CZ263497A3

CZ263497A3 - Způsob detekce aktivní produkce protilátek

Info

Publication number: CZ263497A3
Application number: CZ972634A
Authority: CZ
Inventors: Lars Reinhardt Haaheim
Original assignee: Lars Reinhardt Haaheim
Priority date: 1995-02-21
Filing date: 1996-02-21
Publication date: 1998-02-18
Also published as: NZ301770A; NO317151B1; ATE188551T1; EP0811165A1; CN1098460C; FI117911B; HUP9801448A2; GR3032740T3; RU2197733C2; GB9503406D0; PT811165E; AU4726896A; FI973418A0; FI973418L; NO973823D0; CZ289582B6; HU225687B1; PL182061B1; JP3472929B2; DK0811165T3

Description

Způsob detekce produkce protilátek

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká způsobu detekce produkce protilátek a zejména detekce aktivní syntézy protilátek v krevních vzorcích v odpovědi na infekci nebo na vakcinaci atd., prostřednictvím modifikovaného enzymově vázaného imunosorbentního testu (ELISA).

Dosavadní stav-techniky

ELISA je dlouho používána pro detekci a měření protilátek (nebo antigenu). Nej častěji je ELISA používána jako serologický test, ale je také používána pro studium imunochemických vlastností antigenů nebo protilátek, a často nachází uplatnění' v, například, hodnocení a charakterizaci imunitních odpovědí, pro zkoumání produkce protilátek v buněčných kulturách, v hybridomní technologii, atd.

Díky své senzitivitě, jednoduchosti, a snadností a rychlosti výkonu byla tato technika široce přijata jako diagnostický prostředek a je nyní rutinně používána v klinických laboratořích pro- detekci protilátek k infekčním agens v séru nebo plasmě, po infekci nebo po vakcinaci. Tak například, mnoho testů na HIV infekci v závislosti na detekci protilátek k viru v plasmě nebo séru pacientů využívá běžného ELISA testu.

Nicméně, protože takový jednoduchý serologický ELISA test pouze měří přítomnost cílové protilátky ve vzorku, nemůže ..

· · • * * * · · »· ♦

t · » · φ

rozlišit mezi nastupující syntézou protilátek v odpovědi na antigen a protilátkami již přítomnými od minulé infekce, nebo od pasivního přenosu atd..Ačkoliv v některých případech může být dostačující získat prostou informaci· o přítomnosti protilátek, v jiných případech je žádoucí určit, zda je detekovaná cílová protilátka akutně syntetizována lymfocyty v době testování či nikoliv, například během vakcinace nebo v diagnostice infekce u dětí rozlišit jí od pasivně přenesený protilátek matky. Tohoto nemůže být dosaženo klasickou ELISA metodou.

-Byly proto vyvinuty jiné metody, které umožňují detekci nastupující syntézy protilátek. V tomto směru může být uveden- enzymově vázáný imuriospot (ELISPOT) test (také známý jako spot ELISA nebo ELISA-plaque test)·, jak jej popisuje například Czerkinsky et al., v ELISA and other Solid Phase Imunoassays, Ed. D. M. Kenneny and S. J, Chállacombe, 1988,' kapitola 10, ’ 217 239. Tato technika, založená na .ELISA metodě, umožňuje počítání lymfocytů secernujících protilátky proti j ednomu nebo· více ' cílovým antigenům. Stručně, ELISPOT je variantou ELISA metody, kde mohou být· protilátky secernující buňky ‘(ASCj odhaleny kultivací'lymfocytů ve .speciálních modifikovaných .ELISA jamkách potažených cílovým antigenema nahrazením standardních ELISA reagens komplexem enzym-substrát,- který dává barevný presipitát (skvrny) okolo/secernuj ících buněk.. . Skvrny. mohou být. počítány za_ř: získání počtu protilátku secernujících buněk. Inhibitory proteinové syntézy mohou být obsaženy v kultivačním mediu, pro potvrzení toho, že skvrny jsou detekovány díky de novo syntéze protilátek, v průběhu in vitro inkubační periody.

. . Zatímco , se ELISPOT ukázala ..jako-velmi užitečná ve studiu— ·· · • · ··♦ *· dynamiky humorální imunitní odpovědi a byla používána pro detekci spontánních ASC, které se přechodně objevují v periferní cirkulaci imunizovaných subjektů, jisté vlastnosti metody jsou na obtíž-použití v klinické diagnostice. 2a prvé, je nutné počítat každou jednotlivou skvrnu, což je časově náročné a pracné, proto není metoda vhodná pro analýzu většího množství vzorků, tak jak je tomu v klinických diagnostických laboratořích. 2a druhé, Je počítán a uváděn pouze počet buněk secernujících protilátku, což vyžaduje významně vyšší objemy vzorku, např. několik ml. ELISPOT plotny jsou také nákladné a test nelze snadno přizpůsobit automatizaci..

...... . ' Λ

Je zde'možné vidět/ že i přes pokroky v technikách detekce ' protilátek zde existuje potřeba testu, který je jednoduchý, rychlý a nenákladný pro provedení, který spolehlivě umožní přesnou kvantifikaci spontáně'· secernovaných protilátek, který je schopen rozlišit de novo syntézu protilátek,, a zejména, který může být proveden⁷na krevních vzorcích pro diagnostické účely. Předkládaný vynález'se týká této potřeby. .' '

Podstata vynálezu , .

..-V. jednom aspektu předkládaný vynález- proto poskytuje způsob detekce aktivní produkce protilátek v odpovědi „na cílový . antigen v krevním vzorku,-kde uvedený způsob obsahuje:

kontaktování, v přítomnosti nebo za absence inhibitoru proteinové syntézy, aliquot uvedeného vzorku, nebo volitelně, lymfocytů přímo izolovaných'z uvedeného vzorku, s pevnou fází . za podmínek.,, které umožňují produkci protilátek- a jejich sekreci ·

• Φ · • * · ♦ ·' φ • φφφ* β φ φ • ΦΦΦ φ • · φΦΦ · φφφ φ

«« lymfocyty;

detekování v roztoku, vazby protilátky na uvedený antigen(y) *

na pevné fázi; a srovnání uvedené protilátky navázané v přítomnosti nebo za absence inhibitoru proteinové syntézy pomocí určení množství aktivní sekrece protilátky v odpovědi na uvedený antigen(y)._:

Jak je zde použito, aktivní produkce protilátek označuje spontáně secernované protilátky produkované lymfocyty ve vzorku, které aktivně produkují protilátky v průběhu testu v důsledku aktivního nástupu imunitní odpovědi. Ve všech případech jsouíi protilátky namířené proti antigenům, které jsou přítomny in vivo a nikoliv in vitro, ani před ani během způsobu testování podle vynálezu. , . .. ·

Jak je zde použito znamená fráze aktivní sekrece protilátek v odpovědi na uvedený antigen to, že aktivně.secernované 'protilátky se vážou na antigen použitý v testu, ačkoliv použitý . antigen nebyl imunogen stimulující imunitní odpovědi na prvním místě. Tak,· zatímco oba aňtigeny použité v testu a imunogen,. který stimuloval nebo stimuluje produkci protilátek in vivo se budou vázat na detekované protilátky prostřednictvím stejných nebo velmi podobných epitopů, v jiných ohledech nemusí.být antigen a imunogen identické. Tak, zatímco antigenem použitým.ve způsobu podle vynálezu může být materiál, obsahující všechny nebo některé části relevantního imunogenu, např. odvozeného od infikovaných jedinců, nebo purifikovaných částic ze stejného nebo podobného'materiálu, může být antígen‘podobně připraven ft « a • · ftft·· ·· · * · · • · · • ·ftft· a ·

·· »· a ft • · synteticky, např. chemickou syntézou nebo rekombinantní expresí, s připojením nebo delecí částí vzhledem k nativnímu antigenu. Takové fúsní proteiny, nebo molekuly exprivující pouze vhodný epitop(y) mohou být použity.

Obecně řečeno, způsob podle vynálezu zahrnuje inkubaci lymfocytů z krevního vzorku v kontaktu se vhodným pevným povrchem pro imobilizací detekovaných protilátek za podmínek, které umožňují produkci a sekreci protilátek lymfocyty, a potom odstranění buněk a detekování vazby protilátek na antigen na pevnou fázi. Srovnáním hladiny navázaných protilátek, za přítomnosti nebo za absence inhibitoru proteinové syntézy, může být de novo syntéza protilátek odlišena a kvantifikována.

