethylu ( jako je karboxymethy1 Sepharosa s rychlým průtokem firmy Pharmacia), předem ekvilibrovanou 50 mM Tris/HCl, 2 mM EDTA, 0,02¾ azidem sodným, při 7. Kolona byla promyta lineárním gradientem roztokem chloridu sodného ve stejném pufru, který byl používán pro ekvilibraci kolony v rozmezí koncentraci 0 - 1 M. Přítomnost toxinu v eluátu byla zjištěna SDS-PAGE elektrofořežou jednotlivých frakcí a frakce obsahující toxin byly spojeny.

Sebrané frakce obsahující toxin byly dialyzovány nebo diafiltrovány proti 25 mM fosforečnanu sodnému pH 7,5. Vzorky s toxinem, které se vysrážely po dialýze, byly odstředěny při 40 000 g po dobu 20 minut a supernatanty byly spojeny. Roztok toxinu byl nanesen na kolonu s afinitní barvičkou (jako je zeleň A6XL z ACL, Cambridge,U.K.), předem ekvilibrovanou 25 mM fosforečnanem sodným pH 7,5, a procházející roztok byl sbírán.

Kolona byla promyta 25 mM fosforečnanem sodným pH 7,5 a promývací roztok byl sbírán.' Kontaminující bílkoviny se barevný lígand, převážná část toxinu a byla eluována průtokem a vymyta, v eluátu byla stanovena SDS-PAGE vážou adsorpcí na zůstala nenavázaná Přítomnost toxinu elektrofořežou a frakce obsahující toxin byly spojeny.

Spojené frakce obsahovaly více než 95% toxinu (stanoveno SDS-PAGE elektrofořežou). Malé množství disulfidickýmí můstky vázaných iméru toxinu o molekulové váze 34 kDa bylo pozorováno v některých purifikovaných analozích (TRI 5%, TR4 < 5%, TRS < 5, TRS 20%). Identita Proužků o molekulové váze 34 kDa byla potvrzena SDS-PAGE elektroblotingem a sekvenovánim z N-konce (Problott, Applied Biosystems, USA) (Matsuidara, J.Biol.Chem 262 : 10035-38).

Čistota alikvotú spojených frakcí purifikovaného toxinu byla potvrzena SDS-PACE elektrofořežou a elektrobloLingem. Proužky o molekulové váze 17 kDa byly vyříznuty a podrobeny sekvenační analýze N-konce sekvenátoru bílkovin (Applied na Applied Biosystem 475 Biosystems, USA). TRI, TR3 ___*1 v γ J\a óu v aiy

N-Lei iiixiiulni sekvence restriKtocinu bez žádných dalších detegovatelných sekvencí. TR5 a TRS vykazovaly N-terminální sekvence restriktocinu spolu s dalšími neidentifikovanými bílkovinami. U těchto bílkovin

Swissprot a NBRF databáze signifikantní homologie se kontaminující bílkovina neuspělo využití průzkumu Genembl, sekvencí při hledání jakékoliv známými bílkovinami. Tato representovala 10% a 15% celkových bílkovin pro TRS a TRS, což bylo stanoveno srovnáním plochy píků po HPLC na reverzní fázi (monitorováno při 214 nm). Totožnost píků byla potvrzena sekvenovánim N-konců.

6.1 Podrobný popis čištění analogu TR4

200 g vlhké buněčné biomasy analogu T4 E.coli bylo resuspendováno ve 2 1 lysovacího pufru (1 g na 10 ml) a po té bylo lysovano sonikací jak bylo popsáno v bodu 6. Po odstředěni bylo získáno 1,8 1 supernatantu, u kterého bylo upraveno pH na hodnotu 7, jak bylo popsáno v bodě 6. Tento supernatant byl nanesen na kolonu naplněnou karboxymethyl Sepharosou s rychlým průtokem (Pharmacia), [ objem náplně 290 ml, rozměry 5 cm x 15 cm) s rychlostí průtoku 8 ml za minutu. Po promytí kolony ekvilibračním pufrem do ustáleného stavu, kdy hodnoty absorbance měřené při 280 nm byly na základní čáře, byl toxin z kolony eluován pomocí lineárního gradientu chloridu sodného v rozmezí koncentrací 0 - 1 M, v celkovém objemu 500 ml, při průtoku 8 ml za minutu. Frakce obsahující toxin byly stanoveny SDS-PAGE analýzou alikvotú frakcí.

