ES2341371T3 - Metodo relacionado con el receptor de quimiocinas 88c. - Google Patents

Abstract

Método para identificar un ligando capaz de interactuar con el receptor de quimiocinas 88C, que se caracteriza por la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:2, comprendiendo dicho método las etapas de: (a) proporcionar una célula huésped que expresa dicho receptor, o una preparación de membrana que incluye dicho receptor, (b) poner en contacto e incubar dicho receptor, con un ligando del mismo, y (c) identificar la presencia de un ligando interactuado específicamente con dicho receptor.

Description

Método relacionado con el receptor de quimiocinas 88C.

La presente invención se refiere en general a vías de transducción de señales. Especialmente, la presente invención se refiere a receptores de quimiocinas, ácidos nucleicos que codifican receptores de quimiocinas, ligandos de receptores de quimiocinas, moduladores de la actividad del receptor de quimiocinas, anticuerpos que reconocen las quimiocinas y receptores de quimiocinas, métodos para identificar los moduladores y ligandos de receptores de quimiocinas, métodos para producir receptores de quimiocinas, así como métodos para producir anticuerpos que reconocen los receptores de quimiocinas.

Recientes avances en la biología molecular condujeron a una apreciación del papel central que desempeñan las vías de transducción de señales en los procesos biológicos. Estas vías comprenden un medio central por el cual las células individuales en un organismo multicelular se comunican, coordinando por este medio los procesos biológicos. Véase Springer, Cell 76:301-314 (1994), Tabla I como modelo. Una ramificación de las vías de transducción de señales, definida por la participación intracelular de proteínas de unión al nucleótido de guanina (proteínas-G), afecta a un amplio rango de procesos biológicos.

Lewin, GENES V319-348 (1994)exponen en general vías de transducción de señales a proteína G que implican, como mínimo, los siguientes componentes: una señal extracelular (por ejemplo, neurotransmisores, hormonas peptídicas, moléculas orgánicas, luz, u odorantes), receptor reconocedor de señales (receptor acoplado a proteína G, revisado en Probst y col., DNA and Cell Biology 11:1-20 [1992] y conocido también por GPR o GPCR), y una proteína intracelular, heterotrimérica de unión a GTP, o proteína G. En particular, estas vías son de gran interés debido a su papel en la regulación de glóbulos blancos o tráfico leucocitario.

Los leucocitos comprenden un grupo de tipos de células sanguíneas móviles que incluyen los granulocitos (es decir, neutrófilos, basófilos y eosinófilos), linfocitos y monocitos. Cuando se movilizan y activan, estas células están involucradas esencialmente en la defensa del cuerpo contra una materia extraña. Esta tarea es complicada por la diversidad de procesos normales y patológicos en los que participan los leucocitos. Por ejemplo, la función de los leucocitos en la respuesta inflamatoria normal a la infección. Los leucocitos también intervienen en varias inflamaciones patológicas. Como resumen, véase Schall y col., Curr. Opin. Immunol. 6:865-873 (1994). Además, cada uno de estos procesos puede involucrar contribuciones únicas, en grado, tipo y duración, de parte de cada uno de los tipos de células leucocitarias.

Al estudiar estas reacciones inmunes, los investigadores se concentraron inicialmente en las señales que actúan sobre los leucocitos, razonando que se pediría una señal para obtener cualquier forma de respuesta. Murphy, Ann. Rev. Immunol. 12:593-633 (1994) ha revisado los miembros de un grupo importante de señales leucocitarias, las señales peptídicas. Un tipo de señal peptídica comprende las quimiocinas (citocinas quimioatractivas) denominadas intercrinas en Oppenheim y col., Anni. Rev. Immunol. 9:617-648 (1991). Además de Oppenheim y col., Baggiolini y col., Advances in Immunol. 55:97-179 (1994), documentan el número creciente de quimiocinas que han sido identificadas y sometidas a análisis genéticos y bioquímicos.

Comparaciones de las secuencias de aminoácidos de las quimiocinas conocidas condujeron a un esquema de clasificación que divide las quimiocinas en dos grupos: el grupo \alpha, caracterizado por un solo aminoácido que separa las dos primeras cisteinas (CXC; terminal N como referente) y el grupo \beta, en el que estas cisteinas son adyacentes (CC). Véase Baggiolini y col., más arriba. Se han descubierto correlaciones entre las quimiocinas y los tipos particulares de células leucocitarias que responden a aquellas señales. Schall y col., tal como se menciona anteriormente, han reportado que la quimiocinas CXC afectan en general a los neutrófilos; las quimiocinas CC tienden a afectar a los monocitos, linfocitos, basófilos y eosinófilos. Por ejemplo, Baggiolini y col., mencionados más arriba, expusieron que RANTES, una quimiocina CC, funciona como quimioatractivo para los monocitos, linfocitos (es decir, células T de memoria), basófilos, y eosinófilos, pero no para los neutrófilos, aunque provoca la liberación de la histamina de los
basófilos.

Cocchi y col., Science, 270: 1811-1815 (1995) demostraron recientemente que las quimiocinas son supresores de la proliferación del VIH. Cocchi y col., demostraron que RANTES, MIP-1\alpha, y MIP-1\beta suprimían el VIH-1, VIH-2 e infección por VIS de una línea celular CD4^{+} designada PM1 y de las células mononucleares primarias de sangre periférica humana.

Sin embargo, recientemente, la atención se ha vuelto hacia los receptores celulares que unen las quimiocinas, debido a que las quimiocinas extracelulares parecen contactar las células de forma indiscriminada, y por lo tanto carecen de la especificidad necesaria para regular los tipos individuales de células leucocitarias.

Murphy, tal como se menciona anteriormente, reportó que la superfamilia GPCR de receptores incluye la familia de receptores de quimiocinas. La estructura típica de receptores de quimiocinas incluye un dominio de unión de quimiocinas extracelulares localizado cerca del terminal N, seguido de siete regiones espaciadas de aminoácidos predominantemente hidrofóbicos capaces de formar hélices \alpha transmembrana. Entre cada uno de los dominios \alpha-helicoidales se encuentran dominios hidrofilicos localizados, de forma alterna, en los espacios intra o extra celulares. Estas características dan una conformación de serpentina al receptor de quimiocinas incrustado en la membrana. El tercer bucle intracelular interactúa típicamente con las proteínas G. Murphy, tal como se menciona anteriormente, notó que el terminal carboxilo intracelular es capaz también de interactuar con las proteínas G.

Los primeros receptores de quimiocinas que tuvieron que ser analizados por técnicas de clonación molecular fueron los dos receptores de neutrófilos para la IL8 humana, una quimiocina CXC. Holmes y col., Science 253:178-1280 (1991) y Murphy y col., Science 253:1280-1283 (1991), reportaron la clonación de estos dos receptores para la IL8. Lee y col., J. Biol. Chem. 267: 16283-16287 (1992), analizaron los ADNc que codifican estos receptores y encontraron un 77% de identidad de aminoácidos entre los receptores codificados, con cada receptor que mostraba características de la familia de receptores acoplados a proteína G. Uno de estos receptores es especifico de la IL-8, mientras que el otro se une y hace señales en respuesta a IL-8, gro/MGSA, y NAP-2. La manipulación genética de los genes que codifican los receptores de IL-8 ha contribuido a nuestra comprensión de los papeles biológicos desempeñados por estos receptores. Por ejemplo, Cacalano y col., Science 265:682-684 (1994) reportaron que la deleción del homólogo del receptor de IL-8 en el ratón resultaba en un fenotipo pleiotrópico que implicaba linfadenopatia y esplenomegalia. Además, un estudio sobre mutaciones de sentido erróneo descritas en Leong y col., J. Biol. Chem. 269:19343-19348 (1994) descubrió aminoácidos en el receptor de IL-8 que eran críticos para la unión de IL-8. Experimentos de intercambio de dominios expuestos en Murphy, tal como se menciona más arriba, implicaban el dominio extracelular amino terminal como un determinante de la especificidad de unión.

Varios receptores para las quimiocinas CC también han sido identificados y clonados. CCCKR1 se une tanto a MIP-1\alpha como a RANTES y provoca el flujo de iones de calcio intracelular en respuesta a ambos ligandos. Charo y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 91:2752-2756 (1994) reportaron que otro receptor de quimiocina CC, el MCP-R1 (CCCKR2), es codificado por un único gen que produce dos variantes de empalme que difieren en sus dominios carboxilo terminal. Este receptor se une y responde a MCP-3 además de MCP-1.

Se ha identificado también un receptor promiscuo que se une a las quimiocinas tanto CXC como CC. Este receptor se identificó originalmente en células de glóbulos rojos y Horuk y col., Science 261:1182-1184 (1993) reporta que se une a IL-8, NAP-2, GRO\alpha, RANTES y MCP-1. El receptor de quimiocinas de los eritrocitos comparte aproximadamente el 25% de identidad con otros receptores de quimiocinas y puede ayudar a regular los niveles circulantes de quimiocinas o ayudar en la presentación de quimiocinas a sus dianas. Además de unir quimiocinas, se ha demostrado también que el receptor de quimiocinas de los eritrocitos es el receptor para el plasmodium vivax, mayor causa de malaria (id.). Otro receptor acoplado a proteína G que está estrechamente relacionado con los receptores de quimiocinas, receptor del factor de activación plaquetaria, ha demostrado ser también el receptor de un patógeno humano, la bacteria Streptococcus pneumoniae (Cundell y col., Nature 377:435-438 (1995)).

Además de los receptores de quimiocinas de mamíferos, se han identificado dos homólogos de receptores de quimiocinas virales. Ahuja y col., J. Biol. Chem. 268:20691-20694 (1993) describen un producto genético procedente de Herpesvirus saimiri que comparte aproximadamente un 30% de identidad con los receptores de IL-8 y se une a quimiocinas CXC. Neote y col., Cell, 72:415-425 (1993) reporta que el citomegalovirus humano contiene un gen que codifica un receptor que comparte aproximadamente un 30% de identidad con los receptores de quimiocinas CC, el cual se une a MIP-1\alpha, MIP-1\beta, MCP-1, y RANTES. Estos receptores virales pueden afectar al papel normal de las quimiocinas y proporcionan una ventaja patológica selectiva para el virus.

Debido a la amplia diversidad de las quimiocinas y sus actividades, existen numerosos receptores para las quimiocinas. Los receptores que han sido caracterizados representan solamente una fracción del complemento total de los receptores de quimiocinas. Por lo tanto sigue existiendo una necesidad en la técnica en la identificación de receptores adicionales de quimiocinas. La disponibilidad de estos nuevos receptores proporcionará herramientas para el desarrollo de moduladores terapéuticos de la quimiocina o de la función de los receptores de quimiocinas. La presente invención considera que dichos moduladores son útiles como productos terapéuticos para el tratamiento de la ateroesclerosis, artritis reumatoide, supresión de crecimiento tumoral, asma, infecciones virales, y otros estados inflamatorios. Como alternativa, se consideran como productos terapéuticos, fragmentos o variantes de los receptores de quimiocinas, o anticuerpos que reconocen aquellos receptores.

