JPH11500226A - 抗体産生の検出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、タンパク質合成阻害剤の存在下および非存在下において、血液サンプルのアリコートを、リンパ球による抗体の産生および分泌を許容する条件下で固体相と接触させ；固体相上での抗原（１以上）への抗体結合を溶液中で検出し；そしてタンパク質合成阻害剤の存在下または非存在下における該抗体結合を比較し、これにより該抗原（１以上）に応答した能動抗体分泌の量の測定値を得ることからなる、血液サンプル中で標的抗原に応答した能動抗体産生を検出する方法、およびこの方法を行うためのキットを提供する。この方法を改変して、非特異的感染インディケーターの検出を可能にすることもできる。

Description

【発明の詳細な説明】 抗体産生の検出 本発明は、抗体産生の検出に関し、詳しくは、改変した酵素結合免疫吸着アッ セイ(ELISA)を用いて、感染または予防接種などに応答した血液サンプル中での 能動抗体合成を検出することに関する。 ELISA は、抗体（または抗原）を検出および測定するために以前から使用され ている。最も一般的には、ELISA は血清学的アッセイに用いられるが、抗原また は抗体の免疫学的特性の研究にも用いられ、例えば免疫応答の評価および特性決 定、細胞培養による抗体産生の調査、ハイブリドーマ技術などにしばしば使用さ れている。 その感度、簡便さ及び容易性により、および操作が迅速なため、この技術は診 断手段として広く採用されており、今では臨床実験室においてルーチンに使用さ れ、感染または予防摂取に続いて産生される、感染性物質に対する血清またはプ ラズマ中の抗体を検出している。すなわち、例えば HIV 感染の多くの試験は、 被験者（または患者）の血清またはプラズマ中のウイルスに対する抗体を従来の ELISA アッセイを用いて検出することに基づいている。 しかしながら、このような簡単な血清学的 ELISA 試験は、サンプル中の標的 抗体の存在を測定するだけなので、抗原に応答した進行中の抗体合成と、過去の 感染から既に存在している抗体または受身移入による抗体などとを区別すること ができない。幾つかの場合には、抗体の存在についての情報を得るだけで充分で あろうが、他の場合には、検出された抗体が、試験したとき に、例えば予防接種コース中に、リンパ球により実際に合成されたのかどうかを 決定できるか、あるいは乳児の感染の診断において、受動移入した母性抗体と区 別できることが望ましい。これは古典的 ELISA 方法では達成できない。 従って、進行中の抗体合成の検出を可能にする他の方法が開発されてきた。こ れに関しては、例えば Czerkinsky et al．により ELISA and other Solid Phas e Immunoassays，Ed．D.M．Kenneny and S.J．Challacombe，1988，Chapter 10 ，217-239 に概説されているような酵素結合免疫スポット(ELISPOT)アッセイ（ スポットELISA または ELISA-プラークアッセイとしても知られている）を特に 挙げることができる。 ELISA 法に基づいたこの技術は、１以上の標的抗原に対 する抗体を分泌するリンパ球の計数を可能にする。基本的には、ELISPOT は ELI SA 法の変更法であり、こうして、標的抗原を塗布した特別に改変された ELISA ウェル中でリンパ球を培養することにより、かつ、標準的 ELISA 試薬を、分泌 細胞付近で着色した沈澱（スポット）を生じさせる酵素-基質複合体で置き換え ることにより、抗体分泌細胞(ASC)を示すことができる。次いでスポットを計数 して、抗体産生細胞数の測定値を得ることができる。タンパク質合成阻害剤を培 養培地に含ませて、検出されたスポットがインビトロインキュベーション期間中 の新たな(de novo)抗体合成によることを確認することができる。 ELISPOT 技術は体液性免疫応答の動力学の研究において極めて有用であること が証明されており、また、免疫された被験者の末梢循環中に過渡的に現れる自発 的 ASC を検出するのに使用されてきたが、この方法の幾つかの特徴により、臨 床診断セッティングにおけるその使用は制約されている。第一に、各サンプルに ついて個々のスポットを計数する必要があり、時間の浪費と苦労を伴うことがあ るので、この方法は、臨床診断実験室において生じる ような多数のサンプルの分析のために特に適したものではない。第二に、各サン プル中の抗体分泌細胞の数のみが計数され、また一般的にいって、これにはかな り大きなサンプル体積、例えば数 ml が必要である。また、ELISPOT プレートは 高価であり、アッセイは容易にオートメーション化できない。 従って、抗体検出技術の進歩にもかかわらず、実施するのが簡単、迅速かつコ スト上有効であり、自発的に分泌された抗体の正確な定量を高信頼度で可能にし 、新たな抗体合成を識別することができ、そして特に、診断の目的で血液サンプ ルについて実施することができるアッセイに対する要求があることが判るであろ う。本発明は、この要求を取り扱うものである。 従って一つの観点において、本発明は、血液サンプル中で標的抗原に応答した 能動抗体産生を検出する方法を提供し、この方法は、 タンパク質合成阻害剤の存在下及び非存在下において、血液サンプルのアリコ ート、または所望により該サンプルから直接単離されたリンパ球のアリコートを 、リンパ球による抗体の産生および分泌を許容する条件下で固体相と接触させ、 固体相上での上記抗原（１以上）への抗体結合を溶液中で検出し、そして タンパク質合成阻害剤の存在下または非存在下における上記抗体結合を比較し 、これにより該抗原（１以上）に応答した能動抗体分泌の量の測定値を得ること からなる。 