CZ261097A3 - Chemokinové receptory 88-2B (CKR-3) a 88C a jejich protilátky - Google Patents

Description

(57) Anotace:

Polynukleotidy kódující chemokinové receptory 88-2B nebo 88C a látky a způsoby vhodné pro rekombinantní produkci těchto dvou chemokinových receptorů. Dále se řešení týká stanovení, při nichž se těchto polynukleotidů používá, která umožňují identifikovat ligandy a modulátory těchto chemokinových receptorů. Receptorové fragmenty, ligandy, modulátory a protilátky jsou užitečné při detekci a léčení chorobných stavů spojených s těmito chemokinovými receptory, jako je atherosklerosa, rheumatoidní arthritis, růst nádorů, astma, virové infekce, AIDS a jiné zánětlivé stavy.

- °čl· ·· ·· ·· ···· · • · · ·. · · 9

9 9 99 9 9 9 · • ·· ··· · ·· · _ L — ···· ····

01-1911-97-Če

Chemokinové receptory 88-2B (CKR-3) a 88C a jejich protilátky

Oblast techniky

Vynález se obecně týká transdukčních drah signálu a zejména se týká chemokinových receptorů, nukleových kyselin kódujících chemokinové receptory, ligandů chemokinových receptorů, modulátorů aktivity chemokinových receptorů, protilátek rozpoznávajících chemokiny a chemokinové receptory, způsobů identifikace ligandů a modulátorů chemokinových receptorů, způsobů produkce chemokinových .....

receptorů a způsobů produkce protilátek rozpoznávajících chemokinové receptory.

Dosavadní stav techniky

Nedávný pokrok v molekulární biologii vedl k poznání, že transdukční dráhy signálu mají ústřední roli v biologických procesech. Tyto dráhy zahrnují centrální prostředek, pomocí kterého jednotlivé buňky vícebuněčného organismu komunikují a tím koordinují biologické procesy (viz model, který je uveden v tabulce I publikace Springer, Cell 76: 301 až 314 (1994)). Jedna větev transdukčních drah signálu, která je definována intracelulární participací proteinů vázajících guaninový nukleolid (G-proteinů), ovlivňuje široký rozsah biologických procesů.

Obecná diskuse G-proteinových transdukčních drah signálu je uvedena v publikaci Lewin, Genes V 319 až 348 (1994). Podle této diskuse zahrnují tyto dráhy přinejmenším následující složky: extracelulární signál (například neurotransmitery, peptidové hormony, organické molekuly, světlo nebo odoranty), receptor rozpoznávající signál [receptor kopulovaný s G-proteinem, přehled viz publikace Probst et al., DNA and Cell Biology 11: 1 až 20 (1992), který je rovněž znám pod označením GPR nebo GPCR) a intracelulární heterotrimerní protein vázající GTP nebo G-protein. Tyto dráhy se staly předmětem zájmu zejména s ohledem na úlohu, kterou vykazují při regulaci pohybu bílých krvinek či leukocytů.

Leukocyty zahrnují skupinu pohyblivých krvinek několika typů, tj. granulocyty (tedy neutrofily, basofily a eosinofily), lymfocyty a monocyty. Když jsou tyto buňky mobilizovány a aktivovány, podílejí se především na obraně těla před cizí hmotou. Tento úkol je komplikován rozmanitostí normálních a patologických procesů, na nichž se leukocyty podílejí. Leukocyty se například podílejí na normální odpovědi na infekci, kterou je zánět. Leukocyty se také podílejí na různých patologických zánětech. Přehled viz Schall et al., Curr. Opin. Immunol. 6: 865 až 873 (1994). Každý z těchto procesů může kromě toho zahrnovat jedinečné příspěvky, pokud se týče stupně, druhu a trvání, od každého typu leukocytových buněk.

Při studiu těchto imunitních reakcí se vědci z počátku soustředili na signály působící na leukocyty, poněvadž se domnívali, že pro vyvolání jakékoliv formy odpovědi je zapotřebí signálu. Přehled členů důležité skupiny leukocytových signálů, totiž peptidových signálů, je uveden v publikaci Murphy, Ann. Rev. Immunol_r 12: 593-633 (1994). Jeden typ peptidového signálu zahrnuje chemokiny (chemo-atraktantové cvtokinv). které jsou v publikaci Oppenheim et al., Ann. Rev. Immunol. 9: 617-648 (1991) označovány názvem interkriny. Rostoucí počet chemokinů, které byly identifikovány a podrobeny genetickým a biochemickým analýzám, je kromě výše uvedené citace Oppenheim et • · ·· al. dokumentován také citací Baggiolini et al., Advances in Immunol. 55: 97 až 179 (1994).

Na základě porovnávání aminokyselinových sekvencí známých chemokinů bylo vytvořeno klasifikační schéma rozdělující chemokiny do dvou skupin: a - skupina je charakterizována přítomností jediné aminokyseliny oddělující první dva cysteiny (CXC; N-konec jako referenční) a β - skupina je charakterizována sousedstvím dvou cysteinových zbytků (CC); viz výše uvedená publikace Baggiolini et al. Mezi chemokiny a konkrétními typy leukocytových buněk odpovídajících na tyto signály byly zjištěny korelace. Schall et al. (viz výše uvedená citace) oznámili, že chemokiny CXC obvykle ovlivňují neutrofily a chemokiny CC mají tendenci ovlivňovat monocyty, lymfocyty, basofily a eosinofily. Baggiolini et al. například ve výše zmíněné citaci uvádějí, že RANTES, což je CC chemokin, působí jako chemoatraktant pro monocyty, lymfocyty (tj. pamětové T buňky), basofily a eosinofily, ale nikoli pro neutrofily, přičemž indukuje uvolňování histaminu z basofilů.

Cocchi et al. v publikaci Science, 270: 1811 až 1815 (1995) nedávno ukázali, že chemokiny jsou supresory proliferace HIV. Cocchi et al. demonstrovali, že RANTES, ΜΙΡ-Ια a MIP-Ιβ potlačuje infekci HIV-1, HIV-2 a SIV u buněčné linie CD4⁺ označené PM1 a primárních jednojaderných buněk periferní krve člověka.

Nedávno se však pozornost přesunula na buněčné receptory vázající chemokiny, poněvadž se zdá, že extracelulární chemokiny kontaktují buňky bez diskriminace, a proto postrádají specificitu, které je zapotřebí pro regulaci jednotlivých typů leukocytových buněk.

• ·

Murphy uvádí ve výše jmenované citaci, že třída chemokinových receptorů spadá do nadtřídy GPCR. Typická struktura chemokinového receptoru zahrnuje extracelulární doménu vázající chemokiny, která je umístěna v blízkosti N-konce, po níž následuje sedm v odstupu uspořádaných oblastí převážně hydrofobních aminokyselin, které jsou schopny vytvářet α-helixy rozprostírající se v membráně.

Mezi α-helikálními doménami jsou vždy přítomny hydrofilní domény, a to bud v intra- nebo v extracelulárních prostorech. Tyto znaky dodávají chemokinovému receptoru uloženému v membráně hadovitou konformaci. Třetí intracelulámí smyčka obvykle interaguje s G-proteiny. Dále Murphy ve výše citované publikaci uvádí, že intracelulámí karboxylový konec je rovněž schopen interakce s G-proteiny.

Prvními chemokinovými receptory, které byly analyzovány technikami molekulárního klonování, byly dva neutrofilové receptory pro lidský IL8, což je CXC chemokin. Klonování těchto dvou receptorů pro IL8 oznámili Holmes et al., Science 253: 178 až 1280 (1991) a Murphy et al.,

Science 253: 1280 až 1283 (1991). cDNA kódující tyto receptory byly analyzovány (Lee et al., J. Biol. Chem. 267: 16283 až 16287 (1992) a bylo zjištěno, že mezi kódovanými receptory existuje 77% identita aminokyselinové sekvence, přičemž každý z těchto receptorů vykazuje znaky třídy receptoru kopulovaného s G-proteinem. Jeden z těchto receptorů je specifický pro IL-8, zatímco druhý se váže a signalizuje v odpovědi na IL-8, gro/MGSA a NAP-2.

Genetická manipulace genů kódujících receptory IL-8 přispěla k našemu porozumění biologickým úlohám těchto receptorů. Tak například Cacalano et al. (Science 265: 682 až 684 (1994)) oznámili, že delece IL-8 receptorového homologu u myši vede k pleiotrofickému fenotypu zahrnujícímu lymfadenopatii a splenomegalii. Kromě toho studie mutací s chybným smyslem popsaná v publikaci Leong et al., J. Biol. Chem. 269: 19343 • · · ·

až 19348 (1994) odhalila aminokyseliny receptoru IL-8, které jsou rozhodující pro vazbu IL-8. Na základě pokusů s výměnou domén (Murphy, výše uvedená citace) byl učiněn předpoklad, že determinantem vazebné specifity je amino-terminální extracelulární doména.

Také bylo identifikováno a klonováno několik receptorů CC chemokinů. CCCKR1 váže jak ΜΙΡ-Ια, tak RANTES, a vyvolává intracelulární tok vápenatých iontů v odpovědi na oba ligandy. Charo et al. (Proč. Nati. Acad. Sci USA 91:

2752 až 2756 (1994)) oznámili, že další CC chemokinový receptor, MCP-R1 (CCCKR2) je kódován jediným genem produkujícím dvě varianty sestřihu, které se od sebe liší svými karboxy-terminálními doménami. Tento receptor se váže a odpovídá na MCP-3 kromě MCP-1.

Také byl identifikován promiskuitní receptor, který váže jak CXC, tak CC chemokiny. Tento receptor byl původně zjištěn na červených krvinkách a Horuk et al. (Science 261: 1182 až 1184 (1993)) uvádějí, že váže IL-8, NAP-2, GROa, RANTES a MCP1. Chemokinový receptor erythrocytů sdílí přibližně 25% identitu s jinými chemokinovými receptory a zřejmě pomáhá regulovat hladinu cirkulujících chemokinů nebo napomáhá při orientaci chemokinů na jejich cíle. Bylo také ukázáno, že chemokinový receptor erythrocytů nejen váže chemokiny, nýbrž je také receptorem pro Plasmodium vivax, který je hlavní příčinou malárie (stejná citace). Také u dalšího receptoru kopulovaného ke G-proteinu, který je blízce příbuzný chemokinovým receptorům, totiž u receptoru faktoru aktivace krevních destiček, bylo zjištěno, že působí jako receptor lidského pathogenu, baktérie Streptococcus pneumoniae (Cundell et al., Nátuře 377: 435 až 438 (1995)).

Kromě savčích chemokinových receptorů byly také identifikovány dva virové homology chemokinových receptorů.

• · · ·

Ahuja et al. (J. Bioi. Chem. 268: 20691 až 20694 (1993)) popisují genový produkt z Herpesvirus saimiri, který sdílí přibližně 30% identitu s receptory IL-8 a váže CXC chemokiny. Neote et al. (Cell, 72: 415 až 425 (1993)) uvádějí, že lidský cytomegalovirus obsahuje gen, kódující receptor, který sdílí přibližně 30% identitu s CC chemokinovými receptory a váže ΜΙΡ-Ια, MIP-Ιβ a RANTES. Tyto virové receptory mohou ovlivňovat normální roli chemokinů a poskytovat selektivní patologickou výhodu před virem.

S ohledem na velkou rozmanitost chemokinů a jejich aktivit existují četné receptory chemokinů. Receptory, které byly charakterizovány, představují jen zlomek celkového ~ úhrnu chemokinových receptorú. Přetrvává tedy potřeba identifikovat další chemokinové receptory. Budou-li tyto nové receptory k dispozici, stanou se prostředkem pro vývoj terapeutických modulátorů funkce chemokinů nebo chemokinových receptorú. Na základě tohoto vynálezu lze předpokládat, že takové modulátory budou užitečné jako terapeutická činidla pro léčení atherosklerosy, rheumatoidní arthritis, jako protinádorové prostředky a léčiva pro léčení asthma, virových infekcí a jiných zánětlivých chorob. Alternativně se taková terapeutická užitečnost předpokládá u fragmentů nebo variant takových chemokinových receptorú nebo protilátek rozpoznávajících tyto receptory.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu jsou purifikované a izolované nukleové kyseliny kódující chemokinové receptory, které se podílejí na pohybu leukocytů. Polynukleolidy podle vynálezu (a to jak kódující, tak nekódující řetězce) zahrnují genomové DNA, cDNA a RNA a také úplně nebo z části synthetické nukleové kyseliny. Přednostními polynukleolidy podle vynálezu jsou DNA kódující chemokinový receptor 88-2B, která je ·· ··· ·

- 7 znázorněna v SEQ ID NO:3, DNA kódující chemokinový receptor 88C, která je znázorněna v SEQ ID NO:1, a DNA, které hybridizují k těmto DNA za standardních stringentních hybridizačních podmínek nebo které by takto hybridizovaly nebýt redundance genetického kódu. Jako příklad stringentních hybridizačních podmínek je možno uvést tyto podmínky: hybridizace při 42°C v 5X SSC, 20mM fosforečnanu sodném o pH 6,8, 50% formamidu a promývání při 55°C za použití 0,2X SSC. Odborníkům v tomto oboru je zřejmé, že se tyto podmínky mění s ohledem na délku a obsah GC nukleotidu v sekvencích, které mají být hybridizovány. Pro stanovení přesných hybridizačních podmínek existují v tomto oboru standardní postupy (viz odstavce 9.47 až 9.51 příručky Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Mannual, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989).

Do rozsahu vynálezu také spadají polynukleotidy kódující domény 88-2B nebo 88C, například polynukleotidy kódující jednu nebo více extracelulárních domén bud samotného proteinu nebo jiného jeho biologicky účinného fragmentu. Extracelulární domény 88-2B odpovídají SEQ ID NO:3 a SEQ ID NO:4 v případě aminokyselinových zbytků v pozicích 1-36, 93-107, 171-196 a 263-284. Extracelulární domény 88-2B jsou kódovány polynukleotidovými sekvencemi odpovídajícími SEQ ID NO:3 v nukleotidových polohách 362-469, 638-682, 872-949 a 1148-1213.

Extracelulární domény 88-C ₌odpovídaji SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:2 v případě aminokyselinových zbytků v pozicích 1-32, 89-112, 166-191 a 259-280. Extracelulární domény 88-C jsou kódovány polynukleotidovými sekvencemi odpovídajícími SEQ ID NO:1 v nukleotidových polohách 55-150, 319-390, 550-627 a 829-894.

Do rozsahu vynálezu také spadají polynukleotidy kódující intracelulární domény těchto chemokinových receptorů. Intracelulární domény 88-2B odpovídají SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO:4 v případě aminokyselinových zbytků v pozicích 60-71, 131-151, 219-240 a 306-355. Tyto domény jsou kódovány polynukleotidovými sekvencemi odpovídajícími SEQ ID NO:3 v nukleotidových polohách 539-574, 752-814, 1016-1081 a 1277-1426. Intracelulární domény 88-C odpovídají SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO: 2 v případě aminokyselinových zbytků

Tiš · v pozicích 56-67, 125-145, 213-235 a 301-352. Intracelulární domény 88-C jsou kódovány polynukleotidovými sekvencemi odpovídajícími SEQ ID NO:1 v nukleotidových polohách 220-255, 427-489, 691-759 a 955-1110.

Peptidy odpovídající jedné nebo více těmto extracelulární m nebo intracelulámím doménám nebo protilátky vypěstované proti těmto peptidům jsou považovány za modulátory aktivit receptoru, zejména vazebné aktivity těchto receptorů k ligandu a G-proteinu.

Nukleotidových sekvencí podle vynálezu se také může používat pro konstrukci oligonukleotidů pro použití jako značených prób za účelem izolace genomových DNA kódujících 88-2B nebo 88C za stringentních hybridizačních podmínek (tj. za použití metody analýzy Southern a řetězové reakce vyvolané polymerasou - PCR). Těchto oligonukleotidových prób je kromě toho možno používat pro detekci konkrétních allel genů

......_ kódujících. 88-2B nebo 88C. což umožní diagnózu a genovou _ terapii chorobných stavů, které jsou s těmito specifickými allelami spojeny. Mimoto lze těchto oligonukleotidů použít pro pozměnění genetiky chemokinového receptoru ža účelem umožnění identifikace modulátorů chemokinového receptoru. Těchto nukleotidových sekvencí je také možno použít pro konstrukci kódujících genetických prvků pro použití při výzkumu nebo pozměňování genetiky a exprese 88-2B nebo 88C.

• · ·· · ·

Předmětem vynálezu jsou dále také biologické repliky (tj. kopie izolovaných DNA zhotovené in vivo nebo in vitro) a RNA transkripty DNA podle vynálezu. Dále do rozsahu vynálezu také spadají autonomně se replikující rekombinantní konstrukty, jako jsou plasmidové, virové a chromosomální (například YAC) nukleokyselinové vektory, které mají efektivně zabudovány polynukleotidy 88-2B nebo 88C, a zejména vektory, v nichž je DNA efektivně kódující receptor 88-2B nebo 88C operativně připojen k jedné nebo většímu počtu endogenních nebo heterologních sekvencí řídících expresi.

Receptory 88-2B a 88C mohou být produkovány přírodní, rekombinantní nebo syntetickou cestou. Pro expresi chemokinových receptorů 88-2B a 88C se může používat hostitelských buněk (prokaryontních nebo eukaryontních), jež jsou transformovány nebo transfekovány polynukleotidy podle vynálezu za použití standardních metod. Kromě intaktních genových produktů 88-2B nebo 88C spadají do rozsahu vynálezu také biologicky účinné fragmenty 88-2B nebo 88C, analogy 88-2B nebo 88C a syntetické peptidy odvozené z aminokyselinové sekvence 88-2B (SEQ ID NO:4) nebo 88C (SEQ ID NO:2). Genový produkt 88-2B nebo 88C nebo jeho biologicky účinný fragment produkovaný v eukaryontní buňce může být posttranslančně modifikován (například vytvořením disulfidové vazby, glykosylaci, fosforylaci, myristoylací, palmitoylací, acetylaci atd.). Do rozsahu vynálezu spadají dále genové produkty 88-2B a 88C nebo jejich biologicky účinné fragmenty v monomerních, homomultimerních nebo heteromultimerních konformacích.

Jedním specifickým aspektem tohoto vynálezu jsou protilátkové produkty, které jsou schopny se specificky vázat k chemokinovým receptorům 88-2B nebo 88C. Tyto protilátkové produkty se vytvářejí standardními postupy • · · · 9 ·

tohoto oboru za použití rekombinantních receptorů 88-2B nebo 88C, synthetických peptidů nebo peptidových fragmentů receptorů 88-2B nebo 88C, hostitelských buněk exprimujíeích na svém povrchu 88-2B nebo 88C nebo receptorů 88-2B nebo 88C purifikovaných z přírodních zdrojů, jako imunogenů. Protilátkové produkty mohou zahrnovat monokionáiní protilátky nebo polyklonální protilátky z jakéhokoliv zdroje a jakéhokoliv subtypu. Náleží sem dále také monomerní, homomultimerní nebo heteromultimerní protilátky a jejich fragmenty. Do rozsahu tohoto aspektu vynálezu spadají též CDR-roubované protilátky, humanizované protilátky a jiné modifikované protilátkové produkty, které si zachovávají svou schopnost specificky se vázat k chemokinovému receptoru.

Do rozsahu vynálezu také spadá použití protilátkových produktů pro detekci genových produktů 88-2B nebo 88C, jejich analogů nebo biologicky účinných fragmentů. Tak například se protilátkových produktů může používat při diagnostických postupech, jejichž účelem je odhalit korelace mezi expresí 88-2B nebo 88C a různými normálními nebo pathologickými stavy. Kromě toho se protilátkových produktů může použít pro diagnostikaci tkáňově specifických variací při expresi 88-2B nebo 88C, jejich analogů nebo biologicky účinných fragmentů. Protilátkové produkty, které jsou specifické pro chemokinové receptory 88-2B a 88C, mohou také působit jako modulátory aktivit receptoru. Podle jiného aspektu jsou protilátky vůči receptorům 88-2B nebo 88C užitečné k terapeutickým účelům.