Se descubren ácidos nucleicos purificados y aislados que codifican receptores de quimiocinas que intervienen en el tráfico leucocitario. Los polinucleótidos (hebras tanto sentido como antisentido de los mismos) incluyen los ADN, ADNc y ARN genómicos así como los ácidos nucleicos completa o parcialmente sintéticos. Los polinucleótidos preferentes incluyen el ADN que codifica el receptor de quimiocinas 88-2B que se expone en la SEQ ID NO: 1, y los ADN que se hibridizan con aquellos ADN bajo condiciones de hibridación astringentes estándar, o que se hibridizarian pero para la redundancia del código genético. Los ejemplos de condiciones de hibridación astringentes son como sigue: hibridación a 42ºC en formamida al 50%, 5X SSC, fosfato de sodio 20 mM, pH 6,8 y lavado en 0,2 X SSC a 55ºC. Los especialistas en la técnica entienden que variaciones de estas condiciones tienen lugar sobre la base de la longitud y del contenido en nucleótidos GC de las secuencias que deben ser hibridizadas. Fórmulas estándar en la técnica son adecuadas para determinar las condiciones exactas de hibridación. Véase Sambrook y col., \NAK\NAK 9,47-9,51 en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989). Se descubren asimismo polinucleótidos que codifican los dominios de 88-2B o 88C, por ejemplo, polinucleótidos que codifican uno o más dominios extracelulares de una proteína o de otros fragmentos biológicamente activos de la misma. Los dominios extracelulares 88-2B corresponden a la SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4 en los residuos de aminoácidos 1-36, 93-107, 171-196 y 263-284. Los dominios extracelulares de 88-2B son codificados por secuencias de polinucleótidos que corresponden a la SEQ ID NO: 3 en los nucleótidos 362-469, 638-682, 872-949 y 1148-1213. Los dominios extracelulares de 88C corresponden a la SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2 en los residuos de aminoácidos 1-32, 89-112, 166-191 y 259-280. Los dominios extracelulares 88C son codificados por secuencias de polinucleótidos que corresponden a la SEQ ID NO:1 en los nucleótidos 55-150, 319-390, 550-627 y 829-894. Se descubren también polinucleótidos que codifican dominios intracelulares de estos receptores de quimiocinas. Los dominios intracelulares de 88-2B incluyen los aminoácidos 60-71, 131-151, 219-240 y 306-355 de la SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4. Aquellos dominios son codificados por secuencias de polinucleótidos que corresponden a la SEQ ID NO:3 en los nucleótidos 539-574, 752-814, 1016-1081 y 1277-1426, respectivamente. Los dominios intracelulares 88C incluyen los residuos de aminoácidos 56-67, 125-145, 213-235 y 301-352 de la SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2. Los dominios intracelulares de 88C son codificados por secuencias de polinucleótidos que corresponden a la SEQ ID NO: en los nucleótidos 220-255, 427-489, 691-759 y 955-1110. Los péptidos que corresponden a uno o más de los dominios extracelulares o intracelulares, o los anticuerpos contra aquellos péptidos, se consideran como moduladores de las actividades del receptor, especialmente actividades de unión a proteína G y del ligando de los receptores.

Las secuencias de nucleótidos se pueden utilizar también para designar los oligonucleótidos a utilizar como sondas marcadas para aislar los ADN genómicos que codifican 88-2B o 88C en condiciones de hibridación astringentes (es decir, por análisis Southern y metodologías de Reacción en Cadena de la Polimerasa). Además, estas sondas de oligonucleótidos se pueden utilizar para detectar alelos particulares de los genes que codifican 88-2B o 88C, facilitando tanto el diagnóstico como los tratamientos por terapia génica de estados de enfermedad asociados a alelos particulares. Además, estos oligonucleótidos se pueden utilizar para cambiar la genética del receptor de quimiocina para facilitar la identificación de los moduladores del receptor de quimiocina. Asimismo, las secuencias de nucleótidos se pueden utilizar para diseñar elementos genéticos antisentido de uso en la exploración o modificación de la genética y expresión de 88-2B o 88C. Se descubren además réplicas biológicas (es decir, copias de ADN aislados elaborados in vivo o in vitro) y transcripciones de ARN de los ADN mencionados aquí. Se descubren también construcciones recombinantes de replicación autónoma tales como plásmido, vectores de ácidos nucleicos virales y cromosomales (por ejemplo, YAC) que incorporan efectivamente los polinucleótidos 88-2B o 88C, y, en particular, vectores en los que el ADN que codifica eficazmente 88-2B o 88C está enlazado de forma operativa a una o más secuencias de control de expresión endógena o heteróloga.

Los receptores 88-2B y 88C se pueden producir de forma natural, recombinante o sintética. Las células huésped (procarióticas o eucarióticas) transformadas o transfectadas con los polinucleótidos de la invención por medio de métodos estándar se pueden utilizar para expresar los receptores de quimiocinas 88-2B y 88C. Más allá de los productos genéticos intactos 88-2B o 88C, se descubren fragmentos biológicamente activos de 88-2B o 88C, análogos de 88-2B o 88C, y péptidos sintéticos procedentes de las secuencias de aminoácidos de 88-2B, establecidos en la SEQ ID NO: 4, o de 88C, establecidos en la SEQ ID NO:2. Además, el producto genético 88-2B o 88C, o un fragmento biológicamente activo de ambos productos genéticos, cuando se produce en una célula eucariótica, puede ser modificado de forma postranslacional (por ejemplo, a través de la formación del enlace disulfuro, glicosilación, fosforilación, miristoilación, palmitoilación, acetilación, etc.). Se descubren además los productos genéticos 88-2B y 88C, o los fragmentos biológicamente activos de los mismos, en conformaciones monoméricas, homomultiméricas o heteromultiméricas.

Se descubren también productos de anticuerpos capaces de unirse específicamente a los receptores de quimiocinas 88-2B o 88C. Los productos de anticuerpos son generados por medio de métodos estándar en la técnica que utilizan los receptores recombinantes 88-2B o 88C, péptidos sintéticos o fragmentos de péptidos de los receptores 88-2B o 88C, células huésped que expresan 88-2B o 88C en sus superficies, o receptores 88-2B o 88C purificados a partir de fuentes naturales como los inmunógenos. Los productos de anticuerpos pueden incluir anticuerpos monoclonales o anticuerpos policlonales de cualquier fuente o subtipo. Además, se descubren anticuerpos monoméricos, homomultiméricos y heteromultiméricos, así como los fragmentos de los mismos. Además, se descubren anticuerpos injertados en CDR, anticuerpos "humanizados", y otros productos de anticuerpos modificados que conservan la capacidad de unirse específicamente a un receptor de quimiocina.

Se descubre también el uso de productos de anticuerpos para la detección del producto genético 88-2B o 88C, sus análogos, o los fragmentos biológicamente activos del mismo. Por ejemplo, se pueden utilizar los productos de anticuerpos en procedimientos de diagnóstico diseñados para revelar correlaciones entre la expresión de 88-2B o de 88C, así como varios estados normales o patológicos. Además, los productos de anticuerpos se pueden emplear para diagnosticar variaciones especificas de los tejidos en la expresión de 88-2B o 88C, sus análogos o los fragmentos biológicamente activos de los mismos. Los productos de anticuerpos específicos de los receptores de quimiocina 88-2B y 88C pueden actuar también como moduladores de las actividades del receptor. En otro aspecto, los anticuerpos para los receptores 88-2B o 88C son útiles en propósitos terapéuticos.

Se proporcionan ensayos de ligandos capaces de interactuar con los receptores de quimiocinas tal como se descubren aquí. Estos ensayos pueden implicar la detección directa de la actividad del receptor de quimiocinas, por ejemplo, controlando la unión de un ligando marcado al receptor. Además, estos ensayos se pueden utilizar para evaluar indirectamente la interacción del ligando con el receptor de quimiocinas. Tal como se emplea aquí, el término "ligando" comprende moléculas que son agonistas y antagonistas de 88-2B o 88C, y otras moléculas que se unen a los receptores.

La detección directa de la unión del ligando a un receptor de quimiocina puede lograrse mediante el ensayo siguiente. Los compuestos de la prueba (es decir, ligandos putativos) están marcados de forma detectable (por ejemplo, radioyodados). Los compuestos de la prueba marcados de forma detectable se ponen entonces en contacto con preparaciones de membranas que contienen un receptor de quimiocina de la invención. Preferentemente, las membranas se preparan a partir de células huésped que expresan los receptores de quimiocinas de la invención procedentes de vectores recombinantes. Después de un periodo de incubación para facilitar el contacto entre los receptores de quimiocinas incrustados en la membrana y los compuestos de prueba marcados de forma detectable, se recoge el material de membrana en filtros por medio de la filtración al vacío. Entonces se cuantifica el marcador detectable asociado a los filtros. Por ejemplo, los radiomarcadores se cuantifican utilizando la espectrofotometría de escintilación líquida. Por medio de esta técnica, se identifican los ligandos que se unen a los receptores de quimiocina. Para confirmar la identificación de un ligando, se expone un compuesto de prueba marcado de forma detectable a una preparación de membrana que exhibe un receptor de quimiocinas en presencia de cantidades crecientes del compuesto de prueba en un estado no marcado. Una reducción progresiva en el nivel de marca asociada a filtro a medida que uno añade cantidades crecientes de compuesto de prueba no marcado confirma la identificación de aquel ligando.

Los agonistas son ligandos que se unen al receptor y provocan la transducción de señales intracelulares y los antagonistas son ligandos que se unen al receptor pero que no provocan la transducción de señales intracelulares. La determinación en cuanto a saber si un ligando particular es un agonista o un antagonista se puede realizar, por ejemplo, por medio del ensayo de las vías de transducción de señales acopladas a proteína G. La activación de estas vías se puede determinar midiendo el flujo intracelular de Ca^{++}, la actividad de fosfolipasa C o la actividad de adenilil ciclasa, además de otros ensayos (véase los Ejemplos 5 y 6).

Tal como se expone en detalle en los Ejemplos incluidos aquí, las quimiocinas que se unen al receptor 88C incluyen RANTES, MIP-1\alpha y MIP-1\beta y las quimiocinas que se unen al receptor 88-2B incluyen los ensayos RANTES, similares a los que se utilizan para identificar ligandos. La preparación de membrana que exhibe un receptor de quimiocinas se expone a una cantidad constante y conocida de un ligando funcional marcado de forma detectable. Además, el receptor de quimiocinas unido a membrana se expone también a una cantidad creciente de un compuesto de prueba susceptible de modular la actividad de aquel receptor de quimiocinas. Si los niveles del marcador asociado a filtro están en correlación con la cantidad de compuesto de prueba, aquel compuesto es un modulador de la actividad del receptor de quimiocinas. Si el nivel del marcador asociado a filtro aumenta con las cantidades crecientes del compuesto de prueba, se ha identificado un activador. Por otro lado, si el nivel de marcador asociado a filtro varia inversamente a la cantidad de compuesto de prueba, se ha identificado un inhibidor de la actividad del receptor de quimiocinas. De esta forma, las pruebas de moduladores de la unión de receptores permite la exploración rápida de numerosos moduladores putativos, lo mismo que los grupos conteniendo muchos moduladores potenciales se pueden someter a prueba simultáneamente en la misma reacción.

Los ensayos indirectos para la unión del receptor implican mediciones de la concentración o del nivel de actividad de cualquiera de los componentes encontrados en la vía relevante de transducción de señales. La activación del receptor de quimiocinas se asocia a menudo a un flujo intracelular de Ca^{++}. Las células que expresan receptores de quimiocinas se pueden cargar con un tinte sensible al calcio. A la activación del receptor expresado, un flujo de Ca^{++} seria detectable de forma espectrofotométrica por el tinte. Como alternativa, el flujo de Ca^{++} podría ser detectado microscópicamente. Se pueden realizar ensayos paralelos, mediante cualquiera de estas técnicas, en presencia y ausencia de ligandos putativos. Por ejemplo, por medio del ensayo microscópico para el flujo de Ca^{++}, RANTES, se identificó una quimiocina CC como ligando del receptor de quimiocina 88-2B. Los especialistas en la técnica reconocerán que estos ensayos sirven también para identificar y controlar la purificación de los moduladores de actividad del receptor. Los activadores e inhibidores del receptor activarán o inhibirán, respectivamente, la interacción de los receptores con sus ligandos en estos ensayos.

Como alternativa, la asociación de los receptores de quimiocinas a las proteínas G da la oportunidad de evaluar la actividad de los receptores mediante el control de las actividades de la proteína G. Una actividad característica de las proteínas G, la hidrólisis del GTP, se puede controlar utilizando, por ejemplo, GTP marcado ^{12}P.

Las proteínas G afectan también a una variedad de otras moléculas a través de su participación en las vías de transducción de señales. Por ejemplo, las moléculas efectoras de proteínas G incluyen la adenilil ciclasa, fosfolipasa C, canales iónicos, y fosfodiesterasas. Se pueden utilizar ensayos centrados en cualquiera de estos efectores para controlar la actividad del receptor de quimiocinas inducida por la unión del ligando en una célula huésped que expresa tanto el receptor de quimiocinas de interés como que se pone en contacto con un ligando apropiado. Por ejemplo, un método mediante el cual la actividad de los receptores de quimiocinas puede ser detectada implica la medición de la actividad fosfolipasa C. En este ensayo, se detecta la producción de fosfatos radiomarcados de inositol por células huésped que expresan un receptor de quimiocinas en presencia de un agonista. La detección de la actividad fosfolipasa puede necesitar la cotransfección con ADN que codifica una proteína G exógena. Cuando se requiere la cotransfección, este ensayo se puede realizar por cotransfección del ADN con la proteína G quimérica, por ejemplo, Gqi5 (Conklin y col., Nature 363:274-276 (1993), con ADN de 88-2B o 88C y la detección de la producción de fosfoinositol cuando la célula cotransfectada está expuesta a un agonista del receptor 88-2B o 88C. Los especialistas en la técnica reconocerán que los ensayos centrados en moléculas efectoras de proteínas G sirven también para identificar y controlar la purificación de moduladores de la actividad del receptor. Los activadores e inhibidores del receptor activarán o inhibirán, respectivamente, la interacción de los receptores con sus ligandos en estos ensayos. En particular, se plantean en la presente invención métodos según se definen en las reivindicaciones.