Frakce obsahující toxin byly spojeny (celkový objem 90 ml) a dialyzovány (Spectrapor, membrána zachycující bílkoviny s molekulovou hmotností 3,5 KDa, Pierce, USA) proti 5 1 pufru jak bylo popsáno v bodu 6. Roztok dialyzovaného toxinu byl nanesen na afinitní kolonu mimetic zeleni A6XL (ACL, Cambridge,U.K.) [ objem náplně 150 ml, rozměry 2,6 cm x 28 cm] s rychlostí průtoku 4,25 ml za minutu a proteklé frakce a promyvy byly hromaděny jak bylo popsáno v bodě 6. Frakce obsahující toxin byly určeny SDS-PAGR analýzou a spojeny.

Vzorky spojeného čištěného toxinu byly analyzovány SDS-PAGE, SDS-PAGE alektroblotingem a sekvenováním N-konce, analýzou aminokyselin a biologická aktivita byla stanovena pomocí testu na stanovení inhibiee syntézy bílkovin, jak je popsáno v bodě 8.

Čistota toxinu byla více než 95% (stanoveno SDS-PAGE), s < 5% diměry s disulfidickou vazbou a 17 kDa proužky (stanoveno SDS-PAGE), kde byla stanovena pouze N-koncová sekvence restriktocinu. 7,2 mg toxinu bylo podrobeno analýze složení aminokyselin. Specifická biologická aktivita toxinu je ukázána v bodě 8,3.

Koncentrace výsledných přečištěných analogů restriktocinu byla stanovena analýzou aminokyselin. Před vazbou na protilátku byly přečištěné analogy zakoncentrovány

4 membránovou filtrací.

Vzorky přečištěných analogů byla testovány na inhibicici syntézy bílkovin jak je dokumentováno dále v bodě 8.

Analogy toxinů TRI, TR3, TRS a TR6 byly čištěny a analyzovány za použiti postupu popsaného pro 'TR4.

6.2 Čištění rekombinantního restriktocinu

Rekombinantní restriktocin byl čištěn jak je popsáno pro analog T4 kromě toho, že pH supernatantu po lyzy bylo upraveno na 8 před nanesenín na kolonu s karboxymethyl Sepharosou s rychlým průtokem, kolona byla ekvilibrována a promyta pufrem pH á a toxin byl eluován lineární gradientem chloridem sodným ve stejném pufru, v koncentračním rozmezí 0 - 0,5 M. Také byl použit další purifikaóní krok, po afinitni chromatografií s barvičkou, kdy spojené frakce obsahující toxin byly zakoncentrovány ultrafiltrací (Amicon, míchaná nádobka, YM2 membrána) a chromatografovány na vylučovací koloně Sephacrylu S-200 HR. kolona byla předem ekvilibrována 20 mři fosforečnanem sodným, 150 mM chloridem sodným, pH 7,5 a vzorky byly eluovány stejným pufrem. Přítomnost toxinu v eluátech byla stanovena SDS-PAGE analýzou jednotlivých chromatografických frakcí.

Přečištěný vyeluovaný restriktocin s molekulovou hmotností 17 kDa, vykazoval > 98% čistotu po SDS-PAGE a SDS-PAGE přenesených zon dávala N-koncovou sekvenci restriktocinu bez dalších detegovatelných sekvencí.

Příklad 7 Vazba toxinových analogů na protilátku

Monoklonální protilátka, jako je např. 19.9 protilátka získaná z hybndomu 1116NS-19 (ATCC No.HB 8059), v ΡΒΞ v koncentraci 12 mg/ml, byla naředéna 0,5 objemem borátového pufru (100 mM boritanu sodného, pH 9,1). Koncentrace bílkovin byla stanovena měřením absorbance při 280 nm a pH směsného roztokubylo (pH = 8,7 až 8,9, s preferencí pH 8,8).

Linker ( N-sukcinimidyl 3-(2-pyridyldíthio) butyrát) byl rozpuštěn v suchém, redestilovaném dimethylformamidu nebo acetonitrilu v koncentraci 10 mg/ml a ihned přidán k roztoku protilátky za míchání v poměru 8 molů linkeruna mol protilátky. Vzniklý roztok byl inkubován při 20°C po dobu 1 hodiny a potom nanesen na vylučovací odsolovací kolonu ekvilibrovanou 50 mM fosforečnanem sodným/ 150 mM chloridem sodným/ 1 mM EDTA pH 8,0 na odstranění přebytečných reakčních činidel a pufr vyměnil derivatizovanou protilátku. Odsolená derivatizovaná protilátka byla jímána a koncentrace bílkovin byla stanovena měřením absorbance při 280 nm. Míra vazby linkeru byla stanovena přídavkem přebytku dithithreitolu ke vzorku derivatizované protilátky a měřením uvolněných thiopyridylových skupin spektroskopicky při 343 nm. Míra vazby linkeru byla v rozmezí od 3 do 6 molů ( přednostně okolo 4 molů ) skupin linkeru na jeden mol protilátky.