Předmětem vynálezu jsou také stanovení ligandů, které jsou schopny interagovat s receptory chemokinů podle tohoto vynálezu. Tato stanovení mohou zahrnovat přímou detekci aktivity chemokinového receptoru, například monitorování vazby značeného ligandu k receptoru. Kromě toho se ·♦ ·· ·· 9999 ·’ · · · · 9

9999 9 9 9

99 999 9 9

99 9 · · 9 9 takových stanovení může použít pro nepřímé stanovení interakce ligandu s chemokinovým receptorem. Pod označením ligand, jak se ho používá v tomto popisu, se rozumějí molekuly, které jsou agonisty a antagonisty 88-2B nebo 88C, a jiné molekuly, které se vážou k těmto receptorúm.

Přímá detekce ligandu vázajícího se k chemokinověmu receptorů se může provádět za použití následujícího postupu. Zkoušené sloučeniny (tj. předpokládané ligandy) se detegovatelně označí (například radioaktivním izotopem jodu). Detegovatelně označené zkoušené sloučeniny se potom uvedou do styku s membránovými přípravky obsahujícími chemokinový receptor podle vynálezu. Membrány se přednostně připravují z hostitelských buněk exprimujících chemokinové receptory podle vynálezu z rekombinantních vektorů. Po inkubační periodě, při níž se umožní styk mezi chemokinovými receptory uloženými v membráně a detegovatelně značenými zkoušenými sloučeninami, se membránová látka shromáždí na filtru pomocí vakuové filtrace. Detegovatelná značka zachycená na filtru se kvantifikuje. Kvantifikace radioaktivního značícího činidla se například může provádět pomocí kapalinové scintilační spektrofotometrie. Za použití této techniky se identifikují ligandy vázající se k chemokinovým receptorúm. Pro potvrzení identifikace ligandu se detegovatelně označená sloučenina exponuje membránovému přípravku obsahujícímu chemokinový receptor za přítomnosti zvyšujících se množství zkoušené sloučeniny v neoznačeném stavu. Postupné snižování koncentrace,značícího činidla připojeného k filtru při přidávání zvyšujících se množství neoznačené zkoušené sloučeniny potvrzuje identifikaci ligandu.

Agonisty jsou ligandy, které se vážou k receptorů a vyvolávají iňtracelulární transdukci signálu, zatímco antagonisty jsou ligandy, které se vážou k receptorů, ale iňtracelulární transdukci signálu nevyvolávají. Stanovení, ·· ·· ···· ·· ·· • · · · · · · ·· · · 4 · · ··

- 12 pomocí kterého se zjišťuje, zda určitý ligand je agónistou nebo antagonistou, se například může provést pomocí stanovení transdukčních drah signálu kopulovaných k proteinu G. Aktivace těchto drah se může stanovit měřením intracelulárního toku vápenatých iontů, stanovením aktivity fosfolipasy C nebo adenylyl cyklasy a také jinými způsoby (viz příklady 5 a 6 ).

Jak je to podrobněji diskutováno v dále uvedených příkladech, chemokiny, které se vážou k receptoru 88C, zahrnují RANTES, ΜΙΡ-Ια a MIP-Ιβ, zatímco chemokiny, které se vážou k receptoru 88-2B, zahrnují RANTES.

Podle jiného aspektu zahrnuje vynález také modulátory interakce mezi receptory 88C a 88-2B a jejich ligandy. Modulátory funkce chemokinových receptorů je možno identifikovat za použití stanovení, která se podobají stanovením používaným pro identifikaci ligandů. Membránový přípravek obsahující chemokinový receptor se exponuje konstantnímu a známému množství detegovatelně značeného funkčního ligandu. Kromě toho se také chemokinový receptor vázaný k membráně exponuje zvyšujícímu se množství zkoušené sloučeniny, u níž je předpokládána modulační účinnost na tento chemokinový receptor. Pokud úroveň značícího činidla připojeného k filtru koreluje s množstvím zkoušené sloučeniny, je tato sloučenina modulátorem aktivity chemokinového receptoru. Pokud se úroveň značícího činidla připojeného _k membráně zvyšuje se zvyšuj ícím se množstvím zkoušené sloučeniny, byl identifikován aktivátor. Pokud se naproti tomu úroveň značícího činidla připojeného k filtru mění s množstvím zkoušené sloučeniny nepřímo úměrně, byl identifikován inhibitor aktivity chemokinového receptoru. Takové zkoušení modulátorů vazby k receptoru umožňuje provést rychlý screening mnoha potenciálních modulátorů, • φ φφ Φ· ···· ·· ·· φ φ · φ φ φ φ φ φ φ • · φφφ φ · φ · φ φφ • ·· φφφ · φ φ φφφ · φ φ φ φ φ φ φ φ φ ··· φ φ φφ ·· φφ φφ φφ poněvadž při stejné reakci je možno současně zkoušet skupiny mnoha potenciálních modulátorů.

„, , c.. ·

Nepřímá stanovení vazby k receptoru zahrnují měření koncentrace či úrovně aktivity jakékoliv složky, která se vyskytuje v relevantní transdukční dráze signálu. Aktivace chemokinového receptoru je často spojena s intracelulárním tokem vápenatých iontů. Buňky exprimující chemokinové receptory je možno obarvit barvivém, které je citlivé vůči vápníku. Po aktivaci exprimovaného receptoru se tok vápenatých iontů stane díky barvivu spektrofotometricky detegovatelným. Alternativně je možno detegovat tok vápenatých iontů mikroskopicky. Za použití kterékoliv z těchto technik je možno provádět paralelní stanovení za přítomnosti a nepřítomnosti potenciálních ligandů. Tak například za použití mikroskopického stanovení toku vápenatých iontů byl CC chemokin RANTES identifikován jako ligand chemokinového receptoru 88-2B. Odborníkům v tomto oboru je zřejmé, že tato stanovení jsou také užitečná pro identifikaci a monitorování purifikace modulátorů aktivity receptoru. Aktivátory a inhibitory receptoru budou podle své povahy při těchto stanoveních aktivovat nebo inhibovat interakci receptorů s jejich ligandy.

Asociace chemokinových receptorů s G proteiny poskytuje alternativně možnost stanovení aktivity receptoru na základě monitorování aktivit G proteinu. Tak například .„GTP hydrolýzu, což jecharakteristická aktivita G proteinů, je možno monitorovat za použití ³²P-značeného GTP.

G proteiny také ovlivňují řadu jiných molekul prostřednictvím své účasti v transdukčních drahách signálu. Tak například G proteinové efektorové molekuly zahrnují adenylyl cyklasu, fosfolipasu C, iontové kanály a fosfodiesterasy. Stanovení, zaměřených na kterékoliv z těchto ·» ····

efektoru, se může použít pro monitorování aktivity chemokinového receptorů indukované vazbou ligandu v hostitelské buňce, která exprimuje chemokinový receptor, který je předmětem zájmu a je uvedena do styku s příslušným ligandem. Jednou metodou, kterou je možno zjišíovat aktivitu chemokinových receptorů, je například měření aktivity fosfolipasy C. Při tomto stanovení se deteguje produkce radioisotopem značených inositolfosfátů hostitelskými buňkami exprimujícími chemokinový receptor za přítomnosti agonisty. Detekce aktivity fosfolipasy může vyžadovat kotransfekci s DNA kódující exogenní G protein. Je-li požadována kotransfekce, může se toto stanovení provádět tak, že se kotransf ekci podrobí chimérická DNA G proteinu, například Gqi5 (Conklin et al., Nátuře 363: 274 až 276 (1993)) s DNA 88-2B nebo 88C a deteguje se produkce fosfoinositolu, když se kotransfekovaná buňka exponuje agonistovi receptorů 88-2B nebo 88C. Odborníkům v tomto oboru je zřejmé, že stanovení zaměřená na G proteinové efektorové molekuly jsou také užitečná pro identifikaci a monitorování purifikace modulátorů aktivity receptorů. Aktivátory a inhibitory receptorů budou při těchto stanoveních podle své povahy aktivovat nebo inhibovat interakci receptorů se svými ligandy.

Chemokiny jsou spojovány s mnoha zánětlivými chorobami, jako je psoriasis, arthritis, plicní fibrosa a atherosklerosa (viz Baggiolini et al., výše uvedená citace). Inhibitory působení chemokinů mohu být užitečné při léčení těchto chorob. Jako jeden příklad lze uvést, že Broaddus et al. (J. of Immunol. 152: 2960 - 2967 (1994)) popisují protilátku proti IL-8, která je schopna inhibovat mobilisaci neutrofilů při pleuritidě indukované endotoxinem, což je model akutního zánětu plic králíka. Také se předpokládá, že ligand nebo modulátor vazby k receptorů 88C nebo aktivace tohoto receptorů by mohly být užitečné při léčení infekce HIV a chorobných stavů majících vztah k HIV. Modu9 9 ···· • 9 99 • 9« 99 9 9 9 · 9 *99*9 · * 9 99 9· * 99 9*9 * 99 ··· 9 9 · · 9 99,9 9 * 9* látory chemokinové vazby ke specifickým receptorům podle tohoto vynálezu mohou zahrnovat protilátky zaměřené na chemokiny nebo receptor, biologické nebo chemické malé molekuly nebo syntetické peptidy odpovídající fragmentům tohoto chemokinu nebo receptoru.

Vynález se také vztahuje k podávání prostředků obsahujících modulátory 88-2B nebo 88C savčím subjektům za účelem monitorování nebo léčení normálních nebo patologických imunitních reakcí a virových infekcí včetně infekcí retroviry, jako je HIV-1, HIV-2 a SIV. V tomto ohledu je vynález zejména zaměřen na zmírňování zánětlivých odpovědí, abnormálních hematopoietických procesů a virových infekcí. Přitom se modulátory chemokinových receptorů 88-2B nebo 88C podávají ve farmaceuticky vhodných množstvích. Do rozsahu vynálezu spadají dále také farmaceuticky vhodné prostředky sloužící pro dodávání těchto účinných látek léčeným subjektům. Kromě účinných látek mohou takové prostředky obsahovat nosiče, ředidla a jiná léčiva. Účinné látky a prostředky je možno podávat různými cestami: intravenosně, subkutánně, intraperitoneálně, intramuskulárně, orálně, análně (tj. prostřednictvím čípků) nebo pulmonárně (tj. prostřednictvím inhalátorů, rozprašovačů, rozmlžovačů atd.).

Informace o sekvenci DNA podle vynálezu umožňuje podle jiného aspektu vyvinout hlodavce, kteří neexprimují funkční chemokinový receptor 88C nebo S8-2B nebo kteří exprimují variantu tohoto receptoru. Při tomto vývoji je možno použít techniky homologní rekombinace nebo strategií knockout (viz například Kapecchi, Science, 244: 1288 až 1292 (1989)). Alternativně lze za použití dobře známých laboratorních technik (Manipulating the Mouše Embryo:

A Laboratory Manual, Brigid Hohan, Frank Costantini a Elizabeth Lacy, eds. (1986) Cold Spring Harbor Laboratory (ISBN 0-87969-175-1) vyvinout transgenní myši exprimující ·· ···· • · ·· ·» • · · • · ··· • · · · • · · · ·· 9· • · · · • · ·« ··· · · • · · klonovaný receptor 88-2B nebo 88C. Takoví hlodavci jsou užiteční jako modely pro studium aktivit receptorů 88C nebo 88-2B in vivo.

Jiné aspekty a výhody vynálezu budou odborníkům v tomto oboru zřejmé na základě dále uvedených příkladů provedení. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezují.

Příklady provedení vynálezu

V příkladu 1 je popsána izolace genomových DNA kódujících chemokinové receptory 88-2B a 88C. V příkladu 2 je popsána izolace a sekvencování cDNA kódujících chemokinový receptor 88-2B a 88C člověka a 88C opice makak (rod macaca). V příkladu 3 jsou popsány analýzy Northern, které ukazují profily exprese receptorů 88-2B a 88C v různých tkáních. V příkladu 4 jsou uvedeny podrobnosti vztahující se k rekombinantní expresi receptorů 88-2B a 88C. V příkladu jsou popsána stanovení s tokem vápenatých iontů, stanovení s hydrolýzou fosfoinositolu a vazebná stanovení ukazující aktivitu receptorů 88-2B a 88C v odpovědi na různé potenciální ligandy. Experimenty popisující úlohu receptorů 88-2B a 88C jako ko-receptorů pro HIV jsou uvedeny v příkladech a 7. Příprava a charakterizace monoklonálních a polyklonálních protilátek, jež jsou imunoreaktivní s receptorem 88C, jsou popsány v příkladu 8. V příkladu 9 jsou popsána dalš£ stanovení určená pro identifikaci ligandů nebo modulátorů 88-2B nebo 88C.

Příklad 1

Parciální génomové klony kódující nové geny chemokinových receptorů podle vynálezu byly izolovány pomocí reakce PCR založené na konzervovaných sekvencích vyskytují• 9

9' 9999

9

cích se v dříve identifikovaných genech s přihlédnutím ke skutečnosti, že se geny těchto chemokinových receptorů v lidském genomu shlukují. Genomová DNA byla amplifikována standardními metodami PCR za použití degenerovaných oligonukleotidových primerů.

Jako templátů pro PCR amplifikace bylo použito členů pocházejících z obchodně dostupného zdroje rekombinantní genomové DNA člověka klonované do kvasinkových umělých chromozomů (YAC) (Research Genetics, lne., Huntsville, AL, YAC Library Pools, katalogové číslo 95011 B). Do vektoru YAC je možno umístit inserty o velikosti 500 až 1000 kb párů. Nejprve byly podrobeny screeningu skupiny DNA YAC klonu. Při screeningu bylo použito PCR s primery specif ickými pro gen kódu j í cí CCCKR1, Primer antikóduj ícího řetězce, CCCKR(2)-5’ (který odpovídá antikódujícímu řetězci CCCKR1) je znázorněn v SEQ ID NO:15. Primer CCCKR(2)-5' se Skládá ze sekvence 5’- CGTAAGCTTAGAGAAGCCGGG ATGGGAA-3', kde podtržené nukleotidy představují translační start kodon pro CCCKR1.

Primerem kódujícího řetězce je CCCKR-3' (odpovídající kódujícímu řetězci CCCKR1) a jeho sekvence je uvedena V SEQ ID NO:16. Sekvence CCCKR-3', 5'-GCCTCTAGAGTCAGAGAC

CAGCAGA-3', obsahuje reversní komplement translačního stop kodonů CCCKR1 (podtrženo). Skupiny DNA YAC klonu poskytující detegovatelné PCR produkty (tj. DNA pásy při elektroforéze na gelu) identifikuj i vhodné podskupiny YAC klonů na základě identifikačního schématu Proprietary Identification Schéma (Research Genetics, lne., Huntsville, AL, USA). PCR reakce se zahájí inkubací při 94^eC po dobu 4 minut. Amplifikace sekvencí se provádějí za použití 33 cyklů denaturace při 94°C po dobu jedné minuty, teplotní hybridizace při 55°C po dobu jedné minuty a prodlužování při 72°C po dobu dvou minut.

9 • · • ·

- 18 Podskupiny DNA YAC klonu byly potom podrobeny druhému kolu PCR reakcí prováděných za stejných podmínek a za použití stejných primerů, jakých bylo použito v prvním kole reakcí PCR. Výsledky screeningu těchto podskupin poskytly možnost identifikovat jednotlivé klony schopné podporovat PCR reakce s CCCKR - specifickými primery. Jeden klon, označený šifrou 881F10, obsahoval 640 kb lidské genomové DNA z chromozomu 3p21, včetně genů pro CCCKR1 a CCCKR2, jak bylo zjištěno PCR a hybridizací. Překrývající YAC klon, 941A7, obsahoval 700 kb lidské genomové DNA a také obsahoval geny pro CCCKR1 a CCCKR2. V důsledku toho byly provedeny další mapovací studie za použití těchto dvou YAC klonů. Pomocí analýz Southern se zjistilo, že geny pro CCCKR1 a CCCKR2 byly umístěny přibližně ve lOOkb vzájemné oblasti.

Těsná blízkost genů CCCKR1 a CCCKR2 ukázala, že by k CCCKR1 a CCCKR2 mohly být připojeny nové příbuzné geny. Za použití DNA z kvasinky obsahující YAC klony 881F10 a 941A7, jako templáty, byly provedeny PCR reakce pro amplifikaci jakýchkoliv připojených receptorových genů. Jako PCR primery byly zkonstruovány degenerované oligodeoxyribonukleotidy. Tyto oligonukleotidy odpovídají oblastem kódujícím druhou intracelulární smyčku a šestou transmembránovou doménu CC chemokinových receptorů, jak lze dedukovat z porovnání do zákrytu umístěných sekvencí CCCKR1, CCCKR2 a V28. V28 bylo použito, poněvadž se jedná o osiřelý receptor vykazující . vlastnosti chemokinového receptoru. V28 byl také zamapován do lidského chromozomu 3 (Raport et al., Gene 163: 295 až 299 (1995)). Zajímavé je také, že dvě varianty sestřihu CCCKR2, CCCKR2A a CCCKR2B, jsou identické v druhé intracelulární smyčce a oblasti šesté transmembránové domény, kterých se používá pro analýzu. 5'-primer označený šifrou V28degf2 obsahuje vnitřní místo BamHI (viz dále); jeho sekvence je uvedena v SEQ ID NO:5. Sekvence primeru

V28degf2 odpovídá DNA kódující oblast druhé intracelulární smyčky kanonické receptorové struktury (viz Probst et al., výše uvedená citace). 3'primer, označený názvem V28degr2, obsahuje vnitřní místo HindlII (viz dále); jeho sekvence je uvedena v SEQ ID NO:6. Sekvence primeru V28degr2 odpovídá DNA kódující šestou transmembránovou doménu kanonické receptorové struktury.

Amplifikovaná PCR DNA byla potom následně štěpena BamHI a HindlII pro vytvoření fragmentů o přibližné délce 390 bp, což je velikost, která je konzistentní s velikostí fragmentu předvídanou na základě prohlídky kanonické sekvence. Po štěpení endonukleasou byly PCR fragmenty klonovány do plasmidu pBluescript (Strategene lne., LaJolla, CA, USA). Celkem 54 klonovaných fragmentů se podrobilo automatizované analýze nukleotidové sekvence. Kromě sekvencí genů CCCKR1 a CCCKR2 byly identifikovány sekvence dvou nových genů chemokinových receptorů podle tohoto vynálezu. Tyto dva nové geny chemokinových receptorů byly označeny 88-2B a 88C.

Pro zamapování relativních poloh genů kódujících receptory 88C, 88-2B, CCCKR1 a CCCKR2 bylo použito mapování pomocí restrikční endonuklasy a hybridizace. Tyto čtyři geny jsou spolu těsně spojeny, poněvadž gen pro 88C je umístěn přibližně 18 kbp od genu CCCKR2 na lidském chromozomu 3p21.

P ř. i k 1 a d 2 cDNA 88-2B a 88C o plné délce byly izolovány z cDNA makrofágové knihovny postupem, který lze v krátkosti popsat takto: Nejprve se z mRNA lidského makrofágu zkonstruuje v pRc/CMV (Invitrogen Corp., San Diego, Ca, USA) cDNA knihovna popsaná v publikaci Tjoelker et. al., Nátuře 374: 549 až 553 (1995). Vzniklá cDNA knihovna se podrobí

·· · · . · · screeningu na přítomnost cDNA klonu 88-2B a 88C pomocí PCR za použití jedinečných dvojic primerů odpovídajících 88-2B nebo 88C. PCR reakce se zahájí denaturací při 94C po dobu 4 minut. Amplifikace polynukleotidů se provádějí za použití 33 cyklů PCR za následujících podmínek: denaturace při 94°C po dobu jedné minuty, teplotní hybridizace při 55°C po dobu jedné minuty a prodlužování při 72°C po dobu dvou minut.