Se han relacionado las quimiocinas con muchas enfermedades inflamatorias, tales como la psoriasis, artritis, fibrosis pulmonar y ateroesclerosis. Véase Baggiolini y col., mencionados anteriormente. Los inhibidores de la acción de quimiocinas pueden ser útiles para tratar estas condiciones. En un ejemplo, Broaddus y col., J. of Immunol. 152:2960-2967 (1994), describen un anticuerpo contra la IL-8 que puede inhibir el reclutamiento de neutrófilos en la pleuresía inducida por endotoxina, modelo de inflamación aguda en el pulmón de conejo. Se considera también que el ligando o modulador que se une a, o la activación del, receptor de 88C puede servir en el tratamiento de la infección por VIH y estados de enfermedades relacionadas con el VIH. Los moduladores de quimiocinas que se unen a receptores específicos previstos por le invención, pueden incluir anticuerpos dirigidos hacia una quimiocina o un receptor, pequeñas moléculas biológicas o químicas, o péptidos sintéticos que corresponden a fragmentos de la quimiocina o del receptor.

Es posible la administración de composiciones que contienen moduladores de 88-2B o 88C a sujetos mamíferos, con el propósito de controlar o remediar reacciones inmunes normales o patológicas así como infecciones virales incluida la infección por retrovirus como VIH-1, VIH-2 y VIS. En particular, esto comprende la mitigación de respuestas inflamatorias, procesos hematopoyéticos anormales, e infecciones virales mediante el suministro de una cantidad farmacéuticamente aceptable de moduladores de receptores de quimiocinas 88-2B o 88C. Esto comprende además el suministro de estas sustancias activas en composiciones farmacéuticamente aceptables que comprenden vehículos, diluyentes o medicamentos. Varias vías de administración son adecuadas. Por ejemplo, las sustancias activas se pueden administrar por las siguientes vías: intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular, oral, anal (es decir, por formulaciones en supositorio), o pulmonar (es decir, por inhaladores, atomizadores, nebulizadores, etc.).

En otro aspecto, la información sobre la secuencia de ADN descubierta aquí, posibilita el desarrollo, mediante recombinación homologa de estrategias de "knockout" (interrupción de genes) [véase, por ejemplo, Kapecchi, Science, 244:1288-1292 (1989)], de roedores que dejan de expresar un receptor funcional de quimiocinas 88-2B o 88C o que expresan una variante del receptor. Como alternativa, los ratones transgénicos que expresan un receptor 88-2B o 88C clonado se pueden preparar mediante técnicas de laboratorio bien conocidas (Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Brigid Hohan, Frank Costantini e Elizabeth Lacy, eds. (1986) Cold Spring Harbor Laboratory ISBN 0-87969-175-1). Dichos roedores son útiles como modelos para estudiar in vivo las actividades de los receptores 88-2B o 88C.

Otros aspectos y ventajas de la presente invención serán evidentes para un especialista en la técnica al considerar los siguientes ejemplos.

Los ejemplos siguientes ilustran la invención. El Ejemplo 1 describe el aislamiento de ADN genómicos que codifican los receptores de quimiocinas 88-2B y 88C. El Ejemplo 2 presenta el aislamiento y secuenciación de ADNc que codifican los 88-2B y 88C humanos y 88C de macaco. El Ejemplo 3 proporciona una descripción de análisis Northern que revelan modelos de expresión de los receptores 88-2B y 88C en varios tejidos. El Ejemplo 4 detalla la expresión recombinante de los receptores 88-2B y 88C. El Ejemplo 5 describe ensayos de flujo de Ca^{++}, ensayos de hidrólisis del fosfoinositol, y ensayos de unión para la actividad de los receptores 88-2B y 88C en respuesta a varios ligandos potenciales. Se presentan en los Ejemplos 6 y 7 experimentos que describen el papel de 88-2B y 88C como correceptores para el VIH. Se describen en el Ejemplo 8 la preparación y caracterización de anticuerpos monoclonales y policlonales inmunorreactivos con 88C. El Ejemplo 9 describe ensayos adicionales diseñados para identificar ligandos o moduladores de 88-2B o 88C.

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Ejemplo 1

Clones genómicos parciales que codifican los nuevos genes receptores de quimiocinas de esta invención fueron aislados por PCR basándose en secuencias conservadas encontradas en genes previamente identificados y basándose en un agrupamiento de estos genes receptores de quimiocinas dentro del genoma humano. Se amplificó el ADN genómico mediante métodos de PCR estándar utilizando oligonucleótidos iniciadores degenerados.

Las plantillas para amplificaciones mediante PCR fueron miembros de una fuente comercialmente disponible de ADN genómico recombinante humano clonado en Cromosomas Artificiales de Levadura (es decir, YAC). (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL. YAC Library Pools, catalog no. 95011 B). Un vector de YAC puede acomodar insertos de 500-1000 en pares de kilobases. Inicialmente, se exploraron por PCR grupos de ADN de clones YAC utilizando iniciadores específicos para el gen que codifica CCCKR1. En particular, CCCKR(2)-5', iniciador de hebra sentido (correspondiente a la hebra sentido de CCCKR1), se presenta en la SEQ ID NO:15. El iniciador CCCKR(2)-5' se componía de la secuencia 5'-CGTAAGCTTAGAGAAGCCGGGATGGGAA-3', en la que los nucleótidos subrayados son el codón de inicio de la traducción para CCCKR1. El iniciador de hebra antisentido fue CCCKR-3' (correspondiente a la hebra antisentido de CCCKR1) y su secuencia se presenta en la SEQ ID NO:16. La secuencia de CCCKR-3', 5'-GCCTCTAGAGTCAGAGACCAGCAGA-3', contiene el complemento inverso del codón de parada de la traducción de CCCKR1 (subrayado). Los grupos de ADN de clones YAC que producen productos de PCR detectables (es decir, bandas de ADN sobre electrofóresis de gel) identificaron subgrupos apropiados de clones YAC, basándose en un esquema de identificación del propietario. (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL). Las reacciones de PCR se iniciaron con una incubación a 94ºC durante cuatro minutos. Las amplificaciones de secuencias se obtuvieron mediante 33 ciclos de desnaturación a 94ºC durante un minuto, alineamiento a 55ºC durante un minuto, y extensión a 72ºC durante dos minutos.

Los subgrupos de ADN de clones YAC se sometieron entonces a una segunda vuelta de reacciones de PCR utilizando las condiciones e iniciadores que se utilizaron en la primera vuelta de PCR. Los resultados procedentes de exploraciones de los subgrupos identificaron clones individuales capaces de soportar las reacciones de PCR con los iniciadores específicos de CCCKR. Un clon, 881F10, contenía 640 kb de ADN genómico humano del cromosoma 3p21 que incluía los genes para CCCKR1 y CCCKR2, tal como lo determinan la PCR y la hibridación. Un clon YAC en solapamiento, 941A7, contenía 700 kb de ADN genómico humano y contenía asimismo los genes para CCCKR1 y CCCKR2. Por consiguiente, se emprendieron otros estudios de mapeo utilizando estos dos clones YAC. Análisis Southern revelaron que CCCKR1 y CCCKR2 se localizaban aproximadamente a 100 kb uno de otro.

La estrecha proximidad de los genes CCCKR1 y CCCKR2 sugirió que nuevos genes relacionados podían estar enlazados a CCCKR1 y CCCKR2. Por medio de ADN procedente de levadura que contenía los clones YAC 881F10 y 941A7 como plantillas, se realizaron reacciones de PCR para amplificar todo gen receptor enlazado. Los oligodesoxirribonucleótidos degenerados se diseñaron como iniciadores de PCR. Estos oligonucleótidos correspondían a regiones que codifican el segundo bucle intracelular y el sexto dominio transmembrana de los receptores de quimiocinas CC, según se deduce de comparaciones de secuencias alineadas de CCCKR1, CCCKR2, y V28. Se utilizó V28 debido a que es un receptor huérfano que muestra las características de un receptor de quimiocinas. V28 se ha mapeado también como cromosoma humano 3. Raport y col., Gene 163:295-299 (1995). Se debe tomar nota además que las dos variantes de empalme de CCCKR2, CCCKR2A y CCCKR2B, son idénticas en las regiones del segundo bucle intracelular y del sexto dominio transmembrana utilizadas en el análisis. El iniciador 5', designado por V28degf2, contiene un sitio interno BamHI (ver a continuación); su secuencia se presenta en la SEQ ID NO:5. La secuencia del iniciador V28degf2 corresponde al ADN que codifica la región del segundo bucle intracelular de la estructura canónica del receptor. Véase Probst y col., más arriba. El iniciador 3', designado por V28degr2 contiene un sitio interno HindIII (ver más abajo); su secuencia se presenta en la SEQ ID NO:6. La secuencia del iniciador V28degr2 corresponde al ADN que codifica el sexto domino transmembrana de la estructura canónica del receptor.

El ADN amplificado por PCR fue digerido posteriormente con BamHI e HindIII para generar fragmentos de aproximadamente 390 bp, coherente con el tamaño de fragmento previsto a partir de la inspección de la secuencia canónica. Después de la digestión con endonucleasa, estos fragmentos de PCR fueron clonados en pBluescript (Stratagene Inc., LaJolla, CA). Un total de 54 fragmentos clonados se sometieron a análisis automatizados de secuencias de nucleótidos. Además de las secuencias procedentes de CCCKR1 y CCCKR2, se identificaron las secuencias procedentes de los dos nuevos genes receptores de quimiocinas de la invención. Estos dos nuevos genes receptores de quimiocinas se designaron por 88-2B y 88C.

Se utilizaron el mapeo de endonucleasa de restricción y la hibridación para mapear las posiciones relativas de los genes que codifican los receptores 88C, 88-2B, CCCKR1 y CCCKR2. Estos cuatro genes están estrechamente enlazados, ya que el gen para 88C está aproximadamente a 18 KBP del gen CCCKR2 en el cromosoma humano 3p21.

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Ejemplo 2

ADNc de longitud total de 88-2B y 88C se aislaron de una librería de ADNc de macrófagos mediante el procedimiento siguiente. Inicialmente, una librería de ADNc, descrita en Tjoelker y col., Nature 374:549-553 (1995), se construyó en pRc/CMV (Invitrogen Corp., San Diego, CA) a partir de ARNm de macrófagos humanos. Se exploró la librería de ADNc en busca de la presencia de clones de ADNc de 88-2B y 88C por PCR utilizando únicos pares de iniciadores correspondientes a 88-2B o 88C. El protocolo de PCR implicaba un desnaturación inicial a 94ºC durante cuatro minutos. Entonces se amplificaron los polinucleótidos utilizando 33 ciclos de PCR en las siguientes condiciones: desnaturación a 94ºC durante un minuto, alineamiento a 55ºC durante un minuto, y extensión a 72ºC durante dos minutos. El primer iniciador especifico de 88-2B fue el iniciador 88-2B-f1, presentado en la SEQ ID NO: 11. Corresponde a la hebra sentido de la SEQ ID NO: 3 en los nucleótidos 844-863. El segundo iniciador de PCR especifico del gen que codifica 88-2B fue el iniciador 88-2B-r1, presentado en la SEQ ID NO: 12; la secuencia de 88-2B-r1 corresponde a la hebra antisentido de la SEQ ID NO: 3 en los nucleótidos 1023-1042. De forma similar, la secuencia del primer iniciador especifico del gen que codifica 88C, el iniciador 88C-f1, se presenta en la SEQ ID NO:13 y corresponde a la hebra sentido de la SEQ ID NO:1 en los nucleótidos 453-471. El segundo iniciador especifico del gen que codifica 88C es el iniciador 88C-r3, presentado en la SEQ ID NO:14; la secuencia de 88C-r3 corresponde a la hebra antisentido de la SEQ ID NO:1 en los nucleótidos 744-763.

La exploración identificó el clon 777, un clon de ADNc de 88-2B. El clon 777 contenía un inserto de ADN de 1915 bp que incluía la secuencia de codificación de longitud total de 88-2B según lo determinan los siguientes criterios: el clon contenía un largo marco de lectura abierta que empezaba por un codón ATG, exhibía una secuencia Kozak y tenia aguas arriba un codón de parada dentro del marco. El ADN y secuencias de aminoácidos deducidas del inserto del clon 777 se presentan respectivamente en la SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4. La transcripción de 88-2B era relativamente poco frecuente en la librería de ADNc de macrófagos. Durante la exploración de la librería, se identificaron solamente tres clones de 88-2B a partir de un total estimado en tres millones de clones.

