CZ262998A3 - Způsob syntézy oligonukleotid N3´- P5´fosforamidatů na pevné fázi - Google Patents

Description

(57) Anotace:

Vynález se týká způsobu syntézy oligonukleotid N3 - P5 fosforamidatů použitím výměnné reakce aminu fosforamiditů, v níž je 3 - aminoskupina zbavená chránící skupiny z oligonukleotidového řetězce neseného na pevné fázi zaměněna 5 -fosforamidatů vstupujícího monomeru, který má chráněnou 3 -aminoskupinu. Získaná internukleotidová fosforamiditová vazba je potom oxidována na formu stabilní chráněné fosforamidatové vazby.

• · · · • · · ·

0 *

0 0

0 0

0 0 0 0 0

0 · > 0 0 · 000 000

0

0 0*

72927

PV 2629-98

Způsob syntézy oligonukleotid N3'->P5' fosforamidatů na pevné fázi

Oblast techniky:

Vynález se týká obecně chemie polymerů nukleových kyselin, a konkrétně postupů syntézy oligonukleotid N3'-»P5' fosforamidatů.

Dosavadní stav techniky:

Chemie polymerů nukleových kyselin hrála významnou roli v mnoha rozvíjejících se technologiích v oblasti farmacie, diagnostiky a analytiky, a konkrétněji v podskupině antimediátorových a antigenových léčiv, kombinatorické chemii, amplifikaci signální větvené DNA, a DNA diagnostik a analýz na bázi souborů, například Uhlmann and Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584 (1990); Milligan a kol., J. Med. Chem. 36: 1923-1937 (1993); Mesmaecker a kol., Current Opinion in Structural Biology, 5: 343-355 (1995); Thuong a kol., Angew.Chem.Int.Ed.Engl., 32:666-690 (1993); Brenner a kol., Proč.Nati.Acad.Sci,, 89:5381-5383 (1992); Gold a kol., Ann.Rev.Biochem.,

64: 763-797 (1995); Gallop a kol., J.Med.Chem.37: 1233-1258 (1994); Gordon a kol., J.Med.Chem.37:1385-1401 (1994); Gryaznov, Mezinárodní přihláška PCT/US94/07557; Urdea a kol., americký patent US 5 124 246; Southern a kol., Genomics, 13:1008-1017 (1992); McGall a kol., americký patent US 5 412 087; Fodor a kol., americký patent US 5 424 186; Pirrung a kol., americký patent US 5 405 783; a podobné.

Mnoho z nich bylo chemiky vedeno na zlepšení vazebné pevnosti, specifičnosti a nukleasové resistence polymerů přírodních nukleových kyselin, jako je DNA. Naneštěstí však zlepšení jedné vlastnosti, jako je nukleasová resistence, zahrnuje často záměnu za jiné vlastnosti, takové, jako je vazebná pevnost. Příklady takových záměn jsou: peptidová nukleová kyselina (PNAs) vykazuje dobrou nukleasovou resistenci a vazebnou

4444 44 44

4 4 4 4 · 4 4 · • 4 444 444

4 4 4 •β 44 44 pevnost, ale má sníženou buněčnou absorpci v testovaných kulturách, například Habvey a.kol., Science, 258: 1481-1485 (1992); fosforthioaty vykazují dobrou nukleasovou resistenci a rozpustnost, ale typicky jsou syntetizovány jako P-chirální směsi a vykazují řadu sekvenčně nespecifických biologických účinků, například Stein a kol., Science, 261: 1004-1012 (1993); methylfosfonáty vykazují vykazují dobrou nukleasovou resistenci a buněčnou absorpci, ale také jsou typicky syntetizovány jako P-chirální směsi a mají sníženou stabilitu dvoušroubovice, například Mesmaeker a kol (citovaný výše); a tak dále.

V nedávné době byla objevena nová třída oligonukleotidů majících tak zvané N3'-»P5' fosforamidatové internukleosidové vazby, které vykazují velmi přijatelné vazebné vlastnosti, nukleasovou resistenci a rozpustnost, Gryaznov a Letsinger, Nucleic Acids Research, 20: 3403-3409 (1992); Chena kol., Nucleic Acids Research, 23: 2661-2668 (1995); Gryaznov a kol., Proč. Nati. Acad. Sci., 92: 5798-5802 (1995); a Gryaznov a kol., J.Am.Chem.Soc., 116: 3143-3144 (1994). Nízké výtěžky syntéz těchto sloučenin se zveřejněnými protokoly však naneštěsí zamezují jejich komerčnímu využití.

Použití této nové třídy oligonukleotidových analogů by mělo být výrazně zvýšeno, pokud budou nalezeny modifikace a nová pojetí syntéz, která zlepší výtěžky syntéz bez ztrát jakýchkoliv jiných vlastností z vlastních vynikajících vlastností uvedených výše.

Podstata vynálezu:

S ohledem na výše uvedené je důležitým předmětem našeho vynálezu poskytnutí nového řešení syntéz v pevné fázi oligonukleotid N3'—»P5' fosforamidatů, při nichž jsou výrazně zvýšeny postupně se spojující výtěžky.

Jiným předmětem našeho vynálezu je poskytnout nové 3'-chráněné amino-5'-fosforamidatové monomery pro použití v postupu podle vynálezu.

Dalším předmětem vynálezu je poskytnout praktické postupy syntéz v • · ·

·« ·· • · f • · · ·

širokém měřítku pro přípravu oligonukleotid N3'—>P5' fosforamidatů, zejména 2'-deoxyoligonukleotid N3'-»P5' fosforamidatů.

Tyto a další předměty našeho vynálezu jsou doprovázeny poskytnutím postupu syntézy oligonukleotid N3'—>P5' fosforamidatů použitím výměnné reakce aminu, v níž je 3'-aminoskupina zbavená chránící skupiny z oligonukleotidového řetězce neseného na pevné fázi substituována aminočástí 5'-fosforamidatů vstupujícího monomeru, který má chráněnou 3'aminoskupinu. Získaná internukleotidová fosforamiditová vazba je potom oxidována na formu stabilní chráněné fosforamidatové vazby. Obecné schéma reakce je znázorněno dále.

o^^CN

N-F>

NH

I

Tetrazol

1,/fp

- i pyr/THF

NH t

Tr

Obecně, postup podle vynálezu zahrnuje následující kroky:

(a) poskytnutí prvního nukleosidu navázaného na nosič z pevné fáze, první nukleosid má chráněnou 3'-aminoskupinu; (b) odebrání chránící skupiny z chráněné 3'-aminoskupiny na formu volné 3'-aminoskupiny; (c) reakci volné 3'-aminoskupiny s monomerem 3'-chráněným aminonukleosid-5'fosforamiditem za vzniku internukleosidové N3'-»P5' fosforamiditové vazby;

(d) oxidaci uvedené vazby; a (e) opakování kroků (b) až (d), až je syntetizován požadovaný oligonukleotid N3'—>P5' fosforamidat. Výhodně je dusíkovou částí 5'-fosforamiditu ze 3'-chráněného aminonukleosid-5'-fosforamiditového monomeru stericky bráněný amin, který má pK_a alespoň 10.

Vynález dále zahrnuje 3 '-chráněné-aminonukleosid-5'-fosfor-amiditové monomery následujícího vzorce, přičemž tyto monomery jsou zejména vhodné pro postup podle vynálezu:

φ φ · · φφφ· · φ · · φφ φφφφ φφ φφφ φφφ φφφ φφφφ φ φ ·· φφφφ φφ φφ φφ ··

B kde: B je pyrimidin, purin, nebo jejich analog; R¹ je fosfátová chránící skupina W je buď -NHR² nebo -OR⁷, kde R² je amin chránící skupina a R⁷ je hydřoxyl chránící skupina; R³ je vodík, hydřoxyl, fluor nebo -OR', kde R' je alkyl s 1 až 3 atomy uhlíku nebo 2'-hydroxyl chránící skupina, jako je alkylsilyl, např. tbutyldimethylsilyl, nebo podobné; a R⁴ a R⁵ dohromady s dusíkem, na který jsou navázány, tvoří alkylaminovou nebo arylaminovou odstupující skupinu, která má do 40 atomů uhlíku a/nebo heteroatomy vybrané ze skupiny sestávající z kyslíku, síry a dusíku.

Monomery s W jako -OR⁷ jsou zejména vhodné pro syntetizování chimérických oligonukleotidů obsahujících N3'—»P5' fosforamidatové vazby i další vazby, jako fosfodiesteru, fosforthioátu a podobné.

Vynález překonává kritické nedostatky postupů syntéz oligonukleotid N3'—>P5' fosforamidatů, majících buď plně amidované nebo částečně amidované vazby, známých ze stavu techniky, a otevírají cestu pro komerční širokou výrobu takových sloučenin. Konkrétně poskytuje vynález značně zvýšené výtěžky interakcí při použití mnohem nižších molárních ekvivalentů monomerních reaktantů, které, naopak, umožňují komerčně proveditelné syntézy oligonukleotid N3'-»P5' fosforamidatů. Vynález umožní rozsáhlou aplikaci sloučenin v širokém poli působení, včetně vědeckého a průmyslového výzkumu, léčiv a diagnostik.

Popis obrázků:

Obrázek 1 je ³¹P-NMR spektrum směsi N6-benzoyl-3'-tritylamino-2'-

deoxyadenosin-5'-(2-kyanoethyl-N,N-diisopropyl)-fosforamiditu a tetrazolu. Obrázek 2 je ³¹P-NMR spektrum směsi 3'-tritylaminothymidin-5'-(2kyanoethyi-(2,2,6,6-tetramethylpiperidinyl)-fosforamiditu a tetrazolu.

Obrázek 3a a 3b jsou chromatogramy iontové výměny dvou surových oligonukleotid N3'->P5' fosforamidatů syntetizovaných amino-výměnnou reakcí podle vynálezu.

Obrázek 4 je HPLC chromatogram iontové výměny surové reakční směsi ze syntézy oligo-2'-fluornukleosid N3'-»P5' fosforamidatů z příkladu 19.

Definice

Kdykoliv je oligonukleotid vyjádřen sekvencí písmen, jako je „ATGUCCTG“, je zřejmé, že nukleotidy jsou v pořadí 5'—>3' zleva doprava a že „A“ označuje deoxyadenosin, „C“ označuje deoxycytidin, „G“ označuje deoxyguanosin, „T“ označuje thymidin a „U“ označuje deoxyuridin, pokud není uvedeno jinak.

Jak se používá zde, „ N3'-»P5' fosforamidat“ znamená internukleosidovou vazbu ve formě:

3'-NH-P(=X)(0R¹)-0-5' kde 3'a 5'označují atom uhlíku v částech cukru v po sobě jdoucích nukleosidech, které jsou navázány pomocí vazby, a kde R¹ je vodík nebo fosfát chránící skupina, a X je chalkogen, výhodně kyslík nebo síra. Přesněji, pokud R¹ je fosfát chránící skupina, může jí být alkyl, alkenyl, aryl, aralkyl nebo cykloalkyl obsahující do 10 atomů uhlíku. Výhodně, pokud R¹ je fosfát chránící skupina, její alkyl s 1 až 6 atomy uhlíku; β-substituovaný ethyl odebírající elektrony, konkrétně β-trihalogenmethyl-, β-kyano-, β-sulfo- nebo β-nitro-substituovaný ethyl; elektron odebírající substituovaný fenyl, zejména halogen-, sulfo-, kyano- nebo nitrosubstituovaný fenyl; nebo elektron odebírající substituovaný fenylethyl. Výhodněji, pokud R¹ je fosfát chránící skupina, může jí být methyl, βkyanoethyl nebo 4-nitrofenylethyl. Výhodněji, R¹ je vodík, methyl nebo βkyanoethyl. Elektron odebírajícími substituenty jsou typicky halogenový substituent, kyanosubstituent, nitrosubstituent, sulfosubstituent nebo mono-, di- nebo trihalogenmethyl, a podobné. Atomy halogenu jako substituenty jsou obvykle fluor, chlor, brom nebo jod; výhodně jsou jimi atomy fluoru a chloru. „ Elektron odebírající“ označuje snahu substituentu přitahovat valenční elektrony molekuly, jíž je částí, to znamená, že je elektronegativní, viz. Březen, Advanced Organic Chemistry, str. 16-18 (John Wiley, New York, 1985). Návod pro výběr fosfát chránící skupiny je poskytnut v Beaucage a Iyer Tetrahedron 48:2223-2311 (1992). Pro pohodlnost jsou zde někdy nukleotidové fosforamidaty označovány dolním indexem „np“ nebo „pn“ pro N3'-»P5' fosforamidaty, resp. P3'-»N5' fosforamidaty. Tudíž „UnpU“ je dinukleotid, v němž 3'-aminouridin a uridin jsou navázány N3'-»P5' fosforamidatovou vazbou. Obdobně jsou 2'-fluorsubstituenty označovány horním indexem „f“. Tudíž „U^fnpU“ je dinukleotid, v němž 5'-většina 3'-amino2'-fluoridinu je navázána na uridin N3'-»P5' fosforamidatovou vazbou. Jednotlivé úvodní písmeno, jako dolní index, „p“, označuje 5'monofosfat, a jednotlivé připojené jako dolní index „n“ označuje 3'-aminoskupinu.

Jak se zde používá termín ,,N3'-»P5' fosforamiditová vazba“ (vloženo zdůraznění), týká se forforitého (III) meziproduktu N3'-»P5' fosforamidatové vazby. V souladu s vynálezem je N3'-»P5' vazba tvořena oxidováním N3 —»P5' fosforamiditové vazby.

„Nukleosid“, jak se zde používá, zahrnuje přírodní nukleosidy, včetně 2'-deoxy a 2'-hydroxylových forem, např. jak je popsáno v Kornberg a Baker, DNA Replication, 2. vyd., (Freeman, San Francisco, 1992). „Analogy“ v odkazech na nukleosidy zahrnují syntetické nukleosidy, které mají modifikované bázické části a/nebo modifikované části cukrů, např. jak popsal Sheit, Nucleotide Analogs (John Wiley, New York, 1980). Tyto analogy zahrnují syntetické nukleosidy určené pro zlepšení vazebných • · · ·

• · · · • · · · • · · · · · • · • · · · vlastností, jako stability, specificity, nebo podobných, jako jsou popsány Uhlmannem a Peymanem (citované výše).

„Pyrimidin“, jak se zde používá, označuje pyrimidiny vyskytující se v přírodních nukleosidech, zahrnujících cytosin, thymin, a uráčil, a jejich běžné analogy, jako jsou ty, které obsahují oxy-, methyl-, propinyl-, methoxy-, hydroxyl-, amino-, thio-, halogen- a podobné substituenty. Termín, jak se zde používá, zahrnuje dále pyrimidiny s navázanou běžnou chránící skupinou, jako je N⁴-benzoylcytosin. Další běžné chránící skupiny pyrimidinu popsali Beaucage a Iyer (citovaní výše).

„Purin“, jak se zde používá, označuje puriny, které se vyskytují v přírodních nukleosidech, zahrnující adenin, guanin, a hypoxanthin, a jejich běžné analogy, jako ty, které obsahují oxy-, methyl-, propinyl-, methoxy-, hydroxyl-, amino-, thio-, halogen- a podobné substituenty. Termín, jak se zde používá, zahrnuje dále puriny s navázanou běžnou chránící skupinou, jako je N²-benzoylguanin, N²-isobutyrylguanin a N⁶-benzoyladenin. Další běžné chránící skupiny purinu popsali Beaucage a Iyer (citovaní výše).

„Oligonukleotid N3'-»P5' fosforamidat“ označuje oligomer, obvykle lineární, z nukleosidových podjednotek spojených alespoň jednou N3'—>P5' fosforamidatovou vazbou. Nukleosidové podjednotky obvykle obsahují nukleosidy nebo analogy nukleosidů, ale mohou také obsahovat více obvyklé části, které mají kompatibilní chemické chování, jako jsou bázické cukry a jiné uhlovodíkové části, jako které jsou popsány v následujících referencích; Newton a kol., Nucleic Acids Research, 21:1155-1162 (1993); Griffin a kol., J Am. Chem. Soc., 114: 7976-7982 (1992); Jaschke a kol., Tetrahedron Letters, 34: 301-304 (1992); Ma a kol., Mezinárodní přihláška PCT/CA92/00423; Zon a kol., Mezinárodní přihláška PCT/US90/06630; Durand a kol., Nucleic Acids Research, 18; 6353-6359 (1990); Salunkhe a kol., J.Am.Chem.Soc., 114:87688772 (1992); a podobné. Výhodněji termín označuje oligonukleotid, kde jsou všechny internukleosidové vazby nahrazeny N3'-»P5' fosforamidatovými vazbami, tedy tento výraz se částečně chápe jako plně „amidované“ oligomery. Ještě výhodněji označuje oligonukleotid, kde jsou všechny oligonukleotidové vazby nahrazeny ·· ·· • · ♦ · • · · · · • · · fe · · • · · · · • · · ··· fefe • fe · · · • · · · · • · ··· ··· • · ·

N3 —»P5' fosforamidatovými vazbami a kde nukleosidové podjednotky jsou přírodní nukleosidy nebo jejich analogy. Oligonukleotid N3'-»P5' fosforamidat podle vynálezu, v němž každá vazba je N3'-»P5' fosforamidatová vazba („plně amidovaná“), může být zakotven v nebo navázán na jiné oligonukleotidy nebo polynukleotidy za vzniku velkého oligomeru, který je „částečně amidován“. Například plně amidovaný oligonukleotid N3'-»P5' fosforamidat A_npA„pGnpCnpCn je zakotven do velkého oligonukleotidu

GGCCAAAA_npAnpGnpCnpC_npACTAT (SEQ ID NO:1), nebo je navázán na „TTTATC“ jako větší oligonukleotid: A_npA_npGnpC_npCnpTTTATC (SEQ ID NO:2). Tyto chimérické oligonukleotidy, které mohou být použity jako PCR primery, záchytné sondy, a podobné, jsou zahrnuty do rozsahu vynálezu.

