ES2241383B2 - Metodo de produccion de variantes de ribotoxina. - Google Patents
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Abstract
Método de producción de variantes de
ribotoxina.
Para la producción de variantes de ribotoxina se
ha clonado y expresado el DNA recombinante que codifica una
variante de deleción de la ribonucleasa fúngica extracelular
\alpha-sarcina. Las proteínas recombinantes
expresadas en el procariota Escherichia coli, o en el
eucariota Pichia pastoris, se aislan y purifican con gran
rendimiento, están correctamente plegadas, y exhiben propiedades
inmunológicas, enzimáticas y citotóxicas similares a las de las
proteínas fúngicas naturales por lo que pueden ser empleadas en
protocolos de diagnosis y terapia.
Description
Método de producción de variantes de
ribotoxina.
La presente invención, según se expresa en el
enunciado de esta memoria descriptiva, se refiere a una variante de
la ribotoxina \alpha-sarcina en la que se ha
sustituido el fragmento correspondiente a la secuencia que
comprende los aminoácidos 7 a 22 por dos Gly. Asimismo comprende las
variantes recombinantes cuyas secuencias muestran más de un 60% de
identidad con ella.
La invención también hace referencia a los DNA
recombinantes que codifican tanto las proteínas completas como los
fragmentos que incluyen secuencias con un 60% de identidad, y a
moléculas homólogas como otras ribotoxinas u otras ribonucleasas
fúngicas, producidas en organismos heterólogos recurriendo a la
tecnología del DNA recombinante. El objeto de la invención
consiste, además, en la producción de estas moléculas mediante
tecnología recombinante en la bacteria Escherichia coli y en
la levadura Pichia pastoris, lo que implica el uso de la
secuencia SEQ ID NO: 1, o de otras secuencias nucleotídicas
obtenidas por mutagénesis de SEQ ID NO: 1.
La invención proporciona un eficaz método de
producción, aislamiento y purificación para estas proteínas, con un
alto rendimiento, a fin de utilizarlas con fines terapéuticos y de
diagnóstico.
Las ribonucleasas fúngicas extracelulares
constituyen una familia de proteínas con muy variadas funciones y
secuencias, aunque todas ellas presentan elementos homólogos de
estructura secundaria y centros activos muy parecidos. Dentro de
esta gran familia destaca el grupo de las denominadas ribotoxinas.
Las ribotoxinas son ribonucleasas microbianas extracelulares con
propiedades citotóxicas y antitumorales (Olson, 1963, patente
US3104204; Olson y Goerner, 1965, Applied Microbiol. 13,
314-321; Martínez-Ruiz et
al., 2001, Methods Enzymol. 341,
335-351). Estas funciones biológicas se basan en su
capacidad para atravesar membranas e inactivar los ribosomas. Esta
inactivación bloquea la maquinaria de biosíntesis proteica celular
y produce la muerte por apoptosis (Olmo et al., 2001,
Eur. J. Biochem. 268, 2113-2123). La
secuencia donde se produce la ruptura está presente en todos los
RNA ribosomales conocidos. Sin embargo, estas proteínas muestran
una cierta selectividad, siendo su acción mucho más efectiva cuando
se trata de células tumorales o infectadas por ciertos virus. Esta
selectividad radica precisamente en su capacidad para interaccionar
con membranas biológicas y entrar en ciertas células. Es por ello
también, y por su gran poder inmunogénico y estabilidad, por lo que
participan en el establecimiento de la mayoría de las alergias
frente a Aspergillus spp. y otros hongos filamentosos
(Crameri, 1998, Int. Arch. Allergy Immunol. 115,
99-114). Se ha probado cómo estas proteínas son los
principales alergenos responsables de este tipo de enfermedades
(Crameri, 1998, Int. Arch. Allergy Immunol. 115,
99-114; Hemmann et al., 1999, J. Allergy.
Clin. lmmunol. 104, 601-607; Kao et al.,
2001, Methods Enzymol. 341, 324-335) y se ha
producido en forma recombinante el principal alergeno de A.
fumigatus, la proteína rAspfl, con la idea de utilizarlo con
fines diagnósticos (Arruda et al., 1990 J. Experi.
Med. 172, 1529-1532).