La exploración en busca de clones de ADNc que codifican el receptor de quimiocinas 88C identificó los clones 101 y 134 que, según parece, contenían toda la región de codificación de 88C, incluido un codón de iniciación putativo. Sin embargo, estos clones carecían de la secuencia 5' adicional necesaria para confirmar la identidad del codón de iniciación. La transcripción de 88C era relativamente abundante en la librería de ADNc de macrófagos. Durante la exploración de la librería, se estimó que 88C estaba presente en una cantidad de uno cada 3000 transcripciones (en un total de aproximadamente tres millones de clones en la librería).

Se llevó a cabo una RACE (Amplificación Rápida de Extremos de ADNc) por PCR para ampliar las secuencias existentes de clones de 88C, facilitando por este medio la caracterización exacta del extremo 5' del ADNc de 88C. Se compró ADNc 5'-RACE-ready de bazo humano a Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA, y se utilizó de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. El ADNc se habla elaborado como "5'-RACE-ready" ligando una secuencia ancla a los extremos 5' de los fragmentos de ADNc. La secuencia ancla es complementaria de un iniciador ancla suministrado por Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA. El polinucleótido del dúplex secuencia ancla-iniciador ancla contiene un sitio EcoRI. Se eligió ADNc de bazo humano como ADN plantilla debido a que los Northern blots hablan revelado que se expresaba 88C en este tejido. Las reacciones de PCR empezaron por la desnaturación de muestras a 94ºC durante cuatro minutos. Posteriormente, se amplificaron las secuencias utilizando 35 ciclos que implicaban la desnaturación a 94ºC durante un minuto, el alineamiento a 60ºC durante 45 segundos, y la extensión a 72ºC durante dos minutos. La primera vuelta de PCR se realizó en mezclas de reacción que contenían 2 \mul de ADNc 5'-RACE-ready de bazo, 1 \mul del iniciador ancla, y 1 \mul de iniciador 88c-r4 (100 ng/\mul) en un volumen total de reacción de 50 \mul. El iniciador especifico de 88C, el iniciador 88c-r4 (5'-GATAAGCCTCACAGCCCTGTG-3'), se presenta en la SEQ ID NO:7. La secuencia del iniciador 88c-r4 corresponde a la hebra antisentido de la SEQ ID NO:1 en los nucleótidos 745-765. Una segunda vuelta de PCR se llevó a cabo en mezclas de reacción que incluían 1 \mul de la primera reacción de PCR con 1 \mul de iniciador ancla y 1 \mul de iniciador 88C-r1b (700 ng/\mul) que contenía la secuencia siguiente (5'-GCTAAGCTTGATGACTATCTTTAATGTC-3') y se presentaba en la SEQ ID NO.8. La secuencia del iniciador 88C-r1b contiene un sitio de clonación interno HindIII (subrayado). La secuencia 3' del sitio HindIII corresponde a la hebra antisentido de la SEQ ID NO:1 en los nucleótidos 636-654. El producto resultante de la PCR fue digerido con EcoRI e HindIII y fraccionado en un gel de agarosa al 1%. Se aisló el fragmento de aproximadamente 700 bp y se clonó en pBluescript. Se secuenciaron los clones con los insertos más grandes. Como alternativa, el producto intacto de PCR fue ligado en el vector pCR utilizando un kit comercial de clonación TA (Invitrogen Corp., San Diego, CA) para determinaciones posteriores de secuencias de nucleótidos.

Los ADNc de 88-2B y 88C se secuenciaron por medio del Kit de Secuenciación por Ciclo de Terminación PRISM "Ready Reaction DyeDeoxy" (Perkin Elmer Corp., Foster City, CA) y un Secuenciador de ADN 373A de Applied Biosystems. El inserto del clon 777 proporcionó la plantilla de doble hebra para las reacciones de secuenciación utilizadas para determinar la secuencia de ADNc de 88-2B. La secuencia del inserto en su totalidad del clon 777 se determinó y se presenta como secuencia de ADNc de 88-2B así como la secuencia de aminoácidos deducida en la SEQ ID NO: 3. La secuencia tiene una longitud de 1915 bp, incluidos 361 bp del ADN no traducido 5' (correspondiente a la SEQ ID NO:3 en los nucleótidos 1-361), región de codificación de 1065 bp (correspondiente a la SEQ ID NO:3 en los nucleótidos 362-1426), y 489 bp del ADN no traducido 3' (correspondiente a la SEQ ID NO: 3 en los nucleótidos 1427-1915). El ADN genómico de 88-2B, descrito en el Ejemplo 1 anterior, corresponde a la SEQ ID NO:3 en los nucleótidos 746-1128. La secuencia de ADNc de 88C, así como la secuencia de aminoácidos deducida, se presenta en la SEQ ID NO:1. La secuencia de ADNc de 88C es un compuesto de secuencias obtenido de ADNc por PCR-RACE, el clon 134 y el clon 101. Se utilizó el ADNc por PCR-RACE como plantilla de secuenciación para determinar los nucleótidos 1-654 en la SEQ ID NO:1, incluida la única identificación de 9 bp de la secuencia de ADNc no traducida 5' en la SEQ ID NO:1 en los nucleótidos 1-9. La secuencia obtenida del ADNc por PCR-RACE confirmó la posición del primer codón de metionina en los nucleótidos 55-57 en la SEQ ID NO:1, y corrobora la conclusión de que el clon 134 y el clon 101 contenían copias de longitud total de la región de codificación de 88C. El clon 134 contenía 45 bp del ADNc no traducido 5' (correspondiente a la SEQ ID NO:1 en los nucleótidos 10-54), la región de codificación de 88C de 1056 bp (correspondiente a la SEQ ID NO:1 en los nucleótidos 55-1110), y el ADNc no traducido 3' de 492 bp (correspondiente a la SEQ ID NO:1 en los nucleótidos 1111-1602). El clon 101 contenía 25 bp del ADNc no traducido 5' (correspondiente a la SEQ ID NO:1 en los nucleótidos 30-54), la región de codificación de 88C de 1056 bp (correspondiente a la SEQ ID NO:1 en los nucleótidos 55-1110), y el ADNc no traducido 3' de 2273 bp (correspondiente a la SEQ ID NO:1 en los nucleótidos 1111-3383). El ADN genómico de 88C descrito en el Ejemplo 1 anterior, corresponde a la SEQ ID NO:1 en los nucleótidos 424-809.

Las secuencias de aminoácidos deducidas de 88-2B y 88C revelaron perfiles de hidrofobicidad característicos de los GPCR, incluidos siete dominios hidrofóbicos que corresponden a los dominios transmembrana del GPCR. Las comparaciones de secuencias con otros GPCRs revelaron también un grado de identidad. De forma significativa, las secuencias de aminoácidos deducidas tanto de 88-2B como de 88C tenían mayor identidad con las secuencias de los receptores de quimiocinas. La Tabla 1 presenta los resultados de estas comparaciones de secuencias de
aminoácidos.

TABLA 1

1

La Tabla 1 muestra que 88-2B es el más parecido a CCCKR1 (idéntico en un 62% al nivel de aminoácidos) y 88C es el más parecido a CCCKR2 (idéntico en un 72% al nivel de aminoácidos).

Las secuencias de aminoácidos deducidas de 88-2B y 88C revelaron también dominios intracelulares y extracelulares característicos de los GPCR. Los dominios extracelulares de 88-2B corresponden a la secuencia de aminoácidos proporcionada en la SEQ ID NO:3, así como en la SEQ ID NO:4, en los residuos de aminoácidos 1-36, 93-107, 171-196 y 263-284. Los dominios extracelulares de 88-2B son codificados por secuencias de polinucleótidos que corresponden a la SEQ ID NO:3 en los nucleótidos 362-469, 638-682, 872-949, y 1148-1213. Los dominios extracelulares de 88C incluyen los residuos de aminoácidos 1-32, 89-112, 166-191 y 259-280 en la SEQ ID NO:1 y en la SEQ ID NO:2. Los dominios extracelulares de 88C son codificados por secuencias de polinucleótidos que corresponden a la SEQ ID NO:1 en los nucleótidos 55-150, 319-390, 550-627 y 829-894. Los dominios intracelulares de 88-2B incluyen los aminoácidos 60-71, 131-151, 219-240, y 306-355 de la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4. Dichos dominios son codificados por secuencias de polinucleótidos que corresponden a la SEQ ID NO:3 en los nucleótidos 539-574, 752-814, 1016-1081, y 1277-1426 respectivamente. Los dominios intracelulares de 88C incluyen los residuos de aminoácidos 56-67, 125-145, 213-235 y 301-352 de la SEQ ID NO:1 y la SEQ ID NO:2. Los dominios intracelulares de 88C son codificados por secuencias de polinucleótidos que corresponden a la SEQ ID NO:1 en los nucleótidos 220-255, 427-489, 691-759 y 955-1110.

Además, se amplificó un ADN de 88C de macaco mediante PCR, procedente de ADN genómico de macaco utilizando iniciadores que correspondían a las regiones flanqueantes 5' y 3' del ADNc de 88C humano. El iniciador 5' correspondía a la región inmediatamente aguas arriba de, e incluyendo el codón iniciador Met. El iniciador 3' era complementario de la región inmediatamente aguas abajo del codón de terminación. Los iniciadores incluían sitios de restricción para la clonación dentro de vectores de expresión. La secuencia del iniciador 5' fue GACAAGCTTCACAGGGTGG AACAAGATG (con el sitio HindIII subrayado) (SEQ ID NO:17) y la secuencia del iniciador 3' fue GTCTCTAGACCACTTGAGTCCGTGTCA (con el sitio XbaI subrayado) (SEQ ID NO:18). Las condiciones de amplificación por PCR fueron de 94ºC durante ocho minutos, después 40 ciclos de 94ºC durante un minuto, 55ºC durante cuarenta y cinco segundos, y 72ºC durante un minuto. Los productos amplificados se clonaron en los sitios HindIII y XbaI de pcADN3 y se obtuvo y secuenció un clon. El ADNc de macaco de longitud total y las secuencias de aminoácidos deducidas se presentan en las SEQ ID NO:19 y 20, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de 88C de macaco es idéntica en un 98% a de 88C humana. Las secuencias de aminoácidos deducidas son idénticas en un 97%.

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Ejemplo 3

Se determinaron modelos de expresión de ARNm de 88-2B y 88C mediante análisis de Northern blot.

Los Northern blots que contenían poli(A^{+})-ARN inmovilizado procedente de varios tejidos humanos se compraron a Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA. En particular, se examinaron los tejidos siguientes: corazón, cerebro, placenta, pulmón, hígado, músculo esqueletal, riñón, páncreas, bazo, timo, próstata, testículo, ovario, intestino delgado, colón y leucocitos de sangre periférica.

Se generó una sonda especifica de secuencias de nucleótidos de 88-2B a partir del clon 478 de ADNc. El inserto de ADNc en el clon 478 contiene la secuencia que corresponde a la SEQ ID NO:3 en los nucleótidos 641-1915. Para generar una sonda, el clon 478 fue digerido y el fragmento de ADN insertado se aisló después de electroforesis en gel. El fragmento de inserto aislado entonces fue radiomarcado con los nucleótidos marcados ^{32}P, por medio de técnicas conocidas en el arte.

Se generó una sonda especifica de secuencias de nucleótidos de 88C mediante aislamiento y radiomarcado del fragmento de ADN insertado encontrado en el clon 493. El fragmento insertado procedente del clon 493 contiene la secuencia que corresponde a la SEQ ID NO:1 en los nucleótidos 421-1359. De nuevo, para generar la sonda, se utilizaron técnicas convencionales que implicaban los nucleótidos marcados ^{32}P.

Los Northern blots sondeados con 88-2B revelaron un ARNm de aproximadamente 1,8 kb en los leucocitos de sangre periférica. Los Northerns de 88C mostraron un ARNm de aproximadamente 4 kb en varios tejidos humanos, incluida una fuerte señal cuando se sondeó el tejido de bazo o de timo y señales menos intensas cuando se analizó el ARNm procedente de leucocitos de sangre periférica y del intestino delgado. Se detectó una señal relativamente débil para 88C en tejido de pulmón y en tejido de ovario.