Termín „oxidovat“, „oxidace“, a podobné termíny, jak se zde používají, ve spojení s internukleosidovou vazbou obsahující fosfor, znamenají způsob nebo zpracování pro konverzi atomu fosforu ve vazbě z formy fosforu (III) na formu fosforu (V).

Termín „fosforamiditová aminoskupína“, jak se zde používá, označuje aminoskupinu, -NR⁴R⁵, navázanou na atom fosforu z fosforamiditové skupiny, a termín „fosforamiditový dusík“ označuje atom dusíku z fosforamiditové aminoskupiny.

Termíny „sterické bránění/chránění“, „stericky bráněný/chráněný“ a podobné, jak se zde používají, označují účinek „objemných“ skupin na chemickou reaktivitu, např. Morrison a Boyd, Organic Chemistry, str. 603 (Allyn a Bacon, Boston, 1978).

Detailní popis vynálezu:

Vynález je veden na metodu syntézy, v pevné fázi, oligonukleotid

N3'—>P5' fosforamidatů, v nichž probíhá spojování fosforamiditových monomerů na volnou aminoskupinu růstového řetězce přes výměnu fosforamiditové aminoskupiny monomeru s volnou 3'aminoskupinou růstového řetězce. Výhodně jsou oligonukleotid N3'-»P5' fosforamidaty fl · · fl • · flfl • flfl · • flfl • · · • fl ···· ·« ··♦· • fl ·· • · fl «

• · připravené postupem podle vynálezu popsány vzorcem:

^ΗΟ·^γ

HN RJ

Κ·γ· •Q

R* R³ kde: B je purin nebo pyrimidin nebo jejich analog; X je chalkogen, výhodně kyslík nebo síra, a ještě výhodněji kyslík; R³ je vodík, fluor nebo hydroxyl, přednostně vodík; R⁶ je aminoskupina nebo hydroxyl; Z je vodík nebo kationtový protiion, jako je alkalického kovu, aminový kation jako je amonium, triethylamonium nebo podobné. Výhodně je n v rozmezí od 1 do několika set; výhodněji n je v rozmezí od asi 1 do asi 50; a nejvýhodněji n je v rozmezí od 1 do 30.

Výhodně mají oligo-2'-fluornukleotid N3'-»P5' fosforamidaty podle vynálezu délku mezi 2 a 30 nukleotidy. Výhodněji délky mezi 8 a 25 nukleotidy; a nejvýhodněji jsou mezi 8 a 20 nukleotidy délky.

Jak bylo zmíněno výše, zahrnují obecné kroky postupu (a) poskytnutí prvního nukleosidu navázaného na nosič z pevné fáze, první nukleosid má chráněnou 3'-aminoskupinu; (b) odebrání chránící skupiny z chráněné 3'aminoskupiny na formu volné 3'-aminoskupiny; (c) reakci volné 3'aminoskupiny s 3'-chráněným aminonukleosid-5'-fosforamiditovým monomerem za vzniku internukleosidové N3'-»P5' fosforamiditové vazby; (d) oxidaci uvedené vazby; a (e) opakování kroků (b) až (d), až je syntetizován požadovaný oligonukleotid N3'—»P5' fosforamidat.

Ačkoliv výměnná reakce aminu podle vynálezu závisí na reverzibilní rovnováze mezi reaktanty a produkty (znázorněno dále v rovnicích la a lb) na rozdíl od většiny pojetí syntéz oligonukleotidů v pevné fázi, které zahrnují nevratné slučovací kroky, uvažovaný návod pro provádění výběrů • · ·« ····

·· • · · · ·· ·· • · · ♦ • · · · týkajících se podmínek slučování, chránících skupin, nosičů, kterými je pevná fáze, spojovacích skupin, činidel odebírajících chránící skupiny, činidel pro odštěpení produktů z pevných nosičů, purifikace produktu a podobných ve spojení s předloženým vynálezem lze nalézt v literatuře, jako Gait, vydavatel, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL, Press, Oxford, 1984); Amarnath a Broom, Chemical Reviews, Vol. 77, str. 183-217 (1977); Pon a kol., Biotechniques, Vol.6. str. 768-775 (1988); Ohtsuka a kol., Nucleic Acids Research, Vol 10, str. 6553-6570 (1982); Eckstein, vydavatel (citovaný výše), Greene a Wuts (citovaní výše), Narang, vydavatel, Synthesis and Applications of DNA and RNA (Academie Press, New York, 1987), Beaucage a Iyer (citovaní výše) a podobných odkazech.

R‘ _?OR ’

HN R’ R^J

N=N . HŇ. I \^Ň .

K, ' i*³*' ®Ν. Ο-χ o B

HN R³ d² + Λ ^HJ R^s

-Λ·

Ln .

HN R¹ R^J

HN I \aíN

Ve vynálezu lze použít široké řady nosičů s pevnou fází, včetně mikročástic vyrobených ze skla s regulovanými póry (CPG), vysoce zesítěného polystyrenu, akrylových kopolymerů, celulózy, nylonu, dextranu, latexu, polyakroleinu a podobných , popsaných v následujích příkladných odkazech: Meth.Enzymol.,sekce A, str. 11-147, vol. 44 (Academie Press, New York, • · ·« ···· · · · · · · · 11··· ···· »· ····

1976); americké patenty US 4 678 814; 4 413 070; a 4 046720; a Pon , kapitola 19 v Agrawal, vydavatel, Methods in Molecular Biology,

Vol. 20, (Humana Press, Totowa, NJ, 1993). Nosiče dále zahrnují polystyrénové perličky; polystyren roubovaný s polyethylenglykolem (např. TentaGel^(R), Rapp Polymere, Tubingen, Německo); a podobné. Výběr z charakteristik nosiče, jako je materiál, porozita, velikost, tvar a podobné, a použitý typ vazebné části, závisí na řadě faktorů, jako jsou použité chránící skupiny, délka výsledného produktu, množství výsledného produktu a podobné. Příkladové vazebné části jsou popsány v Pon a kol, Biotechniques, 6:768-775 (1988); Webb, americký patent US 4 659 774; Barany a kol., Mezinárodní patentová přihláška PCT/US91/06103; Brown a kol., Chem. Soc. Commun., 1989: 891-893; Damba a kol, Nucleic Acids Research, 18: 3813-3821 (1990); Beattie a kol., Clinical Chemistry, 39; 719-722 (1993); Maskos a Southern, Nucleic acids Research, 20: 1679-1684 (1992); a podobné.

Výhodnými pevnými nosiči pro použití podle předloženého vynálezu jsou CPG a polystyren roubovaný polyethylenglykolem a vykazující koncové aminoskupiny (jako TenaGel-NH2^<R), Rapp Polymere, Tubingen Německo). Aminopropylová skupina je preferovaným spacerem mezi CPG a nukleosidovou vazbou. Preferovanou vazbou na 5'-hydroxyl z prvního nukleosidu je sukcinylová skupina, která poskytuje bázicky nestálou esterovou vazbu, která se typicky štěpí po syntéze s vodným ammoniem.

Monomery podle vynálezu zahrnují 2'-fluor-3 -chráněné aminonukleosid-5'-fosforamidaty, 2'-deoxy-3'-chráněné aminonukleosid-5'fosforamidaty, 2'-chráněné-3'-chráněné aminoribonukleosid -5'-fosforamidaty, a jejich 3'-chráněné-3'-hydroxylové protistrany. Výhodně jsou monomery podle vynálezu definovány vzorcem:

B «· «« • · · · • · · • · · • · · ·» ·»·· ·· ««·· • · · • · · • · · • · · · ·· ·· ·· ·· • · · · • · · · ·· · ··· • · ·· ·· kde B, W, R¹, R³, R⁴ a R³ jsou definovány výše.

Výhodněji je -NR⁴R⁵ stericky chráněná aminoskupina, která může sestávat z následujících výhodných provedení:

Za prvé, R⁴ a R⁵ samostatné jsou alkyl, aralkyl, cykloalkyl nebo cykloalkylalkyl, kde R⁴ a R⁵ mají dohromady celkově od 6 do 20 atomů uhlíku. Ještě výhodněji R⁴ a R⁵ samostatně jsou alkyl mající od 1 do 8 atomů uhlíku. Při dalším výhodném provedení, R⁴ a R⁵, pokud se vezmou samostatně, jsou isopropyl, sek.butyl, isobutyl, t.butyl, cyklohexyl, nebo 2-ethylhexyl. Nejvýhodněji, vzaty samostatně R⁴ je isopropyl, zatímco R⁵ je t.butyl.

Za druhé, R⁴ a R⁵ vzaty dohromady mohou tvořit alkylenový řetězec obsahující do 12 atomů uhlíku v základním řetězci a celkově od 4 do 20 atomů uhlíku s oběma koncovými valenčními vazbami uvedeného řetězce navázanými na atom dusíku, na nějž jsou navázány R⁴ a R³. V dalším výhodném provedení R⁴ a R³ vzaty dohromady tvoří alkylenový řetězec obsahující do 6 atomů uhlíku v základním řetězci a celkově od 4 do 12 atomů uhlíku s oběma koncovými valenčními vazbami uvedeného řetězce navázanými na atom dusíku, na nějž jsou navázány R⁴ a R³.

Za třetí, R⁴ a R³ vzaty dohromady a s dusíkem, na nějž jsou navázány, tvoří nasycený heterocykl s dusíkem, který má do 10 atomů uhlíku nebo heteroatomů v základním řetězci a celkově od 4 do 20 atomů uhlíku nebo heteroatomů společně, tak, že R⁴ a R³ vzaty dohromady a s dusíkem, na nějž jsou navázány, obsahují do tří heteroatomů vybraných ze skupiny sestávající z dusíku, kyslíku a síry. V dalším výhodném provedení, R⁴ a R³ vzaty dohromady a s dusíkem, na nějž jsou navázány, tvoří nasycený heterocykl s dusíkem, který má do 10 uhlíkových atomů a až tři další heteroatomy vybrané ze skupiny sestávající z dusíku, kyslíku a síry. Ještě výhodněji, R⁴ a R³ vzaty dohromady a s dusíkem, na nějž jsou navázány, jsou pyrrolidino-, morfolino-, tetramethylguanidinyl nebo piperidino-. Ještě výhodněji, R⁴ a R³ vzaty dohromady a s dusíkem, na nějž jsou navázány, jsou dimethylpiperidinyl, pyrrolidinyl, dimethylmorfolino-, tetramethylmorfolino-, dimethylpyrrolidinyl, tetramethylpyrrolidinyl nebo tetramethylpiperidinyl. Ještě výhodněji, R⁴ a R³ ·· ·· • β · ·

W Φ · · • · · · · «I vzaty dohromady a s dusíkem, na nějž jsou navázány, jsou 2,2,6,6tetramethylpiperidinyl,

2,6-dimethylpiperidinyl, nebo 2,5-dimethylpyrrolidinyl. Nejvýhodněji, R⁴ a R⁵ vzaty dohromady a s dusíkem, na nějž jsou navázány, je 2,2,6,6tetramethylpiperidinyl.

Monomery pro použití v postupu jsou výhodně 2'-deoxy-3'-chráněné aminonukleosid-5'-fosforamidity. V dalším výhodném provedení má fosforamiditová aminoskupina pKa alespoň 10,0. Ještě výhodněji je fosforamiditová aminoskupina vybrána tak, že tetrazolová aktivační rovnovážná konstanta Ki, jak je definována dále, a jak je měřena v příkladu 9, je vyšší než 10 M¹. Ještě výhodněji je rovnovážná konstanta vyšší než 100 M' \ a nej výhodněji je rovnovážná konstanta vyšší než 1000 M'¹.

Tetrazolová aktivační rovnovážná konstanta Ki je definována takto:

[Tetrazolidylamidit] [R₂NH₂ ⁺tetrazolid·] Ki = [Tetrazol]² [monomer amidit] kde [Tetrazolidylamidit] je rovnovážná koncentrace meziproduktu tetrazolidylamiditu, [Tetrazol] je rovnovážná koncentrace tetrazolu, [monomer amidit] je rovnovážná koncentrace fosforamiditového monomeru, a [R₂NH₂ ⁺tetrazoliď] je rovnovážná koncentrace tetrazolidové soli aminové odstupující skupiny fosforamiditového monomeru.

Výhodně je 3'-aminochránící skupina monomeru, R², v kyselině labilní skupina, jako je trifenylmethyl (jako trityl), p-anisyldifenylmethyl (jako monomethoxytrityl nebo MMT), di-p-anisylfenylmethyl (jako dimethoxytrityl nebo DMT), nebo kysele labilní urethan . Nejvýhodněji je 3'-aminochránící skupinou trifenylmethyl. Tyto chránící skupiny se odebírají zpracováním s roztoky kyselin, nejvýhodněji s roztokem 3% kyseliny dichloroctové v methylenchloridu. Obdobně, 3 -hydroxylovou chránící skupinou monomeru, R⁷, je kysele labilní skupina, jako je trityl, MMT, DMT nebo urethan. Nejvýhodněji 3'-hydroxylovou chránící skupinou je DMT.

9 aΟ » · 9

0 9 <

999 999

Jak se zde používá, termín „ volná aminoskupina“ v odkazu na monomery podle vynálezu označuje aminoskupinu schopnou reagovat s fosforamiditovou skupinou vstupujícího monomeru. Výhodně je volnou aminoskupinou primární amin. Po kroku detritylace je obvykle aminoskupina ve formě své soli s konjugátem kyseliny, použité pro detritylaci. Tato sůl může být výhodně neutralizována zásaditým roztokem, jako je 2% triethylamin nebo pyridin v acetonitrilu, po detritylačním kroku.

Krok slučování podle vynálezu se může provádět v teplotním rozmezí 20 až 200 stupňů Celsia. Výhodněji se reakce provádí při teplotě okolí ( asi 1530 stupňů Celsia). Reakce se uskutečňuje přidáním roztoku fosforamiditového monomeru a roztoku aktivátoru (nebo roztoku obsahujícího fosforamiditový monomer a aktivátor) do reakční nádoby obsahující volnou aminoskupinu (oligo)nukleotidu kovalentně vázanou na pevný nosič. Obvykle jsou aktivátory podle vynálezu nukleofilní katalyzátory, které nahradí stabilnější fosforamiditovou aminoskupinu za vzniku vysoce reaktivního ( a mnohem méně stabilního) meziproduktu, který, dále, reaguje s volnou 3'- aminoskupinou pevného neseného oligonukleotid N3'-»P5' fosforamiditu. Směs se potom mísí postupy, jako jsou mechanické víření, kropení inertním plynem a pod.

Obdobně roztok (y) monomeru a aktivátoru mohou být připraveny tak, aby protékaly reakční nádobou (nebo kolonou) obsahující pevný nesený (oligo)nukleotid s volnou 3'-aminoskupinou. Monomer a aktivátor bud^v mohou být předsmíseny, míchány ve ventilovém bloku vhodného syntetizéru, míchány v předaktivační nádobě a , pokud je to žádoucí, přednastaveny do rovnováhy, nebo se mohou přidávat samostatně do reakční nádoby.

Příklady aktivátorů pro použití podle vynálezu jsou tetrazol, 5(ethylthio)tetrazol, 5-(4-nitrofenyl)tetrazol, 5-(2-thiofen)tetrazol, triazol, pyridinium chlorid a podobné, viz např. Beaucage a Iyer (citovaní výše);

Berner a kol., Nucleic Acids Research, 17:853-864 (1989); Benson, Chem.Rev.

41:1-61 (1947). Termín „tetrazolový aktivátor“, jak se zde používá, označuje aktivátory, kterými jsou tetrazol nebo deriváty tetrazolu. Nejvýhodnějším aktivátorem je tetrazol. Výhodnými rozpouštědly jsou acetonitril, tetrahydrofuran, methylenchlorid a podobné. Přednost se dává acetonitrilu.

Μ φ e »♦ • Φ Φ · Φ φ φ · · » «φφφ 9 9 9 9 9 φφ ΦΦΦΦ ΦΦ ·<· · *

Φ Φ Φ · • Φ Φ Φ

ΦΦΦ ΦΦΦ • Φ • Φ Φ Φ

Velké opatrnosti by mělo být dbáno při použití velmi suchého (bezvodého) monomeru, aktivátoru a rozpouštědla pro krok slučování a u rozpouštědla použitého k promytí pevného nosiče bezprostředně před slučováním.

Výběr monomeru ( konkrétně výběr fosforamiditové aminoskupiny) závisí na použití. Obecně, pro účely výzkumu (0,01-10 pmol) fosforamidat oligonukleotidové syntézy použitím komerčně dostupných DNA syntézerů, jako je ABI Model 394, je vhodné použít monomer, který je relativně stabilní a relativně méně reaktivní (jak je definováno rovnovážnou konstantou Ki vide supra), tak, že roztok může odcházet ze zařízení pro vícenásobnou syntézu v období týdnů. Dalším důvodem pro upřednostnění méně reaktivního monomeru pro toto použití je fakt, že zařízení tohoto typu nejsou typicky určena na minimální objem použitého reagens. Ve skutečnosti, jelikož se při syntézách ve výzkumném měřítku typicky pracuje v určitém přebytku tekoucího roztoku monomeru reakční nádobou (kolonou), odebírají se některé rozpustné produkty z kolony (a tedy z rovnovážného stavu), a takto napomáhají řízení rovnováhy do ukončení. Také cena monomeru, použitá v tomto měřítku, může být relativně méně důležitá než jiné faktory (jako je cena laboratoře, smlouvy a pod.). Obvykle pokud se použijí méně reaktivní monomery (jako diisopropylaminofosforamidity), je třeba použít relativně velké přebytky monomeru (10-50) ve srovnání s volnou aminoskupinou, a je potřeba použít velké přebytky aktivátoru k dosažení požadovaných reakčních rychlostí a konverzí (výtěžku).