Rekombinantní analog toxinu byl navázán na derivatizovanou protilátku mícháním roztoku rekombinantniho analogu toxinu (v PBS s pH upraveným hydroxidem sodným na pH 8,0) a roztoku derivatizované protilátky ve váhovém poměru obou složek 1:1. Nádobka byla očištěna argonem a inkubována při 15°C po dobu 40 hodin.

Roztok bílkovin byl naředén stejným objemem PBS o pH 8,0 (upraveno hydroxidem sodným) a po te byl k němu přidán cystein do konečné koncentrace dostačující k překrytí přebytku skupin linkeru na protilátce, aniž by přitom došlo k redukci disulfidických vazeb vázajícíh toxin na derivatizovanou protilátku. Uskutečnění cysteinové reakce bylo cvcrcnc vx. cnini v<,o.la.u y utťiio imunoKonj ugatu přebytkem dithiothreitolu a měřením absorbance spektrofotometricky při 343 nm. Nebylo detegováno žádné uvolňování thiopyridylových skupin.

Roztok imunokonjugátu byl zakoncentrován membránovou filtraci a nanesen na vylučovací chromatografickou kolonu ekvilibrovanou 50 mM fosforečnanem sodným/25 mM chloridem sodným/lmM EDTA, pH 6,3 a s frakcionačním rozmezím 10 - 200 kd. Pík bílkovin obsahující imunokonjugát byl jímán a koncentrace bílkovin stanovena měřením absorbance při 280 nm.

Příklad 8 Biologické stanovení analogů ribotoxinu

Úkolem bylo stanovit podmínky, za kterých by mohla být testována biologická aktivita vzorků v bezbuněčném in vitro stanovení inhibice syntézy bílkovin.

Lyzáty králičích retikulocytů byly připraveny podle metody Allena a Schweeta (J.Biol.Chem (1962), 237, 760-767). Při stanovení je inhibice syntézy bílkovin demonstrována nedostatečnou inkorporaci syntetizující bílkoviny.

¹⁴C značeného leucinu do nově se

8.1 Popis stanovení

Základní roztok : 1 mM směs aminokyselin bez leucinu. Roztok obsahující všechny aminokyseliny v koncentraci 1 mM kromě leucinu (pH upraveno na pH 7,4 pomocí NaOH a roztok uchováván při -70°C).

Roztok A mM octan hořečnatý

M octan amonný

0,2 M Tris (pH 7,4, upraveno HCl, uchováván při 4°C)

Roztok B

ATP (adenosintrifosfát) (Sigma A5394) 246 mg/ml GTP (guanosintrifosfát) (Sigma G8752) 24,4 mg/ml

Smés pro stanovení: 1 ml směsi aminokyselin ml Roztoku A 0,1 ml Roztoku B 103 mg kreatin fosfátu 1 mg kreatinkinasy 510 ul vody

600 ul ( 60uCi) L-¹⁴C leucin (New England Nuclear, NEC-279E)

Reakční směs : Vzorek 25 ul Směs pro stanovení 12,5 ul Lyzát králičích retikulocytů 25 ul s'lepý poku je 2 mg/ml sérum hovězího albumunu (BSA) ve fosfátovém pufru s fysiologickým roztokem.

Všechny stanovení byly prováděny paralelně.

ul směsi pro stanovení bylo přeneseno do sterilních skleněných zkumavek ul BSA v PBS bylo přidáno do každé první zkumavky ze čtyř (slepý pokus) ul testovaných vzorků bylo přidáno do ostatních zbylých zkumavek ml 0,1 M hydroxidu draselného bylo přidáno do prvníc svou zkumavek (pozadí slepého pokusu)

Zkumavky byly vytemperovány na 28°C ve vodní lázni ul lyzátu králičích retikulocytů (ponechaných tání z teploty tekutého dusíku) bylo přidáno do každé zkumavky ve 20 vteřinových intervalech. Když se první zkumavka inkubovala 12 minut, 1 ml 0,1 Μ KOH byl přidán do každé zkumavky znova ve 20 vteřinových intervalech, tak aby všechny zkumavky byly inkubovány 12 minut. Dvé kapky 20¾ peroxidu vodikubylo přidán do každé zkumavky následované přídavkem 1 ml 20% trichloroctové kyseliny (TCA).

Zkumavky byly promíchány a ponechány v klidu alespoň hodinu nebo přes noc pří 4°C. Sraženina byla zfiltrována na 2,5 cm kruhovém disku ze skleněných vláken, promyta 3 x 4 ml 5% TCA, přenesena do scintilačních ampulek a bylo k ní přidáno 10 ml scintilačního roztoku (Ready-Solv.MP, Beckman). Po 1 hodině byly ampulky protřepány a proměřena radioaktivita.

8.2 Techniky pro použití lyzátů E.coli ml kultury v L-mediu se kultivuje přes noc při 37°C. 400 ul alikvoty se odstředují při 13000 rpm po dobu 30 vteřin a většina supernatantu se dekantuje.