Překvapivě, 2působ podle vynálezu umožňuje použití malých objemů krevních vzorků (např. μί objemů, menších než 1 ml), přímo pro detekci spontánní produkce protilátek nestimulovanými lymfocyty, bez předchozího kroku pre-kultivace lymfocytů-před inkubací s pevnou fází. Jinými slovy, lymfocyty ve vzorku jsou použity přímo v testovacím způsobu podle vynálezu bez jakéhokoliv předcházejícího ošetření nebo stimulace, např. in vitro stimulace antigenem. Tak mohou být detekovány protilátky produkované lymfocyty v době odběru vzorku. Tímto způsobem, i za použití malých objemů vzorku, spontánní nástup syntézy protilátek v odpovědi na testovaný antigen může být výhodně odlišen od okolních aktivací lymfocytů. Také jsou lymfocyty testovány v situaci, kdy spontáně secernují protilátky, bez stimulace buněk pro odhalení jakékoliv paměti. Toto je v kontrastu k jiným publikovaným způsobům, které využívají výhody in vitro antigenní stimulace pro zvýšení sénzitivitý těstu. Předkládaný vynález ► · ««« • .

• « ¹ · · · •« oproti tomu využívá výhody spontánní, sekrece protilátek pro umožnění detekce protilátek v krvi, které jsou ukazatelem nástupu infekce testovaným antigenem; plasmatické lymfócyty budou secernovat protilátku proti testovanému antigenu v prvních několika týdnech po infekci, nebo vakcinaci atd. Dtekce takových protilátek způsobem podle předkládaného vynálezu umožňuje diagnosu nebo určení infekce, nebo monitorování protilátkové odpovědi na vakcinaci a td. Toto je zejména užitečné u dětí a u novorozenců, kde je důležité odlišit nově syntetizované protilátky od pasivně přenesených mateřských.protilátek= Stejný vzorek krve může být analyzován na protilátky proti několika odlišným infekčním agens'buď v separátním testu/ nebo ve stejném testů za použití mnohotných· relevantních antigenů. Tak umožňuje použití relevantních kontaktních antigenů podle'klinického syndromu, který se u pacienta presentuje. V diagnostice infekcí je také*důležité být schopen rozlišit mezi nástupem syntézy protilátek a protilátek již' existujících od dřívější infekce. Vyvolání imunologické paměti antigenní stimulací in vitro není slučitelné s testem zaměřeným na.nástup akutní infekce a proto předchozí metody založené'na^- antigenní stimulaci xienešoů tuto '' výhodu.Také,zahrnutí kroku antigenní stimulace.bude nepříznivě ovlivňovat výhodný časový faktor testu podle předkládaného vynálezu,- jehož-provedení, je velmi rychlé ve srovnání s předchozími v oboru, známými způsoby. . . . - .

Antigeny, ke kterým jsou protilátky pro detekci podle způsobu podle předkládaného vynálezu namířeny, zahrnují jak bakteriální, tak virové antigeny. Klinicky významné antigeny zahrnují, ale nejsou omezeny na, například antigeny Herpes Simplex viru,. Cytomegaloviru, viru lidské- imunodef icience- (HIV) a-jakýchkoliv

	« · •	•	• * · * « * ·
	•	« ·	♦ · 0‘ ·
	»	•	• *
• »	·*		• · ·

virů hepatitidy. Detekce takových můše být použita pro rychlé stanovení toho, zda je pacient infikován např. pro účely skríningu krve nebo pro stanovení a/nebo monotorování infekce. Způsob je zejména užitečný vzhledem ke své jednoduchosti a může být použita tam, kde laboratorní vybavení není dostupné, např. v polních podmínkách.

Jak je zde použito, termín detekování¹' a určení množství znamenají jak kvantitativní, tak kvalitativní zhodnocení hladiny produkce protilátek, vě smyslu získání absolutní hodnoty množství protilátek produkovaných, ve vzorku a také index, poměr, procento nebo podobný ukazatel produkce protilátek, stejně jako semikvantitativní.nebo kvalitativní... zhodnocení.

Hlavní výhodou předkládaného vynálezu je potřeba pouze malého objemu vzorku,' např. 50 - 500 μΐ, lépe 100 - 300 μΐ a běžně 100 200 μΐ krve nebo krevního produktu ve srovnatelném objemů k plné krvi, oproti klasickým diagnostickým testům, které- obyčejně vyžadují objem několika ml séra. Toto je zejména užitečné v případě odběru vzorků od novorozenců/ protože způsob podle předkládaného vynálezu vyžaduje objem pouze několik μΐ.

- Vzorky krve,, obecně vzorky periferní krve, mohou být použity přímo,, ačkoliv mohou být nejprve preferovaně izolovány lymfocyty ze vzorku. Toto může být provedeno za použití standardních technik v oboru dobře.známých. Tak, například, mohou být běžně použity různé přípravky plné krve, například, heparinizovaná krev, EDTA-krev atd, jak jsou běžně připravoványv klinických laboratořích. Ačkoliv to. není zásadní, ěrytrocyty přítomné ve vzorku .mohou být lysovány, např. za-použití běžných' metod......

f· • * krátkodobou expozicí destilované vodě nebo chloridu amonnému, nebo za použití jiných dobře známých technik hemolýzy. Musí být dáno, že všechny obohacené nebo čištěné přípravky musí obsahovat lymfocyty přítomné v plné krvi, ze které je přípravek odvozen, aby bylo možné detekovat spontání produkci protilátek. Pokud je. to žádoucí, mohou být lymfocyty separovány, například za použití standardního lymfocytárního separačního media, např. Lymphoprep {Nyegaard Co., Oslo, Norsko) , nebo za použití imunomagnetické separace (IMS) nebo podobného ne pevné fázi založeného separačního systému nebo jiných běžných technik.. V případě IMS nebo podobných separačních technik může být použita pevná fáze, např. magnetické korálky, potažená protilátkou specifickou pro jistou sadu leukocytů pro selektivní .separování použitelných . lymfocytů.Pokud jsou použity separované lymfocyty, pak mohou být buňky před použitím promyty, za použití standardních technik promytí. Bylo nicméně pozorováno, .že extensivní promývání buněk není žádoucí. Kromě toho, pokud není použito rozsáhlé promývání, může být přežívání buněk zlepšeno a způsob může být urychlen.

Vzorek krve, ošetřený jak uvedeno'výše*, pokud je to žádoucí, nebo·separované' lymfocyty, jsou potom vhodně uvedeny do kontaktu s pevnou fází nesoucí vhodného vazebného partnera pro imobilizování protilátek nebo protilátky, které mají být detekovány. Běžně -je vazebným partnerem testovaný antigen. nebo. antigeny, rozpoznávaný.protilátkou nebo protilátkami, které mají být detekovány; V jednom provedení tak předkládaný vynález poskytuje způsob pro detekci aktivní produkce protilátek v krevním vzorku, kde uvedený způsob obsahuje:

kontaktování, v přítomnosti nebo za-absence inhibitoru ·· ·♦··

9 »

999« 9

9

9 9

9

9« 9 O proteinové syntézy, aliquot uvedeného vzorku, nebo volitelné, lymfocytů přímo izolovaných z uvedeného vzorku, s pevnou fází nesoucí jeden nebo více antigenů rozpoznávaných protilátkou nebo protilátkami, které mají být detekovány;

detekování v roztoku, vazby protilátky na uvedený antigen(y); a .

srovnání uvedené protilátky navázané v přítomnosti nebo za absence inhibitoru proteinové syntézy pomocí určení množství. aktivní sekrece protilátky v odpovědi na.uvedený antigen(y)·.

Alternativní vazebné .partnery mohou být také použity·, například protein A, protein G nebo protilátky·, které rozpoznávají a vážou protilátku, která má být detekována. Vposlepdní případě, vysoce specifická vazba není žádoucí, protože specificita je v tomto provedení' testovací metody zajištěna následnou vazbou antigenů, které se vážou specificky na protilátky, které mají být detekovány. Tak je ve všech provedeníchtvořen'komplex ' antigen-prótilátka. Přítomnost takových komplexů na pevném nosiči je zjištěna- krokem detekce způsobu podle předkládaného vynálezu. Pevnou fází může být jakýkoliv z dobře známých nosičů'nebomatrice, které jsou nyní běžně používány nebo navrženy pro imobilizaci·, separaci adt. -Tyto mohou mít· formu částic, listů, · gelů,membrán nebo mikrotitřaČníčh proužků, tub nebo. ploten atd. a vhodně mohou být vyrobeny ž polymerního materiálu. Nicméně, pro snadnou manipulaci a jednoduchost mohou být použity standardní mikrotitrační plotny a jamky, preferovaně standardní ELISA plotny.