本明細書中で使用するように、「能動抗体産生」は、能動的な進行中の免疫応 答の結果として、アッセイの経過中に能動的に抗体を産生しているサンプル中の リンパ球により産生される自発的に分泌された抗体を指す。全ての場合、抗体は 、本発明のアッセイ方法の前またはその間にインビトロではな くインビボで提示された抗原に向けられる。 ここで使用するように、「該抗原に応答した能動抗体分泌」という表現は、使 用した抗原が初めから免疫応答を刺激する免疫原ではなかったとしても、能動的 に分泌された抗体が、使用した抗原に結合することを意味することを意図してい る。すなわち、アッセイに使用した抗原、およびインビボで抗体の産生を刺激し たかまたは刺激しつつある免疫原の両方は、同一または非常に類似したエピトー プのために、検出すべき抗体に結合するであろうが、他の点では、抗原および免 疫原は同一でなくてもよい。すなわち、本発明の方法に用いられる抗原は、関連 する免疫原、例えば感染した個体に由来する免疫原の全部または一部を含有する 材料、あるいは同一または類似の材料から精製した部分であってもよいが、抗原 は同様に合成的に、例えば化学的合成または組み換え発現により、自然抗原と比 較して付加部分または欠失部分を有するように調製することもできる。従って、 適切なエピトープ（１以上）のみを発現する融合タンパク質または分子を使用で きる。 一般的にいって、本発明の方法は、血液サンプルからのリンパ球を、リンパ球 による抗体の産生および分泌を許容する条件下で、適切な固体表面と接触させて 検出すべき抗体を固定化させ、次いで、細胞を除去し、固体相上での抗原への抗 体結合を検出することを伴う。タンパク質合成阻害剤の存在または不在において 、検出された抗体結合のレベルを比較することにより、新たな抗体合成を識別お よび定量することができる。 驚くべきことに、本発明の方法は、小さい血液サンプル体積（例えば、数μl ，1ml 未満）を用いて、リンパ球を固体相とともにインキュベーとする前の前培 養工程なしに、刺激されないリンパ球による自発的抗体産生を直接的に検出する ことを可能にする。換言すれば、サンプルからのリンパ球は、 前処理または刺激、例えば抗原によるインビボ刺激を行わずに、本発明のアッセ イ方法に直接使用される。従って、サンプル採取時にリンパ球により分泌された 抗体を検出することができる。こうして、このように小さいサンプル体積を用い ても、試験抗原に応答した自発的な進行中の抗体合成を、リンパ球の傍観者(bys tander)活性化と有利に区別することができる。また、リンパ球は、細胞を刺激 していかなる記憶をも現すことなく自発的に抗体を分泌する状況でアッセイされ る。これは、インビボ抗原刺激による試験感度の上昇を利用した他の公開された 方法とは著しく異なる。他方において、本発明は、自発的な抗体分泌を利用して 、進行中の感染の徴候である血液中での抗体産生を試験抗原により検出するのを 可能にする。プラズマリンパ球は、感染または予防接種などの後の最初の２〜３ 週間に抗原に対する抗体を分泌するであろう。本発明の方法によるこのような抗 体の検出は、感染の診断または決定、あるいは予防接種に対する抗体応答のモニ ターなどを可能にする。これは、新たに合成された抗体を、受動移入した母性抗 体から区別することが重要である乳児および新生児において特に有用である。同 一の血液サンプルは、幾つかの別個の感染性物質に対する抗体について、関連す る複数の抗原を用いた別のアッセイまたは同じアッセイで分析することができる 。こうして、患者が示す臨床的症状と調和した関連接触抗原を使用することがで きる。感染を診断する際には、進行中の抗体合成を、以前の感染から既に存在し ている抗体と区別できることも重要である。インビトロでの抗原刺激により免疫 学的記憶を回復させることは、進行中の急性感染の同定を目的としたアッセイと は調和せず、それ故に抗原刺激に基づく従来法は、この利点を共有しない。また 、抗原刺激工程を含むことは、従来技術の方法と比較して極めて迅速に実施され る本発明のアッセイの有利な時間ファクターを傷つけるであろう。 本発明の方法により検出するために抗体が向けられる抗原には、バクテリ アおよびウイルスの両方の抗原が包含される。臨床的に重要な抗原としては、例 えば単純疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)お よび全ての肝炎ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。このような抗 原の検出は、例えば血液スクリーニングの目的で、あるいは感染の証明および／ またはモニターの目的で、被験者が感染しているかどうかを迅速に確証する。本 方法は、これが簡単であるために特に有用であり、例えばフィールドの局面にお いて精巧な装置を利用できない場合に使用することができる。 本明細書で使用するように、「検出する」および「量を測定する」という用語 は、サンプル中で産生された抗体の量についての絶対値、そしてまた、抗体産生 レベルの指数、比率、パーセントまたは同様の指示を得るという意味で、抗体産 生レベルを定量的および定性的に評価することの両方を、半定量的および／また は定性的な評価とともに包含する。 本発明の主な利点は、一般的に数 ml の血清体積に基づく古典的診断試験と対 比して、小さいサンプル体積、例えば 50〜 500μl 、好ましくは 100〜300 μl 、普通は 100〜200μl の血液、または全血液源に匹敵する血液製剤体積しか必 要としないことである。これは、本発明の方法にはμｌ台の体積しか必要でない ので、新生児から採血する場合に特に有用である。 