La expresión de 88C en células-T humanas y en líneas celulares hematopoyéticas se determinó también mediante análisis Northern blot. Los niveles de 88C en las células-T CD4^{+} y CD8^{+} eran muy altos. La transcripción estaba presente a niveles relativamente altos en las líneas celulares mieloides THP1 h HL-60 y se encontró también en la línea celular B Jijoye. Además, el ADNc era una transcripción relativamente abundante en una librería de ADNc de macrófagos humanos basada en la amplificación por PCR de subfracciones de la librería.

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Ejemplo 4

Los ADN de 88-2B y 88C se expresaron mediante métodos recombinantes en células de mamíferos.

Para experimentos de transfección transitoria, se subclonó 88C dentro del vector pBJ1 de expresión de células de mamíferos (Ishi, K. y col., J. Biol. Chem. 270:16435-16440 (1995)). La construcción incluía secuencias que codificaban una secuencia de señales de prolactina para una expresión eficaz en la superficie celular y un epítopo FLAG en el amino terminal de 88C para facilitar la detección de la proteína expresada. El epítopo FLAG se compone de la secuencia "DYKDDDD". Células COS-7 fueron transfectadas transitoriamente con el plásmido de expresión de 88C utilizando Lipofectamina (Life Technology, Inc., Grand Island, NY) siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, se sembraron las células en placas de 24 pocillos a una densidad de 4 x 10^{4} células por pocillo y se cultivaron durante toda la noche. Entonces, se lavaron las células con PBS, y se añadieron en cada pocillo 0,3 mg de ADN mezclado con 1,5 \mul de lipofectamina en 0,25 ml de Opti-MEM. Después de 5 horas a 37ºC, el medio se sustituyó por un medio que contenía un 10% de FCS. Un ELISA cuantitativo confirmó que se expresaba el 88C en la superficie celular en células COS-7 transfectadas transitoriamente utilizando el anticuerpo MI especifico del epítopo FLAG (Eastman Co., New Haven, CT).

El receptor de 88C marcado con FLAG fue transfectado también de forma estable dentro de células HEK-293, línea celular de riñón embrionario humano, utilizando el reactivo de transfección DOTAP (N-[1-[(2,3-dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio-metilsulfato, Boehringer-Mannheim, Inc., Indianapolis, IN) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Se seleccionaron líneas estables en presencia del medicamento G418. Se evaluaron las células transfectadas HEK-293 en cuanto a la expresión de 88C en la superficie celular por medio de ELISA, utilizando el anticuerpo MI al epítopo FLAG. ELISA mostró que el 88C marcado con el epítopo FLAG se expresaba en la superficie celular de células HEK-293 transformadas de forma estable.

Se utilizaron los ADNc de 88-2B y 88C para estabilizar los transfectantes de HEK-293. El ADNc del receptor 88-2B se clonó detrás del promotor del citomegalovirus en pRc/CMV (Invitrogen Corp., San Diego, CA) utilizando una estrategia basada en PCR. La plantilla para la reacción PCR fue el inserto de ADNc en el clon 777. Los iniciadores de PCR fueron 88-2B-3 (que contenía un sitio interno XbaI) y 88-2B-5 (que contenía un sitio interno HindIII). La secuencia de nucleótidos del iniciador 88-2B-3 se presenta en la SEQ ID NO:9; la secuencia de nucleótidos del iniciador 88-2B-5 se presenta en la SEQ ID NO:10. Se amplificó una región de 1104 bp de ADNc. Después de la amplificación, el ADN fue digerido con XbaI e HindIII y fue clonado en pRc/CMV digerido de forma similar. El plásmido resultante se denominó 777XP2, que contiene 18 bp de la secuencia no traducida 5', la totalidad de la región de codificación de 88-2B y 3 bp de la secuencia no traducida 3'. Para la secuencia de 88C, el inserto de ADNc de longitud total en el clon 134 no se modificó más antes de la transfección de las células HEK-293.

Para crear líneas celulares transformadas establemente, clones recombinantes de pRc/CMV fueron transfectados utilizando el reactivo de transfección DOTAP (N-[1-[(2,3-dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamoniometil sulfato, Boehringer-Mannheim, Inc., Indianapolis, IN) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante, en células HEK-293, línea celular del riñón embrionario humano. Se seleccionaron líneas estables en presencia del medicamento G418. Se realizaron procedimientos estándar de exploración (es decir, análisis Northern blot) para identificar líneas celulares estables que expresan los niveles más altos de ARNm de 88-2B y 88C.

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Ejemplo 5 A. Ensayos de Flujo de Ca^{++}

Para analizar la expresión de los polipéptidos, se empleó un ensayo funcional en busca de la actividad receptora de quimiocinas. Una característica común de la señalización a través de los receptores conocidos de quimiocinas es que la transducción de la señal está asociada a la liberación de cationes de calcio intracelular. Por lo tanto, la concentración de Ca^{++} intracelular en las células transfectadas HEK-293 se sometió a ensayo para determinar si los receptores 88-2B o 88C respondían a cualquiera de las quimiocinas conocidas.

Las células HEK-293, transfectadas establemente con 88-2B, 88C (sin la secuencia del epítopo FLAG), o una región de codificación de control (que codifica IL8R o CCCKR2, véase más abajo) tal como se ha descrito anteriormente, se cultivaron en matraces T75 hasta una confluencia aproximadamente del 90% en MEM + 10% de suero. Después, se lavaron las células, se cosecharon con verseno (0,6 mM de EDTA, 10 mM de Na_{2}HPO_{4}, 0,14 M de NaCl, 3 mM de KCl, y 1 mM de glucosa), y se incubaron en MEM + 10% de suero + 1 \muM de Fura-2 AM (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Fura-2 AM es un tinte sensible a Ca^{++}. Las células se resuspendieron en una solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco que contenía 0,9 mM de CaCl_{2} y 0,5 mM de MgCl_{2} (D-PBS) a una concentración de aproximadamente 10^{7} células/ml y los cambios en la fluorescencia se controlaron mediante un espectrofotómetro de fluorescencia (Modelo F-4010 de Hitachi). Se suspendieron aproximadamente 10º células en 1,8 ml de D-PBS en una cubeta mantenida a 37ºC. Las longitudes de ondas de excitación alternaban entre 340 y 380 nm a intervalos de 4 segundos; la longitud de onda de emisión fue de 510 nm. Se añadieron composiciones de prueba a la cubeta a través de un orificio de inyección; se midió el flujo máximo de Ca^{++} al añadir ionomicina.

Se observaron respuestas positivas en las células que expresaban IL-8RA cuando se estimulaban con IL-8 y también cuando CCCKR2 se estimulaba con MCP-1 o MCP-3. Sin embargo, las células HEK-293 que expresaban 88-2B o 88C dejaron de mostrar un flujo en la concentración de Ca^{++} intracelular cuando se exponían a cualquiera de las siguientes quimiocinas: MCP-1, MCP-2, MCP-3, MIP-1\alpha, MIP-1\beta, IL8, NAP-2, gro/MGSA, IP-10, ENA-78, o PF-4. (Peprotech, Inc., Rocky Hill, NJ).

Por medio de un ensayo más sensible, se observó microscópicamente una respuesta del flujo de Ca^{++} a RANTES en células cargadas con Fura-2 AM que expresan 88-2B. El ensayo implicaba células y reactivos preparados tal como se describió anteriormente. RANTES (Regulado sobre Activación. Célula T Normal Expresada y Secretada) es una quimiocina CC que ha sido identificada como quimioatractivo y activador de eosinófilos. Véase Neote y col, mencionado más arriba. Esta quimiocina media también la liberación de la histamina por los basófilos y se ha demostrado que funciona como quimioatractivo para las células T de memoria in vitro. Se considera por lo tanto que la modulación de las actividades del receptor 88-2B es útil en la modulación de la activación de leucocitos.

El receptor 88C marcado con FLAG se expresó en células HEK-293 y se sometió a prueba en busca de interacciones de quimiocinas en el ensayo de flujo de Ca^{++}. La expresión de 88C en la superficie celular se confirmó por ELISA y por análisis FACScan utilizando el anticuerpo Mi. Las quimiocinas RANTES, MIP-1\alpha, y MIP-1\beta provocaron todas un flujo de Ca^{++} en las células transfectadas de 88C cuando se añadían a una concentración de 100 nM.

Se pueden diseñar también ensayos de flujo de Ca^{++} para identificar moduladores de la unión de receptores a quimiocinas. Los ensayos fluorimétricos o microscópicos anteriores se llevan a cabo en presencia de compuestos de prueba. Si se aumenta el flujo de Ca^{++} en presencia de un compuesto de prueba, dicho compuesto es un activador de la unión del receptor a quimiocinas. Por otra parte, un flujo reducido de Ca^{++} identifica el compuesto de prueba como un inhibidor de la unión del receptor a quimiocinas.

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B. Hidrólisis del Fosfoinositol

Otro ensayo dirigido a ligandos o moduladores implica la actividad de la fosfolipasa C, tal como se describe en Hung y col., Chem. 116:827-832 (1992). Inicialmente, las células huésped que expresan un receptor de quimiocina se cargan con ^{3}H-inositol durante 24 horas. Entonces se añaden los compuestos de prueba (es decir, los ligandos potenciales) a las células y se incuban a 37ºC durante 15 minutos. Entonces, se exponen las células a ácido fórmico 20 mM para solubilizar y extraer metabolitos hidrolizados del metabolismo del fosfoinositol (es decir, los productos de hidrólisis mediada por la fosfolipasa C). El extracto se somete a una cromatografía de intercambio aniónico utilizando una columna de intercambio aniónico AG1X8 (forma del formato). Se eluyen los fosfatos de inositol con formato de amonio 2M/ácido fórmico 0,1M y el ^{3}H asociado a los compuestos se determina por medio de espectrofotometría de escintilación liquida. Se puede explotar también el ensayo con fosfolipasa C para identificar moduladores de la actividad del receptor de quimiocinas. El ensayo antes mencionado se realiza tal como se describe, pero con la adición de un modulador potencial. Niveles elevados de marcado detectable indicarían que el modulador es un activador; niveles bajos del marcado indicarían que el modulador es un inhibidor de la actividad del receptor de quimiocinas.

El ensayo con fosfolipasa C se realizó para identificar ligandos de quimiocinas del receptor 88C marcado con FLAG. Aproximadamente 24 horas después de la transfección, las células COS-7 que expresan 88C se marcaron durante 20-24 horas con myo-[2-^{3}H]inositol (1 \muCi/m) en un medio exento de inositol que contenía FCS dializado al 10%. Se lavaron las células marcadas con DMEM exento de inositol que contenía 10 mM de LiCl y se incubaron a 37ºC durante 1 hora con DMEM exento de inositol que contenía 10 mM de LiCl y una de las siguientes quimiocinas: RANTES, MIP-1\beta, MIP-1\alpha, MCP-1, IL-8, o el homólogo JE de MCP-1 murino. Se sometió a prueba la formación de fosfato de inositol (IP) tal como se describe en el párrafo anterior. Después de la incubación con quimiocinas, se aspiró el medio y se Usaron las células mediante la adición de 0,75 ml de ácido fórmico 20 mM helado (30 min). Se cargaron fracciones de sobrenadante en columnas AG1-X8 Dowex (Biorad. Hercules, CA), seguido de la adición inmediata de 3 mi de NH_{4}OH 50 mM. Entonces se lavaron las columnas con 4 ml de formato de amonio 40 mM, seguido de la elución con formato de amonio 2M. Los fosfatos de inositol totales se cuantificaron mediante conteo de emisiones beta.

Como se ha demostrado que algunos receptores de quimiocinas, tales como IL8RA e IL8RB requieren una cotransfección con una proteína G exógena antes de que se puedan detectar señales en las células COS-7, el receptor 88C se co-expresó con la proteína G quimérica Gqi5 (Conklin y col., Nature 363:274-276, (1993). La Gqi5 es una proteína G cuyos cinco aminoácidos carboxilo terminales de Gi (que se une al receptor) se empalman sobre G\alphaq. La cotransfección con Gqi5 potencia significativamente la señalización por CCCKR1 y CCKR2B. La cotransfección con Gqi5 reveló que 88C mandó bien las señales en respuesta a RANTES, MIP-1\beta y MIP-1\alpha, pero no en respuesta a MCP-1, IL-8 o el homólogo de MCP-1 murino JE. Las curvas dosis-respuesta revelaron valores EC_{50} de 1 nM para RANTES, de 6 nM para MIP-1\beta, y de 22 nM para MIP-1\alpha.