Pelety jsou podrobeny dvěma za sebou následujícím rychlým zmrazením ve směsi tuhého kysličníku uhličitého a ethanolu následováné rozmrazováním při 37°C. Po té se přidá 12 ul 25% sacharozy v 50 mM Tris HCl pH 8,0 a dále 4 ul roztoku lysosymu (lOmg/ml).

Po inkubaci v ledu 15 minut, se přidá 8 ul 0,25 M EDTA a inkubace pokračuje dalších 15 minut. Lyže je způsobena osmoticky ředěním vzorků na 400 ul vodou. Tento postup dává 80-100 životných buněk na ml.

Když 25 ul alikvotu tohoto lyzátu je přidáno do směsi pro stanovení, hladina inkorporace ¹⁴C-leucinu do nově syntetizované bílkoviny je přibližně 10% slepého pokusu bez lyzátu. Výsledek jasně ukazuje, že minimálně 16 -ti násobné ředěni je nutné k redukci vlivu lyzátu ve srovnání s blankem.

Aby se dalo důvěryhodně prohlásit, Že lyse E.coli a lysáty E.coli nevyrovnávají toxicit'! ribotoxinu, byly provedeny dvě kontrolní stanovení. V prvním byl ribotoxin přidán k 16 X ředěným buněčným peletám E.coli, tak aby dával ve sněsi pro stanoveni, po lyži buněk, koncentraci 8 ng/ml.

Ir *·λ1 U nl/ 3 1 lf -T i ikn/ř tri i tT 1 1 r Γ7 é b \ \ λ U. _Λ — + t i v. » i — — — — J — — . ---- · · — — — — j — . . —. « r —. — w . Λ, J v, tj, lyže na inhibíční působeni ribotoxinu.

Tyto techniky byly použity pro ověření syntézy biologicky aktivních bílkovinných analogů.

8.3 Bioaktivita purifikovaných analogů restriktocinu

Analog

TRI průměr IC50 (Μ χ 10E-11)

41,1 s.d. 14,3 (n=6)

TR3

TR4

TR5

TR6

Rekombinanntí

10,5	s.d.	4,7	(n=7)
10,8	s.d.	4,5	(n=6)
13,4	s.d.	6,2	(n=6)
4,95	s.d.	0,68	(n=4)
2,27	s.d.	1,04	(n=6)

1

Restriktocin

Každá hodnota IC50 byla spočítána ze serie 5 ředění ribotoxinu, trojmo provedených, kdy spočítaná hodnota IC50 byla vyšší než alespoň hodnota jednoho ředění a také nižší než alespoň hodnota jednoho ředění. To říká, že hodnota IC50 byla počítána ze serie 5 ředění bez užití extrapolace.

Hodnoty pro specifickou aktivitu analogů TR5 a TR6 byly korigovány pro 10 a 15% kontaminujících bílkovin v purifikovaném produktu s ohledem na to, že kontaminující bílkovina nemá žádnou aktivitu při stanovení syntézy bílkovin. Ostatní testované analogy nevykazovaly žádnou významnou kontaminaci. Analogy restriktocinu TR5 a TR6 byly odděleny od kontaminantů použitím HPLC na reverzní fázi a proměřováním eluátu při 214 nm. Vznikající píky byly identifikovány sekvenováním N-konce. Procento kontaminace bylo spočítáno měřením ploch jednotlivých píků.

Tak analogy TRI, TR3, TR4 , TR5 a TR6 obsahovaly 6%, 22%, 21%, 17%, a 46% aktivitu přírodního rekombinantního restriktocinu. Avšak tento test neukazuje nezvratnou prospěšnost analogů bílkovin, poněvadž in vitro stanovení cytotoxicity, dokumentováno dále, využívá pro stanovení prospěšnosti, konjugátu imunotoxinu. Např. potence analoga TRI, ve vztahu k rekombinantnímu restriktocinu, je signifikantně zlepšeno v in vitro testu cytotoxicity

Příklad 9 Cytotoxicita imunotoxinu

9,1 In vitro cytotoxicita

Tento test ukazuje in vitro cytotoxicitu imunotoxinu proti lidským buňkám nádoru tlustého střeva a konečníku {Colo 205-ATCC No.CCL 222), kdy ribotoxin je navázán na protilátku, KLej-ťi LUójJULiia viixLj_iiÍ ai'i t-xy ϊύ'ΰίιβύΓί^ xiuič.

Colo 205 buňky rostou v suspenzi v RPMI1640 mediu s 2,0 g/1 bikarbonátu sodného, bez glutaminu, s 5% tepelně inaktivovaného zárodečného telecího séra, 2 mM L-glutaminu 50 ug/ml gentamicinu. Buňky se vystaví účinku trypsinu po dobu 15 hodin a poté se odstředí a promyjí za účelem jeho odstranění. Buňky se počítají v komůrkách hemocytometru.