·· »»·· • · · ♦ · :·· · · · ' · •

• ·

Pevná fáze může být také modifikována tak, aby umožnila detekci protilátek specifických pro řadu různých antigenu. Tak například, disky nebo proužky atd. ze vhodného materiálu pevné fáze, např. nitrocelulozy'a podobně, mohou být potaženy různými antigeny a přidány simultáné do mikrotitrační jamky nebo jiníé vhodné nádobky, která.,neobsahuje žádný kontaktní antigen. Způsob detekce navázaných protilátek může potom být použit pro odlišení mezi různými antigeny. Sady. disků, které jsou každý potažen relevantními antigeny pro jisté klinické stavy nebo syndromy mohou být použity pro identifikaci toho,- které z podezřelých agens způsobuje infekci. Disky budou potom jednotlivě zpracovány v separátních jamkách; Toto je'zejména postup šetřící materiál,' protože testy mohou být provedeny pro simultání testování mnoha různých agens (buď’od stejného infekčního agens nebo od různých agens relevantních pro klinický syndrom nebo stav v určitém případě) za použití stejného malého objemu krve. Alternativním přístupem je použití mnoha;vzorků krve v separátních jamkách, která je každá potažena jiným vazebným partnerem,, např. antigenem nebo protilátkou, a provedením testu. ......

Techniky pro vazbu vazebného partnera', např·. antigenu, na > pevnou fázi, jsou také v oboru velmi dobře známé a jsou rozsáhle popsáiiy v literatuře? Mnoho standardních postupů pro potažení antigenem je popsáno například v ELISA and other solid -phase-Immunoassays, Theoretical and Practical Aspects; 1988, ed. D. M. Kemeny and S. J. Challacombe, John Wiley and Sons. Pokud je to žádoucí, mohou být plotny promyty a blokovány, opět za použití standardních technik. Tak například, standardní mikrotitrační plotny, např. ELISA plotny, mohou být jednoduše potaženy vazebným partnerem inkubací přes -noc pří·4-°C ve vhodném pufru-, například·· ·· »**»

»· · • « · • « «« · ,· · · *' ·· *· » fosfátem pufrovaném salinickém roztoku (PBS), obsahujícím vazebný partner, např. v koncentraci 0,01 až 150 ^g/ml proteinu, po čemž následuje blokování vhodným blokovacím mediem (obecně buněčným kultivačním mediem) a inkubace např. při 37 °c po l až 5 hodin.

Po odstranění blokovacího roztoku jsou plotny připraveny pro použití.

Nicméně, je vhodné, aby materiály potřebné k provedení způsobu podle předkládaného.vynálezu byly poskytnuty ve formě kitu, kde je dodán pevný nosič potažený vazebným partnerem a vhodně blokován..

Jak je uvedeno výše, krok kontaktování obecně vyžaduje inkubaci vzorku nebo separovaných lymfocytů v přítomnosti pevné fáze za podmínek, které umožňují syntézu protilátek a jejich sekreci. Mohou být použity standardní ELISPOT inkubační podmínky, jak je popsal například Czerkinsky et al., 1988 (výše).'Obecně, vzorek nebo buňky jsou inkubovány při 37 ^QC s 5% CCi ve vzduchu, kde medium, ve kterém jsou buňky inkubovány, počítá s C0₃ jako se součástí pufrovacího systému. C0₂ nezávislé medium může také být použito, kde v tomto mediu pracuje alternativní pufrovací systém, jako je medium využívající dobře známého HEPES konstituentu. V tomto případě jsou buňky jednoduše inkubovány při 37 °C, což dále zjednodušuje test a jeho požadavek na laboratorní vybavení. inkubační doba se může lišit, ale obecně jsou požadovány alespoň 1-2 hodiny, inkubační doba okolo 2-6 hodin, např. 2 až 4 hodiny, může dávat dobré výsledky, ačkoliv delší inkubační doba, např. více než 12 nebo 24 hodin, nebo přes noc, může být také žádoucí. Vhodná media pro inkubaci jsou v oboru dobře známá a zahrnují jakákoliv standardní kultivační media; např. Dulbeccó

9

9 9 ·

i2 z ··:

9* 9 « 9 9 -, *·[ 999 9

9 9 · · ♦·*. 4 • '· * 9 9 »

9 9 9 '0 ·*·'''· • 9 · . «9 • 9 99 99 9 modifikované Eaglovo medium (DMEM) nebo RPMI nebo jiná dobře známá kultivační media užívající HEPES jako C0₂ nezávislý pufrovací systém, obsahující vhodné sérum, např. fetální telecí sérum (FCS) nebo jiné složky, např. glutamin, podle potřeby.

Další volitelné'složky v mediu mohou zahrnovat antibiotika, např. géntamycin, penicilín, streptomycin, atd., jiné aminokyseliny, růstové faktory atd.. ..

Může být žádoucí ředit suspenzi vzorek/buňka před krokem kontaktování a vhodný rozsah buňka/vzorek ředění může být použit. Ředění bude obvykle použito za, použití.kultivačního media jako. ředidla. ' .. ... . ·.

Pro odlišení nastupující syntézy protilátek je inkubace provedena.za přítomnosti nebo za absence inhibitoru proteinové syntézy. Tak je před inkubacípřidán inhibitor k Části aliquot vzorku/buněk, pro blokování'syntézy proteinů, a proto protilátek a část je inkubována bez inhibitoru. Mohou být použity jakékoliv známé inhibitory syntézy proteinů, např.' cykloheximid. Může být použita koncentrace 10 - 5000 ^g/ml, např. -50 500 ^g/ml cyklohexiir.idu. '·

Také je preferováno, aby byl obsažen inhibitor ATPasy, jako je azid sodný, nebo-jiné-podobné’ inhibitory spolu s inhibitorem proteinové syntézy, aby se rychle a úplně zastavil metabolismus buněk.. .. ·

Po inkubaci jsou vzorky/buňky odstraněny z pevné fáze. Toto může obecně být provedeno, jednoduše promytím za použití vhodného media,- např. pufru jako jě'PBS, Nicméně, bylo shledáno,, že ··. »»»· ♦ · · » ···* · ί' • · · « • · »· · extensivní promývání není žádoucí.

Pevná fáze je potom podrobena kroku detekce vazby protilátky. Krok detekce, ve smyslu čtení signálu, probíhá v roztoku. Mohou být použity jakékoliv známé prostředky pro detekování va2by protilátky, podle toho, jaký signál je generován v roztoku; například v závislosti na fluorescenci, chemiluminiscenci,. kolorimetrii nebo enzymové reakci k produkování detekovatelného signálu. Nicméně,.je vhodné použít imunotest jako prostředek detekce, preferovaně enzymově vázaný imunosorbentní test (ELISA).

Techniky pro imunotesty, a zejména pro ELISA, jsou dobře známé v oboru a jsou popsané v literatuře (například v ELISA and other solid phase Immunoassays, Theoretical and Pracťical Aspects;

1988, ed. D. M. Kemeny and S. J. Challacombe, John Wiley and sons).

Po odstranění vzorku/buněk může být přidán konjugát enzym protilátka, například v ELISA detekčním způsobu, který se váže na protilátku navázanou na antigen na pevné fázi. Obdobně, pokud je protilátka, která má být detekována, navázána na pevnou fázi nespecificky, cestou vazebného partnera, například protilátkou proti protilátkám různých druhů, pak může být přidán konjugát enzym - antigen, který se bude specifický vázat na imobilizovanou protilátku, která má být detekována. Potom je přidán substrát pro enzym, aby se mohl vyvinout detekovatelný signál, v předkládaném vynálezu je vhodně'použit solubilní substrát, který dává signál detekovatelný v roztoku. Toto jě výhodné, protože to zjednodušuje a usnadňuje manipulaci a zpracování velkého množství vzorků a umožňuje to hodnocení produkce protilátek, ačkoliv, jak je ·· · '· »» • · · * · · · ·»« · « · • ·«·' · * · · · · « ·

9999 t 991 ··14 zmíněno výše, absolutní hodnocení kvantity není nezbytné, a pokud je to žádoucí, mohou být získány kvalitataivní nebo semikvantitativní výsledky. Výhodně, substrát může být vybrán tak, aby dával spektrofotometricky detekovatelný signál, který může být snadno určen přečtením absorbance, například za použití standardní ELISA čtečky mikroploten. Kromě toho, mohou být použita standardní ELISA reagens, což má tu výhodu, že se test podle předkládaného vynálezu stane kompatibilním s existujícími metodami a technikami rutinně používanými v klinických laboratořích. Nicméně, jiné detekční/signál generující signály mohou být použity, které činí signál detekovatelným za použití fluorescence, chemiluminiscence atd.