血液サンプル、一般的に末梢血液サンプルをそのまま使用できるが、サンプル から最初にリンパ球を単離するのが好ましい場合がある。これは、この分野にお いて公知の標準的技術を用いて行うことができる。すなわち例えば、臨床実験室 でルーチンに調製されるような様々な血液製剤、例えばヘパリン処理血液、EDTA -血液などを好都合に使用できる。不可欠ではないが、サンプル中に存在する赤 血球は、蒸留水または塩化アンモニウムに短時間暴露さ せる普通の方法を用いることにより、あるいは他のよく知られた溶血技術を用い ることにより、溶解させてもよい。全ての濃縮調製物または精製調製物は、自発 的抗体産生の検出を可能にするように、由来する全血液中に存在したリンパ球を 含有する必要があることが判るであろう。望ましいならば、例えば Lymphoprep （Nyegaard Co．Oslo，Norway）などの標準的リンパ球分離媒体を用いるか、あ るいは免疫磁性分離（IMS）または同様の固体相に基づく分離システムまたは他 の普通の技術を用いて、リンパ球を分離してもよい。IMS または同様の分離技術 の場合、例えば特定セットの白血球に対して特異的な抗体で塗布した磁性ビーズ などの固体相を用いて、有用なリンパ球を選択的に分離することができる。分離 されたリンパ球を用いる場合、細胞は、使用前にスタンディング洗浄法を用いて 洗浄してもよい。しかしながら、細胞を徹底的に洗浄する必要はないことが認め られた。実に、徹底的に洗浄しないことにより、細胞の生存率を改善することが でき、かつ方法をスピードアップできる。 必要に応じて上記のように処理した血液サンプル、または分離されたリンパ球 は、次いで好都合には、適切な結合パートナーを担持した固体相と接触させられ 、検出すべき１以上の抗体が固定化される。結合パートナーは、１以上の検出す べき抗体により認識される１以上の試験抗原であることが好都合である。従って 、一つの態様において、本発明は、血液サンプル中での能動抗体産生を検出する 方法を提供し、この方法は、 タンパク質合成阻害剤の存在下及び非存在下において、上記サンプルのアリコ ート、または所望により該サンプルから直接に単離されたリンパ球のアリコート を、検出すべき１以上の抗体により認識される１以上の抗原を担持する固相と接 触させ、 上記抗原（１以上）への抗体の結合を溶液中で検出し、そして タンパク質合成阻害剤の存在下または非存在下で該抗体結合を比較し、こ れにより抗原（１以上）に応答した能動抗体分泌の量の測定値を得ることからな る。 他の結合パートナー、例えばプロテインＡ、プロテインＧ、または検出すべき 抗体を認識して結合する抗体を用いることもできる。後者の場合、高度に特異的 な結合は必要でない。なぜならば、この態様のアッセイ方法には以後に抗原結合 が組み込まれ、この抗原が検出すべき抗体と特異的に結合するからである。こう して、全ての態様において、特定の抗原-抗体複合体が創製される。このような 複合体が固体支持体に固定化されて存在することは、本発明の検出工程で確認さ れる。固体相は、固定化、分離などのために現在広く用いられているかまたは提 案されている公知の支持体またはマトリックスであってよい。これらは粒子、シ ート、ゲル、フィルター、膜、あるいはマイクロタイターストリップ、チューブ またはプレートなどの形態であってよく、好都合には、重合体材料製であってよ い。しかしながら、操作が容易で簡単なためには、標準的マイクロタイタープレ ートおよびウェル、好ましくは標準的 ELISA プレートを用いることが便利であ る。 固体相を改変して、ある範囲の異なった抗原に対して特異的な抗体の検出を可 能にすることができる。すなわち例えば、好適な固体相材料例えばニトロセルロ ースその他のディスクまたはストリップなどは、異なる抗原で塗布されてもよく 、また、接触試薬を含まないマイクロタイターウェルまたは他の好適な容器に同 時に添加されてもよい。次いで抗体結合検出方法を用いて、異なった抗原間を識 別することができる。疑わしい作用物質の中のどれが病気の原因であるのかを同 定するために、各々が特定の臨床的状態または症状と調和する関連抗原で塗布さ れたディスクのセットを使用することができる。次いでディスクは、別個のウェ ル中で個々に処理される。これは特に材料節約手法である。なぜならば、複数の 異なった抗原（それぞれの場合に臨床的 症状または状態に関連した、同じまたは異なった感染性物質から）の同時試験を 、同じ小体積の血液を用いて実施できるからである。もう一つのアプローチは、 各々が異なった結合パートナー、例えば抗原又は抗体で塗布された別個のウェル 中で複数の血液サンプルを使用し、これにより試験を展開させることである。 結合パートナー、例えば抗原を固体相に結合させる技術もまた、非常によく知 られかつ広範な文献に記載されている。多くの標準的抗原塗布手法は、例えばEL ISA and other solid phase Immunoassays，Theoretical and Practical Aspect s; 1988，ed．D.M．Kemeny & S.J．Challacombe，John Wiley & Sonsに記載され ている。所望によりプレートは洗浄してブロックすることもでき、ここでもまた 、標準的技術が用いられる。従って例えば、標準的マイクロタイタープレート、 例えば ELISA プレートを、例えば 0.01〜150 μg/mlタンパク質の濃度で結合パ ートナーを含有する好適な緩衝液、例えば燐酸塩緩衝塩水（PBS）中で４℃にて インキュベートすることにより、結合パートナーで簡単に塗布し、次いで適切な ブロッキング媒体（一般的に細胞培養培地）を用いてブロックし、例えば 37℃ で１〜５時間インキュベートすることができる。ブロッキング溶液を除去した後 、プレートそのまま使用できる。 