88C es el primer receptor humano clonado con una respuesta por señales a MIP-1\beta. En comparación con otras quimiocinas CC, MIP-1\beta tiene claramente un único modelo de activación celular. Parece que activa las células T pero no los monocitos (Baggiolini y col, mencionados más arriba) lo que es coherente con los estudios de estimulación de receptores. Por ejemplo, mientras MIP-1\beta se une a CCCKR1, no induce el flujo de calcio (Neote y col, mencionados anteriormente). Por otra parte, MIP-1\alpha y RANTES se unen a, y provocan, señales en CCCKR1 y CCCKR5 (RANTES provoca también la activación de CCCKR3). Por lo tanto, parece que MIP-1\beta es mucho más selectiva que otras quimiocinas de la familia de quimiocinas CC. Dicha selectividad es de importancia terapéutica debido a que se puede estimular una actividad ventajosa específica (tal como la supresión de la infección por VIH) sin estimular múltiples poblaciones leucocitarias que resultan en general de actividades proinflamatorias.

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C. Ensayos de Unión

Otro ensayo para la interacción de los receptores con las quimiocinas fue una modificación del ensayo de unión descrito por Ernst y col., J. Immunol. 152:3541-3549 (1994). Se marcó MIP-1\beta por medio del reactor de Bolton and Hunter (diyoduro, NEN, Wilmington, DE) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se separó el yoduro no conjugado de la proteína marcada mediante elución utilizando una columna PD-10 (Pharmacia) equilibrada con PBS y BSA (1% peso/volumen). La actividad especifica fue típicamente de 2200 Ci/mmol. La unión en equilibrio se realizó mediante la adición del ligando marcado ^{125}I con o sin un exceso de 100 veces de ligando no etiquetado, a 5 x 10^{5} células HEK-293 tranfectadas con 88C etiquetado con el epítopo FLAG en tubos de polipropileno en un volumen total de 300 \mul (HEPES 50 mM, pH 7,4, CaCl_{2} 1 mM, MgC_{2}, BSA al 0,5%), y la incubación durante 90 minutos a 27ºC con agitación a 150 r.p.m. Se recogieron las células, utilizando un cosechador de células Skatron (Skatron Instruments, Inc., Sterling, VA), sobre filtros de fibra de vidrio en polietilenoimina al 0,3% y BSA al 0,2%. Después del lavado, se quitaron los filtros y se cuantificó el ligando unido mediante conteo de emisiones gamma. La unión del ligando por competición con el ligando no marcado se determinó por incubación de 5 x 10^{5} células tranfectadas (de la misma forma que anteriormente) con 1,5 nM de ligando radiomarcado y las concentraciones indicadas de ligando no marcado. Se recogieron las muestras, se lavaron y se contaron tal como se hizo anteriormente. Se analizaron los datos por medio del programa PRISMA de ajuste de la curva (GraphPad, Inc., San Diego, CA) y el programa de regresión no lineal iterativa, LIGAND (PM220).

En los ensayos de unión en equilibrio, el receptor 88C se unió al MIP-1\beta radiomarcado de una forma especifica y saturable. El análisis de estos datos de unión por el método de Scatchard reveló una constante de disociación (Kd) de 1,6 nM. Los ensayos de unión por competición utilizando MIP-1\beta marcado reveló una unión de gran afinidad de MIP-1\beta (IC_{50} = 7,4 nM)), RANTES (IC_{50} = 6,9 nM) y MIP-1\alpha (IC_{50} = 7,4 nM), coherente con los datos sobre señalización obtenidos en las células COS-7 transfectadas transitoriamente tal como se ha expuesto en el apartado B anterior.

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Ejemplo 6

Se ha demostrado que las quimiocinas MIP-1\alpha, MIP-1\beta y RANTES inhibían la replicación del VIH-1 y VIH-2 en células mononucleares de sangre periférica humana y células PM1 (Cocchi y col., más arriba). Considerando este descubrimiento y a la vista de los resultados descritos en el Ejemplo 5, la presente invención considera que la activación de, o la unión del ligando, al receptor 88C puede proporcionar un papel protector en la infección por VIH.

Se ha reportado recientemente que el receptor huérfano acoplado a la proteína G, la fusina, puede actuar como correceptor para la entrada de VIH. La fusina/CXCR4 en combinación con CD4, principal receptor del VIH, facilita aparentemente la infección por VIH de las células T cultivadas (Feng y col., Science 272: 872-877 (1996). Sobre la base de la homología de la fusina con los receptores de quimiocinas y el perfil de unión a quimiocinas de 88C, y debido a que 88C se expresa constitutivamente en las células T y se expresa abundantemente en los macrófagos, es probable que 88C intervenga en la infección viral y por VIH.

La función de 88C y 88-2B como correceptores para el VIH se determinó mediante la transfección de células que expresan CD4 con 88C o 88-2B y retando las células cotransfectadas con el VIH. Sólo se infectaron las células que expresan tanto CD4 como un correceptor funcional para el VIH. Se puede determinar la infección por VIH por medio de varios métodos. Los ELISA que someten a prueba la expresión de antígenos del VIH están disponibles comercialmente, por ejemplo el ensayo con el antígeno FHV-L_{p}24 de Coulter (patente de Estados Unidos Nº 4.886.742), Coulter Corp., 11800 SW 147th Ave., Miami, FL 33196). Como alternativa, las células de prueba se pueden elaborar para expresar un gen reportero tal como LACZ unido al promotor LTR del VIH [Kimpton y col., J. Virol. 66:2232-2239 (1992)]. En este método, las células que están infectadas por VIH, se detectan mediante un ensayo colorimétrico.

Se transfectó transitoriamente 88C en una línea celular de gato. CCC [Clapham y col., 181:703-715 (1991)] que habla sido transformada establemente para expresar CD4 humano (CCC-CD4). Estas células normalmente son resistentes a la infección por cualquier cepa del VIH-1 debido a que no expresan de forma endógena 88C. En estos experimentos, las células CCC/CD4 fueron transfectadas transitoriamente con 88C clonado en el vector de expresión pcDNA3.1 (Invitrogen Corp., San Diego, CA) utilizando lipofectamina (Gibco BRL. Gaithersburg, MD). Dos días después de la transfección, se retaron las células con el VIH. Tras 4 días de incubación, las células se fijaron y tiñeron para el antígeno p24 como medición de la infección por VIH. La expresión de 88C por estas células las convirtió en susceptibles de infección por varias cepas del VIH-1. Estas cepas incluían cuatro aislados principales de VIH-1 no inductores de sincitio (M23, E80, SL-2 y SF-162) que mostraron utilizar solamente 88C como correceptor pero no fusina. Varias cepas principales inductoras de sincitio del VIH-1 (2006, M13, 2028 y 2076) utilizaron 88C o fusina como correceptor. Asimismo, dos virus de VIH-1 clonales establecidos (GUN-1 y 89,6) utilizaron 88C o fusina como correceptor.

Se ha reportado que algunas cepas del VIH-2 pueden infectar ciertas líneas celulares CD4-negativas, implicando de este modo una interacción directa del VIH-2 con un receptor distinto del CD4 [Clapham y col., J. Virol. 66:3531-3537 (1992)]. Para algunas cepas del VIH-2, esta infección está facilitada por la presencia de CD4 soluble (sCD4). Como 88-2B comparte alta similitud de secuencias con otros receptores de quimiocinas que actúan como correceptores del VIH (a saber 88C y fusina), se consideró que 88-2B era probablemente correceptor del VIH-2. El papel de 88-2B como correceptor del VIH-2 se demostró utilizando la cepa de VIH-2 ROD/B. Células CCC de gato que no expresan de forma endógena CD4 fueron transfectadas con 88-2B. En estos experimentos, las células fueron transfectadas con pcDNA3,l que contenía 88-2B por medio de lipofectamina y se infectaron con VIH-2, 48 horas más tarde. Tres días después de la infección, las células fueron inmunoterapias en busca de la presencia de proteínas envolventes del VIH-2. La presencia de sCD4 durante el reto de VIH-2_{ROD/D} incrementó en diez veces la infección de estas células. La entrada del VIH-2 en las células tranfectadas 88-2B pudo ser bloqueada por la presencia de 400-800 ng/ml de azotaina, uno de los ligandos para 88-2B. Los niveles de afectividad en la línea base de CCC/88-2B (con CD4 no soluble) fueron equivalentes a las células CCC que no estaban transfectadas con 88-2B.

El papel de 88-2B y 88C como correceptores para VIH se confirmó con la preparación y reto de líneas celulares transformadas establemente para expresar 88C o 88-2B con varias cepas de VIH y VIS. Se describen estos resultados en el Ejemplo 7.

Como alternativa, el papel como correceptor de 88C y 88-2B ha podido ser demostrado mediante un método experimental que no requiere el uso de virus vivos. En este método, las líneas celulares que coexpresan 88C o 88-2B, CD4 y un gen reportero LACZ se mezclan con una línea celular que coexpresa la glicoproteína envolvente (ENV) del VIH y un factor de transcripción para la construcción del gen reportero (Nussbaum y col., 1994, J. Virol. 68:5411). Las células que expresan un correceptor funcional para el VIH se fusionarán con las células que expresan ENV y por este medio permitirán la expresión del gen reportero. En este método, la detección del producto de gen reportero por el ensayo colorimétrico indica que 88C o 88-2B funciona como correceptor para el VIH.

El mecanismo por el que las quimiocinas inhiben la infección viral no se ha aclarado todavía. Un posible mecanismo implica la activación del receptor por la unión de una quimiocina. La unión de la quimiocina conduce a eventos de transducción de señales en la célula que convierte la célula en resistente a la infección viral y/o impide la replicación del virus en la célula. De forma similar a la inducción del interferón, la célula puede diferenciarse de modo tal que sea resistente a la infección viral, o se establezca un estado antiviral. Como alternativa, un segundo mecanismo implica la interferencia directa con la entrada viral en células bloqueando el acceso de las glicoproteínas envolventes de virus al correceptor por unión de las quimiocinas. En este mecanismo, no es necesaria la señalización de la proteína G para la supresión de la infección por VIH de las quimiocinas.

Para distinguir entre dos mecanismos por los que 88C o 88-2B pueden funcionar como correceptores para la infección por VIH o viral, la unión de la quimiocina al receptor se desacopla de la transducción de señales y se determina el efecto de la quimiocina sobre la supresión de la infección viral.

La unión del ligando se puede desacoplar de la transducción de señales mediante la adición de compuestos que inhiben la señalización mediada por la proteína G. Estos compuestos incluyen, por ejemplo, la toxina pertussis y la toxina del cólera. Además, los polipéptidos efectores aguas abajo pueden ser inhibidos por otros compuestos como la wortmanina. Si la señalización de la proteína G interviene en la supresión de la infección viral, la adición de dichos compuestos impedirla la supresión de la infección viral por la quimiocina. Como alternativa, los residuos clave o los dominios receptores del receptor 88C o 88-2B necesarios para el acoplamiento de la proteína G pueden ser modificados o suprimidos de modo tal que el acoplamiento de la proteína G se modifique o se destruya sin que se vea afectada la unión de la quimiocina.

En estas condiciones, si las quimiocinas no pueden suprimir la infección por VIH o viral, entonces es necesaria la señalización a través de una proteína G para suprimir la infección por VIH o viral. Sin embargo, si las quimiocinas son capaces de suprimir la infección viral, entonces no es necesaria la señalización a través de la proteína G para que las quimiocinas supriman la infección viral y los efectos protectores de las quimiocinas pueden ser debidos al bloqueo por las quimiocinas de la disponibilidad del receptor para el virus.

Otra aproximación implica el uso de anticuerpos dirigidos contra 88C o 88-2B. Los anticuerpos que se unen a 88C o 88-2B, los cuales muestran no poder obtener la señalización a través de la proteína G, pueden bloquear el acceso a la quimiocina o al sitio de unión viral del receptor. Si, en presencia de anticuerpos contra 88C o 88-2B, se suprime la infección viral, entonces el mecanismo de los efectos protectores de las quimiocinas consiste en bloquear el acceso viral a su receptor. Feng y col, reportaron que los anticuerpos contra el amino terminal del receptor de fusina suprimieron la infección por VIH(Feng y col., 1996).

