PL183661B1 - Sposób syntezy oligonukleotydów N3'P5'fosforoamidanowych - Google Patents

Abstract

1. Sposób syntezy oligonukleotydów N3'— P5' fosforoamidanowych, znamienny tym, ze sklada sie z nastepujacych etapów: (a) dostarczenie pierwszego nukleozydu zwiazanego z nosnikiem w fazie stalej, z zabezpie- czona grupa 3'aminowa; (b) usuniecie grupy zabezpieczajacej z zabez- pieczonej grupy 3' aminowej, z utworzeniem wolnej grupy 3' aminowej; (c) przereagowanie wolnej grupy 3' aminowej z monomerem aminonukleozydu-5'-fosforoamidynowe- go zabezpieczonego w pozycji 3', w celu wytworzenia miedzynukleozydowego wiazania N3''— P5' fosfo- roamidynowego; (d ) u tlenianie te go wiaornnia PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest ogólnie chemia polimerów kwasów nukleinowych, a szczegółowiej sposób syntezy fligonukleftydów N3' —> P5' fosforfamidaaowych.

Chemia polimerów kwasów nukleinowych odgrywa istotną rolę w wielu rozwijających się technologiach w dziedzinie farmaceutyki, diagnostyki i analizy, a zwłaszcza w terapeutyce skierowanej przeciw nadwrażliwości i w terapeutyce prreciwgeaowej, przy wzmocnieniu sygnału rozgałęzionego DNA, diagnostyce i analizie opartej na sekwencji DNA, patrz np. Uhlmann i Peyman, Chemical Reviews, 90: 543-584 (1990); Milligan i inni J. Med. Chem. 36: 1923-1937 (1993); Mesmaeker i inni, Current Opinion in Structural Biology, 5: 343-355 (1995); Thuong i inni, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 32: 666-690 (1993); Brenner i inn. Proc. Natl. Acad. Sci., 89: 5381-5383 (1992); Gold i inni, Ann. Rev. Biochem., 64: 763-797 (1995); Gallop i inni, J. Med. Chem. 37: 1233-1258 (1994); Gordon i inni, J. Med. Chem. 37: 13851401 (1994); Graraov, międzynarodowe zgłoszenie patentowe PCT/US94/07557; Urdea i inni, patent Stanów Zjednoczonych 5 124 246; Southern i inni, Genomics, 13: 1008-1017 (1992); McGall i inni, patent Stanów Zjednoczonych 5 412 087; Fodor i inni patent Stanów Zjednoczonych 5 424 186; Pirrung i inni, patent Stanów Zjednoczonych 5 405 783 i tym podobne.

Duża część tych badań chemicznych ukierunkowana była na polepszenie trwałości wiązania, specyficzności i odporności na nukleazę naturalnych polimerów kwasów nukleinowych, takich jak DNA. Niestety, polepszenie jednej właściwości, takiej jak odporność na nukleazę, często związane jest z pogorszeniem innych właściwości, takich jak trwałość wiązania. Przykłady takich sytuacji są liczne: Peptydowe kwasy nukleinowe (PNAs) charakteryzują się dobrą odpornością na nukleazę i trwałością wiązania, ale mają zmniejszoną wchłanialność komórkową w testowych hodowlach, np. Hanvey i inni Science, 258: 1481-1485 (1992); fosforotioniany wykazują dobrą odporność na nukleazę i dobrą rozpuszczalność, ale zazwyczaj syntezowane sąjako mieszaniny P-chiralne i wykazują szereg biologicznych działań niespecyficznych względem sekwencji, np. Stein i inni, Science, 261: 1004-1012 (1993); metylofosfoniany charakteryzują się dobrą odpornością na nukleazę i dobrą wchłanialnością komórkową,

183 661 ale również zazwyczaj syntezowane są jako mieszaniny P-chiralne i mają zmniejszoną stabilność dupleksową, np. Mesmaeker i inni (cytowany powyżej); itd.

Ostatnio opracowano nową klasę analogów oligonukleotydowych mających tak zwane międzynukleozydowe wiązanie N3' — P5' fosforoamidanowe, wykazujące bardzo korzystne właściwości wiążące, odporność na nukleazę i rozpuszczalność, Gryaznov i Letsinger, Nucleic Acids Research, 20: 3403-3409 (1992); Chen i inni, Nucleic Acids Research, 23: 26612668 (1995); Gryaznov i inni, Proc. Natl. Acad. Sci., 92: 5798-5802 (1995) i Gryaznov i inni, J. Am. Chem. Soc. 116: 3143-3144 (1994). Niestety, niska wydajność wytwarzania tych związków, syntezowanych zgodnie z opublikowanymi sposobami wytwarzania, zahamowała ich zastosowania handlowe.

Użyteczność tej nowej klasy oligonukleotydowych analogów znacząco by wzrosła, jeśli mogłyby być znalezione modyfikacje i nowe sposoby syntezy, poprawiające wydajność, bez utraty innych, wymienionych wyżej korzystnych właściwości.

W świetle powyższego, ważnym celem wynalazku jest opracowanie nowego sposobu syntezy oligonukleotydów N3' — P5' fosforoamidanowych w fazie stałej, w której etapowe wydajności są znacznie zwiększone.

Innym celem wynalazku jest dostarczenie nowych amino-5'-fosforoamidynowych monomerów zabezpieczonych w pozycji 3', dla zastosowania w sposobie według wynalazku.

Dalszym celem wynalazku jest dostarczenie praktycznego sposobu syntezy na dużą skalę oligonukleotydów N3' -» P5' fosforoamidanowych, zwłaszcza 2'-deoksyoligonukleotydu N3' —> P5' fosforoamidanowego.

Te i inne cele wynalazku osiągnięto przez opracowanie sposobu syntezowania oligonukleotydów N3' —> P5' fosforoamidanowych, stosując reakcję wymiany grup aminowych, w której odbezpieczona grupa 3'-aminowa łańcucha oligonukleotydu osadzonego na fazie stałej wymieniana jest na aminową część 5'-fosforoamidynowego monomeru, z zabezpieczoną grupą 3'-aminową. Wytworzone międzynukleozydowe wiązanie fosforoamidynowe jest następnie utleniane, w celu utworzenia stabilnego zabezpieczonego wiązania fosforoamidanowego. Ogólny schemat reakcji przedstawiony jest poniżej.

Ogólnie, sposób według wynalazku obejmuje następujące etapy: (a) dostarczenie pierwszego nukleozydu związanego z nośnikiem w fazie stałej, z zabezpieczoną grupą 3' aminową; (b) usunięcie grupy zabezpieczającej z zabezpieczonej grupy 3' aminowej, z utworzeniem wolnej grupy 3' aminowej; (c) przereagowanie wolnej grupy 3' aminowej z monomerem aminonukleozydu-5'-fosforoamidynowego zabezpieczonego w pozycji 3', w celu wytworzenia międzynukleozydowego wiązania N3' -> P5' fosforoamidynowego; (d) utlenianie tego wiązania; oraz (e) powtarzanie etapów (b) do (d) aż do zsyntezowania pożądanego oligonukleotydu N3' —» P5' fosforoamidanowego. Korzystnie, część azotowa ugrupowania 5'fosforoamidyny monomeru aminonukleozydu-5'-fosforoamidynowego z grupą zabezpieczającą w pozycji 3' jest sterycznie zahamowaną aminą o pKa przynajmniej 10.

Poza tym, wynalazek obejmuje szczególnie przydatne w sposobie według wynalazku monomery aminonukleozydu-5'-fosforoamidynowego z grupą zabezpieczającą w pozycji 3' o następującym wzorze:

183 661

R⁵

WR¹ w którym: B oznacza pirymidynę, purynę lub ich analogi; R1 oznacza fosforanową grupę zabezpieczającą; W oznacza -NHR' lub OR7, gdzie r2 jest grupą zabezpieczającą grupę aminowa, a R' jest grupą zabezpieczającą hydroksyl; r3 oznacza atom wodoru, hydroksyl, atom fluoru lub grupę -OR', gdzie R' jest alkilem o 1do 3 atomach węgla lub grupą .zabezpieczającą 2''hyazoksyl, taką jak alkilosilil, np. t-butylodimetylosilil itp.; oraz R' i R' razem z atomem azotu, do którego są przyłączone, oznaczają alkiloaminową lub aryloaminową grupę opuszczającą o do 40 atomach węgla i/lub heteroatomach, wybranych z grupy obejmującej tlen, siarkę i azot.

Monomery, w których W oznacza OR7 są szczególnie użyteczne przy syntezie chimerycznych oligonukleotydów zawierających zarówno wiązania n3' — P5' fosforoamidanowe, jak i inne wiązania, takie jak fosfonodiestrowe, fosforotionowe itp.

Wynalazek pokonuje istotne wady znanych sposobów syntezowania oligonukleotydów N3' —> P5' fosforoamidanowych mających albo całkowicie, albo częściowo zamidowane wiązania i otwiera drogę do produkcji takich związków na skalę handlową. W szczególności, wynalazek umożliwia uzyskanie bardzo zwiększonych wydajności sprzęgnia, przy stosowaniu dużo niższych molowych stężeń reagentów monomerowych, co z kolei zezwala na komercyjnie akceptowalną syntezę oligonukleotydów N3' — P5' fosforoamidanowych. Wynalazek zezwoli na rozpowszechnione zastosowanie tych związków w różnorodnych dziedzinach, włączając w to badania naukowe i przemysłowe, teraputykę i diagnostykę.

Opisowi wyalazku towarzyszą rysunki, na których:

figura 1 przedstawia widmo 31P-NMR mieszaniny N6-beazoilO'3'-trifenylometyloamiao2' -deoksyadenozyno^' '(cyjanoetylo-N,N-dίizopropylo)'fosfozoamidyay i tetrazolu, figura 2 przedstawia widmo 3¹P-NMR mieszaniny 3'-tzifeaylometyloamiaotymidynO'5'(2-cyjαaoetylO'(2,2,6,6-tetrametylopipezydynylo)-fosfbroamidyay i tetrazolu, figura 3a i 3b przedstawia chromatogramy na wymieniaczach jonowych dwóch nieoczyszczonych oligonukleotydów N3' —» P5' fosforoamidanowych, zsyntezowanych reakcją wymiany grupy aminowej według wynalazku, figura 4 przedstawia chromatogram HPLC na wymieniaczu jonowym nieoczyszczonej mieszaniny reakcyjnej z syntezy oligo^-fluoronukleozydu N3' P5' fosforoamidanowego z przykładu 19.

Kiedykolwiek oligonukleotyd reprezentowany jest sekwencją liter, takich jak „ATGUCCTG” należy rozumieć, że nukleotydy są uszeregowane w porządku 5' 3' z lewej do prawej i że - jeśli nie jest to inaczej zaznaczone - „A” oznacza deoksyaaeaozyaę, „C” oznacza deokscytydynę, „G” oznacza deoksyguanozynę, „T” oznacza tymidynę, i „U” oznacza aeoksyuzydyaę.

Określenie ,,N3' — P5' fosforoamidan” oznacza międzynukleotydowe wązanie w postaci: 3^11=(=0))05^0= gdzie 3' i 5' odnoszą się do atomów węgla w cząsteczce cukru kolejnych nukleotydów połączonych wiązaniem, R1 oznacza wodór lub fosforanową grupę zabezpieczającą, a X oznacza atom tlenowca, korzystnie tlenu lub siarki.

Szczegółowiej, jeśli R ^r oznacza fosforanową grupę zabezpieczającą, może to być alkil, aikenyl, aryl, aryloalkil lub cykloalkil zawierający do 10 atomów węgla. Korzystnie, jeśli R ' oznacza fosforanową grupę zabezpieczającą, to jest to alkil o 1do 6 atomach węgla; ściągający elektrony etyl podstawiony w pozycji p; p-cyjano-, β-sulfo- lub P-nitroetyl; ściągający elektrony podstawiony fenyl, zwłaszcza chlorowco-, cyjano- lub nitrofenyl; albo ściągający elektrony podstawiony fenyloetyl. Korzystniej, jeśli R1 oznacza fosforanową grupę zabezpieczają10

183 661 cą, to jest to metyl, β-cyjanoetyl lub 4-nitrofenyloetyl. Najkorzystniej R¹ oznacza atom wodoru, metyl lub β-cyjanoetyl. Ściągającymi elektrony podstawnikami są zwykle atomy chlorowców, grupa cyjanowa, nitrowa, sulfonowa lub mono-, di- lub trichlorowcometylen, i tym podobne. Atomami chlorowców są zazwyczaj fluor, chlor, brom lub jod, korzystnie fluor lub chlor. Określenie „ściągający elektrony” oznacza tendencję podstawnika do przyciągania elektronów walencyjnych cząsteczki, z którą jest związany, co oznacza, że podstawnik ma charakter elektroujemny, np. March, Advanced Organie Chemistry, str. 16-18 (John Wiley, New York, 1985). Przewodnikiem dostarczającym wskazówek dotyczących wyboru fosforanowych grup zabezpieczających jest artykuł Beaucage i Iyera, Tetrahedron 48: 2223-2311 (1992). Dla wygody, nukleotydowe fosforoamidany są czasami oznaczane indeksem dolnym „np.” lub „pn” odpowiednio dla N3’ — P5' fosforoamidanów i P3' — N5' fosforoamidanów. W ten sposób, „U ’_npU” jest dinukleotydem, w którym 3'-aminourydyna i urydyna połączone są wiązaniem N3' -> P5' fosforoamidanowym. Podobnie, podstawniki 2'-fluoro oznaczone są indeksem górnym ,,f’. I tak, „UfpU” oznacza dinukleotyd, w którym 3'-amino2'fluorourydyna jest związana z urydyną wiązaniem N3' — P5' fosforoamidanowym. Pojedynczy indeks dolny „p” oznacza 5' monofosforan, a pojedynczy indeks dolny „n” oznacza grupę 3'-aminową

Tak jak używane jest to w tym opisie, określenie „wiązanie N3' — P5' fosforoamidynowe” odnosi się do wiązania fosforu (III), będącego pośrednią formą wiązania N3' P5' fosforoamidanowego. Według wynalazku wiązanie N3' — P5' fosforoamidanowe wytwarza się przez utlenianie wiązania N3' — P5' fosforoamidynowego.

Określenie „nukleozydy” obejmuje naturalne nukleozydy, włącznie z formami 2'-deoksy i 2'-hydroksylowymi, np. tak jak opisali to Komberg i Baker w DNA Replication, wydanie drugie (Freeman, San Francisco, 1992). Określenie „analogi” w odniesieniu do nukleozydów obejmuje syntetyczne nukleozydy o zmodyfikowanej części zasadowej cząsteczki i/lub zmodyfikowanej części cukrowej, np. opisane ogólnie przez Scheita w Nucleotide Analogs (John Wiley, New York, 1980). Takie analogi obejmują syntetyczne nukleozydy przeznaczone do zwiększenia właściwości wiążących, np. stabilności, specyficzności i tym podobne, tak jak ujawnili to Uhlmann i Peyman (zacytowani powyżej).

Określenie „pirymidyna” oznacza pirymidyny występujące w naturalnych nukleozydach, włączając w to cytozynę, tyminę, uracyl i ich pospolite analogi, takie jak analogi zawierające grupę oksylową, metylową, propynylową, metoksylową, hydroksylową, aminową, atom chlorowca, grupę tio i tym podobne podstawniki. Określenie obejmuje poza tym pirymidyny z przyłączonymi pospolitymi grupami zabezpieczającymi, takimi jak N⁴-bezoilocytozyna. Inne pospolite grupy zabezpieczające ujawnił Beaucage i Iyer (zacytowany powyżej).

Określenie „puryna” oznacza puryny występujące w naturalnych nukleozydach, włączając w to adeninę, guaninę, hipoksantynę i ich pospolite analogi, takie jak puryny zawierające grupę oksylową, metylową, propynylową metoksylowią hydroksylową, aminową, atom chlorowca, grupę tio i tym podobne podstawniki. Określenie obejmuje poza tym puryny z przyłączonymi pospolitymi grupami zabezpieczającymi, takimi jak N -benzoiloguanina, Nizobutyryloguanina, N⁶-benzoiloadenina i tym podobne. Inne pospolite grupy zabezpieczające purynę ujawnił Beaucage i Iyer (zacytowany powyżej).

Określenie „oligonukleotyd N3' — P5' fosforoamidanowy” oznacza oligomer, zwykle liniowy, nukleozydowych członów połączonych przynajmniej jednym wiązaniem N3' -» P 5' fosforoamidanowym. Nukleozydowe człony zwykle składają się z nukleozydów lub analogów nukleozydów, ale mogą składać się z innych cząsteczek o kompatybilnych właściwościach chemicznych, takich jak cukry i inne cząsteczki węglowodorowe, opisane w następujących odnośnikach: Newton i inni, Nucleic Acids Research, 21: 1155-1162 (1993); Griffin i inni J. Am. Chem. Soc., 114: 7976-7982 (1992); Jaschke i inni, Tetrahedron Letters, 34: 301-304 (1992); Ma i inni, międzynarodowe zgłoszenie patentowe PCT/CA92/00423; Zon i inni, międzynarodowe zgłoszenie patentowe PCT/US90/06630; Durand i inni, Nucleic Acids Research, 18: 6353-6359 (1990); Salunkhe i inni, J. Am. Chem. Soc., 114: 8768-8772 (1992) i tym podobne. Korzystniej, określenie oznacza oligonukleotyd, w którym wszystkie międzynukleozydowe wiązania są zastąpione wiązaniami N3' — P5' fosforoamidanowymi i w którym nukle183 661 ozydowymi członami są naturalne nukleozydy lub ich analogi. Oligonukleotyd N3' — P5' fosforoamidanowy według wynalazku, w którym każde wiązanie jest wiązaniem N3' — P5' fosforoamidanowym („całkowicie amidanowany”) może być osadzony w lub przyłączony do innych oligonukleotydów lub polinukleotydów, z utworzeniem większego oligomeru „częściowo amidanowanego”. Na przykład, całkowicie amidanowany oligonukleotyd N3' —» P5' fosforoamidanowy A_npA_npGnpC_npC_n jest osadzony w większym oligonukleotydzie GGCCAAAAnpAnpGnpCnpCnpACTAT (SEQ ID NO: 1) lub jest przyłączony do „TTTATC” jako większy oligonukleotyd: AnpA_IipGn_PCnpTrrATC (SEQ ID NO: 2). Takie chimeryczne oligonukleotydy, które mogą być stosowane jako pimery PCR, objęte są zakresem wynalazku.

Określenia „utleniać”, „utlenianie” i tym podobne terminy w odniesieniu do międzynukleozydowego wiązania zawierającego fosfor oznaczają proces przekształcenia atomu fosforu, będącego częścią wiązania, z fosforu (III) w fosfor (V).

Określenie „fosforoamidynowa grupa aminowa” odnosi się do grupy aminowej -NR⁴r5 przyłączonej do atomu fosforu grupy fosforoamidynowej, a określenie „azot fosforoamidynowy” do atomu azotu aminowej grupy fosforoamidynowej.

Określenia „przeszkoda sferyczna”, „sterycznie hamowany” i tym podobne odnoszą się do wpływu dużych grup przestrzennych na reaktywność chemiczną, np. Morrison i Boyd, Organie Chemistry, strona 603 (Allyn i Bacon, Boston, 1978).

Wynalazek jest ukierunkowany na sposób syntezy oligonukleotydów N3' —» P5' fosforoamidanowych w fazie stałej, w którym sprzęganie monomerów fosforoamidynowych z wolną grupą aminową rozbudowywanego łańcucha następuje przez wymianę fosforoamidynowej grupy aminowej monomeru z wolną grupą 3'-aminową rozbudowywanego łańcucha. Korzystnie, oligonukleotydy N3' —> P5' fosforoamidanowe wytwarzane sposobem według wynalazku opisane są wzorem:

R* R³ w którym: B oznacza purynę lub pirymidynę lub ich analogi; X oznacza atom z grupy tlenowców, korzystnie atom tlenu lub siarki, najkorzystniej atom tlenu; R³ oznacza atom wodoru, fluoru lub grupę hydroksylową, korzystnie atom wodoru; r6 oznacza grupę aminową, lub hydroksylową, a Z oznacza atom wodoru lub kationowy przeciwjon, taki jak metal alkaliczny, aminowy kation, jak jon amonowy, trietyloamonowy i tym podobne. Korzystnie, liczba n mieści się w zakresie od 1 do kilkuset, korzystniej w zakresie od 1 do 50, najkorzystniej w zakresie od 1do 30.