Jako prvního primerů, který je specifický pro gen kódující 88-2B, se použije primerů 88-2B-fl, který je charakterizován v SEQ ID NO:11. Tento primer odpovídá antikódujícímu řetězci sekvence SEQ ID NO:3 v nukleotidových pozicích 844 až 863. Jako-druhého primerů, který je specifický pro gen kódující 88-2B, se použije primerů 88-2B-rl, který je charakterizován v SEQ ID NO:12. Tento primer odpovídá kódujícímu řetězci sekvence SEQ ID NO:3 v nukleotidových pozicích 1023 až 1042. Podobně se jako prvního primerů, který je specifický pro gen kódující 88C, použije primerů 88C-fl, který je charakterizován v SEQ ID NO:13. Tento primer odpovídá antikódujícímu řetězci sekvence SEQ ID NO:1 v nukleotidových pozicích 453 až 471. Jako druhého primerů, který je specifický pro gen kódující 88C, se použije primerů 88C-r3, který je charakterizován v SEQ ID NO:14. Tento primer odpovídá kódujícímu řetězci sekvence SEQ ID NO:1 v nukleotidových pozicích 744 až 763.

Při screeningu byl identifikován klon 777, což je cDNA klon 88-2B. Klon 777 obsahoval DNA insert o délce 1915 bp obsahující úplnou délku kódující sekvence 88-2B, což bylo zjištěno na základě následujících kritérií: klon obsahoval dlouhý otevřený čtecí rámec začínající ATG kodonem, zahrnoval Kozákovu sekvenci a uvnitř otevřeného čtecího rámce byl proti směru exprese umístěn stop kodon. Sekvence DNA insertu klonu 777 je uvedena v SEQ ID NO:3 a jeho dedukovaná aminokyselinová sekvence je uvedena v SEQ

ID NO:4. Transkript 88-2B byl v makrofágové cDNA knihovně poměrně řídký. Z celkového odhadnutého počtu klonů 3x10^ byly během screeningu této knihovny identifikovány pouze tři klony 88-2B.

Při screeningu cDNA klonů kódujících chemokinový receptor 88C byly identifikovány klony 101 a 134, které zřejmě obsahovaly úplnou kódující oblast 88C, včetně předpokládaného iniciačního kodonu. Tyto klony však neobsahovaly přídavnou 5' sekvenci, která je nutná pro potvrzení totožnosti iniciačního kodonu. Transkript 88C byl v makrofágové cDNA knihovně poměrně hojně zastoupen. Při screeningu této knihovny bylo odhadem zjištěno, žese tento transkript vyskytuje jednou za každých 3000 transkriptú (z celkového počtu přibližně 3xlO⁶ klonů v knihovně).

RACE PCR (Rapid Amplification of cDNA Ends) bylo použito pro prodloužení existujících sekvencí klonu 88C za účelem umožnění přesné charakterizace 5' konce cDNA 88C. Lidská slezinná cDNA připravená pro 5’-RACE byla zakoupena od firmy Clontech Laboratories lne., Palo Alto, CA, USA a bylo jí použito podle doporučení výrobce. cDNA byla připravena pro 5'-RACE ligací kotevní sekvence k 5' koncům cDNA fragmentů. Kotevní sekvence je komplementární ke kotevnímu primerů od firmy Clontech Laboratories lne., Palo Alto, CA, USA. Polynukleotidový duplex kotevní sekvence - kotevní primer obsahuje místo EcoRI. Jako templátová DNA byla zvol ena. cDNA z lidské s 1 e z iny, poněvadžloty Northern __ ukázaly, že 88C je exprimován v této tkání. PCR reakce se zahájí denaturací při 94 C po dobu 4 minut. Amplifikace sekvencí se provádějí za použití 35 cyklů denaturace při 94°C po dobu jedné minuty, teplotní hybridizace při 60 °C po dobu 45 sekund a prodlužování při 72°C po dobu dvou minut. První kolo PCR bylo provedeno za použití reakční směsi obsahující vždy 2 μΐ slezinové cDNA připravené pro 5'-RACE, • · • · · · · · μΐ kotevního primeru a 1 μΐ primeru 88c-r4 (lOOng/μΙ) v celkovém reakčním objemu 50 μΐ. 88C-specifický primer, primer 88c-r4 (5'-GATAAGCCTCACAGCCCTGTG-3') je charakterizován v SEQ ID NO:7. Sekvence primeru 88c-r4 odpovídá kódujícímu řetězci sekvence SEQ ID N0:l v nukleotidových pozicích 745 až 765. Druhé kolo PCR bylo provedeno za použití reakční směsi obsahující 1 μΐ první PCR reakční směsi, 1 μΐ kotevního primeru a 1 μΐ primeru 88C-rlb (lOOng/μΙ) obsahujícího sekvenci '-GCTAAGCTTGATGACTATCTTTAATGTC-3 ' , která je charakterizována v SEQ ID NO:8. Sekvence primeru 88C-rlb obsahuje vnitřní klonovací místo HindlII (podtrženo). Sekvence 3' místa HindlII odpovídá kódujícímu řetězci SEQ ID NO:1 v nukleotidových pozicích 636 až 654. Výsledný PCR produkt byl štěpen EcoRI a HindlII a frakcionován na 1% agarosovém gelu. Přibližně 700bp fragment byl izolován a klonován do pBluescript. Klony s největšími inserty byly sekvenovány. Alternativně byl intaktní PCR produkt ligován do vektoru pCR za použití obchodně dostupného klonovacího kitu TA (Invitrogen Corp., San Diego, CA, USA) pro následující stanovení nukleotidové sekvence.

cDNA 88-2B a 88C byly sekvencovány za použití kitu PRISM^R) Ready Reaction DyeDeoxy(^R) Terminátor Cycle Sequencing Kit (Perkin Elmer Corp., Foster City, CA, USA) a zařízení Applied Biosystems 373A DNA Sequencer. Insert klonu 777 poskytl dvouřetězcový templát pro sekvenační reakce použité pro stanovení cDNA 88-2C. Byla stanovena sekvence celého insertu klonu 777 a tato sekvence je uvedena jako sekvence 88-2B cDNA. Dedukovaná aminokyselinová sekvence je potom charakterizována v SEQ ID NO:3. Tato sekvence má délku 1915 bp, včetně 361 bp 5'-nepřeložené DNA (odpovídající SEQ ID NO:3 v nukleotidových pozicích 1 až 361), kódující oblasti 1065 bp (odpovídající SEQ ID N0:3 v nukleotidových pozicích 362 až 1426) a 489 bp 3'-nepře• ·

- 23 ložené DNA (odpovídající SEQ ID NO:3 v nukleotidových pozicích 1427 až 1915). 88-2B genomová DNA, která je popsána v příkladu 1 výše, odpovídá SEQ ID NO:3 v nukleotidových pozicích 746 až 1128. 88C cDNA sekvence a dedukovaná aminokyselinová sekvence je charakterizována v SEQ ID NO:1. 88C cDNA sekvence představuje kompozit sekvencí získaných z RACE-PCR cDNA, klonu 134 a klonu 101. RACE-PCR cDNA bylo použito jako sekvenačního templátu pro stanovení nukleotidů 1 až 654 v SEQ ID N0:l, včetně jedinečné identifikace 9 bp 5'-nepřeložené cDNA sekvence v SEQ ID NO:1, nukleotidové polohy 1 až 9. Sekvence získaná pomocí RACE-PCR cDNA potvrdila polohu prvního methioninového kodonu v nukleotidových polohách 55 až 57 v SEQ ID N0:l a potvrdila závěr, že klon 134 a klon 101 obsahuje kopie kódující oblasti 88C o úplné délce. Klon 134 obsahoval 45 bp 5'-nepřeložené cDNA (odpovídajících SEQ ID N0:l v nukleotidových pozicích 10 až 54) 1056 bp 88C kódující oblasti (odpovídajících SEQ ID NO:1 v nukleotidových pozicích 55 až 1110) a 492 bp

3'-nepřeložené cDNA (odpovídajících SEQ ID NO:1 v nukleotidových pozicích 1111 až 1602).

Klon 101 obsahoval 25 bp 5'-nepřeložené cDNA (odpovídajících SEQ ID NO:1 v nukleotidových pozicích 30 až 54) 1056 bp 88C kódující oblasti (odpovídajících SEQ ID NO:1 v nukleotidových pozicích 55 až 1110) a 2273 bp 3'-nepřeložené cDNA (odpovídajících SEQ ID NO:1 v nukleotidových pozicích 1111 až 3383). 88C genomová DNA popsaná v příkladu 1 odpovídá SEQ ID NO:I v nukleotidových pozících 424 až 809.

Dedukované aminokyselinové sekvence 88-2B a 88C vykazují profily hydrofobicity, které jsou charakteristické pro GPCR a obsahuj í sedm hydrofobních domén odpovídaj ících transmembránovým doménám GPCR. Porovnání sekvence s jinými GPCR rovněž ukázalo stupeň identity. Významné je, že dědu• · · ·

kované sekvence aminokyselin jak 88-2B, tak 88C vykazují nejvyšší identitu se sekvencemi chemokinových receptorů. Výsledky porovnání aminokyselinových sekvencí jsou uvedeny v tabulce 1.

Tabulka 1

Receptory chemokinu	88-2B	88C
IL-8RA	30 %	30 %
I1-8RB	31 %	30 %
CCCKR1	62 %	54 %
CCCKR2A	46 %	66 %
CCCKR2B	50 %	72 %
88-2B	100 %	50 %
88—C	50 %	100 %

Tabulka 1 ukazuje, že 88-2B se nejvíce podobá CCCKR1 (62% identita na úrovni aminokyselin) a 88C se nejvíce podobá CCCKR2 (72% identita na úrovni aminokyselin).

Dedukovaná aminokyselinová sekvence 88-2B a 88C také vykazuje intracelulární a extracelulární doménu charakteristickou pro GPCR. Extracelulární domény 88-2B odpovídají aminokyselinovým sekvencím uvedeným v SEQ ID NO:3 a SEQ ID NO:4 v aminokyselinových zbytcích 1 až 36, 93 až 107. 171 až 196 a. 263 až 284. Extracelulární domény 88-2B _ jsou kódovány polynukleotidovými sekvencemi odpovídajícími SEQ ID NO:3 v nukleotidových pozicích 362 až 469, 638 až 682, 872 až 949 a 1148 až 1213. Extracelulární domény 88C zahrnují aminokyselinové zbytky 1 až 32, 89 až 112, 166 až 191 a 259 až 280 ze SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:2. Extracelulární domény 88C jsou kódovány polynukleotidovými sekvencemi odpovídajícími SEQ ID NO:1 v nukleotidových pozicích 55 • · •♦ 999 9

9 9 9 9 9 9 9

- 25 - ........

až 150, 319 až 390, 550 až 627 a 829 až 894. Intracelulámí domény 88-2B zahrnují aminokyseliny 60 až 71, 131 až 151,

219 až 240 a 306 až 355 ze SEQ ID NO:3 a SEQ ID NO:4. Tyto domény jsou kódovány polynukleotidovými sekvencemi, které odpovídají SEQ ID NO:3 v nukleotidových pozicích 539 až 574, 752 až 814, 1016 až 1081 a 1277 až 1426. Intracelulámí domény 88C zahrnují aminokyselinové zbytky 56 až 67, 125 až 145, 213 až 235 a 301 až 352 ze SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:2. Intracelulámí domény 88C jsou kódovány polynukleotidovými sekvencemi odpovídajícími sekvenci SEQ ID N0:l v nukleotidových pozicích 220 až 255, 427 až 489, 691 až 759 a 955 až 1110.

Kromě toho byla také pomocí PCR amplifikována 88C DNA makaka (rod macaca) za použití primérů odpovídajících 5' a 3' lemujícím oblastem lidské 88C cDNA. 5'primer odpovídal oblasti bezprostředně předcházející (proti směru exprese) a obsahující iniciační Met kodon. 3'primer byl komplementární vzhledem k oblasti bezprostředně následující (ve směru exprese) za terminačním kodonem. Primery obsahovaly restrikční místa pro klonování do expresních vektorů. 5'primer měl následující sekvenci GACAAGCTTCACAGGGTGGAACAAGATG (přičemž místo HindlII je podtrženo) (SEQ ID N0:17) a 3'primer měl sekvenci GTCTCTAGACCACTTGAGTCCGTGTCA (přičemž místo Xbal je podtrženo) (SEQ ID NO:18). Použité podmínky PCR amplifikace zahrnovaly 8 minut při 94’C a potom 40 cyklů s 94°C (po dobu 1 minuty), 55°C (po dobu 45 sekund) a 72°C (po dobu jedné minuty)_____Amplif ikované produkty byly klonovány do míst

HindlII a Xbal pcDNA3 a získaný klon byl sekvencován. Úplná délka cDNA makaka a dedukované aminokyselinové sekvence jsou charakterizovány v SEQ ID NO: 19 a SEQ ID NO: 20. Nukleotidová sekvence 88C makaka je z 98 % identická s lidskou 88C sekvencí. Dedukovaná aminokyselinová sekvence je identická z 97 %.

Příklad 3 mRNA expresní profily 88-2B a 88C byly stanoveny analýzami Northern blot. . .

Bloty Northern obsahující imobilizovanou póly A⁺RNA z různých lidských tkání byly zakoupeny od firmy Clontech Laboratories, lne., Palo Alto, CA, USA. Zkoušení byly podrobeny zejména tkáně srdce, mozku, placenty, plic, jater, kosterního svalstva, ledvin, slinivky břišní, sleziny brzlíku, prostaty, varlat, vaječníků, tenkého střeva, tlustého střeva a leukocyty periferní krve.

Z cDNA klonu 478 se vytvoří próba specifická pro nukleotidové sekvence 88-2B. cDNA insert v klonu 478 obsahuje sekvenci odpovídající SEQ ID NO:3 v nukleotidových pozicích 641 až 1915. Pro vytvoření próby se klon 478 štěpí a DNA fragment insertu se po elektroforéze na gelu izoluje. Izolovaný fragment insertu se potom označí radioisotopem za použití ³²P-značených nukleotidů pomocí techniky známé v tomto oboru.

Z cDNA klonu 493 se vytvoří próba specifická pro nukleotidové sekvence 88C. cDNA insert v klonu 493 obsahuje sekvenci odpovídající SEQ ID NO:3 v nukleotidových pozicích 421 až 1359. Pro vytvoření próby se v tomto případě použije konvenčních technik za použití ³²P-značených nukleotidů.

Bloty Northern zkoušené pomocí prób 88-2B jeví

1,8 kb mRNA v leukocytech periferní krve. Bloty Northern 88C jeví přibližně 4 kb mRNA v několika lidských tkáních. Silný signál je zřejmý při zkoušení tkáně sleziny nebo brzlíku a méně intenzivní Signály se získají při analýze mRNA z leukocytů periferní krve a tkáně tenkého střeva. Relativně slabý signál pro 88C byl detegován v tkáni plic a vaječníků.

- 27 ► '·· • 9 9 9 9 9 9 9 «

Analýzou Northern Blot byla též zjišťována exprese 88C v lidských T-buňkách a hematopoietických buněčných liniích. Hladina 88C v T-buňkách CD4⁺ a CD8⁺ byla velmi vysoká. Transkript byl přítomen v relativně vysoké koncentraci v myeloidních buněčných liniích THP1 a HL-60 a také byl zjištěn v buněčné linii B Jijoye. Kromě toho byla tato cDNA poměrně hojným transkriptem v lidské makrofágové cDNA knihovně (na základě PCR amplifikace subfrakcí z knihovny).

Příklad 4 cDNA 88-2B a 88C byly exprimovány rekombinantními metodami v savčích buňkách.

Pro experimenty s transientní transfekci; byl 88C subklonován do expresního vektoru savčí buňky pBJl (Ishi, K. et al., J. Biol. Chem. 270: 16435 až 16440 (1995)). Konstrukt zahrnoval sekvence kódující prolaktinovou signální sekvenci pro účinnou expresi na povrchu buňky a epitop FLAG u aminového konce 88C pro umožnění detekce exprimovaného proteinu. Epitop FLAG se skládá ze sekvence DYKDDDD. Buňky COS-7 byly transientně transfekovány expresním plasmidem 88C za použití Lipofectamine (Life Technology, lne., Grand Island, NY, USA) podle instrukcí výrobce. Použitý postup lze v krátkosti popsat takto: Buňkami se zaočkují 24-jamkové misky při hustotě 4xl0⁴ buněk na jamku a kultury se nechají růst přes noc. Potom se buňky promyjí PBS a do každé jamky se přidá 0,3 mcr DNA ve gměsi s 1,5 μΐ lipofectamine v 0,25 ml Opti-MEM. Po 5 hodinách při 37°C sé médium nahradí médiem obsahujícím 10 % felálního telecího séra. Kvantitativním stanovením ELISA bylo potvrzeno, že 88C byl exprimován na povrchu transientně transfekovaných buněk COS-7.

Při stanovení ELISA bylo použito protilátky Ml, která je specifická pro epitop FLAG (Eastman Co., New Haven, CT,

USA).

·· ·· • ··· · ·· ··

Receptor 88C značený sekvencí FLAG byl také stabilně transfekován do buněk HEK-293, což je buněčná linie lidských embryonálních ledvin, za použití transfekčního činidla DOTAP [N-[l-[(2,3-dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylamoniummethylsulfát, Boehringer Mannheim, lne., Indianapolis, (IN, USA) podle doporučení výrobce. Stabilní linie byly podrobeny selekci na přítomnost léčiva G418. Transfekované buňky HEK-293 byly podrobeny zkoušení na expresi 88C na povrchu buněk pomocí testu ELISA za použití protilátky Ml vůči epitopů FLAG. Při tomto stanovení se zjistilo, že receptor 88C značený epitopem FLAG byl exprimován na buněčném povrchu stabilně transformovaných buněk HEK-293.

cDNA 88-2B a 88C bylo také použito pro získání stabilních transfektantů HEK-293. cDNA receptoru 88-2B byla klonována za cytomegalovirový promotor v pRc/CMV (Invitrogen Corp., San Diego, CA, USA) za použití strategie opírající se o PCR. Jako templátu pro PCR reakci bylo použito insertu cDNA do klonu 777. Pro PCR bylo použito primerů 88-2B-3 (obsahujícího vnitřní místo Xbal) a 88-2B-5 (obsahujícího vnitřní místo HindlII). Nukleotidová sekvence primerů 88-2B-3 je uvedena v SEQ ID NO:9 a nukleotidová sekvence primerů 88-2B-5 je uvedena v SEQ ID NO:10. Oblast 1104bp cDNA byla amplifikována. Po amplifikaci byla DNA štěpena Xbal a HindlII a klonována do podobně štěpeného pRc/CMV. Výsledný plasmid obsahující 18bp 5'-nepřeloženou sekvenci, celou kóduj ící₌ oblast 88-2B a 3bp_3'-nepřeloženě sekvence byl označen 777XP2. Před transfekci buněk HEK-293 nebyl insert cDNA o úplné délce v klonu 134 dále modifikován pro sekvenci 88C.

Pro vytvoření stabilně transformovaných buněčných linií byly rekombinantní klony pRc/CMV transfekovány do buněk HEK-293, což je buněčná linie lidských embryonálních

- 29 ·· ·· » · · » · ···' ledvin, za použití transfekčního činidla DOTAP [N-[l-[(2,3dioleoyloxy) propyl ] -N, N, N-trimethylamoniummethylsulfát, Boehringer - Mannheim, lne. , Indianapolis, (IN, USA) podle doporučení výrobce. Stabilní linie byly podrobeny selekci na přítomnost léčiva G418. Pro identifikaci stabilních linií exprimujících nejvyšší koncentraci 88-2B a 88C mRNA bylo použito standardních postupů screeningu (tj. analýz Northern Blot).

Příklad 5

A. Stanovení s tokem vápenatých iontů

Pro analýzu exprese polypeptidů bylo použito funkčního stanovení aktivity chemokinového receptoru. Společným znakem signalizace prostřednictvím známých chemokinových receptorů je, že transdukce signálu je spojena s uvolňováním intracelulárních vápenatých iontů. Proto byla měřena intracelulární koncentrace vápenatých iontů v transfekovaných buňkách HEK-293 za účelem zjištění, zda receptory 88-2B nebo 88C odpovídají na některý ze známých chemokinů.