Imunoenzymatické amplifikační metody mohou také být použity pro vylepšení signálu nebo pro zvýšení sensitivity, například za použití avidin biotinové metody jako je Extravidin systém dostupný od Sigma. Biotinylované sekundární protilátky jsou použity jako ELISA reagens, v kombinaci s komplexem peroxidasa avidin. Protože jednaq molekula avidinu je schopna vázat několik molekul biotinu, zvyšuje použití avidin-biotin peroxidasového komplexu povrchovou koncentraci peroxidasových molekul, což dává způsobu větší senzitivitu..·

Materiály-a metody potřebné' pro krok inkubace· (kontaktování) buněk a pro krok detekce vazby protilátek mohou také být váhodně dodány ve formě kitu s pevnou fází potaženou vazebným partnerem. Informace získána z testu podle předkládaného vynálezu může být doplněna použitím jiných testovacích metod. Další a užitečná data o pre existujících serových/plasmatických protilátkách mohou být získána v klasickém ELISA testu. Dále,’ po separaci lymfocytů ze *· ···· • •i · v · • · · · * ··*·' 4 • · ·♦· · 4 ' 4 4

4 · 44 krevního vzorku, pokud je toto provedeno, zbylá plasmatická tekutina může být použita pro detekci preexistujících protilátek za použití stejné pevné fáze potažené vazebným partnerem jako je použit v testu podle předkládaného vynálezu.

Pro zajištění toho, že způsob podle předkládaného vynálezu pracuje spolehlivě může být obsažena vhodná kontrola. Za prvé, srovnání jamkami s· blokovanou syntézou proteinu a jamkami s neblokovanou syntézou proteinů ověří, že vynález je zaměřen na akutní produkci protilátek testovanými buňkami a že není zaměřen pouze- na preexistující'protilátky z periferní krve. V případě . použití purifikovaných lymfocytárních přípravků jako vzorku je zajištěno, že stopové množství stopované protilátky -z periferní, krve ve vzorku lymfocytů neovlivní test. Za druhé, pro zajištění toho, aby zaznamenaný rozdíl mezi signály zblokovaných a z neblokovaných jamek nebyl způsobeny sporadicky a okolními nespecificky, aktivovanými dymfocyty, je použit negativní kontrolní antigen..Tento antigen bude od infekčního agens, které s největší pravděpodobností nezpůsobuje akutní onemocnění pacienta, např. tetanický toxóiď. Počet takových okolních aktivovaných lymfocytů bude za jakýchkoliv okolností o mnoho' nižší než je potřeba pro pozitivní testovací výsledky za použití způsobu podle předkládaného/vynálezu.' Provedení vynálezu bere tento bod.....

v úvahu.

Jak bylo zmíněno, výše, vzhledem ke snadnosti a rychlosti provedení a jednoduchosti je test podle vynálezu vhodný pro diagnostické nebo jiné klinické nébo veterinární použití, např. při chovu ryb. Kromě malého objemu vzorku je další výhodou to, že je potřeba pouze jeden vzorek a ně'vzorky séra Odebírané've 2' až ' '4444 • 44 ··«· « « _t ••4 · 4 4 « 4 9 £ ·*····>·*»*··«

J-O 4 4 4*4 * *

4*4* 44·*4 44 4 týčením intervalu, jak je to vyžadováno pro většinu serologických testů. Pracné zpracování není potřebné a test je snadno automatizován. Kromě toho, je snadno možné testovat různé imunoglobulinové izotypy, pokud je to potřeba.

Výše uvedená testovací metoda podle předkládaného vynálezu poskytuje jednu metodu pro hodnocení přítomnosti nebo rozsahu nastupující infekce prostřednictvím analýzy spontání exprese specifických protilátek k definovanému antigenu. Taková metoda je jednoduše aplikovatelná na hodnocení chorobných stavů, které jsou známé.a ke kterým jsou antigeny týkající se relevantních imunogenů dostupné a tak poskytují specifický markér infekce. V některých klinických situacích, nicméně, nemůže být specifická choroba nebo infekce identifikována a/nebo vhodný antigen nemusí být dostupný pro použití v testu. V takovém případě může být test modifikován na hodnocení přítomnosti nebo rozsahu nespecifických ukazatelů infekce. Tak například, lymfocyty obsahujíc vzorky, např. plná krev nebo její purifikované nebo obohacené lymfocytární přípravky mohou být vyšetřovány s ohledem na jejich produkci infekčních markérů, např. cytokinů nebo interferonů, například- interferonu gamma.

Z tohoto pohledu poskytuje ještě další aspekt vynálezu způsob pro detekci přítomnosti nespecifických ukazatelů infekce ve vzorku krve, kde uvedený způsob obsahuje:

kontaktování, v přítomnosti nebo za absence inhibitoru proteinové syntézy, aliquot uvedeného vzorku, nebo volitelně, •v lymfocytů přímo'izolovaných z uvedeného vzorku, s pevnou fází za podmínek, které umožňují produkci' á sekreci ukazatelů infekce • 4 4 .4 « · ♦ 4 4 • · 4 4 4 • 4 «4*4 4 ·· ·» 44*4 >4-44 <

• 4 4 4 » • . 4 4 4·4· • · · 4 lymfocyty;

detekování v roztoku, vazby ukazatele infekce na vazebný partner pevné fáze; a srovnání vazby uvedeného ukazatele infekce v přítomnosti nebo za absence inhibitoru proteinové syntézy pomocí určení množství ukazatele infekce v uvedeném vzorku.

Pro provedení této metody může být pevná fáze poskytnuta s vhodnými zachycovacími molekulami, například protilátkami k ukazatelům infekce pro detekci. Pro detekci,přítomnosti uvedených ukazatelů infekce imobilizovaných na pevné fázi mohou být použity způsoby jak byly popsány dříve, například.použití značených protilátek nebo ligandů. V této metodě mohou být specifické markéry identifikovány vhodnou volbou.imobílizující skupiny nebo detekční molekuly.·.. Tak, například,, všechny proteiny ve vzorku mohou být imobilizovány na pevném nosiči a detekce může být provedena za použití značené specifické protilátky nebo. ligandu. Alternativně, specifický-vazebný'partner může být použit pro. imobilizaci týkající se ukazatelů infekce a'může být potom vhodně značen, buď pozitivně nebo negativně, například v prvním případě vazbou na'doménu přítomnou na ukazately infekce, ale ne výlučně-na této-molekule, nebo v- druhém případě značením nenavážahého vazebného partnera na pevné fázi. Kity pro provedení tohoto způsobu tvoří'také' část tohoto vynálezu. ¹

Vynález bude nyní popsán podrobněji s odkazem na následujíc nelimitující příklady, ve kterých je testovací způsob podle předkládaného vynálezu označován jako Plasmacute”test.

·* ft··· • ftft ftft· • ♦ ftftft··· 9 • · ft ftft· · ft 9 ft ftftftft « ftft ftft «·· ft * · ftftft ft · ··♦♦ · ftftft ftft ftft ·

Příklady provedení_vynálezu

Příklad 1

Obecný postup

Buňky: . Heparinizováná krev byla odebraná různou dobu po vakcinaci od dobrovolníků, kterým byla podána inaktivovaná vakcina proti chřipce. Krev byla smísena se stejným objemem PBS. Lymfocyty byly separovány Lymphoprep (Nyegaard and Co., Oslo). Buňky byly promyty dvakrát v PBS, resuspendovány (ředění) v Dulbecco modifikovaném Eaglově mediu doplněném 20% FCS, 2 mM L-glutaminem, 100 IU/ml penicilinem a 100 gg/ml streptomycinem (Pen + Střep) = MEDIUM. '

Stop roztok:.· 1 mg/ml.cykloheximidu v PBS obsahuj ícím 10% azid sodný.

ELISA a chřipkové antigeny: Purifikované povrchové antigeny ze tří kmenů viru v chřipkové vakcině byly použité v. klinickém pokusu a zde jsou označeny krátce H3N2,. H1N1 a B.