Korzystnie, oligo-2'-fluoronukleotydy N3' -» P5' fosforoamidanowe według wynalazku mają długość pomiędzy 2 i 30 nukleotydów. Korzystniej zawierają one pomiędzy 8 i 25 nukleotydów, 'najkorzystniej między 8 i 20 nukleotydów.

Jak wspomniano wyżej, ogólne etapy sposobu wytwarzania obejmują (a) dostarczenie pierwszego nukleozydu związanego z nośnikiem w fazie stałej, z zabezpieczoną grupą 3' aminową; (b) usunięcie grupy zabezpieczającej z zabezpieczonej grupy 3' aminowej, z utworzeniem wolnej grupy 3' aminowej; (c) przereagowanie wolnej grupy 3' aminowej z monomerem aminonukleozydu-5'-fosforoamidynowego zabezpieczonego w pozycji 3', w celu wytworzenia międzynukleozydowego wiązania N3' —> P5' fosforoamidynowego; (d) utlenianie tego wiązania; oraz (e) powtarzanie etapów (b) do (d) aż do zsyntezowania pożądanego oligonukleotydu N3' — P5' fosforoamidanowego.

183 661

Chociaż reakcja wymiany grup aminowych według wynalazku zależy od odwracalnej równowagi pomiędzy reagentami i produktami (pokazanej niżej w równaniach 1a i 1 b) - w przeciwieństwie do większości sposobów syntezowania oligonukleotydów w fazie stałej, obejmujących nieodwracalne etapy sprzęgania - w literaturze można znaleźć wiele informacji dotyczących doboru warunków sprzęgania, grup zabezpieczających, nośników w postaci fazy stałej, grup wiążących, reagentów usuwających grupy zabezpieczające, reagentów odszczepiających produkty od stałego nośnika, oczyszczania produktu i tym podobne, np. Gait (redaktor), Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1984); Amanath i Broom, Chemical Reviews, Vol. 77, strony 183-217 (1917); Pon i inni, Biotechniques, Vol. 6, strony 768-775 (1988); Ohtsuka i inni, Nucleic Acids Research, Vol. 10, strony 65536570 (1982); Eckstein (redaktor) (zacytowany powyżej; Greene i Wuts (zacytowany powyżej); Narang (redaktor), Synthesis and Applications of DNA and RNA (Academic Press, New York, 1987), Beaucage i Iyer (zacytowany powyżej) i tym podobne odnośniki.

HN R¹ R’ n-n· °V

HN R³ R’ *

R^ł o··

R*

Duża rozmaitość stałych nośników może być wykorzystywana w sposobie według wynalazku, włączając w to mikrocząstki zrobione ze szkła o kontrolowanej wielkości porów (CPG), wysokousieciowany polistyren, kopolimery akrylowe, celulozę, nylon, dekstran, lateks, poliakreloinę i tym podobne materiały, ujawnione w następujących przykładowych odnośnikach: Meth. Enzymol. Section A, strony 11-147, vol. 44 RNA (Academic Press, New York, 1976); patenty Stanów Zjednoczonych 4 678 814; 4 413 070 i 4 046 720 oraz Pon, rozdział 19 w Agrawal (redaktor) Methods in Molecular Biology, Vol. 20, (Humana Press, Totowa, NJ, 1993). Nośnikami mogą być poza tym perełki polistyrenowe; polistyren szczepiony glikolem polietylenowym (np. TentaGel™, Rapp Polymere, Tubingen, Niemcy) i tym podobne. Dobór charakterystyki nośnika, pod względem rodzaju mteriału, porowatości, wielkości, kształtu i tym podobne, oraz typu wiążącej cząsteczki zależy od rozmaitych czynników, takich jak rodzaj użytych grup zabezpieczających, długości produktu finalnego, ilości produktu finalanego itp. Przykładowe cząsteczki wiążące ujawniono w: Pon i inni, Biotechniques, 6: 768-775 (1988); Webb, patent Stanów Zjednoczonych 4 659 774; Barany i inni, międzynarodowe zgłoszenie patentowe PCT/US91/06103; Brown i inni, J. Chem. Soc. Commun., 1989: 891-893; Damha i inni, Nucleic Acid Research, 18: 3813-3821 (1990); Beattie i inni, Clinical Chemistry, 39: 719-722 (1993); Maskos i Southern, Nucleic Acid Research, 20: 1679-1684 (1992) i tym podobne odnośniki.

Korzystnymi stałymi nośnikami są CPG i polistyren szczepiony glikolem poletylenowym, z aminowymi grupami końcowymi (np. TentaGel™, Rapp Połymere, Tubingen, Niemcy). Grupa aminopropylowa jest korzystnym przerywnikiem (spacer) pomiędzy CPG i wiązaniem nukleozydowym. Korzystnym połączeniem z 5'-hydroksylem pierwszego nukleozydu jest grupa sukcynilowa, tworząca zasadowo labilne wiązanie estrowe, które po syntezie jest zazwyczaj rozszczepiane roztworem amoniaku.

183 661

Monomerami według wynalazku są 2'-fluoro aminonukleozydy-5'-fosforoamidynowe zabezpieczone w pozycji 3', 2'-deoksy aminonukleozydy-5'-fosforoamidynowe zabezpieczone w pozycji 3', aminorybonukleozydy-5'-fosforoamidynowe zabezpieczone w pozycji 2' i 3' oraz ich odpowiedniki 3'-hydroksylowe zabezpieczone w pozycji 3'. Korzystnie, monomery według wynalazku określone są wzorem:

B gdzie B, W, R i, R³, R⁴ i R⁵ zdefiniowano powyżej.

Korzystniej, -NR⁴R⁵jest sterycznie hamowaną grupą aminową, składającą się z następujących korzystnych możliwości: Pierwsza: r4 i niezależnie od siebie oznaczają alkil, aryloalkil, cykloalkil lub cykloalkiloalkil, gdzie r4 i r5 mają łącznie od 6 do 20 atomów węgla. Jeszcze korzystniej R⁴ i r5 niezależnie od siebie oznaczają alkil o 1do 8 atomach węgla. Również korzystnie Ri i r5 niezależnie od siebie oznaczają izopropyl, sec-butyl, izobutyl, tbutyl, cykloheksyl lub 2-etyloheksyl. Najkorzystniej r4 oznacza izopropyl, a r5 t-butyl.

Druga: R4 i R⁵ razem mogą tworzyć łańcuch alkilenowy zawierający do 12 atomów węgla w łańcuchu głównym i sumarycznie od 4 do 20 atomów węgla, przy czym oba końcowe wiązania walencyjne łańcucha związane są z atomem azotu, do którego przyłączone są grupy r4 i r5. Również korzystnie, R4 i r5 razem tworzą łańcuch alkilenowy zawierający do 6 atomów węgla w łańcuchu głównym i sumarycznie od 4 do 12 atomów węgla, przy czym oba końcowe wiązania walencyjne łańcucha związane są z atomem azotu, do którego przyłączone są grupy R4 i r5.

Trzecia: r4 i Ri razem i z atomem azotu do którego są przyłączone tworzą nasycony związek heterocykliczny azotu, mający do 10 atomów węgla lub heteroatomów w łańcuchu głównym i sumarycznie od 4 do 20 atomów węgla lub heteroatomów, tak że r4 i r5 razem i z atomem azotu do którego są przyłączone zawierają do trzech heteroatomów wybranych z grupy obejmującej azot, tlen i siarkę. Również korzystnie, R4 i r5 razem i z atomem azotu do którego są przyłączone tworzą nasycony związek heterocykliczny azotu, mający do 10 atomów węgla i do trzech dodatkowych heteroatomów wybranych z grupy obejmującej azot, tlen i siarkę. Również korzystnie. R⁴ i r5 razem i z atomem azotu do którego są przyłączone stanowią grupę pirolidynową, morfolinową, tetrametyloguanidynylową lub piperydynową. Korzystniej, R⁴ i R5 razem i z atomem azotu do którego są przyłączone stanowią grupę dimetylopiperydynylową, pirolidynylową, dimetylomorfolinową, tetrametylomorfolinową, dimetylopirolidynylową, tetrametylopirolidynylową lub tetrametylopiperydynylową. Również korzystniej, R i R5 razem i z atomem azotu do którego są przyłączone stanowią grupę 2,2,6,6tetrametylopiperydynylową, 2,6-dimetylopiperydynylową lub 2,5-dimetylopirolidynylową. Najkorzystniej, R4 i r5 razem i z atomem azotu do którego są przyłączone stanowią grupę 2,2,6,6-tetr-am^e^ty^lopipery^dynylową.

Korzystnie monomerami stosowanymi w sposobie według wynalazku są 2'-deoksy aminonukleozydy-5'-fosforoamidynowe zabezpieczone w pozycji 3'. Korzystne jest również aby aminowa grupa fosforoamidynowa miała pKa przynajmniej 10,0. Korzystniej, aminowa grupa fosforoamidynowa jest dobrana w ten sposób, stała równowagi aktywacji tetrazoli Kj zdefiniowana poniżej i zmierzona w przykładzie 9, miała wartość większą niż 10 M'1 Również korzystniej, stała równowagi jest większa niż 100 M¹, najkorzystniej większa niż 1000 M*¹.

Stała równowagi aktywacji tetrazoli zdefiniowano w sposób następujący:

_ [TetrazolidyloamidynjfRjNHjtetrazolid^-] [Tetrazol] [monomer amidynowy] gdzie [Tetrazolidyloamidyn] jest równowagowym stężeniem tetrazolidyloamidyny, [Tetrazol] jest równowagowym stężeniem tetrazolu, [monomer amidynowy] jest równowa14

183 661 gowym stężeniem monomeru amidynowego i [R2NH2’ tetrazolid ] jest równowagowym stężeniem soli tetrazolidowej aminowej grupy opuszczającej monomer fosforoamidynowy.

Korzystnie, grupą R² zabezpieczającą grupę 3'-am^o'wą monomeru jest grupa kwasowo labilna, taka jak trifenylometyl, p-metoksybenzyloditenylometyl (MMT), di-p- metoksybenzylofenylometyl (DMT) lub kwasowo labilny uretan. Najkorzystniej, grupą zabezpieczającą grupę 3'-aminową jest trifenylometyl. Grupy zabezpieczające usuwane są działaniem roztworów kwaśnych, najkorzystniej 3% roztworem kwasu ^chlorooctowego w chlorku metylenu. Podobnie, grupą R⁷ zabezpieczającą grupę 3'-hydroksylową monomeru jest kwasowo labilna grupa, taka jak trifenylometyl, mMt, dMT lub uretan. Najkorzystniej, grupą zabezpieczającą grupę 3'-hyd^<^^s;^^l^’wćą jest DMT.

Określenie „wolna grupa aminowa” w odniesieniu do monomerów według wynalazku oznacza grupę aminową dostępną dla reakcji z grupą fosforoamidynową przyłączanego monomeru. Korzystnie, wolne grupy aminowe są aminami pierwszorzędowymi. Po etapie usuwania grupy trifenylometylowej, grupa aminowa jest w postaci soli z zasadą, sprzężoną z kwasem użytym do reakcji usuwania. Po etapie usuwania grupy trifenylometylowej, sól ta może być ewentualnie neutralizowana zasadowym roztworem, takim jak 2% trietyloamina lub pirydyna w acetonitrylu.

Etap sprzęgający wynalazku może być przeprowadzany w zakresie temperatury -20 do 200°C. Korzystnie rekcję przeprowadza się w temperaturze otoczenia (około 15-30°C). Reakcję przeprowadza się dodając roztwór monomeru fosforoamidynowego i roztwór aktywatora (lub roztwór monomeru fosforoamidynowego i aktywatora) do naczynia zawierającego stały nośnik z kowalencyjnie przyłączonymi wolnymi grupami aminowymi (oligo)nukleotydu. Ogólnie, aktywatorami według wynalazku ^nukleofilowe katalizatory zastępujące bardziej trwałe aminowe grupy fosforoamidyaowe wysoce reaktywnymi (i dużo mniej trwałymi) produktami pośrednimi, które z kolei reagują z wolną grupą 3'-aminową oligonukleotydu N3' —> P5' fosforoamidanowego osadzonego na nośniku. Mieszanina jest następnie mieszana, takimi metodami jak mechaniczne wprawianie mieszaniny w ruch wirowy lub przepuszczanie gazu obojętnego. Alternatywnie, róztwór(ory) monomeru i aktywatora zmusza się do przepływu przez naczynie reakcyjne (lub kolumnę), zawierające osadzony na stałym nośniku (oligo^ukleotyd z wolnymi grupami 3'-aminowymi. Monomer i aktywator mogą być albo wcześniej ze sobą wymieszane, albo mieszane w bloku zaworowym odpowiedniego urządzenia do syntezy, mieszane w naczyniu przedaktywacyjnym i jeśli jest to pożądane pozostawiane do osiągnięcia stanu równowagi, albo mogą być dodawane oddzielnie do naczynia reakcyjnego.

Przykładami aktywatorów używanych w sposobie według wynalazku są tetrazol,

5-(etylotio)tetrazol, 5-(4-nitrofenylo)tetrazol, triazol, chlorek pirydyny i tym podobne związki, np. Beaucage i Iyer (zacytowany powyżej); Bemer i inni, Nucleic Acids Research, 17: 853864 (1989); Benson, Chem. Rev. 41: 1-61 (1947). Określenie „aktywator tetrazolowy” dotyczy aktywatorów, które są tetrazolami lub pochodnymi tetrazoli. Najkorzystniejszym aktywatorem jest tetrazol. Odpowiednimi rozpuszczalnikami są acetonitryl, tetrahydrofuran, chlorek metylenu i tym podobne związki. Korzystnym rozpuszczalnikiem jest acetonitryl. Wielką wagę należy przykładać do tego, aby stosować dokładnie odwodniony (bezwodny) monomer, aktywator i rozpuszczalnik używany w etapie sprzęgania oraz rozpuszczalnik używany do przemywania stałego nośnika bezpośrednio przed etapem sprzęgania.

Dobór monomeru (zwłaszcza dobór aminowej grupy fosforoamidynowej) zależy od późniejszych zastosowań. Ogólnie, dla syntezy fligonukleftydów fosforoaimidanowych na skalę badawczą (0,01-10 pmoli) przy zastosowaniu dostępnych w handlu urządzeń do syntezy DNA, takich jak ABI Model 394, użyteczne jest stosowanie monomeru względnie trwałego i względnie mniej reaktywnego (według zdefiniowanej powyżej stałej równowagi Ki), tak że roztwór może być pozostawiony w urządzeniu do wielokrotnych syntez przez okres tygodni. Innym powodem faworyzowania w tym przypadku względnie mniej reaktywnego monomeru jest fakt, że urządzenie tego typu nie jest zaprojektowane z myślą zminimalizowania objętości stosowanego reagentu. Ponieważ urządzenia syntezujące na skalę badawczą zwykle do pewnego stopnia działają na zasadzie przepływu roztworu monomeru przez naczynie reakcyjne (kolumnę), to część rozpuszczalnych produktów usuwane jest z kolumny (i w ten sposób z

183 661 układu będącego w równowadze), co sprzyja przesunięciu równowagi w kierunku całkowitego przebiegu reakcji. Przy takiej skali także koszt użytego monomeru może być relatywnie mniej ważny niż inne czynniki (koszty osobowe, wygoda etc). Ogólnie, jeśli stosowane są mniej reaktywne monomery (takie jak diizopropyloaminofosforoamidyn) potrzebne jest stosowanie względnie dużego nadmiaru monomeru (10-50), w porównaniu do wolnych grup aminowych i konieczne jest użycie dużego nadmiaru aktywatora, w celu osiągnięcia rozsądnych szybkości reakcji i wydajności konwersji.

Aby zminimalizować ilość (liczbę równoważników) monomeru wymaganą do osiągnięcia pożądanej wydajności, szczególnie przy używaniu względnie mniej reaktywnego monomeru i dokonywaniu syntezy na małą skalę naszkicowaną powyżej, bardzo korzystne jest przeprowadzanie etapów sprzęgania i utleniania dwukrotnie, przy stosowaniu w każdym z tych dwóch etapów niższych stężeń (i mniej równoważników) monomeru. Jest to rezultatem tego, że sprzęganie jest reakcją odwracalną, (zilustrowaną w równaniach 1a i 1b). Stosując taką metodę, pierwszy cykl sprzęgania jest dokonywany przy zastosowaniu dość małych ilości monomeru i równowagowe stężenie tworzącego się w tych warunkach pożądanego wiązania fosforoamidynowego jest wiązane jako fosforoamidan, przez przeprowadzenie pierwszego etapu utleniania cyklu. Następnie przeprowadza się drugi etap sprzęgania, ponownie ze względnie małą ilością monomeru, po którym następuje drugi etap utleniania. Stosując tę metodę, do osiągnięcia pożądanej wydajności wymagane jest sumarycznie mniej monomeru niż w przypadku, w którym cała ilość monomeru używana jest w pojedynczym sprzęganiu.

Ekonomika produkcji na dużą skalę wymaga, aby ilość (liczba równoważników) stosowanego monomeru była zminimalizowana. W takim zastosowaniu koszt monomeru stanowi duży procent całości kosztów, ponieważ koszt robocizny i inne koszty nie rosną liniowo wraz ze skalą syntezy. Urządzenia syntezujące oligonukleotydy na dużą skalę zwykle działają w sposób periodyczny, a nie w sposób przepływowy, pospolicie spotykany w badawczych urządzeniach syntezujących, wskutek czego nie jest praktyczna technika przesuwania równowagi reakcji w kierunku zakończenia reakcji, przez usuwanie rozpuszczalnych produków z naczynia reakcyjnego. W tym zastosowaniu konieczne jest wybieranie monomeru względnie bardziej reaktywnego (według zdefiniowanej powyżej stałej równowagi Ki). Takie monomery posiadają aminowe grupy fosforoamidynowe, które są relatywnie bardziej zasadowe i/lub bardziej sterycznie zahamowane. Zastosowanie takich reaktywnych monomerów zezwala na użycie niższych stężeń aktywatora, w celu osiągnięcia rozsądnych szybkości reakcji. Niższe stężenia aktywatora zapobiegają odwrotnej reakcji produktu z aktywatorem, z utworzeniem aktywnego produktu pośredniego (równanie 1b). Z tego powodu wymagana jest znacznie mniejsza ilość monomeru (1-5 równoważników). Ogólnie, bardzo ważne jest, aby używać monomeru o najwyższej czystości.

Po etapie sprzęgania, wytworzone wiązanie fosforoamidynowe jest utleniane (sulfuryzowane), z utworzeniem trwałego, zabezpieczonego wiązania fosforoamidanowego (fosforotioamidanowego). Etap utleniania może być przeprowadzany bezpośrednio po odciągnięciu sprzężonego roztworu z naczynia reakcyjnego, lub z pośrednim przemywaniem rozpuszczalnikiem. Ponieważ wiązanie fosforoamidynowe mogłoby hydrolizować w obecności tetrazolu, przemywający roztwór jest bezwodny i/lub zasadowy. Jeśli nie stosuje się etapu przemywania, roztwór utleniający jest korzystnie zasadowy i/lub bezwodny, albo środek utleniający jest tak dobierany, by był wystarczająco reaktywny aby pomyślnie konkurować z hydrolizą.