しかしながら、有利には、本発明の方法を実施するために必要な材料はキット の形態で提供することができ、この場合、固体支持体は、既に結合パートナーで 塗布され、かつ適切にブロックされた状態で供給される。 上記のように、接触工程は、一般的に、固体相の存在下に抗体の合成および分 泌を許容する条件下でサンプルまたは分離されたリンパ球をインキュベートする ことを伴う。便利には、例えば Czerkinsky et al.，1988（上記） に記載された標準的 ELISPOT インキュベーション条件を使用できる。一般的に サンプルまたは細胞は、細胞がインキュベートされる培地が緩衝システムの一部 として CO₂に基づく場合は、空気中 5 % CO₂とともに 37 ℃でインキュベートさ れる。公知の HEPES 成分を用いた培地のような、別の緩衝システムが作用する CO₂-非依存性培地を使用することもできる。これらの場合、細胞は 37 ℃で簡単 にインキュベートされ、こうしてアッセイおよび精巧な装置に対するその必要性 はさらに単純化される。インキュベート時間は変化してよいが、一般的に少なく とも１〜２時間である。２〜６時間、例えば２〜４時間のインキュベート時間が 良好な結果を生じることが見出されたが、場合によっては例えば 12 または 24 時間、または一夜までのより長いインキュベート期間が望ましいことがある。イ ンキュベーションのための適切な培地は、当該技術においてよく知られており、 その例としては、全ての標準的細胞培養培地、例えばダルベッコ改変イーグル培 地（DMEM）または RPMI、またはCO₂-非依存性緩衝システムとして HEPES を用い 、必要ならば適切な血清、例えば子ウシ血清（FCS）または他の成分、例えばグ ルタミンを含有する公知の培養培地が挙げられる。培地中の任意の添加成分とし ては、抗生物質、例えばゲンタマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシンなど 、他のアミノ酸、成長因子などが挙げられる。 接触工程の前に、サンプル／細胞懸濁液を希釈することが望ましい場合があり 、ある範囲のサンプル／細胞希釈液を好都合に使用できる。希釈は一般的に希釈 剤として培養培地を用いて行われる。 進行中の抗体合成を識別するために、インキュベーションはタンパク質合成阻 害剤の存在下および非存在下において行われる。すなわち、インキュベーション の前に、サンプル／細胞アリコートの部分に阻害剤を加えて、タンパク質、従っ て抗体の合成をブロックし、そして他の部分を阻害剤なしでイ ンキュベートする。普通公知の全てのタンパク質合成阻害剤、例えばシクロヘキ シミドを使用できる。10〜5000μg/ml、例えば 50〜500 μg/ml の濃度のシクロ ヘキシミドを使用できる。 細胞代謝を迅速かつ完全に停止させるために、タンパク質合成阻害剤とともに アデノシントリホスファターゼ（ATPase）阻害剤、例えばナトリウムアジドまた は他の類似の阻害剤を含ませることもまた好ましい。 インキュベーションに続いて、サンプル／細胞は固体相から除去される。これ は一般的に、好適な培地、例えば PBS のような緩衝液を用いて簡単に洗浄する ことにより行うことができる。しかしながら、徹底的な洗浄の必要はないことが 見出された。 次いで固体相は抗体結合の検出工程に付される。検出工程は、シグナルを読み 取るという点から、溶液中で行われる。溶液中で読み取り可能なシグナルが生じ る限り、全ての公知の抗体結合検出手段を使用でき、これは例えば蛍光、化学ル ミネッセンス、比色、あるいは検出可能なシグナルを生成する酵素反応による。 しかしながら、検出手段として免疫アッセイ、および好ましくは酵素結合免疫吸 着アッセイ（ELISA）を使用できることが便利である。 免疫アッセイ技術および特に ELISA 技術は、当該技術において公知であり、 文献（例えば ELISA and other solid phase Immunoassays，Theoretical and P ractical Aspects; 1988，ed．D.M．Kemeny & S.J．Challacombe，John Wiley & Sons 参照）に記載されている。 サンプル／細胞の分離に続いて、酵素-抗体接合物を、例えば ELISA 検出方法 に添加することができ、これは固体相上の抗原に結合された抗体に結 合する。同様に、検出すべき抗体が結合パートナーを介して、例えば異なった種 の抗体に対する抗体により非特異的に固体相に結合されているならば、検出すべ き固定化抗体に特異的に結合する酵素-抗体接合物を添加することができる。検 出可能な信号を発生させるために、次いで酵素基質が加えられる。本発明におい ては、可溶性基質を用いて、溶液中で検出可能なシグナルを生じさせることが好 ましい。これは、多数のサンプルの取扱いおよび処理を容易かつ簡単にし、また 、抗体産生の評価を可能にするので、前記のように絶対的定量が必要でないため に好ましく、所望により定性的または半定量的結果を得ることができる。便利の ために基質を選択して分光光度法で検出可能なシグナルを生成させることができ 、これは例えば標準的 ELISA プレートリーダーを用いて、吸光度により簡単に 読み取ることができる。実に、標準的 ELISA 試薬を使用でき、これは本発明の アッセイを、臨床実験室でルーチンに採用される現存の方法および技術と比較可 能にするという利点を有する。しかしながら、他の検出／シグナル生成システム を使用して、蛍光、化学ルミネッセンスなどで検出可能なシグナルを生じさせる ことができる。 また、免疫酵素的増幅方法を用いて、例えば Sigma から入手可能なExtravidi n システムなどのようなアビジン-ビオチン方法を用いて、シグナルを改善し、 かつ感度を上昇させることもできる。