Buňky HEK-293 stabilně transfekované 88-2B, 88C (bez sekvence epitopu FLAG) nebo kontrolní kódující oblastí (kódující IL8R nebo CCCKR2, viz dále), jak to bylo popsáno výše, byly nechány růst v baňkách T75 až do konfluence přibližně 90 % v MEM + 10% séra. Potom byly buňky promyty, sklizeny s versenem (0,6mMEDTA, lOmM hydrogenfosforečnan _ dvoj sodný, 0,14M chlorid sodný, 3mM chlorid draselný a lmM glukosa) a inkubovány v MEM + 10% séra + ΙμΜ Fura-2 AM (Molecular Probes, lne., Eugene, OR, USA) po dobu 30 minut při teplotě místnosti. FURA-2 AM je barvivo citlivé vůči vápenatým iontům. Buňky byly resuspendovány v Dulbeccově roztoku chloridu sodného pufrovaném fosforečnanem obsahujícím 0,9mM chlorid vápenatý a 0,5mM chlorid hořečnatý ·· ··*· (D-PBS) na koncentraci asi 10⁷ buněk/ml a změny fluorescence byly monitorovány za použití fluorescenčního spektrofotometru (Hitachi Model F-4010). Přibližně 10^ buněk bylo suspendováno v 1,8 ml D-PBS v kyvetě udržované při 37°C. Excitační vlnová délka byla alternována mezi 340 a 380 nm ve čtyřsekundových intervalech. Emisní vlnová délka byla 510 nm. .Zkoušené směsi byly dávkovány, do kyvety vstupem pro injekční jehlu; maximální tok vápenatých iontů byl naměřen po přídavku ionomycinu.

Pozitivní odpovědi byly pozorovány v buňkách exprimujících IL-8RA po stimulaci IL-8 a také, když byl CCCKR2 stimulován MCP-1 nebo MCP-3. Buňky HEK-293 exprimující 88-2B nebo 88C však nevykazovaly intracelulární tok vápenatých iontů po expozici kterémukoliv z následujících chemokinů: MCP-1, MCP-2, MCP-3, ΜΙΡ-Ια, MIP-Ιβ, IL8, NAP-2, gro/MGSA, IP-10, ENA-78 nebo PF-4 (Peprotech, lne., Rocky Hill, NJ, USA).

Za použití citlivějšího stanovení byla sledována odpovědi toku vápenatých iontů na RANTES mikroskopicky v buňkách obarvených barvivém FŮRA-2 AM exprimujících 88-2B. Při tomto stanovení bylo použito buněk a reakčních činidel připravených výše popsanými způsoby. RANTES /Regulated on Activation, Normál T Expressed nad Secreted) je CC chemokin, který byl identifikován jako chemoatraktant a aktivátor eosinofilů (viz Neote et. al., výše uvedená citace). Tento chemokin také zprostředkovává uvolňování histaminu v basofilech a bylo ukázáno, že působí jako chemoatraktant pro paměťové T buňky in vitro. Předpokládá se, že modulace aktivit receptoru 88-2B by mohla být užitečná při modulaci aktivace leukocytů.

Receptor 88C značený sekvencí FLAG byl exprimován v buňkách HEK-293 a zkoušen na interakce chemokinů pomocí ·· ···· «9 • 9 9 • 9 999

9 ·

9 ·

99

9 9 9

9 99

999 « - 9

9 9 stanovení toku vápenatých iontů. Exprese 88C na povrchu buněk byla potvrzena testem ELISA a analýzou FACScan za použití protilátky Mj. Všechny chemokiny ze souboru zahrnujícího RANTES, ΜΙΡ-Ια a MIP-Ιβ indukovaly tok vápenatých iontů v buňkách transfekovaných 88C, pokud byly tyto chemokiny přidány v koncentraci ΙΟΟηΜ.

Stanovení s tokem vápenatých iontů mohou být také uspořádána tak, aby bylo možno s jejich pomocí identifikovat modulátory vazby chemokinových receptorů. Výše popsaná fluorimetrická nebo mikroskopická stanovení se v tomto případě provádějí za přítomnosti zkoušených sloučenin. Pokud za přítomnosti zkoušené sloučeniny tok vápenatých iontů vzroste, je sloučenina aktivátorem vazby chemokinu k receptoru. Naproti tomu snížený tok vápenatých iontů ukazuje, že zkoušená sloučenina je inhibitorem vazby chemokinu k receptoru.

B. Hydrolýza fosfoinositolu

Další zkoušení ligandů nebo modulátorů zahrnuje sledování aktivity fosfolipasy C, které je popsáno v publikaci Hung et al., J. Biol. Chem. 116: 827 až 832 (1992).

V krátkosti lze tuto zkoušku popsat takto: Nejprve se hostitelské buňky exprimující chemokinový receptor 24 hodin plní ³H-inositolem. Potom se k buňkám přidají zkoušeně sloučeniny (tj. potenciální ligandy) a buňky se 15 minut inkubují při 37’C. Dále se buňky exponují 20mM kyselině mravenčí, aby se rozpustily a extrahovaly hydrolyzované metabolity metabolismu fosfoinositolu (tj. produkty hydrolýzy vyvolané působením fosfolipasy C). Extrakt se podrobí chromatografii na anexové pryskyřici za použití sloupce anexu AGlx8 ve formiátové formě. Inositolfosfáty se *5 eluují 2M mravenčanem amonným/Ο,ΙΜ kyselinou mravenčí a H ♦ · ·· • · · · · · ·· ·· asociovaný se sloučeninami se stanoví kapalinovou scihtilační spektrofotometr!i. Stanovení s fosfolipasou C je také možno využít pro identifikaci modulátorů aktivity chemokinového receptoru. Stanovení se v tomto případe provádí výše popsaným způsobem ale za přidání potenciálního modulátoru. Zvýšená hladina detegovatelné značky ukazuje, že modulátor je aktivátorem, zatímco snížená hladina ukazuje, že modulátor je inhibitorem aktivity chemokinového receptoru.

Stanovení s fosfolipasou C bylo provedeno za účelem identifikace chemokinových ligandů receptoru 88C s charakteristickou sekvencí FLAG. Přibližně 24 hodin po transfekcí se buňky COS-7 exprimující 88C během 20 až 24 hodin označí působením myo[2-³H]inositolu (lgCi/ml) v médiu neobsahujícím inositol s obsahem 10% dialyzovaného fetálního telecího séra. Označené buňky se promyji DMEM bez inositolu s obsahem chloridu lithného (lOmM) a 1 hodinu inkubují při 37°C s DMEM bez inositolu s obsahem chloridu lithného (lOmM) a jednoho z následujících chemokinů: RANTES, ΜΙΡ-1β, ΜΪΡ-1α, MCP-1, IL-8 nebo myšího MCP-1 homologu JE. Tvorba inositolfosfátu se stanovuje způsobem popsaným v předchozím odstavci. Po inkubaci s chemokiny se médium odsaje a buňky se podrobí lysi přidáním 0,75 ml ledově chladné 20mM kyseliny mravenčí (30 min). Frakce supernatantu se nanesou na sloupce AG1-X8 Davex (Biorad, Hercules, CA, USA) a ihned nato se na sloupec přidají 3 ml 50mM roztoku hydroxidu amonného. Po promytí 4 ml 40mM mravenčanu amonného následovala eluce 2M __mravenčanem amonným. Kvantifikace inositolfosfátů byla __;_____ provedena spočítáním β-rozpadů.

Poněvadž se ukázalo, že některé chemokinové receptory, jako jsou IL8RA a IL8RB, vyžadují kotransfekci s exogenním G proteinem, před tím, než je signalizace detegovatelné v buňkách COS-7, receptor 88C byl koexprimován s chimérickým G proteinem Gqi5 (Conklin et al. , Nátuře 363:

274 až 276 (1993)). Gqi5 je G protein, který obsahuje sestřih pěti karboxy-terminálních aminokyselin Gi (které se vážou k receptorů) na Gaq. Kotransfekcí s Gqi5 se významně zesílí signalizace CCCKR1 a CCKR2B. Kotransfekce s Gqi5 ukázala, že receptor 88C poskytoval dobrý signál v odpovědi na RAŇTES, MIP-Ιβ a ΜΙΡ-Ια, ale nikoliv v odpovědi na MCP-1, IL-8 nebo myší MCP-1 homolog JE. Z křivek závislosti odpovědi na dávce byly zjištěny následující hodnoty EC₅₀ RANTES-lnM; ΜΙΡ-1β-6ηΜ a MIP-la-22nM.

Receptor 88C je první klonovaný lidský receptor poskytující signalizační odpovědí na MIP-Ιβ. Ve srovnání s.jinými CC chemokiny vykazuje MIP-Ιβ jasný jedinečný profil buněčně aktivace. Zdá se, že aktivuje T buňky, ale nikoliv monocyty (Baggiolini et al., výše uvedená citace), což je konzistentní se stimulačními studiemi receptorů. Tak například MIP-Ιβ se sice váže k CCCKR1, ale neindukuje vápníkový tok, (Neote et al., výše uvedená citace). Naproti tomu ΜΙΡ-Ια a RANTES se vážou k CCCKR1 a CCCKR5 a vyvolávají jejich signalizaci (RANTES také vyvolává aktivaci CCCKR3). Zdá se tedy, že MIP-Ιβ je podstatně selektivnější než jiné chemokiny třídy chemokinů CC. Taková selektivita jé therapeuticky významná, poněvadž je možno stimulovat specifickou prospěšnou aktivitu (jako je potlačení infekce HIV) bez stimulace četných leukocytových populací mající za následek obecné prozánětlivé aktivity.

C. Vazebná stanovení

Jinou zkoušku interakce mezi receptorem a chemokiny představuje modifikace vazebného stanovení, která je popsána v publikaci Ernst et al., J. Immunol. 152: 3541 až 3549 (1994). MÍP-Ιβ byl označen Bolton-Hunterovým činidlem (dijodid, NEN, Wilmington, DE, USA) podle instrukcí výrobce.

Nekonjugovaný jodid byl oddělen od značeného proteinu elucí ze sloupce PD-10 (Pharmacia) ekvilibrovaného s PBS a BSA (10 g/1). Specifická aktivita byla obvykle 2200 Ci/mmol. Rovnovážná vazba byla provedena přidáním ¹²⁵I-značeného ligandu samotného nebo ve směsi se stonásobným nadbytkem neznačeného ligandu k 5xl0⁵ buněk HEK-293 transfekováných receptorem 88C s charakteristickou sekvencí epitopu FLAG v polypropylenových zkumavkách v celkovém objemu 300 μΐ (50mM HEPES, pH 7,4, lmM chlorid vápenatý a chlorid hořečnatý 0,5% BSA). Inkubace za třepání s frekvencí otáčení třepačky 150 min^-1 probíhala 90 minut při 27“C. Buňky byly shromážděny pomocí zařízení Skatron Cell Harvester (Skatron Instruments lne., Sterling, VA, USA) na filtrech ze skleněných vláken, které byly předem máčeny v 0,3% polyethyleniminu a 0,2% BSA. Po promytí byly filtry vyjmuty a navázaný ligand byl kvantifikován spočítáním gamma emisí. Kompetitivní vazba značeného ligandu s neznačeným ligandem byla stanovena inkubací 5xl0⁵ transfekovaných buněk (viz výše) s l,5nM radioisotopem značeným ligandem a uvedenými koncentracemi neznačeného ligandu. Vzorky byly shromážděny, promyty a spočítány výše uvedeným způsobem. Data byla analyzována za použití programu pro proložení křivky Prism (GraphPad lne., San Diego, CA, USA) a iteračního nelineárního regresního programu, LIGAND (PM220).

Při rovnovážných vazebných stanoveních vázal receptor 88C radioisotopem značený ΜΙΡ=1β specifickým a saturovatelným způsobem. Analýza těchto vazebných dat Scatchardovou metodou poskytla hodnotu disociační konstanty (Kd) l,6nM. Kompetitivní vazebná stanovení za použití značeného MIP-Ιβ ukázala, že existuje vysoká afinita pro vazbu MIP-Ιβ (IC₅₀ = 7,4nM), RANTES (IC₅₀ = 6,9nM) a ΜΙΡ-Ια (IC50 = 7,4nM), což je konzistentní se signalizačními daty získanými za použití transientně transfekovaných buněk COS—7, viz výše uvedený odstavec B).

49 • · ··

- 35 Příklad 6

Již bylo ukázáno, že chemokiny ΜΙΡ-Ια, ΜΙΡ-1β a RANTES inhibují replikaci HIV-1 a HIV-2 v jednojaderných buňkách periferní krve člověka a buňkách PMI (Cocchi et al., výše uvedená citace). S ohledem na toto zjištění a výsledky uvedené v příkladu 5 se podle vynálezu předpokládá, že aktivace receptoru 88C nebo vazba ligandu k tomuto receptoru může mít ochrannou úlohu při infekci HIV.

Nedávno bylo oznámeno, že osiřelý receptor kopulovaný s G proteinem, fusin, může působit jako ko-receptor pro vstup HIV. Fusin/CXCR4 v kombinaci s CD4, primárním receptorem HIV, zřejmě usnadňuje infekci HIV kultivovaných T buněk (Fenget al., Science 272: 872 až 877 (1996)). Vzhledem k homologii fusinu s chemokinovými receptory, vzhledem k profilu vazby receptoru 88C k chemokinům a také vzhledem k tomu, že receptor 88C je konstitutivně exprimován v T buňkách a hojně exprimován v makrofázích, je pravděpodobné, že se receptor 88C podílí na virových infekcích včetně infekce HIV.

Funkce 88C a 88-2B, jako ko-receptorů pro HIV, byla stanovena tak, že byly transfekovány buňky exprimující CD4 pomocí 88C nebo 88-2B a ko-transfekované buňky byly vystaveny provokaci HIV. Infikovány byly jen buňky exprimující jak CD4, tak funkční ko-receptor pro HIV. Infekci HIV je možno určit několika metodami. Obchodně dostupné jsou kity ELISA, pomocí kterých se zjištuje exprese HIV antigenů, například Coulter HIV-1 p²⁴ Antigen Assay (US patent č. 4 886 742), Coulter Corp., 11800 SW 147th Ave., Miami, FL 33196, USA. Alternativně mohou být vytvořeny zkušební buňky pro expresi reporterového genu, jako je LACZ připojený k LTR promotoru HIV (Kimpton et al., J. Virol.·, 66: 2232 až 2239 (1992)). Při této metodě se buňky infikované HIV detegují kolorimetrickým stanovením.

Receptor 88C byl transientně transfekován do kočičí buněčné linie CCC (Clapham et al., 181: 703 až 715 (1991)), která byla stabilně transformována pro expresi lidského CD4 (CCC-CD4). Tyto buňky jsou normálně resistentní k infekci jakýmkoliv kmenem HIV-1, poněvadž endogenně neexprimují receptor 88C. Při těchto experimentech byly buňky CCC/CD4 transientně transfekovány receptorem 88C klonovaným do expresního vektoru pcDNA3.1 (Invitrogen Corp., San Diego,

CA, USA) za použití lipofectaminu (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA). Dva dny po transfekci byly buňky vystaveny provokaci HIV. Po 4 dnech inkubace byly buňky fixovány a obarveny

- na p24 antigen, jako měřítko infekce HIV.

Schopnost exprimovat receptor 88C učinila tyto buňky susceptibilními pro infekci několika kmeny HIV-1. Tyto kmeny zahrnovaly čtyři primární isoláty HIV-1 neindukující syncytium (M23, E80, SL-2 a SF-162), které, jak se ukázalo, používají jako ko-receptor pouze 88C, ale nikoliv fusin. Několik primárních kmenů HIV-1 indukujících syncytium (2006, M13, 2028 a 2076) používalo bud 88C nebo fusinu, jako ko-receptoru. Také dva zavedené klonální viry HIV-1 (GUN-1 a 89.6) používaly jako ko-receptoru bud 88C nebo fusinu.

Bylo oznámeno, že některé kmeny HIV-2 mohou ________infikovat určité CD4 - negativní buněčné linie, což ukazuje na přímou interakci HIV-2 s jiným receptorem, než je CD4 (Clapham et al. , J. Virol. , 66: 3531 až 3537 (1992)).

U některých kmenů HIV-2 je tato infekce usnadněna přítomností rozpustného CD4 (sCD4). Jelikož 88-2B sdílí vysokou sekvenční podobnost s jinými chemokinovými receptory, které působí jako ko-receptory HIV (totiž s 88C a fusinem), zdá se pravděpodobné, že receptor 88-2B bude ko-receptorem HIV-2.

• « · · «· «· • · ♦» ·« • · ·· ' ♦ .· « · · · · · · « · 9 9 9 «

B · · · · ·

Úloha receptoru 88-2B, jako ko-receptoru HIV-2, byla demonstrována za použití kmene HIV-2 ROD/B. Kočičí buňky CCC, které endogenně neexprimují CD4, byly transfekovány 88-2B. Při těchto experimentech byly buňky transfekovány za použití pcDNA3.1 obsahujícího 88-2B pomocí lipofectaminu a infikovány po dalších 48 hodinách HIV-2. Tři dny po infekci byla u buněk pomocí imunobarvení zjišťována přítomnost obalových glykoproteinů HIV-2. Přítomnost sCD4 během provokace HIV-2_R0D/_B zvýšila infekci těchto buněk desetinásobně. Vstup HIV-2 do buněk transfekovaných 88-2B bylo možno blokovat přítomností 400 až 800 ng/ml eotaxinu, jednoho z ligandů 88-2B. Základní úroveň infekčnosti buněk CCC/88-2B (bez rozpustného CD4) byla stejná jako v případě CCC buněk, které nebyly transfekovány 88-2B.

Úloha receptorů 88-2B a 88C jako ko-receptorů HIV byla potvrzena tak, že byly připraveny buněčné linie stabilně transformované pro expresi 88C nebo 88-2B a tyto buněčné linie byly vystaveny provokaci různými kmeny HIV a SIV. Dosažené výsledky jsou uvedeny v příkladu 7.

Alternativně lze úlohu receptoru 88C a 88-2B jakožto ko-receptoru demonstrovat experimentálním postupem, který nevyžaduje použití živého viru. Při této metodě se buněčné linie koexprimující receptory 88C nebo 88-2B, CD4 a reporterový gen LACZ smísí s buněčnou linií ko-exprimující obalový glykoprotein (ENV) HIV a transkripční faktor _ konstruktu reporterového genu (Nussbaum et al., 1994, J.

Virol., 68: 5411). Buňky exprimující funkční ko-receptor HIV budou fúzovat s buňkami exprimujícími ENV a tím umožní expresi reporterového genu. Při této metodě ukazuje detekce produktu reporterového genu kolorimetrickým stanovením, že receptor 88C nebo 88-2B funguje jako ko-receptor pro HIV.

• · • · · · ·'· »·· * · · · · · · 9 ····' · · » · · · · ·-·· · 9 * « · · · · · 9 · • · · · · ·♦ · · · »

Mechanismus, jakým chemokiny inhibují virovou infekci, dosud nebyl objasněn. Jedním možným mechanismem je aktivace receptoru vazbou Chemokinu. Vazba chemokinu vede k transdukcím signálu v buňce, které činí buňku resistentní vůči virové infekci a/nebo zabraňuje replikaci viru v buňce. Podobně, jako je tomu u indukce interferonem, může dojít k diferenciaci buňky tak, že je buňka resistentní vůči virové infekci nebo že se ustaví antivirální stav. Alternativní druhý mechanismus zahrnuje přímou interferenci se vstupem viru do buněk blokováním přístupu obalových glykoproteinů viru ke ko-receptoru, které je způsobeno vazbou chemokinu. Pro potlačení infekce HIV působením chemokinu není podle tohoto mechanismu nutná signalizace G proteinu.