Pese a todo, su utilización en el tratamiento y
diagnóstico de enfermedades (principalmente procesos de carácter
alérgico o cancerígeno) no ha sido posible hasta ahora debido a su
extremada toxicidad. Las ribotoxinas son los inhibidores de la
biosíntesis de proteínas más potentes que se conocen (Lamy et
al., 1992, Genetically Engineered Toxins, Ed.
Marcel-Dekker, 237-257). Es, por
tanto, del máximo interés poder disponer de formas suficientemente
activas pero con su citotoxicidad y/o alergenicidad atenuadas. La
ribonucleasa U2 (RNasa U2) de Ustilago sphaerogena es la
ribonucleasa fúngica extracelular no tóxica más próxima a las
ribotoxinas, desde un punto de vista filogenético. Como todas las de
la familia, comparte con ellas un núcleo estructural que comprende
los elementos de estructura secundaria ordenada y el centro activo
(Pérez-Cañadillas et al., 2000, J. Mol.
Biol. 299, 1061-1073). Sin embargo, la RNasa U2
presenta una especificidad enzimática completamente diferente y no
parece ser capaz de interaccionar con membranas. Por ello, no es
citotóxica. Disponer de formas recombinantes puras tanto de
diversas ribotoxinas como de la RNasa U2, o de cualquier variante
de las mismas obtenida por mutagénesis, permite el aislamiento de
proteínas no naturales potencialmente aptas para su utilización en
la diagnosis y el tratamiento terapéutico. Cuando se comparan las
estructuras de ambas enzimas, \alpha-sarcina y
RNasa U2, se observa que la principal diferencia radica en la
horquilla \beta amino-terminal de la primera. Como
se ha probado que esta horquilla determina las características
citotóxicas de la \alpha-sarcina
(García-Ortega et al., 2001, Protein
Sci. 10, 1658-1668), se decidió preparar una
variante en la que este elemento de estructura se sustituyó por las
dos Gly que constituyen el giro \beta presente en la posición
equivalente en la RNasa U2.
Hasta la fecha, no se ha descrito la preparación
de la variante objeto de la invención, pues se trata de una
proteína no natural obtenida mediante la tecnología del DNA
recombinante y distintas aproximaciones mutagénicas. Se ha descrito
la producción de alguna de las proteínas naturales en forma
recombinante (Arruda et al., 1990, J. Experi. Med.
172, 1529-1532; Fitton, 1993, patente ZA9301832;
Fitton, 1994, patente US5306626; Lacadena et al,1994,
Gene 142, 147-151;
Martínez-Ruiz et al., 1998, Protein
Expression and Purification 12, 315-322;
Martínez-Ruiz et al., 2000, FEMS
Microbiology Letters 189, 165-169), pero
éstas no reúnen las propiedades adecuadas para su utilización en
diagnosis y terapia, por las razones apuntadas más arriba.
La presente invención se refiere a la producción
de una variante de \alpha-sarcina que implica la
sustitución del fragmento de secuencia que comprende los
aminoácidos que ocupan las posiciones 7 a 22 por dos Gly, y de
proteínas homólogas a ésta que se produzcan mediante la tecnología
recombinante. Los organismos utilizados para su producción son el
procariota Escherichia coli y el eucariota Pichia
pastoris. La invención también se refiere a los protocolos de
aislamiento y purificación utilizados.
Por medio del procedimiento objeto de la
invención, se obtienen moléculas de DNA recombinante que codifican
polipéptidos que exhiben la funcionalidad de las ribotoxinas y/o de
la RNasa U2, y que, en muchos casos, son hipocitotóxicas y/o
hipoalergénicas.
Además, la invención dispone de secuencias
polinucleotídicas que hibridan en condiciones restrictivas con las
descritas antes -lo que implica un nivel de identidad de al menos
un 60% entre sus secuencias de nucleótidos-, o bien derivan de
ellas por degeneración del código genético, inserción, deleción o
mutagénesis.
El procedimiento de obtención de esta proteína
recombinante, \Delta (7-22)sarcina,
incluye vectores de expresión y células huésped que contengan una
secuencia de nucleótidos como la descrita en SEQ ID NO: 1
codificante de \Delta(7-22)sarcina,
proteínas homólogas o fragmentos suyos.