ビオチニル化第二抗体は、パーオキシダー ゼアビジン複合体と組み合わせて ELISA 試薬として使用できる。１分子のアビ ジンは数個のビオチン分子と結合可能なので、アビジン-ビオチンパーオキシダ ーゼ複合体の使用は、パーオキシダーゼ分子の表面濃度を増大させ、本方法によ りいっそう高い感度を与える。 細胞インキュベーション（接触）工程および抗体結合検出工程に必要な材料お よび手段はまた、結合パートナーが塗布された固体相と一緒に、便利にはキット 形態においても適用できる。本発明の方法から得られた情報は、他 のアッセイ方法を用いることにより補足することができる。既存の血清／プラズ マ抗体に関する付加的および有用なデータは、古典的 ELISA 試験において得る ことができる。加えて、血液サンプルからリンパ球を分離した後にこれを行う場 合は、残りのプラズマ液体は、本発明のアッセイ方法に用いたのと同じ結合パー トナーが塗布された固体相を用いて、既存の抗体の検出に使用することができる 。 本発明のアッセイ方法が確実に実用的であることを保証するために、適切なコ ントロールを含めることができる。第一に、タンパク質合成がブロックされたウ ェルとブロックされないウェルとの比較は、本発明が試験細胞による急性タンパ ク質産生を記録するのであって、単に末梢血からの既存の抗体を記録しているの ではないことを保証する。サンプルとして精製リンパ球調製物を用いる場合、こ れは、リンパ球サンプル中の末梢血から捕獲された痕跡量の抗体が試験を傷つけ ないことを保証する。第二に、ブロックされたウェルとブロックされないウェル との間の記録された差が、特異的におよび非特異的に（傍観者で）活性化された リンパ球によるものではないことを確認するために、陰性コントロールが使用さ れる。この抗原は、患者の急性疾患の原因とは最もなりそうにない感染性物質、 例えば破傷風トキソイドからの抗原であろう。このような傍観者活性化リンパ球 の数は、いずれの場合にも全ての状況において、本発明の方法を用いた陽性試験 結果のために要求されるよりもずっと少ないであろう。本発明の意図はこの点を 考慮に入れている。 上記のように、その容易さ、操作のスピードおよび簡単さのために、本発明の アッセイは、診断的または他の臨床的用途あるいは動物学的用途、例えば魚の養 殖に役立つ。小さいサンプル体積に加えて、もう一つの利点は、従来のほとんど の血清学的試験において必要であるような、２〜３週間の間隔で採取された血清 のペアよりはむしろ、ただ一つのサンプルを必要とするこ とである。精巧な装置は必要でなく、アッセイは容易に自動化することができる 。加えて、必要ならば異なった免疫グロブリンアイソタイプについて容易に試験 することができる。 本発明の前記アッセイ方法は、特定の抗原に対して特異的な抗体の自発的発現 を分析することにより、進行中の感染の存在または程度を評価するための方法を 提供する。このような方法は、疾患の状態（これは既知であり、かつこの状態に 対して適切な免疫原に関する抗原を利用できる）を評価するために適用できるこ とが明らかであり、従って感染の特異的マーカーを提供する。しかしながら、あ る臨床的状況においては、特定の疾患または感染は同定されないことがあり、そ して／またはアッセイに使用するのに適切な抗原が入手できないことがある。こ のような場合、アッセイを改変して、感染の非特異的インディケーターの存在ま たは程度を評価してもよい。従って例えば、リンパ球含有サンプル、例えば全血 液、あるいはそれからの精製または濃化リンパ球調製物を、これらサンプルが感 染マーカー、例えばサイトカインまたはインターフェロン、例えばインターフェ ロン-γを産生することについて検査してもよい。 従って、もう一つの観点からみて、本発明は、血液サンプル中の非特異的感染 インディケーターの存在を検出する方法を提供し、この方法は、 タンパク質合成阻害剤の存在下及び非存在下において、血液サンプルのアリコ ート、または所望により該サンプルから直接単離されたリンパ球のアリコートを 、リンパ球による感染インディケーターの産生および分泌を許容する条件下で固 体相と接触させ、 固体相上での結合パートナーへの感染インディケーターの結合を溶液中で検出 し、そして タンパク質合成阻害剤の存在下または非存在下における該感染インディケ ーター結合を比較し、これにより該サンプル中の感染インディケーターの量の測 定値を得ることからなる。 この方法を実施するために、固体相には適切な捕獲分子、例えば検出のための 感染インディケーターに対する抗体を備えることができる。固体相上に固定化さ れた該感染インディケーターを検出するために、例えば標識された抗体またはリ ガンドを用いて、前記の方法を使用することができる。この方法において、固定 化部分または検出分子を適切に選択することにより、特異的マーカーを同定でき る。すなわち例えば、サンプル中の全てのタンパク質を固体相上に固定化するこ とができ、そして標識された特異的抗体またはリガンドを用いて検出を行うこと ができる。あるいは、特異的結合パートナーを用いて、関連する感染インディケ ーターを固定化してもよく、これを次いで陽性または陰性に適切に標識すること ができ、例えば前者の場合は、感染インディケーター上に存在するが、その分子 を除いたドメインに結合させることによるか、あるいは二番目は、固体相上に結 合していない結合パートナーを標識することによる。この方法を実施するための キットもまた、本発明の一部を形成する。 以下の非限定的実施例を参照して、本発明をさらに詳細に説明する。実施例に おいて、本発明のアッセイ方法は、プラズマキュート（Plasmacute）アッセイと 呼ばれる。