Środkami utleniającymi w sposobie według wynalazku są jod, chlor, brom, kwasy nadtlenowe takie jak kwas m-chlorobenzoesowy, wodoronadtlenki, takie jak wodoronadtlenek t-butylu, wodoronadtlenek etylu, wodoronadtlenek metylu itp., ozon, mieszane bezwodniki acylosulfinowe, takie jak 1-tlenek 3H-2,1-benzoksatiolan-3-onu nadsiarczany, takie jak nadsiarczany sodu, amonu, tetrabytyloamonu itp., mononadsiarczany, takie jak oxone™ , podchloryny sodu i/lub innych metali, nadtlenki, takie jak nadtlenek dietylu lub nadtlenek bis(trimetylosililu), albo nadtlenek wodoru lub równoważniki wodnych roztworów nadtlenku wodoru, takie jak kompleks mocznik/nadtlenek wodoru, etc. Inne użyteczne środki utleniające, które mogą być zastosowane do przekształcenia fosforu (III) w fosfor (V), opisane są przez Beaucage i Iyera (zacytownych powyżej). Środkami sulfuryzującymi stosowanymi w sposobie

183 661 według wynalazku są siarka elementarna, disiarczki tiuramu, takie jak disiarczek tetraetylotiuramu, disiarczki acylu, takie jak disiarczek fenacylu, disiarczki fosfinotioilu, takie jak S-Tetra™ i 1,1-diokso-3H-1,2-benzoditiol-3-on. Korzystnym środkiem utleniającym w sposobie według wynalazku jest nadtlenek wodoru. W korzystnym wykonaniu wynalazku stosuje się roztwór 1,5% nadtlenku wodoru, 3,5% wody, 20% pirydyny i 75% THF.

W jednym z wykonań wynalazku nieprzereagowane grupy 3'-aminowe pozostałe po (ostatnim) etapie utleniania są zakrywane odpowiednim środkiem przed następnym etapem usuwania grupy trifenylometylowej, w celu uczynienia ich inertnymi w następujących po tym etapach sprzęgania. Etap zakrywania nie tylko polepsza profil HPLC czyniąc oczyszczanie łatwiejszym, ale także znacznie zwiększa sumarczną wydajność produktu, prawdopodobnie przez wyeliminowanie meprzereagowanych grup 3'aminowych z konkurowania przy ustalaniu się stanu równowagi. Środkami zakrywającymi w sposobie według wynalazku są reagenty elektrofilowe, takie jak bezwodnik octowy i bezwodnik izomasłowy, chlorki kwasowe, takie jak chlorek karbonyloadamantylu, chlorek piwaoilowy, itp, izotiocyjaniany, chloromrówczany, etc. Użytecznymi są także fosforiamidyny w połączeniu z aktywatorem z następczym utlenianiem, oraz sole H-fosfoniowe, takie jak izopropylo-H-fosfonian trietyloamonu, stosowany w połączeniu z chlorkiem kwasowym, takim jak chlorek piwaoilowy lub chlorek karbonyloadamantylu.

Grupy zabezpieczające grupy 3'-aminowe w monomerze, np. trifenylometyl, czynią je mniej reaktywne w reakcji grupą fosforoamidynową monomerów i z środkami zakrywającymi. Jednakże, to zabezpieczenie nie jest tak całkowite, jak w przypadku podobnie zabezpieczanej grupy 5'-hydroksylowej konwencjonalnej syntezy fosfodiestrowej. Z tego powodu preferowany jest nieznacznie mniej reaktywny środek zakrywający taki jak bezwodnik izomasłowy, w porównaniu do bezwodnika octowego najczęściej używanego w syntezie fosfodiestrowej. Zarówno bezwodnik izomasłowy, jak i bezwodnik octowy mogą być używane jako roztwór bezwodnik/lutydyna/ tetrohydrofuran w stosunku 1:1:8 (objętościowo) i stosowane w równych częściach z roztorem 1-metyloimidizolu w tetrahydrofuranie, tak jak jest to dostarczane przez PE Applied Biosystems (Foster City, CA).

Oligonukleotyd jest odszczepiany od stałego nośnika i po zakończeniu składania łańcucha usuwane są grupy zabezpieczające, przy zastosowaniu wodnego roztworu amoniaku lub innych środków opisanych w odnośnikach cytowanych powyżej. Oligonukleotyd może być odszczepiany od nośnika z nienaruszoną grupą zabezpieczającą końcową grupę aminową (lub w pewnych przypadkach grupą zabezpieczającą hydroksyl). Jest to pożądane w pewnych sytuacjach, w których trifenylometylowe lub inne grupy zabezpieczające s, pomocne przy oczyszczaniu, takim jak HPLC z odwrócona fazą lub HPLC na wymieniaczu jonowym. Jednakże, jeśli stosowane s, grupy zabezpieczające trifenylometylowe, usuwane działaniem kwasów po odszczepieniu od stałego nośnika, usunięciu zabezpieczenia i oczyszczaniu, to jest silna tendencja do niepożądanej fragmentacji wiązania fosforoamidanowego po usunięciu zabezpieczenia i dlatego wymagana jest wielka ostrożność w czasie tego etapu procesu.

Alternatywnie, grupa zabezpieczająca końcową grupę aminowa (taka jak trifenylometylowa) może być usuwana działaniem kwasu przed odszczepieniem od nośnika. W tym przypadku wiązania fosforoamidanowe są ciągle zabezpieczane i unika się fragmentacji. Oligonukleotyd jest następnie odszczepiany od nośnika i zabezpieczenie usuwane jest w sposób podany powyżej. Oligonukleotyd fosforoamidanowy jest oczyszczany metod, HPLC na wymieniaczu jonowym, metod, HPLC z odwrócona faz, lub innymi metodami.

Przykład I

Wytwarzanie monomerów 2'-deoksy-3'-trifenylometylotymidyno-5'-fosforoamidanowych.

Syntezę 3' -(trifenylometylo)amino-3' -deoksytymidyno-5' -(2-cyjanoetylo N,N-diizopropylo)fosforoamidyny, 4t, naszkicowano w schemacie I. 3'-Azydo-5'-0-(4-metoksybenzoilo)3'-deoksytymidynę, 1t, syntezowano metod, Czernecki i Yalery, Synthesis, 1991: 239.

183 661

CH.

Schemat I

1) Hj.10% Pd/C,EtOH

2) TrCI, EtjN, pirydyna 83%

<UL° 4

NaOH _Hf, I J h

1,4-dloksan/CH/)H

90% NH Ν,Ν-dllzopropyłoetyłoamlna, CH₂CI₂

I

Tr

M aq. NaOH

I /-CN Η

744

NH

Tr

3t

4t

Wydajność oczyszczonego produktu - 70-80%

Objaśnienia: Tr - trityl (trłfenylometyl)

Et-etyl

3'-(Trifenylometylo)amino-5'-(4-metoksybenzoilo)-3'deoksytymidyna, 2t. 3'-Azydo-5'O-(4-metoksybenzoilo)- 3 '-deoksytymidynę, lt, (10,0 g, 24,9 mmola), rozpuszczono w etanolu (500 ml) i redukowano przez uwodornienie (4,2-10⁵ Pa) w obecności 10% Pd/C (1,0 g) przez 16 godzin. Przez odsączenie katalizatora i odparowanie rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskano z 92% wydajnością (8,6 g, 22,9 mmola) odpowiednią 3'-aminę, którą wzięto bezpośrednio do następnej reakcji. 5'-(4-Metoksybenzolo)-3'-amino-3'-deoksytymidynę (8,6 g, 22,9 mmola) oczyszczano przez wytworzenie azeotropu z pirydyną (2 x 50 ml) i rozpuszczono w bezwodnej pirydynie (50 ml). Do roztworu tego dodano trietyloaminę (6,71 ml, 48,1 mmola) i chlorek trifenylometylu (7,0 g, 25,2 mmola). Mieszaninę mieszano 2 godziny w temperaturze otoczenia, dodano dodatkową porcję chlorku trifenylometylu (1,9 g, 6,9 mmola) i ponownie mieszano ją przez 2 godziny. Rozpuszczalniki usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem i surowy produkt oczyszczano na krzemionce (2-5% MeOH/CH2CI2), uzyskując 3'-(trifenylometylo)amino-5'-(4-metoksybenzoilo)-3'deoksytymidynę, 2t, z 90% wydajnością (12,7 g, 20,6 mmola).

3'-(Trifenyiometylo)amino-3'deoksytymidyna, 3t Usunięto 5'-O-anizoilową grupę zabezpieczajątcąprzez rozpuszczenie 2t (30,1 g, 48,7 mmola) w mieszaninie 1,4-dioksan/MeOH o stosunku 57:43 (150 ml), po czym dodano wodny roztwór 2M NaOH (73,1 ml, 146,2 mmole). Po 1,5 godzinnym mieszaniu w temperaturze otoczenia, mieszaninę reakcyjną zneutralizowano kationową żywicą jonowymienną Dowex 50W-X8 (ok. 150 g w postaci bezwodnej soli pirydyniowej H+, 1,6 meq/g). Po uzyskaniu obojętnego pH (ok. 10 minut) żywicę odsączono, przemyto ją obficie CH2CI2 i MeOH i surowy produkt odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszczono w EtOAc (500 ml) i ekstrahowano nasyconym wodnym roztworem NaHC03 (2 x 250 ml), H2O (250 ml) i nasyconym wodnym roztworem NaCl (250 ml). Po wysuszeniu nad Na2S04 i przesączeniu, usunięto rozpuszczalniki pod zmniejszonym ciśnieniem i wytworzoną pianę rozpuszczono w mieszaninie CH2CI2 i MeOH w stosunku 95:5 (300 ml). Roztwór ten dodawano powoli do energicznie mieszanej mieszaniny Et20/heksan w stosunku 1:1 (1250 ml), wytrącając czystą 3'-(trifenylometylo)amino-3'deoksytymidynę, 3t, z wydajno18

183 661 ścią 90% (21,2 g, 43,8 mmoli). Konwersja do monomerów fosforoamidynowych i/lub sukcynilowanego nukleozydu opisana jest poniżej w przykładach 5-7.

Przykład II

Wytwarzanie monomerów 2' -deoksy-3' -trifenylometylocytydyno-5' -fosforoamidynowych. Syntezę N4-benzoilo-3' -(trifenylometylo)amino-2' ,3' -dideoksycytydyno-5' -(2-cyjanoetylo N,N-diizopropylo)fosforoamidyny, 4c, naszkicowano w schemacie n.

Schemat II

1)H₂.10%Pd/C. C₂H_sOH

2) TrCI, Et jN, pirydyna 85%

1) POCIj.EtjN, 1,2,4-triazol, CH₃CN

2) NH₄OH, 1,4-dioksan

3) BzCI, pirydyna

92% «yyNtiBz

NH

Tr

2e

Et₃N’3HF

CHjCIj / pirydyna — »

75%

Objaśnienia:

Wydajność oczyszczonego produktu - 70-60%

TBDMS-CI	- chlorek f-butylodimetylosililu
DMAP	- 4diimMttyl<aimirK>pirydyTa
DIAD	• suudJitarbeksyan- diizopropylu
Tr	• trity- (trifenylonettyl)
Bz	- iearuoll
PhjP
Et	- etyl

3'-Azydo-5'-0-(tert-butylodimetylosililo)-2',3'-dideoksyurydyna, Idu. 2'-Deoksyurydynę (11,4 g, 50 mmoli) starannie wysuszono przez odparowywanie z bezwodnym DMF (2 x 100 ml) pod zmniejszonym ciśnieniem. Następnie dodano dMf (100 ml), po czym dodano trietyloaminę (8,36 ml, 60 mmoli), 4-dimetyloaminopirydynę (0,31 g, 2,5 mmoli) i chlorek tertbutylo-dimetylosililu (8,29 g, 55,0 mmoli). Mieszaninę reakcyjną mieszano 1 godzinę w temperaturze pokojowej, rozcieńczono dichlorometanem (600 ml) i ekstrahowano H2O (3 x 200 ml) i nasyconym wodnym roztworem NaCl (200 ml). Organiczną, warstwę wysuszono nad Na2S04, przesączono i odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczono na krzemionce (2-10% MeOH/C^Cf) uzyskując 5'-O-(tert-butylodimetylosililo)-2'183 661 deoksywydynę z wydajnością 80% (13,7 g, 40,0 mmoli). Dodano trifenylofos^ę (16,8 g, 64,0 mmola) i DMF (100 ml) i mieszając dodano do tej mieszaniny roztwór diizopropyloazodikarboksylanu (12,6 ml, 64,0 mmola) w DMF (20 ml). Po 2 godzinnym mieszaniu w temperaturze pokojowej, mieszaninę reakcyjną zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem do około 30 ml i wlano do ET20 (1200 ml). Po 10 minutach energicznego mieszania zaczęła się wytrącać 2,3''anhy<aro-5^,-O-(tert-butylodimetylosililo)'2’-aeoksyuzydyaa, Wytworzoną mieszanie umieszczono na noc w lodówce, osad oddzielono przez odsączenie, przemyto dodatkowo zimnym Et20 (2 x 300 ml) i wysuszono pod próżnią uzyskując z 90% wydajnością (11,7 g, 36,0 mmola) 2,3'anhydrO'5'-O-(tert'butyloaimetyłosililo(-2''deoksyurydynę w postaci białej substancji stałej, dalej nie oczyszczanej. Następnie 2,3'-anhydrO'5'-0-(tert-butylodimetylosililo)-2'-aeoksyuzydyaę (33,8 g, 104,2 mmola) poddano reakcji z L1N3 (7,65 g, 153,3 mmola) w DMF (300 ml) w temperaturze 95-100°C przez 48 godzin. Wytworzoną brązową jednorodną mieszaninę oziębiono do temperatury pokojowej, zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem do postaci oleju, rozpuszczono w EtOAc (800 ml) i ekstrahowano H20 (200 ml). Wodną warstwę dwukrotnie ekstrahowano EtOAc (75 ml) i połączone fazy organiczne przemyto H20 (3 x 250 ml) i raz nasyconym wodnym roztworem NaCl (250 ml). Roztwór EtOAc wysuszono nad Na₂S0^ przesączono i odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując z 87% wydajnością (33,2 g, 90,3 mmole) 3'-azydo-5'-0-^1= butylodimetylosililo)-2',3'-dideoksyurydynę 1du, w postaci brązowawej piany, poddawanej bezpośrednio uwodornieniu.

3' -(Trifenylomety^amino^' -O-(teit-butylodimetylosililo)-2' ,3' -aideoksyuryayaa, 2du. Nieoczyszczony Idu (33,2 g, 90,3 mmole) rozpuszczono w mieszaninie EtOH/C^Cb w stosunku 2:1 (300 ml) i zredukowano przez uwodornienie (4,2-10⁵ Pa) w obecności 10% Pd/C (3,0 g) przez 18 godzin. Przez odsączenie katalizatora i odparowanie rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskano z wydajnością ilościową (30,4 g, 89,8 mmola) odpowiednią 3'-aminę, którą wzięto bezpośrednio do następnej reakcji. 5'Ό-(tert'butylodimetyiosililo)'2',3''dideoksyuzydyaę (30,4 g, 89,8 mmola) oczyszczano przez wytworzenie azeotropu z pirydyną (2 x 300 ml) i rozpuszczono w mieszaninie CH2G2 (600 ml) i bezwodnej pirydyny (70 ml). Do roztworu tego dodano trietyloaminę (25,0 ml, 48,1 mmola) i chlorek trifeaylometylu (35,0 g, 125,7 mmola) i mieszaninę mieszano 2 godziny w temperaturze otoczenia. Rozpuszczalniki usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem i surowy produkt oczyszczano na krzemionce (1-5% MeOH/C^Cb), uzyskując 3'(trifenylometylo)amino-5'-C-(tert-butylodimetylosililo('2',3'-<iideoksyuzydyaę, 2du, z 85% wydajnością (44,3 g, 75,9 mmola).

N⁴-Beazoilo-3'-(trifenylometylo)amiao-5'-0-(tert-butylodimefylosililo)-2',3''aideoksycytydyna, 2c. Trietyloaminę (22,5 ml, 161,1 mmola) w ciągu 10 minut dodano kroplami, ciągle mieszając, do mieszaniny 1,2,4-triazolu (11,1 g, 161,1 mmola) i tlenochlorku fosforu (3,5 ml,

37.1 mmola) w bezwodnym acetonitrylu (125 ml) w temperaturze 0°C. Mieszając, do tej zimnej mieszaniny dodano 2du (9,4 g, 16,1 mmola), w postaci roztworu w acetonitrylu (50 ml). Otrzymaną mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. W celu przerwania reakcji i polepszenia rozpuszczalności dodano trietyloaminę (30 ml) i H20 (10 ml), a następnie usunięto rozpuszczalniki pod zmniejszonym ciśnieniem. Wytworzoną brązową substancję stałą rozpuszczono w CH2C1 (250 ml), ekstrahowano nasyconym wodnym roztworem NaHCC3 (3 x 150 ml), nasyconym wodnym roztworem NaCl, wysuszono nad Na₂SO4, przesączono i odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując ilościowo (10,2 g, 16,1 mmola) 3''(trifenylometylo)(amno-5'-0'(tert'butylO'aimetylosililo)-2',3’-aiaeoksy-4-(1,2,4-triazol-1-ilo(urydynę, w postaci pomarańczowej substancji stałej. Nieoczyszczony materiał rozpuszczono w 1,4-dioksanie (200 ml) i dodano zimny, stężony NH4OH (50 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 4 godziny i odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując ilościowo (9,4 g, 16,1 mmoli) SUtrifenylomceyloj^ino-S-Odtert-butylodimetylosililo(-2',3''dideoksycytydyaę, w postaci beżowej substancji stałej. Ten surowy materiał oczyszczano przez wytworzenie azeotropu z bezwodną pirydyną (2 x 300 ml), rozpuszczono w pirydynie (200 ml) i mieszając dodano w temperaturze 0°C chlorek benzoilu (2,2 ml, 19,3 mmola). Następnie roztwór mieszano w temperaturze pokojowej przez 16 godzin, oziębiono do 0°C, przerwano reakcję dodatkiem H20 (40 ml) i po mieszaniu 5 minutowym dodano stężony wodny roztwór amoniaku (40 ml), po czym mieszaninę mieszano przez dodatkowe 15 minut w 0°C. Roz20

183 661 puszczałniki odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, pozostałość rozpuszczono w CH2CI2 (125 ml) i ekstrahowano nasyconym wodnym roztworem NaliCO₃ (3 x 75 ml), suszono nad Na2SO4, przesączono i odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Surowy materiał oczyszczano na krzemionce (1-5% MeOH/ CH2CI2,) uzyskując N4-beazoilo-3^,-(trifenylometylo)amino-5'-O(tert-butylodimetylosiłilo)-2',3' -dideoksycytydynę, 2c, z 92% wydajnością (10,2 g, 14,8 mmola).

N4-Beazoilo-3'-3trifenylometylo)amiao-2', 3 '-dideoksycytydyna, 3c.

Grupę zabezpieczaaącą 5-TBDMS -usunięto przez rozpuszczenie 2c (5,8 g, 8,5 mmoli) w mieszaninie CIĘCŁ/pirydyna 1:1 (25 ml) i poddaniu reakcji z Et₃N₃HF (6,9 ml, 42,6 mmoli) w czasie 16 godzin. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono CH2CI2 (200 ml) i ekstrahowano H2O (2 x 50 ml) i nasyconym wodnym roztworem NaCl (50 ml). Warstwę organiczną wysuszono nad Na2S04, przesączono i odparowano rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem. Surowy produkt oczyszczano na krzemionce (3% MeOH/C^Cf), uzyskując N4-benzoilo-3'(trifenylometylo)amino 2',3'-dideoksycytydyaę, 3c, z wydajnością 75% (3,7 g, 6,4 mmola). Konwersja do monomerów fosforoamidynowych i/lub sukcynilowanego nukleozydu opisana jest poniżej w przykładach 5-7.