Mediante el procedimiento objeto de esta
invención se obtienen polipéptidos con actividad enzimática
endorribonucleolítica, con capacidad para interaccionar con
membranas lipídicas y/o propiedades antigénicas como las de las
ribotoxinas y/o la RNasa U2. Estos polipéptidos pueden contener la
secuencia caracterizada por SEQ ID NO: 1 y 2, o sus homólogas,
unidas a otros polipéptidos (por ejemplo, como proteínas de fusión
o como proteínas quiméricas), o haber sido modificados química o
enzimáticamente.
Los métodos de preparación de estos polipéptidos
implican su producción recombinante a partir de las moléculas
polinucleotídicas anteriormente mencionadas, en sistemas de cultivo
de células procariotas y eucariotas que contienen como vehículo de
esos DNA los vectores de expresión descritos. Una vez producida la
molécula polipeptídica concreta, ésta es aislada en forma soluble
mediante el adecuado fraccionamiento de las células y el medio
extracelular, utilizando cromatografías de intercambio fónico y
penetrabilidad, según se describe más adelante.
Los productos obtenidos mediante el
procedimiento objeto de la invención presentan actividad
ribonucleolítica y/o capacidad para interaccionar con membranas
lipídicas, así como reacción cruzada con anticuerpos IgG e IgE del
suero de pacientes alérgicos a hongos filamentosos, como los de
Aspergillus spp., sensibles a rAspfl (el alergeno principal
de la alergia frente a Aspergillus) (Arruda et al.,
1990 J. Experi. Med. 172, 1529-1532), o
segmentos antigénicos suyos.
Finalmente, con el procedimiento objeto de la
invención se dispone de moléculas homólogas a las ribotoxinas, pero
con propiedades biológicas alteradas, tanto a nivel de su actividad
y especificidad enzimática, como de su capacidad para atravesar
membranas, y, en muchos casos, además son hipoalergénicas. Por
ello, se pueden utilizar para ser incorporadas para la fiel
diagnosis de la hipersensibilidad a Aspergillus spp. y a
otros hongos filogenéticamente relacionados con ellos. Además,
también se pueden emplear en las preparaciones de alergenos que se
utilizan para llevar a cabo la inmunoterapia correspondiente para
el tratamiento de la alergia a Aspergillus. Asimismo, estas
moléculas (o sus fragmentos, o las proteínas quiméricas y de fusión
construidas con ellas) se pueden utilizar como agentes
antitumorales y/o antivirales, pues retienen muchas de las
propiedades de las ribotoxinas pero muestran una mayor selectividad
frente a las células diana o una menor citotoxicidad general. En
cuanto a su empleo en forma de proteínas de fusión, o de proteínas
quiméricas, también se contempla su utilización formando parte de
inmunotoxinas específicamente dirigidas contra células
tumorales.
En resumen, lo que la invención aporta es un
método reproducible y estandarizado para la producción y
aislamiento de proteínas homólogas a las ribotoxinas que sean lo
suficientemente tóxicas y/o alergénicas como para poder ser
utilizadas en distintos procedimientos de terapia y diagnosis, pero
que carezcan de las propiedades de toxicidad y alergenicidad propias
de las proteínas fúngicas naturales. Propiedades que, hasta ahora,
han impedido su utilización clínica.
En el procedimiento de obtención de la proteína
recombinante \Delta(7-22)sarcina se
utilizaron los conocimientos acumulados durante los procesos de
donación y producción de las proteínas naturales,
\Delta(7-22)sarcina y RNasa U2,
también en forma recombinante (Lacadena et al., Gene
142, 147-151,1994; Martínez-Ruiz
et al., Protein Expression and Purification 12,
315-322, 1998; Martínez-Ruiz et
al., FEMS Microbiology Letters 189,
165-169, 2000). Así, a partir de las secuencias
nucleotídicas conocidas de estas proteínas se diseñaron los
desoxioligonucleotidos necesarios para construir los mutantes
mediante técnicas de mutagénesis dirigida clásica, ya utilizadas en
la preparación de otros mutantes puntuales (Lacadena et al.