K minimalizaci množství (počtu ekvivalentů) monomeru potřebného k zajištění požadovaného výtěžku reakce, zejména při použití relativně méně reaktivního monomeru a provádění syntézy v malém měřítku, jak je uvedeno výše, je velice vhodné provádět slučovací a oxidační kroky dvakrát, použitím nižší koncentrace (a méně ekvivalentů) monomeru v každém ze dvou slučovacích kroků. To je proto, neboť reakce slučování je zvratná rovnovážná reakce ( znázorněná v rovnicích la a lb). Při použití tohoto postupu nejprve probíhá slučování v cyklu použitím trochu menších množství monomeru a rovnovážná koncentrace požadované fosforamiditové vazby, která se tvoří za

44 • 4 4 ·

4 4

4 4

4 4 >« 4444 • 4 4444

4 *

4»

4 4 4

4 4 4

4 4 4

4 4 4

4 4

4 4

444 444

4

4 4 4 těchto podmínek, je potom „zamkne“ jako fosforamidat uskutečněním prvního oxidačního kroku cyklu. Potom proběhne druhý slučovací krok, opět s relativně malými množstvími monomeru, a následuje druhý oxidační krok. Použitím tohoto postupuje potřeba celkově méně monomerů k získání požadovaného výtěžku, než když se použije všechen monomer v jediném slučování.

Ekonomie při výrobě ve velkém měřítku vyžaduje, aby bylo množství (počet ekvivalentů) použitého monomeru minimalizováno. V tomto vynálezu se obvykle cena monomeru stává větším procentickým dílem z celkových nákladů, neboť cena práce a některé další náklady se nezvyšují lineárně s rozsahem syntézy. Kromě toho oligonukleotidové syntetizéry v rozsáhlém měřítku obvykle pracují vsádkovým způsobem spíše než průtokovým postupem, který lze běžně nalézt u syntéz ve výzkumném měřítku, neboť technika řízení reakce k úplnému ukončení odebíráním rozpustných produktů z nádoby není praktická. V tomto vynálezu je nezbytné vybrat monomer, který je relativně více reaktivní (jak je definováno konstantou Ki, viz svrchu). Tyto monomery obvykle mají fosforamiditové aminoskupiny, které jsou relativně zásaditější a/nebo více stericky bráněné. Použití takto reaktivních monomerů umožňuje použití nižších koncentrací aktivátoru pro dosažení přiměřených reakčních rychlostí. Tyto nižší koncentrace aktivátoru napomáhají bránit zvratné reakci požadovaného produktu s aktivátorem za vzniku aktivovaného meziproduktu (rovnice lb). Z těchto důvodů jsou požadovány výrazně nižší množství monomeru (rovnice 1-5). Obecně je velmi důležité použít monomer nejvyšší čistoty.

Po kroku slučování je získaná fosforamiditová vazba oxidována (sulfurována) za vzniku stabilně chráněné fosforamidatové (fosforthioamidatové) vazby. Krok oxidace se může provádět bezprostředně po vypuštění slučovacího roztoku z reakční nádoby, nebo s mezitím promytým rozpouštědlem. Jelikož může být fosforamiditová vazba za přítomnosti tetrazolu hydrolyzována, promývací roztok je přednostně velmi suchý a/nebo zásaditý. Pokud není promývací krok použit, je oxidační roztok přednostně ft· ♦· • · · · •· 9 99 9 • · 9 · • · 9 9 9

9 9 9

9 9

9 zásaditý a/nebo velmi suchý, neboje oxidační činidlo vybráno tak, že je dostatečně reaktivní k úspěšnému konkurování hydrolýze.

Oxidační činidla, která jsou vhodná v postupu podle vynálezu, zahrnují jod, chlor, brom, perkyseliny jako kyselinu m-chlorbenzoovou, hydroperoxidy jako je t.butylhydroperoxid, ethylhydroperoxid, methylhydroperoxid a podobné, ozon, směsné acyl-sulfínové anhydridy jako je 3H-2, l-benzoxathiolan-3-on-l-oxid, soli persulfatů jako je sodný, amonný a persulfat tetrabutylamonný a podobné, monoperoxysulfaty jako je oxon™, sodný a/nebo jiné chlornany, peroxidy, jako je diethylperoxid nebo bis(trimethylsilyl)peroxid, nebo peroxid vodíku nebo nevodné ekvivalenty peroxidu vodíku jako je komplex močovina/peroxid vodíku, atd. Další vhodná oxidační činidla, která mohou být použita ke konverzi fosforu (III) na fosfor (V), jsou popsána v Beaucage a Iyer (citovaní výše). Sulfurační činidla pro použití podle vynálezu zahrnují elementární síru, thiuram-disulfidy, jako je tetraethylthiuram disulfid, acyldisulfidy, jako je fenacyldisulfid, fosfinothioyldisulfidy, jako je S-Tetra ™, a 1,l-dioxo-3H-l,2-benzodithiol-3-on. Pro použití podle předloženého vynálezu se jako oxidačnímu činidlu dává přednost peroxidu vodíku. Výhodným provedením je použití roztoku 1,5% peroxidu vodíku, 3,5% vody, 20% pyridinu a 75% THF.

V jednom provedení vynálezu může být nezreagovaná 3'-aminoskupina, zůstávající po (posledním) oxidačním kroku v cyklu, překryta vhodným překrývacím činidlem předtím, než je další krok detritylace učiní inertními k následujícím krokům slučování. Tento krok překrytí nejenom zlepšuje HPLC profil tím, zeje purifikace úspěšnější, ale také výrazně zlepšuje celkový výtěžek produktu, pravděpodobně tím, že eliminuje nezreagované 3'aminoskupiny soupeřící v udržení rovnovážného stavu. Překrývací činidla vhodná v postupu podle vynálezu zahrnují elektrofilní reagens, taková, jako je acetanhydrid a anhydrid kyseliny isomáselné, a chloridy kyselin, jako je adamantylkarbonylchlorid, pivaoylchlorid a podobné, isothiokyanaty, chlorformiaty atd. Také jsou vhodné fosforamidity ve spojení s aktivátorem s následnou oxidací, a H-fosfonatové soli jako je isopropyl-H-fosfonat «« «··· ·· ·· • · * · • · ·

9 9

9 9 ·· ···· • 4 ·

9 9

9 9

9 9 9

9 9 9

9 9

9 triethylamonný používaný ve spojení s chloridem kyseliny, jako je pivaoyl chlorid nebo adamantylkarbonylchlorid.

3'-Aminochránící skupiny v monomeru, jako je trityl, činí aminoskupinu méně reaktivní s fosforamiditovou skupinou monomerů a překrývacími činidly. Tato ochrana však není úplná, jako je to v případě s obdobně chráněnou 5 '-hydroxylovou skupinou v běžných syntézách fosfodiesterů. Z tohoto důvodu se dává přednost trochu méně reaktivnímu překrývacímu činidlu, jako je anhydrid kyseliny isobutylmáselné, před acetanhydridem, nejčastěji používaným v fosfodiesterových syntézách. Může se použít buď anhydrid kyseliny isobutylmáselné, nebo acetanhydrid jako roztok 1:1:8 anhydridu.lutidinu: tetrahydrofuranu (objemově), a použít v dílech odpovídajících roztoku 1-methylimidazolu v tetrahydrofuranu, jak je dodáván PE Applied Biosystems (Foster City, CA).

Oligonukleotid se odštěpí z pevného nosiče a odstraní se z něj chránící skupiny po ukončení sestavení řetězce použitím vodného amoniaku nebo jiných prostředků, jak jsou popsány v referencích citovaných výše. Oligonukleotidy mohou být odštěpeny z nosiče se svou nedotčenou koncovou amino-chráněnou skupinou (nebo v některých případech hydroxyl- chráněnou skupinou) . To je žádoucí v těch situacích, kdy se použije tritylová nebo jiná chránící skupina jako pomocná při purifikaci, jako je HPLC s reverzní fází nebo intověvýměnná HPLC. Nicméně, pokud se použijí tritylové chránící skupiny a jsou odebrány zpracováním kyselinou po odštěpení z nosiče, odstraněním chránění a purifikaci, potom je velká snaha nechráněných fosforamidatových vazeb podrobit se nežádoucímu štěpení. Proto je třeba dbát v tomto kroku velké opatrnosti.

Obdobně lze odebrat koncové amino-chránící skupiny (jako je trityl) kyselinou před odštěpením z nosiče. V tomto případě jsou fosforamidatové vazby stále ještě chráněny a fragmentaci je zabráněno . Potom se oligonukleotid odštěpí z nosiče, odebere se chránící skupina, jak je popsáno výše. Fosforamidatový oligonukleotid může být purifikován iontově-výměnnou HPLC, HPLC se reverzní fází, nebo jinými prostředky.

• « · · · · • « • · 0 · 0 0 ·

0 · 0 · » • 0 0000 0»

0 0 0 0 0 0

0000 00 00

0

Příklady provedení:

Příklad 1

Příprava 2-deoxv-3'-tritylaminothymidin-5'-fosforamiditových monomerů

Syntéza 3 '-(trityl)amino-3'-deoxythymidin-5'-(2-kyanoethyl N,Ndiisopropyl)fosforamiditu, 4t je uvedena ve schématu I. 3 '-Azido-5 '-O-(4methoxybenzoyl)-3'-deoxythymidin, lt, byl syntetizován postupem podle Czernecki a Valery, Synthesis, 1991:239.

Schéma I

2) TrCI, pyr 83%

θ

M aq. NaOH _u__ „ Y 1 1,4-Dioxan /MeOH

90% NH .P.

□ ci

Tr

3t (/•Pr^NEt, C^CIj

70-80% purifikovaný výtěžek

4t • · · ·

• · · · • · · · · · · • · ·· ·» '-(Trityl)amino-5 '-(4-methoxybenzoyl)-3 '-deoxythymidin, 2t. 3 '-Azido 5'-<3-(4-methoxybenzoyl)-3 '-deoxythymidin, lt, (10,0 g, 24,9 mmol) se rozpustí v ethanolu (500 ml) a redukuje se hydrogenací (60 psi H₂)(asi 413 kPa) za přítomnosti 10% Pd/C (1,0 g) po 16 h. Následuje odebrání katalyzátoru filtrací a odpaření rozpouštědla ve vakuu, získá se 92% výtěžek (8,6 g, 22,9 mmol) odpovídajícího 3'-aminu, který se odebírá přímo pro další reakci. 5'-(4-Methoxybenzoyl)-3 '-amino-3'deoxythymidin (8,6 g, 22,9 mmol) se azeotropicky oddělí z pyridinu (2 x 50 ml) a rozpustí se v bezvodém pyridinu (50 ml). Do tohoto roztoku se přidá triethylamin (6,71 ml,

48,1 mmol) a tritylchlorid (7,0 g, 25,2 mmol). Tato směs se míchá po 2 h při teplotě okolí, a přidá se další podíl tritylchloridu (1,9 g, 6,9 mmol) a reakční směs se míchá po další 2 hodiny. Rozpouštědla se ve vakuu odstraní a surový produkt se purifikuje na silice (2-5 % MeOH/CH₂Cl₂) za získání 90% výtěžku (12,7 g, 20,6 mmol) 3'-(trityl)amino-5'-(4-methoxybenzoyl)-3'deoxythymidinu, 2t.

3'-(Trityl)amino-3'-deoxythymidinu, 3t. 5'-<9-anisoyl chránící skupina se odebere rozpuštěním 2t (30,1 g, 48,7 mmol v 57:43 1,4-dioxanu/MeOH (150 ml), následovaným přídavkem 2 M vodného NaOH (73,1 ml, 146,2 mmol). Po míchání po 1,5 h při teplotě okolí se reakční směs neutralizuje kationtovou iontovýměnnou pryskyřicí Dowex 50W-X8 (cca 150 g suché pyridiniové H⁺formy, 1,6 mekv./g). Jakmile je pH neutrální (cca 10 min.), pryskyřice se zfiltruje, promyje se důkladně CH₂C1₂ a MeOH a surový produkt se koncentruje ve vakuu. Zbytek se opětovně rozpustí v EtOAc (500 ml) a extrahuje se nasyceným vodným NaHCO3 (2 x 250 ml), H₂O (250 ml) a nasyceným vodným NaCl (250 ml). Po usušení nad Na₂SO4 a filtraci se rozpouštědla odstraní ve vakuu a výsledná pěna se opětovně rozpustí v 95:5 CH₂Cl₂/MeOH (300 ml). Tento roztok se pomalu přidává do rychle míchané směsi 1:1 Et₂O/hexanu (1250 ml) k vysrážení čistého 3'-(trityl)amino-3'deoxythymidinu, 3t, v 90% výtěžku (21,2 g, 43,8 mmol). Konverze na fosforamiditové monomery a/nebo sukcinylovaný nukleosid je popsána v příkladech 5-7 dále.

• « · · · ·

·· ·· ► · · · ► · · · • · · · · ·

Příklad 2

Příprava 2 ^y-deoxv-3 '-tritylaminocytidin-5 '-fosforamiditových monomerů

Syntéza N⁴ -benzoyl- 3'-(trityl)amino-2',3'-dideoxycytidin-5'-(2kyanoethyl AČ/V-diisopropyl)fosforamiditu, 4c, je uvedena ve schématu II.

Schéma II dU

1) TBDMS-CI, kat DMAP ξΝ, DMF *

2) PhP, DIAD. DMF 3) LiN. dmfa

58%

1) K, 10% Pd/C, EtOH

2) TrCl, 5N. pyr 85%

1) POQl E£N, 1,2,4-Triazole.

Q€N __

2) NhjOH, 1,4-Dioxane

3) BzCI, pyr 92%

NH t

Tr

NHBz

EJN3HF 1:1 C^Cfe/pyr

75%

výtěžek

3'-azido-5'-O-(terc.butyldimethylsilyl)-2',3'-dideoxyuridin, Idu. 2'Deoxyuridin (11,4 g, 50 mmol) se důkladně usuší společným odpařováním ve vakuu s bezvodým DMF ( 2 x 100 ml). Potom se přidá DMF (100 ml), * · « · · · • · · · • ·« · ··· « · • · · · následovaný triethylaminem (8,36 ml, 60 mmol), 4-dimethylaminopyridinem (0,31 g, 2,5 mmol) a terc.butyldimethylsilylchloridem (8,29 g, 55,0 mmol). Reakční směs se míchá po 1 h při teplotě místnosti, zředí se dichlormethanem (600 ml) a extrahuje se H₂O (3 x 200 ml) a nasyceným vodným NaCl (200 ml). Organická vrstva se suší nad Na₂SO₄, zfiltruje se a koncentruje ve vakuu. Výsledný zbytek se purifikuje na silice (2-10% MeOH/CH₂Cl₂) za vzniku 80% výtěžku (13,7 g, 40,0 mmol) 5'-0-(terc.butyldimethylsilyl)-2'-deoxyuridinu. Přidají se trifenylfosfin (16,8 g,

64,0 mmol) a DMF (100 ml), a do míchané směsi se přidá roztok diisopropylazodikarboxylatu (12,6 ml, 64,0 mmol) v DMF (20 ml). Po míchání 2 h při teplotě místnosti se reakční směs koncentruje ve vakuu na asi 30 ml a nalije se do Et₂O (1200 ml). Požadovaný 2,3'-anhydro-5'-O(terc.butyldimethylsilyl)-2'-deoxyuridin začíná s vysrážením po 10 min rychlého míchání. Získaná směs se uloží přes noc do lednice, sraženina se spojí filtrací, promyje se dalším chladným Et₂O ( 2 x 300 ml) a suší se ve vakuu za získání 90% výtěžku (11,7 g, 36,0 mmol) 2,3'-anhydro-5'-O(terc.butyldimethylsilyl)-2'-deoxyuridinu jako bílé pevné látky, která se dále nepurifikuje. 2,3'-Anhydro-5'-O-(terc.butyldimethylsilyl)-2'-deoxyuridin (33,8 g, 104,2 mmol) potom reaguje s LiN₃ /7,65 g, 156,3 mmol) v DMF (300 ml) při 95-100 °C po 48 h. Získaná hnědá homogenní směs se potom ochladí na teplotu místnosti, koncentruje se ve vakuu na olej, rozpustí se v EtOAc (800 ml) a extrahuje se H₂O (200 ml). Vodná vrstva se extrahuje dvojnásobně s EtOAc (75 ml) a spojené organické vrstvy se promyjí H₂O (3 x 250 ml) a jednou nasyceným vodným NaCl (250 ml). Roztok EtOAc se suší nad Na₂SO₄, zfiltruje se a koncentruje ve vakuu za získání 87% výtěžku (33,2 g, 90,3 mmol) 3'-azido-5'-O-(terc.butyldimethylsilyl)-2',3'-dideoxyuridinu, Idu, jako hnědavé pěny, která se odebírá přímo na hydrogenací.

'-(Trityl)amino-5'-O-(terc.butyldimethylsilyl)-2',3'-dideoxyuridin, 2du.