Pro rozlišení mezi těmito dvěma mechanismy, kterými mohou receptory 88C nebo 88-2B fungovat jako ko-receptory virové infekce a infekce HIV, se vazba chemokinu k receptoru oddělí od transdukce signálu a stanoví se účinek chemokinu na potlačení virové infekce.

Vazbu ligandu je možno oddělit od transdukce signálu přídavkem sloučenin inhibujících signalizaci zprostředkovanou G-proteinem. Tyto sloučeniny zahrnují například toxin černého kašle a cholerový toxin. Kromě toho lze také jinými sloučeninami, jako wortmanninem, inhibovat dále umístěné (po směru exprese) efektorové polypeptidy. Pokud by se signalizace ,G-proteinu podílela na potlačování virové infekce, přídavek takových látek by bránil potlačení virové infekce použitým chemokinem. Alternativně je možno pozměnit nebo vypustit klíčové zbytky receptorových domén receptoru 88C nebo 88-2B, kterých je zapotřebí po kopulaci G-proteinu, čímž dojde k pozměnění nebo likvidaci kopulace G-proteinu, aniž by byla ovlivněna vazba chemokinu.

• ·

Za těchto podmínek, pokud nejsou chemokiny schopny potlačit virovou infekci nebo infekci HIV, potom je signalizace prostřednictvím G-proteinu nutná pro potlačení virové infekce nebo infekce HIV. Pokud jsou však chemokiny schopny potlačit virovou infekci, potom signalizace prostřednictvím G-proteinu není pro chemokinové potlačení virové infekce nutná a ochranné účinky chemokinů mohou být důsledkem zablokování dostupnosti receptoru pro virus působením chemokinů.

Jiný přístup zahrnuje použití protilátek zaměřených proti receptoru 88C nebo 88-2B. Protilátky, které se vážou k 88C nebo 88-2B, u nichž lze demonstrovat, že nevyvolávají signalizaci prostřednictvím G-proteinu, mohou blokovat přístup k vazebnému místu receptoru pro chemokin nebo virus. Pokud za přítomnosti protilátek vůči receptoru 88C nebo 88-2B dojde k potlačení virové infekce, potom mechanismus protektivních účinků chemokinů spočívá v blokování přístupu viru k jeho receptoru. Feng et al. oznámili, že protilátky vůči aminovému konci fusinového receptoru potlačují infekci HIV (Feng et al., 1996).

Příklad 7

Buněčné linie byly stabilně transformovány receptorem 88C nebo 88-2B, aby bylo možno dále vymezit úlohu těchto receptorů při infekci HIV. V publikaci Kimpton a

Emerman, Detection of Replication-Competent and.Pseudo- ______ typed Human Immunodeficiency Virus with a Sensitive Cell Line on the Basis of Activation of an Integrated BetaGalactosidase Gene, J. Virol., 66(5): 3026-3031 (1992) byla nedávno popsána indikátorová buněčná linie, zde označovaná jako Hela-MAGI. Buňky Hela-MAGI jsou buňky Hela, které byly stabilně transformovány tak, aby exprimovaly CD4 a integrovaný HIV-l LTR pohánějící expresi v jádře umístěného genu ·· ·· ·· • · • · · · β-galaktosidasy. Integrace proviru HIV do buňky vede k produkci virového transaktivátoru, Tat, který potom obrací expresi β-galaktosidasového genu. Počet buněk, které se pozitivně barví pomocí X-gal na β-galaktosidasovou aktivitu in šitu, je přímo úměrný počtu infikovaných buněk.

Tyto buňky Hela-MAGI jsou schopny detegovat laboratorně adaptované izoláty HIV-1, ale pouze malou část primárních izolátů (viz Kimpton a Emerman, výše uvedená citace) a nejsou schopny detegovat většinu izolátů SIV (Chackerian et al., Characterization of a CD4-Expressing Macaque Cell Line that can Detect Virus After A Single Replication Cycle and can be infected by Diverse Simian Immunodeficiency Virus Isolates, Virology, 213(2):

6499-6505 (1995)). Kromě-toho Harington and Geballe (Co-Factor Requirement for Human Immunodeficienty Virus Type 1 Entry into a CD4-Expressing Human Cell Line, J.

Virol., 67: 5939-5947 (1993)) popsali buněčnou linii, založenou na buňkách U373, která byla vytvořena tak, aby exprimovala CD4 a stejný LTR^-galaktosidasový konstrukt.

Již bylo ukázáno, že tato buněčná linie, zde označována jako U373-MAGI, nemůže být infikována žádným kmenem HIV (M- nebo T-tropickým), ale susceptibilita k infekci jí může být dodána fusí s buňkami Hela (Harrington a Geballe, výše uvedená citace).

Pro konstrukci indikátorových buněčných linií, které,by byly schopny detegovat makrofágové viry (CM) nebo tropické viry Tbuněk (T-tropické), byla DNA kódující epitopem značený receptor 88C nebo 88-2B transfekována do buněk Hela-MAGI nebo U373-MAGI prostřednictvím infekce retrovirovým vektorem. Tak byly vytvořeny buněčné linie Hela-MAGI-88C a U373-MAGI-88C. Exprese těchto ko-receptorů na povrchu buněk byla demonstrována imunobarvením živých buněk za použití protilátky anti-FLAG Ml a RT-PCR.

·· ·· · ···· ·· ··

Geny 88C a 88-2B použité pro konstrukci Hela-MAGI88C a U373-MAGI-88C zahrnovaly sekvence kódující prolaktinový signální peptid následované epitopem FLAG (viz příklad 4). Tento gen byl vložen do retrovirálního vektoru pBabePuro (Morgenstern and Land, Nucleic Acids Research, 18(12): 3587-3596 (1990)). Vektory s vysokým titrem retroviru pseudotypované proteinem VSV-G byly zhotoveny transientní transfekci popsanou v publikaci Bartx et al., J. Virol.,

70: 2324 až 2331 (1996) a bylo jich použito pro infekci buněk Hela-MAGI a U373-MAGI. Buňky resistentní vůči 0,6 μg/ml puromycinu (Hela) nebo 1 μg/ml puromycinu (U373) byly spojeny. Každá skupina obsahovala přinejmenším 1000 nezávislých transdukčních příhod. Pro vytvoření buněk Hela-MAGI-88C bylo použito časné pasáže (pasáže 2) zásobního vzorku původních buněk Hela-MAGI (viz Kimpton a Emerman, výše uvedená citace).

Infekce indikátorových buněčných linií za použití HIV byla provedena ve 12-jamkových miskách za použití desetinásobného sériového ředění 300 μΐ viru za přítomnosti DEAE-Dextran (30 μg/ml) způsobem popsaným ve výše uvedené citaci Kimpton a Emerman.

Všechny kmeny HIV-1 a ^SIVmaC239 hyly získány od NIH AIDS Reference and Reagent Program. Molekulární klony primárního HIV-2_7312A (^{Gao e}^· ^al·/ Genetic Diversity of Human Immunodeficiency Virus Type 2: Evidence for Distinct Sequence Subtypes with Differences. in Virus- Biology, J. Virol., 68(11): 7433-7447 (1992)) a SIVsmPbjl.9 (Dewhurst et al., Sequence Analysis and Acute Pathogenicity of Molecularly Cloned SIV_smm-PBjl4, Nátuře, 345: 636-640 (1990)) byly získány od B. Hahna (UAB). Všechny další SIV_mne izoláty byly získány od Julie Overbaughové (Universita státu Washington, Seáttle, USA). Zásobní vzorky klonovaných provirů byly získány transientní transfekci buněk 293. Jiné • · • · 9 9 99 9999 • · · 9 · 9 · · · 9 • 9 ··· 9 · · 9 9 9 9 ·· 9 9 9 9 9 9 999 9 · • · 9 9 · * » · ···

- 42 - .. .» .. ......

virové zásobní vzorky byly získány pasážováním viru v jednojaderných buňkách periferní lidské krve nebo v buňkách CEMX174 (v případě zásobních vzorků SIV). Zásobní vzorky viru byly normalizovány za použití ELISA nebo p24^^a9 (Coulter Immunology) nebo p27^^a^ (Coulter Immunology) pro HIV-1 a HIV-2/SIV, s použitím standardů poskytovaných výrobcem.

Buňky U373-MAGI-88C a U373-MAGI (kontrolní) byly infikovány T-tropickým kmenem HIV-1 (Ηΐν_βΑΙ), ^{a M-tr}°PÍckým kmenem (Ηΐν_γυ_₂) a také SIV isolátem, SIV_MAC239, vždy za použití limitního zředění. Infekčnost byla změřena spočítáním modrých buněk a vyjádřena jako počet modrých buněk vztažený na jamku a jednotku objemu virového vzorku (tabulka 2).

Tabulka 2

Kmen viru3	titr v buněčné linii	(lU/ml)b
	U373-MAGI	U373-MAGI-88C
hiv-1lai	< 100	< 100
HIV-1yu_2	< 100	2,2 X 106
SIVMAC239	1,2 X 103	4 X 105

. ... _ ,^a-₌viry_získané, transfekcí^molekulárních^klonů buněk 293 ^b IU = jednotky infekce; počet IU na mililitr představuje počet modrých buněk na jamku vynásobený zředěním supernatantu viru a normalizovaný na 1 ml konečného objemu.

- 43 • 4 ·» 44 4··· ·· ·· • · · · 4'· · 4 4 4« • · ··· · 4 4 · · ·· • 4 4 9 9 9 4 99 9999 9

Dva dny po infekci byly buňky fixovány a obarveny pomocí X-gal po stanovení aktivity β-galaktosidasy. Buňky MAGI procházející z buněk U373 byly barveny 120 minut při 37“C a buňky MAGI pocházející z buněk Hela byly barveny 50 minut při 37°C. Barvení neinfikovaných buněk (pozadí) nikdy neposkytlo více než asi 3 modré buňky v jamce. Spočítány byly jen tmavomodré buňky, přičemž syncitium s několika jádry bylo počítáno jako jediná infikovaná buňka. Titr infekce představuje počet modrých buněk v jamce vynásobený zředěním viru a normalizovaný na 1 ml. Titr infekce u buněk HIVyu_2 ^v případě buněk U373-MAGI-88C byl 2xl0⁶. Naproti tomu titu HIV-1_lai u stejných buněk byl nižší než 100. Specificita konkrétního kmene HIV pro receptor 88C se tedy změnila o čtyři řády.

Přestože infekce SIV_MAC239 se zvýšila u buněk U373-MAGI-88C na 4xl0⁵, zcela jasně byly infikovány i buňky U373-MAGI (tabulka 2).

Dále byla analyzována série primárních neklonovaných kmenů HIV a klonovaných M-tropických kmenů HIV-1 na svou schopnost infikovat indikátorové buněčné linie exprimující receptor 88C.

Jak bylo popsáno výše, buňky Hela-MAGI a HelaMAGI-88C byly infikovány limitním zředěnímrůzných kmenů HIV. Dva klonované M-tropické viry, ^hivjr-csF ^{a HIV}YU-2 infikovaly buňky Hela-MAGI-88C, ale nikoli buňky Hela-MAGI, což ukazuje, že oba tyto kmeny používají receptorú 88C jako ko-receptoru (viz tabulka 3, poznámka c). Ve schopnosti těchto dvou virových kmenů infikovat buňky Hela-MAGI-88C byla však pozorována velká rozdílnost, 6,2xl0⁵ IU/ml, v případě Ηΐνγυ_2 a l,2xl0⁴ IU/ml, v případě HIVJR__CSF. Infekčnost virového vzorku (viz tabulka 3) je definována jako počet infekčních jednotek, vztažený na fyzikální

9

9999

«'9 částici (zde reprezentováno množstvím virového jaderného proteinu). Kromě toho bylo pozorováno, že infekčnost těchto dvou klonovaných virových kmenů se lišila více než padesátinásobně u nezávisle připravených zásobních virů.

Variabilita infekčnosti primárních virálních izolátů byla dále zkoušena analýzou souboru dvanácti různých neklonovaných zásobních virů pocházejících ze tří různých kladů (tabulka 3). Bylo použito tří kladů A (primární izoláty), tří izolátů kladů E a tří dalších izolátů kladů B, pocházejících z geograficky odlišných oblastí. V případě použití všech devíti kmenů bylo možno primární kmeny HIV detegovat u buněk Hela-MAGI-88C, ale nikoliv u buněk Hela-MAGI (tabulka 3). Účinnost infekce však kolísala v rozmezí od pěti infekčních jednotek na ng p24Ú^aú do více než 100 infekčních jednotek na ng p24^^aú (viz tabulka 3). Tyto výsledky ukazují, že absolutní infekčnost M-tropických kmenů se značně mění a je závislá na kladu. Hypothesa, která může vysvětlit tuto nesrovnalost, může zahrnovat afinitu smyčky V3 každého kmene viru k 88C po vazbě CD4 (Trkola et al., Nátuře 384(6605): 184 až 187 (1996); Wu et al., Nátuře 384(6605): 179 až 183 (1996)).

Tabulka 3

Kmen virua Subtyp viru.	Titr (IU/ml) u	P24^a^ Infekčnostd
(země původu)D	Hela-MAGI-88Cc	(ng/ml)

HIV-1yu_2	B	(USA)	6,	2 x 105	2	200	281
hiv_1jk-csf	B	(USA)	12	000	2	800	4,2.
hiv-ith020	E	(Thajsko)	4	133		93	44
HIV-1THO21	E	(Thajsko)	4	967		52	96
hiv-iTHO22	E	(Thajsko)		200		15	13
HIV-1US660	B	(USA)	2	367		127	19
HIV-1UG031	A	(Uganda)	1	633		71	23
hiv-iRW009	A	(Rwanda)	3	333		158	21
HIV-1RW026	A	(Rwanda)		739		143	5,2
HIV-1US727	B	(USA)	14	067		289	49
HIV-1US056	B	(USA)	5	833		284	21
hiv-Ilai	B	(Francie)	2,	8 X 103		167 1	600
a	Kmeny	' HIV-1yu_2	a	hiv_1jr-csf	byly získány

transfekci molekulárních klonů. Všechny ostatní kmeny byly zkoušeny v podobě surových supernatantů neklonovaných virových zásobních vzorků pocházejících z infikovaných heterologních mononukleárních buněk periferní krve.

_ Klady jsou označovány způsobem navrženým pro _env gen v publikaci Myers et al., 1995: Země původu označuje zemi, kde sídlil HIV - pozitivní jednotlivec, jemuž byla odebrána krev pro izolaci viru (World Health Organization Viral Isolate Program).

^c Hodnota titru v jednotkách IU/ml je definována jako počet modrých buněk vztažený na jamku vynásobený

- 46 ·· ·· » · « a • ·· • 9 9 · a zředěním virového supernatantu a normalizovaný na konečný objem 1 ml. Při zkoušení na buňkách Hela-MAGI bez 88C vykázaly všechny viry, s výjimkou HIV-1_LAI, titr nižší než 10 IU/ml. Kmen HIV _LAI, což je T-tropický kmen, vykázal titr 2,8xl0⁵ v případě buněk Hela-MAGI s receptorem i bez receptoru 88C.

d Infekčnost je definována jako počet infekčních jednotek (IU) vztažený na ng P24^^a^ (hodnota uvedená ve třetím sloupci vydělená hodnotou uvedenou ve čtvrtém sloupci).

Také byla zjištována schopnost buněk Hela-MAGI-88C detegovat HIV-2 a jiné kmeny SIV. Bylo oznámeno, že HlV-2_Rod používá jako receptoru fusinu, a to i za nepřítomnosti CD4 (Endres et al., Cell 87(4): 745 až 756 (1996)). Kmen HIV-2_Rod je schopen infikovat buňky Hela-MAGI, jeho infekčnost v buňkách Hela-MAGI-88C je však zvýšena přinejmenším desetkrát (viz tabulka 4). Buňky Hela endogenně exprimují fusin. Molekulární klon HIV-2_Rod je tedy dvojnásobně tropický a je schopen používat receptoru 88C jako jednoho z ko-receptorů, kromě CXCR4. Podobně i primární kmen HIV-2_7312A infikuje buňky Hela-MAGI-88C a nikoliv buňky Hela-MAGI, což ukazuje, že tak jako primární kmen HIV-1 používá jako receptoru 88C.

• 4 44 •4 4444

44

Tabulka 4

Kmen virua	Citace	Titr (IU/ml) u HelaMAGÍb	Titr (iu/mi) u HelaMAGI88C	Infekčnostd na HelaMAGI 88Cc
HIV-2ROD9	Guyader et al.,1987	967	5 900	13
HIV-27312A	Gao et al.,1994	<30	6 500	17
SIVMAC239	Naidu et al.,1988	<30	20 900	90
SIVMNEc18	Overbaugh et al.,1991	<30	15 700	19
SIVMNE170	Rudensey et al.,1995	<30	10 700	27
SIVSMPbjl.9	Dewhurst et al.,1990	<30	776	NDd
SIVAGM9063	Hirsch et al.,1995	<30	50	<1

^a Zásobní vzorky HIV-2 a kmeny SIV_gMPbjl.9 a SIV_agm9063 byly zkoušeny přímo poté transfekci molekulárních klonů do buněk 293. Všechny ostatní kmeny pocházely z transfekce molekulárních klonů a následně byly amplifikovány v buňkách CEMxl74.

^b Hodnota titru v jednotkách IU/ml je definována jako počet modrých buněk vztažený na jamku vynásobený zředěním virového supernatantu a normalizovaný na konečný objem 1 ml. Všechny viry v tomto panelu byly také negativní na Hela-MAGI-88-2B.

^cInfekčnost je definována jako počet infekčních jednotek (IU) (v případě buněk exprimujících receptor 88C) vztažené na ng P27^^a^ podle stanovení ELISA.

ND = nestanoveno.

• fc fcfc • · · · · · • · · · fcfc fcfc • fc · · · ·

Žádný ze zkoušených kmenů SIV neinfikoval buňky Hela-MAGI (tabulka 4) a žádný neinfikoval buňky Hela-MAGI exprimující receptor 88-2B. To ukazuje, že alternativní ko-receptor používaný SIV v buňkách U373 není exprimován v buňkách Hela a nejedná se o receptor 88-2B. Všechny zkoušené kmeny SIV do určité míry infikovály buňky Hela-MAGI-88C (tabulka 3), což ukazuje, že všechny zkoušené kmeny SIV používají alespoň receptorů 88C jako jednoho ze svých ko-receptorů.

Klasifikace M-tropických a T-tropických kmenů HIV byla v minulosti často korelována s jiným označením, totiž neindukující syncytium (NSI) a indukující syncytium (SI). Zkoušení za použití zde popsaných buněčných linií je citlivé na tvorbu syncytia. Infikované buňky mohou vytvářet velká a malá ohniska infekce obsahující větší počet jader (Kimpton a Emerman, výše uvedená citace).

Experimenty provedené za použití několika různých kmenů virů a buněk U373-MAGI-88C nebo Hela-MAGI-88C ukazují, že označování SI/NSI nemá opodstatnění, poněvadž všechny kmeny virů vytvořily syncytia, pokud byl přítomen správný ko-receptor. Tyto experimenty ukazují, že tvorba syncytia je spíše známkou přítomnosti vhodného ko-receptoru na infikované buňce než známkou tropismu. Infekce buněk Hela-MAGI-88C kmeny SIV (které byly v literatuře popsány jako kmeny nevytvářející syncytium), zejména kmeny = SIV_MAC239, SIVjQjgC 18. aSIV^NE¹⁷θ' ^la ve skutečnosti .

pozoruhodná, poněvadž velikost syncytia indukovaného v monovrstvě byla mnohem větší než velikost indukovaná jakýmkoli jiným kmenem HIV.