Przykład III

Wytwarzanie monomerów 2'-deoksy-3'-trifenylometyloaminoguanozyao-5'-fosforoamidynowych.

Syntezę N2-2-metylfprfpionylo3'-(trifenylometylo)aminf-2',3' -dideoksy-guanozyno-5'(2-cyjaafetylo N,N-diizopropylo)fosforoamidyny, 4g, naszkicowano w schemacie III. 5'-0Beazoilf-N4-2-metylopropifnylo-2'-deoksyguanozyaę i 3'-O-Benzoilo-N2-2-metylopropionylo-2'-deoksyksyloguanozynę wytwarzano w sposób opisany uprzednio, Reese i inni, J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 1984: 1263.

Schemat III

1) TBDMS-CI, Et₃N cat DMAP, DMF

2) 2M NaOH, 0°C 65:30:5 pirydyna:CHjOH:CHf lą I j.

EtjN'3HF

1:1 CHj&j / pirydyna

78%

3) LiN,, Ph₃P, DEAD DMF 49%

1) H₂,10% Pd/C, CjHgOH

2) TrCI, Εί,Ν, pirydyna

NH

Tr

73%

Wydajność oczyszczonego produktu - 70-80% *g

183 661

Objaśnienia: TBDMS-CI - chlorek Mbutylodimetylosililu DMAP - 4dtimety0aammoprrdJyna

DIAD - azodikabokcsytan diizopooyylu

Tr trriyy | (rirtfβηγΟ^πβ^

Bz -temooil

Ph₃ P * rrifanyOrfosfina

Et -eyyl

5'-0-(tert-butylodimetylosilo)N²-2-metylopropionylo-3' -azydo-2' ,3' -dideoksyguanozyna, lg. Do roztworu 3'-O-Bernzoilo-N²-2-metylopropionylo2'-deoksyksyloguanozyny (4,86 g, 11,0 mmoli) w DMF dodano mieszając trietyloaminę (3,4 ml, 24,2 mmole), 4-dimetyloaminopirydynę (54 mg, 0,44 mmola) i chlorek tert-butylodimetylosililu (3,31 g, 22,0 mmola). Roztwór mieszano w temperaturze pokojowej 2 godziny, dodano metanol (10 ml) i po mieszaniu przez dodatkowe 5 minut mieszaninę odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszczono w CH2CI2 (150 ml), przemyto H2O (3 x 40 ml) i nasyconym wodnym roztworem NaCl (60 ml). Warstwę organiczną wysuszono nad Na2SOą, przesączono i odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując 6,40 g czerwonawo zabarwionej piany. Do tego nieoczyszczonego materiału dodano wstępnie ochłodzony (ok. 5°C) 2M roztwór NaOH w mieszaninie pirydyna:MeOH:H2O 65:30:5 (4,0 ml, 87,9 mmoli). Mieszaninę reakcyjną mieszano 20 minut na łaźni z wodą i lodem i zobojętniono ją IM HC1 (97 ml) do pH 7. Mieszaninę reakcyjną zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem do ok. 50 ml i ekstrahowano CH2CI2 (2 x 75 ml). Połączone ekstrakty organiczne przemyto nasyconym wodnym roztworem NaCl (50 ml), wysuszono nad Na2SOą, przesączono i odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując z 82% wydajnością (4,1 g, 9,1 mmola) 5-0-(tert-butylodimetyk)sililo)N²-2-metylopiOpionylo2-deoksyksyloguanozynę, w postaci piaskowo zabarwionej piany, zużytkowanej w następnej reakcji bez dalszego oczyszczania. Do nieoczyszczonej 5-O-(ttert-butylodimetylosililo)-N²-2metylopropionylo-2'-deoksyksyloguanozyny (47,3 g, 104,7 mmola) dodano LiN3 (15,4 g,

314,1 mmola), trifenylofosfinę (41,2 g, 157,1 mmola) i bezwodny DMF (1000 ml). Dodano dietyloazodikarboksylan (24,7 ml, 157,1 mmola) i mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 5 godzin w atmosferze argonu. Następnie dodano H20 (20 ml) i mieszaninę reakcyjną odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszczono w EtOAc (1500 ml), przemyto H2O (3 x 1000 ml), nasyconym wodnym roztworem NaCl (1000 ml), wysuszono nad Na2SOą i odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczono na krzemionce (1-5% MeOH/CrfCk), jednak w wyniku tego uzyskano wydajność >100% (112,7 g) zanieczyszczonej 5'-C^-(l^e:rt-butylodimetylosililo)-N²-2-metylopropionylo-3'-azydo-2',3'-dide^)ksyguanozyny, lg. Ten zanieczyszczony produkt nie był dalej oczyszczany, lecz poddawany bezpośrednio uwodornieniu i oczyszczany w postaci 3'-aminy.

5'-0-(tert-Butylodimetylosililo)-N²-2-metylopropionylo-3'-(trifenylometylo)-amino2',3'-dideoksyguanozyna, 2g. Nieoczyszczony produkt 1g (49,9 g, 104,7 mmola) rozpuszczono w ciepłym etanolu (1600 ml) i uwodorniono (4,2-10° Pa) w obecności 10% Pd/C (2,5 g) przez 16 godzin. Przez odsączenie katalizatora i odparowanie rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskano surową 5'-0-(tert-butylodimetylosiulo)N²-2-metylopropionylo3'-amino-2',3'-dideoksyguanozynę, którą oczyszczano na krzemionce (2-6% MeOH/CH2CI2, a następnie 1% Et3N/6% MeOH/CHbCh). uzyskując z wydajnością 60% (28,5 g, 63,2 mmola) czystą 5'-O-(tert-butylodimetylosililo)-N-2-metylopropionylo-3'-amino-2',3'-dideoksyguanozynę, w postaci piany w kolorze złamanej bieli. Do 3'-aminy (28,5 g, 63,2 mmola) wprowadzono grupę zabezpieczającą przez przereagowanie z trietyloaminą (17,6 ml, 126,4 mmola) i chlorkiem trifenylometylu (28,2 g, 101,1 mmola) w pirdynie (500 ml) przez 16 godzin, w temperaturze otoczenia. Rozpuszczalniki usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałość oczyszczano na krzemionce (1-5% MeOH/CH2Cl2 uzyskując iloścowo (43,8 g, 63,2 mmole) 5'-O-(tert-Butylodimetylosililo)-N²-2-metylo-propionylo-3'-(trifenylometylo)-amino-2',3'dideoksyguanozynę, 2g

N²-2-Metylopropionylo-3'-(trifenylometylo)-amino-2',3' -dideoksyguanozyna, 3g. Grupę zabezpieczającą 5'-TBDMS usunięto przez rozpuszczenie 2g (5,9 g, 8,5 mmoli) w mieszani22

183 661 nie C^Ch/pirydyna 1:1 (25 ml) i poddaniu reakcji z Et₃N 3HF (6,9 ml, 42,6 mmoli) w czasie 16 godzin. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono CH2CI2 (200 ml) i ekstrahowano H2O (2 x 50 ml) i nasyconym wodnym roztworem NaCl (50 ml). Warstwę organiczną wysuszono nad Na2SO4, przesączono i odparowano rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem. Surowy produkt oczyszczano na krzemionce (2-5% MeOH/C^Ch), uzyskując N -2-Metylopropionylo-3' -(trifenylometylo)-amino-2' ,3' -dideoksyguanozynę, 3g, z wydajnością 73% (3,6 g,

6,2 mmola). Konwersja do monomerów fosforoamidynowych i/lub sukcynilowanego nukleozydu opisana jest poniżej w przykładach 5-7.

Przykład IV

Wytwarzanie monomerów 2' -deoksy-3' -trifenylometyloaminoadenozyno-5' -fosforoamidynowych.

Syntezę N⁶benzoilo-3' -(trifenylometylo)amino-2' ,3' -dideoksyadenozyno-5' -(2-cyjanoetylo N,N-diizopropylo)fosforoamidyny, 4a, naszkicowano w schemacie IV. N⁶Benzoilo-9-(5-O-benzoilo-2-deoksy-P-D-treo-pentofijranozylo)adeninę syntezowano metodą Herddewijna, J. Org. Chem., 53: 5050 (1988).

Schemat IV

1) Li^Ł PIjP, DEAD DMF

2) H. 10% Pd/C 3:1 EtOH/ąBI,

57%

1) TrCI, ĘN, pyr

2) 2M NaOH, 0’C 65:30:5 pyr. MeOtyl·

71%

HI .Bz

-UBz (FPr)NEt, CfcCk <^zT j -f

NH

I ^Tr , 3a

Wydajność oczyszczonego produktu - 70-80%

NH

Tr

5' -0-(Benzoilo)-N6-benzoilo-3' -azydo-2' ,3' -dideoksyadenozyna, 1a. N6-Benzoilo-9^-O-benzoilo^-deoksy-P-D-treo-pentofuranozy^adeninę (7,0 g, 15,3 mmola), trifenylofosfinę (6,0 g, 22,9 mmola) i LiN3 (2,8g, 56,4 mmola) rozpuszczono w DMF (100 ml). Do tego roztworu mieszając dodano w jednej porcji dietyloazodikarboksylan (3,6 ml, 22,9 mmoli), mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 2,5 godziny i zatrzymano reakcję dodając H2O (10 ml). Rozpuszczalniki odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, pozostały olej rozpuszczono w EtOAc (300 ml) i ekstrahowano H2O (2 x 200 ml) i nasyconym wodnym roztworem NaCl (200 ml). Warstwę organiczną wysuszono nad Na2SCO, przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostający olej oczyszczono na krzemionce (25% MeOH/CHĘCb), uzyskując 5'-0-(benzoilo)-N-benzoilo-3'-azydo-2',3'-dideoksyadenozynę, 1a, w postaci piany o bursztynowym zabarwieniu, którą bezpośrednio poddano uwodornieniu.

^-Benzoilo^^trifenylomety^amino^^-dideoksyadenozyna, 3a. Nieoczyszczony la (33,2 g, 90,3 mmole) rozpuszczono w mieszaninie EtOH/CH^h 3:1 (200 ml) i zredukowano przez uwodornienie (4,2-105 Pa) w obecności 10% Pd/C (0,7 g) przez 18 godzin. Przez odsączenie katalizatora i odparowanie rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem, uzy183 661 skano z wydajnością 57% (4,0 g, 8,7 mmola) odpowiednią 3'-aminę, któr, wzięto bezpośrednio do następnej reakcj i. 5' -O-(Benzoilo)-N^ń-benzoilo-3' -amino-2', 3' -dideoksyadenozynę (3,9 g, 8,5 mmola) rozpuszczono w CH2G2 (50 ml), dodano trietyloaminę (2,9 ml, 20,8 mmola) i następnie chlorek trifenylometylu (2,9 g, 10,2 mmola). Po 1,5 godzinnym mieszaniu w temperaturze otoczenia, mieszaninę rozcieńczono CH2O2 (50 ml), ekstrahowano H20 (2 x 50 ml) i nasyconym wodnym roztworem NaCl (50 ml). Warstwę organiczną wysuszono nad Na₂SC^4, przesączono i odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując surow, 5-0-(benzoilo)-N⁶-benzoilo-3 '-(trifenylometylo)amino-2',3 '-dideoksyadenozynę, której 5'-benzoilową grupę zabezpieczaj ^, bezpośrednio poddano hydrolizie. Nieoczyszczoną 5'-0-(benzoilo)-N⁶benzoilo3'-(trifenylometylo)amino2', 3’-dideoksyadenozynę (ok. 6,0 g, 8,5 mmola) rozpuszczono w mieszaninie THF/MeOH 1:1 (100 ml) i oziębiono do temperatury 0°C. Do mieszaniny tej dodano wstępnie schłodzony 2M roztwór wodny NaOH (13,7 ml, 27,4 mmoli) i mieszano ją 20 minut w temperaturze 0°C. W tym momencie zaawansownie reakcji wynosiło około 50%, dlatego dodano dodatkowa ilość 2M roztworu wodnego NaOH (10,0 ml, 20 mmoli) i po dodatkowym 15 minutowym mieszaniu w temperaturze pokojowej mieszaninę reakcyjną zobojętniono kationow, żywic,jonowymienną Dowex 50W-X8 (ok. 40 g w postaci bezwodnej soli pirydyniowej H+, 1,6 meq/g). Żywicę odsączono, przemyto j, obficie MeOH i THF i rozpuszczalniki odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszczono w CH2G2 (300 ml) i ekstrahowano H20 (150 ml), nasyconym wodnym roztworem NaHC03 (2 x 150 ml), H20 (150 ml) i nasyconym wodnym roztworem NaCl (150 ml). Po wysuszeniu nad Na2S0>4 i przesączeniu, usunięto rozpuszczalniki pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczono na krzemionce (2-3% MeOH/CH2Cl2 uzyskując z wydajności, 71% (3,6 g, 6,0 mmoli) N⁶-benzoilo-3'-(trifenylometylo)amino2',3’-dideoksyadenozynę, 3a, w postaci białej piany. Konwersja do monomerów fosforoamidynowych i/lub sukcynilowanego nukleozydu opisana jest poniżej w przykładach 5-7.

Przykład V

Wytwarzanie 3' -trifenylometyloamino-2' ,3' -dideoksynukleozydów-5' -(2-cyjanoetylo N,N-diizopropylo)fosforoamidynowych, 4a, 4c, 4g i 4t:

Do 8,4 mmola 3’-trifenylometyloamino-2', 3’-dideoksynukleozydu (3a, 3c, 3g lub 3t) (uprzednio azeotropowo 2 razy oczyszczanego z CH3CN) w 25 ml CH2G2, w atmosferze argonu dodawano 2,0 ml (11,8 mmoli) N,N-diizopropyloetyloaminy i 2,1 ml (9,4 mmola) 2cyjanoetylo N,N-diizopropylochlorofosforoamidyny. Po 15 minutowym mieszaniu mieszaninę reakcyjna rozcieńczono CH2G2 i ekstrahowano nasyconym wodnym roztworem NaHC0>3 i nasyconym wodnym roztworem NaCl. Warstwę organiczna wysuszono (Na2SO4), przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. N-Benzoilo-3'-(trifenylometylo)amino-2',3'dideoksyadenozyno-5'-(2-cyjanoetylo N,N-diizopropylo)fosforoamidynę, 4a, oczyszczano na S1O2 (5%Et3N/2% metanol/toluen), uzyskując 5,82 g (87,1%) czystej fosforoamidyny. 31p NMR (CD3CN) 8 148,6, 149,2. N⁴Benzoilo-3'-(trifenylometylo)amino2'3'-dideoksycytydyno-5'-(2-cyjanoetylo N,N-diizopropylo)fosforoamidynę, 4c, oczyszczano na S1O2 (3%MeOH/5%Et3N/tołuen), uzyskując 5,58 g (86,0%) czystego produktu. 3^JP NMR (CD3CN) 8 149,3, 149,6. N²-2-Metylopropionylo-3'-(trifenylometylo)amino-2',3’-dideoksyguanozyno5'-(2-cyjanoetylo N,N-diizopropylo)fosforoamidynę, 4g, wytrącano w atmosferze argonu z 10 ml CH2C12 przez dodawanie do energicznie mieszanego eteru etylowego (200 ml) i heksanu (200 ml) w temperaturze 4°C, w celu usunięcia zanieczyszczenia wodorofosfonoamidanem, który w tym przypadku nie może być usunięty metodą chromatografii kolumnowej. Osad odsączono, przemyto heksanem i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem. Wytrącanie powtórzono i osad dalej oczyszczano na S1O2 (10%Et3N/CH2Cl2), uzyskuąc 4,51 g (69%) czystej fosforoamidyny. 3’p NMR (CD3CN) 8 148,7, 149,4. 3'-(Trifenylometylo)amino-3'-deoksytymidyno5'-(2-cyjanoetylo N,N-diizopropylo)fosforoamidynę, 4t, oczyszczano na S1O2 (2%EtbN/CH2Cl2), uzyskując 4,06 g (70,7%) czystej fosforoamidyny i innych frakcji mieszanych?^rP NMR (CD3CN) δ 149,4, 149,5.

183 661

Przykład VI

Wytwarzanie 3' -trifenylometyloamino-2' ,3' -dideoksynukleozydów-5' -(2-cyjanoetylo2,2,6,6-tetrametylopiperydyno)f'osforoamidynowych, 5a, 5c, 5g i 5t:

Do 8,4 mmola 3'-tnfeaylometyloamiao-2',3'-dideoksynukleozydu (3a, 3c, 3g lub 3t) (uprzednio azeotropowo 2 razy oczyszczanego z CH3CN) w 25 ml CH2CI2, oziębionego do 4°C, w atmosferze argonu dodawano 1,9 ml (12,6 mmola) DBU i 5,2 ml (8,4 mmola) roztworu 2-cyjanoetylo-2,26,6-tetrametylopiperydynochlfofosforoamidyay w CH2CI2 (stężenie = 1,626 mmoli/mL). Usunięto łaźnię wody z lodem i roztwór mieszano przez 30-60 minut. W celu uniknięcia rozkładu, nieoczyszczoną mieszaninę reakcyjną podawano do oczyszczenia bezpośrednio na kolumnę wypełnioną S1O2 (3% MeOH/5% Et3N/toluen dla 5a, 5c i 5t oraz 10% Et3N/CH2Cl2 dla 5g). We wszystkich przypadkach konieczne było dalsze oczyszczanie, tak jak to wskazano dla każdego produktu. N⁶-Benzoilo-3'-(trifenylometylo)amino-2',3'dideoksyadeaozyno-5'-(2-cyjaaoetylo-2,2,6,6-tetrametylopiperydyno)fosforoamidynę, 5a, oczyszczano na S1O2 (3%MeOH/5%Et3N/toluen), uzyskując 5,21 g (74,3%) czystej fosforoamidyny. 3^]P NMR (CD3CN) δ 164,8, 165,4. N⁴-Benzfilo-3'-(trifenylometylo)amino-2',3'dideoksycytydyao-5'-(2-cyjanoetylo-2,2,6,6-tetrametylopiperydyao)fosfbroamidynę, 5c, oczyszczano na S1O2 (3%MeOH/5%Et3N/toluen), uzyskując 5,07 g (74,2%) czystego produktu i pewne frakcje mieszane. 3’p NMR (CD3CN) 8 164,8, 165,7. N2-2-Metylopropionylo3'(trifenylfmetylo)amino-2',3'-didefksyguaaozyno-5'-(2-cyjaaoetylo-2,2,6,6-tetrametylopiperydyno)fosforoamidynę, 5g, wytrącano w atmosferze argonu z 2 ml CH2Cl2przez dodawanie do energicznie mieszanego eteru etylowego (40 ml) i heksanu (40 ml) w temperaturze 4°C, w celu usunięcia zanieczyszczenia wodorofosfonoamidanem, który w tym przypadku nie może być usunięty metodą chromatografii kolumnowej. Osad odsączono, przemyto heksanem i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem. Wytrącanie powtórzono dwa razy i osad dalej oczyszczano na S1O2 (10%Et3N/CH2Cl2), uzyskuąc 0,89 g (12,8%) czystej fosforoamidyny. 3*P NMR (CD3CN) 8 165,2, 165,5. 3'-(Trifenylometylo)ammo-3'-deoksytymidyao-5'-(2-cyjanoetylo-2,2,6,6-tetrametylopiperydyno)fosforoamidyaę, 5t, oczyszczano na S1O2 (5%MeOH/5%Et3N/toluen), uzyskując 3,33 g (54,8%) czystej fosforoamidyny. 31p NMR (CDCb) δ 165,3, 166,1.