Surový Idu (33,2 g, 90,3 mmol) se rozpustí ve 2:1 EtOH/CH₂Cl₂ (300 ml) a redukuje se hydrogenací (60 psi H₂, tedy kolem 413 kPa) za přítomnosti 10% ·· ···· • ·

·· ·· • · · · • · · · · · · · · ·· ····

Pd/C (3,0 g) po 18 hodin. Následným odebráním katalyzátoru filtrací a odpařením rozpouštědla ve vakuu se získá kvantitativní výtěžek (30,4 g, 89,8 mmol) odpovídajícího 3'-aminu, který se odebírá přímo do další reakce. 5-0(terc.butyldimethylsilyl)-3'-amino-2',3'-dideoxyuridin (30,4 g, 89,8 mmol) se azeot<yřpicky oddělí z pyridinu (2 x 300 ml) a rozpustí se ve směsi CH2CI2 (600 ml) a bezvodém pyridinu (70 ml). Do tohoto roztoku se přidá triethylamin (25,0 ml, 179,6 mmol) a tritylchlorid (35,0 g, 125,7 mmol), a reakční směs se míchá po 2 h při okolní teplotě . Rozpouštědla se odstraní ve vakuu a surový produkt se purifikuje na silice (1 - 5 % MeOH/CřUCU) za získání 85% výtěžku (44,3 g, 75,9 mmol) 3'-(trityl)amino-5'-O-(terc.butyldimethylsilyl)-2',3'dideoxyuridinu, 2du.

N⁴-Benzoyl-3 '-(trityl)amino-5'-O-(terc.butyldimethylsilyl)-2',3 'dideoxycytidin, 2c.Triethylamin (22,5 ml, 161,1 mmol) se přidává po kapkách po dobu 10 min do míchané směsi 1,2,4-triazolu (11,1 g, 161,1 mmol) a oxychloridu fosforečného (3,5 ml, 37,1 mmol) v bezvodém acetonitrilu (125 ml) při 0 °C. Do této chladné míchané směsi se přidá 2du (9,4 g, 16,1 mmol) jako roztok v acetonitrilu (50 ml). Tato směs se míchá při teplotě místnosti po 2 h, přidají se triethylamin (30 ml) a H2O (10 ml) ke zchlazení reakce a podpoře disoluce, a rozpouštědla se odeberou va vakuu. Výsledná hnědá pevná látka se opětovně rozpustí v CH2CI2 (250 ml), extrahuje se nasyceným vodným NaHCCU (3 x 150 ml), nasyceným vodným NaCl, suší se nad Na2SO4, zfiltruje se a koncentruje ve vakuu za získání kvantitativního výtěžku (10,2 g, 16,1 mmol) 3 '-(trityl)amino-5'-O-(terc.butyldimethylsilyl)-2',3 '-dideoxy-4-( 1,2,4triazol-l-yl)uridinu jako naoranžovělé pevné látky. Surový materiál se rozpustí v 1,4-dioxanu (200 ml) a ochladí se, a přidá se koncentrovaný NH4OH (50 ml). Reakční směs se míchá při teplotě místnosti po 4 h a koncentruje se ve vakuu za vzniku kvantitativního výtěžku (9,4 g, 16,1 mmol) 3'-(trityl)amino-5'-O-(terc.butyldimethylsilyl)-2',3'-dideoxycytidinu jako béžové pevné látky. Tento surový materiál se potom azeotropicky oddělí z bezvodého pyridinu (2 x 200 ml), opětovně se rozpustí v pyridinu (200 ml) a ftft • · ······ do tohoto míchaného roztoku se přidá benzoylchlorid (2,2 ml, 19,3 mmol) pří °C. Reakční směs se potom míchá při teplotě místnosti po 16 h, intenzivně se ochladí na 0°C, chladí se H2O (40 ml) a po míchání 5 min se přidá koncentrovaný amoniak (40 ml) a reakční směs se míchá po dalších 15 min při 0 °C. Rozpouštědla se odstraní ve vakuu, zbytek se opětovně rozpustí v CH2CI2 (125 ml) a extrahuje se nasyceným vodným NaHCCh (3 x 75 ml), suší se nad Na2SC>4, zfiltruje se a koncentruje ve vakuu. Surový materiál se purifikuje na silice ( 1 - 5% MeOH/CHiCh) za získání 92% výtěžku (10,2 g, 14,8 mmol)

N⁴-benzoyl-3 '-(trityl)amino-5 '-O-(terc.butyldimethylsilyl)-2 ',3 'dideoxycytidinu, 2c.

N⁴-Benzoyl-3'-(trityl)amino-2',3'-dideoxycytidin, 3c. 5'-TBDMS chránící skupina byla odebrána rozpuštěním 2c (5,8 g, 8,5 mmol) v 1:1 ClUCh/pyridinu (25 ml) a reakcí s EtjN 3HF (6,9 ml, 42,6 mmol) po 16 h. Reakční směs se zředí CH2CI2 (200 ml) a extrahuje H2O (2 x 50 ml) a nasyceným vodným NaCl (50 ml). Organická vrstva se suší nad Na2SO₄, zfiltruje se a rozpouštědlo se odstraní ve vakuu. Surový produkt se purifikuje na silice (3% MeOH/CH₂Cl2) za získání 75% výtěžku (3,7 g, 6,4 mmol) N⁴benzoyl-3'-(trityl)amino-2',3'-dideoxycytidinu, 3c. Konverze na fosforamiditové monomery a/nebo sukcinylovaný nukleosid je popsána v příkladech 5-7 dále.

Příklad 3

Příprava 2 '-deoxv-3 '-tritylaminoguanosin-5 '-fosforamiditových monomerů

Syntéza N²-isobutyryl-3'-(trityl)amino-2',3-dideoxyguanosin-5'-(2kyanoethyl jV,/V-diisopropyl)fosforamiditu, 4g je uvedena ve schématu III. 5'O-benzoyl-N²-isobutyryl-2'-deoxyguanosin a 3'-O-benzoyl-N²-isobutyryl-2'deoxyxyloguanosin se připraví, jak bylo uvedeno dříve, Reese a kol., J.Chem.

Soc.Perkin Trans.I, 1984:1263.

»· ···· fl · · · · · »· · · · · • · »· flfl

Schéma III

1) TBDMS-Cl.jEK, feat. DMAFDMF

OBz//

NH O

V

2) 2M NaOH, 0’C 65:30:5 pyr. MeO^CH

3) Lity. Pty³. DEAD DMF

49% <

Čí

NH O

Nj ig

1) 4,10% Pd/C, EtOH — ' —>

2) TrCi, EjN, pyr 78%

Tr

EJN3HF 1:1 CtyCUpyr

73%

2g

p-/-^cn M, N-P, 4

-( Wy

NH t

Tr

XaX

4g •4 4444

44

4 4 4

4 4

4 4

4 4 • 4 4 4 4 4

44

4 4 4 4

4 4 4 4

4 444 4·4 • 4 4 •4 44 44

5'-0-(terc.Butyldimethylsilyl)-N²-isobutyryl-3 '-azido-2',3 'dideoxyguanosin, lg. Do míchaného roztoku 3'-D-benzoyl-N²-isobutyryl-2'deoxyxyloguanosinu (4,86 g, 11,0 mmol) v DMF (20 ml) se přidá triethylamin (3,4 ml, 24,2 mmol), 4-dimethylaminopyridin (54 mg, 0,44 mmol) a terc.butyldimethylsilylchlorid (3,31 g, 22,0 mmol). Reakční směs se míchá po h při teplotě místnosti, přidá se methanol (10 ml) a po míchání dalších 5 min se reakční směs koncentruje ve vakuu. Zbytek se opětovně rozpustí v CH2CI2 (150 ml), promyje se H₂0 (3 x 40 ml) a nasyceným vodným NaCl (60 ml). Organická vrstva se suší nad Na₂SO₄, zfiltruje se a koncentruje ve vakuu za vzniku 6,40 g načervenale zbarvené pěny. Do tohoto surového produktu se přidá předchlazený ( asi 5 °C) roztok 2M NaOH v 65:30:5 pyridinu:MeOH:H2O (44,0 ml, 87,9 mmol). Reakční směs se míchá v ledové lázni po 20 min a neutralizuje se 1 M HCl (97 ml) na pH 7. Reakční směs se koncentruje ve vakuu na asi 50 ml a extrahuje CH₂C1₂ (3 x 75 ml). Spojené organické podíly se promyjí nasyceným vodným NaCl (50 ml), suší se nad Na2SO₄, zfiltrují se a koncentrují ve vakuu za zisku 82% výtěžku (4,1 g,

9.1 mmol) 5'-ú-(terc.butyldimethylsilyl)-N²-isobutyryl-2'-deoxyxyloguanosinu jako pískově zbarvené pěny, která se bere do další reakce bez další purifikace. Do surového 5'-č?-(terc.butyldimethylsilyl)-N²isobutyryl-2'-deoxyxyloguanosinu (47,3 g, 104,7 mmol) se přidá LiN₃ (15,4 g,

314.1 mmol), trifenylfosfin (41,2 g, 157,1 mmol) a bezvodý DMF (1000 ml). Diethylazodikarboxylat (24,7 ml, 157,1 mmol) se přidá a reakční směs se míchá po dobu 5 h při teplotě místnosti pod argonem. Přidá se H2O (20 ml) a reakční směs se koncentruje ve vakuu. Zbytek se rozpustí v EtOAc (1500 ml), promyje se vodou (3 x 1000 ml), nasyceným vodným NaCl (1000 ml), suší se nad Na2SO₄, zfiltruje se a koncentruje ve vakuu. Zbytek se purifikuje na silice (1-5% MeOH/CH2Cl2), ačkoliv to umožní > 100% výtěžek (112,7 g) čistého 5'-0-(terc.butyldimethylsilyl)-N²-isobutyryl-3 '-azido-2',3 '-dideoxyguanosinu, lg. Tento znečištěný produkt není dále purifikován, a přímo se odebírá k hydrogenací a purifikuje se jako 3'-amin.

η ·· ·· • · · · • · · • · · • · · ·· ···· • φ φφφφ φ · · φφφ • · · · • · φ · φφ φφ φφ φφ φ φ φ · • φ φ φ • φφφ φφφ • · φ« φφ

-O-(terc.Butyldimethylsilyl)-N²-isobutyryl-3 '-(trityI)amino-2',3 'dideoxyguanosin, 2g. Surová sloučenina lg (49,9 g, 104,7 mmol) se rozpustí v (teplém) ethanolu (1600 ml) a hydrogenuje se (60 psi H2, tedy kolem 413 kPa) za přítomnosti 10% Pd/C (2,5 kg) po 16 h při teplotě místnosti. Katalyzátor se odstraní filtrací a rozpouštědlo se odpaří ve vakuu za vzniku surového 5 -0(terc.butyldimethylsilyl)-N²-isobutyryl-3 -amino-2',3 -dideoxyguanosinu, který se purifikuje na silice (2-6% MeOH/CH2Cl₂ a potom 1% Et₃N/6%

MeOH/CH₂Cl₂) za vzniku 60% výtěžku (28,5 g, 63,2 mmol) čistého 5-O(terc.butyldimethylsilyl)-N²-isobutyryl-3 '-amino-2',3 '-dideoxyguanosinu jako ne zcela bílé pěny. 3'-Amin (28,5 g, 63,2 mmol) je chráněn reakcí s triethylaminem (17,6 ml, 126,4 mmol) a tritylchloridem (28,2 g, 101,1 mmol) v pyridinu (500 ml) po 16 h při teplotě místnosti. Rozpouštědla se odstraní ve vakuu a zbytek se purifikuje na silice (1-5% MeOH/CH₂Cl₂) za zisku kvantitativního výtěžku (43,8 g, 63,2 mmol) 5'-0(terc.butyldimethylsilyl)-N²-isobutyryl-3 '-(trityl)amino-2',3'dideoxyguanosinu, 2g.

N²-Isobutyryl-3'-(trityl)amino-2',3'-dideoxyguanosin, 3g. 5'-TBDMS chránící skupina se odstraní rozpuštěním 2g (5,9 g, 8,5 mmol) v 1:1 CH₂Cl₂/pyridinu (25 ml) a reakcí s Et₃N 3HF (6,9 ml, 42,6 mmol) po 16 h. Reakční směs se zředí CH₂C1₂ (200 ml) a extrahuje se H₂O (2 x 50 ml) a nasyceným vodným NaCl (50 ml). Organická vrstva se suší nad Na₂SO4, zfiltruje se a rozpouštědlo se odpaří va vakuu. Surový produkt se purifikuje na silice (2-5% MeOH/CH₂Cl₂) za vzniku 73% výtěžku (3,6 g, 6,2 mmol) N²isobutyryl-3'-(trityl)amino-2',3'-dideoxyguanosinu, 3g. Konverze na fosforamiditové monomery a/nebo sukcinylovaný nukleosid je popsána v příkladech 5-7 dále.

Příklad 4

Příprava 2'-deoxv-3'-tritylaminoadenosin-5'-fosforamiditových monomerů

0 0 0 • » * 9 • 0 · ♦ · · ·

0000

0 ·

0 0

0 0 0 e 0· «

0 0 0

Syntéza N⁶-benzoyl-3 '-(trityl)amino-2',3 '-dideoxyguanosin-5 '-(2kyanoethyl V,V-diisopropyl)fosforamiditu, 4a je uvedena ve schématu IV. N⁶ benzoyl-9-(5-0-benzoyl-2-deoxy-P-D-threo-pentofuranosyl)adenin se syntetizuje postupem podle Herdewijna, J.Org.Chem., 53:5050 (1988).

Schéma IV

1) Li^, PbP, DEAD DMF

2) K, 10% Pd/C 3:1 EtOH/QBIj

71%

57%

NH

Ťr

3a

4a (i-Pr)₂NEt, CH₂C1₂

70-80% purifikovaný výtěžek

0· ···· ·· ί·· • · · * $ .* .

ύ · · €«► ·»·· • · · • ♦ · • · · • · 6 · • · ··

-O-(Benzoyl)-N⁶-benzoyl-3'-azido-2 ',3 '-dideoxyadenosin, la. N⁶Benzoyl-9-(5-0-benzoyl-2-deoxy-p-D-threo-pentofuranosyl)adenin (7,0 g,

15,3 mmol), trifenylfosfin (6,0 g, 22,9 mmol) a LiN₃ (2,8 g, 56,4 mmol) se rozpustí v DMF (100 ml). Do této míchané směsi se přidá diethylazodikarboxylat (3,6 ml, 22,9 mmol) v jednom dílu, reakční směs se míchá 2,5 h při teplotě místnosti, a reakční směs se zchladí H₂O (10 ml). Rozpouštědla se odstraní ve vakuu, zbytkový olej se opětovně rozpustí v EtOAc (300 ml) a extrahuje H₂O (2 x 200 ml) a nasyceným vodným NaCl (200 ml). Organická vrstva se suší nad Na₂SO4, zfiltruje se a koncentruje ve vakuu. Získaný zbytkový olej se purifikuje na SiO₂ (2-5% MeOH/CH₂Cl₂) za vzniku 5'-O-benzoyl-N⁶-benzoyl-3’-azido-2',3'-dideoxyadenosinu, la, jako jantarově žluté pěny, která se odebírá přímo k hydrogenací.

N⁶-Benzoyl-3'-(trityl)amino-2',3'-dideoxyadenosin, 3a. Surový la se rozpustí v 3.1 EtOH/CH₂Cl₂ (200 ml) a redukuje se hydrogenací (60 psi H₂, tedy kolem 413 kPa) za přítomnosti 10% Pd/C (0,7 g) po 18 h. Následným odstraněním katalyzátoru filtrací a odpařením rozpouštědla ve vakuu se získá 57% (4,0 g, 8,7 mmol) odpovídajícího 3'-aminu, který se odebírá přímo do další reakce. 5'-O-(Benzoyl)-N⁶-benzoyl-3'-amino-2',3'dideoxyadenosin, (3,9 g, 8,5 mmol) se rozpustí v CH₂C1₂ (50 mi), přidá se triethylamin (2,9 ml, 20,8 mmol), následovaný přídavkem tritylchloridu (2,9 g,

10,2 mmol). Po míchání po 1,5 h při teplotě místnosti se reakční směs zředí CH₂C1₂ (50 ml) a extrahuje se H₂O (2 x 50 ml) a nasyceným vodným NaCl (50 ml). Organická vrstva se suší nad Na₂So₄, zfiltruje se a koncentruje ve vakuu za vzniku surového 5'-O-benzoyl-N⁶-benzoyl-3'-(trityl)amino-2',3'dideoxyadenosinu, který se odebírá přímo k hydrolýze 5'-benzoyl chránící skupiny. Surový 5'-O-benzoyl-N⁶-benzoyl-3'-(trityl)amino-2',3'dideoxyadenosin, (asi 6.0 g, 8,5 mmol) se rozpustí v 1:1 THF/MeOH (100 ml) a ochladí se na 0 °C. Do této směsi se přidá předchlazený 2 M vodný NaOH (13,7 ml, 27,4 mmol) a reakční směs se míchá při 0 °C po 20 min. Po této době se zdá, že reakce proběhla pouze z 50 %, proto se přidá další 2M vodný NaOH (10,0 ml, 20 mmol). Po míchání dalších 15 min při 0 °C se reakční směs • Φ

9999

Φ * ♦ · • 9

Φ 9 9

9

999

9 ι ·..

• « φ * β φφ φ »

Φ 9 9 Φ • 9 9 *

ΦΦΦ ΦΦΦ

Φ Φ

Φ Φ 9 9 neutralizuje kationtové výměnou pryskyřicí Dowex 50W-X8 (asi 40 g formy H⁺ suchého pyridinium

1,6 mekv./g) na pH 6. Pryskyřice se zfiltruje a promyje se intenzivně MeOH a THF, a rozpouštědla se odstraní ve vakuu. Zbytek se opětovně rozpustí v CH₂C1₂ (300 ml) a extrahuje se H₂O (150 ml), nasyceným vodným NaHCO₃ (2 x 150 ml), H₂O (150 ml) a nasyceným vodným NaCl (150 ml). Po usušení nad Na₂SO₄ se roztok zfiltruje a koncentruje ve vakuu. Zbytek se purifikuje na SiO₂ (2-3% MeOH/CH₂Cl₂) za zisku 71% výtěžku (3,6 g, 6,0 mmol) N⁶benzoyl-3'-(trityl)amino-2',3'-dideoxyadenosinu, 3a, jako bílé pěny. Konverze na fosforamiditové monomery a/nebo sukcinylovaný nukleosid je popsána v příkladech 5-7 dále.