ELISA plotny: Greiner ΈΙΑ plotny 655001 F-forma, nebo Costar EIA plotny 3590. Potažené 100 μΐ/jemku roztokem 10 ^g/ml proteinu v PBS přes noc při 4 °C. Blokovány v MEDIUM po 1 hodinu při pokojové teplotě. Promyty jedenkrát v PBS.

Test: 100 μΐ ředění buněčné suspense v MEDIUM přidáno do trojích jamek ve dvou paralelních sadách pro každý ze tří chřipkových antigenu. Jedna sada trojích jamek je blokována • · « · · « ·· *·

ΜΙ» · · · « · » · » · • * « · ··♦ ♦ • » * · * ·«· ·· · · * v počátečním kroku přidáním 50 μΐ STOP roztoku. Jsou. inkubovány po různou dobu při 37 °C při 5¾ C0₂ na vzduchu. ELISA plotna je promyta jedenkrát PBS, potom dvakrát PBS s 0,05¾ Tween 20. 50 μΐ/jamku vhodně ředěného králičího anti lidského Ig peroxidasa konjugátu (Sigma) je přidáno a ponecháno při pokojové teplotě po 1 hodinu. Plotna je potom vyvíjena za použití o-fenylendiaminu (OPD) substrátu a je čtena absorbance při 492 nm.

Vzorky odebrané 11 dní po vakcinaci

]	Doba	inkubace buněk: Počet buněk	4 hodiny, 0 hodin = blokované jamky
H3N2	H1N1	B ' '
0/4	h	6,6 x 10⁴	264/522	199/490 '	352/327
0/4	h	6, 6 x 10³	238/290	143/194	331/353

Všechny hodnoty jsou průměrem trojích jamek jako absorbance x 1000.průměr ± 10%

Závěr: 6,6 xlO⁴ = 66000 buněk dávalo signifikantní zvýšení signálu po 4 hodinové inkubaci. H3N2 absorbance stoupla na 98%, H1N1 na 153% a B na 50%.

Toto je reprezentativní pokus. Další testy ukázaly, že inkubace buněk přes noc dala zřetelnější rozlišení mezi blokovanými a neblokovanými jamkami s absorbancí více než 1000. System také pracoval při kratší inkubační době, např. 2-3 hodiny. 10 krát více buněk, např. 6,6 x 10³ buněk/jamku může také, ale ne vždy, dát jasnější rozlišení.

• ·» ·· t · • · · · · « ····*. · · « • * «. · V • ·«« * ·* · · · ·· I·· ·

Přiklad 2

Obecné postupy

Buňky: Heparinizovaná krev byla odebrána 7 dní po vakcinaci od dobrovolníků, kterým byla podána inaktivovaná vakcina proti chřipce. Krev byla smísena- se stejným objemem PBS. Lymfocyty byly separovány Lymphoprep (Nyegaard and Co., Oslo). Buňky byly promyty dvakrát v PBS, resuspendovány' (ředění) v ' . ' v

Dulbecco modifikovaném Eaglově mediu doplněném 20% FCS, 2 mM L-glutaminem, Pen + Střep (jako v předchozím) = MEDIUM...··. .' '

Stop roztok: 1 mg/ml cykloheximidu v PBS obsahujícím 10% ažid sodný.

. Testovací antigeny: Purifikované povrchové antigeny ze tří kmenů vi ru;: v'chřipkové·''vakcině byly použité v klinickém pokusu a zde jsou označeny krátce H3N2, H1N1 a B. ' • ; ' · · '..

’ Kontrolní antigen: Tetanový toxoid (neádsorbóvaný na hliník;

Lederle).

ELISÁ plotny': Grěineř EIA plotny 655Ó01 F-forma, nebo Costar EIA plotny 3590. ^r Potažené 100 μΐ/jemku roztokem 10 μ5/πι1 proteinu v PBS přes noc při 4 °C, tetanus: 10 Lf/ml. Blokovány v MEDIUM po 1 hodinu při pokojové teplotě. Promýty jedenkrát v PBS.

Test: 100 μΐ ředění buněčné suspense v MEDIUM bylo přidáno do trojích jamek ve dvou paralelních sadách pro každý ze tří chřipkových antigenů atetanový kontrolní 'ánťigen. Jedna sada

Μ · • · 9

9 9 • · · · · 9

9

999 9 · trojích jamek je blokována v počátečním kroku přidáním 50 μΐ STOP roztoku. Jsou inkubovány při 37 °C v inkubátoru s 5% CO₂ ná vzduchu po 3 hodiny. Po inkubaci je ELISA plotna promyta jedenkrát PBS, potom dvakrát PBS s 0,05% Tween 20. 50 μΐ/jamku vhodně ředěného králičího anti lidského Ig peroxidasa konjugátu (Sigma) je přidáno a ponecháno při pokojové teplotě po 1 hodinu. Plotna, je.potom vyvíjena, za použití o-fenylendiaminového (OPD) substrátu, a je čtena absorbance při 492 nm. (Test může být modifikován pro zvýšení sensitivity dalším krokem před substrátem za použití 1 hodinového kroku Extravidin/peroxidasa (Sigma). Toto vyžaduje' použití biotynylovaného konjugátu in lieu'peroxidasového konjugátu (Sigma)). , , /.

Representativní experimentální výsledky dní po vakcinaci-(subjekty; č. 1 a č. 2)

Doba.inkubace buněk:	. 3 hodiny,	0 hodin =	blokované	j amky
' Počet buněk-' '	H3N2	’ H1N1 .	B .	Tetanus
0/3 h 10^Ξ č.l	063/410	055/269	206/258	' 046/050
........ č.2	/ 045/077	048/242	182/207,	040/046

Všechny hodnoty jsou průměrem trojích jamek jako absorbahce x 1000.průměr + 16%

Subjekty jsou náctiletí (16 let). Je dobře známé, že mladí lidé odpovídají lépe na A/H1N1 chřipkovou vakcinu. To je jasně vidět výše, oba subj ektý č. ‘ I a či’ odpovídá jí dobře. Nicméně, ·· · · ·» • · · * · · • · · Φ Φ φ φφφφ*· »- φ · φ · φφφ

ΦΦΦ * φφφ «φ

Φφφ · • φ

ΦΦ φ obvyklé vakciny odpovídají různě na různé složky vakcin, takže musí být očekáván rozdíl v absorbanci. Toto je zde demonstrováno, kdyý subjekt č. l odpovídá slabě na B virus, zatímco č. 2 odpovídá signifikantně pouze na H1N1 virus.' Jak je očekáváno, žádný z nich neodpovídá ne tetanový toxoid. Pokud nicméně byly buňky stimulovány in vitro toxoidem po dobu několika dní, jejich časná imunologická paměť . (díky dětské vakcinaci) může vést k produkci tetanových protilátek. V reálné případu infekce testovaném v diagnostické laboratoři za použití metody podle předkládaného vynálezu bude pouze testované agens/antigen dávat pozitivní signál.

Příklad 3

Obecné postupy:

Buňky: Heparinizovaná.krev byla odebrána 6 dní po vakcinaci'od dospělých (muži věku 24 let) a dětí (muži věku 3 let) , kteří, dostali inaktivovanou podjednotkovou chřipkovou vakcinu.

Lymfocyty byly separovány jak je popsáno v příkladech. 1 a 2. .· Buňky byly uvedeny do kontaktu s pevnou fází nesoucí antigen H3N2, H1N1 a B jak je popsáno v příkladech.1 a 2 po.3 hodiny při 37 °C, a potom test probíhal' jak je popsáno (žádný stop roztok nebo kontrolní antigen nebyl použit v tomto pokusu):

Tabulka 1 ukazuje výsledky od dvou jedinců, u kterých jsou výsledky pro každý antigen průměrem trojích jamek jako absorbance x 1000.

• φφ · · φ · · φ • Φ φ · · ·'' φ φ

Φφφ · · · φ φ ' · φ φφ* φ φφφ φ i φ φ φ· φφ φφ φ ·· φ • φφφ

Tabulka 1

dospělý subjekt	dětský subjekt
počet buněk „( tisíce)	A/H3N2	A/H1Ň1	B	počet buněk (tisíce)	A/H3N2	A/H1N1	B
224	475	322	913	²⁷⁵	1268	97	10 '
112	189	.193	567	138	951	. 65	10
56	93 '	62	'162	.69·	.672	51	20

τ ' . ‘

Výsledky ukazují, že malé dítě, mající pouze jednu časnou' epizodu chřipky, A/H3N2 infekci,· má velmi silnou imunitní odpověď na A/H3N2' složku, v. trivalentní vakcině. Jak bylo očekáváno pro toto' dítě,-.'.'nebyla;.zde'.žádná odpověď na A/H1N1 nebo

B složku. Takto; malé.·dítě'obvykle¹ potřebuje 2;.'dávky .vakciny pro ů i ¹ vyvolání dostatečné imunitní· odpovědi? Okolo 70000 lymfocytů,. což koresponduje asi 70 μΙ.objemu plné krve, bylo dostačující pro . ··.