実施例１ 一般的手順 細胞 ： 不活化インフルエンザワクチンを与えたボランティアから、ワクチン接 種後の様々な時点で採取したヘパリン処理血液。血液を同体積の PBSと 混合する。Lymphoprep（Nyegaaed & Co.，Oslo）によりリンパ球を分離する。細 胞を PBS 中で２回洗浄し、20% の FCS、2 mM の L-グルタミン、100IU/ml のペ ニシリンおよび 100μg/mlのストレプトマイシン（Pen＋Strep）を補充したダル ベッコ改変イーグル培地 = MEDIUM 中に再懸濁させる（希釈液）。STOP 溶液 ： 10% のナトリウムアジドを含有する PBS 中で調製した１mg/mlの シクロヘキシミド。ELISA およびインフルエンザ抗原 ： インフルエンザワクチン中の三つのウイル ス株からの精製表面抗原が臨床的トライアルに用いられる。ここでは短縮して H 3N2 、H1N1 および B と称する。ELISA プレート ： Greiner EIA プレート 655001 F- 形、または Costar EIA プレート 3590。PBS 中の 10 μg/mlタンパク質溶液を用い、100μl/ウェルで４ ℃にて一夜塗布する。MEDIUM を用いて室温で１時間ブロックする。PBS で１回 洗浄する。試験 ： 三つのインフルエンザ抗原の各々について平行な二組において、三重ウ ェルに、MEDIUM 中の細胞懸濁液の希釈液 100μl を添加する。一組の三重ウェ ルは、最初の工程で 50 ml の STOP 溶液を添加してブロックする。インキュベ ーター内において、空気中 5 % CO₂で 37 ℃にて様々な時間インキュベートする 。ELISA プレートを PBS で１回洗浄し、次いで Tween20 を 0.05 % 添加した P BS で２回洗浄する。50μl/ウェルの適切に希釈したウサギ抗-ヒト Ig パーオキ シダーゼ接合物(Sigma)を添加し、室温で１時間放置する。続いて o-フェニレン ジアミン（OPD）基質を用いてプレートを展開し、492 nm での吸光度を読み取る 。ワクチン接種後 11 日に採取した血液 細胞インキュベーション時間：４時間、０時間＝ブロックしたウェル 全てのエントリーは、吸光度× 1000 としての三重ウェルの平均。範囲±10% 。結果 ： 6.6 10⁴＝66,000 個の細胞は、4 時間のインキュベーションで著しいシ グナル増加を与える。吸光度は、H3N2 では 98% まで、H1N1 では 153% まで、 B では 50% までとなる。 これは代表的な実験である。追加の試験は、細胞の一夜インキュベーションが 、ブロックされたウェルとブロックされないウェルとの間で、1000 個を越える 吸光度に関して、よりいっそう明確な区別を与えることを示した。このシステム はまた、より短いインキュベーション時間、例えば２〜３時間でもうまくいく。 十分の一の細胞、例えば 6.6 10³個の細胞／ウェルでも、常にではないが、よ り明確な区別を与えることができる。実施例２ 一般的手順 細胞 ： 不活化インフルエンザワクチンを与えたボランティアからの、ワクチン 接種後７日に採取したヘパリン処理血液。血液を同体積の PBS と混合 する。Lymphoprep（Nyegaaed & Co.，Oslo）によりリンパ球を分離する。細胞を PBS 中で２回洗浄し、20% の FCS、2 mM の L-グルタミン、pen + Strep（上記 のとおり）を補充したダルベッコ改変イーグル培地 = MEDIUM 中に再懸濁させる 。STOP 溶液 ： 10% のナトリウムアジドを含有する PBS 中で調製した１mg/mlの シクロヘキシミド。試験抗原 ： インフルエンザワクチン中の三つのウイルス株からの精製表面抗原 が臨床的トライアルに用いられる。ここでは短縮して H3N2、H1N1 および B と 称する。コントロール抗原 ： 破傷風トキソイド（非-アルミニウム吸収; Lederle）。ELISA プレート ： Greiner EIA プレート 655001 F- 形、または Costar EIA プレート 3590。PBS 中の10 μg/mlタンパク質溶液を用い、100μl/ウェルで４ ℃にて一夜塗布する（破傷風：10 Lf/ml）。MEDIUM を用いて室温で１時間ブロ ックする。PBS で１回洗浄する。試験 ： 三つのインフルエンザ抗原の各々と破傷風コントロール抗原について平 行な二組において、三重ウェルに、MEDIUM 中の細胞懸濁液の希釈液100μl を添 加する。一組の三重ウェルは、最初の工程で 50 μl の STOP 溶液を添加してブ ロックする。インキュベーター内において、空気中 5 % CO₂で 37 ℃にて３時間 インキュベートする。インキュベーションの後、ELISA プレートを PBS で１回 洗浄し、次いで Tween 20 を 0.05 % 添加した PBS で２回洗浄する。適切に希 釈したウサギ抗-ヒト Ig パーオキシダーゼ接合物(Sigma)を50μl/ウェルで添加 し、室温で１時間放置する。続い て o-フェニレンジアミン（OPD; Sigma）基質を用いてプレートを展開し、492 n m での吸光度を読み取る。[この試験は、１時間の Extravidin/パーオキシダー ゼ工程(Sigma)の使用による基質の前の追加工程によって改変して、感度を上昇 させることができる。これは、パーオキシダーゼ接合物(Sigma)の代わりにビオ チン化接合物の使用を必要とする。]代表的実験結果（extravidin なし） ： ワクチン接種後７日（被験者２人；#1 および #2） 細胞インキュベーション時間：３時間、０時間＝ブロックしたウェル 全てのエントリーは、吸光度としての三重ウェルの平均×1000。範囲±16%。 被験者は十代（16才）である。