Příklad 5

Příprava 3'-(trityl)amino-2'.3'-dideoxynukleosid-5'-(2'-kvanoethyl N.NdiisopropyDfosforamiditů. 4a, 4c, 4g a 4t.

Do 8,4 mmol 3'-(trityl)amino-2',3'-dideoxynukleosidu (3a, 3c, 3g nebo 3t) (předtím dvakrát azeotropován z CH₃CN) ve 25 ml CH₂C1₂ pod argonem se přidají 2,0 ml (11,8 mmol) Ν,Ν-diisopropylethylenaminu a 2,1 ml (9,4 mmol) 2-kyanoethyl Ν,Ν-diisopropylchlorfosforamiditu. Po míchání 15 min se reakční směs zředí CH₂C1₂ a extrahuje se nasyceným NaHCO₃ a nasyceným NaCl. Organická vrstva se suší (Na₂SO₄), zfiltruje se a koncentruje ve vakuu. N⁶benzoyl-3'-(trityl)amino-2',3'-dideoxyadenosin-5'-(2-kyanoethyl N,Ndiisopropyl)fosforamidit, 4a, se purifikuje na SiO₂ (5% Et₃N/2% methanol/toluen), který poskytne 5,82 g (87,1 %) čistého fosforamiditu. ³¹P NMR (CD3CN) δ 148,6, 149,2. N⁴-Benzoyl-3'-(trityl)amino-2',3'dideoxycytidin-5'-(2-kyanoethyl MW-diisopropyl) fosforamidit, 4c, se purifikuje na SiO2 (3% MeOH/5%Et₃N/toluen) a poskytne 5,58 g (86,0%) čistého produktu. ³¹P NMR (CD3CN) δ 149,3, 149,6. N²-Isobutyryl-3'(trityl)amino-2 ',3 '-dideoxyguanosin-5 '-(2-kyanoethyl /V,/V-diisopropyl) fosforamidit, 4g, se purifikuje pod argonem z 10 ml CH2C1₂ v rychle míchaném ethyletheru (200 ml) a hexanu (200 ml) při 4 °C k odstranění nečistoty *

♦

• · --.

hydrogenfosfonamidatu, která v tomto případě nemůže být odstraněna chromatografii na koloně. Pevná látka se zfiltruje, promyje se hexanem a suší se ve vakuu. Srážení se opakuje a získaná pevná látka se dále purifikuje na SiO₂ (10% Et₃N/CH₂Cl₂ ) a poskytne 4,51 g (69%) čistého produktu fosforamiditu. ³¹P NMR (CD₃CN) δ 148,7, 149,4. 3'-(Trityl)amino-2',3'-dideoxythymidin-5'-(2-kyanoethyl N,Ndiisopropyl) fosforamidit, 4t, se purifikuje na SiO₂ (2% Et₃N/CH₂Cl₂) a poskytne 4,06 g (70,7%) čistého fosforamiditu a některých směsných frakcí.

³¹P NMR (CD₃CN) δ 149,4, 149,5.

Příklad 6

Příprava 3^z-(trityl)amino-2'.3^,-dideoxvnukleosid-5^,-(2'-kvanoethyl-2.2.6.6tetramethvlpiperidinlfosforamiditů. 5a, 5c, 5g a 5t.

Do 8,4 mmol 3'-(trityl)amino-2',3'-dideoxynukleosidu (3a, 3c, 3g nebo 3t) (předtím dvakrát azeotropován z CH₃CN) ve 25 ml CH₂C1₂ pod argonem ochlazený na 4 °C se přidá 1,9 ml (12,6 mmol) DBU a 5,2 ml (8,4 mmol) roztoku 2-kyanoethyl 2,2,6,6-tetramethylpiperidinchlorfosforamiditu v CH₂C1₂ (konc.= 1,626 mmol/ml). Ledová lázeň se odstraní a roztok se míchá po 30-60 min. Aby se zabránilo rozkladu, vede se surový reakční produkt přímo na SiO₂ kolonu (3% MeOH/5%Et₃N/toluen pro 5a, 5c a 5t, a 10% Et₃N/CH₂CI₂ pro 5g) pro purifikaci. Ve všech případech je další purifikace nezbytná, jak je uvedeno pro každý produkt. N⁶-benzoyl-3'-(trityl)amino-2',3'-dideoxyadenosin-5'-(2kyanoethyl 2,2,6,6-tetramethylpiperidin) fosforamidit, 5a, se purifikuje na SiO2 (3% MeOH/5%Et3N/toluen), který poskytne 5,21 g (74,3 % čistého fosforamiditu). ³¹P NMR (CD3CN) δ 164,8, 165,4. N⁴-benzoyl-3'(trityl)amino-2',3'-dideoxycytidin-5'-(2-kyanoethyl 2,2,6,6tetramethylpiperidin) fosforamidit, 5c, se purifikuje na SiO₂ (3%

MeOH/5%Et₃N/toluen), který poskytne 5,07 g (74,2 % čistého produktu a některých směsných frakcí. ³¹P NMR (CD3CN) δ 164,8, 165,7 . N²-Isobutyryl3'-(trityl)amino-2',3'-dideoxyguanosin-5'-(2-kyanoethyl 2,2,6,6tetramethylpiperidin) fosforamidit, 5g, se vysráží ze 2 ml CH2C1₂ v rychle « · · · • * míchaném ethyletheru (40 ml) a hexanu (40 ml) při 4 °C pod argonem k odstranění nečistoty hydrogenfosfonamidatu, která v tomto případě nemůže být odstraněna chromatografíi na koloně. Pevná látka se zfiltruje, promyje se hexanem a suší se ve vakuu. Srážení se opakuje dvakrát a získaná pevná látka se dále purifikuje na SiO₂ (10% Et₃N/CH₂Cl₂ ) a poskytne 0,89 g (12,8%) čistého produktu fosforamiditu. ³¹P NMR (CD₃CN) δ 165,2, 165,5. 3 '-(Trityl)amino-3 '-deoxythymidin-5'-(2-kyanoethyl 2,2,6,6tetramethylpiperidin) fosforamidit, 5t, se purifikuje na SiO₂ (5% MeOH/5%Et₃N/toluen) a poskytne 3,33 g (54,8%) čistého fosforamiditu. ³¹P NMR (CDClj) δ 165,3, 166,1.

Příklad 7

Příprava 3^z-(trityl)amino-2'.3'-dideoxynukleosid-5'-sukcinylatů. 6a, 6c a 6t.

Do 1,5 mmol 3'-(trityl)amino-2',3'-dideoxynukleosidu (3t, 3c, nebo 3a) v 5 ml CH₂C1₂ se přidá 0,22 g (1,8 mmol) V.Tf-dimethylaminopyridinu a potom 0,18 g (1,8 mmol) sukcinanhydridu. Po míchání při teplotě místnosti 1 h se reakční směs zchladí přídavkem 0,6 ml methanolu, zředěného s CH₂C1₂ a extrahuje se chladnou 10% kyselinou citrónovou, vodou a nasyceným vodným NaCl. Organická vrstva se suší (Na₂SO₄), filtruje se a koncentruje na pěnu. N⁶-Benzoyl-3'-(trityl)amino-2',3'-dideoxyadenosin-5'-sukcinylat, 6a. Výtěžek 1.15 g (100%). N⁴-Benzoyl-3'-(trityl)amino-2',3'-dideoxycytidin-5'-sukcinylat, 6c. Výtěžek 0,77 g (76,3%). 3'-(Trityl)amino-3'-deoxythymidin-5'-sukcinylat, 6t. Výtěžek 0,82 g (94,0%).

Příklad 8

Příprava 3'-(trityl)amino-2'.3'-dideoxynukleosid-S^-sukcinvlem plněného CPG

Do 1 mmolů 3'-(trityl)amino-2',3'-dideoxynukleosid-5'-sukcinylatu, (6a, 6c nebo 6t) a 0,13 g (0,95 mmol) 1-hydroxybenzotriazolu v 5 ml Nmethylpyrrolidonu a 5 ml DMSO se přidá 0,35 ml ( 2,0 mmol) N,Ndiisopropylethylaminu a potom 0,36 g (0,95 mmol) 2-(l-H-benzotriazol-l-yl)33 • f • · 9 · • « fe • fefe • · · fe« 9 99 9 • fe fefe • a · · · · · • · f> fe · · · • « ♦ · · · · ··· • · · fe · · « · · ·' · · ··

1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorfosfatu. Roztok se míchá 5 min, přidá se do 10,0 g aminopropyl-CPG, a vloží se do třepačky na 6 h. CPG se filtruje a promyje se DMF, methanolem, a ethyletherem. Nezreagované aminoskupiny na CPG se acetylují použitím standardních ABI překrývacích roztoků po 30 min. Nanesení nukleosidu, stanovená trityl-testem při 432 nm ve 20% TFA/CHCI3 použitím molárního koeficientu extinkce 40,7 μηιοΓ¹ .cm'¹, byly 38,6 pmol/g pro A, 33,6 pmol/g pro C a 29,0 pmol/g pro T.

Příklad 9

Měření aktivační rovnovážné konstanty Ki tetrazolu

Rovnováha definovaná rovnicí 1 byla studována rozpuštěním N⁶-benzoyl3 '-(trityl)amino-3 '-deoxyadenosin-5 '-(2-kyanoethyl N,Ndiisopropyljfosforamiditu, (4a. 56,1 mg, 65,2 pmol) v 0,300 ml suchého deuteroacetonitrilu a přidáním 0,300 ml roztoku 0,5 M tetrazolu v acetonitrilu, vše pod atmosférou argonu. Po 2 min bylo zaznamenáno ³¹P-NMR spektrum, zobrazené na obr. 1.

Spektrum sestává z rezonancí odpovídajících monomeru fosforamiditu (143,07, 143,72 ppm) tetrazolidyl-amiditového meziproduktu (127,58 ppm), hydrogenfosfonatu (10,24, 9,61 ppm) vzniklého z hydrolýzy některého z monomerů (přes meziprodukt tetrazolidyl amiditu), a minimálních vedlejších reakcí. Celek integrací těchto druhů byl posouzen jako shodný s výchozí koncentrací fosforamiditu 0,0993 M, koncentrace při rovnováze byly vypočteny z relativních integrací jednotlivých resonancí. Koncentrace druhů, které neobsahují fosfor, a tudíž se nevykazují ve spektru, byly vypočteny následujícím postupem. Koncentrace diisopropylammonium tetrazolidu při rovnováze (0,0824 M) byla uvažována jako odpovídající výchozí koncentraci (0,0993 M) mínus rovnovážná koncentrace (0,0169 M) fosforamiditového monomeru. Koncentrace tetrazolu při rovnováze (0,0875 M) byla uvažována jako odpovídající výchozí koncentraci tetrazolu (0,2286 M) mínus součet koncentrace tetrazolidylamiditového meziproduktu (0,0587 M) a koncentrace

diisopropylamoniumtetrazolidu ((0,0824 Μ). Aktivační rovnovážná konstanta

Ki byla vypočtena následovně:

• · 94 9 4 4 4 4·

9 « * · ·· · • · * · 9 · · • · ·· · · · · · ·

Λ · 9 4 4 ·· 99 94 [Tetrazolidylamidit] [R₂NH₂ ⁺tetrazolid~] Ki = [Tetrazol]² [monomer amidit] (0,0587 M) (0,0824 M) (0,0875 M)² (0,0169) = 37,4 M¹

Výše uvedený experiment se opakoval s použitím 3'-tritylaminothymidin5'-diisopropylaminofosforamiditového monomeru (4t) a Ki bylo stanoveno na

56,2 M’¹. Experiment se opět opakoval s použitím 3'-tritylaminothymidin-5 tetramethylpiperidinylfosforamiditového monomeru (5t). ³¹P-NMR spektrum je zobrazeno na obrázku 2.

Za podmínek experimentu nebyl při rovnováze detekován žádný zbývající tetramethylpiperidinylfosforamiditový monomer (předpokládáno 165.3, 166,1 ppm). Monomer může být detekovatelný nad hladinou spektra, pokud je jeho koncentrace alespoň 0,19 mM. Z této informace lze vypočítat, že Ki musí být pro tuto rovnováhu alespoň 5260 M'¹, nebo 93 krát větší, než pro diisopropylaminofosforamiditový monomer. Experiment se opakoval ještě jednou s použitím 3 '-tritylaminothymidin-5'-(N-isopropyl-Nt.butyljfosforamiditového monomeru (4t). Jako v případě tetramethylpiperidinylfosforamiditového monomeru, nebyl tento monomer při rovnováze v ³¹P-NMR spektru detekovaný.

Příklad 10 · 9 * • · * · · · · • 4 · * · ·

9 · «49 •9 «»·· ·· » * «·9 999

9 9

9 9 9

Syntéza monomerů oligo-2'-deoxynukleosid N3'->P5' fosforamidatů použitím diisopropylaminofosforamidatových monomerů v rozsahu 1-umol

Oligonukleotid N3'—>P5' fosforamidaty byly připraveny na ABI 392 DNA syntetizeru a v rozsahu l-pmol a purifikovány preparativní intově výměnnou chromatografii. Syntéza se prováděla ve směru 5'ke 3 (namísto směru od 3'k 5', na který jsou naprogramovány komerčně dostupné syntetizery) použitím l-pmolu 3'-(trityl)amino-2',3 -dideoxynukleosid-5'sukcinylu neseného GPC v koloně. 3'-Tritylamino-5'diisopropylfosforamiditové monomery byly připraveny jako 0,1 M roztoky v acetonitrilu; aktivačním roztokem byl 0,5 M tetrazol v acetonitrilu (PE Applied Biosystems, Foster City, CA), detritylačním roztokem byla 3% dichloroctová kyselina (DCA) v dichlormethanu (DMC), a oxidačním roztokem byl O,1M jod v roztoku tetrahydrofuranu/pyridinu/vodě, 75/20/2, obj./obj./obj. (PE Applied Biosystems, Foster City, CA).

Oligonukleotid N3'-»P5' fosforamidaty byly syntetizovány použitím repetitivního cyklu syntézy sestávajícího z detritylace následované interakcí, oxidací, interakcí, oxidací. Detritylace 3'-aminu na nosič vázaného nukleosidu bylo dosaženo použitím po 40 sekund toku 3% DCA/DCM pro nukleosidy G a A, a 50 sekund pro nukleosidy T a C. Na nosič navázaný 3'aminonukleosid byl potom šestkrát promyt proplachovací kombinací 10 sekund přívodu acetonitrilu / 5 sekund argonu. Interakce aminu s 5'-fosforamidit-3'tritylaminonukleosidem bylo dosaženo použitím střídavého přívodu monomeru plus tetrazolu a tetrazolu samotného do kolony po asi 10 sekund, následovaný 5minutovým počkáním. Monomer byl vymyt z kolony argonem a bezprostředně byl přidán jodový roztok, následovaly 2 minuty sečkání. Po ukončení oxidace byl narůstající nosič, který váže oligomer, promyt jedenkrát 20 sekund kombinací přívodu acetonitrilu /5 sekund přívodu argonu, a pětkrát kombinací 10 sekund přívodu acetonitrilu / 5 sekund přívodu argonu. Interakce a oxidace se jednou opakovaly, následovalo promývání před detritylací. Použitím tohoto postupuje použito asi 15 ekvivalentů monomeru (ve srovnání s původním nanesením nukleosidu vázaného na nosič) pro každý krok • ·· 9 • ·

I 9 9 « • ·ζ · · • · · · ♦ • · · · • « ·«· · ·· » a · > 9 9 · · interakce; tudíž asi 30 ekvivalentů monomeru je použito pro každý cyklus syntézy.

Po ukončení syntézy byl 3'-detritylovaný oligonukleotid N3'—»P5' fosforamidat vázaný na nosič odštěpen, a zbaven bázické ochrany v koncentrovaném vodném amoniaku při 55 °C po 12 hodin. Roztok rozštěpeného a zbaveného chránící skupiny oligonukleotid N3'—»P5' fosforamidatu byl odebrán z CPG a CPG byl promyt dvakrát 200 μΐ amonia. Všechny promývací roztoky amoniaku byly spojeny, roztok byl pufrován na 0,0ÍM NaOH a amoniak byl odstraněn ve vakuu. Po filtraci byl surový oligonukleotid purifikován na preparativní aniontově výměnné koloně (Pharmacia MonoQ 10/10), zbaven solí na Sephadexu G-25 (Pharmacia NAP5) a lyofilizován.

Sekvence uvedené dále byly syntetizovány na ABI syntetizeru použitím buď fosforamiditového aminového výměnného postupu podle vynálezu, nebo řešením podle Atherton-Todd oxidační interakcí, jak je např. popsáno v Letsinger a kol., v patentu US 5 476 925. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 3a a 3b a znázorněny na obr. 3a a 3b, na kterých jsou zobrazeny chromatogramy iontově výměnných HPLC separací dvou směsných bázických sekvencí uvedených v tabulce.

Sekvence1	SEQ IDe.	Metoda	Surový x OD	HPLC =	Výtěžek čistota
T15	3	Amino-výměna	74	56%	41
T,5	3	Atherton-Todd	49	29%	14
A15	4	Amino-výměna	101	39%	39
A,5	4	Atherton-Todd	86	8%	7
5'-AACGAGTTGGGGCAT 5	Amino-výměna	96	42%	40

(OD jednotky) • » β w ♦ ft · · • » • * ftft

5'-TTCTCTCTCTA ' 6

Amino-výměna 71 62% 44 • » ft ft • ftft ·

Sekvence syntetizované oxidační slučovací metodou podle Atherton-Todda mají 3 terminální hydroxylovou skupinu, zatímco sekvence syntetizované metodou výměny aminu mají 3'-terminální aminoskupinu.