Pro stanovení inhibice bílkovin se buňky nanášejí na destičku s 96 jamkami v koncentraci 2-5 x 10^ buněk/jamku v objemu 100 ul. Vzorky imunotoxinu se přidají do 4 replikačních jamek. Imunotoxin se přidá ve 12 dvojnásobných ředěních od 2 000 do 0,98 ng/ml. 100 ul kultivačního media se přidá do některých jamek jako kontrola. Dříve než se přidá do každé jamky 2 uCi ³H-L-leucinu, je každá destička inkubována 24 hodin při 37°C. Destičky jsou inkubovány při 37°C dalších 24 hodin. 50 ul trypsinu se přidá do každé jamky a destičky se inkubují po dobu dalších 15-20 minut. Buňky se přenesou z každé jamky destičky na tkaninu ze skleněných vláken a radioaktivita se stanoví beta scintilátorem takovým jaký vyrábí LKB. Křivky inhibice syntézy bíkovin se vynesou a hodnoty IC₅₀ jsou odvozeny ( viz níže).

průměr IC50 (Μ χ 10Ε-11) analog-19.9 Ab analog samotný imunokonjugát

TRI	206	58300
TR3	55,1	23300
TR4	77,5	49800
TRS	85,9	29700
TRS	20,2	21700
kontrola 19.9 Ab samotný	více než než 100 000

Tak analogy TRI, TR3, TR4, TRS a TR6 jsou využitelné na přípravu potentních imunotoxinu.

9.2 In vivo cytotoxicita

Tento test ukazuje in vivo cytotoxicitu imunotoxinu proti lidským nádoroqým buňkám, COLO 205, rostoucích umělý podkožní roub u myší bez brzlíku. Současně se sleduje kontrolní skupina, využívající protilátku samotnou nebo fosfátový pufr ve fysiologickém roztoku.

χ 10⁶ COLO 205 buněk se injektuje do jednoho podkožního místa ve slabinách myší bez brzlíku. U rostoucích nádorů se proměřují kaliperem každé 3-4 dny dva rozměry. Testované látky se neinjektují dříve než nádor dosáhne rozměr 0,7-1,0 cm^. Tento moment se označí jako den 0 a testované látky se injektují intravenosné do ocasní žíly ve dnech 0,1 a 2. Velikost nádorů se dále proměřuje ve dvou rozměrech a výsledky se presentují jako relativní objem nádoru. Měření ri r—. »*. -v- λτ f é /4 i Ir -i ι-i z-4 zě _ fl /4 n ? -Ί r] ΖΎ ii 1/· o tn ět y-s η π r-\ í-hVi i n i 1

Tento test srovnává vliv fosfátového pufru ve fysiologickém roztoku, protilátky samotné (1,2 mg/kg) a imunotoxinu (příprava popsána výše) (2,0 mg/kg) na růst nádoru.

Imunotoxin může zvýšit zmenšování velikosti nádoru ve srovnání s fosfátovým pufrem ve fysiologickém roztoku (PBS) a protilátkou samotnou.

Příklad 10 Složení

Dále je uvedena representativní farmaceutická forma obsahující imunokonjugát (imunotoxin) předkládané přihlášky vynálezu, která může být použita pro terapeutické účely u lidí.

Injektovaný roztok

Sterilní vodný roztok, určený k injektování,

Analog restriktocinu/selektivni protilátku k Octan sodný trihydrát Chlorid sodný Tween 20

obsahuje :
nádoru 1,0	mg
6,8	mg
7,2	mg
0,05	mg/ml

roztoku

SEZNAM SEKVENCÍ (2) ÚDAJE 0 SEQ ID NO:1;

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 38 baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC : jednovláknový (D) TOPOLOGIE : lineární (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:1:

CCCTCAGCTG CAGCTACTTG GACTTGYATC AAYCARCA (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:2:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 51 baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC : jednovláknový (D) TOPOLOGIE : lineární (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:2:

CACCGACGTC GACTATTATT ARTGRSWRCA CAGNCGCAGR TCRCCYTGRT T (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:3:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 41 baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC : jednovláknovy (D) TOPOLOGIE : lineární (xi) POPIS SEKVENCE ; SEQ ID NO:3:

AATTCGAGCT CGCCCGGGGA TCCTGCAGCT ACTTGGACTT G

ÚDAJE 0 SEQ	ID NO:4:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :
(A)	DÉLKA : 45 bází
(B)	i TYP : nukleová kyselina
(C)	i ŘETĚZEC : jednovláknový
(D)	i TOPOLOGIE : lineární

(xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:4:

CCAAGCTTGG GTTGCAGGTC GACTATTATT AGTGGCTACA CAGTC (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:5:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 17 bází (B) TYP : nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC : jednovláknový (D) TOPOLOGIE : lineární (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:5

GTTTTCCCAG TCACGAC (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:6:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 17 bází (B) TYP : nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC : jednovláknový (D) TOPOLOGIE : lineární (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:6

CAGGAAACAG CTATGAC (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:7:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 17 bází (B) TYP : nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC : jednovláknový (D) TOPOLOGIE : lineární (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:7:

ACGGGAATGG CAAGCTC (2) ÚDAJE O SEQ ID NO: o:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 17 baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC : jednovláknový (D) TOPOLOGIE : lineární (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:8:

GGTCTGGCTG TGCTTCG (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:9:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 17 bází (B) TYP : nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC : jednovláknový (D) TOPOLOGIE : lineární

( XI	) POPIS SEKVENCE :	; SEQ ID NO:9
GAACCAGTGC	GGGTAGC

(2) ÚDAJE 0 SEQ ID NO:10:
(i:	1 CHARAKTERISTIKY SEKVENCE : (A) DÉLKA : 456 bází (B) TYP : nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC : jednovláknový (D) TOPOLOGIE : lineární
(xi;	1 POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:

GCT Ala 1

ACT Thr

TGG Trp

ACT Thr

TGT Cys 5

ATC AAC Ile Asn

CAA Gin

CAG Gin

CTG Leu 10

AAT Asn

CCC Pro

AAG Lys

ACA Thr

42

AAC

AAA

TGG

GAA

GAC

AAG

CGG

CTT

CTA

TAC

AGT

CAA

GCC

AAA

84

Asn 15

Lys

Trp

Glu

Asp

Lys 20

Arg

Leu

Leu

Tyr

Ser 25

Gin

Ala

Lys

GCC

GAA

AGC

AAC

TCC

CAC

CAC

GCA

CCT

CTT

TCC

GAC

GGC

AAG

126

Ala

Glu

Ser

Asn

Ser

His

His

Ala

Pro

Leu

Ser

Asp

Gly

Lys

30

35

40

ACC

GGT

AGC

AGC

TAC

CCG

CAC

TGG

TTC

ACT

AAC

GGC

TAC

GAC

168

Thr

Gly

Ser 45

Ser

Tyr

Pro

His

Trp 50

Phe

Thr

Asn

Gly

Tyr 55

Asp

GGG

AAT

GGC

AAG

CTC

ATC

AAG

GGT

CGC

ACG

CCC

ATC

AAA

TTC

210

Gly

Asn

Gly

Lys

Leu

Ile

Lys

Gly

Arg

Thr

Pro

Ile

Lys

Phe

252

GGA

AAA

GCC

GAC

TGT

GAC

CGT

CCC

CCG

AAG

CAC

AGC

CAG

AAC

Gly

Lys

Ala

Asp

Cys 75

Asp

Arg

Pro

Pro

Lys 80

His

Ser

Gin

Asn

GGC

ATG

GGC

AAC

GAT

GAC

CAC

TAC

CTG

CTG

GAG

TTC

Γ'Γ'Γ1

λ

Gly 85

Met

Gly

Lys

Asp

Asp 90

His

Tyr

Leu

Leu

Glu 95

Phe

Pro

Thr

τχτ

CCA

GAT

GGC

CAC

GAC

TAT

AAG

TTT

GAC

TCG

AAG

AAA

CCC

Phe

Pro 100

Asp

Gly

His

Asp

Tyr 105

Lys

Phe

Asp

Ser

Lys 110

Lys

Pro

29·

336

AAG Lys

GAA GAC CCG

GGC Gly

CCA GCG AGG GTC

ATC Ile

TAT Tyr

ACT Thr

TAT Tyr 125

CCC Pro

Glu Asp 115

Pro

Pro

Ala Arg 120

Val

AAC

AAG

GTG

TTT

TGC

GGC

ATT

GTG

GCC

CAT

CAG

CGG

GGG

AAT

Asn

Lys

Val

Phe

Cys

Gly

Ile

Val

Ala

His

Gin

Arg

Gly

Asn

130

135

140

CAA

GGC

GAT

CTG

CGA

CTG

TGT

AGC

CAC

TAA

TAA

TAG

Gin

Gly

Asp

Leu

Arg

Leu

Cys

Ser

His

145

378

422

456 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA : 51 bází (2) ÚDAJE Ο SEQ ID NO:11:

(B) TYP : nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC : jednovláknový (D) TOPOLOGIE : lineární (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:11:

CAATCTAGAG GGTATTAATA ATGTTCCCAT TGGAGGATGA TTAAATGGTA C (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:12:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 51 bází (B) TYP : nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC : jednovláknový (D) TOPOLOGIE : lineární (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:12:

CATTTAATCA TCCTCCAATG GGAACATTAT TAATACCCTC TAGATTGAGC T (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:13:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A)	DÉLKA : 21	bází
(B)	TYP : nukleová kyselina
(c)	ŘETĚZEC :	jednovláknový
(D)	TOPOLOGIE	: lineární

(xi) POPIS SEKVENCE	: SEQ ID NO:13:
CCGAAGCACT GCCAGAACGG C
(3)ÚDAJE 0 SEQ ID NO: 14
(i) CHARAKTERISTIKY	SEKVENCE :	<
(A) DÉLKA : 21	bází
(B) TYP : nukleová kyselina	*
<(_) řetězec : jednovláknový
(D) TOPOLOGIE :	lineární
(xi) POPIS SEKVENCE	: SEQ ID NO:14:

CACGACTATT GCTTTGACTC G (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:15:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 21 bází (B) TYP : nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC : jednovláknový (D) TOPOLOGIE : lineární (xí) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:15:

CTGAATCCCT GCACAAACAA A (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(2) ÚDAJE O SEQ ID NO:16:

(A) DÉLKA : 30 bází (B) TYP : nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC ; jednovláknový (D) TOPOLOGIE : lineární (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:16:

*

CTGTGTAGCC ACTGCGGTTA ATAATAGTCG i

(2) ÚDAJE O SEQ ID NO:26;

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA :24 bází (B) TYP : nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC : jednovláknový (D) TOPOLOGIE : lineární (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:26:

GCAGTTACTT GGACTTGCCT GAAC (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:27:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 63 bází (B) TYP : nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC : jednovláknový fD) TOPOLOGIE : lineární (XÍ) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO;27;

GTTTCGTATT TGTTAGTTTT CGGGTTTTTC TGGTCGTTCA GGCAAGTCCA 50

AGTAACTGCT GCA 63 (2) ÚDAJE O SEQ ID NO;31;

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 30 bází (B) TYP : nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC ; jednovláknové (D) TOPOLOGIE : lineární (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:31:

GTCCGCCGAA ACACTGCAAA GACGGTAACG 30 (2) ÚDAJE 0 SEQ ID NO:34:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 30 bází (B) TYP : nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC : jednovláknový (D) TOPOLOGIE : lineární (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:34:

GGTCACGACT ACTGTTTCGA CTCTAAAAAA _> j (2) ÚDAJE O SEQ ID NO :35;

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE .

(A) DÉLKA : 30 bází (B) TYP : nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC ; jednovláknový (D) TOPOLOGIE ; lineární (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:35:

ACCAGAAAAA CCCGTGTACT AACAAATACG 30 (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:36:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE .

(A) DÉLKA : 30 bází (B) TYP : nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC : jednovláknový (D) TOPOLOGIE : lineární (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:36:

CTGTGCTCTC ACTGCGGTTG ATGGATCCCC 30 (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:37:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 50 bází (B) TYP : nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC ; jednovláknový (D) TOPOLOGIE : lineární (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:37:

GTAAAACTGG TTCCTCTTAC CCGCACTGGT TCACTAACGG TTACGACGGT 50 (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:33:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 50 bází (B) TYP : nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC : jednovláknový (D) TOPOLOGIE : lineární (xi) ΡΡΟΡΙΞ SEKVENCE : SEQ ID NO: 38:

AGTGAACCAG TGCGGGTAAG AGGAACCAGT TTTACCGTCA GACAGCGGAG (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:39:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 55 bází (B) TYP : nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC : jednovláknový (D) TOPOLOGIE : lineární (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:39:

GATCCGTCGA CTCAGTGAGA GCACAGTTTC AGTTCACCCT GGTTTTCTTT AGTGT (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:40:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 36 bází (B) TYP : nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC : jednovláknový (D) TOPOLOGIE : lineární (xi) PPOPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:40:

AGGGTGAACT GAAACTGTGCN TCTCACTGAG TCGACG (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:41:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 21 bází (B) TYP : nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC : jednovláknový (D) TOPOLOGIE : lineární (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ ID NO:41:

TTTGACTCGT GCAAACCCAA G (2) ÚDAJE O SEQ ID NO:42:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 30 bází (B) TYP : nukieová kyselina (C) ŘETĚZEC : jednovláknový

X (D) TOPOLOGIE : lineární ϊ

(xi) POPIS SEKVENCE : bCQ ID NO : 42:

ACAAATTCGA CTCTTGTAAA CCGAAAGAAA

Claims (13)