·· 99 ·« ····

99' 99

Příklad 8

Byly připraveny myší monoklonální protilátky, které specificky rozpoznávají receptor 88C. Tyto protilátky byly vytvořeny imunizací myší peptidem, který odpovídá dvaceti aminoterminálním aminokyselinám receptoru 88C. Peptid byl konjugován ke KLH (Keyhole Limpet Cyanin) podle instrukcí výrobce (Pierce, Imject Maleimide Activated KLH) emulgovanému v úplném Freundově adjuvans a injekčně podán pěti myším. Dvě další injekce konjugovaného peptidu v neúplném Freundově adjuvans byly podány v intervalech 3 týdnů. Deset dnů po závěrečné injekci bylo sérum každé z těchto pěti myší zkoušeno na imunoreaktivitu s výše popsaným dvacetiaminokyselinovým peptidem pomocí zkoušky ELISA. Kromě toho byla imunoreaktivita séra zkoušena vzhledem k intaktnímu receptoru 88C exprimovanému na povrchu buněk 293 za použití metody FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting). Myši s nej lepší aktivitou proti 88C byly vybrány pro fúzi slezinných buněk a produkci monoklonálních protilátek za použití standardních laboratorních metod. Bylo získáno celkem pět monoklonálních buněčných linií (227K, 227M, 227N, 227P, 227R), které produkovaly protilátky rozpoznávající výše uvedený peptid při zkoušce ELISA a 88C protein na buňkách 293 při zkoušce FACS. Každá protilátka byla reaktivní pouze s buňkami 293 exprimujícími 88C, ale nikoliv s buňkami 293 exprimujícími blízce příbuzný receptor MCP (CCCKR-2). Každá z těchto protilátek také rozpoznávala 88C transientně exprimovaný v buňkách COS.

Také byly vytvořeny králičí polyklonální protilátky proti 88C. Dvěma králíkům byl Injekčně podán konjugovaný aminoterminální peptid popsaný výše. Králíci byli dále imunizováni čtyřmi přídavnými injekcemi konjugovaného aminoterminálního peptidu. Sérum z každého králíka (2337J a 2470J) bylo zkoušeno metodou FACS na buňkách 293 • « • 1 ·· ···· ·'· ·*

- 50 • a · ·· · · · · ··· • · · r · · « ·· · · · · · exprimujících 88C. Tato séra specificky rozpoznávala 88C na povrchu buněk 293.

Pět anti-88C monoklonálních protilátek bylo zkoušeno na schopnost blokovat infekci buněk virem SIV (virus imunodeficience lidoopů), který je blízce příbuzný s viru HIV (Lehner et al., Nátuře Medicine, 2: 767 (1996)).

Lidoopí buňky CD4⁺T, které jsou normálně susceptibilní vůči

4· infekci SIV, byly inkubovány s klonem SIV_mac32HJ5 za přítomnosti supernatantů anti-88C monoklonální protilátky zředěných v poměru 1:5. Infekce SIV byla měřena pomocí stanovení aktivity reversní transkriptasy (RT) devátý den za použití detekce RT a kvantifikace za použití kitu Quan-T-RT Assay Kit, Amersham, Arlington Heights, IL, USA. Čtyři protilátky byly schopny blokovat infekci SIV: protilátka 227K vykazovala blokační účinnost 53 %, protilátka 227M 59 %, protilátka 227N 47 % a protilátka 227P 81 %.

Protilátka 227R neblokovala infekci SIV.

Pět monoklonálních protilátek vypěstovaných proti lidskému 88C aminoterminálnímu peptidu bylo také zkoušeno na reaktivitu vůči receptorů 88C z makaka (SEQ ID NO:X) (který vykazuje dva aminokyselinové rozdíly ve srovnání s lidským receptorem 88C v aminoterminální peptidové oblasti).

Kódující oblasti receptorů 88C z člověka a makaka (rod Macaca) byly klonovány do expresního vektoru pcDNA3 (Invitrogen). Těchto expresních plasmidů bylo použito pro <£___ _ transfekci buněk COS·za použitÍ DEAE. Prázdného vektoru by1o , použito jako negativní kontroly. Tři dny po transfekci byly buňky sklizeny a inkubovány s pěti anti-88C monokionáiními protilátkami a připraveny pro FACS. Výsledky ukázaly, že čtyři z pěti protilátek (227K, 227M, 227N a 227P) rozpoznaly receptor 88C z opice makak a jedna (227R) nikoli. Všech pět protilátek rozpoznalo transfekovaný lidský receptor 88C ·· ·· ·» ···· ·· 99

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 999 9 9 9 9 9 99

9 9 9 9 9 9 9 9 999 9 ·

9 9 9 · · · · · · 9 a žádná nereagovala zkříženě s buňkami transfekovanými samotným vektorem.

P ř ík 1 a d 9

Pro identifikace ligandů a modulátorů chemokinových ř receptorů podle vynálezu se může použít i dalších metod.

ě V jednom provedení zahrnuje vynález přímé stanovení ligandů. Detegovatelné označené zkoušené sloučeniny se exponují membránovým přípravkům obsahujícím chemokinové receptory ve funkční konformaci. Tak například buňky HEK-293 nebo buňky z tkáňové kultury se transfekují expresním vehikulem kódujícím chemokinový receptor. Z transfekovaných buněk exprimujících chemokinový receptor se potom vyrobí membránový přípravek, který se poté exponuje zkoušeným sloučeninám (například chemokinům) značeným radioizotopem jodu ¹²⁵I a inkubují za vhodných podmínek (například 10 minut při 37°C). Membrány s navázanými zkoušenými sloučeninami se potom shromáždí na filtru pomocí, vakuové filtrace a promytím se zbaví nenavázané zkoušené sloučeniny. Radioaktivita spojená s navázanou zkoušenou sloučeninou se potom kvantifikuje tak, že se filtry podrobí kapalinové scintilační spektrofometrii. Specifítu vazby zkoušené sloučeniny je možno potvrdit tak, že se stanovení opakuje za přítomnosti * rostoucích množství neznačené zkoušené sloučeniny a zaznamenává se úroveň soutěže o vazbu k receptoru. Pomocí těchto

... vazebných stanovení lze také identifikovat modulátory vazby chemokinů k receptoru. Výše popsané vazebné stanovení se může provádět s následujícími modifikacemi. Kromě detegovatelně značené zkoušené sloučeniny se membránovému přípravku exponuje potenciální modulátor. Zvýšení koncentrace značícího činidla asociovaného k membráně ukazuje, že potenciální modulátor je aktivátorem a snížení koncentrace ·· ····

- 52 ·· ·· • 44 44 • 4 4·· · · · · 4 4 4 4 • 4 4 4 4 4 4

44

4 4 4 4 · ··

4 ··· · ·

4 4 4 značícího činidla asociovaného k membráně ukazuje, že modulátor je inhibitorem vazby chemokinů k receptoru.

Podle jiného provedení vynález zahrnuje nepřímá stanovení pro identifikaci receptorových ligandů, která využívají kopulace chemokinových receptorů ke G proteinům.

Jak je to uvedeno v přehledu publikovaném v Linder et al., Sci. Am., 267: 56 až 65 (1992), během transdukce signálu interaguje aktivovaný receptor s G proteinem a tím dochází k aktivaci G proteinu. G protein je aktivován výměnou GDP za GTP. K deaktivaci G proteinu dochází následující hydrolýzou GTP vázaného ke G proteinu. Při jedné zkoušce aktivity G proteinu se proto monitoruje uvolňování ³²P z [gamma-³²P]-GTP. Stanovení lze například provést takto: 5xl0⁷ buněk HEK-293 nesoucích plasmid podle vynálezu se pěstuje v médiu MEM+10 % FCS. Růstové médium se doplní 5 mCi/ml [³²P]-fosforečnanu sodného a nechá se působit po dobu 2 hodin, aby došlo k rovnoměrnému značení nukleotidových skupin. Buňky se promyjí isotonickým pufrem s nízkým obsahem fosforečnanu. Jeden alikvotní díl promytých buněk se exponuje zkoušené sloučenině, zatímco druhý alikvot buněk se zpracuje podobně, ale bez expozice zkoušené sloučenině. Po inkubační periodě (například 10 minut) se buňky peletizují, podrobí lysí a nukleotidové sloučeniny se frakcionují za použití chromatografie na tenké vrstvě s vyvíjením ÍM chloridem lithným. Značený GTP a GDP se identifikuje současným vyvíjením známých standardů. Značený GTP a GDP se potom kvantifikuje autoradiografickými technikami, které jsou známé v tomto oboru. Relativně vysoké koncentrace ³^-značeného GDP identifikují zkoušené sloučeniny jako ligandy. Tohoto typu stanovení s hydrolýzou GTP se také může použít pro identifikaci modulátorů vazby chemokinů k receptoru.

Výše uvedené stanovení se provádí za přítomnosti potenciálního modulátoru. Intenzivnější signál, který je důsledkem relativního zvýšení hydrolýzy GTP produkující ³²P-značený

- 53 ·· ····

GDP, ukazuje relativní zvýšení aktivity receptoru. Intenzivnější signál tedy identifikuje potenciální modulátor jako aktivátor. Naopak, snížený relativní signál ³²P-značeného GDP ukazující na nižší aktivitu receptoru, identifikuje potenciální modulátor jako inhibitor vazby chemokinů k receptoru.

Stanovovat je také možno aktivity efektorových molekul G proteinu (například adenylyl cyklasy, fosfolipasy C, iontových kanálů a fosfodierteras). Zkoušení aktivit těchto efektorových molekul byla již dříve popsána. Tak například adenylyl cyklasa, která katalyzuje syntézu cyklického adenosinmonofosfátu (cAMP), je aktivována G proteiny. Ligand vázající se k chemokinovému receptoru, který aktivuje G protein, což má za následek aktivaci adenylyl cyklasy, je možno detegovat monitorováním hladiny cAMP v rekombinantních hostitelských buňkách podle vynálezu. Za použití vhodných kontrolních mechanismů, což je v tomto oboru samozřejmé, je možno zvýšenou úroveň intracelulárního cAMP připsat zvýšení aktivity receptoru, jež je indukováno ligandem, a tak je ligand identifikován. Opět za použití kontrolních mechanismů, které jsou v tomto oboru zřejmé, relativní snížení koncentrace cAMP nepřímo identifikuje inhibitor aktivity receptoru. Koncentraci cAMP je možno měřit obchodně dostupným enzymovým imunoesejem. Tak například souprava BioTrak Kit (Amersham, nc., Arlington Heights, IL, USA) obsahuje reakční činidla pro kompetitivní =· - imunoe se j . Kdy ž se toho to ki tu pou ž i je pod le doporučení „ . ___ výrobce, uspořádá se reakce zahrnující konkurenci neznačeného cAMP s cAMP konjugovaným ke křenové peroxidase. Neznačený cAMP je například možno získat z aktivovaných buněk exprimujících chemokinové receptory podle vynálezu. Tyto dvě sloučeniny soutěží o vazbu k immobilizované anti-cAMP protilátce. Po konkurenční reakci se immobilizovaný konjugát křenová peroxidasa-cAMP kvantifikuje stanovením enzymu za použití substrátu tetramethylbenzidin/peroxid vodíku (jednonádobový substrát), přičemž detekce barevných reakčních produktů se provádí při 450 nm. Výsledky představují základ pro výpočet úrovně neznačeného cAMP za použití technik, které jsou v tomto oboru známy. Kromě identifikace ligandů vázajících se k chemokinovým receptorům , se stanovení cAMP může také použít pro identifikaci modulátorů vazby chemokinů k receptoru. Za použití rekombinantních hostitelských buněk podle vynálezu se stanovení provádí výše popsaným způsobem, přičemž se však přidá potenciální modulátor aktivity chemokinového receptoru. Za použití kontrolních mechanismů, které jsou v tomto oboru samozřejmé, odráží relativní zvýšení nebo snížení hladiny intracelulámího cAMP aktivaci nebo inhibici aktivity adenylyl cyklasy. Úroveň aktivity adenylyl cyklasy pak odráží relativní aktivitu chemokinového receptoru, který je předmětem zájmu. Relativně zvýšená hladina aktivity chemokinového receptoru identifikuje zkoušenou sloučeninu jako aktivátor a relativně snížená hladina aktivity chemokinového receptoru identifikuje potenciální modulátor jako inhibitor aktivity chemokinového receptoru.

Vynález byl podrobně popsán na svých specifických provedeních. Je však zřejmé, že do jeho rozsahu spadají i všechny obměny a modifikace, které jsou zřejmé odborníkům v tomto oboru. Pro rozsah ochrany jsou rozhodující připojené

Claims (2)

1. patentové nároky.

   iÁ.. · ·

   ΦΦΦΦ

   ΦΦ

   ΦΦ φ · ι ::..

   Φ · » φ φ φ

   SEZNAM SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE:

   (i) PŘIHLAŠOVATEL: ICOS Corporation

   22021 20th Avenue, S.E., Bothell,

   WA 98021, U.S.A.

   (ii) NÁZEV VYNÁLEZU: Chemokinově receptory 88-2B (CKR-3) a 88C a jejich protilátky (iii) POČET SEKVENCÍ: 20 (iv) ADRESA PRO KORESPONDENCI:

   (A) ADRESÁT: Čermák-Hořejš-Vrba, Advokátní a patentová kancelář (B) ULICE: Národní 32, (c) MĚSTO: 110 00 Praha 1, (D) ZEMĚ: Česká republika (E) TELEFAX: (004202) 24 214 187

   (v) STROJNĚ ČITELNÁ FORMA:

   (A) TYP MÉDIA: Floppy disk (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Verze #1.30 (vi) DATA O SOUČASNÉ PŘIHLÁŠCE: .

   (A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: PV 2610-97 (B) DATUM PODÁNÍ: 15. 8. 1997 (C) ZATŘÍDĚNÍ:

   • · • · · · · · < υ • · (viii) INFORMACE O ZÁSTUPCI:

   (A) : JMÉNO: GOWSHALL, Jon V.

   (B) : ADRESA: Forrester Ketley & Co.

   (C) : ULICE: 52 Bounds Green Road (D) : MĚSTO: Londýn (E) : ZEMĚ: Velká Británie (F) : PSČ (ZIP): Nil 2EY (ix) TELEKOMUNIKAČNÍ INFORMACE:

   (A) TELEFON: (0181) 889 6622 (B) TELEFAX: (0181) 881 1088 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:1:

   (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

   (A) DÉLKA: 3383 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

   (A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 55..1110

   ..(ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK: , ..

   (A) JMÉNO/KLÍČ: misc_feature (B) JINÉ INFORMACE: /= polynukleotidová a aminokyselinová sekvence 88C (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:1:

   AGAAGAGCTG AGACATCCGT TCCCCTACAA GAAACTCTCC CCGGGTGGAA CAAG ATG ·· ··· 9 ··

   - 5 7 J • · • · 9-9 9 • · · 9 · * t • · ·· «Ί I · » 9 99 9 9 9 · · 9.9 Met 1 GAT TAT CAA GTG TCA AGT CCA ATC TAT GAC ATC AAT TAT TAT ACA TCG 105 Asp Tyr Gin Val Ser Ser Pro Ile Tyr Asp Ile Asn Tyr Tyr Thr Ser 5 10 15 GAG CCC TGC CAA AAA ATC AAT GTG AAG CAA ATC GCA GCC CGC CTC CTG 153 Glu Pro Cys Gin Lys Ile Asn Val Lys Gin Ile Ala Ala Arg Leu Leu 2 0 25 30 CCT CCG CTC TAC TCA CTG GTG TTC ATC TTT GGT TTT GTG GGC AAC ATG 201 Pro Pro Leu Tyr Ser Leu Val Phe Ile Phe Gly Phe Val Gly Asn Met 35 40 45 CTG GTC ATC CTC ATC CTG ATA AAC TGC AAA AGG CTG AAG AGC ATG ACT 249 Leu Val Ile Leu Ile Leu Ile Asn Cys Lys Arg Leu Lys Ser Met Thr 5'S 55 60 65 GAC ATC TAC CTG CTC AAC CTG GCC ATC TCT GAC CTG TTT TTC CTT CTT 297 Asp Ile Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Ile Ser Asp Leu Phe Phe Leu Leu 70 75 80 ACT GTC CCC TTC TGG GCT CAC TAT GCT GCC GCC CAG TGG GAC TTT GGA 345 Thr Val Pro Phe Trp Ala His Tyr Ala Ala Ala Gin Trp Asp Phe Gly 8 5 90 95 AAT ACA ATG TGT CAA CTC TTG ACA GGG CTC TAT TTT ATA GGC TTC TTC 393 Asn Thr Met Cys Gin Leu Leu Thr Gly Leu Tyr Phe Ile Gly Phe Phe 100 105 110 TCT GGA ATC TTC TTC ATC ATC CTC CTG ACA ATC GAT AGG TAC CTG GCT 441 Ser Gly Ile Phe Phe Ile Ile Leu Leu Thr Ile Asp Arg Tyr Leu Ala 115 120 125 GTC GTC CAT GCT GTG TTT GCT TTA AAA GCC AGG ACG GTC ACC TTT GGG 489 Val Val His Ala Val Phe Ala Leu Lys Ala Arg Thr Val Thr Phe Gly 130 135 140 145 GTG GTG ACA AGT GTG ATC ACT TGG GTG GTG GCT GTG TTT GCG TCT CTC 537 Val Val Thr Ser Val Ile Thr Trp Val Val Ala Val Phe Ala Ser Leu '•í 150 155 160 CCA GGA ATC ATC TTT ACC AGA TCT CAA AAA GAA GGT CTT CAT TAC ACC 585 Pro Gly Ile Ile Phe Thr Arg Ser Gin Lys Glu Gly Leu His Tyr Thr . η.£.ξ.. - IDD - ±-/ v ‘ ' X 7 O ' TGC AGC TCT CAT TTT CCA TAC AGT CAG TAT CAA TTC TGG AAG AAT TTC 633 Cys Ser Ser His Phe Pro Tyr Ser Gin Tyr Gin Phe Trp Lys Asn Phe 180 185 190 CAG ACA TTA AAG ATA GTC ATC .TTG GGG CTG GTC CTG CCG CTG CTT GTC 681 Gin Thr Leu Lys Ile Val Ile Leu Gly Leu Val Leu Pro Leu Leu Val 195 200 205 ATG GTC ATC TGC TAC TCG GGA ATC CTA AAA ACT CTG CTT CGG TGT CGA 729 Met Val Ile Cys Tyr Ser Gly Ile Leu Lys Thr Leu Leu Arg Cys Arg 210 215 220 225 AAT GAG AAG AAG AGG CAC AGG GCT GTG AGG CTT ATC TTC ACC ATC ATG 777 Asn Clu Lys Lys Arg His Arg Ala Val Arg Leu Ile Phe Thr Ile Met 230 235 240 ATT GTT TAT TTT CTC TTC TGG GCT CCC TAC AAC ATT GTC CTT CTC CTG 825

   ··

   Ile Val Tyr Phe 245 Leu Phe Trp Ala Pro 250 Tyr Asn .T’le*Val T!eu’*Leu 255 ’3eu*· AAC ACC TTC CAG GAA TTC TTT GGC CTG AAT AAT TGC AGT AGC TCT AAC 873 Asn Thr Phe Gin Glu Phe Phe Gly Leu Asn Asn Cys Ser Ser Ser Asn 260 265 270 AGG TTG GAC CAA GCT ATG CAG GTG ACA GAG ACT CTT GGG ATG ACG CAC 921 Arg Leu Asp Gin Ala Met Gin Val Thr Glu Thr Leu Gly Met Thr His 275 280 285 TGC TGC ATC AAC CCC ATC ATC TAT GCC TTT GTC GGG GAG AAG TTC AGA 969 Cys Cys Ile Asn Pro Ile Ile Tyr Ala Phe Val Gly Glu Lys Phe Arg 290 295 300 305 AAC TAC CTC TTA GTC TTC TTC CAA AAG CAC ATT GCC AAA CGC TTC TGC 1017 Asn Tyr Leu Leu Val Phe Phe Gin Lys His Ile Ala Lys Arg Phe Cys jí 310 315 320 AAA TGC TGT TCT ATT TTC CAG CAA GAG GCT CCC GAG CGA GCA AGC TCA 1065 Lys Cys Cys Ser Ile Phe Gin Gin Glu Ala Pro Glu Arg Ala Ser Ser 325 330 335 GTT TAC ACC CGA TCC ACT GGG GAG CAG GAA ATA TCT GTG GGC TTG 1110 Val Tyr Thr Arg Ser Thr Gly Glu Gin Glu Ile Ser Val Gly Leu 340 345 350