Příklad 11

Syntéza oligo-2^/-deoxynukleosid N3'—>P5 fosforamidatů použitím diisopropylaminofosforamiditových monomerů v rozsahu 1-umolu : Srovnání slučování/oxidace se slučováním/oxidací/slučováním/oxidací

Vliv na výtěžek produktu jednoho kroku slučování /oxidace byl porovnáván s výtěžkem produktu při dvojitém kroku slučování /oxidace (slučování/oxidace/slučování/oxidace) následujícím způsobem:

Sekvence 5'- AAC-ATG-GAG-AGC-GTC-3'(SEQ ID NO:7) byla syntetizována použitím diisopropylaminofosforamiditových monomerů použitím postupu popsaného výše a porovnána s druhou syntézou, která byla podobná té výše, ale s následujícími rozdíly: 1) jedna slučování/oxidace použitá na cyklus (namísto dvou) a 2) koncentrace roztoku monomeru byla 0,2 M (namísto 0,1 M). Tudíž byly v experimentu jediného slučování/oxidace použito kolem 30 ekvivalentů monomeru v každém cyklu syntézy, zatímco v experimentu slučování/oxidace/slučování/oxidace bylo použito kolem 15 ekvivalentů monomeru v každém ze dvou kroků slučování, pro totéž celkově kolem 30 ekvivalentů monomeru na cyklus syntézy.

Výsledky, které jsou uvedeny dále, dokládají zlepšenou účinnost při použití 2 x metody (slučování/oxidace)

Metoda

Surový

OD

HPLC čistota

Výtěžek (OD jednotky) « · * ·

00»· 0 » 0 «»·» • « · · · · 0 · · · » · 0 ·» 9 »9 »»···· »00 » 0 » · 0 » »» »»0» ·0 *· *· »*

Slučování/oxidace 113

2x(slučování/oxidace) 115

21,3% 24,1

29,4% 33,8

Příklad 12

Syntéza oligo-2'-deoxynukleosid N3>P5'fosforamidatů v rozsahu 1-umolu:

Porovnání bez překrytí, překrytí s acetanhvdridem. a překrytí anhvdridem kyseliny isomáselné

Sekvence 5'- AAC-ATG-GAG-AGC-GTC-3'(SEQ ID NO:7) byla syntetizována třikrát v rozsahu 1-μπιο1υ použitím výše uvedeného postupu, ale do dvou syntéz byl v každém cyklu po posledním oxidačním kroku a před detritylací vložen překrývací krok o 60 sekundách. Jako překrývací činidla byly použity acetanhydrid/NMI (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) v jednom z experimentů, a anhydrid kyseliny isomáselné (1/1/8 anhydrid kyseliny isomáselné/2,6-lutidin/THF)/NMI (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) ve druhém. Výsledky uvedené dále dokládají zlepšení výtěžku a čistoty s překrytím.

Překrytí Surový OD HPLC Čistota = Výtěžek (OD jednotky)

Bez překrytí	97	29,6%	28,7
Acetanhydrid	97	39,6%	38,4
Anhydrid kyseliny
isomáselné	82	39,6%	32,5

Příklad 13 ·· · ·

Syntéza oligo-2 -deoxynukleosid N3'->P5'fosforamidatů v rozsahu 1-u.molu:

Porovnání oxidace I? a H₂Q?

Následující sekvence byly syntetizovány v rozsahu ΐ-μηιοίυ použitím výše popsaného postupu, avšak v jedné řadě experimentů byla jodová oxidační reakční látka nahrazena oxidačním činidlem sestávajícím z 1,5% H₂O2/3,5 % H₂O /20 % pyridinu/ 75 % THF. V těchto experimentech nebylo použito žádné překrytí.

Sekvence Oxidační látky %Plné délky %“N-l“chybných produktu sekvencí

5'-TTTTT	I2	76,94	5,11
5'-TTTTT	H2O2	80,05	2,55
5'-TAAAA	I2	73,05	4,28
5'-TAAA	H2O2	78,72	2,69

Příklad 14

Syntéza oligo-2'-deoxynukleosid N3'—>P5'fosforamidatů v rozsahu ΙΟ-μιηοΙη :

Porovnání monomerů diisopropyl- a tetramethylpiperidinyl-fosforamiditu

Následující obecný postup byl prováděn pro syntézy v rozsahu 10-μιηο1:

Oligonukleotid N3'-^P5'fosforamidaty byly připraveny na modifikovaném 390Z ABI DNA syntetizeru při rozsahu 10-μιηο1 a « · ···· • · ··· ·

purifikovány preparativní iontově výměnnou chromatografií. 3'-Tritylamino 5'-fosforamidatové monomery byly připraveny jako 0,1 M roztoky v acetonitrilu; aktivátorem byl 0,15 M tetrazol v acetonitrilu; detritylačním roztokem byla 3% kyselina dichloroctová (DCA) v dichlormethanu (DCM), a oxidačním roztokem byl 0,1 M jod v tetrahydrofuranu/pyridinu/vodě, 75/20/2 (obj./obj./obj.) (PE Applied Biosystems, Foster City, CA).

Oligonukleotidy byly syntetizovány použitím vsádkového repetitivního cyklu syntézy, který sestává z detritylace následované slučováním (interakcí) a oxidací. Individuální moduly byly popsány a sloučeny do formy kompletního cyklu syntézy. Přesněji, syntéza je prováděna ve směru 5' ke 3' použitím 10 pmol 3'-(trityl)amino-2',3'-dideoxynukleosid-5'-sukcinylem zatíženého CPG. Detritylace 3'-aminu bylo dosaženo použitím opakovaného přítoku 3% DCA/DCM do hlavy reakční nádoby následovaného 3 sekundami víření a odtoku. Celková doba exponování kyselinou je přibližně 2 minuty. Potom byl 3 '-aminonukleosid vázaný na nosič promyt 10 krát řadou střídavých promývacích roztoků ode dna reakční nádoby stejně jako od hlavy s vířením a odtokem. Sloučení získaného volného aminu (převážně jako dichloracetátové soli) s 3 '-(trityl)aminonukleosid-5 '-fosforamiditovým monomerem se provádělo použitím výchozí dávky monomeru v reakční nádobě a následným dávkováním tetrazolu. Slučovací směs potom byla vířena po dobu 5 minut. Po odtoku z reakční nádoby byl bezprostředně dodán roztok jodu, a vířen po 2 minuty. Oxidační roztok byl sušen a nosič byl promyt 10 krát řadou střídavých acetonitrilových promývacích roztoků ode dna reakční nádoby stejně jako od hlavy za víření a odtoku.

Po ukončení syntézy byl oligonukleotid s 3 -odebranou chránící skupinou odštěpen z nosiče a zbaven ochrany koncentrovaným vodným amoniakem při °C po 12 hodin. Roztok se pufroval na 0,01 M NaOH a amoniak se odstranil ve vakuu. Po následné filtraci se surový roztok purifikoval na preparativní aniontově výměnné koloně (Pharmacia MonoQ 10/10), byl zbaven soli a lyofilizován.

Použitím výše uvedeného postupu byly syntetizovány v rozsahu 10 pmol 5'-TT-3'dimery při použití různých koncentrací ( a tedy různého počtu ekvivalentů) tetrazolu a buď monomeru diisopropylaminofosforamiditu nebo monomeru tetramethylpiperidinfosforamiditu. Výsledky jasně dokazují, že se syntézy fosforamidatů mohou provádět použitím výrazně nižších ekvivalentů silnějšího tetramethylpiperidinyl-fosforamiditového monomeru než méně silného diisopropylaminofosforamiditového monomeru.

Typ monomeru	Ekvivalenty monomeru	Ekvivalenty tetrazolu	%Dimeru	%Nezreagovaného monomeru
diisopropyl	10	50	93,8	2,4
diisopropyl	5	50	89,1	5,0
diisopropyl	2,8	28	87,1	8,0
diisopropyl	2,8	7	82,9	14,0
tetramethyl-
piperidin 2,8	7	94,2	2,8

Příklad 15

Syntéza oligo-2'-deoxynukleosid N3'—>P5'fosforamidatů v rozsahu 10-umolu

Následující sekvence byly syntetizovány v rozsahu 10-pmol použitím výše uvedeného postupu a použitím následujících množství monomerů tetramethylpiperidinyl-fosforamiditu.

Sekvence • ft ·· • ftftft · · • · · · · • · · · · * • · · ♦ ft • ft ftftftft ftft • ftftft ft· ftft • ftftftft • ftftftft • ft ftftft ftftft • ♦ ftft • ft ·· ftft

Ekvivalenty monomeru HPLC na cyklus výtěžek (%)

-TT1	4	94
-AA1'2 *	4	98
-CC1'2	4	96
-ccc2	4	93
-TTTTT	2,8	82

O

Tento oligo byl odštěpen z nosiče s terminální tritylovou skupinou zbývající na dimeru.

Tento HPLC výtěžek je korigován pro benzamid vytvořený při deprotekci benzoylové chránící skupiny na bázi.

Příklad 16

N⁴-benzovl-2'-fluor-3 '-(4-methoxytrityl)amino-2'.3'-dideoxyuridin 5'-(2kvanoethyl N.N-diisopropyl)fosforamidit

2'-Fluornukleosid-fosforamiditové monomery podle vynálezu jsou připraveny postupem, znázorněným ve schématech V a VI. Stručně, ribonukleosid se transformuje na 5'-hydroxyl-chráněný-2',3 anhydroxylnukleosid, potom se 2',3'-epoxykruh otevře zpracováním s azidem sodným nebo podobným reagens, za vzniku 5 -hydroxyl-chráněného-3 -azido3'-deoxyarabinonukleosidu. Po purifikaci se 5'-hydroxyl-chráněný-3'-azido-3deoxyarabinonukleosid fluoruje na 2'-pozici zpracováním s diethylaminosulfurtrifluoridem (DAST), nebo podobným reagens, potom se azidoskupina redukuje za vzniku 3'-aminoskupiny. Po vhodném chránění 3 aminoskupiny a uvolnění 5'-hydroxylové chránící skupiny je nukleosid fosfitylován na 5' kyslíku za tvorby surového fosforamiditového monomeru.

···· ·· ·· > · · · ··· ··· ·· ··

Schéma V o

HO OH

O

MsO

O

II

a) MsCl

b) NaOBz

c) HCI, H₂O

d) NH₄OH

e) NH₄N₃

f) DAST

g) H₂.Pd/c

h) MMTrCl

i) NaOH, H₂0

j) CEOP (N(iPr)₂)₂

V odkazu na schéma V byl uridin 3 methansulfonován a potom selektivně benzoylován za doprovázejícího vzniku 2,2'-anhydrocyklu zpracováním s benzoatem sodným podle postupů v literatuře, např. Codington, J.F.; Fecher,

R.; Fox,J. J.7.Am. Chem 5OC.1960, 82, 2794-2803. Výsledkem těchto reakcí je

00 « · · 0 • 0 · ·0·0 • ·

0 • 00 « ·· 0000 sloučenina 7 s celkovými výtěžky 69-77%. Jinou literární metodou (Codington, J.F.; Fecher.R.; Fox,J.J.J.Organic Chem.

1962, 27, 163-167), 2,3'-anhydroarabinonukleosid 7 byl transformován na 2',3'-anhydrolyxouridin 8 ve dvou krocích. To zahrnuje zpracování 7 s kyselinou chlorovodíkovou za vzniku 3'-mesyl-5'-benzoylarabinouridinu, který se během zpracování s hydroxidem amonným uzavře do formy lyxo-2',3'epoxidu 8 v celkových výtěžcích 63-77%. Potom, také podle publikovaného postupu (Reichman,U.; Hollenberg, D.H.; Watanabt.K.A.; Fox.J.J.J.Organic Chem. 1976, 41, 2042-2043), byl 2',3'-anhydrolyxonukleosid 8 zahříván s azidem amonným. Oproti předpokladům v literatuře, není tato reakce zcela stereoselektivní, ale jejím produktem je chromatograficky nerozlišitelná směs požadovaného 5'-benzoyl-3'-azidoarabinonukleosidu 9 a jeho 2'-azido-2'deoxyregioisomeru 9i v poměru přibližně 2,5:1. Surový arabinonukleosid 9 byl fluorován DAST za vzniku 2'-fluor-3'-azidonukleosidu 10, potom katalyticky hydrogenován za vzniku 2'-fluor-3'-aminonukleosidu 11, který by oddělen od svého regioisomeru chromatogafií na silikagelu. Ochrana 3 -aminu monomethoxytrityl(MMT) skupinou, následovaná 5 -debenzoylací, poskytla meziprodukt 13, který 5'-fosfitylací poskytuje požadovaný fosforamiditový stavební blok 2u ve 22% celkovém výtěžku z anhydronukleosidu 8. Ještě přesněji se kroky prováděly následujícím způsobem:

3'-O-Methansulfonyl-5'-O-benzoyl-2,2'-anhydroarabinouridin 7 byl připraven ve dvou krocích ze 3 postupem podle Codingtona a kol., (citovaný výše, J.Am. Chem.Soc.) v 69-77% celkových výtěžcích.

3'-O-benzoyl-2,3'-anhydrolyxouridin 8 byl připraven ve dvou krocích ze 7 postupem podle Codingtona a kol., (citovaný výše, J.Am. Chem.Soc.) v 6377% celkových výtěžcích.

3'-azido-5'-O-benzoyl-3'-deoxyarabinouridin 9 byl připraven z 8 a bezvodého NH₄N₃ (popsaný v Obenland, C.O.; Mangold, D.J.; Marino, M.P.

Inorg.Synth. 1966,8,53-56) postupem podle Reichmana a kol., (citovaný výše), ale bez uspokojivé rekrystalizace. Hmotové výtěžky byly 98% nebo vyšší, ale

NMR svědčilo o 25-35% regioisomeru, 2'-azido-5'-O-benzoyl-2'• 0 ··«·

00 deoxyxylouridinu, 9i, který se eluuje společně s požadovaným produktem TLC na silikagelu.

’H NMR, majoritní složka, 9: δ 10,8 (br s, 1H), 8,11 (d,J = 7,5 Hz,2H), 7,68 (d,J = 8,1 Hz, 1H), 7,62 (d,J = 7,3 Hz, 1H), 7,5 (m, 2H), 6,19 (d,J = 3,6 Hz, 1H), 5,40, (d,J = 8,0 Hz, 1H), 4,84 (m, 1H), 4,73 (d,J = 5,7 Hz, 1H), 4,63 (br d, J = 4,2 Hz, 1H), 4,2 mm, 2H;

minoritní složka, 9i: : δ 10,6 (br s, 1H), 8,11 (d,J = 7,5 Hz,2H), 7,81 (d,J =

8,1 Hz, 1H), 7,64 (d,J = 7,5 Hz, 1H), 7,5 (m, 2H), 5,85 (s, 1H), 5,47 (d,J =

8,1 Hz, 1H), 4,86 (m, 1H), 4,76 (d,J = 5,4 Hz, 1H), 4,62 (br d, J = 4,0 Hz,

1H), 4,3-4,2( mm, 2H).

2'-fluor-3'-azido-5'-O-benzoyl-2',3'-dideoxyuridin 10 byl připraven následujícím postupem: Do 5 g (13,4 mmol) surového 9 (obsahujícího 25 %

9i) ve 30 ml bezvodého CH2CI2 se přidalo 8,8 ml (66,6 mmol) diethylaminosulfurtrifluoridu. Po míchání 48 h byla směs zředěna 100 ml CH2CI2 a nalita do 200 ml nasyceného vodného NaHCO3, Když vývin plynu ustal, byla vrstva CH2CI2 promyta 100 ml čerstvého roztoku NaHCCh a potom vodou (2 x 100 ml). Koncentrací CH2CI2 vrstvy ve vakuu a mžikovou chromatografii se získalo 3,5 g (70%) produktu obsahujícího 20% rozsáhle chromatograficky nerozdělitelných isomerních nečistot, lOi.

*H NMR, majoritní složka, 9: δ 8,7 (br s, 1H), 8,07 (d,J = 7,4 Hz,2H), 7,62 (d,J = 7,5 Hz, 1H), 7,49 (dd,J = 7,6, 7,6 Hz, 2H), 7,39 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 5,70, (d,J = 21,1 Hz, 1H), 5,65 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 5,48 (dd,J =

4,7, 52,9 Hz, 1H), 4,7-4,4 (nerozděleno), 4,32 (dd, J = 4,7, 9,5 Hz, 1H),

4,27 (dd, J = 4,7, 9,5 Hz, 1H);

minoritní složka, lOi: : δ 8,7 (br s, 1H), 8,03 (d,J = 7,2 Hz, 2H), 7,64 (d,J =

7,6 Hz, 1H), 7,51 (dd,J = 7,4, 7,7 Hz, 2H), 7,33 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 5,99 (d,J = 6,4 Hz, 1H), 5,67 (d, J = 9 Hz, 1H), 5,40 (ddd,J = 2,8, 5,0, 53,4 Hz, 1H), 4,8-4,4 (nerozděleno), 4,10 (mm, 2H).

2'-fluor-3'-amino-5'-O-benzoyl-2',3'-dideoxyuridin 11 byl připraven následujícím postupem: Do 3,5 g (9,3 mmol) surového 10 (10 % lOi) ve 200 ·« fefe • fefe fe fefe · • · · • · · •fe ···· • fe ··»· fefe • fefe • · ml 95% ethanolu se přidalo 600 mg 10% paladia na uhlíku. Suspenze byla hydrogenována při 40 psi (kolem 413 kPa) přes noc a potom byl katalyzátor odstraněn filtrací. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu za vzniku 2,93 g (90%) světle žluté pevné látky sestávající ze dvou sloučenin, které byly rozdělitelné TLC. Mžikovou chromatografii se získalo 1,96 g (60% výtěžek) požadovaného produktu jako čisté bílé pevné látky. Hmotovou spektrometrií, FAB⁺, M+H⁺, bylo vypočteno: 350,1152, pozorováno 350,1152.