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Ejemplo 7

Lineas celulares se transformaron establemente con 88C o 88-2B para delimitar después el papel de 88C y 88-2B en la infección por VIH. Kimpton y Emerman, "Detection of Replication-Competent and Pseudotyped Human Immunodeficiency Virus with a Sensitive Cell Line on the Basis of Activation of an Integrated Beta-Galactosidase Gene", J. Virol., 66 (5): 3026-3031 (1992) describieron previamente una línea celular indicadora, identificada aquí por células HeLa-MAGI. Las células HeLa-MAGI son células HeLa que han sido transformadas establemente para expresar CD4 así como LTR del VIH-1 integrado que conduce la expresión de un gen para \beta-galactosidasa nuclear localizada. La integración de un provirus VIH en las células lleva a la producción del transactivador viral, Tat, el cual después pone en marcha la expresión del gen para \beta-galactosidasa. El número de células que se tiñen de positivas con X-gal para la actividad de \beta-galactosidasa in situ es directamente proporcional con el número de células infectadas.

Estas células HeLa-MAGI pueden detectar aislados adaptados en laboratorio del VIH-1 pero sólo una minoría de aislados primarios [Kimpton y Emerman, mencionados más arriba] y no pueden detectar la mayoría de aislados de VIS [Chackerian y col., "Characterization of a CD4-Expressing Macaque Cell Line that can Detect Virus After A Single Replication Cycle and can be infected by Diverse Simian Immunodeficiency Virus Isolates", Virology, 213(2):6499-6505 (1995)].

Además, Harrington y Geballe ``Co-Factor Requirement for Human Immunodeficiency Virus Type 1 Entry into a CD4-Expressing Human Cell Line, J. Virol. 67:5939-5947 (1993) describieron una línea celular basada en células U373 que hablan sido elaboradas para expresar CD4 y la misma construcción de LTR-\beta-galactosidasa. Se demostró previamente que esta línea celular, identificada aquí por U373-MAGI; no había podido ser infectada por ninguna cepa de VIH (M o T-trópico), sino que había podido convertirse en susceptible de infección por fusión con las células HeLa [Harrington and Geballe, mencionados más arriba).

Con el fin de construir líneas celulares indicadoras que pudieran detectar virus trópicos de célula T o de Macrófagos, 88C o 88-2B etiquetado con epítopo que codifica el ADN fue transfectado en células HeLa-MAGI o U373-MAGI mediante infección con un vector retroviral para generar las líneas celulares HeLa-MAGI-88C o U373-MAGI-88C respectivamente. La expresión de los correceptores en la superficie celular se demostró mediante inmunotinción de células vivas utilizando el anticuerpo anti-FLAG M1 y por RT-PCR.

Los genes de 88C y 88-2B utilizados para construir HeLa-MAGI-88C y U373-MAGI-88C incluían secuencias que codificaban el péptido señal de prolactina seguido de un epítopo FLAG tal como se ha descrito en el Ejemplo 4. Se insertó este gen en el vector retroviral pBabe-Puro [Morgenstern and Land Nucleic Acids Research, 18 (12): 3587-3596 (1990)]. Stocks del vector retroviral de título elevado pseudotipado con la proteína VSV-G se elaboraron mediante transfección transitoria tal como se describe en Bartx y col., J. Virol. 70:2324-2331 (1996), y se utilizaron para infectar células HeLa-MAGI y U373-MAGI. Se agruparon células resistentes a 0,6 \mug/ml de puromicina (HeLa) o 1 \mug/ml de puromicina (U373). Cada grupo contenía al menos 1000 eventos independientes de transducción. Se utilizó un stock de paso temprano (paso 2) de las células originales HeLa-MAGI [Kimpton y Emerman, mencionados anteriormente) para crear células HeLa-MAGI-88C.

Las infecciones de las líneas celulares indicadoras con VIH se realizaron en placas de 12 pocillos con diluciones seriadas en base 10 de 300 \mul de virus en presencia de 30 \mug/ml de DEAE-Dextran tal como se describe [Kimpton and Emerman, citados más arriba].

Todas las cepas de VIH-1 y VIS_{mac239} se obtuvieron todas a partir del Programa de Reactivos y Referencias del VIH SIDA. Se obtuvieron de B. Hahn clones moleculares de VIH-2_{7312a} primario [Gao y col., "Genetic Diversity of Human Immunodeficiency Virus Type 2: Evidence for Distinct Sequence Subtypes with Differences in Virus Biology", J. Virol., 68(11):7433-7447 (1992)] y VISsmPbjl.9 [Dewhurst y col., "Sequence Analysis and Acute Pathogenicity of Molecularly Cloned VISsinin-PBj14", Nature, 345:636-640 (1990)].

(UAB). Se obtuvieron todos los demás aislados de VIS_{inne} de Julie Overbaugh (U. Washington. Seattle). Se elaboraron stocks a partir de provirus clonados mediante transfección transitoria de 293 células. Se realizaron otros stocks virales por paso del virus en células mononucleares de sangre periférica humana o en células CEMxl74 (para los stocks de VIS). Los stocks virales se normalizaron por ELISA o p24^{gag} (Coulter Immunology) o p27^{gag} (Coulter Immunology) para el VIH-1 y VIH-2/VIS, respectivamente, utilizando estándares proporcionados por el fabricante.

Células U37 3-MAGI-8 8C y células U373-MAGI (controles) se infectaron con diluciones limitadoras de una cepa T-trópica de VIH-1 (VIH_{LAI}), una cepa M-trópica (VIH_{YU2-}) y un aislado de VIS, SIV_{MAC}239. Se midió la infectividad mediante conteo del número de células azules por pocillo por volumen de virus (Tabla 2).

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TABLA 2

2

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Dos días después de la infección, se fijaron las células y se tiñeron en busca de la actividad de \beta-galactosidasa con X-gal. Las células MAGI derivadas de U373 se tiñeron durante 120 minutos a 37ºC y se tiñeron las células MAGI derivadas de HeLa durante 50 minutos a 37ºC. La tinción de fondo de las células no infectadas no sobrepasó nunca más de aproximadamente tres células azules por pocillo. Se contaron solamente células de color azul oscuro, y se contó sinticio con múltiples núcleos como única célula infectada. El titulo infeccioso es el número de células azules por pocillo multiplicado por la dilución de virus y normalizado a 1 ml. El titulo de VIH_{YU-2} en las células U373-MAGI-88C fue de 2 x 10^{6}. Por otra parte, el titulo de VIH-I_{LAI} fue inferior a 100 sobre U373-MAGI-88C. Por lo tanto, la especificidad de una cepa particular de VIH para 88C variaba en cuatro órdenes de magnitud.

Aunque la infección de VIS_{MAC}239 aumentó a 4 x 10^{5} en U373-MAGI-88C, infectó también claramente las células U373-MAGI (Tabla 2).

A continuación, se analizó una serie de cepas no clonadas de VIH primario y cepas M-trópicas clonadas de VIH en busca de su capacidad para infectar líneas celulares indicadores que expresan 88C.

Tal como se ha descrito anteriormente, se infectaron células HeLa-MAGI y HeLa-MAGI-88C con diluciones limitadoras de varias cepas de VIH. Los dos virus M-trópicos clonados, VIH_{JR-CSF} y VIH_{YU-2}, infectaron ambos las células HeLa-MAGI-88C, pero no las HeLa-MAGI, mostrando que ambas cepas utilizan 88C como correceptor (Tabla 3. Véase la nota c). Sin embargo, se observó gran disparidad en la capacidad de cada una de estas dos cepas virales para infectar las células HeLa-MAGI-8 8C, 6,2 x 10^{5} IU/ml para el VIH_{YU-2} y 1,2 x 10^{4} para el VIH_{JR-CSF}. La infectividad del stock de virus (Tabla 3) es el número de unidades infecciosas por partícula física (representado aquí por la cantidad de proteína del núcleo viral). Además, se observó que la infectividad de estas dos cepas clonadas virales era diferente en más de 50 unidades en los stocks virales que se hablan preparado independientemente.

La variabilidad de la infectividad de los aislados primarios virales se estudió además mediante el análisis de una colección de doce stocks diferentes de virus no clonado procedentes de tres ciados diferentes (Tabla 3). Se utilizaron tres aislados primarios de ciado A, tres de ciado E y tres adicionales de ciado B procedentes de orígenes geográficamente diversos. Con las nueve cepas, se pudieron detectar cepas primarias de VIH en las células HeLa-MAGI-88C, pero no en las células HeLa-MAGI (Tabla 3). Sin embargo, la eficacia de infección oscilaba entre cinco unidades infecciosas por ng de p24^{gag} y más de 100 unidades infecciosas por ng de p24^{gag} (Tabla 3). Estos resultados indican que la infectividad absoluta de las cepas M-trópicas varia considerablemente y es independiente del ciado. Existe una hipótesis que puede explicar esta diferencia en lo que puede implacar la afinidad del bucle V3 de cada cepa viral para 88C después de la unión de CD4 [Trkola y col., Nature, 384 (6605): 184-187 (1996): Wu y col., Nature, 384 (6605): 179-183 (1996)].

TABLA 3

3

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Se determinó también la capacidad de las células HeLa-MAGI-88C para detectar VIH-2 y otras cepas del VIS. Se ha reportado que VIH-2_{Rod} utiliza fusina como receptor aún en ausencia de CD4 [Endres y col., Cell, 87 (4):745-756 (1996)]. VIH-2_{Rod} es capaz de infectar las células HeLa-MAGI, sin embargo su infectividad aumenta al menos de 10 veces en HeLa-MAGI-88C (Tabla 4). Las células HeLa expresa de forma endógena la fusina. Así, el clon molecular de VIH-2_{Rod} es trópico doble, y es capaz de utilizar 88C como uno de sus correceptores además de CXCR4. De forma similar, una cepa primaria de VIH-2_{7312A} infectó células HeLa-MAGI-88C y no células HeLa-MAGI, lo que indica que, como la cepa primaria del VIH-1, utiliza 88C como receptor.

TABLA 4

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Ninguna de las cepas de VIS sometidas a prueba infectó las células HeLa-MAGI (Tabla 4), y ninguna célula HeLa-MAGI infectada que exprese 88-2B. Esto indica que un correceptor alternativo utilizado por VIS en células U373 no se expresa en las células HeLa, y no es 88-2B. Todas las cepas de VIS sometidas a prueba infectaron las células HeLa-MAGI-88C hasta cierto punto (Tabla 3) lo que indica que todas las cepas de VIS sometidas a prueba utilizan al menos 88C como uno de sus correceptores.

La clasificación de cepas M-trópicas y T-trópicas del VIH en el pasado ha sido puesta en correlación a menudo con otra designación "no inductoras de sincitio" (NSI) e "inductoras de sincitio" (SI), respectivamente. Ensayos basados en líneas celulares descritas aquí son sensibles a la formación de sincitio. Las células infectadas pueden formar grandes y pequeños focos de infección que contienen múltiples núcleos [Kimpton y Emerman, mencionados
anteriormente).

Los experimentos que utilizan múltiples cepas virales diferentes y U373-MAGI-88C o HeLa-MAGI-88c indican que la designación SI/NSI no es significativa debido a que todas las cepas virales formaron sincitios si estaba presente el correceptor correcto. Estos experimentos muestran que la formación de sincitio es probablemente un marcador de la presencia de un correceptor apropiado en la célula infectada, más que una indicación de tropismo. Se reportó en la literatura que la infección de las células HeLa-MAGI-88C con cepas de VIS es de cepas no formadoras de sincitio, en particular, VIS_{MAC}239. VIS_{MNE}c18 y VIS_{MNE}170 fueron notables debido a que el tamaño de los sincitios inducidos en la monocapa era mucho más grande que los inducidos por cualquier otra cepa de VIH.

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Ejemplo 8

Se prepararon anticuerpos monoclonales de ratón que reconocen específicamente 88C. Los anticuerpos se produjeron mediante la inmunización de ratones con un péptido correspondiente a veinte aminoácidos amino terminales de 88C. El péptido fue conjugado a Cianina de Megathura Crenulata (lapa californiana)(KLH) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Pierce, Inject maleimide activated KLH), emulsionada con adyuvante completo de Freund e inyectada en cinco ratones. Dos inyecciones adicionales de péptido conjugado a adyuvante completo de Freund se aplicaron a intervalos de tres semanas. Diez días después de la última inyección, se sometió a prueba el suero de cada uno de los cinco ratones en busca de la inmunorreactividad con el péptido de veinte aminoácidos por ELISA. Además, la inmunorreactividad de los sueros se sometió a prueba contra el receptor 88C intacto expresado en la superficie de 293 células mediante la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Se eligió el ratón con mejor actividad anti-88C para la fusión de células de bazo y producción de anticuerpos monoclonales por medio de métodos estándar de laboratorio. Se establecieron cinco líneas celulares monoclonales (227K, 227M, 227N, 227P, 227R) las cuales produjeron anticuerpos que reconocían el péptido por ELISA y la proteína de 88C en 293 células por FACS. Se mostró que cada anticuerpo reaccionaba solamente con las 293 células que expresaban 88C, pero no con las 293 células que expresaban el receptor MCP estrechamente relacionado (CCCKR-2). Se mostró también que cada anticuerpo reconocía 88C expresado transitoriamente en las células COS.