Przykład VII

Wytwarzanie 3' -(trifenylometylo)amino-2' ,3' -dideoksynukleozydów©' -sukcynilanowych, 6a, 6c i 6t:

Do 1,5 mmola 3'-trifenylometyloamino-2',3'-dideoksynukleozydu (3t, 3c lub 3a) w 5 ml CH2CI2, dodano 0,22 g (1,8 mmola) N,N-dimetyloaminopirydyay, a następnie 0,18 g (1,8 mmola) bezwodnika bursztynowego. Po mieszaniu w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, reakcję zatrzymano dodaniem 0,6 ml metanolu, mieszaninę rozcieńczono CH2CI2 i ekstrahowano 10% roztworem kwasu cytrynowego, wodą i nasyconym wodnym roztworem NaCl. Warstwę organiczną wysuszono (N^SO^, przesączono i zatężono do postaci piany. N⁶-Benzoilo-3'-(trifenylometylo)amino-2',3 '-dideoksyadenozyno-5'-sukcyailaa, 6a. Wydajność 1,15 g (100%). N⁴-Beazoilo-3'-(trifenylometylo)aminf-2',3'-didefksycytydyno-5'-sukcyailan, 6c. Wydajność 0,77 g (76,3%). 3'-(Trifenylometylo)amino-3'-defksytymidyno-5'-sukcyailan, 6t. Wydajność 0,77 g (76,3%).

Przykład VIII

Wytwarzanie 3'-(trifenylometylo)aminf-2',3'-dideoksyaukleozydów-5'-sukcynilfwaaych osadzonych na CPG.

Do 1 mmola 3'-(trifenylometylo)amino-2',3'-dideoksynukleozydu-5'-sukcyailanowego (6a, 6c lub 6t) i 0,13 g (0,95 mmola) 1hydroksybenzotriazolu w 5 ml N-metylopirolidyny i 5 ml DMSO dodano 0,35 ml (2,0 mmola) N,N-dizopropylfetyloamiay, a następnie 0,36 g (0,95 mmola) heksafluorofosffranu 2-(lH-benzotriazol-1-ilo)-1,13,3-tetrametylouronu. Roztwór mieszano 5 minut, dodano 10,0 g aminopropylf-CPG i trzymano 6 godzin na wytrząsarce. CPG przesączono i przemyto DMF, metanolem i eterem etylowym. Nieprzereagowane grupy aminowe w CPG acylowano, stosując przez 30 minut standardowe roztwory przykrywające ABI. Wypełnienie glukozydami, oznaczone próbą trifenylometylową przy 432 nm w 20% TFA/CHCI3,

183 661 przy zastosowaniu molowego współczynnika ekstynkcji 40,7 μιηοΓ cm , wynosiło 38,6 pmol/g dla A, 33,6 μιηοΐ/g dla C i 29,0 pmol/g dla T.

Przykład IX

Pomiary stałej równowagi Ki tetrazolowej aktywacji.

Równowagę przedstawioną równaniem 1 badano rozpuszczając N-benzoilo-3'-(trifenylometylo)amino-deoksyadenozyno-5'-(2-cyjanoetylo-N,N-diizopropylo)fosforoamidynę (4a,

56,1 mg, 65,2 gmola) w 0,300 inl bezwodnego deuteroacetonitryiu i dodając 0,300 ml 0,5 M roztworu tetrazolu w acetonitrylu, wszystko w atmosferze argonu. Roztwór przeniosiono do probówki NMR w atmosferze argonu. Po 2 minutach zarejestrowano widmo ^TIP-NMR przedstawione na fig. 1.

Widmo składa się z przejść rezonansowych odpowiadających monomerowi fosforoamidynowemu (143,07, 143,72 ppm), tetrazolidyloamidynowemu produktowi pośredniemu (127,58 ppm), wodorofosfonianowi (10,24, 9,6 ppm), będących rezultatem hydrolizy części monomeru (przez tetrazolidyloamidynowy produkt pośredni) i pobocznych reakcji przebiegających w niewielkim stopniu. Przyjęto, że całkowita suma tych produktów jest równa początkowemu stężeniu fosforoamidyny 0,0993 M i stężenia w stanie równowagi były liczone ze względnych rezonansów indywidualnych. Stężenia produktów nie zawierających fosforu i dlatego nie pojawiających się w widmie, liczono w sposób następujący. Przyjęto, że stężenie diizopropyloamono tetrazolidu w stanie równowagi (0,0824 M) jest równe stężeniu początkowemu (0,0993 M) minus równowagowe stężenie (0,0169 M) monomeru fosforoamidynowego. Przyjęto, że stężenie tetrazolu w stanie równowagi (0,0875 M) jest równe początkowemu stężeniu tetrazolu (0,2286 M) minus suma stężenia pośredniego produktu tetrazolidyloamidyny (0,0587 M) i stężenia diizopropyloamono tetrazolidu (0,0824 M). Stałą równowagi Ki tetrazolowej aktywacji obliczno w sposób następujący:

_ [Tetrazolidyloamidyn][R2NH2 tetrazolid'] _ (0,0587 M)(0,0824 M) _ ₄ [Tetrazol]2 [monomer amidynowy] (0,0875 M)² (0,0169 M) ’

Powyższe doświadczenie powtórzono stosując monomer 3'-trifenylometylo-aminotymidyno-5' -diizopropyloamonofosforoamidynowy (4t), stwierdzając że stała Ki wynosi 56,2 M'1 Doświadczenie powtórzono jeszcze raz, stosując monomer 3'-trifenylometyloaminotymidyno-5'-tetrametylopiperydynylo fosforoamidynowy (5t). Widmo ³¹P-NMR przedstawono na fig.2.

W warunkach doświadczenia nie wykryto w stanie równowagi obecności monomeru tetrametylopiperydynylo fosforoamidynowego (spodziewany przy 165,3, 166,1 ppm). Monomer powinien być wykrywalny powyżej poziomu szumów widma, jeśli jego stężenie wynosiłoby przynajmniej 0,19 mM. Opierając się na tym można wyliczyć, że Ki dla tej równowagi musi mieć wartość przynajmniej 5260 M' ^r, albo być 93 razy większa niż w przypadku monomeru diizopropyloaminofosforoamidynowego. Doświadczenie powtórzono jeszcze raz stosując mnomer 3' -trifenylometylo-aminotymidyno-5' -(N-izopropylo-N-t-butylo)amidynowy. Tak jak w przypadku monomeru tetrametylopiperydynylo fosforoamidynowego, monomer ten w stanie równowagi nie był wykrywalny w widmie ^'P-NMR.

Przykład X

Synteza oligo-2'-deoksynukleozydów N3' — P5' fosforoamidanowych na skalę 1-pmolową, przy zastosowaniu monomerów diizopropyloaminofosforoamidynowych:

Oligonukleotydy N3' -» P5' fosforoamidanowe wytwarzano na skalę 1-pmolową na urządzeniu do syntez ABI 392 DNA i oczyszczane metodą preparatywnej chromatografii na wymieniaczach jonowych. Syntezy dokonywano w kierunku 5' do 3' (zamiast 3' do 5', jak zaprogramowane są urządzenia do syntez znajdujące się w handlu), stosując w kolumnie 1 ol 3'-(trifenylometylo)amino-2',3'-dideoksynukleozydu-5'-sukcynilowanego CPG. Monomery 3'trifenylometyloammo-5'-diizopropylofosforoamidynowe przygotowywano w postaci 0,1 M roztworów w acetonitrylu (PE Applied Biosystems, Foster City, CA). Roztworem usuwającym grupę trifenylometylową był 3% kwas dichlorooctowy (DCA) w dichlorometanie (DCM), a roztworem utleniającym był 0,1 M jod w roztworze tetrahydrofuran/pirydyna/woda w stosunku objętościowym 75:20:2 (Pe Applied Biosystems, Foster City, CA).

183 661

Oligonukleotydy N3' —> P5' fosforoamidanowe syntezowano stosując powtarzający się cykl syntez składający się z etapu odszczepiania grupy trifenylometylowęj, po którym następuje sprzęganie, utlenianie, sprzęganie, utlenianie. Odszczepianie grupy trifenylometylowęj od grupy 3'-aminowej nukleozydu osadzonego na nośniku osiągano stosując 40 sekundowy przepływ 3% DCA/DCM dla nukleozydów G i A oraz 50 sekundowy dla nukleozydów T i C. Związany z nośnikiem 3'-aminonukleozyd przemywano następnie sześciokrotnie kombinacją 10 sekund przepływ acetonitrylu/5 sekund przepływ argonu. Sprzęganie aminy z nukleozydem 5'-fosforoamidyno-3'-trifenylometyloaminowym osiągano przez zmienne dostarczanie do kolumny monomer plus tetrazol i sam tetrazol przez około 10 sekund, z następczym 5 minutowym odczekaniem. Monomer usuwano z kolumny argonem, po czym dodawano natychmiast roztwór jodu, z następczym odczekaniem 2 minutowym. Po zakończeniu utleniania rosnący oligomer związany z nośnikiem przemywano jeden raz kombinacją 20 sekundowego przepuszczania acetonitrylu/5 sekundowego przepuszczania argonu i 5 razy kombinacją 10 sekundowego przepuszczania acetonitrylu/5 sekundowego przepuszczania argonu. Sprzęganie i utlenianie powtarzano dodtkowo jednokrotnie, z następczym przemywaniem przed odszczepianiem grupy trifenylometylowęj. Stosując tę procedurę stosowane jest około 15 równoważników (w porównaniu do początkowej ilości związanego z nośnikiem nukleozydu) monomeru na każdy etap sprzęgania; stąd około 30 równoważników monomeru jest używane w każdym cyklu syntezy.

Po zakończeniu syntezy, związany z nośnikiem oligonukleotyd N3' — P5' fosforoamidanowy z odszczepioną grupą 3'-trifenylometylową był odszczepiany od nośnika i usuwane były zasadowe grupy zabezpieczające, przez działanie stężonym wodnym roztworem amoniaku w temperaturze około 55°C przez 12 godzin. Odszczepiony i obezpieczony oligonukleotyd N3' -» P5' fosforoamidanowy usuwano z CPG i CPG przemywano dwukrotnie 200 pl amoniaku. Wszystkkie partie amoniaku użyte do przemywania połączono, roztwór zbuforowano 0,01 M NaOH i amoniak usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Po przesączeniu, surowy oligonkleotyd oczyszczono na preparatywnej kolumnie z anionowym wymieniaczem jonowym (Pharmacia MonoQ 10/10), pozbawiono soli na Sephadex G-25 (Pharmacia NAP-5) i poddano liofilizacji.

Sekwencje wyszczególnione poniżej zsyntezowano na urządzeniu do syntez ABI 392, stosując albo metodę wymiany fosforoamidynowyh grup aminowych według wynalazku, albo metodę utleniającego sprzęgania Athertona-Todda, np. opisaną przez Letsingera i innych w patencie Stanów Zjednoczonych 5 476 925. Wyniki są pokazane w poniższejej tabeli i zilustrowane na fig.3a i 3b, które przedstawiają chromatogramy rozdzielania dwóch sekwencji zamieszczonych w tabeli, metodą HPLC z wymieniaczem jonowym.

Sekwencja1	SEQ ID NO	Metoda	Surowe OD	Czystość HPLC	Wydajność (jednostki OD)
T15	3	wymiana amin	74	56%	41
T,5	3	Atherton-Todd	49	29%	14
A15	4	wymiana amin	101	39%	39
A15	4	Atherton-Todd	86	8%	7
5'-96 42% 40	5	wymiana amin	96	42%	40
AACGAGTTGGGGCAT
5'-TTCTCTCTCTA	6	wymiana amin	71	62%	44

'Sekwencje syntezowane metodą utleniającego sprzęgania Athertona-Todda mają końcową grupę 3'-hydroksylową, podczas gdy sekwencje syntezowane metodą wymiany grup aminowych mają końcową grupę 3'-aminową.

183 661

Przykład XI

Synteza oligo^-deoksynukleozydów N3' — P5' fosforoamidanowych na skalę 1-pmolową, przy zastosowaniu monomerów diizopropyloaminofosfozoamiayaowych: porównanie metody sprzęganie/utlenianie z metodą sprzęganie/ utleaiaaie/spzzęgaaie/utleaiaaie:

Porównanie wpływu jaki mają na wydajność otrzymywania produktu pojedynczy etap sprzęganie/utlenianie i podwójny etap sprzęganie/utlenianie (sprzęganie/utlenianie/sprzęganie/utlenianie) dokonano w sposób następujący:

Sekwencję 5'-AAC-ATG'GAG-AGC'GTC'3' (SEQ ID NO: 7) zsyntezowano wychodząc z monomerów diizopropyloamino fosforoamidynowych, przy zastosowaniu powyżej opisanej procedury, i wyniki porównano z drugą syntezą, podobną do powyższej, ale z następującymi odstępstwami: 1) zastosowano pojedynczy etap sprzęganie/utlenianie w cyklu (w miejsce dwóch), 2) stężenie roztworu monomeru wynosiło 0,2M (zamiast 0,1 M). Z tego powodu, w doświadczeniu z pojedynczym etapem sprzęganie/utlenianie w każdym cyklu syntezy używano około 30 równoważników monomeru, podczas gdy w doświadczeniu z podwójnym etapem sprzęganie/utleniaaie/sprzęgαaie/utleniαaie używano około 15 równoważników monomeru w każdej z dwóch operacji sprzęgania, z tą samą sumaryczną liczbą około 30 równoważników monomeru na cały cykl syntezy. Wyniki przedstawione poniżej demonstrują polepszoną wydajność przy stosowaniu metody 2 x (sprzęganie/utlenianie).

Metoda	Surowy OD	x Czystość HPLC	= Wydajność (jednostki OD)
sprzęganie/utlenianie	113	21,3%	24,1
2x(sprzęganie/utlenianie)	115	29,4%	33,8

Przykład XII

Synteza oligo-^-deoksynukleozydów N3' — P5' fosforoamidanowych na skalę 1- (molową: porównanie metody bez stosowania operacji przykrywania, metody z przykrywaniem bezwodnikiem octowym i metody z przykrywaniem bezwodnikiem kwasu izomasłowego.

Sekwencję 5'-AAC-ATG'GAG'AGC-GTC'3' (SEQ ID NO: 7) zsyntezowano trzy razy na skalę 1-((molową stosując powyższą procedurę, wprowadzając w dwóch syntezach w każdym cyklu 60 sekundową operację przykrywania, po etapie ostatniego utleniania i przed odszczepieniem zabezpieczającej grupy trifenylometylowej. W jednym doświadczeniu jako czynnik przykrywający stosowano bezwodnik octowy/NMI (PE Applied Biosystems, Foster City, CA), a w drugim bezwodnik kwasu izomasłowego (1:1:8 bezwodnik kwasu izomasłowego^ó-lutydyna/THF^MI (PE Applied Biosystems, Foster City, CA). Wyniki przedstawione poniżej demonstrują polepszoną wydajność i czystość produktu przy stosowaniu operacji przykrywania.

Operacja przykrywania	Surowy? OD x	Cyystość HPLC -	Wydajność (jednostki OD)
Bez przykrywania	97	29,6%	28,7
Bezwodnik octowy	97	39,6%	38,4
Bezwodnik izomasłowy	82	33,6%	32,5
Przykład XIII

Synteza oligo-2'-deoksynukleozydów N3' — P5’ fosforoamidanowych na skalę 1 -(molową: porównanie utleniania J₂ i H₂O₂

Następujące sekwencje syntezowano na skalę 1-(molową stosując powyższą procedurę, jednakże w jednej serii doświadczeń jodowy reagent utleniający zastąpiono czynnikiem utleniającym składającym się z 1,5% H₂02/3,5%H20/2C⁰/opizydyaa/ 75%THF. W doświadczeniach tych nie stosowano operacji przykrywania.

183 661

Sekwencja	Czynnik utleniający	% produktu o pełnej długości	% sekwencji z błędem „N-1”
5'-TTTTT	J2	76,94	5,11
5'-TTTTT	H2O2	50,05	2,55
5-TAAAA	J2	73,05	4,28
5-TAAAA	H2O2	78,72	2,69

Przykład XIV

Synteza oligo-2'-deoksynukleozydów N3' P5' fosforoamidanowych na skalę 1-pmolową:

porównanie monomerów diizopropylo i tetrametylopiperydynylo fosforoamidynowych.

Stosowano następującą ogólną procedurę syntezy na skalę 1-pmolową:

Oligonukleozydy N3' — P5' fosforoamidanowe na skalę 1-pmolową wytwarzano stosując zmodyfikowne urządzenie do syntez 390Z ABI DNA, oczyszczając je metodą preparatywnej chromatografii na wymieniaczach jonowych. Monomery 3'trifenylometyloamino 5'fosforoamidynowe przygotowywano w postaci 0,1 M roztworów w acetonitrylu; aktywatorem był 0,15M tetrazol w acetonitrylu; roztworem odszczepiającym trifenylometylową grupę zabezpieczającą był 3% kwas dichlorooctowy (DCA) w dichlorometanie (DCM), a roztworem utleniającym był 0,1 M jod w mieszaninie tetrahydrofuran/pirydyna/woda o stosunku objętościowym 75:20:2 (PE Applied Biosystems, Foster City, CA).

Oligonukleotydy syntezowano stosując periodyczną metodę powtarzalnych cyklów syntezy, obejmujących odszczepianie trifenylometylowej grupy zabezpieczającej, po którym następowało sprzęganie i utlenianie. Poszczególne moduły sekwencji rozpisywano i łączono tworząc całkowity cykl syntezy. Szczegółowiej, syntezę przeprowadzano w kierunku 5' do 3', stosując 10 pmoli 3'-(trifenylometylo)amino-2',3'-dideoksynukleozydu-5'-sukcynilowanego CPG. Odszczepianie trifenylometylowej grupy zabezpieczającej od grupy 3'-amonowej osiągano przez powtarzający się przepływ 3% DCA/DCM na szczyt naczynia reakcyjnego, po którym następowało 3 sekundowe wirowe mieszanie i odciąganie reagentu. Całkowity czas działania kwasu wynosił około 2 minut. Następnie 3'-aminonukleozydy związane z nośnikiem przemywano 10 razy serią zmiennych przemywań od dołu naczynia reakcyjnego oraz od szczytu tego naczynia, z mieszaniem wirowym i odciąganiem reagenta. Sprzęganie wytworzonej wolnej aminy (prawdopodobnie jako jej soli dichlorooctanowej) z monomerem 3'(trifenylometylo)aminonukleozydu-5’-fbsforoamidynowego dokonywano stosując początkowe doprowadzanie monomeru do naczynia reakcyjnego, po którym następowało doprowadzenie tetrazolu. Mieszanie sprzęgającą mieszano następnie ruchem wirowym przez 5 minut. Po odciągnięciu reagentów z naczynia reakcyjnego, dodawano natychmiast roztwór jodu i mieszano ruchem wirowym przez 2 minuty. Roztwór utleniający odciągano i nośnik 10 razy przemywano serią, zmiennych przemywań acetonitrylem od dołu naczynia reakcyjnego oraz od szczytu tego naczynia, z mieszaniem wirowym i odciąganiem reagentu.

Po zakończeniu syntezy, oligonukleotyd z usuniętą grupą zabezpieczającą w pozycji 3' odszczepiano od nośnika i stężonym roztworem amoniaku w 55°C przez 12 godzin usuwano pozostałe grupy zabezpieczające. Roztwór buforowano 0,01 M NaOH i usuwano amoniak pod zmniejszonym ciśnieniem. Po przesączeniu, surowy roztwór oczyszczano na preparatywnej kolumnie z anionowym wymieniaczem jonowym (Pharmacia MonoQ 10/10), odsalano i poddawano liofilizacji.

Stosując powyższą metodę zsyntezowano dimery 5'-TT-3' na skalę 10 pmolową, stosując różne stężenia (a zatem zmienną liczbę równoważników) tetrazolu i albo monomeru diizopropylo fosforoamidynowego, albo monomeru tetrametylopiperydynylo fosforoamidynowego. Wyniki jasno wskazują na to, że synteza fosforoamidanowa może być dokonywana przy zastosowaniu znacznie mniejszej liczby bardziej skutecznego monomeru tetrametylopiperydynylo fosforoamidynowego niż mniej skutecznego monomeru diizopropylo fosforoamidynowego.