* definitivně pozitivní; výsledek. Pro-dospělý'subjekt, . který měl mnoho epizod chřipky, nebyla odpověď takto silná, přesto však byla signifikantní prď všechny tři/složký vakciny, ' ďkdýž v různém stupni. Pro B složku bylo-potřeba asi-100000- lymfocytů pro pozitivní výsledek, zatímco pro dvě A složky bylo potřeba minimálně 100000 buněk a lépe 200000 buněk.

* · * · · · · · · · · »«». ·«···

Z4 * ·*♦· · · · · * ··· · • * · * · * · ··«« r ··* «· · 4

Příklad 4: Detekce Herpes simplex typ 2 klasickou testovací metodou a Phasmacute testovací metodou

Obecné postupy

Tkáňová kultura a serologické analýzy

Materiál z,genitálií pěti subjektů majících příznaky podezřelé z genitální infekce virem herpes byly podrobeny rutinnímu postupu tkáňové kultivace s cílem detekovat virus ze vzorku (provedeno Virus Laboratory,· Haukeland University Hospital, Bergen) . Stejná laboratoř provedla rutihí serologické analýzy sérových vzorků za použití.komerčních ELISA.kitň (Behringer-Enzygnost od Behringer, Germany obsahujících HSV antigeny přo. detekci IgG a IgM.

Separace lymfocytů.·.

Lymfocyty byly. separovány za použití lymfoprepu (Nycomed) ..centirfugace podle gradientu density hepairinizované krve od pěti ř subjektů majících-příznaky podezřelé z genitální infekce virem herpesodebrané,-simultáně se vzorkami pro analýzu v laboratoři. Buňky byly promyty třikrát v PBS, resuspendovány v kultivačním

- mediu DMEM obsahujícím 20% FCS, l.mML- glutamin, 50' lU/ml , penicilinu, a 50 ýig/ml streptomycinu (DMEM/FCSj·. ‘Přežívající buňky byly počítány vylučováním trypanové modři (0,2%).

Plasmácute.‘test za .použití Behringer Enzygnost anti-HSV IgM a IgG ELISA

Behrenger- Enzygnost anti- HSV IgM a IgG jsou dodány jako proužky • · * • * · * · « · * · · » · · · ···· · ··· ·· » *' ♦ * ···· obsahující 8 jamek potažených antigenem odvozeným od permanentních opičích buněk ledvin infikovaných HSV a 8 jamek potažených kontrolním antigenem od neinfikovaných buněk. Proužky byly blokovány 200 μΐ/jamku DMEM/FCS při 37 °C v 5% CO₂ po 1 hodinu. Jedno sto μΐ na jamku vhodného ředění lymfocytů bylo přidáno a inkubováno po 3 hodiny pří 37 °C v 5% C0₂ . Všechny další postupy byly přesně podle instrukcí daných dodavatelem kitu. Plotny byly vyvíjeny za použití konjugátů, reagens a pufrů dodaných stejným dodavatelem. Substrát, tetramethylbenzidin hydrochlorid (TMB), vyžadoval čtení OD při 450 nm, za použití dostupné Titertek Multiskan MCC/340 čtečky ploten (Flow Laboratories).

Plasmacute test za použití Bioelisa HSV-2 IgG

Bioelisa IgG HSV-2(Biokit, Spain) je dodán jako proužky obsahující 8 jamek-potažených inaktivovaným HSV-2 antigenem. Proužky byly blokovány 200 μΐ/jamku DMEM/FCS při 37 °C v 5% C0.₂po 1 hodinu. Jedno sto μΐ na jamku vhodného ředění lymfocytů bylo přidáno a inkubováno po 3 hodiny při 37 °C v 5% C0₂. Všechny další postupy byly přesně podle instrukcí daných dodavatelem kitu. Plotny byly vyvíjeny za použití konjugátů, reagens a pufrů dodaných stejným dodavatelem) Substrát, tetramethylbenzidin hydrochlorid¹ (TMB), vyžadoval čtení OD při 450 nm, za použití dostupné Titertek Multiskan MCC/340 čtečky ploten (Flow . Laboratories).

Plasmacute test za použití Bioelisa HSV IgM

Bioelisa HSV IgM (Immůnocaptuře) test (Biokit, Spain) je dodán

99 9 • · 9

9 9 9 • 9

9 9!· jako proužky obsahující. 8 jamek potažených králičími ánti lidský IgM protilátkami. Proužky byly blokovány 200 μΐ/jamku DMEM/FCS při 37 °C v 5% C0₂ po 1 hodinu. Jedno sto μΐ na jamku vhodného ředění lymfocytů bylo* přidáno a inkubováno po 3 hodiny při -37 °C v 5%

CO₂, Všechny další postupy byly přesně podle instrukcí daných dodavatelem kitu. Přesněji, navázaná protilátka byla detekována 100 μί/jamku HS-V antigenů značeného křenovou peroxidasou (purifikovaný a inaktivovaný HSV, který byl propagován in vitro v lidských fibroblastech)' a pro minimalizaci nespecifických reakcí neznačeného kontrolního antigenů, skládajícího se z .neinfikovaných buněčných složek (dodaných s křtem); 10 μΐ HSV antigenů a 10 μί kontrolního antigenů na jamku, Plotriy byly čteny· na Titertek Multiskan MCC/340 čtečce ploten (Flow Laboratories). .

^Výsledky pokusu jsou ukázány v tabulce 2. .

·· •» · · · ·

....

·* * « »· ···· ·· · ·· ·

Tabulka 2 u

0)

OJ

XJ > Φ 44 U

C U 3 OJ '(0 u U H fU

S-rl ε

Λ XJ 01 U O <U (0 54 H N Q.CL

XJ

0)

OJ

Jj

OJ u 3 O rc ε co UJ .—! Cí β

n ~ S <U 01 o u ιβ· a

•rt rt (U JI O Hi4

Cl

C C Ci u ~

c.

-II

Cl o o o c a tn ω o v <r

O

O o

rt

G <3 a, g

tn (N

G	G	G
G	G	tn
O	e	CN
to	—	rt
σ\ '	ÍN	CN

a c

o jj

Q O O G G tn tn o

G

Lfl

		<y
44		,-
Xj.		^c á
'Φ		-2 =
r-1		c -a
Ή		2.²
XJ .	c
0	-Cl				u
Í4		s		• - ’	- X
0.
'OJ
>				G
0 0				Έ	Λ O
'OJ				<w u	rt
ai -	‘ _r ·
					o
	Cl				rt —
		¹	1	¹	·

OJ
o
tu 3
r-l U
0. -H			Pí ?J
N >		1	1 1
	’ 41	>	> >	<t)
	>	^rn	cn 71	>

Ή			M rt
•X. 3 Φ
ř—1 M U O	\r4		3	Ή	Ή
44 C 3 44	o a)	C .OJ	XJ	3 OJ	3 OJ
0 O OJ OJ	o υ	0 u	3 OJ	ix υ	Sx (J
Oi'(U 3 w	'fU 44	'(U 44'	OJ O	'<U 44	'fU 44.
ό ε 3 c	ε oj	E OJ	O 44	ε oj	£ OJ
0) -η 34 -u	•Η M	•H <W	3 OJ	H tu	iX U4
»x Sx 0)	ÍX 3	tx 3	44 <w	ti a	O 3
a o. o	Οι·Η	Qj-H	0) 3	Οι Ή	CL-h

•3

34 34 O & (OXD a: c >

U NX, o m w χ (U 'flj >U OJ XJ C 0.0) u

c a>

	o		rt	ÍN	—
a		<N		CN	Pí
<		'«s
	u	£fa	rt	íx	ÍL·
	to	to	Pl O	<n o\	rt
			P4	rt

netestováno o

tu

CL

II

Tabulka 2 shrnuje data prd pacienty 1-5. Diagnostická laboratoř v Haukeland University Hospital se pokusila izolovat virus z klinických vzorků a také provedla rutinní ELISA testy na sérové IgG a IgM za použití Behringer Enzygnost ELISA křtů. Je uveden typ izolovaného viru, -ve znamená negativní izolaci. Sérové ELISA hraniční hodnoty jsou definovány výrobcem kitu; + OD >0,2, hraniční- OD 0,1 /0,2, definováno jako neurčitý výsledek výrobcem kitu; a -~ = OD <0,1.