若者が A/H1N1 インフルエンザワクチンに特に よく応答することは公知である。これは上記において明確に認められ、両方の被 験者 #1 および #2 がよく応答している。しかしながら、ワクチン接種者は通常 、様々なワクチン成分に異なる応答をするので、吸光度増加の差が予期されねば ならない。これは、ここで被験者 #1 が B ウイルスに対して劣った応答を示し たが、被験者 #2 が H1N1 ウイルスにのみ著しく応答した場合に示される。期待 したとおり、どの被験者も破傷風トキソイドには応答しなかった。しかしながら 、細胞がトキソイドによりインビトロで数日 間の時間、刺激されていたならば、それらの免疫学的な初期記憶（幼児期のワク チン接種による）が、結果として破傷風抗体を産生させたかもしれない。実際の 感染の場合に本発明を用いて診断実験室でアッセイすると、一の試験物質／抗原 のみが陽性シグナルを与えるであろう。実施例３ 一般的手順 細胞 ： 不活化サブユニットインフルエンザワクチンを与えた成人（24才の男性 ）および子供（３才の男児）からの、ワクチン接種後６日に採取したヘパリン処 理血液。リンパ球は実施例１および２に記載したように分離された。実施例１お よび２に記載したように、抗原 H3N2 、H1N2 および B を担持した固体相とと もに、細胞を 37 ℃で３時間インキュベートし、試験を記載したように展開した （この実験では、STOP 溶液またはコントロール抗原は使用しなかった）。 表１は、２人の固体からの結果を示す。表中、各抗原についての読み取り値は 、吸光度× 1000 としての三重ウェルの平均である。 これらの結果は、以前のインフルエンザエピソードである A/H3N2 感染を１回 だけ有する小さな小児が、３価ワクチン中の A/H3N2 成分に対して非常に強い免 疫応答を与えたことを示している。この小児については期待されたとおり、H1N2 および B 成分に対する応答はなかった。このような小さな小児達には、充分な 免疫応答を与えるのに、通常、数週間の間隔をおいた２回のワクチン投与を必要 とする。約７μｌ体積の全血液に対応する約70,000 個のリンパ球は、陽性の結 果を得るのに充分であった。複数回のインフルエンザエピソードを有する成人被 験者については、ワクチンの三成分全てに対して応答は激しいほどではないが、 それにもかかわらず、程度は異なるものの有意であった。B-成分については、陽 性応答を得るのに100,000 個のリンパ球が必要であったが、二つの A-成分には 、同様に100,000 個、好ましくは 200,000 個の細胞が必要であった。実験４：古典的および Pharmacute アッセイ方法による単純疱疹タイプ２の検出 一般的手順 細胞培養および血清学的分析 陰部疱疹ウイルス感染を示唆する症状を呈している５人の患者の性器からの材 料を、ルーチン組織培養手法に付し、ウイルスの複製を検体から検出しようと試 みた（Virus Laboratory，Haukeland University Hospital，Bergen で実施）。 同じ研究室では、HSV を含有する市販の ELISA キット(Behringer，Germany か らの Behringer Enzygnost)を用いた血清サンプルのルーチンの血清学的分析を 行い、IgG および IgM を検出した。リンパ球の分離 病院サンプルと同時に採取した、陰部疱疹ウイルス感染を示唆する症状を呈し ている５人の患者からのヘパリン処理血液を lymphoprep（Nycomed）密度勾配遠 心分離することにより、リンパ球を単離した。細胞を PBS 中で３回洗浄し、20% の FCS、１ mM の L-グルタミン、50 IU/ml のペニシリンおよび 50 μg/ml の ストレプトマイシンを含有する DMEM の培養培地(DMEM/FCS)中に再懸濁させた。 生育可能な細胞を、トリパンブルー排除(0.2%)により計数した。Behringer Enzygnost 抗-HSV IgM および IgG ELISA を用いたPlasmacute アッセイ Behringer Enzygnost 抗-HSV IgM および IgG は、HSV に感染した永久サル 腎臓細胞に由来する抗原で塗布された８個のウェル、および未感染細胞からのコ ントロール抗原で塗布された８個のウェルを含むストリップとして供給される。 200 μl/ウェルの DMEM/FCS を用い、5 % CO₂中で 37 ℃にて１時間、ストリッ プをブロックした。リンパ球の適切な希釈液をウェル当たり 100μｌ添加し、5 % CO₂中で 37 ℃にて３時間インキュベートした。これ以後の全ての手順は、キ ット供給者の指示に厳密に従った。同じ供給者により供給された接合物、試薬お よび緩衝液を用いてプレートを展開した。テトラメチルベンジジン塩酸塩（TMB ）基質は、入手可能な Titertek Multiskan MCC/340 プレートリーダー（Flow L aboratories）を用いて 450nm で光学密度（OD）を読み取る必要があった。Bioelisa HSV-2 IgG を用いた Plasmacute アッセイ Bioelisa IgG HSV-2 ELISA（BIOKIT，Spain）は、不活性化 HSV-2 抗原で塗布 された８個のウェルを含むストリップとして供給される。200 μl/ウェルの DME M/FCS を用い、5 % CO₂中で 37 ℃にて１時間、ストリップをブロックした。リ ンパ球の適切な希釈液をウェル当たり 100μl 添加し、5 % CO₂中で 37 ℃にて３時間インキュベートした。これ以後の全ての手順は、キッ ト供給者の指示に厳密に従った。同じ供給者により供給された接合物、試薬およ び緩衝液を用いてプレートを展開した。