*H NMR δ 8,14 (br s, 1H), 8,06 (d,J = 7,1 Hz, 2H), 7,64 (dd,J = 7,4, 7,7 Hz, 1H), 7,57 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,50, (dd 7,7, 7,8 Hz, 1H), 5,86 (d,J = 18,5 Hz, 1H), 5,51 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 5,00 (dd, J = 4,3, 52,4 Hz, 1H), 4,81 (dd J = 2,2, 12,8 Hz, 1H), 4,73 (dd, J = 3,5, 12,7 Hz, 1H), 4,14 (ddd, J = 2, 3,

10,2 Hz, 1H), 3,57 (ddd, J = 4, 10,5, 26,6 Hz, 1H); ¹⁹F NMR 5-198,3 (ddd, J = 18,5,26,4, 52,2 Hz).

2'-fluor-3'-(4-methoxytrityl)amino-2',3'-dideoxyuridin 12 byl připraven následujícím postupem: Do 1,0 g (2,9 mmol) 11 v 50 ml bezvodého pyridinu byl přidán 1,0 g (3,2 mmol) 4-methoxytritylchloridu. Směs byla míchána přes noc, přidalo se 5 ml nasyceného vodného NaHCCh a směs se koncentrovala ve vakuu na olej. Olej byl rozpuštěn ve 125 ml ethylacetátu, který byl promyt vodou (3 xx 100 ml), a opětovně koncentrován ve vakuu na 2,05 g pěny.

Pěna byla rozpuštěna ve směsi 40 ml methanolu, 40 ml dioxanu a 10 ml vody. Byl přidán NaOH (1 g, 25 mmol) a směs byla míchána přes noc. Roztok byl koncentrován ve vakuu na sirup, který byl rozpuštěn ve lOOml ethylacetátu a promyt vodou (3 x 100 ml). Koncentrací organické vrstvy ve vakuu se získalo 1,11 g pěny, která poskytla po mžikové chromatografii 1,05 g (76%) bílé látky. Hmotovou spektrometrií, FAB⁺, M+H⁺, bylo vypočteno: 518,2091, pozorováno 518,2076.

³H NMR δ 8,64 (br d J = 4,2 Hz, 1H), 8,14 (br, s, 1H), 7,57 (mm, 5H), 7,48 (d J = 8,7 Hz, 1H), 7,3 (mm, 8H), 6,83 (d J 8,8 Hz, 2H), 5,67 (d,J = 17,7 Hz, 1H), 5,62 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 4,23 (m, 2H), 4,03 (br d,J = 10,2 Hz, 1H), 3,80 (s, 3H), 3,31 (dddd, J = 3,6, 10,3, 10,9, 25,8 Hz, 1H), 2,80 (dd, J = 3,6, 50,9 ·· ftft·· ·« ·· • ·· · • · · • · · · • · · ·· ···· • · · ··♦ • · · • ·> · >· ·· ·· ·· • · · · • · · · « ··· ··« • · ·· ·>

Hz, 1H), 2,51 (dd, J = 3,0, 11,2 Hz, 1H); ¹⁹F NMR δ-192,5 (dddd, J = 2,9

11,2 Hz, 1H); ¹⁹F NMR δ-192,5 (dddd, J = 2,9 17,7,

26,1, 50,9 Hz).

N⁴-benzoyl-2'-fluor-3'-(4-methoxytrityl)amino-2',3'-dideoxyuridin 5'(2-kyanoethyl N,N-diisopropyl)fosforamidit 2u byl připraven následujícím postupem: Do 700 mg (1,35 mmol) 12 ve 20 ml bezvodého CH2CI2 bylo přidáno 200 mg (1,17 mmol) tetrazolidu diisopropylamonného a 0,5 ml (1,57 mmol) 2-kyanoethyl Ν,Ν,Ν',Ν'-tetraisopropylfosfordiamiditu. Po míchání směsi po 3 h bylo rozpouštědlo odstraněno ve vakuu a zbytek byl purifikován na Chroniatotronu s použitím 4 mm destiček a promýváním 0-3% methanolem, 0,5% triethylaminem v CH2CI2. Produkt byl koncentrován ve vakuu na olej, který byl rozpuštěn v 10 ml CH2CI2 a vysrážen pomalým přidáváním do 100 ml rychle míchaného hexanu. Po dekantaci supernatantu byl produkt vakuově vysušen nad P2O5 za vzniku 680 mg ( 70%) bílého prášku.

Hmotovou spektrometrií, FAB⁺, M+H⁺, bylo vypočteno: 718,3170, pozorováno 718,3194. ¹⁹F NMR δ-190,9 (ddd, J = 21,7, 21,8, 51,3 Hz); ³¹P NMR δ 150,5, 149,5.

Příklad 17

N⁴-benzovl-2'-fluor-3'-(4-methoxytrityl)amino-2^/· 3 '-dideoxycytidin 5'-(2kyanoethyl N,N-diisopropyl)fosforamidit

Pro přípravu příslušně chráněného cytidin-fosforamiditu 2c, jak je znázorněno ve schématu VI dále, byl použit surový meziprodukt 10. Uracilová báze byla konvertována na cytosin přizpůsobením postupu od Divakar a Reese, J. Chem.Soc., Perkin.Trans. 1 1982, 1171-1176. Následnou 4-N benzoylací a redukcí 3 '-azidoskupiny na aminovou skupinu vznikla sloučenina 13, oddělitelná od svého regioisomeru chromatografii na silikagelu. Ochrana 3'aminu prostřednictvím MMT-skupiny, následovaná selektivní 5-Odebenzoylací, poskytla meziprodukt 15. Následná 5 - fosfitylace vedla k požadovanému fosforamiditu 2c v 10% celkovém výtěžku vztaženo na anhydronukleosid 8.

« · · · · · • t

Schéma VI φφφφ φφφ φ φ φφφφ φ φ φ φφφ φ φ * φ « φ φ φ

ΗΝΒζ

MMTrNH F 15

CEO-rP

a) POC1₃, triazol, ΊΈΑ; NHtOH

b) BzCl

c) H₂ Pd/C

d) MMTrCl

e) NaOH, Pyr/MeOH/H₂O; H^-Pyr dowex

f) CEOP (N(iPr)₂)₂

Ještě přesněji se kroky prováděly následujícím způsobem: N⁴,5'-Odibenzoyl-2'-fluor-3'-amino-2',3'-dideoxycytidin 13 byl připraven následujícím postupem: Do 6,9 g (18,4 mmol) surového 10 (obsahujícího 35% lOi) v 50 ml bezvodého CH₃CN byl vnesen ledově chladný roztok 11,7 g (169 mmol) 1,2,4• · • » · · · · • * ι» · • 4 vt

9 9 9 ·

9 9 9 9 · 9 9 9 9

9 9 9 9 ^r9 9 99 99 9 9 triazolu a 3,35 ml (36,1 mmol) POCI3 v 90 ml bezvodého CH3CN. Směs byla ochlazena v ledové lázni a byl přidán bezuvodý triethylamin (23 ml, 165 mmol), potom byla reakční směs ponechána ohřát se za míchání na teplotu místnosti . Po 90 min bylo přidáno 15 ml (108 mmol) triethylaminu a 4 ml vody a směs byla míchána po 10 min. Rozpouštědlo bylo odebráno ve vakuu, potom bylo přidáno 250 ml ethylacetátu a roztok byl indikován TLC fluorescenčním meziproduktem se stejnou mobilitou, jako výchozí materiál.

Směs byla koncentrována ve vakuu na 6.7 g pěny. Byl přidán dioxan (ÍOO ml) a 20 ml koncentrovaného vodného amoniaku, a po 3 h byla směs konvertována ve vakuu na žlutý gel. Gel byl rozpuštěn ve 100 ml ethylacetátu a promyt vodou (3x200 ml). Koncentrací ve vakuu a vakuovým vysušením nad P2O5 se získalo 5,4 g pevné látky, která poskytla pouze jednu skvrnu při TLC na slikagelu. Při ^l9F NMR byly pozorovány pouze dva významné signály. Majoritní složka:5-192,8 (ddd, J = 22,8, 22,8, 53,1 Hz); Minoritní složka:5200,7 (ddd, J = 13.6, 19,9, 53,4 Hz).

Byl přidán bezvodý pyridin (100 ml) a roztok byl ochlazen na 4 °C. Za míchání byl přidán benzoylchlorid (11,7 ml, 100 ml) a směs byla ponechána se ohřát na teplotu místnosti. Po 2 h bylo přidáno 5 ml vody a rozpouštědlo bylo odebráno ve vakuu„ čímž se získal hnědý olej, který byl rozpuštěn ve 200 ml ethylacetátu, promyt vodou (3 x 200 ml) a potom opětovně koncentrován ve vakuu za vzniku olejové pěny.

Byl přidán ethanol (150 ml) a 2 g 10% paladia na aktivním uhlí a směs byla přes noc hydrogenována při tlaku 40 psi H₂ (asi 413 kPa). TLC indikovala vytvoření dvou nových, pomalých, uzavřeně se pohybujících sloučenin.

Katalyzátor byl odebrán filtrací, a filtrát byl koncentrován ve vakuu na olejovou žlutou pěnu. Mžiková chromatografie na silikagelu (500 ml siliky, promývání 0-3% CH₃OH v CH2CI2) poskytla 1,85 g částečně čistého produktu, který byl rozpuštěn v 10 ml CH2CI2. Pevná látky se rychle vysrážela, potom byla spojena filtrací a promyta čerstvým CH2CI2. Vakuovým vysušením se • · · · • · · o · · • · · * · · • · · · · • · 9 9ι 9 9

9 9 9 9

9999 99

9 999 999

9 9

99 získalo 1,5 g produktu 13 (11% výtěžek z 9 a 9i) jako jemných bílých krystalů.

Hmotovou spektrometrií, FAB⁺, M+H⁺, bylo vypočteno: 453,1574, pozorováno 453,1574.

^lH NMR δ 8,21 ( d,J = 7,5 Hz, 1H), 8,08-8,13 (mm, 3H), 7,94 (d,J = 7,4 Hz, 2H), 7,46,7,7 (mm, 8H), 6,04 (d,J = 16,9 Hz, 1H), 5,08 (dd, J = 3,6, 51,5 Hz, 1H), 4,85 (dd, J = 3,3, 12,8Hz, 1H), 4,80 (dd,J = 2,1, 12,8 Hz, 1H), 4,26 (m, 1H), 3,48 (dm, J = 27 Hz, 1H), ¹⁹F NMR δ-200,1 (m).

N⁴,5 '-O'-dibenzoyl-2'-fluor-3 '-(4-methoxytrityl)amino-2',3'dideoxycytidin 14 byl připraven následujícím postupem: Do 0,9 g (2,0 mmol) ve 25 ml bezvodého pyridinu bylo přidáno 0,86 g (2,8 mmol) 4methoxytritylchloridu, a směs byla míchána přes noc. Reakční směs byla ochlazena 0,5 ml H^O a zkoncentrována ve vakuu. Byl přidán CH2CI2 (50 ml) a promyto 50 ml nasyceného vodného NaHCCh a vodou (2 x 50 ml). Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu, nahrazeno 10 ml CH2CI2 a směs byla pipetována do 80 ml rychle míchaného 1/1 hexanu / etheru. Po dalším míchání 2 h se produkt spojil filtrací a sušil ve vakuu za vzniku 1,3 g (výtěžek 88%) produktu jako bílého prášku. Hmotovou spektrometrií, FAB⁺, M+H⁺, bylo vypočteno: 725,2772, pozorováno 725,2761.

’H NMR δ 8,59 (br s, 1H), 8.07 (br d, J = 5,7 Hz, 1H), 7,89 (br d, J = 7 Hz, 2H), 7,83 (dd, J= 1,3, 6,7 Hz, 2H), 7,68 (dd, J= 7,4, 7,4 Hz, 2H),

7,5-7,6 (m, 8H), 7,43 (dd, J=2,1, 6,9 Hz, 2H), 7,1-7,3 (mm, 7H), 6,71 (d,

J = 8,9 Hz, 2H), 5,80 (d, J=15,4 Hz, 1H), 5,03 (dd, J = 2,0, 13,0 Hz, 1H), 4,98 (dd, J = 2,3, 13,1Hz, 1H), 4,41 (br d, J = 10,5 Hz, 1H), 3,63 (s, 3H),

3,36 (dddd, J = 3,l) 11,1, 11,1, 25,7 Hz, 1H), 2,84 (dd, J= 3,1, 59,9 Hz, 1H), 2,52 (dd, J = 2,7, 11,5 Hz, 1H; ¹⁹F NMR δ-196,3 (m).

N⁴-benzoyl-2'-fluor-3 '-(4-methoxytrityl)amino-2', 3'-dideoxycytidin 15 byl připraven následujícím postupem: Do 1,3 g (1,75 mmol) 14 ve 20 ml

65/30/5 pyridinu/methanolu/vody, chlazených v ledové lázni, bylo přidáno 10 ml chladného 2M NaOH v 65/30/5 pyridinu/methanolu/vodě. Směs byla míchána chladná po 20 min, potom se neutralizovala pyridinium-H⁺formou Bio51

Rad AG^(R) 50W-X8 kationtově výměnnou pryskyřicí. Po 5 min byla pryskyřice odebrána filtrací a promyta methanolem. Spojené filtráty a promývací kapaliny byly koncentrovány ve vakuu na olej, který byl rozpuštěn v 100 ml ethylacetátu. Směs byla promyta 100 ml nasyceného vodného NaHCO₃ a vodou (2 x 100 ml). Po koncentrování ve vakuu na pěnu byl produkt rozpuštěn v 10 ml CH2CI2 a pipetován do 75 ml rychle míchaného hexanu/etheru, 2/1.

Produkt byl spojen filtrací a sušen ve vakuu za vzniku 1,13 g (102% výtěžek) produktu jako bílého prášku. Hmotovou spektrometrií, FAB⁺, M+Cs⁺, bylo vypočteno: 753,1489, pozorováno 753,1499.

Ή NMR δ 8,30 (br d, J= 6,8 Hz, 1H), 7.89 (br d, J = 6,7 Hz, 2H), 7,64 (dd, J = 7,4, 7,4 Hz, 1H), 7,44-7,56 (mm, 9H), 7,22-7,32 (mm, 9H), 6,82 (d, J =

8,8 Hz, 2H), 5,80 (d, J=15,7 Hz, 1H), 4,26 (mm, 2H), 4,13 (d, J = 10,2 Hz,

1H), 3,81 (s, 3H), 3,26 (dddd, J = 3,4, 10,7, 10,8, 26,5 Hz, 1H), 2,93 (dd, J = 3,3, 50,5 Hz, 1H), 2,50 (dd, J = 2,8, 11,0 Hz, 1H); ¹⁹F NMR δ-195,3 (m).

N⁴-benzoyl-2'-fluor-3'-(4-methoxytrityl)amino-2',3'-dideoxycytidin 5 '(2-kyanoethyl N,N-diisopropyl)fosforamidit 2c byl připraven následujícím postupem Do 970 mg (1,56 mmol) 15 ve 25 ml bezvodého CH₂C1₂ bylo přidáno 200 mg ( 1,17 mmol) diisopropylamoniumtetrazolidu a 1,0 ml (3,15 mmol) 2kyanoethyl Ν,Ν,Ν',Ν'-tetraisopropylfosfordiamiditu. Po míchání směsi 3 h bylo rozpouštědlo odstraněno ve vakuu a zbytek byl purifikován na Chromatotronu použitím 4 mm desek a promýváním 0-1,5% methanolem v 0,5% triethylaminu v CH2CI2. Produkt byl koncentrován ve vakuu na pěnu, která byla rozpuštěna v 10 ml CH₂C1₂ a vysrážena pomalým přidáváním 40 ml rychle míchaného hexanu. Po dekantaci supernatantu byl produkt vakuově vysušen nad P2O5 za vzniku 880 mg ( 69%) bílého prášku. Hmotovou spektrometrií, FAB⁺, M+Cs⁺, bylo vypočteno: 953,2568, pozorováno 953,253 1. ¹⁹F NMR δ-193,6 (m); ³¹P NMR δ 150,4, 149,4.

Příklad 18 « · ♦·· · « · • · ·· « · · · · · ♦ * '> · * 9 · « •· 99 9 9 9 9 ·· · · W · · ·

9 9

9 9 9

N⁴-benzoyl-2^,-fluor-3^>-(4-methoxytrityl)amino-2\3'-dideoxycytidin 5'-sukcinvl nesený CPG

Meziprodukt 15 byl 5 -sukcinylován a nanesen na CPG pevný nosič standardními postupy, např. Atkinson, T; Smith,M. v Oligonucleotide Synthesis.A Practical. Approach, Gait, M.J.Ed., IRL Press, 1984, 35-81; a Knorr, R.; Trzeciak, A.; Bannwarth,W.; G\\\QSSQn,D .Tetrahedron Lett, 1989,

30, 1927-1930, Přesněji byl N⁴-benzoyl-2'-fluor-3 '-(4-methoxytrityl)amino2',3'-dideoxycytidin 5'-sukcinyl nesený CPGpřipraven následujícím postupem: Do 100 mg (0,16 mmol) 15 ve 2 ml bezvodého CH₂C1₂ bylo přidáno 55 mg (0,55 mmol) sukcinanhydridu a 65 mg (0,53 mmol) dimethylaminopyridinu. Směs byla míchána po 2 h, odpařena ve vakuu na olej. Olej byl rozpuštěn ve 20 ml CH₂C1₂, promyt 20 ml nasyceného vodného NaHCOs a vodou (2 x 20 ml), a potom opětovně koncentrován ve vakuu na pěnu. Do pěny byl přidán 1 ml 0,4 M diisopropylethylamin v DMSO/N-methylpyrrolidinu, 1/1, a 0,7 ml 0,2 Μ 1hydroxybenzotriazolu, 0,2 M 2-(lH-benzptriazol-l-yl)-l,1,3,3tetramethyluronium hexafluorfosfátu v DMSO/N-methylpyrrolidinu, 1/1. Po 3 min byla směs vtažena do 10 ml injekční stříkačky obsahující 1,2 g CPG s dlouhými alkylaminořetězci. Do injekční stříkačky bylo rovněž nataženo dalších 5 ml promývací tekutiny DMSO. Směs CPG-nukleosid byla míchána po 1,5 h, potom byl CPG promyt 5 objemy bezvodého acetonitrilu.