1. PATENTOVÉ NÁROKY *·

   1. Bílkovinný analog přírodního ribotoxinu, vyznačující se tím, že jak bílkovinný analog tak přírodní ribotoxin mohou štěpit pouze jednoduchou fosfodiesterovou vazbu 28S rRNA v 60S ribosomální podjednotce, a že bílkovinný analog obsahuje pouze jeden cystein vhodný pro kovalentní vazbu na jinou látku, přičemž uvedený cystein není přítomen v přírodním ribotoxinu.
2. 2. Bílkovinný analog podle nároku 1, vyznačující se tím, že přírodním ribotoxinem je restriktocin, mitogillin nebo alfa-sarcin.
3. 3. Bílkovinný analog podle nároku 2, vyznačující se tím, že (a) analogy restriktocinu jsou: ‘ ,

   i) analogy restriktocinu, v nichž je namísto libovolného z následujících zbytků přítomných v přírodním restriktocinu obsažen cystein: Lys 13, Lys 20, Lys 28, Lys 60, Lys 63, Lys 69, Ser 82, Lys 88, Lys 106, Lys 110 a Lys 128, (ii) přírodní restriktocin prodloužený na C-konci o Cys 150— -Gly 151 a (iii) přírodní restriktocin prodloužený na N-konci o Gly-Cys restriktocin, (b) analogy mitogillinu jsou:

   (i) analogy mitogillinu, v nichž je namísto libovolného z následujících zbytků přítomných v přírodním mitogillinu obsažen cystein: Lys 13, Lys 20, Lys 28, Lys 60, Lys 63, Lys 69, Ser 82, Lys 88, Lys 106, Lys 110 a Lys 128, (ii) přírodní mitogillín prodloužený na C-konci o Cys 150 - Gly 151 a

   II (iii) přírodní mitogillin prodloužený na N-konci o Gly-Cys mitogillin, a (c) analogy alfa-sarcinu jsou:

   (i) analogy alfa-sarcinu, v nichž je namísto libovolného z následujících zbytků přítomných v přírodním alfa-sarcinu obsažen cystein: Lys 14, Lys 21, Lys 29, Lys 61, Lys 64, Lys 70, Ser 03, Lyb 89, rys m/, Lys 111 a Lys 129, (ii) přírodní alfa-sarcin prodloužený na C-konci o Cys 151 - Gly 152 a (iii) přírodní alfa-sarcin prodloužený na N-konci o Gly-Cys alfa-sarcin.
4. 4. Bílkovinný analog podle nároku 3, vyznačující se tím, že (a) analogy restriktocinu jsou:

   (i) analogy restriktocinu, v nichž je namísto libovolného z následujících zbytků přítomných v přírodním restriktocinu obsažen cystein: Lys 13, Ser 82, Lys 106 a Lys 110, a (ii) přírodní restriktocin prodloužený na C-konci o Cys 150 - Gly 151, (b) analogy mitogillinu jsou:

   (i) analogy mitogillinu, v nichž je namísto libovolného z následujícíh zbytků obsažených v přírodním mitogillinu obsažen cystein: Lys 13, Ser 82, Lys 106 a Lys 110, a (ii) přírodní mitogillin prodloužený na C-konci o Cys 150 - Gly 151, a (c) analogy alfa-sarcinu jsou:

   (i) analogy alfa-sarcinu, v nichž je namísto libovolného z následujících zbytků přítomných v přírodním alfa-sarcinu obsažen cystein: Lys 14, Ser 83, Lys 107 a Lys 111, a (ii) přírodní alfa-sarcin prodloužený na C-konci o Cys 151 - Gly 152.

   III
5. 5. Konjugát, vyznačující se tím, že obsahuje partnerskou látku vázanou kovalentní vazbou na bílovinný analog definovaný v nárocích ) až 4.
6. 6. Konjugát podle nároku 5,vyznačující se tím, ze partnerskou látkou je činidlo schopné selektivně se vázat k nádorům.
7. 7. Polynukleotidová sekvence, vyznačující se tím, že je schopna kódovat bílkovinný analog definovaný v nárocích 1 až 4.
8. 8. Replikativní klonovací vektor, vyznačující se tím, že obsahuje polynukleotidovou sekvenci definovanou v nároku 7.
9. 9. Replikativní expresní vektor, vyznačující se tím, že obsahuje polynukleotidovou sekvenci definovanou v nároku 7.
10. 10. Rekombinantní hostitelské buňky, vyznačující se tím, že jsou transformovány replikativním expresním vektorem definovaným v nároku 9.
11. 1 1 . Způsob výroby bílkovinných analogů podle nároků 1 až 4,vyznačující se tím, že se kultivují rekombinantní hostitelské buňky definované v nároku 10.
12. 12. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje jako učinnou složku konjugát de• finovaný v nároku 6, v kombinaci s farmaceutickým nosičem nebo/a pomocnou látkou.

    *
13. 13. Konjugát definovaný v nároku 6, pro použití k léčbě nádorových onemocnění v humánní a veterinární medicíně.