Biochem. J. 309, 581-586, 1995; Lacadena
et al, Proteins 37, 474-484, 1999;
García-Ortega et al. Prot. Sci. 10,
1658-1668, 2001; Martínez-Ruiz et
al, Methods Enzymol. 341, 335-351,
2001).
El procedimiento objeto de esta invención se
realiza mediante las siguientes fases:
El método empleado fue el que se conoce como
Método de Kunkel (Kunkel et al, Methods Enzymol. 154,
367-382,1987). Se disponía del DNA codificante de
la secuencia original de las proteínas nativas, donado en distintos
vectores. Uno de ellos permite su biosíntesis en forma de DNA de una
única hebra, mediante la utilización de E. coli con genotipo
F' y la utilización del fago filamentoso F1. Estas hebras de cadena
sencilla, que además se enriquecieron en uridina, mediante el
empleo de cepas de E. coli que también tuviesen un genotipo
ung^{-} dut^{-}, se utilizaron como molde para llevar a
cabo la mutagénesis y construir los mutantes objeto de la invención.
El desoxioligonucleótido mutagénico empleado para la preparación de
\Delta(7-22)sarcina fue
5'-GTGACCTGGACCTGCGGCGGCCTCCTCTACAACCAG-3'.
Tras la correspondiente elongación y ligación in vitro, se
transformaron células E. coli ung^{+}dut^{+} y se
seleccionaron las colonias que contenían las secuencias de DNA
mutantes, cuya estructura se confirmó mediante secuenciación.
Para la producción recombinante de estas
proteínas en E. coli la correspondiente secuencia
codificante de DNA fue ligada a los plásmidos pINPG (Lacadena et
al., Gene 142, 147-151,1994) o pET
(Novagen). Se utilizaron construcciones que implicaban la fusión de
las secuencias codificantes a la del péptido señal de la proteína
OmpA de E. coli, lo que permite su exportación al periplasma
y su correcto procesamiento. Las células utilizadas fueron de la
cepa BL21(DE3). La inducción se llevó a cabo mediante la
adición de distintas cantidades de IPTG durante la fase logarítmica
de crecimiento de las bacterias. Tras la correspondiente incubación
a 37ºC durante 16-36 horas, las bacterias se
trataron según protocolos estándar para obtener las distintas
fracciones celulares que contenían las proteínas recombinantes en
estado soluble y estas fracciones se utilizaron para llevar a cabo
su purificación. Este proceso de fraccionamiento se detalla en
Martínez-Ruiz et al., Methods Enzymol
341, 335-351, 2001.
En este caso, los vectores empleados para ligar
las secuencias codificantes de las proteínas recombinantes fueron
pHILD2, pHILS1, pPIC9 y pPICZ\alpha (Invitrogen). Células GS115 o
KM71, convenientemente transformadas con las construcciones
correspondientes, se cultivaron primero en medio mínimo tamponado
de glicerol (BMY), no inductor, para conseguir buenos niveles de
densidad celular. Una véz alcanzado este punto, las células se
recogieron mediante centrifugación y se volvieron a resuspender en
el medio inductor, medio mínimo tamponado de metanol (BMM). Estas
células se incubaron a 30ºC durante 2-4 días, con
fuerte agitación añadiendo metanol cada 12 horas (concentración
final del 0.5%) para que la producción de las proteínas
recombinantes fuese máxima. Una vez acabado el cultivo, se separó
el medio extracelular mediante ultracentrifugación y se utilizó
como punto de partida para llevar a cabo el aislamiento y la
purificación de las proteínas.
Esta purificación se llevó a cabo mediante dos
etapas, una cromatografía de intercambio fónico en Amberlita IRC 50
y una cromatografía de penetrabilidad en Biogel P10. Cuando fue
necesario concentrar las distintas fracciones de proteína se
recurrió a la liofilización o a la ultrafiltración. Los cambios de
pH y/o de tampón se llevaron a cabo mediante diálisis o
cromatografía de penetrabilidad en Biogel P2. Este procedimiento
rinde una preparación de proteína de una pureza superior al 99% de
acuerdo con su comportamiento en HPLC y PAGE-SDS,
con su composición de aminoácidos y con sus características
espectroscópicas. Además, es reconocida por el anticuerpo
policlonal específico de la \alpha-sarcina
fúngica natural.