183 661

Rodzaj monomeru	Liczba równoważników monomeru	Liczba równoważników tetrazolu	% Dimeru	% nieprzereagowanego monomeru
diizopropylowy	10	50	93,8	2,4
diizopropylowy	5	50	89,1	5,0
diizopropylowy	2,8	28	87,1	8,0
diizopropylowy	2,8	7	82,9	14,0
tetrametylopiperydynowy	2,8	7	94,2	2,8

Przykład XV

Synteza oligf-2'-deoksyaukleozydów N3' — P5' fosforoamidanowych na skalę 10-pmolową.

Zsyntezowano następujące sekwencje na skalę 10-pmolową, przy zastosowaniu powyższej procedury i stosując następujące ilości monomeru tetrametylopiperydynylo fosforoamidynowego.

Sekwencja	Liczba równoważników monomeru na cykl	Wydajność HPLC (%)
5-TT1	4	94,0
5’-AA1’2	4	98,1
5'-CCu	4	96,9
5'-CCC2	4	93,2
5'-TTTT	2,8	82,7

Ten oligonukleozyd odszczepiano od nośnika z końcową trifenylometylową grupą zabezpieczającą pozostającą na dimerze.

Wydajność HPLC jest skorygowana na benzamid tworzący się przy usuwaniu benzoilowej grupy zabezpieczającej zasadę.

Przykład XVI

N^{1 2 * 4}Benzoilo-2' fluoro-3' -(4-metfksytrifenylometylo)amino-2' ,3' -dideoksywydyno 5'(2-cyjanoetylo N^-diizopropylofosforoiamidyna.

Monomery 2'-fluoronuklefzydo fosforoamidynowe według wynalazku wytwarzane są w sposób zilustrowany na schematach V i VI. W skrócie, rybonukleozyd jest przekształcany w 5'-hydroksylo(zabezpieczoay)-2',3'-anhydroksylonukleozyd, po czym otwierany jest pierścień 2',3'-epoksy przez potraktowanie azydkiem sodu lub podobnym reagentem, z utworzeniem 5'hydroksylo(zabezpieczony)-3' -azydo-3' -defksyarabinonukleozydu. Po oczyszczeniu, 5' hydroksylo(zabezpieczony)-3' -azydo-3' -defksyarabinonuklefzyd jest fluorowany w pozycji 2', przez potraktowanie trifluorkiem dietyloaminosiarki (DAST) lub podobnym reagentem, po czym grupa azydowa jest redukowana, dając grupę 3'-aminową. Po odpowiednim zabezpieczeniu grupy 3'-aminowej i uwolnieniu grupy zabezpieczającej 5'-hydroksyl, nukleozyd jest fosfilowany przy tlenie w pozycji 5', przez co uzyskuje się surowy monomer fosforoamidynowy.

183 661

Schemat V

O

NH, F 11

,)ΜΛ οκα,Η,ο

b) NaOBz ^d> NH4OH

O

MMTcNH F

Γ2

e) NH«N,

f) DAST

O

MMTcNH F 2u

l) H,. WC 9 NaOH. H,0

h) MMTcCl J) CEOPWfthh

Odnosząc się do schematu V, do urydyny 3 wprowadza się grupę mesylową i selektywnie benzylową, czemu przy działaniu benzoesanu sodu towarzyszy tworzenie się pierścienia 2,2'-anhydrocyklicznego, zgodnie z procedurą literaturową, np. Codington J.F., Fecher R., Fox J.J., J. Am. Chem. Soc. 1960, 82, 2794-2803. Wynikiem tych reakcji jest związek 7, przy sumarycznej wydajności 69-77%. Zgodnie z inną metodą znaną z literatury (Codington J.F., Fecher R., Fox J.J., J.Organie Chem., 1962, 27,163-167), 2,3'-anhydroarabinonukleozyd 7 przekształcano w dwóch etapach 2',3'anhydrolyksourydynę 8. Obejmuje to potraktowanie związku 7 kwasem solnym z utworzeniem 3'-mesylo-5'-benzoiloarabinourydyny, która pod wpływem wodorotlenku amonu tworzy lykso-2',3'-epoksyd 8, z całkowitą wydajnością 6377%. Następnie, również zgodnie z opublikowaną procedurą (Reichman U., Hollenberg D.H., Chu C.K., Watanabe K.A., Fox J.J., J.Organic Chem., 1976, 41, 2042-2043), 2',3'anhydrolyksonukleozyd 8 ogrzewano z azydkiem amonu. W przeciwieństwie do sugestii literaturowych, reakcja ta nie była całkowicie stereoselektywna, lecz tworzyła się nie poddająca się chromatograficznemu rozdzielaniu mieszanina pożądanego 5'-benzoilo-3'-azydoarabinonukleozydu 9 i jego 2'-azydo-2'-deoksyregioizomeru 9i w przybliżonym stosunku 2,5:1. Nieoczyszczony arabinonukleozyd 9 fluorowano za pomocą DAST, uzyskując 2'-fluoro-3'nukleozyd 10, następnie katalitycznie uwodorniany do 2'-fluoro-3'-aminonukleozydu 11, który może być oddzielony od swego regioizomeru metodą chromatografii na żelu krzemionkowym. Zabezpieczanie 3'-aminy grupą monometoksytrifenylometyłową (MMT), z następczym usuwaniem grupy 5'-benzoilowej wytwarzało produkt pośredni 13, z którego przez 5'183 661 fosfitylację wytwarzano poż,dany blok 2u, z calkowit, wydajnością 22%, wychodząc z anhydronukleozydu 8. Szczegółowiej, poszczególne etapy przeprowadzano w sposób następujący:

3'-0-Metanosulfonylo-5'-O-benzoilo-2,2'anhydroarabinourydynę 7 wytwarzano z związku 3 w dwóch etapach, zgodnie z procedur, podan, przez Codingtona i innych (cytowani powyżej, J. Am. Chem. Soc.), przy całkowitej wydajności 69-77%.

5'-0-Benzoilo-2',3'-anhydrolyksourydynę 8 wytwarzano ze związku 7 w dwóch etapach, zgodnie z procedur, podan, przez Codingtona i innych (cytowani powyżej, J.Organic Chem.), przy całkowitej wydajności 63-77%.

3'-Azydo-5'-O-benzoilo-3'-deoksyarabinourydynę 9 wytwarzano ze związku 8 i bezwodnego NH4N3 (opisanego w publikacji Obenlanda C.O., Mangolda D.J., Marino M.P. Inorg. Synth. 1966, 8, 53-56), zgodnie z procedur, podaną przez Reichmana i innych (cytowani powyżej), ale bez zakończonej sukcesem krystalizacji. Sumaryczna wydajność była 98% lub większa, ale widmo NMR sugeruje, że 25-35% tej ilości jest regioizomerem - 2'-azydo-5'-0-benzoilo-2'-deoksyksylourydyna_t, 9i, wymywan, razem z pożądanym produktem w TLC na żelu krzemionkowym. 'HNMR, składnik główny 9: δ 10,8 (br s, 1H), 8,11 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,68 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,62 (d, J = 7,3 Hz, 1H), 7,5 (m, 2H), 6,19 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 5,40 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 4,84 (m, 1H), 4,73 (d, J - 5,7 Hz, 1H), 4,63 (br d, J - 4,2 Hz, 1H), 4,2 (mm, 2H); składnik dodatkowy 9i: 8 10,6 (br s, 1H), 8,11 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,81 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,64 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 7,5 (m, 2H), 5,85 (s, 1H), 5,47 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 4,96 (m, 1H), 4,76 (d, J - 5,4 Hz, 1H), 4,62 (br d, J - 4,0 Hz, 1H), 4,3-4,2 (mm, 2H).

2'-Fluoro-3'-azydo-5'-O-benzoilo-3'-deoksyurydynę 10 wytwarzano w sposób następujący: Do 5,0 g (13,4 mmoli) nieoczyszczonego związku 9 (zawierającego 25% 9i) w 30 ml bezwodnego CH2CI2 dodano 8,8 ml (66,6 mmoli) trifluorku dietyloaminosiarki. Po mieszaniu w ciągu 48 godzin, mieszaninę rozcieńczono 100 ml CH2CI2 i wlano j, do 200 ml nasyconego wodnego roztworu NaHCO3. Po zaprzestaniu wydzielanie się gazu, warstwę CH2CI2 przemyto 100 ml świeżego roztworu NaHCO3, a następnie wody (2 x 100 ml). Zatężanie warstwy CH2CI2 pod zmniejszonym ciśnieniem i chromatografia (flash chromatography) doprowadziły do uzyskania 3,5 g (70%) produktu zawierającego 20% izomerycznego zanieczyszczenia w dużym stopniu nie dającego się oddzielić chromatograficznie, 10i. ^!H NMR, składnik główny 10: 8 8,7 (br s, 1H), 8,07 (d, J = 7,4 Hz, 2H), 7,62 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 7,49 (dd, J = 7,6,7,6 Hz, 2H), 7,39 (d, J - 8,1 Hz, 1H), 5,70 (d, J = 21,1 Hz, 1H), 5,65 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 5,48 (dd, J = 4,7, 52,9 Hz, 1H), 47-4,4 (zła rozdzielczość), 4,32 (dd, J = 4,7, 9,5 Hz, 1H), 4,27 (dd, J = 4,7, 9,5 Hz, 1H); składnik dodatkowy 10i: 9 8,7 (br s, 1 H), 8,03 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 7,64 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,51 (dd, J = 7,4, 7,7 Hz, 2H), 7,33 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 5,99 (d, J = 6,4 Hz, 1H), 5,67 (d, J = 9 Hz, 1H), 5,40 (ddd, J = 2,8,5,0,53,4 Hz, 1H), 4,84,4 (zła rozdzielczość), 4,10(mm,2H).

2'-Fłuoro-3'-amino-5'-O-benzoilo-3'-dideoksyu:rydynę 11 wytwarzano w sposób następujący: Do 3,5 g (9,3 mmoli) nieoczyszczonego związku 10 (20% 10i) w 200 ml 95% etanolu dodano 600 mg 10/o palladu na węglu. Zawiesinę uwodorniano przy ciśnieniu 2,8-10⁵ Pa przez noc, a następnie usunięto katalizator przez odsączenie. Rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując 2,93 g (90%) jasno żółtej substancji, składającej się z dwóch związków rozdzielanych metodą TlC. Chromatograficznie (flash chromatography) uzyskano 1,96 g (60% wydajność) pożadanegpo produktu, w postaci czysto białej substancji stałej. Spektrometria masowa, FAB+ M + H obliczono: 350,1152, stwierdzono 350,1152. ’H NMR 8 8,14 (br s, 1H), 8,06 (d, J = 7,1 Hz, 1H), 7,64 (dd, J = 7,4, 7,4 Hz, 1H), 7,57 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,50 (dd 7,7, 7,8 Hz, 1H), 5,86 (d, J = 18,5 Hz, 1H), 5,51 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 5,00 (dd, J = 4,3, 52,4 Hz, 1H), 4,81 (dd J + 2,2,12,8 Hz, 1H), 4,73 (dd, J = 3,5,12,7 Hz, 1H), 4,14 (ddd, J - 2, 3, 10,2 Hz, 1H), 3,57 (ddd, J - 4, 10,5, 26,6 Hz, 1H); 'T NMR δ -198,3 (ddd, J = 18,5,26,4, 52,2 Hz).

2'-Fluoro-3' -(4-metoksytrifenylometylo)amino-2' ,3' -dideoksymydynę 12 wytwarzano w sposób następujący: Do 1,0 g (2,9 mmola) związku 11 w 50 ml bezwodnej pirydyny dodano 1,0 g (3,2 mmola) chlorku 4-metoksytrifenylometylu. Mieszaninę mieszano przez noc, dodano 5 ml nasyconego wodnego roztworu NaHCO3, i mieszaninę zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem do postaci oleju. Olej rozpuszczono w 125 ml octanu etylu, który przemyto wodą (3 x 100 ml) i zatężono powtórnie pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując 2,05 g piany.

183 661

Pianę rozpuszczono w mieszaninie 40 ml metanolu, 40 ml dioksanu i 10 ml wody. Do roztworu dodano NaOH (1 g, 25 mmola), mieszano przez całą noc i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem do syropu, który rozpuszczono w 100 ml octanu etylu. Roztwór organiczny przemyto wodą (3 x 100 ml) i odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując 1,11 g piany, z której po procesie chromatograficznym otrzymano 1,05 g (76%) białej substancji stałej. Spektrometria masowa, FAB+ M + H+ obliczono: 518,2091, stwierdzono 518,2076. 1h NMR δ 8,64 (br d J = 4,2 Hz, 1 H), 8,14 (br s, 1H), 7,57 (mm, 5H), 7,48 (d J = 8,7 Hz, 1H), 7,3 (mm, 8H), 6,83 (d J = 8,8 Hz, 2H), 5,67 (d,J = 17,7 Hz, 1H), 5,62 (d, J - 8,1 Hz, 1H), 4,23 (m, 2H), 4,03 (br d, J = 10,2 Hz, 1H), 3,80 (s, 3H), 3,31 (dddd, J = 3,6,10,3,10,9,25,8 Hz, 1H), 2,80 (dd, J = 3,6,50,9 Hz, 1H), 2,51 (dd, J = 3,0,11,2 Hz, 1H); 'TF NMR 6 -192,5 (dddd, J “ 2,9,17,7,26,1, 50,9 Hz).

N4-Benzoilo-2' -fluoro-3' -(4-metoksytrifenylometylo)amino-2' ,3' -dideoksyurydyno 5'(2-cyjanoetylo N,N-diizopropylo)fosforoamidyn 2u wytwarzano w sposób następujący: Do 700 mg (1,35 mmola) związku 12 w 20 ml bezwodnego CH^bdodano 200 mg (1,17 mmola) diizopropyloamonowego tetrazolidu i 0,5 ml (1,57 mmola) 2-cyjanoetylo-N,NN',N'-tetraizopropylofosforodiamidyny. Po mieszaniu mieszaniny przez 3 godziny, odparowano rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałość oczyszczono na Chromatotronie, używając 4 mm płytki i wymywając 0-3% metanolem w 0,5% Metyloaminie w CH2CI2. Produkt zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem do oleju, który rozpuszczono w 10 ml CH2CI2 i wytrącano osad przez wolne dodawanie tego roztworu do 100 ml energicznie mieszanego heksanu. Po zdekantowaniu klarownego roztworu z nad osadu, produkt wysuszono w próżni nad P2O5, uzyskując 680 mg (70%) białego proszku. Spektrometria masowa, FAB+ M + H+ obliczono: 718,3170, stwierdzono 718,3194.¹⁹F NMR 6 - 190,9 (ddd, J = 21,7, 21,8, 51,3 Hz);¹⁹P NMR 5 150,5, 149,5.

Przykład XVII

N4-Benzoilo-2' fluoro-3' -(4-metoksytrifenylometylo)amino-2' ,3' -dideoksy-cytydyno 5'(2-cyjanoetylo N,N-diizopropylo)fosforoamidyna.

Nieoczyszczony produkt pośredni 10 zastosowano do wytwarzania właściwie zabezpieczonego cytydynowego fosforoamidynu 2c, jak pokazano to w poniższym schemacie VI. Zasadę uracylową 10 przekształcono w cytozynę adoptując metodę Divakara i Reese, J. Chem. Soc., Perkin. Trans, 1 1982, 1171-1176. Następne wprowadzenie grupy benzoilowej w pozycję 4-N i zredukowanie grupy 3'-azydowej do aminy daje związek 13, który można oddzielić od jego regioizomeru metodą chromatografii na żelu krzemionkowym. Zabezpieczenie grupy 3'aminowej grupą MMT, z następczym selektywnym usuwaniem grupy benzoilowej w pozycji 5'-O wytwarza produkt pośredni 15. Następna 5'-fosfitylacja prowadzi do pożądanej fosforoamidyny 2c, z 10% całkowitą wydajnością, bazując na anhydronukleozydzie 8.

Schemat VI

Zc

a) POdj, uiuoie.TCA: ΝΗ,ΟΗ

b) Bad

c) Hj. PdZC ^e> NaOH. Pyt/McOK/HjO: H^ł-Pyr<lowex

d) ΜΜΤιΟ 0 CEOPiNGPrhh

183 661

Szczegółowiej, poszczególne etapy przeprowadzano w następujący sposób:

N⁴,5'-0-Dibemzoilo-2'-fluoro-3'-amino2',3'-dideoksycytydynę 13 wytwarzano następująco: do 6,9 g (18,4 mmoli) nieoczyszczonego związku 10 (zawierającego 35% 10i) w 50 ml bezwodnego CH₃CN dodano oziębiony w łaźni z lodem roztwór 11,7 g (169 mmoli) 1 ,2,4triazolu i 3,35 ml (36,1 mmola) POCh w 90 ml bezwodnego CH3CN. Mieszaninę oziębiono na łaźni z wodą i lodem, dodano bezwodną trietyloaminę (23 ml, 165mmoli) i mieszając pozostawiono ją do ogrzania się do temperatury pokojowej. Po 90 minutach dodano 15 ml (108 mmoli) trietyloaminy i 4 ml wody i mieszaninę mieszano przez 10 minut. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem i dodano 250 ml octanu etylu. Metodą TLC wykazano obecność fluorescencyjnego produktu pośredniego o tej samej mobilności co materiał wyjściowy.

Mieszaninę odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując 6,7 g piany. Dodano dioksanu (100 ml) i 20 ml stężonego wodnego roztworu amoniaku .i po 3 godzinach mieszaninę odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskując żółty żel. Żel rozpuszczono w 100 ml octanu etylu i uzyskany roztwór przemyto wodą (3 x 200 ml). Przez zatężanie pod zmniejszonym ciśnieniem i suszenie w próżni nad P2O5 uzyskano 5,4 g substancji stałej, dającej tylko jedną plamkę przy TLC na żelu krzemionkowym. Przy 1⁹F NMR obserwowano tylko dwa znaczące sygnały, składnik główny: δ -192,8 (ddd, J = 22,8, 22,8 53,1 Hz); składnik dodatkowy: δ -200,7 (ddd, J = 13,6,19,9, 53,4 Hz).

Dodano bezwodną pirydynę (100 ml) i roztwór oziębiono do 4°C, po czym mieszając dodano chlorku benzoilu i roztwór pozostawiono do ogrzania się do temperatury pokojowej. Po 2 godzinach dodano 5 ml wody i odparowano rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując brązowy olej, który rozpuszczono w 200 ml octanu etylu. Wytworzony roztwór przemyto wodą (3 x 200 ml) i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując oleistą pianę.

Dodano do niej etanolu(150 ml) i 2 g 10% palladu na węglu aktywnym i mieszaninę uwodorniano przez noc przy 2,8 · 10⁵ Pa. Metoda tLc wykazała tworzenie się dwóch nowych, wolniej i blisko siebie przesuwających się związków.

Katalizator oddzielono przez odsączenie i przesącz zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując żółtą oleistą pianę. Chromatografia na żelu krzemionkowym (500 ml krzemionki, wymywanie 0-3% CH3OH w CH2CI2) dostarczyła 1,85 półczystego produktu, który rozpuszczono w 10 ml CH2CI2. Szybko wytrącił się osad, który odsączono i przemyto świeżym CH2CI2. Po wysuszeniu w próżni uzyskano 1,5 g produktu 13 (11% wydajność ze związków 9 i 9i), w postaci drobnych, białych kryształów. Spektrometria masowa, FAB+ M + H+, obliczono: 453,1574, stwierdzono 453,1574. ^lH NMR δ 8,21 (d, J = 7, Hz, 1H), 8,08-8,13 (mm, 3H), 7,94 (d, J - 7,4 Hz, 2H), 7,46-7,7 (mm, 8H), 6,04 (d,J -16,9 Hz, 1H), 5,08 (dd, J = 3,6, 51,5 Hz, 1H), 4,85 (dd, J = 3,3, 12,8 Hz, 1H), 4,80 (dd, J - 2,1, 12,8 Hz, 1H), 4,26 (m, 1 H), 3,48 (dm, J = 27 Hz, 1 H); ¹⁹F NMR 8 - 200,1 (m).