Pro Plasmacute test jsme použili OD > 0,2 jako ózítivní a v tabulce jsme uvedli počet lymfocytů nezbytných pro vyvolání takové odpovědi. ’

Pouze Bioelisa IgG test si nárokuje identifikaci HSV2 f protilátek, zatímco .ostatní ukazují infekcí HSV (1 a/nebo 2).,

Výsledky

Pacient 1 měl klinické příznaky-primární HSV-2 infekce. Nemocniční^testy selhaly při 'izolací-viru z klinického vzorku a žádný IgM nebyl nalezen při standardním-ELISA testu. Hraniční, sérové IgG protilátky byly nalezeny standardními nemocničními ELISA těsty.’V potvrzení těchto,výsledků zde nebyly nalezeny žádné buňky,^: které- by produkovaly IgM-protilátky v Plasmacute;.,,. testu. Jak Behringer IgG, tak Bioelisa IgG Plasmacutre testy detekovaly buňky produkující IgG protilátku k'HSV.- 205000 lymfocytů bylo potřeba pro pozitivní hodnotu absorbance v Plasmacute testu a v Bioelisa IgG bylo vyžadováno 103000 lymfocytů pro dosažení pozitivní absorbance.

·· ♦ • ♦ ··« « * * ♦ « » • · ♦ »««· • ·

U pacienta 2 proběhla primární infekce, což bylo potvrzeno izolací viru HSV typ 1. Žádný sérový IgM nebyl detekován v nemocniční laboratoři, ale IgG protilátka byla detekována. V Plasmacute testu nebyly detekovány žádné buňky produkující IgM, nicméně, jak Behřinger, tak Bioelisa Plasmacute test detekoval IgG produkující buňky, 223000 a 111000 buněk bylo potřeba, v příslušném pořadí.

Pacient 3 měl rekurentní HSV-2 infekci, která byla potvrzena izolací HSV-2 viru z klinických vzorků. IgG byl přítomen v klinickém vzorku odebraném 2 dny po nástupy klinických příznaků, nicméně žádný sérový igM nebyl v tuto dobu detekován. V Plasmacute testu nebyl žádný IgM detekován 2 dny po nástupu klinických příznaků, nicméně jak Behringer, tak Bioelisa Plasmacute test detekoval IgG produkující buňky (bylo požadováno 43000 - 96000 buněk);) . IgM sérové protilátky byly detekovány nemocnicí v sérovém vzorku, odebraném 20 dní po nástupu klinických příznaků. 132000' byly,požadováno pro produkci.pozitivní' absorbance v Plasmacute Behringer IgM testu, nicméně žádné buňky nebylydetekovány v Bioelisa. IgM Plasmacute testu.

Pacient 4 měl primární infekci HSV. žádný virus nebyl detekován v klinickém vzorku zaslaném do nemocniční - laboratoře. Hraniční sérové IgM protilátky byly detekovány a byly nalezeny pozitivní hladiny sérových IgG protilátek.· Jak IgG, tak IgM protilátky byly detekovány v Plasmacute testu za použití jak Behringer, tak Bioelisa kitu ve vzorcích krve odebraných 5 a 19 (žádný Behringer IgM nebyl detekován) dní po nástupu klinických příznaků. V Plasmacute testu bylo vyžadováno méně než 8000 buněk pro Bioelisa IgM' test a 60500 buněk bylo vyžadováno pro Behringer♦ίι *· 99 ««·· ·· · · « · . * • · · · · «' «' * ·' * « ··♦·!

• · · · >

·· «· ·» 4 ·· * ♦' « · • · · • ···· • · ««»· «:

IgM test a oba tyto vyžadovaly méně než 100 μΐ heparinisované krve.

*

U pacienta 5 bylo podezření na primární infekci HSV. Nicméně, laboratoří nebyl izolován žádný virus a nebyly detekovány žádné sérové protilátky. V Plasmacute testu nebyly detekovány žádné buňky produkující IgG nebo IgM protilátky k HSV.

Diskuse

Plasmacute test byl ukázán jako funkční jak pro primární, tak pro rekurentní_: infekci herpes simplex. Ve všech^případech byl Plasmacute test alespoň stejně účinný jako tradiční ELISA postupy zde použité. Jednotlivě, pro pacienta 1, ačkoliv nebyl z klinického vzorku izolován žádný virus, a skorování bylo pouze hraniční (t.j., ne směrodatné:)?·· v rutiním nemocnočnim testu, Plasmacute. test;. (BioelisaIgG' a Behtinger IgG) ukázal, še přibližně 100000 buněk a 200000 buněk, v příslušném pořadí, dává nedvojsmyslné pozitivní výsledky. Je možné, Že tento pacient má dvojitou infekci .(HSV1 a HSV2) , ze které byl pouze HSV1 . zaznamenán v místě izolace viru. Nemůže být nicméně vyloučeno, že pozitivní HSV2 výsledek (Bioelisa IgG) byl způsoben serologickou zkříženou-reakcí^ Pro dva časově vzdálené vzorky od pacienta 4, od kterého nebyl izolován žádný virus, ukázal Plasmacute-test posun počtu herpes specifických IgM a IgG produkujících lymfocytů od časné fázi k pozdní fázy infekce, což je slučitelné s_;dobře známou dynamikou po primární infekci a jasně to potvrzuje aktivní imunitní odpověď. Bioelisa IgM Plasmacute test byl zejména sensitivní, protože méně něž 8000 lymfocytů bylo požadováno pro vyvolání pozitivního signálu v prvním ze dvou vzorků.

4' j

♦ · ·

Β ····

V tomto pokusu jsme ukázali, že Plasmačute metoda je účinná pro klinické případy virových infekcí u lidí.

Příklad 5: Mnohonásobné disky - Potažení nitrocelulosoyých disků protilátkami specifickými pro IgG, IgA a IgM protilátky.

Tento pokus byl proveden pro stanovení toho, zda systém mnohonásobných disků může být použit v Plasmačute testu pro detekování protilátek různých-specificit.

Obecné postupy:

Vzorky heparinizované plné krve byly odebrány od dvou zdravých dospělých subjektů. Protože tyto subjekty nebyly v akutní fázy jakékoliv infekce, dali jsme si za cíl analyzovatIgG,. IgA a IgM spontání protilátkovou^sektreci bez ohledu na jejich (neznámou) antigenní specifícitu·. . í -

Subjekt l byl použit pro stanovení systém používající disků potažených 3 toho, zda může být použit různými antigeny v jedné jamce v Plasmačute testu. Jedna jamka (č. 1).

Subjekt 2 byl použit pro stanovení toho,” zdá existuje oslabení signálu za přítomnosti počtu disků potažených- stejným antigenem. . 1

Tři separátní jamky v Plasmačute testu (jamky Č. 2, 3 a 4) .

Separace lymfocytů

Lymfocyty byly separovány za použití lymfoprepu (Nycomed) centrigáce podle gradientu děnšity heparinizované krve. Buňky ·· ·· »Μ·

byly promyty třikrát v PBS a resuspendovány v kultivačním mediu DMEM obsahujícím 20% FCS, 1 mM L- glutamin, 50 lU/ml penicilinu a 50 gg/ml streptomycinu (DMEM/FCS). Přežívající buňky byly počítány vylučováním trypanové modři (0,2%) .