\smallskip
SEQ ID NO: 1
\smallskip
La secuencia de DNA correspondiente
a los residuos 7 a 22 de la \alpha-sarcina fue
delecionada. Esta secuencia de DNA corresponde a una horquilla
\beta que sobresale del núcleo estructural principal de la
\alpha-sarcina.
\smallskip
La secuencia de DNA correspondiente
a dos Gly fue insertada. Estas dos glicocolas aparecen en una
posición equivalente en la RNasa U2 y permiten el establecimiento
de un giro \beta necesario para que la proteína se pliegue
correctamente.
\smallskip
SEQ ID NO: 2
\smallskip
La secuencia de aminoácidos
correspondiente a los residuos 7 a 22 de la
\alpha-sarcina ha sido delecionada. Esta
secuencia de aminoácidos corresponde a una estructura de horquilla
\beta presente en el extremo amino-terminal de la
\alpha-sarcina. Esta estructura sobresale del
núcleo estructural principal de la
\alpha-sarcina
\smallskip
Se insertaron dos residuos de Gly.
Estas dos glicocolas están presentes en la RNasa U2 y permiten el
establecimiento de un giro \beta necesario para que la proteína
se pliegue
correctamente.
<110> Universidad Complutense de
Madrid
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Método de producción de variantes de
ribotoxina
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 424
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (19)...(24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> The DNA sequence corresponding to
\alpha-sarcin amino acid residues 7 to 22 has
been deleted. This DNA corresponds to a
\beta-hairpin structure which protudes out of the
\alpha-sarcin main structural core.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (19)...(24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> The DNA sequence corresponding to
two Gly residues has been inserted. These two Gly are present in
RNase U2 and allow the establishment of a
\beta-turn required for the correct folding of the
protein.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 136
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)...(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> The amino acid sequence
corresponding to \alpha-sarcin amino acid
residues 7 to 22 has been deleted. This amino acid sequence
corresponds to the \alpha-sarcin
amino-terminal \beta-hairpin. This
structure protrudes out of the \alpha-sarcin main
structural core.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)...(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Two Gly residues have been inserted.
These two Gly are present in RNase U2 and allow the establishment
of \beta-turn required for the correct folding of
the protein.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
Claims (19)
1. Moléculas de DNA recombinante
caracterizadas por SEQ ID NO: 1 que codifican péptidos con
actividad ribonucleolítica y que poseen al menos un epítopo
alergénico común con el alergeno principal de Aspergillus
spp. denominado Aspfl.
2. Moléculas de DNA recombinante
caracterizadas por SEQ ID NO: 1 que codifican péptidos con
propiedades citotóxicas y/o alergénicas atenuadas.
3. Moléculas de DNA recombinante
caracterizadas por SEQ ID NO: 1 que codifican péptidos con
capacidad alterada, con respecto a la
\alpha-sarcina, para interaccionar con membranas
lipídicas.
4. Moléculas de DNA recombinante, según
reivindicacones anteriores, o modificaciones de las mismas, que
codifican polipéptidos unidos a un polipéptido adicional, o
modificados química o enzimáticamente.
5. Polipéptidos recombinantes de
\Delta(7-22)sarcina, o fragmentos de
dichos polipéptidos, caracterizados por la secuencia dada en
SEQ ID NO: 1 y 2, que presentan la antigenicidad de, al menos, un
epítopo de Aspf1.
6. Polipéptidos recombinantes de
\Delta(7-22)sarcina, o fragmentos de
dichos polipéptidos, caracterizados por la secuencia dada en
SEQ ID NO: 1 y 2, que presentan actividad ribonucleolítica alterada
con respecto a la \alpha-sarcina y la RNasa
U2.
7. Polipéptidos recombinantes de
\Delta(7-22)sarcina, o fragmentos de
dichos polipéptidos, caracterizados por la secuencia dada en
SEQ ID NO: 1 y 2, que presentan actividad citotóxica alterada con
respecto a la \alpha-sarcina y la RNasa U2.