N⁴,5'^^-Bi^benz^oilo-2'-fluoro-3'-(4-metoksytrifenylometylo)amino-2',3'-dideoksycytydynę 14 wytwarzano w sposób następujący: Do 0,9 g (2,0 mmola) związku 13 w 25 ml bezwodnej pirydyny dodano 0,86 g (2,8 mmola) chlorku 4-metoksytrifenylometylu i roztwór mieszano przez noc. Reakcję przerwano dodatkiem 0,5 ml H2O i zatężono roztwór pod zmniejszonym ciśnieniem. Dodano CH2CI2 (50 ml) i roztwór przemyto 50 ml nasyconego wodnego roztworu NaHCCO oraz wodą (2 x 50 ml). Rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem' zastąpiono go 10 ml CH2CI2 i otrzymany roztwór pipetowano do 80 ml energicznie mieszanej mieszaniny heksanu i eteru 1:1. Po dodatkowym 2 godzinnym mieszaniu, produkt odsączono i wysuszono w próżni, uzyskując 1,3 g (88% wydajność) białego proszku. Spektrometria masowa, FAB+, M + H+ obliczono: 725,2775, stwierdzono 725,2761. *H NMR δ 8,59 (br s, 1 H), 8,07 (br d, J = 5,7 Hz, 1 H), 7,89 (br d, J = 7 Hz, 2H), 7,83 (dd, J = 1,3, 6,7 Hz, 2H), 7,68 (dd, J = 7,4 7,4 Hz, 2H), 7,5-7,6 (m, 8H), ,43 (dd, J = 2,1, 6,9 Hz, 2H), 7,1-7,3 (mm, 7H), 6,71 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 5,80 (d, J = 15,4 Hz, 1H), 5,03 (dd, J = 2,0, 13,0 Hz, 1H), 4,98 (dd, J = 2,3, 13,1 Hz, 1H), 4,41 (br d, J = 10,5 Hz, 1H), 3,63 (s, 3H), 3,36 (dddd, J = 3,1, 11,1 11,1 25,7 Hz, 1H), 2,84 (dd, J = 3,1,49,9 Hz, 1H), 2,52 (dd, J = 2,7,11,5 Hz, 1H); ¹⁹F NMR δ -196,3 (m).

183 661

N⁴'BenzoilO'2''fluozO'3''(4-metoksytrifenylometyloamiaO'2',3''dideoksycytydynę 15 wytwarzano w sposób następujący: Do 1,3 g (1,75 mmola) związku 14 w 20 ml mieszaniny pirydynaZ/metanol/woda 65:30:5, oziębionego na łaźni z lodem, dodano 10 ml zimnego 2M roztworu NaOH w mieszaninie pirydynaZ/metanol/woda 65:30:5. Mieszaninę mieszano na zimno przez 20 minut, zobojętniając ją następnie kationową żywicą jonowymienną Bio-Rad AG® 50W-X8, w formie soli pirydynowej -H. Po 20 minutach żywicę odsączono i przemyto metanolem. Połączony przesącz i metanol użyty do płukania zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskując olej, który rozpuszczono w 100 ml octanu etylu. Roztwór przemyto 100 ml nasyconego wodnego roztworu NaHCO.3 oraz wodą (2 x 100 ml). Po zatężeniu pod zmniejszonym ciśnieniem uzyskano pianę, którą rozpuszczono w 10 ml CH2CI2 i otrzymany roztwór pipetowano do 75 ml energicznie mieszanej mieszaniny heksanu i eteru 2:1. Produkt odsączono i wysuszono w próżni, uzyskując 1,13 g (102% wydajności) białego proszku. Spektrometria masowa, FAB , M + H+ obliczono: 753,1489, stwierdzono 753,1499. Ή NMR δ 8,30 (br d, J = 6,8 Hz, 1 H), 7,89 (br d, J = 6,7 Hz, 2H), 7,64 (dd, J = 7,4, 7,4 Hz, 1 H), 7,447,56 (mm, 9H), 7,22-7,32 (mm, 9H), 6,82 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 5,80 (d, J = 15,7 Hz, 1 H), 4,26 (mm, 2H), 4,13 (d, J = 10,2 Hz, 1 H), 3,81 (s, 3H), 3,26 (dddd, J = 3,4, 10,7, 10,8, 26,5 Hz, 1 H), 2,93 (dd, J = 3,3, 50,5 Hz, 1 H), 2,50 (dd, J = 2,8,11.0 Hz, 1 H); ¹⁹F NMR 8-195,3 (m).

N⁴-Benzoilo'2' fluoro-3' -(4-metoksytrifenylomeΐylo)αmiaO'2' ,3' -dideoksy-cytydyno 5'(2-cyjanoetylo N,N-dπzopzopylo)fosforoamidyaę 12c wytwarzano w sposób następujący: Do 970 mg (1,56 mmola) związku 15 w 25 ml bezwodnego CH2CI2 dodano 200 mg (1,17 mmola) diizopropyloamonu tetrazolidu i 1,0 ml (3,15 mmola) 2'cyjaaoetylo N/N^^NMetraizopropylofosforodiamidyny^. Po 3 godzinnym mieszaniu rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałość oczyszczono na Chromatotronie, używając 4 mm płytki i wymywając 0-1,5% metanolem w 0,5% trietyloamiaie w CH2CI2. Produkt zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem uzysjując pianę, którą rozpuszczono w 10 ml CH2CI2 i wytrącano osad przez wolne dodawanie tego roztworu do 40 ml energicznie mieszanego heksanu. Po zdekantowaniu klarownego roztworu z nad osadu, produkt wysuszono w próżni nad P2O5, uzyskując 880 mg (69%) białego proszku. Spektrometria masowa, FAB+, M + Cs⁺ obliczono: 953,2568, stwierdzono 953,2531. ^F NMR 8 - 193,6 (m); ^,!>P NMR 8 150,4, 149,4.

Przykład XVIII

N⁴-BenzoilO'2'-fluorΌ·-3'--(4-metoksytrifenylometylo)amiao-2',3'-dideoksycytydynO'5'' sukcynilo CPG.

Produkt pośredni 15 sukcynilowano w pozycji 5' i umieszczano na stałym nośniku CPG stosując standardowe procedury, np Atkinson T., Smith M. w Oligonucleotide Synthesis. A Practical Approach, Gait M. J. (redakcja), IRL Press, 1984, 35-81 oraz Knorr R., Trzeciak A., Bannwarth W., Gillessen D., Tetrahedron Lett. 1989, 30, 1827-1930. Szczegółowiej, N4benzoilo-2''fluorO'3'-metoksytrifenylometylo)ammO'2' ,3' -dideoksycytydyno^' -sukcynilo CPG wywarzano w sposób następujący: Do 100 mg (0,16 mmola) związku 15 w 2 ml bezwodnego CH2CI2 dodano 55 mg (0,55 mmola) bezwodnika bursztynowego i 65 mg (0,53 mmola) dimetyloaminopiiyd^yny. Roztwór mieszano 2 godziny i odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem do postaci oleju. Olej rozpuszczono w 20 ml CH2CI2, uzyskany roztwór przemyto 20 ml nasyconego wodnego roztworu NaHCOs i wodą (2 x 20 ml), po czym ponownie zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując pozostałość w postaci piany. Do piany dodano 1 ml 0,4M diizopropyloetyloaminy w mieszaninie DMSO/N-metylopirolidyaa 1:1, 0,7 ml 0,2M 1-hydroksyben:zotriazolu oraz 0,2M heksafluozofosfozaau 2-(lHbeazotriazol'1'ilo('113,3-tetrametylouroau w mieszaninie DMSO/N'metylopirolidyaa 1 1. Po 3 minutach, mieszaninę wciągnięto do 10 ml strzykawki zawierającej 1,2 g długołańcuchowego alkiloamino-CPG. Dodatkowo wciągnięto do strzykawki 5 ml przemywającego DMSO. Mieszaninę CPG-nukleozyd mieszano 1,5 godziny, a następnie CPG przemyto 5 objętościami bezwodnego acetonitrylu. Nieprzereagowane grupy aminowe CPG acylowano przez 2 minuty standardowymi roztworami przykrywającymi (PE Applied Biosystems, Foster City, CA). CPG ponownie przemyto 5 objętościami acetonitrylu i 5 objętościami CH2CI2. Zawartość nukleozydów oznaczona standardową próbą z trifenylometylem wynosiła około 5 (moli/g.

183 661

Przykład XIX

Synteza oligo-2'-fluoronukleftydów N31 -» P5' fosforoamidanowych w fazie stałej.

01igo-2'-fluoronukleotydy N3' — P5' fosforfamidaaowe syntezowano na stałym nośniku, stosując monomery fosforoamidynowe ze schematów V i VI. Związki 22-25 (Tabela 1) zsyntezowano na drodze monomerów fosforoamidynowych. Przeciętna wydajność sprzęgania oznaczona próbą uwolnienia kationu MMT wynosiła około 94% przy pojedynczym sprzęganiu na cykl i około 96% przy podwójnym stosowaniu etapu 2 w cyklu syntezy. Reprezentatywny profil IE HPLC syntezy surowego oligomeru pokazano na fig.4.

Jednolicie zmodyfikowane oligo-2'-fluoronukleotydy N3' — P5' fosforo-amidanowe wytwarzano na drodze reakcji amidynowego transferu na urządzeniu syntezującym ABI 380B, stosując następującą procedurę:

1) usuwanie tTifenylometylowej grupy zabezpieczającej, 5% kwas dichlorooctowy w dichlorometanie, 1 minuta.

2) sprzęganie. 0,1 M fosforoamidyny 2u lub 2c (odpowiednio schemat V lub VI) i 0,45N tetrazol w acetonitrylu, 3 minuty.

3) utlenianie, 0,1 M jod w mieszaninie tetrahydrofUraa/pirydyaa/wfda o stosunku objętościowym 10:10:1,1 minuta.

4) przykrywanie, acylowanie nieprzereagowanych grup 3'-aminowych standarowymi roztworami przykrywającymi PE Applied Biosystems (Foster City, CA), 30 sekund.

Po chemicznych etapach cyklu następowało przemywanie acetonitrylem i przedmuchiwanie suchego argonu przez 0,2-0,4 minuty. Po odszczepieniu od stałego nośnika i usunięciu grup zabezpieczających pod wpływem działania stężonego wodnego roztworu amoniaku przez 1-1,5 w 55°C, oligonukleozydy analizowano i oczyszczano metodą IE HPLC. Oligonukleozydy bezpośrednio po oczyszczeniu odsalano na żelowej kolumnie filtracyjnej Pharmacia AP-5 lub NAP-10, i przechowywano w stanie zamrożonym lub liofilizowanym w -18°C.

Wytwarzanie 5'-fosforylowanych oligonukleftydów dokonywano na sulfonowych pochodnych CPG, np. Gryaznov S.M., Letsinger R.L., Nucleic Acids Res., 1993, 21, 1403-1408.

Przy analizie IE i oczyszczaniu fligoaukleftydów stosowano system Dionex DX300 lub DX500. Przy analizie i oczyszczaniu surowych oligomerów używano kolumny Pharmacia MonoQ 10/10, wymywanej z gradientem 2% na minutę 1,5 M NaCl w 10 mM NaOH. Kolumnę Dionex NucleoPac PA100, wymywaną z gradientem 1,5% na minutę 1,5 M NaCl w 10 mM NaOH stosowano we wszystkich innych analizach IE HPLC. Przy RP HpLC stosowano 5 μ/kolumnę Hewlett Packard Hypersil ODS system Waters HPLC z gradientem 1% na minutę acetonitrylu w 0,1 M octanie trietyloamonu o pH 7,0.

Widmo NMR rejestrowano na spektrometrze Bruker DRX-400. Przesunięcia chemiczne odnoszone są względem TMS, CCKF i H3PO4, odpowiednio dla widma *H, 1⁹F i 31p

Cienkowarstwową, chromatografę (TLC) przeprowadzano na poliestrowych płytkach Whatmana z żelem krzemionkowym i metaaolo/dichlorfmetaaowym eluentem.

Kwasową hydrolizę 0,17 OD260 dimeru dU^pT dokonywano w 25 μΐ 64% kwasu octowego w czasie 2 godzin w 55°C, a mieszaniny reakcyjne analizowano metodą RP HPLC. W przybliżeniu 83% dimeru, czas retencji (Rt) 15,0 minut, zhydrolizowało głównie do kwasu 5'-tymidylowego, Rt 10,6 minut, i 2'-flufro-3'aminourydyay, Rt 11,2 minuty, jak było to zidentyfikowane przez wspólne wstrzyknięcie ze standartami. W mieszaninie reakcyjnej stwierdzono także obecność około 7,5% tymidyny, Rt 12,1 minuty.

Tabela 1

Oligonukleotydy i wartości Tm ich dupleksów

Doświadczenie	Oligonukleotyd8	Nr	SEOID NO	Tm°Cb DNAC	Tm°Cb RNAC
1	2	3	4	5	6
1	UUUUUUUUUT	18	8	16,7; 24,6	17,9; 20,3
2	U„pUnpUnpUnpUnpUnpUnpUnpUnpT	19	8	18,5; 38,2	38,1; 47,2
3	UnpUnpUnpUnpUfUnpUnpUnpUnpT	20	8	20,0; 41,0	40,1; 49,3

183 661 dalszy ciąg tabeli 1

1	2	3	4	5	6
4	Unp^npUnpUfDpUfnpUnpUnpUnpUnpT	21	8	23,4; 44,6	44,5; 52,7
5	Ujf„pufnpufnpunpufnpi^^fnJ^^fnpGr„piUnp'r	22	8	34,6; 63,0	55,2; 64,6
6	Uf llf TTf Uf Uf UJf Uf Uf lJf uf p*-* np'-' np'-' np'-' np'-' np'-' np'-' np'-' np'-' np'-' np	23	9	39,5; 63,2	56,4; 64,0
7	CjpUfpUpp^-^U^^^CfpUnpUppA	24	10	44,2;-	66,0;-
8	cf pjf pTf cf tL pp c- π- tt- a np'-' np'-' np'—' np'-' np'-' np'-' np'—' np'-' np'-' np2*	25	10	6,9; -	81,6;-

^a Wszystkie związki 2'-deoksy: np, f, p oraz n reprezentują odpowiednio wiązanie międzynukleozydowe 3'NHP(O)(O')O-5', 2'-fluoro, 5'-fosforano i 3'-amino.

^b T_m oznaczono z 3 pM oligonukleidów; pierwszą wartość oznaczono w 10 mM fosforanie sodu i 150 mM chlorku sodu, pH 7,04; drugą wartość oznaczono w tym samym buforze, zawierającym dodatkowo 10mM chlorku magnezu; kreski oznaczają, że wartości Tms nie były oznaczone.

c Uzupełniający target; poli(dA) lub poli(rA) w doświadczeniach 1-6, d(ATAAGGAAGAAGC) lub r(AUAAGGAAGAAGC) dla doświadczeń 7,8.

SEKWENCJE (1) INFORMACJE OGÓLNE (i) ZGŁASZAJĄCY: Bernard L. Hirschbein, Karen L. Fearon, Sergei M. Gryaznov, Sarah N. McCurdy, Jefrrey S. Nelson, Ronald G. Schultz (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Synteza oligonukleotydów N3' —» P5' fosforoamidanowych w fazie stałej (iii) LICZBA SEKWENCJI: 10 (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI:

(A) ADRESAT: Stephen C. Macevicz, Lynx Therapeutics Inc.

(B) ULICA: 3832 Bay Center Place (C) MIASTO: Hayward (D) STAN: Kalifornia (E) KRAJ: USA (F) KOD: 94545 (v) FORMULARZ ODCZYTYWALNY KOMPUTEROWO:

(A) RODZAJ NOŚNIKA: dyskietka 3,5 cala (B) KOMPUTER: kompatybilny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: Windows 3.1 (D) PROGRAM: Microsoft word for Windows 2.0 (vi) DANE DOTYCZĄCE OBECNEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA:

(B) DATA ZGŁOSZENIA:

183 661 (C) KLASYFIKACJA:

(vii) DANE DOTYCZĄCE ZGŁOSZENIA PIERWSZEŃSTWA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: 08/603 566 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 21 luty 1996 (viii) DANE PRAWNIKA/RZECZNIKA:

(A) NAZWISKO: Stephen C. Macevicz (B) NUMER REJESTRACYJNY: 30 285 (C) REFERENCJE/NUMER REJESTRU: LYNX-035/01 (ix) INFORMACJE TELEKOMUNIKACYJNE:

(A) TELEFON: (510) 670-9365 (B) FAKS: (510) 670-9302 (2) DANE DLA SEQ ID NO: 1:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 17 nukleotydów (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 1:

GGCCAAAAA CCACTAT (2) DANE DLA SEQ ID NO:21:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 11 nukleotydów (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 2

AAGCCTTTAT C (2) DANE DLA SEQ ID NO: 3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 15 nukleotydów (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa

183 661 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 3:

(2) DANE DLA SEQ ID NO: 4:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 15 nukleotydów (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 4: AAAAAAAAAA AAAAA (2) DANE DLA SEQ ID NO: 5:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 15 nukleotydów (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 5: AACGAGTTGG GGCAT (2) DANE DLA SEQ ID NO: 6:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 11 nukleotydów (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 6: TTCTCTCTCT A (2) DANE DLA SEQ ID NO: 7:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 15 nukleotydów (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 7: AACATGGAGA GCGTC

183 661 (2) DANE DLA SEQ ID NO: 8:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 10 nukleotydów (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 8: UUUUUUUUUT (2) DANE DLA SEQ ID NO: 9:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 10 nukleotydów (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 9: UUUUUUUUUU (2) DANE DLA SEQ ID NO: 10:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 11 nukleotydów (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCH: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 10: CUUCUUCCUU A

183 661

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

Claims (64)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób syntezy oligonukleotydów N3' — P5' fosforoamidanowych, znamienny tym, że składa się z następujących etapów:

   (a) dostarczenie pierwszego nukleozydu związanego z nośnikiem w fazie stałej, z zabezpieczoną grupą 3'aminową;

   (b) usunięcie grupy zabezpieczającej z zabezpieczonej grupy 3' aminowej, z utworzeniem wolnej grupy 3' aminowej;

   (c) przereagowanie wolnej grupy 3' aminowej z monomerem aminonukleozydu-5'fosforoamidynowego zabezpieczonego w pozycji 3', w celu wytworzenia międzynukleozydowego wiązania N3'—> P5' fosforoamidynowego;

   (d) utlenianie tego wiązania.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje dodatkowy etap wielokrotnego powtarzania etapów reagowania i utleniania.
3. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że wielokrotność wynosi od 2 do 4.
4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że obejmuje dodatkowy etap powtarzania etapów (b) do (d) aż do zsyntezowania oligonukleotydu N3' — P5' fosforoamidanowego.
5. 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że monomer aminonukleozydu-5'fosforoamidynowego z grupą zabezpieczającą w pozycji 3' ma stałą równowagi aktywacji tetrazolu wynoszącą przynajmniej 10 M'¹.
6. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że obejmuje dodatkowo etap przykrywania (capping) wolnych grup 3' aminowych, które nie przereagowały z monomerem aminonukleozydu-5'-fosforoamidynowego z grupą zabezpieczającą w pozycji 3'.
7. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że monomer aminonukleozydu-5'fosforoamidynowego z grupą zabezpieczającą w pozycji 3’ ma stałą równowagi aktywacji tetrazolu wynoszącą przynajmniej 100 M_.
8. 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że pKa aminowej grupy fosforoamidynowej monomeru aminonukleozydu-5'-fosforoamidynowego z grupą zabezpieczającą w pozycji 3'wynosi przynajmniej 10.
9. 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że monomer aminonukleozydu-5'fosforoamidynowego z grupą zabezpieczającą w pozycji 3' określony jest wzorem:

   B w którym: B oznacza pirymidynę, purynę lub ich analogi; R oznacza fosforanową grupę zabezpieczającą; W oznacza -NHR lub -OR⁷, gdzie R² jest grupą zabezpieczającą grupę aminową a R^r jest grupą zabezpieczającą hydroksyl; R³ oznacza atom wodoru, hydroksyl, atom fluoru lub grupę -OR', gdzie R' jest alkilem o 1do 3 atomach węgla lub grupą zabezpieczającą hydroksyl; oraz R⁴ i R⁵ razem z atomem azotu, do którego są przyłączone, oznaczają alkiloaminową lub aryloaminową grupę opuszczającą o do 40 atomach, wybranych z grupy obejmującej węgiel, tlen, siarkę i azot.
10. 10. Sposób wedhig eałtrz . 9, znamienny iym, że R³ oenacza aaom wodoru, aR⁴ i R⁵ niezależnie od siebie oznaczają alkil, aryloalkil, cykloalkil lub cykloalkioalkil o łącznej liczbie od 6 do 20 atomów węgla.