Plasmacute test používající disků jako pevné fáze

Směsné estery celulosových disků s velikostí pórů 8 μΜ (Millipore SCWP 01300) byly potaženy 10 μ9/τη1 kozími anti-lidskými pro třídy specifickými protilátkami. (Sigma, anti-IgG 1-3382; anťi-IgA 1-0884; ailťi-IgM 1-0759) ředěnými v PBS azidu (0/001%) přes noc při pokojové teplotě. Disky byly blokovány DMEM/FCS při-37 ^aC v 5% CO₂ po 1 hodinu. Lymfocyty bylý přidány k 12 mm čirým příčným jamkám (clear transwell) s velikostí pórů 0,4 μΜ .(Costar 3460) a disky byly umístěny na spodní stranu a inkubovány. po.-.dobu 3 hodin při 37 °C v 5% C0₂. Jednotlivé 'disky.byly. přeneseny do separátních jamek 24 jamkové plotny (Costar) a byly 3x promyty PBS a 3x PBS Twe.en (0,05%) . Navázaná- protilátka byla detekována' 200 μΐ/jamkukozími anti-lidskými pro'třídu'specifickými s peroxidasoú konjugovanými protilátkami (Sigma/.IgG A-6029; IgAA-4165; IgM A-4290) ředěnými v DMEM/FCS a inkubovanými 2 hodiny při pokojové teplotě. Disky byly promyty pro' odstranění“ nenavázané protilátky, jakbylo.......

popsáno dříve- á vyvíjeny za použití -200 μ-1/jamku - / · o-fenylendiamin-dihydrochlorid (OPD) (Sigma P-7288) v..0,05 M fosforečnanovém-citrátovém pufru (pH 5,0). Třicet minut po přidání substrátu byl vývoj ukončen za použití 100 μΐ/jamku ÍM H₂SO₄- Jedno sto μΐ na jamku bylo přeneseno do 96 jamkové ELISA . plotny (Greineer EIA plotny 65501 F-forma) a OD byly čteny na Titertek Multiskair MCC/340 čťečce ploten' (Flow Laboratories) při' • ft ftftftft

492 nm.

Výsledky pokusů jsou ukázány v tabulce 3, ve které jsou výsledky pro každou zachycovaoí protilátku průměrem ze tří jamek jako absorbance x 1000.

• Φ · • · e • · • «♦·· • ·' ···« φ

♦

ΦΦ • «a

φφ· 'Φ'Φ'ΦΦΙ • φ φ • ί · ' φ φφφ · *

ΦΦ' ·

Tabulka 3

ι/Ι UJ <9 ¢7¾ /ϊ

9 • · 9

9 9

9999 «

9

9999 9

9999

9 9

999 9

9 • 9 9

Jamka 1 obsahovala 2 miliony lymfocytů, jamky 2-4 obsahovaly 1 milion lymfocytů. buňka ukazuje, které číslo disku byly umístěno nejblíže k vrstvě buněk.

Výsledky:

Test se subjektem i ukázal, že i 9 disků může být snadno použito v jamce obsahující lymfocyty. Odpověď pro tři IgG disky, tři IgA disky a tři IgA disky byly pro všechny praktické účely identické pro každou sadu, což ukazuje, že aktuální umístění disku vzhledem k protilátce není zásadní. Test s lymfocyty od subjektu 2 ukázal, že alespoň 8 identicky potažených jamek může být umístěno v jedné lymfocyty obsahující jamce za vzniku prakticky shodných výsledků. Tak vynález- umožňuje mnohonásobné testy pro stejné přípravky lymfocytů v jedné jamce.

Claims

1. Způsob pť©· detekování aktivní produkce protilátek v odpovědi na cílový antigen v krevním vzorku vyznačuj ící se t i m, Še obsahuje:

a) kontaktování, v přítomnosti nebo za absence inhibitoru proteinové syntézy, aliquot uvedeného vzorku, nebo volitelně, lymfocytů přímo izolovaných z uvedeného vžorku, se pevnou fází za podmínek, které umožňují produkcí protilátek a jejich sekreci lymfocyty;

I ' '

b) detekci vazby protilátky na uvedený antigěn(y) na pevné· fázi v roztoku; a

c). srovnání vazby, uvedené, protilátky v přítomnosti, nebo za absence inhibitoru.proteinové.syntézy, čímž se získá určení množství aktivní sekrece protilátky v odpovědi na uvedený antigen(y). .

2. · Způsob podle nároku. 1 v. yznačují. cí se tím, še uvedená pevná fáze nese jeden nebo více antigenu.

;rozpoznávaných protilátkou-'nebo protilátkami, které-mají být. , detekovány; ...... . ........ ³

3. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že uvedená pevná fáze nese jednu nebo více protilátek, které rozpoznávají protilátku nebo protilátky, které mají být detekovány.

4 4 4

4 4 4 44 '4

4 4

44 44 4

44 « • r ·« 4 *·· 4«

4 4' ,·«·! 4 4 - ·

4 4

44 4 4

4 ·

44 4 až 3

4. Způsob podle jakéhokoliv z předešlých nároků 1 vyznačující setím, že vzorek krve použitý ve způsobu, nebo použitý pro přípravu lymfocytů pro použití ve způsobu, má objem menší než 1 ml.

.

5. Způsob podle jakéhokoliv z předešlých nároků 1 až. 4 vyznačujícísetím, Že způsob je. proveden na vzorcích krve od novorozenců nebo dětí pro odlišení mezi nově syntetizovanými protilátkami a pasivně přenesenými mateřskými, protilátkami.

6. Způsob podle jakéhokoliv z předešlých nároků l aš 5 vyzná č ují č í's e t í m, že vzorek krve je získán postupy purifikace nebo obohacení krve získané přímo od pacienta.

7. Způsob podle jakéhokoliv z předešlých nároků 1 až 6 vyznač u j' i' c. í s; e t i m, že lymfocyty, které jsou'přímo izolovány z uvedeného vzorku,. jsou použity ve způsobu.

\ .

8. Způsob podle jakéhokoliv z předešlých nároků 1 až 7 vyznačuj ícís^Jetím,.že před krokem kontaktování . nároku 1 je pevný nosič blokován.

9. Způsob podle jakéhokoliv z předešlých nároků ,1' aš ,8 vyznačujícísetím, že inhibitor proteinové syntézy je cykloheximid použitý v koncentraci 50 ? 500 Mg/ml.

10. Způsob podle jakéhokoliv z. předešlých nároků 1 až '9vyznačuj ícísetím, že inhibitor ATPasy je použit v konjunkci s. inhibitorem: syntézy .proteinů. ...... ... .

*9 ·'»··

11. Způsob podle jakéhokoliv z předešlých nároků 1 až 10 vyznačující se t í m, že krok detekce nároku 1 je proveden imunotestem.

12. Způsob podle nároku 11 vyznačující se tím, že imunotestem je ELISA.

13. Způsob podle jakéhokoliv z předešlých, nároků 3 až 12 vyznačujíc. íse.tím, že jeden nebo více antigenů rozpoznávaných protilátkou nebo protilátkami, které'mají být detekovány, imobilizovaných na uvedené pevné fázi je uveden do kontaktu s uvedenou pevnou fází.' ¹

14. Způsob podle jakéhokoliv i předešlých nároků 2 a 4 aš 12 vyz.naču j í c í s e t í m, že jedna nebo .více protilátek rozpoznávajících protilátku nebo protilátky, které mají být detekovány,, imobilizovaných sna, uvedené pevné fázi je uvedeno do kontaktu s uvedenou -pevnou·.· fází.

15; Způsob podle jakéhokoliv z předešlých nároků 1 až 14 vyznačuj í c-í s e. t í m, že solubilní substrát je-použit pro krok detekce nároku 1 a dává spektřofotometricky detekovatelný signál______ _____ . _____________

16. Způsob podle jakéhokoliv z předešlých nároků 1 až 15 vyznačuj ícísetím, že je použit negativní kontrolní antigen.

ll ¹ _f

17. Způsob podle jakéhokoliv z předešlých nároků 1 až 16 vyznačuj ícísetí m,'še je detekována aktivní ·· « • · · * * * β «·ββ * » » ··· * · ·· ···· »1 o

·»» ·· • · • · 4 t · • · • » · • 4 · ·»« 4 • ♦ ·· · produkce protilátek k Herpes viru.

18. Způsob podle jakéhokoliv z předešlých nároků 2 a 4 až 17 v y z n a č u j/í c í. s e t í m, že je využito více pevných fází, která každá nese různý cílový antigen.

19. Způsob pro detekování přítomností nespecifických ukazatelů infekce ve vzorku krve vyznačuj ící setím, že obsahuj e:

kontaktování, v přítomnosti nebo za absence inhibitoru proteinové syntézy/ aliquot uvedeného vzorku, nebo volitelně,.· lymfocytů přímo izolovaných z uvedeného vzorku, se pevnou fází za podmínek, které umožňují produkci sekreci ukazatelů infekce lymfócyty;

detekci , vazby; ukazatele inf ekce? na ·, vazebným partner na pevné fázi; a srovnání vazby uvedeného ukazatele infekce v přítomnosti nebo za absence- inhibitoru proteinové syntézy, čímž- se získá určení . množství ukazatele infekce v uvedeném vzorku.