   TGACACGGAC TCAAGTGGGC TGGTGACCCA GTCAGAGTTG TGCACATGGC TTAGTTTTCA 1170 TACACAGCCT GGGCTGGGGG TGGGGTGGGA GAGGTCTTTT TTAAAAGGAA GTTACTGTTA 1230 TAGAGGGTCT AAGATTCATC CATTTATTTG GCATCTGTTT AAAGTAGATT AGATCTTTTA 1290 AGCCCATCAA TTATAGAAAG CCAAATCAAA ATATGTTGAT GAAAAATAGC AACCTTTTTA 1350 TCTCCCCTTC ACATGCATCA AGTTATTGAC AAACTCTCCC TTCACTCCGA AAGTTCCTTA 1410 TGTATATTTA AAAGAAAGCC TCAGAGAATT GCTGATTCTT GAGTTTAGTG ATCTGAACAG 14 7 0 AAATACCAAA ATTATTTCAG AAATGTACAA CTTTTTACCT AGTACAAGGC AACATATAGG 1530 TTGTAAATGT GTTTAAAACA GGTCTTTGTG TTGCTATGGG GAGAAAAGAC ATGAATATGA 1590 & TTAGTAAAGA AATGACACTT TTCATGTGTG ATTTCCCCTC CAAGGTATGG TTAATAAGTT 1650 TCACTGACTT AGAACCAGGC GAGAGACTTG TGGCCTGGGA GAGCTGGGGA AGCTTCTTAA 1710 <5 - -- ATGAGAAGGA ATTTGAGTTG GATCATCTAT TGCTGGCAAA GACAGAAGCC TCACTGCAAG 1770 CACTGCATGG GCAAGCTTGG CTGTAGAAGG AGACAGAGCT GGTTGGGAAG ACATGGGGAG 1830 GAAGGACAAG GCTAGATCAT GAAGAACCTT GACGGCATTG CTCCGTCTAA GTCATGAGCT 1890 GAGCAGGGAG ATCCTGGTTG GTGTTGCAGA AGGTTTACTC TGTGGCCAAA GGAGGGTCAG 1950 GAAGGATGAG CATTTAGGGC AAGGAGACCA CCAACAGCCC TCAGGTCAGG GTGAGGATGG 2010 CCTCTGCTAA GCTCAAGGCG TGAGGATGGG AAGGAGGGAG GTATTCGTAA GGATGGGAAG 2070 GAGGGAGGTA TTCGTGCAGC ATATGAGGAT GCAGAGTCAG CAGAACTGGG GTGGATTTGG 2130 TTTGGAAGTG AGGGTCAGAG AGGAGTCAGA GAGAATCCCT . AGTCTTCAAG. CAGATTGGAG 219 0 AAACCCTTGA AAAGACATCA AGCACAGAAG GAGGAGGAGG AGGTTTAGGT CAAGAAGAAG 2250

   » ·· « · • · ·· · « ·* ·»

   ATGGATTGGT GTAAAAGGAT GGGTCTGGTT TGCAGAGCTT GAACACAGTC TCACCCAGAC 2 310 TCCAGGCTGT CTTTCACTGA ATGCTTCTGA CTTCATAGAT TTCCTTCCCA TCCCAGCTGA 2370 AATACTGAGG GGTCTCCAGG AGGAGACTAG ATTTATGAAT ACACGAGGTA TGAGGTCTAG 2430 GAACATACTT CAGCTCACAC ATGAGATCTA GGTGAGGATT GATTACCTAG TAGTCATTTC 2490 ATGGGTTGTT GGGAGGATTC TATGAGGCAA CCACAGGCAG CATTTAGCAC ATACTACACA 2 5.5 0 TTCAATAAGC ATCAAACTCT TAGTTACTCA TTCAGGGATA GCACTGAGCA AAGCATTGAG 2610 CAAAGGGGTC CCATATAGGT GAGGGAAGCC TGAAAAACTA AGATGCTGCC TGCCCAGTGC 2670 ACACAAGTGT AGGTATCATT TTCTGCATTT AACCGTCAAT AGGCAAAGGG GGGAAGGGAC 2730 ATATTCATTT GGAAATAAGC TGCCTTGAGC CTTAAAACCC ACAAAAGTAC AATTTACCAG 2790 CCTCCGTATT TCAGACTGAA TGGGGGTGGG GGGGGCGCCT TAGGTACTTA TTCCAGATGC 2850 CTTCTCCAGA CAAACCAGAA GCAACAGAAA AAATCGTCTC TCCCTCCCTT TGAAATGAAT 2910 ATACCCCTTA GTGTTTGGGT ATATTCATTT CAAAGGGAGA GAGAGAGGTT TTTTTCTGTT 2970 CTTTCTCATA TGATTGTGCA CATACTTGAG ACTGTTTTGA ATTTGGGGGA TGGCTAAAAC 3030 CATCATAGTA CAGGTAAGGT GAGGGAATAG TAAGTGGTGA GAACTACTCA GGGAATGAAG 3090 GTGTCAGAAT AATAAGAGGT GCTACTGACT TTCTCAGCCT CTGAATATGA ACGGTGAGCA 3150. TTGTGGCTGT CAGCAGGAAG CAACGAAGGG AAATGTCTTT CCTTTTGCTC TTAAGTTGTG 3210 GAGAGTGCAA CAGTAGCATA GGACCCTACC CTCTGGGCCA AGTCAAA.GAC ATTCTGACAT 3270 CTTAGTATTT GCATATTCTT ATGTATGTGA AAGTTACAAA TTGCTTGAAA GAAAATATGC 3330 ATCTAATAAA AAACACCTTC TAAAATAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAA 3383
2. (2) INFORMACE O SEQ ID NO:2:

   (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

   (A) DÉLKA: 3 52 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

   (A) JMÉNO/KLÍČ: misc_feature (B) JINÉ INFORMACE: /= aminokyselinová sekvence 88C

   (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 2: Met 1 Asp Tyr Gin Val Ser 5 Ser Pro Ile Tyr Asp Ile Asn Tyr Tyr Thr 10 15 Ser Glu Pro Cys Gin Lys 20 Ile Asn Val Lys Gin Ile Ala Ala Arg Leu 25 30 Leu Pro Pro Leu Tyr Ser Leu Val Phe Ile Phe Gly Phe Val Gly Asn 3 5 · ' ’ · ·- .-···-· ' 40 '...... ' ~ 4 5 ' ' ' ’ ‘ --------- Met Leu Val Ile Leu Ile Leu Ile Asn Cys Lys Arg Leu Lys Ser Met

   ·· ·» «· ···· • * · · · ·

   50 55 9 9 4 » 60 c* 4 · 9 » ’ Thr Asp Ile Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Ile Ser Asp Leu Phe Phe Leu 65 70 75 80 Leu Thr Val Pro Phe Trp Ala His Tyr Ala Ala Ala Gin Trp Asp Phe 85 90 95 Gly Asn Thr Met Cys Gin Leu Leu Thr Gly Leu Tyr Phe Ile Gly Phe 100 105 110 Phe Ser Gly Ile Phe Phe Ile Ile Leu Leu Thr Ile Asp Arg Tyr Leu 115 120 125 Ala Val Val His Ala Val Phe Ala Leu Lys Ala Arg Thr Val Thr Phe 130 135 140 Glý Val Val Thr Ser Val Ile Thr Trp Val Val Ala Val Phe Ala Ser 145 150 155 160 Leu Pro Gly Ile Ile Phe Thr Arg Ser Gin Lys Glu Gly Leu His Tyr 165 170 175 Thr Cys Ser Ser His Phe Pro Tyr Ser Gin Tyr Gin Phe Trp Lys Asn 180 185 190 Phe Gin Thr Leu Lys Ile Val Ile Leu Gly Leu Val Leu Pro Leu Leu 195 200 205 Val Met Val Ile Cys Tyr Ser Gly Ile Leu Lys Thr Leu Leu Arg Cys 210 215 220 Arg Asn Glu Lys Lys Arg His Arg Ala Val Arg Leu Ile Phe Thr Ile 225 230 235 240 Met Ile Val Tyr Phe Leu Phe Trp Ala Pro Tyr Asn Ile Val Leu Leu 245 250 255 Leu Asn Thr Phe Gin Glu Phe Phe Gly Leu Asn Asn Cys Ser Ser Ser 260 265 270 Asn Arg Leu Asp Gin Ala Met Gin Val Thr Glu Thr Leu Gly Met Thr 275 280 285 His Cys Cys Ile Asn Pro Ile Ile Tyr Ala Phe Val Gly Glu Lys Phe 2 90 __:___ ___ _____ _. 2 95 mn - Arg Asn Tyr Leu Leu Val Phe Phe Gin Lys His Ile Ala Lys Arg Phe 305 310 315 320 Cys Lys Cys Cys Ser Ile Phe Gin Gin Glu Ala Pro Glu Arg Ala Ser 325 330 335 Ser Val Tyr Thr Arg Ser Thr Gly Glu Gin Glu Ile Ser Val Gly Leu 340 345 350 (2) INFORMACE 0 SEQ id : NO: 3 • •

   (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

   (A) DÉLKA: 1915 bázových páru (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární «'« (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

   (A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 362..1426 (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

   (A) JMÉNO/KLÍČ: misc_feature (B) JINÉ INFORMACE: /= polynukleotidová a aminokyselinová sekvence 88-2B (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NÓ:3:

   rATAATAATGA TTATTATATT GTTATCATTA TCTAGCCTGT TTTTTCCTGT TTTGTATTTC . 60 TTCCTTTAAA TGCTTTCAGA AATCTGTATC CCCATTCTTC ACCACCACCC CACAACATTT 12 0 / CT^CTTCTTT TCCCATGCCG GGTCATGCTA ACTTTGAAAG CTTCAGCTCT TTCCTTCCTC 180 AATCCTTTTC CTGGCAČCTC TGATATGCCT TTTGAAATTC ATGTTAAAGA ATCCCTAGGC 240 TGCTATCACA TGTGGCATCT TTGTTGAGTA CATGAATAAA TCAACTGGTG TGTTTTACGA 300 AGGATGATTA TGCTTCATTG TGGGATTGTA TTTTTCTTCT TCTATCACAG GGAGAAGTGA 360

   A ATG ACA ACC TCA CTA GAT ACA GTT GAG ACC TTT GGT ACC ACA TCC 406

   Met Thr Thr Ser Leu Asp Thr Val Glu Thr Phé Gly Thr Thr Ser

   1 5 10 15 TAC TAT GAT GAC GTG GGC CTG CTC TGT GAA AAA GCT GAT ACC AGA GCA 454 Tyr Tyr Asp Asp Val Gly Leu Leu 20 Cys Glu Lys Ala Asp Thr 25 Arg Ala 30 CTG ATG GCC CAG TTT GTG CCC CCG CTG TAC TCC CTG GTG TTC ACT GTG 502 Leu Met Ala Gin 35 Phe Val Pro Pro Leu Tyr Ser Leu Val Phe 40 45 Thr Val GGC CTC TTG GGC AAT GTG GTG GTG GTG ATG ATC CTC ATA AAA TAC AGG 550 Gly Leu Leu Gly 50 Asn Val Val Val 55 Val Met Ile Leu Ile Lys 60 Tyr Arg AGG CTC CGA ATT ATG ACC AAC ATC TAC CTG CTC AAC CTG GCC ATT TCG 5 9.8 Arg,. Leu Arg Ile 65 Met Thr Asn Ile 70 Tyr Leu Leu Asn Leu Ala 75 Ile Ser GAf CTG CTC TTC CTC „GTC ACC CTT CCA TTC TGG ATC CAC TAT GTC AGG 64 6 Asp 80 Leu Leu Phe Leu Val Thr Leu 85 Pro Phe Ťřp Ile His Tyr 90 Val Arg 95 GGG CAT AAC TGG GTT TTT GGC CAT GGC ATG TGT AAG CTC CTC TCA GGG 694 Gly His Asn Trp Val Phe Gly His 100 Gly Met Cys Lys Leu Leu 105 Ser Gly 110 TTT TAT CAC ACA GGC TTG TAC AGC GAG ATC TTT TTC ATA ATC CTG CTG 742 Phe Tyr His Thr 115 Gly Leu Tyr Ser Glu Ile Phe Phe Ile Ile 120 125 Leu Leu ACA ATC GAC AGG TAC CTG GCC ATT GTC CAT GCT GTG TTT GCC CTT CGA 790 Thr Ile Asp Arg 130 Tyr Leu Ala Ile 135 Val His Ala Val Phe Ala 14 0 Leu Arg GCC CGG ACT GTC ACT-TTT GGT- GTC ATC - ACC AGC -ATC GTC ACC TGG- GGC...... ..... .83.8 Ala Arg Thr Val 145 Thr Phe Gly Val 150 Ile Thr Ser Ile Val Thr 155 Trp Gly

   «· ····

   CTG GCA GTG Val CTA GCA GCT Ala 165 CTT Leu CCT Pro GAA Glu TTT Phe ATC Ile 170 TTC Phe TAT Tyr GAG Glu ACT Thr GAA Glu 175 886 Leu 160 Ala Leu Ala GAG TTG TTT GAA GAG ACT GTT TGC AGT GCT CTT TAC CCA GAG GAT ACA 934 Glu Leu Phe Glu Glu Thr Leu Cys Ser Ala Leu Tyr Pro Glu Asp Thr 180 185 190 GTA TAT AGC TGG AGG CAT TTC- CAC ACT CTG AGA ATG ACC ATC TTC TGT 982 Val Tyr Ser Trp Arg His Phe His Thr Leu Arg Met Thr Ile Phe Cys 195 200 205 CTC GTT CTC CCT CTG CTC GTT ATG GCC ATC TGC TAC ACA GGA ATC ATC 103 0 Leú Val Leu Pro Leu Leu Val Met Ala Ile Cys Tyr Thr Gly Ile Ile 210 215 220 AAÁ ACG CTG CTG AGG TGC CCC AGT AAA AAA AAG TAC AAG GCC ATC CGG 1078 Lys Thr Leu Leu Arg Cys Pro Ser Lys Lys Lys Tyr Lys Ala Ile Arg 22 5 230 235 CTC ATT TTT GTC ATC ATG GCG GTG TTT TTC ATT TTC TGG ACA CCC TAC 1126 Leu Ile Phe Val Ile Met Ala Val Phe Phe Ile Phe Trp Thr Pro Tyr 240 245 250 255 AAT GTG GCT ATC CTT CTC TCT TGC TAT CAA TCC ATC TTA TTT GGA AAT 1174 Asn Val Ala Ile Leu Leu Ser Ser Tyr Gin Ser Ile Leu Phe Gly Asn 260 265 270 GAC TGT GAG CGG AGC AAG CAT CTG GAC CTG GTC ATG CTG GTG ACA GAG 1222 Asp Cys Glu Arg Ser Lys His Leu Asp Leu Val Met Leu Val Thr Glu 275 280 285 GTG ATC GCC TAC TCC CAC TGC TGC ATG AAC CCG GTG ATC TAC GCC TTT 1270 Val Ile Ala Tyr Ser His Cys Cys Met Asn Pro Val Ile Tyr Ala Phe 290 295 300 GTT GGA GAG AGG TTC CGG AAG TAC CTG CGC CAC TTC TTC CAC AGG CAC 1318 Val Gly Glu Arg Phe Arg Lys Tyr Leu Arg His Phe Phe His Arg His 305 310 315 TTG CTC ATG CAC CTG GGC AGA TAC ATC CCA TTC CTT CCT AGT GAG AAG 1366 Leů Leu Met His Leu Gly Arg Tyr Ile Pro Phe Leu Pro Ser Glu Lys 320 325 330 335 CTG GAA AGA ACC AGC tct GTC TCT CGA TCC ACA GCA GAG CCG GAA _CTC 1414 Leu Glu Arg Thr Ser Ser Val Ser Pro Ser Thr Ala Glu Pro Glu Leu 340 345 350

   TCT ATT GTG TTT TAGGTCAGAT GCAGAAAATT GCCTAAAGAG GAAGGACCAA 14 6 6

   Ser Ile Val Phe

   355

   GGAGATGAAG CAAACACATT AAGCCTTCCA CACTCACCTC TAAAACAGTC CTTCAAACTT 1526 CCAGTGCAAC ACTGAAGCTC TTGAAGACAC TGAAATATAC ACACAGCAGT AGCAGTAGAT 1586 GCATGTACCC TAAGGTCATT ACCACAGGCC AGGGGCTGGG CAGCGTACTC ATCATCAACC 1646 CTAAAAAGCA GAGCTTTGCT TCTCTCTCTA AAATGAGTTA CCTACATTTT AATGCACCTG 1706 AATGTTAGAT AGTTACTATÁ TGCCGČTACA AAAAGGTAAA AČTTTŤTATA TTTTATACAT 1766 TAACTTCAGC CAGCTATTGA TATAAATAAA ACATTTTCAC ACAATACAAT AAGTTAACTA 182 6

   • ·

   TTTTATTTTC TAATGTGCCT AGTTCTTTCC CTGCTTAATG AAAAGCTTGT TTTTTCAGTG

   TGAATAAATA ATCGTAAGCA ACAAAAAAA (2) INFORMACE O SEQ ID NO:4:

   (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

   (A) DÉLKA: 355 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein

   I (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

   (A) JMÉNO/KLÍČ: misc_feature (B) JINÉ INFORMACE: /= aminokyselinová sekvence 88-2B íí (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:4:

   1886

   1915

   Met 1 Thr Thr Ser Leu Asp 5 Thr Val Glu Thr 10 Phe Gly Thr Thr Ser 15 Tyr Tyr Asp Asp Val Gly Leu Leu Cys Glu Lys Ala Asp Thr Arg Ala Leu 20 25 3 0 Met Ala Gin Phe Val Pro Pro Leu Tyr Ser Leu Val Phe Thr Val Gly 35 40 45 Leu Leu Gly Asn Val Val Val Val Met Ile Leu Ile Lys Tyr Arg Arg 50 55 60 Leu Arg Ile Met Thr Asn Ile Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Ile Ser Asp 65 70 75 80 Leu Leu Phe Leu Val Thr Leu Pro Phe Trp Ile His Tyr Val Arg Gly 85 90 95 His Asn Trp Val Phe Gly His Gly Met Cys Lys Leu Leu Ser Gly Phe 100 105 110 Tyr His Thr Gly Leu Tyr Ser Glu Ile Phe Phe Ile Ile Leu Leu Thr Λ 115 120 125 Ile Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Val Phe Ala Leu Arg Ala -1-3-0- ±4 u · Arg Thr Val Thr Phe Gly Val Ile Thr Ser Ile Val Thr Trp Gly Leu 145 150 155 160 Ala Val Leu Ala Ala Leu Pro Glu Phe Ile Phe Tyr Glu Thr Glu Glu ¹⁶⁵ 170 175 Leu Phe Glu Glu Thr Leu Cys Ser Ala Leu Tyr Pro Glu Asp Thr Val 180 185 190 Tyr Ser Trp Arg His Phe His Thr Leu Arg Met Thr Ile Phe Cys Leu 195 200 205 Val Leu Pro Leu Leu Val Met Ala Ile Cys Tyr Thr Gly Ile Ile Lys 210 . . . . 215 ..________ 220 Thr Leu Leu Arg Cys Pro Ser Lys Lys Lys Tyr Lys Ala Ile Arg Leu 225 230 235 240