Nezreagované aminoskupiny CPG byly acetylovány standardními překrývacími roztoky (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) po 2 min. CPG byl opět promyt 5 objemy acetonitrilu a 5 objemy CH₂C1₂. Nanesení nukleošidu bylo stanoveno standardním tritylovým testem na přibližně 5 pmolu/g.

Příklad 19

Syntéza oligo-2'-fluornukleotid N3'->P5' fosforamidatů na pevné fázi

Oligo-2'-fluornukleotid N3'-»P5' fosforamidaty byly syntetizovány na pevné fázi nosičů použitím monomerů fosforamiditů ze schémat V a VI. Sloučeniny 22-25 (Tabulka 1) byly syntetizovány cestou fosforamiditových • * · 4 · · 4 • · • 4 · • · · 4 « «4 4 • · 4 · • · · 44 ·

4 «4 4 4

Sloučeniny 22-25 (Tabulka 1) byly syntetizovány cestou fosforamiditových monomerů. Průměrná účinnost slučování, jak je stanovena MMT-kationtovým testem , byla kolem 94% s jediným slučováním v cyklu a kolem 96% s dvojí aplikací kroku 2 na cyklus syntézy. Reprezentativní IE HPLC profil syntézy surového oligomeru je znázorněn na obr. 4.

Jednotně modifikované oligo-2'-fluornukleotid N3'—>P5' fosforamidaty byly připraveny přenosovou reakcí amiditu na ABI 38OB syntetizeru použitím následujícího protokolu:

1) detritylace, 5% kyselina dichloroctová v dichlormethanu, 1 min,

2) slučování 0,1 M fosforamiditu 2u nebo 2c (schéma V nebo VI) a 0,45 M tetrazolu v acetonitrilu, 3 min,

3) oxidace, 01 M jod v tetrahydrofuranu/pyridinu/vodě, 10/10/1, obj./obj./obj., 1 min,

4) překrytí, acetylace nezreagovaných 3 '-aminoskupin standardními PE aplikovanými biosystemy (PE Applied Biosystems) (Foster City, CA) překrývacími roztoky, 30 Sx

Po chemických krocích v cyklu následovala promývání acetonitrilem a proplach suchým argonem po 0,2-0,4 min. Po odštěpení z pevného nosiče a odebrání ochrany koncentrovaným vodným amoniakem, 1-1,5 h, 55°C, byly oligonukleotidy analyzovány a purifikovány IE HPLC. Oligonukleotidy byly odsoleny na Pharmacia NAP-5 nebo NAP-10 gelových filtračních kolonách bezprostředně po purifikaci a uskladněny zmražené nebo lyofilizované při minus 18 °C.

Příprava 5'-fosforylovaných oligonukleotidů byla uskutečněna během sulfonem derivatizovaného CPG, např. Gryaznov, S.M.; Letsinger, R.L.

Nucleic Acids Res. 1993, 21, 1403-1408.

Pro IE analýzy a purifikaci oligonukleotidů byly použity systémy Dionex

DX300 nebo DX 500. Kolona Pharmacia MonoQ 10/10 byla použita pro analýzu a purifikaci surových oligomerů, promývaná gradientem 2% za minutu

1,5 M NaCl v 10 mM NaOH. Kolona Dionex NuceloPac PA100, promývaná gradientem 1,5% za minutu 1,5 M NaCl v 10 mM NaOH byla použita pro ·* *··· všechny ostatní IE HPLC anylýzy. Pro RP HPLC byla použit Hewlett Packard Hypersil ODS, 5μ kolona vodního HPLC systému, s gradientem 1% za minutu acetonitrilu v 0,1 M triethylamoniumacetatu, pH 7,0.

NMR spektra byla zaznamenávána na Bruker DRX-400 spektrometru. Chemické přesuny jsou zaznamenány ve vztahu k TMS, CC1₃F a H₃PO₄, resp. pro spektra *H, ¹⁹F a ³¹P .

Chromatografie na tenké vrstvě (TLC) se prováděly na Whatmannových silikagelových deskách se zadní polyesterovou stranou, promýváním s methanolem/dichlormethanem.

Kyselá hydrolýza 0,17 OD₂6o dimeru dU^fnpT byla provedena ve 25 μΐ 64% kyseliny octové, 2 h při 55 °C, a reakční směs byla analyzována RP HPLC. Přibližně 83% dimeru, retenční doba (Rt) 15,0 min, bylo hydrolyzováno na hlavně 5'-thymidylovou kyselinu, a 2'-fluor-3'-aminouridin, Rt 11,2 min, jako bylo identifikováno současným vstřikováním ověřenými standardy. Také bylo v reakční směsi nalezeno kolem 7,5% thymidinu, Rt 12,1 min.

Tabulka 1

Oligonukleotidy a hodnoty T_m jejich duplexů

Př	Oligonukleotid 3	č.	SEQ ID Tm°Cb	Tm°Cb RNAC
£	DNAC
1	UUUUUUUUUT	18	8	16,7;24,6	17,9;20,3
2	Unp Unp Unp Unp Unp Unp Unp Unp UnpT	19	8	18,5;38,2	38,1;47,2
3	Unp Unp Unp Unp U np Unp Unp Unp UnpT	20	8	20,0;41,0	40,l;49,2
4	Unp U„p Unp Uf np Uf np Unp Unp Unp UnpT	21	8	23,4;44,6	44,5;52,7
5	P uf np uf np Uf „p uf np Uf np Uf „p ď „p Uf	np Uf „p T

« 9

		22	8	34,6;63,0	55,2;64,6
6	p Uf np Uf np Uf np Uf np Uf np Uf np Uf np	uf uf uf v np u np U n
		23	9	39,5;63,2	56,4;64,0
7	CnpUnpUnpCnpUnpUnpCnpCnpUnpUnp A	24	10	44,2;-	66,0;-
8	cf uf uť cf uf uf cf rf uf npu np^ np1- np U npu np1— np1- np'-'	npUf np A 25	10	56,9;-	81,6;-

Všechny 2'-deoxysloučeniny; np, f, p a n označuje 3'-NHP(O)(O')O-5' internukleosidovou vazbu, 2'-fluor, 5'-fosfonat , resp- 3 -amin; ^bT_m byl stanoven s 3 μΜ oligonukleotidy; první hodnoty byly stanoveny v 10 mM fosforečnanu sodného, 150 mM chloridu sodného, pH 7,04; druhé hodnoty byly stanoveny v tomtéž pufru obsahujícím dalších 10 mM chloridu hořečnatého; příměsi jsou pro nestanovitelné T_ms. 'komplementární vzorek; poly(dA) nebo poly(rA) pro příklady 1-6, d(AAAGGAAGAAGC) nebo r(AUAAGGAAGAAGC) pro příklady 7,8.

•ft ftft ftft ···· ftft ftft

• ftft ftftft» · · •ft ···· ·♦ ftft · * ··

SEKVENČNÍ PROTOKOL (1) OBECNÉ INFORMACE:

(i) PŘIHLASOVATEL.Bernard. L. Hirschbein, Karen L.Fearon, Sergei M.Gryaznov, Sarah N.McCurdy, Jeffrey S.Nelson, Ronald G.Schultz (ii) NÁZEV VYNÁLEZU: Způsob syntézy oligonukleotid N3'->P5' fosforamidatů na pevné fázi (iii) POČET SEKVENCÍ: 10 (iv) KORESPONDENČNÍ ADRESA:

(A) ADRESÁT: Stephen C. Macevicz, Lynx Therapeutics, lne.

(B) ULICE: 3832 Bay Center Plače (C ) MĚSTO: Hayward (D) STÁT: Kalifornie (E) ZEMĚ: USA (F) ZIP: 94545 (v) POČÍTAČOVÁ ČTECÍ FORMA:

(A) TYP PROSTŘEDÍ: disketa 3,5 palců (B) POČÍTAČ: IBM kompatibilní (C ) OPERAČNÍ SYSTÉM: Windows 3,1 (D) SOFTWARE: Microsoft Word for Windows 2,0 (vi) SOUČASNÁ DATA PŘIHLÁŠKY:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY:

(B) DATUM PODÁNÍ:

(C ) ZATŘÍDĚNÍ:

(vii) DATA PRIORITNÍ PŘIHLÁŠKY:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: 08/603566 (B) DATUM PODÁNÍ: 21. února 1996 (viii) INFORMACE O ZÁSTUPCI:

(A) JMÉNO: Stephen C. Macevicz (B) ČÍSLO REGISTRACE: 30,285 (C ) REFERENCE/ČÍSLO: LYNX -035/01

(ix) TELEKOMUNIKAČNÍ INFORMACE:

(A) TELEFON: (510) 670-9365 (B) TELEFAX: (510) 670-9302 (2) Údaje k SEQ ID NO:1 (1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 17 nukleotidů (B) TYP: nukleová kyselina (C ) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 1

GGCCAAAAAG CCACTAT (2) Údaje k SEQ ID NO:2 (1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 11 nukleotidů (B) TYP: nukleová kyselina (C ) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 2

AAGCCTTTAT C (2) Údaje k SEQ ID NO:3 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 15 nukleotidů (B) TYP: nukleová kyselina (C ) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 3 »· ·· • · · · • · * • · · ·· ·»·· rj' «ττ' τη? τ τ τ τ' τ τ' (2) Údaje k SEQ ID N0:4 (1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 15 nukleotidů (B) TYP: nukleové kyselina (C ) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 4

AAAAAAAAAA AAAAA 15 (2) Údaje k SEQ ID NO:5 (1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 15 nukleotidů (B) TYP: nukleové kyselina (C ) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 5

AACGAGTTGG GGCAT 15 (2) Údaje k SEQ ID NO:6 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 11 nukleotidů (B) TYP: nukleová kyselina (C ) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 6

TTCTCTCTCT A 11 (2) Údaje k SEQ ID NO:7 • · · · • « ·· ·· t · * · « • · · · · · · · • · · · • · · 9 · · (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 15 nukleotidů (B) TYP: nukleová kyselina (C ) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 7

AACATGGAGA GCGTC 15 (2) Údaje k SEQ ID NO:8 (1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 10 nukleotidů (B) TYP: nukleová kyselina (C ) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 8

UUUUUUUUUT 10 (2) Údaje k SEQ ID NO:9 (1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 10 nukleotidů (B) TYP: nukleová kyselina (C ) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 9

UUUUUUUUUU 10 (2) Údaje k SEQ ID NO: 10 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

φφ φφφφ φ · • φ

I Φ Φ ·

I φ φ φ φφφ φφφ (A) DÉLKA: 11 nukleotidů (Β) TYP: nukleová kyselina (C ) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 10

CUUCUUCCUU A

fl · • · • ♦ » » • ····

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (22)

1. Způsob syntézy oligonukleotid N3'-»P5' fosforamidatu vyznačující se t í m, že zahrnuje kroky:

(a) poskytnutí prvního nukleosidu vázaného na pevnou fázi nosiče, přičemž první nukleosid má chráněnou 3'-aminoskupinu;

(b) odebrání chránící skupiny z chráněné 3'-aminoskupiny za vzniku volné 3'-aminoskupiny;

(c ) reakci volné 3'-aminoskupiny s 3'-chráněným monomerem aminonukleosid-5 -fosforamiditem za vzniku internukleosid N3'-»P5' fosforamiditové vazby; a (d) oxidaci uvedené vazby.

2. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že dále zahrnuje krok vícenásobného opakování uvedených kroků reakce a oxidace.

3. Způsob podle nároku 2 vyznačující se tím, že uvedená vícenásobnost je mezi 2 a 4, včetně.

4. Způsob podle nároku 3 vyznačující se tím, že dále zahrnuje krok opakování kroků (b) až (d), až je uvedený oligonukleotid

N3'—»P5 fosforamidat syntetizován.

5. Způsob podle nároku 4 vyznačující se tím, že uvedený monomer 3'-chráněný aminonukleosid-5'-fosforamidit má tetrazolovou aktivační rovnovážnou konstantu alespoň 10 M'¹.

6. Způsob podle nároku 5 vyznačující se tím, že dále zahrnuje krok překrytí uvedených volných 3'aminoskupin, aby se zabránilo reakci s uvedeným monomerem 3'-chráněným aminonukleosid-5'-fosforamiditem.

·· ·· • · * · • · · fe • · · · · · • · · · · · fe fe ·· ··

7. Způsob podle nároku 6 v yz n a č u j í c í s e t í ra, že uvedený monomer 3'-chráněný aminonukleosid-5'-fosforamidit má tetrazolovou aktivační rovnovážnou konstantu alespoň 100 M'¹.

8. Způsob podle nároku 7 vyznačujícísetím, že uvedený monomer 3'-chráněný aminonukleosid-5'-fosforamidit má aminoskupinu fosforamiditu s pK_a alespoň 10.

9. Způsob podle nároku 8 v yz n a č u j i c i s e t í m, že monomer 3 'chráněný aminonukleosid-5'-fosforamidit je definovaný vzorcem:

B kde

B je pyrimidin, purin, nebo jejich analog;

R¹ je fosfátová chránící skupina;

W je buď -NHR² nebo -OR⁷, kde R² je amino-chránící skupina a kde R⁷ je hydroxyl chránící skupina;

R³ je vodík, hydroxyl, fluor nebo -OR', kde R' je alkyl s 1 až 3 atomy uhlíku nebo hydroxyl chránící skupina; a

R⁴ a R⁵ dohromady s dusíkem, na který jsou navázány, tvoří alkylaminovou nebo arylaminovou odstupující skupinu, která má do 40 atomů vybraných ze skupiny sestávající z uhlíku, kyslíku, síry a dusíku.

10. Způsob podle nároku 9 vyznačující se t i m, že R³ je vodík, a že

R⁴ a R⁵ samostatně jsou alkyl, aralkyl, cykloalkyl nebo cykloalkylalkyl mající celkově sloučených od 6 do 20 atomů uhlíku.

• ·

11. Způsob podle nároku lOvyznačující setím, že uvedený krok reakce zahrnuje dále zpracování uvedeného monomeru 3'-chráněného aminonukleosid-5'-fosforamiditu s nukleofilním katalyzátorem za vzniku reaktivního meziproduktu.

12. Způsob podle nároku 11 vyznačující setím, že uvedeným nukleofilním katalyzátorem je tetrazolový aktivátor.

13. Způsob podle nároku 12 vyznačující se tím, že uvedený krok oxidace dále zahrnuje zpracování uvedené vazby oxidačním činidlem vybraným ze skupiny sestávající z peroxidu vodíku a jodu.

14. Způsob podle nároku 9 vyznačující se t i m, že R³ je vodík, a že R⁴ a R⁵ dohromady tvoří alkylenový řetězec obsahující do 12 atomů uhlíku v základním řetězci a celkově od 4 do 20 atomů uhlíku, kdy jsou obě terminální valenční vazby uvedeného řetězce navázány na atom dusíku, na nějž se váže R⁴ a R⁵.

15. Způsob podle nároku 14 vyznačující se tím, že uvedený krok reakce dále zahrnuje zpracování uvedeného monomeru 3'-chráněného aminonukleosid-5'-fosforamiditu s nukleofilním katalyzátorem za vzniku reaktivního meziproduktu.

16. Způsob podle nároku 15 vyznačující setím, že uvedeným nukleofilním katalyzátorem je tetrazolový aktivátor.

17. Způsob podle nároku 16 vyznačující se tím, že uvedený krok oxidace dále zahrnuje zpracování uvedené vazby oxidačním činidlem vybraným ze skupiny sestávající z peroxidu vodíku a jodu.

18. Způsob podle nároku 9 vyznačující se tím, že R³ je vodík, a že R⁴ a R⁵ dohromady a s dusíkem, na který jsou vázány, tvoří nasycený dusíkový •4 4444

4 4 heterocyklus, který má do 10 atomů uhlíku nebo heteroatomů v základním řetězci a celkově oď 4 do 20 atomů uhlíku nebo heteroatomů společně, tak, že

R⁴ a R⁵ dohromady a s dusíkem, na který jsou vázány, obsahují do tří heteroatomů vybraných ze skupiny sestávající z dusíku, kyslíku a síry.

19. Způsob podle nároku 18 vyznačující se tím, že uvedený krok reakce dále zahrnuje zpracování uvedeného monomeru 3'-chráněného aminonukleosid-5'-fosforamiditů s nukleofílním katalyzátorem za vzniku reaktivního meziproduktu.

20. Způsob podle nároku 19 vyznačující se tím, že uvedeným nukleofílním katalyzátorem je tetrazolový aktivátor.

21. Způsob podle nároku 20 vyznačující se tím, že uvedený krok oxidace dále zahrnuje zpracování uvedené vazby oxidačním činidlem vybraným ze skupiny sestávající z peroxidu vodíku a jodu.

22. Způsob podle nároku 4 v yz načující se tím, že uvedený monomer 3'-chráněný aminonukleosid-5'-fosforamidit má aminoskupinu fosforamiditů s