    183 661
11. 11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że etap reagowania obejmuje dodatkowo potraktowanie monomeru aminonukleozydu-5'-fosforoamidynowego z grupą zabezpieczającą w pozycji 3' nukleofilowym katalizatorem, w celu utworzenia reaktywnego produktu pośredniego.
12. 12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że nukleofilowym katalizatorem jest aktywator tetrazolowy.
13. 13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że etap utleniania obejmuje potraktowanie wiązania międzynukleozydowego środkiem utleniającym wybranym z grupy obejmującej nadtlenek wodoru i jod.
14. 14. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że R³ oznacza atom wodoru, a R⁴ i R⁵ razem oznaczają łańcuch alkilenowy zawierający do 12 atomów węgla w łańcuchu głównym i sumarycznie od 4 do 20 atomów węgla, przy czym oba końcowe wiązania walencyjne łańcucha związane są z atomem azotu, do którego przyłączone są grupy R⁴ i R5.
15. 15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że etap reagowania obejmuje dodatkowo potraktowanie monomeru aminonukleozydu-5'-fosforoamidynowego z grupą zabezpieczającą w pozycji 3' nukleofilowym katalizatorem, w celu utworzenia reaktywnego produktu pośredniego.
16. 16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że nukleofilowym katalizatorem jest aktywator tetrazolowy.
17. 17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że etap utleniania obejmuje potraktowanie wiązania międzynukleozydowego środkiem utleniającym wybranym z grupy obejmującej nadtlenek wodoru i jod.
18. 18. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że R3 oznacza atom wodoru, a r4 i r5 razem i z atomem azotu do którego są przyłączone oznaczają nasycony związek heterocykliczny azotu, mający do 10 atomów węgla lub heteroatomów w łańcuchu głównym i sumarycznie od 4 do 20 atomów węgla lub heteroatomów, tak że R4 i r5 razem i z atomem azotu do którego są przyłączone zawierają do trzech heteroatomów wybranych z grupy obejmującej azot, tlen i siarkę.
19. 19. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że etap reagowania obejmuje dodatkowo potraktowanie monomeru aminonukleozydu-5'-fosforoamidynowego z grupą zabezpieczającą w pozycji 3' nukleofilowym katalizatorem, w celu utworzenia reaktywnego produktu pośredniego.
20. 20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że nukleofilowym katalizatorem jest aktywator tetrazolowy.
21. 21. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że etap utleniania obejmuje potraktowanie wiązania międzynukleozydowego środkiem utleniającym wybranym z grupy obejmującej nadtlenek wodoru i jod.
22. 22. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że pKa aminowej grupy fosforoamidynowej monomeru aminonukleozydu-5'-fosforoamidynowego z grupą zabezpieczającą w pozycji 3' wynosi przynajmniej 10.
23. 23. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że monomer aminonukleozydu-5'fosforoamidynowego z grupą zabezpieczającą w pozycji 3' ma stałą równowagi aktywacji tetrazolu wynoszącą przynajmniej 10 M'¹.
24. 24. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że obejmuje dodatkowo etap przykrywania wolnych grup 3' aminowych, które nie przereagowały z monomerem aminonukleozydu5'-fosforoamidynowego z grupą zabezpieczającą w pozycji 3'.
25. 25. Sposób według zastrz. 24, znamienny tym, że monomer aminonukleozydu-5'fosforoamidynowego z grupą zabezpieczającą w pozycji 3' ma stałą równowagi aktywacji tetrazolu, K1, wynoszącą przynajmniej 100 M'1
26. 26. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że etap reagowania obejmuje dodatkowo potraktowanie monomeru aminonukleozydu-5'-fosforoamidynowego z grupą zabezpieczającą w pozycji 3' nukleofilowym katalizatorem, w celu utworzenia reaktywnego produktu pośredniego.

    183 661
27. 27. Sposób według zastrz. 26, znamienny tym, że nukleofilowym katalizatorem jest aktywator tetrazolowy.
28. 28. Sposób według zastrz. 27, znamienny tym, że etap utleniania obejmuje potraktowanie wiązania międzynukleozydowego środkiem utleniającym wybranym z grupy obejmującej nadtlenek wodoru i jod.
29. 29. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje dodatkowy etap powtarzania etapów (b) do (d) aż do zsyntezowania oligonukleotydu N3' —— P5' fosforoamidanowego.
30. 30. Sposób według zastrz. 29, znamienny tym, że monomer aminonukleozydu-5'fosforoamidynowego z grupą zabezpieczającą w pozycji 3' ma sterycznie zahamowaną fosforoamidynową grupę aminową o pKa przynajmniej 10.
31. 31. Sposób według zastrz. 30, znamienny tym, że obejmuje dodatkowo etap przykrywania wolnych grup 3' aminowych, które nie przereagowały z monomerem aminonukleozydu5'-fosforoamidynowego z grupą zabezpieczającą w pozycji 3'.
32. 32. Sposób według zastrz. 31, znamienny tym, że sterycznie zahamowaną fosforoamidynową grupę aminową jest grupa alkiloaminowa, dialkiloaminowa, cykloalkiloaminowa, dicykloalkiloamniowa lub aryloalkiloaminowa, mające od 6 do 20 atomów węgla.
33. 33. Sposób według zastrz. 32, znamienny tym, że etap reagowania obejmuje dodatkowo potraktowanie monomeru aminonukleozydu-5'-fosforoamidynowego z grupą zabezpieczającą w pozycji 3' nukleofilowym katalizatorem, w celu utworzenia reaktywnego produktu pośredniego.
34. 34. Sposób według zastrz. 33, znamienny tym, że nukleofilowym katalizatorem jest aktywator tetrazolowy.
35. 35. Sposób według zastrz. 34, znamienny tym, że monomer aminonukleozydu-5'fosforoamidynowego z grupą, zabezpieczającą w pozycji 3' ma stałą równowagi aktywacji tetrazolu, K>, wynoszącą przynajmniej 100 M¹.
36. 36. Sposób według zastrz. 35, znamienny tym, że etap utleniania obejmuje potraktowanie wiązania międzynukleozydowego środkiem utleniającym wybranym z grupy obejmującej nadtlenek wodoru i jod.
37. 37. Sposób syntezowania oligonukleotydu o wzorze:

    R* R³ w którym: B oznacza purynę lub pirymidynę lub ich analogi; X oznacza atom tlenu lub siarki, R³ oznacza atom wodoru, fluoru lub grupę hydroksylową, R⁶ oznacza grupę aminową lub hydroksylową, Z oznacza atom wodom, metal alkaliczny lub kation aminowy, n oznacza liczbę przynajmniej 1, znamienny tym, że składa się z następujących etapów:

    (a) dostarczenie pierwszego nukleozydu związanego z nośnikiem w fazie stałej, z zabezpieczoną grupą 3' aminową, (b) usunięcie grupy zabezpieczającej z zabezpieczonej grupy 3' aminowej, z utworzeniem wolnej grupy 3' aminowej;

    (c) przereagowanie wolnej grupy 3' aminowej z monomerem aminonukleozydu-5'fosforoamidynowego zabezpieczonego w pozycji 3', w obecności nuklefilowego katalizatora, w celu wytworzenia międzynukleozydowego wiązania N3' -> P5' fosforoamidynowego;

    (d) utlenianie tego wiązania; oraz (e) powtarzanie etapów (b) do (d) aż do zsyntezowania oligonukleotydu.

    183 661
38. 38. Sposób według zastrz. 37, znamienny tym, że obejmuje dodatkowo etap przykrywania wolnych grup 3' aminowych, które nie przereagowały z monomerem aminonukleozydu5'-fosforoamidynowego z grupą zabezpieczającą w pozycji 3'.
39. 39. Sposób według zastrz. 38, znamienny tym, że monomer aminonukleozydu-5'fosforoamidynowego z grupą zabezpieczającą w pozycji 3' ma sterycznie zahamowaną fosforoamidynową grupę aminową o pK_a przynajmniej 10.
40. 40. Sposób według zastrz. 39, znamienny tym, że obejmuje dodatkowy etap wielokrotnego powtarzania etapów (c) i (d), podczas każdego cyklu etapów (b) do (d).
41. 41. Sposób według zastrz. 40, znamienny tym, że etapy (c) i (d) powtarzane są dwukrotnie podczas każdego cyklu etapów (b) do (d).
42. 42. Sposób według zastrz. 41, znamienny tym, że monomer aminonukleozydu-5'fosforoamidynowego z grupą zabezpieczającą w pozycji 3' określonyjest wzorem:

    W

    R³' °^°y^B

    U w którym: B oznacza pirymidynę, purynę lub ich analogi; R¹ oznacza fosforanową grupę zabezpieczającą; W oznacza -NHR² lub -OR⁷, gdzie R² jest grupą zabezpieczającą grupę aminową, a R^r jest grupą zabezpieczającą hydroksyl; R³ oznacza atom wodoru, hydroksyl, atom fluoru lub grupę -OR', gdzie R' jest alkilem o 1do 3 atomach węgla lub grupą zabezpieczającą hydroksyl; oraz R⁴ i R⁵ razem z atomem azotu, do którego są przyłączone, oznaczają alkiloaminową lub aryloaminową grupę opuszczającą o do 40 atomach, wybranych z grupy obejmującej węgiel, tlen, siarkę i azot.
43. 43. Sposób według zastrz. 42, znamienny tym, że R3 oznacza atom wodoru, katalizator nukleofilowy jest aktywatorem tetrazolowym, a r4 i r5 niezależnie od siebie oznaczają alkil, aryloalkil, cykloalkil lub cykloalkioalkil o łącznej liczbie od 6 do 20 atomów węgla.
44. 44. Sposób według zastrz. 43, znamienny tym, że etap utleniania obejmuje potraktowanie wiązania międzynukleozydowego środkiem utleniającym wybranym z grupy obejmującej jod, chlor, wodoronadtlenki, kwasy nadtlenowe, mieszane bezwodniki acylosulfinowe, nadtlenki, ozon, elementarną siarką, disiarczki tiuramu, disiarczki acylu, disiarczki fosfinotioilu i 1,1-diokso-3H-1,2-benzoditiol-3-on.
45. 45. Sposób według zastrz. 44, znamienny tym, że R1 oznacza metyl, β-cyjanoetyl lub

    4-nitrofenyloetyl; r2 oznacza trifenylometyl, a n oznacza liczbę w zakresie od 1 do 50.
46. 46. Sposób według zastrz. 42, znamienny tym, że R3 oznacza atom wodoru, a R4 i R5 razem oznaczają łańcuch alkilenowy zawierający do 6 atomów węgla w łańcuchu głównym i sumarycznie od 4 do 12 atomów węgla, przy czym oba końcowe wiązania walencyjne łańcucha związane są z atomem azotu, do którego przyłączone są grupy R4 i r5.
47. 47. Sposób według zastrz. 46, znamienny tym, że katalizatorem nukleofilowym jest aktywator tetrazolowy; R oznacza metyl, β-cyjanoetyl lub 4-nitrofenyloetyl; r2 oznacza trifenylometyl; n oznacza liczbę w zakresie od 1 do 50, a etap utleniania obejmuje potraktowanie wiązania międzynukleozydowego środkiem utleniającym wybranym z grupy obejmującej jod, chlor, wodoronadtlenki, kwasy nadtlenowe, mieszane bezwodniki acylosulfinowe, nadtlenki, ozon, elementarną siarkę, disiarczki tiuramu, disiarczki acylu, disiarczki fosfinotioilu i 1,1diokso-3H-l,2-benzoditiol-3-on.
48. 48. Sposób według zastrz. 42, znamienny tym, że r3 oznacza atom wodoru, a r4 i r5 razem i z atomem azotu do którego są przyłączone oznaczają nasycony związek heterocykliczny azotu, mający do 10 atomów węgla lub heteroatomów w łańcuchu głównym i sumarycznie od 4 do 20 atomów węgla lub heteroatomów, tak że r4 i r5 razem i z atomem azotu do którego są przyłączone zawierają do trzech heteroatomów wybranych z grupy obejmującej azot, tlen i siarkę.

    183 661
49. 49. Sposób według zastrz. 46, znamienny tym, że katalizatorem nukleofilowym jest aktywator tetrazolowy, a etap utleniania obejmuje potraktowanie wiązania międzynukleozydowego środkiem utleniającym wybranym z grupy obejmującej jod, chlor, wodoronadtlenki, kwasy nadtlenowe, mieszane bezwodniki acylosulfinowe, nadtlenki, ozon, elementarną siarkę, disiarczki tiuramu, disiarczki acylu, disiarczki fosfinotioilu i 1,1-diokso-3H-1,2-benzoditiol-3-on.
50. 50. Sposób według zastrz. 49, znamienny tym, że R¹ oznacza metyl, β-cyjanoetyl lub 4-nitrofenyloetyl; R2 oznacza trifenylometyl, a n oznacza liczbę w zakresie od 1 do 50.
51. 51. Związek o wzorze:

    ^R>n-^p^z

    OR'

    R^s ft w którym: B oznacza pirymidynę, purynę lub ich analogi; R1 oznacza fosforanową grupę zabezpieczającą; W oznacza -NHR² lub -OR⁷, gdzie R² jest grupą zabezpieczającą grupę aminową, a R⁷ jest grupą zabezpieczającą hydroksyl; R³ oznacza atom wodoru, hydroksyl, atom fluoru lub grupę -OR', gdzie R'jest alkilem o 1do 3 atomach węgla lub grupą zabezpieczającą hydroksyl; oraz R⁴ i R^y razem z atomem azotu, do którego są przyłączone, oznaczają alkiloaminową lub aryloaminową grupę opuszczającą o do 40 atomach, wybranych z grupy obejmującej węgiel, tlen, siarkę i azot, z zastrzeżeniem że wyłączone z tego są związki, w których: B oznacza N⁶-benzoiloadeninę lub tyminę; R1 oznacza trimetylosilil; W oznacza 0-4, 4'-dimetoksytrifenylometyl; r3 oznacza atom wodoru; R⁴ i R⁵ oznaczają niezależnie izopropyl; oraz związek o powyższym wzorze, w którym B oznacza adeninę zabezpieczoną dimetyloformamidem, cytozynę zabezpieczoną grupą 2-metylopropionylową lub tymina; R¹ oznacza β-cyjanoetyl; W oznacza O-dimetoksytrifenylometyl; R3 oznacza wodór oraz R⁴i R⁵ oznaczają niezależnie izopropyl.
52. 52. Związek według zastrz. 51, w którym R3 oznacza atom wodoru; a R⁴ i R⁵ niezależnie od siebie oznaczają alkil, aryloalkil, cykloalkil lub cykloalkioalkil o łącznej liczbie od 6 do 20 atomów węgla.
53. 53. Związek według zastrz. 51, w którym R1 oznacza metyl, β-cyjanoetyl lub 4nitrofenyloetyl; r2 oznacza trifenylometyl; r7 oznacza di-p-anizylofenylometyl; a R⁴ i R⁵ niezależnie od siebie oznaczają izopropyl, sec-butyl, izobutyl, t-butyl, cykloheksyl lub 2etyloheksyl.
54. 54. Związek według zastrz. 51, w którym r3 oznacza atom wodoru; a R⁴ i R⁵ razem oznaczają łańcuch alkilenowy zawierający do 6 atomów węgla w łańcuchu głównym i sumarycznie od 4 do 12 atomów węgla, przy czym oba końcowe wiązania walencyjne łańcucha związane są z atomem azotu, do którego przyłączone są grupy R⁴ i R⁵.
55. 55. Związek według zastrz. 51, w którym R3 oznacza atom wodoru; a R⁴ i R⁵ razem i z atomem azotu do którego są przyłączone oznaczają nasycony związek heterocykliczny azotu, mający do 10 atomów węgla lub heteroatomów w łańcuchu głównym i sumarycznie od 4 do 20 atomów węgla lub heteroatomów, tak że R4 i R⁵ razem i z atomem azotu do którego są przyłączone zawierają do trzech heteroatomów wybranych z grupy obejmującej azot, tlen i siarkę.
56. 56. Związek według zastrz. 55, w którym R1 oznacza metyl, β-cyjanoetyl lub 4nitrofenyloetyl; r2 oznacza trifenylometyl; a R i R5 razem i z atomem azotu do którego są przyłączone oznaczają grupę dimetylopiperydynylową, pirolidynylową, dimetylomorfolinową, tetrametylomorfolinową, dimetylopirołidynylową, tetrametylopirolidynylową lub tetrametylopiperydynylową.
57. 57. Sposób syntezy oligonukleotydów N3' — P5' fosforoamidanowych na stałym nośniku, znamienny tym, że składa się z następujących etapów:

    183 661

    - dostarczanie monomeru aminonukleozydu-5'-fosforoamidynowego z grupą, zabezpieczającą w pozycji 3', mającego aminową grupę fosforoamidynową, oraz

    - sprzęganie monomeru aminonukleozydu-5'-fosforoamidynowego zabezpieczonego w pozycji 3' z oligonukleotydydem N3' -> P5' fofforoamidanowymi, przez wymianę mninowj grupy ffsforfamidyafwej monomeru z pierwszorzędową 3'-aminową grupą oligonukleftydydu N3' —> P5' ffsforfamidaafwego.
58. 58. Sposób według zastrz. 57, znamienny tym, że aminowa grupa fosforoamidynowa monomeru aminfnukleozydu-5'-ffsffrfamidynowego z grupą zabezpieczającą w pozycji 3' ma pKa przynajmniej 10. ... .
59. 59. Sposób według zastrz. 58, znamienny tym, że etap sprzęgania obejmuje tworzenie wiązania N3' — P5' fosforfamidyafwego.
60. 60. Sposób według zastrz. 59, znamienny tym, że obejmuje dodatkowy etap utleniania wiązania N3' — P5' fosforoamidynowego, z utworzeniem wiązania N3' — P5' fosforoamidanowego lub N3' -> P5' fosforotioamidanowego.
61. 61. Sposób według zastrz. 60, znamienny tym, że monomer aminonukleorydu-5'ffsforfamidynowegf z grupą zabezpieczającą w pozycji 3' ma stalą równowagi aktywacji tetrazolu, K1, wynoszącą przynajmniej 100 M‘ *.
62. 62. Sposób według zastrz. 61, znamienny tym, że obejmuje dodatkowy etap wielokrotnego powtarzania etapów sprzęgania i utleniania.
63. 63. Sposób według zastrz. 62, znamienny tym, że powtarzanie jest dwukrotne.
64. 64. Sposób według zastrz. 63, znamienny tym, że obejmuje dodatkowo etap przykrywania pierwszorzędowych grup 3' aminowych, które nie przereagowały z monomerem aminonuklefzydu-5'-ffsffroamidyafwego z grupą zabezpieczającą w pozycji 3'.