Se generaron también anticuerpos policlonales de conejo contra 88C. Se inyectó a dos conejos el péptido amino terminal conjugado tal como se ha descrito anteriormente. Los conejos fueron inmunizados además por cuatro inyecciones adicionales del péptido amino terminal conjugado. Suero procedente de cada uno de los conejos (2337J y 2470J) se sometió a prueba por FACS de 293 células que expresaban 88C. Los sueros reconocieron específicamente 88C en la superficie de 293 células.

Se sometieron a prueba los cinco anticuerpos monoclonales anti-88C en busca de su capacidad para bloquear la infección de células por VIS, virus de inmunodeficiencia en simios estrechamente relacionado con el VIH [Lehner y col., Nature Medicine, 2:767 (1996)]. Células T de CD4+ de simios, que son susceptibles normalmente de infección por VIS, se incubaron con el clon VIS_{mac}32HJ5 en presencia de los sobrenadantes del anticuerpo monoclonal anti-88C diluidos al 1:5. Se midió la infección por VIS mediante la determinación de la actividad de transcriptasa inversa (RT) el día nueve utilizando el método de detección y cuantificación RT (kit de ensayo Quan-T-RT, Amersham, Arlington Heights, IL). Cuatro de los anticuerpos fueron capaces de bloquear la infección por VIS: el anticuerpo 227K bloqueó en un 53%, 227M en un 59%, 227N en un 47%, y 227P en un 81%. El anticuerpo 227R no bloqueó la infección por VIS.

Los cinco anticuerpos monoclonales contra el péptido amino terminal 88C humano se sometieron a prueba también en busca de la reactividad contra 88C de macaco (SEQ ID NO:X) (que tiene diferencias de dos aminoácidos con respecto al 88C humano dentro de la región amino terminal peptídica). Las regiones de codificación de 88C humano y 88C de macaco se clonaron en el vector de expresión pcADN3 (Invitrogen). Estos plásmidos de expresión se utilizaron para transfectar las células COS utilizando DEAE. El vector vacío se utilizó como control negativo. Tres días después de la transfección, se cosecharon las células, se incubaron con los cinco anticuerpos monoclonales anti-88C y se prepararon para FACS. Los resultados mostraron que cuatro de los cinco anticuerpos (227K, 227M, 227N, 227P) reconocían el 88C de macaco mientras que uno (227R) no lo hacía. Los cinco anticuerpos reconocieron 88C humano tranfectado, y ninguno sometido a reacción cruzada con células transfectadas con el vector solo.

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Ejemplo 9

Se pueden utilizar métodos adicionales para identificar ligandos y moduladores de los receptores de quimiocinas de la invención.

En una realización, la invención comprende un ensayo directo de ligandos. Se exponen compuestos de prueba marcados de forma detectable a preparaciones de membrana que presentan receptores de quimiocinas en una conformación funcional. Por ejemplo, células HEK-293 o células de cultivo de tejido, son transfectadas con un vehículo de expresión que codifica un receptor de quimiocinas. Se elabora entonces una preparación de membrana a partir de las células transfectadas que expresan el receptor de quimiocina. La preparación de membrana se expone a compuestos de prueba marcados con ^{125}I (por ejemplo, quimiocinas) y se incuba en condiciones adecuadas (por ejemplo, 10 minutos a 37ºC). Las membranas, con cualquier compuesto de prueba unido, se cosechan entonces en un filtro mediante filtración al vacío y se lavan para eliminar los compuestos de prueba no unidos. La radioactividad asociada al compuesto de prueba unido se cuantifica entonces sometiendo los filtros a espectrofotometría de escintilación líquida. La especificidad de la unión del compuesto de prueba se puede confirmar repitiendo el ensayo en presencia de cantidades crecientes de compuesto de prueba no marcado y tomando nota del nivel de competición para la unión al receptor. Estos ensayos de unión pueden identificar también los moduladores de unión del receptor a quimiocinas. El ensayo de unión anteriormente descrito se puede realizar con las siguientes modificaciones. Además del compuesto de prueba marcado de forma detectable, se expone un modulador potencial a la preparación de membrana. Un nivel creciente de la marca asociada a la membrana indica que el modulador potencial es un activador; un nivel decreciente de la marca asociada a la membrana indica que el modulador potencial es un inhibidor de la unión del receptor a quimiocinas.

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En otra realización, la invención comprende ensayos indirectos para identificar los ligandos de receptores que aprovechan el acoplamiento de los receptores de quimiocinas a las proteínas G. Tal como lo revisan Linder y col., Sci. Am., 267:56-65 (1992), durante la transducción de señales, un receptor activado interactúa con una proteína G, activando a su vez la proteína G. La proteína G se activa mediante el intercambio de GDP y GTP. La hidrólisis posterior de GTP unido a proteína G desactiva la proteína G. Un ensayo de la actividad de la proteína G controla por lo tanto la liberación de ^{32}P de [\gamma-^{32}P]-GTP. Por ejemplo, 5 x 10^{7} células HEK-293 que albergan los plásmidos de la invención se cultivan en MEM + 10% de FCS. El medio de cultivo es completado por 5 mCi/ml de [^{32}P]-fosfato de sodio durante 2 horas para marcar uniformemente los grupos de nucleótidos. Posteriormente se lavan las células en un tampón bajo en fosfato isotónico. Entonces se expone una parte alícuota de células lavadas a un compuesto de prueba mientras se trata de forma similar una segunda parte alícuota, pero sin exposición al compuesto de prueba. Después de un periodo de incubación (por ejemplo, 10 minutos), las células se granulan, se lisan y los compuestos nucleotídicos se fraccionan utilizando una cromatografía en capa fina desarrollada con 1 M de LiCl. GTP y GDP marcados son identificados codesarrollando estándares conocidos. Entonces se cuantifican GTP y GDP marcados por medio de técnicas autorradiográficas que son estándares en la técnica. Niveles relativamente altos de GDP marcado con ^{32}P identifican los compuestos de prueba como ligandos. Este tipo de ensayo por hidrólisis de GTP es útil también para la identificación de moduladores de la unión de receptor a quimiocina. El ensayo mencionado anteriormente se realiza en presencia de un modulador potencial. Una señal intensificada que resulta de un aumento relativo en la hidrólisis de GTP, produciendo GDP marcado con ^{32}P, indica un incremento relativo en la actividad receptora. La señal intensificada identifica por lo tanto el modulador potencial como activador. A la inversa, una señal relativamente reducida para GDP marcado con ^{32}P, indicativa de una actividad receptora reducida, identifica el modulador potencial como inhibidor de la unión de receptor a quimiocina.

Las actividades de las moléculas efectoras de proteína G (por ejemplo, adenilil ciclasa, fosfolipasa C, canales iónicos y fosfodiesterasas) se pueden someter también a ensayo. Se han descrito anteriormente ensayos de las actividades de estas moléculas efectoras. Por ejemplo, la adenilil ciclasa, que cataliza la síntesis del monofosfato de adenosina cíclico (cAMP), es activada por proteínas G. Por lo tanto, la unión del ligando a un receptor de quimiocinas que activa una proteína G, que a su vez activa la adenilil ciclasa, se puede detectar controlando los niveles de cAMP en una célula huésped recombinante de la invención. Al implementar controles apropiados que son entendidos en la técnica, un nivel elevado de cAMP intracelular se puede atribuir a un aumento inducido por el ligando en la actividad receptora, identificando por este medio un ligando. De nuevo, al utilizar controles que se entienden en la técnica, una reducción relativa en la concentración de cAMP identificarla indirectamente un inhibidor de la actividad receptora. La concentración de cAMP se puede medir mediante un inmunoensayo comercial de enzimas. Por ejemplo, el Kit BioTrak proporciona reactivos para un inmunoensayo competitivo. (Amersham, Inc., Arlington Heights, IL). Por medio de este kit, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante, se diseña una reacción que implica hacer competir cAMP no marcado con cAMP conjugado a peroxidasa de rábano picante. Se puede obtener cAMP no marcado, por ejemplo, a partir de células activadas que expresan los receptores de quimiocinas de la invención. Los dos compuestos compiten para la unión de un anticuerpo anti-cAMP inmovilizado. Después de la reacción de competición, el conjugado inmovilizado de cAMP a peroxidasa de rábano picante se cuantifica por el ensayo con enzimas utilizando un sustrato de único frasco de tetrametilbenzidina/H_{2}O_{2} con detección de productos de reacción coloreados que tienen lugar a 450 nm. Los resultados proporcionan una base para calcular el nivel de cAMP no marcado utilizando técnicas que son estándares en el arte. Además de identificar la unión de ligandos a los receptores de quimiocinas, el ensayo con cAMP se puede utilizar también para identificar moduladores de la unión de receptores a quimiocinas. Por medio de las células huésped recombinantes de la invención, se realiza el ensayo tal como se ha descrito anteriormente, con la adición de un modulador potencial de la actividad receptora de quimiocinas. Por el uso de controles que se entienden en la técnica, un aumento o una reducción relativa en los niveles de cAMP intracelular refleja la activación o inhibición de la actividad adenilil ciclasa. El nivel de actividad adenilil ciclasa, a su vez, refleja la actividad relativa del receptor de quimiocinas en cuestión. Un nivel relativamente elevado de actividad receptora de quimiocinas identifica un activador; un nivel relativamente reducido de actividad receptora identifica un inhibidor de la actividad receptora de quimiocinas.

Aunque se ha descrito la presente invención en términos de realizaciones especificas, se entiende que aparecerán variaciones y modificaciones a los especialistas en la técnica. En consecuencia, sólo dichas limitaciones tal como aparecen en las reivindicaciones adjuntas deben formar parte de la invención.

<100> ICOS Corporation

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<120> Método y Materiales Receptores de Quimiocinas

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<130> E1 1668EPB/FB685

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<140> EP 07013395.4

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<141> 20-12-1996

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<160> 21

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<170> Versión patente 3.3

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<210> 1

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<211> 3383

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> característica_misc

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<223> OTRA INFORMACIÓN: /x "secuencias de polinucleótidos y aminoácidos de 88C"

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<220>

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<221> CDS

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<222> (55)...(1110)

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<400> 1

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7

8

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<211> 352

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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10

11

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<210> 3

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<211> 1915

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> característica_misc

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<223> OTRA INFORMACIÓN: /= "secuencias de polinucleótidos y aminoácidos de 88-2B"

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<220>

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<221> CDS

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<222> (362)...(1426)

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<400> 3

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12

13

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<210> 4

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

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16

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<210> 5

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> iniciador

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gacggatcca tygayagrta cctggcyaty gtcc

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34

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> iniciador

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gctaagcttt trtagggdgt ccayaagagy aa

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32

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> iniciador

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gataagcctc acagccctgt g

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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gctaagcttg atgactatct ttaatgtc

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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ccctctagac taaaacacaa tagagag

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27

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> iniciador

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gctaagctta tcacagggag aagtgaaatg

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> iniciador

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<212> ADN

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<223> iniciador

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<212> ADN

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<212> ADN

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<220>

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<223> iniciador

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<212> ADN

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<213> Esp. macaco

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(1056)

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17

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<210> 20

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<211> 352

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<212> PRT

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<213> Esp. macaco

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<211> 352

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 21

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21

22

23

Claims (7)

1. Método para identificar un ligando capaz de interactuar con el receptor de quimiocinas 88C, que se caracteriza por la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:2, comprendiendo dicho método las etapas de:

(a)

proporcionar una célula huésped que expresa dicho receptor, o una preparación de membrana que incluye dicho receptor,

(b)

poner en contacto e incubar dicho receptor, con un ligando del mismo, y

(c)

identificar la presencia de un ligando interactuado específicamente con dicho receptor.

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2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho ligando está marcado.

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque dicho ligando es un agonista o un antagonista.

4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicha interacción se identifica mediante la medición de la concentración o nivel de actividad de un componente de una vía de transducción de señales.

5. Método según la reivindicación 4, caracterizado porque dicha vía de transducción de señales se identifica mediante la medición de una actividad seleccionada de entre el grupo compuesto de: concentración de calcio, hidrólisis de GTP y actividad de la fosfolipasa C.

6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dicho receptor se pone en contacto y se incuba con un ligando y otro compuesto de prueba.

7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque dichas células son células HEK-293 o preparaciones de membrana de las mismas.