   «I ·· > 9 9 9 9

   9 9

   9.9 λ

   Ile Phe Val Ile Met 245 Ala Val Phe Phe Ile 250 Phe Trp Thr Pro Tyr 255 Asn Val Ala Ile Leu 260 Leu Ser Ser Tyr Gin 265 Ser Ile Leu Phe Gly 270 Asn Asp Cys Glu Arg 275 Ser Lys His Leu Asp 280 Leu Val Met Leu Val 285 Thr Glu Val Ile P Ala 290 Tyr Ser His Cys Cys 295 Met Asn Pro Val Ile 300 Tyr Ala Phe Val Gly 3 05 Glu Arg Phe Arg Lys 310 Tyr Leu Arg His Phe 315 Phe His Arg His Leu 320 Leu Met His Leu Gly 325 Arg Tyr Ile Pro Phe 330 Leu Pro Ser Glu Lys 335 Leu Glu Arg Thr Ser 340 Ser Val Ser Pro Ser 345 Thr Ala Glu Pro Glu 350 Leu Ser

   Ile Val Phe 355 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 5:

   (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

   (A) DÉLKA: 34 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

   (A) JMÉNO/KLÍČ: misc_feature (B) JINÉ INFORMACE: /= V28degf2 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 5:

   GACGGATCCA TYGAYAGRTACCTGGCYATY GTCC . . 34 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:6:

   (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

   (A) DÉLKA: 32 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

   (A) JMÉNO/KLÍČ: misc_feature (B) JINÉ INFORMACE: /= V28degr2 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:6:

   GCTAAGCTTT TRTAGGGDGT CCAYAAGAGY AA 32 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:7:

   (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

   (A) DÉLKA: 21 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

   (A) JMÉNO/KLÍČ: misc_feature (B) JINÉ INFORMACE: /= 88c-r4 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:7:

   GATAAGCCTC ACAGCCCTGT G 21 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:8:

   (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

   (A) DÉLKA: 28 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

   (A) JMÉNO/KLÍČ: misc_feature (B) JINÉ INFORMACE: /= 88c-rlb (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:8:

   GCTAAGCTTG ATGACTATCT TTAATGTC 28 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:9:

   (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

   (A) DÉLKA: 27 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární « ·· * • ft ft· (ii) TYP MOLEKULY: DNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

   (A) JMÉNO/KLÍČ: misc_feature (B) JINÉ INFORMACE: /= 88-2B-3 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:9:

   CCCTCTAGAC TAAAACACAA TAGAGAG 27 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:10:

   (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

   (A) DÉLKA: 30 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

   (A) JMÉNO/KLÍČ: misc_feature (B) JINÉ INFORMACE: /= 88-2B-5 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:10:

   GCTAAGCTTA TCACAGGGAG AAGTGAAATG 30 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:11:

   (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

   (A) DÉLKA: 20 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

   (A) JMÉNO/KLÍČ: misc_feature (B) JINÉ INFORMACE: /= 88-2B-fl (Xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:11:

   AGTGCTAGCA GCTCTTCCTG 20 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:12:

   (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

   (A) DÉLKA: 20 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

   (A) JMÉNO/KLÍČ: misc_feature (B) JINÉ INFORMACE: /= 88-2B-rl (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:12:

   CAGCAGCGTT TTGATGATTC 20 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:13:

   (<

   (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

   (A) DÉLKA: 19 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

   (A) JMÉNO/KLÍČ: misc_feature (B) JINÉ INFORMACE: /= 88C-fl (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:13:

   TGTGTTTGCT TTAAAAGCC 19 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:14:

   (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

   (A) DÉLKA: 17 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární _? (ii) TYP MOLEKULY: DNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK: s „ .........._ (A) JMÉNO/KLÍČ: misc_feature____, (B) JINÉ INFORMACE: /= 88C-r3 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:14:

   TAAGCCTCAC AGCCCTG 17 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:15:

   (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

   (A) DÉLKA: 28 bázových párů • φ Φφφφ (Β) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

   (A) JMÉNO/KLÍČ: misc_feature (B) JINÉ INFORMACE: /= CCCKR1 (2)-5 Primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:15:

   CGTAAGCTTA GAGAAGCCGG GATGGGAA 28 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:16:

   (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

   (A) DÉLKA: 25 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (iv) KÓDUJÍCÍ: ANO (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

   (A) JMÉNO/KLÍČ: misc_feature (B) JINÉ INFORMACE: /= CCCKR-3 Primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:16:

   GCCTCTAGAG TCAGAGACCA GCAGA 25 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:17:

   (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

   (A) DÉLKA: 28 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:17:

   GACAAGCTTC ACAGGGTGGA ACAAGATG 28 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:18:

   (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

   (A) DÉLKA: 27 bázových párů • Φ

   4 Φ • ·ΦΦ φφφφ φ

   (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:18:

   GTCTCTAGAC CACTTGAGTC CGTGTCA 27 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:19:

   (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

   (A) DÉLKA: 1059 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:

   (A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 1..1056 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:19:

   ATG GAC TAT Tyr CAA GTG TCA Ser AGT Ser CCA ACC TAT Tyr 10 GAC Asp ATC Ile GAT Asp TAT Tyr TAT Tyr 15 ACA Thr 48 Met 1 Asp Gin Val 5. Pro Thr TCG GAA CCC TGC CAA AAA ATC AAT GTG AAA CAA ATC GCA GCC CGC CTC 96 Ser Glu Pro Cys Gin Lys Ile Asn Val Lys Gin Ile Ala Ala Arg Leu 20 25 30 CTG CCT CCG CTC TAC TCA CTG GTG TTC ATC TTT GGT TTT GTG GGC AAC 144 Leu Pro Pro Leu Tyr Ser Leu Val Phe Ile Phe Gly Phe. Val Gly Asn 35 40 45 ATA CTG GTC GTC CTC ATC CTG ATA AAC TGC AAA AGG CTG AAA AGC ATG 192 Ile Leu Val Val Leu Ile Leu Ile Asn Cys Lys Arg Leu Lys Ser Met . S 50 55 60 ACT GAC ATC TAC CTG CTC AAC CTG GCC ATC TCT GAC CTG CTT TTC CTT 240 Thr Asp Ile Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Ile Ser Asp Leu Leu Phe Leu 65 70 75 80 CTT ACT GTC CCC TTC TGG GCT CAC TAT GCT GCT GCC CAG TGG GAC TTT 28 8 Leu Thr Val Pro Phe Trp Ala His Tyr Ala Ala Ala Gin Trp Asp Phe 85 90 95 GGA AAT ACA ATG TGT CAA CTC TTG ACA GGG CTC TAT TTT ATA GGC TTC 336

   • ·

   Gly Asn Thr Met 100 Cys Gin Leu Leu Thr 105 TTC TCT GGA ATC TTC TTC ATC ATC CTC Phe Ser Gly Ile Phe Phe Ile Ile Leu 115 120 GCT ATC GTC CAT GCT GTG TTT GCT TTA Ala Ile Val His Ala Val Phe Ala Leu 130 135 GGG GTG GTG ACA AGT GTG ATC ACT TGG Gly Val Val Thr Ser Val Ile Thr Trp 145 150 CTC CCA GGA ATC ATC TTT ACC AGA TCT Leu Pro Gly Ile Ile Phe Thr Arg Ser Ss 165 ACC TGC AGC TCT CAT TTT CCA TAC AGT Thr Cys Ser Ser His Phe Pro Tyr Ser 180 185 TTT CAG ACA TTA AAG ATG GTC ATC TTG Phe Gin Thr Leu Lys Met Val Ile Leu 195 200 GTC ATG GTC ATC TGC TAC TCG GGA ATC Val Met Val Ile Cys Tyr Ser Gly Ile 210 215 CGA AAC GAG AAG AAG AGG CAC AGG GCT Arg Asn Glu Lys Lys Arg His Arg Ala 225 230 ATG ATT GTT TAT TTT CTC TTG TGG GCT Met Ile Val Tyr Phe Leu Leu Trp Ala 245 CTG AAC ACC TTC CAG GAA TTC TTT GGC Leu Asn Thr Phe Gin Clu Phe Phe Gly 260 265 AAC AGG TTG GAC CAA GCC ATG CAG GTG Asn Arg Leu Asp Gin Ala Met Gin Val = -275 ·'··-’ -.....··· -· - -·- --- 2 80 —- -·· CAC TGC TGC ATC AAC CCC ATC ATC TAT His Cys Cys Ile Asn Pro Ile Ile Tyr 290 295 AGA AAC TAC CTC TTA GTC TTC TTC CAA Arg Asn Tyr Leu Leu Val Phe Phe Gin 305 310 TGC AAA TGC TGT TCC ATT TTC CAG CAA Cys Lys Cys Cys Ser Ile Phe Gin Gin 325 TCA GTT TAC ACC CGA TCC ACT GGG GAG Ser Val Tyr Thr Arg Ser Thr Gly Glu 340 345

   TGA *· ·'· 44 ···· • · * 11 ·

   • 11 ί 119 - 70 i :: « '· fl • >4 · 1 « ' 4 Phe ♦ 4 • • 4 ·· 4 Ile 110 4 « 4 « ♦ *J 4 Gly * 4 4 4 11 111 1 1 4 « · 4 4 4' 4' Phe Gly Leu Tyr CTG ACA ATC GAT AGG TAC CTG 384 Leu Thr Ile Asp 125 Arg Tyr Leu AAA GCC AGG ACA GTC ACC TTT 432 Lys Ala Arg 140 Thr Val Thr Phe GTG GTG GCT GTG TTT GCC TCT 480 Val Val 155 Ala Val Phe Ala Ser 160 CAG AGA GAA GGT CTT CAT TAC 528 Gin 170 Arg Glu Gly Leu His 175 Tyr CAG TAT CAA TTC TGG AAG AAT 576 Gin Tyr Gin Phe Trp 190 Lys Asn GGG CTG GTC CTG CCG CTG CTT 624 Gly Leu Val Leu 205 Pro Leu Leu CTG AAA ACT CTG CTT CGG TGT 672 Leu Lys Thr 220 Leu Leu Arg Cys GTG AGG CTT ATC TTC ACC ATC 720 Val Arg 235 Leu Ile Phe Thr Ile 240 CCC TAC AAC ATT GTC CTT CTC 768 Pro 250 Tyr Asn Ile Val Leu 255 Leu CTG AAT AAT TGC AGT AGC TCT 816 Leu Asn Asn Cys Ser 270 Ser Ser ACA GAG ACT CTT GGG ATG ACA 864 Thr Glu Thr Leu 285 Gly Met Thr GCC TTT GTC GGG GAG AAG TTC 912 Ala Phe Val 300 Gly Glu Lys Phe AAG CAC ATT GCC AAA CGC TTC 96 0 Lys His 315 Ile Ala Lys Arg Phe 320 GAG GCT CCC GAG CGA GCA AGT 1008 Glu 330 Ala Pro Glu Arg Ala 335 Ser CAG GAA ATA TCT GTG GGC TTG 1056 Gin Glu Ile Ser Val Gly Leu_

   10 5 5

   350

   49 44 k · · a i · ·<

   ··· 4 a • · a

   4 4 '·'· »

   4' «♦ · • · 4 • · ··· • · · a ι · · a ·· 4 4

   - 71 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:20:

   (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

   (A) DÉLKA: 352 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein

   < (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:20: Met Asp Tyr 1 '9 Gin Val Ser 5 Ser Pro Thr Tyr Asp Ile Asp Tyr Tyr Thr 10 15 Ser Glu Pro Cys Gin Lys 20 Ile Asn Val Lys Gin Ile Ala Ala Arg Leu 25 3 0 Leu Pro Pro 35 Leu Tyr Ser Leu Val Phe Ile Phe Gly Phe Val Gly Asn 40 45 Ile Leu Val 50 Val Leu Ile Leu Ile Asn Cys Lys Arg Leu Lys Ser Met 55 60 Thr Asp Ile 65 Tyr Leu Leu 70 Asn Leu Ala Ile Ser Asp Leu Leu Phe Leu 75 80 Leu Thr Val Pro Phe Trp 85 Ala His Tyr Ala Ala Ala Gin Trp Asp Phe 90 95 Gly Asn Thr Met Cys Gin 100 Leu Leu Thr Gly Leu Tyr Phe Ile Gly Phe 105 110 Phe Ser Gly 115 Ile Phe Phe Ile Ile Leu Leu Thr Ile Asp Arg Tyr Leu 120 125 Ala Ile Val 13 0 His Ala Val Phe Ala Leu Lys Ala Arg Thr Val Thr Phe ^{135 140} Glý Val Val 145 Thr Ser Val 150 Ile Thr Trp Val Val Ala Val Phe Ala Ser 155 160 Leu Pro¹ Gly Tle Ile Phe 165 Thr Arg Ser Gin Arg.....Glu -Gly Leu His Tyr 170 175 Thr Cys Ser Ser His Phe 180 Pro Tyr Ser Gin Tyr Gin Phe Trp Lys Asn 185 _t 190 Phe Gin Thr 195 Leu Lys Met Val Ile Leu Gly Leu Val Leu Pro Leu Leu 200 205 Val Met Val 210 Ile Cys Tyr Ser Gly Ile Leu Lys Thr Leu Leu Arg Cys 215 220 Arg Asn Glu 225 Lys Lys Arg 230 His Arg Ala Val Arg Leu Ile Phe Thr Ile 235 240 Met Ile Val Tyr Phe Leu 245 Leu Trp Ala Pro Tyr Asn Ile Val Leu Leu 250 . ‘ ’ 255 Leu Asn Thr Phe Gin Glu < /Λ Phe Phe Gly Leu Asn Asn Cys Ser Ser Ser

   . ·· .#-· ·· ···· • · · ·φ· · • · · · ·

   Asn Arg Leu Asp Gin Ala Met Gin Val Thr Glu Thr Leu ·· · Gly Met ·· · Thr 275 280 285 His Cys Cys Ile Asn Pro Ile Ile Tyr Ala Phe Val Gly Glu Lys Phe 290 295 300 Arg Asn Tyr Leu Leu Val Phe Phe Gin Lys His Ile Ala Lys Arg Phe 305 310 315 320 Cys Lys Cys Cys Ser Ile Phe Gin Gin Glu Ala Pro Glu Arg Ala Ser 325 330 335 Ser Val Tyr Thr Arg Ser Thr Gly Glu Gin Glu Ile Ser Val Gly Leu 340 345 350

   TV 26 <<0-47 ·· ·· ·· ♦···

   9 · · .999 • · 4 4 ··

   PATENT O V É NÁROKY

   1. Purifikovaný a izolovaný polynukleotid kódující aminokyselinovou sekvenci chemokinového receptoru 88-2B uvedenou v SEQ ID NO:4.

   2. Polynukleotid podle nároku 1, kterým je DNA.

   3. Polynukleotid podle nároku 2, kterým je genomová

   DNA.

   4. Polynukleotid podle nároku 2, kterým je cDNA.

   5. Polynukleotid podle nároku 1, kterým je plně nebo z části chemicky syntetizovaná DNA.

   6. RNA transkript polynukleotidu podle nároku 2.

   7. cDNA podle nároku 4 zahrnující DNA ze sekvencí SEQ ID NO:3.

   8. Biologicky funkční DNA vektor obsahující DNA podle nároku 2.

   9. Vektor podle nároku 8, kde DNA je operativně připojena k sekvenci řídící expresi DNA.

   HQgtitelská buňka_ stabilně trans formovaná nebo transfekovaná DNA podle nároku 1 způsobem umožňujícím expresi této DNA.

   11. Způsob produkce polypeptidů 88-2B, vyznačuj ícíse tím, že zahrnuje stupeň pěstování hostitelské buňky podle nároku 10 ve vhodném ·· ·· • 4 · živném médiu a stupeň izolace tohoto polypeptidu z buňky nebo média.

   12. Polynukleotid kódující polypeptid 88-2B, který hybridizuje za stringentních hybridizačnich podmínek k polynukleotidu se sekvencí SEQ ID NO:3.

   13. Purifikovaný a izolovaný polypeptid zahrnující aminokyselinovou sekvenci chemokinového receptorů 88-2B uvedenou v SEQ ID NO:4.

   14. Protilátkový produkt, který specificky váže polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci 88-2B uvedenou v SEQ ID NO:4.

   15. Hybridom produkující protilátkový produkt podle nároku 14.

   16. Purifikovaný a izolovaný polynukleotid kódující aminokyselinovou sekvenci chemokinového receptorů 88C uvedenou v SEQ ID NO:2.

   17. Polynukleotid podle nároku 16, kterým je DNA.

   18. Polynukleotid podle nároku 17, kterým je genomová

   DNA.

   19. Polynukleotid podle nároku 17, kterým je cDNA.

   20. Polynukleotid podle nároku 16, kterým je plně nebo z části chemicky syntetizovaná DNA.

   21. RNA transkript polynukleotidu podle nároku 17.

   9 9 '999 9

   - 75 999 9 9 9

   99 «

   22. cDNA podle nároku 19 zahrnující DNA ze sekvencí SEQ ID NO:1.

   23. Biologicky funkční DNA vektor obsahující DNA podle nároku 17.

   24. Vektor podle nároku 23, kde DNA je operativně připojena k sekvenci řídící expresi DNA.

   25. Hostitelská buňka stabilně transformovaná nebo transfekovaná DNA podle nároku 16 způsobem umožňujícím expresi této DNA.

   26. Způsob produkce polypeptidů 88C, vyznačuj ícíse tím, že zahrnuje stupeň pěstování hostitelské buňky podle nároku 25 ve vhodném živném médiu a stupeň izolace tohoto polypeptidů z buňky nebo média.

   27. Polynukleotid kódující polypeptid 88C, který hybridizuje za stringentních hybridizačních podmínek k polynukleotidu se sekvencí SEQ ID NO:1.

   28. Purifikovaný a izolovaný polypeptid zahrnující aminokyselinovou sekvenci chemokinového receptorů 88C uvedenou v SEQ ID NO:2.

   29. Protilátkový produkt, který specificky váže · polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci 88C uvedenou v SEQ ID NO:2.

   30. Hybridom produkující protilátkový produkt podle nároku 29.

   31. Hybridomální buněčná linie 227K.

   • Φ·ΦΦ • Φ Φ φ · • ···· · φ • · · φφφ φ φφφφ φ · ·· φφ φφ • Φ φ

   φ φφφ

   32. Hybridomální buněčná linie 227M. 33 . Hybridomální buněčná linie 227N. 34. Hybridomální buněčná linie 227P. 35. Hybridomální buněčná linie 227R.

   36. Purifikovaný a izolovaný polynukleotid kódující aminokyselinovou sekvenci chemokinového receptoru 88C makaka uvedenou v SEQ ID NO:20.

   37. Polynukleotid podle nároku 36, kterým je DNA. 38. DNA. Polynukleotid podle nároku 37, kterým je genomová 39. Polynukleotid podle nároku 37, kterým je cDNA. 40. nebo z části Polynukleotid podle nároku chemicky syntetizovaná DNA. 36, kterým je plně

   41. RNA transkript polynukleotidu podle nároku 37.

   42. cDNA podle nároku 39 zahrnující DNA ze sekvencí SEQ ID N0:l.

   43 . Bio log icky funkční DNA vektor obs ahujíc i DNA podle nároku 37.

   44. Vektor podle nároku 43, kde DNA je operativně připojena k sekvenci řídící expresi DNA.

   45. Hostitelská buňka stabilně transformovaná nebo transfekované DNA podle nároku 36 způsobem umožňujícím ·· ···· ·· ··

   ΊΊ ·· ·· • · · • · ♦ ·· • · · <

   • · · · ·> ·· expresi této DNA.

   46. Způsob produkce polypeptidu 88C makaka, vyznačuj ícíse tím, že zahrnuje stupeň pěstování hostitelské buňky podle nároku 45 ve vhodném živném médiu a stupeň izolace tohoto polypeptidu z buňky nebo média.

   47. Polynukleotid kódující polypeptid 88C, který hybridizuje za stringentních hybridizačních podmínek k polynukleotidu se sekvencí SEQ ID NO:19.

   48. Purifikovaný a izolovaný polypeptid zahrnující aminokyselinovou sekvenci chemokinového receptoru 88C makaka uvedenou v SEQ ID NO:20.

   49. Protilátkový produkt, který specificky váže polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci 88C uvedenou v SEQ ID NO:20.

   50. Hybridom produkující protilátkový produkt podle nároku 49.