8. Polipéptidos recombinantes de
\Delta(7-22)sarcina, o fragmentos de
dichos polipéptidos, caracterizados por la secuencia dada en
SEQ ID NO: 1 y 2, que presentan una capacidad alterada para
interaccionar con membranas con respecto a la
\alpha-sarcina y la RNasa U2.
9. Un vector de expresión procariota, y
preferentemente pINPG o pET, que contenga cualquiera de las
secuencias de nucleótidos descritas en las reivindicaciones 1 a 4,
y que permita la producción recombinante de cualquiera de los
polipéptidos según reivindicaciones 5 a 8.
10. Un vector de expresión eucariota, y
preferentemente pHILD2, pHILS1, pPIC9 o pPICZ\alpha, que contenga
cualquiera de las secuencias de nucleótidos descritas en las
reivindicaciones 1 a 4, y que permita la producción recombinante de
cualquiera de los polipéptidos según reivindicaciones 5 a 8.
11. Un organismo hospedador procariota,
transformado con un vector según reivindicación 9.
12. Un organismo hospedador eucariota,
transformado con un vector según reivindicación 10.
13. Un método para producir los polipéptidos
recombinantes descritos en las reivindicaciones 5, 6, 7 y 8,
utilizando un vector de expresión como el descrito en la
reivindicación 9 en el sistema procariota de bacteria Escherichia
coli y preferentemente de la cepa BL21(DE3),
caracterizado por una cromatografía de intercambio fónico en
Amberlita IRC-50 y una de penetrabilidad en Biogel
P10.
14. Un método para producir los polipéptidos
recombinantes descritos en las reivindicaciones 5, 6, 7 y 8,
utilizando un vector de expresión como el descrito en la
reivindicación 10 en el sistema eucariota de levadura Pichia
pastoris y preferentemente de las cepas GS115 y KM71,
caracterizado por una cromatografía de intercambio iónico en
Amberlita IRC-50 y una de penetrabilidad en Biogel
P10.
15. Utilización de las moléculas, según
reivindicaciones 1-8, en el diagnóstico in
vitro de la alergia.
16. Aplicación de las moléculas recombinantes,
según reivindicaciones 1-8, para el diseño de
vacunas destinadas a la inmunoterapia de la alergia.
17. Aplicación de las moléculas recombinantes
según reivindicaciones 1-8 para producir péptidos
que contengan al menos un epítopo T del alergeno Aspfl y sean
capaces de actuar como vacunas.
18. Aplicación de las moléculas recombinantes,
según reivindicaciones 1-8, para la producción de
isoformas recombinantes hipoalergénicas que tengan disminuida o
anulada su unión a IgE para el tratamiento de alergias.
19. Aplicación de las moléculas recombinantes,
según reivindicaciones 1-8, para la producción de
polipéptidos recombinantes con citotoxicidad modificada.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200200562A ES2241383B2 (es) | 2002-03-08 | 2002-03-08 | Metodo de produccion de variantes de ribotoxina. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200200562A ES2241383B2 (es) | 2002-03-08 | 2002-03-08 | Metodo de produccion de variantes de ribotoxina. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2241383A1 ES2241383A1 (es) | 2005-10-16 |
| ES2241383B2 true ES2241383B2 (es) | 2008-04-01 |
Family
ID=35151124
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200200562A Expired - Fee Related ES2241383B2 (es) | 2002-03-08 | 2002-03-08 | Metodo de produccion de variantes de ribotoxina. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2241383B2 (es) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1104768A1 (en) * | 1999-12-02 | 2001-06-06 | Council of Scientific and Industrial Research | Peptide sequences from aspergillus fumigatus for the diagnosis of aspergillosis |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU654563B2 (en) * | 1991-07-24 | 1994-11-10 | Imperial Chemical Industries Plc | Proteins |
-
2002
- 2002-03-08 ES ES200200562A patent/ES2241383B2/es not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1104768A1 (en) * | 1999-12-02 | 2001-06-06 | Council of Scientific and Industrial Research | Peptide sequences from aspergillus fumigatus for the diagnosis of aspergillosis |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| SACCO, G. et al. "The primary structure of the cytotoxin alpha-sarcin". THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY. 10 de mayo de 1983. Vol. 258, nº 9, páginas 5811-5818, todo el documento. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2241383A1 (es) | 2005-10-16 |
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