テトラメチルベンジジン塩酸塩(TMB)基 質は、入手可能な Titertek Multiskan MCC/340 プレートリーダー（Flow Labor atories）を用いて 450 nmで光学密度（OD）を読み取る必要があった。Bioelisa HSV IgM （immunocapture）アッセイを用いた Plasmacute アッセイ Bioelisa HSV IgM（Immunocapture）アッセイ（BIOKIT，Spain）は、ウサギ抗 -ヒト IgM 抗体で塗布された８個のウェルを含むストリップとして供給される。 200 μl/ウェルの DMEM/FCS を用い、5 % CO₂中で 37 ℃にて１時間、ストリッ プをブロックした。リンパ球の適切な希釈液をウェル当たり 100μl 添加し、5 % CO₂中で 37 ℃にて３時間インキュベートした。全ての手順は、キット供給者 の指示に厳密に従った。詳しくは、100μl / ウェルの HSV 抗原で標識されたホ ースラディッシュパーオキシダーゼ（ヒト繊維芽細胞中でインビトロにて増殖さ せた、精製および不活性化 HSV）、および非特異的反応を最小限にするための未 標識コントロール抗原を用いて、結合した抗体を検出し、この未標識コントロー ル抗原は、未感染細胞成分（キットにて供給される）、ストリップ当たり 10 μ l の HSV 抗原および10 μl のコントロール抗原からなる。プレートは、Titert ek Multiskan MCC/340プレートリーダー（Flow Laboratories）で 450 nm にて 読み取られた。 実験結果を表２に示す。 表２には、患者１〜５のデータがまとめられている。Haukeland University H ospital の診断実験室では、臨床検体からウイルスを単離しようと試み、また、 Behringer Enzygnost ELISA キットを用いた血清 IgG および IgM についてのル ーチン ELISA 試験も行われた。単離されたウイルスの型が述べられ、-ve は陰 性単離を意味する。血清 ELISA カットオフ値はキット製造業者により定義され ；＋ = OD ＞ 0.2 であり、ボーダーライン = OD 0.1 〜0.2 であり、アッセイ 製造業者によって不明確な結果と定義され；-- = OD ＜ 0.1 である。 我々は、Plasmacute アッセイのために OD ＞ 0.2 を陽性として用い、このよ うな応答を与えるのに必要なリンパ球の数を表に示した。 Bioelisa IgG 試験のみが HSV2 抗体の同定を要求するが、他のものはHSV（ １および／または２）感染を示すであろう。結果 患者１は初回 HSV-2 感染の臨床的症状を有した。病院試験では臨床サンプル からウイルスを単離することができず、標準的 ELISA アッセイによりIgG は見 出されなかった。ボーダーライン血清 IgG 抗体が標準的病院ELISA 試験により 見出された。これらの結果の確認として、Plasmacuteアッセイでは、どの細胞も IgM 抗体を産生しないことが見出された。Behringer IgG および Behringer Ig M Plasmacute アッセイの両方は、HSVに対する IgG 抗体を産生する細胞を検出 した。Behringer Plasmacute アッセイでカットオフ吸光度を与えるのに 205,00 0 個のリンパ球が必要であり、Bioelisa IgG でカットオフ吸光度を与えるのに 103,000 個のリンパ球が必要であった。 患者２は初回感染中であり、これは HSV 型-1 として単離されたウイルスによ って確認された。病院実験室では、どの血清 IgG も検出されなかったが、IgG 抗体が検出された。Plasmacute アッセイでは、IgM を産生する細胞は検出され なかったが、Behringer および Bioelisa Plasmacute アッセイの両方は IgG 産 生細胞を検出し、それぞれ 223,000 および 111,000 個の細胞が必要であった。 患者３は回帰 HSV-2 感染を有し、これは臨床検体から HSV-2 を単離すること により確認された。臨床的症状の発生後２日目に採取した血清サンプル中に IgG が存在したが、この時点で血清 IgM は検出されなかった。Plasmacute アッセ イでは、臨床的症状の発生後２日目に IgM は検出されなかったが、Behringer および Bioelisa Plasmacute アッセイの両方はIgG 産生細胞を検出した（48,00 0〜96,000 個の細胞が必要）。IgM 血清抗体は、病院で臨床的症状の発生後 20 日目に採取した血清サンプル中で検出された。Plasmacute Behringer IgM アッ セイでカットオフ吸光度を与えるのに 182,000 個のリンパ球が必要であったが 、Bioelisa IgM Plasmacute アッセイでは細胞が検出されなかった。 患者４は初回 HSV 感染を有した。病院実験室に送った臨床サンプル中にはウ イルスは検出されなかった。ボーダーライン血清 IgM 抗体が検出され、陽性レ ベルの血清 IgG 抗体が見出された。IgM および IgG 抗体の両方が、Behringer および Bioelisa キットの両方を用いた Plasmacute アッセイで、臨床的症状の 発生後５日目および 19 日目（Behringer IgM は検出されず）に採取した血液サ ンプル中に検出された。Plasmacute アッセイにおいて、Bioelisa IgM アッセイ には 8,000 個未満の細胞が必要であり、Behringer IgM には 60,500 個の細胞 であった。両方とも、100μl 未満のヘパリン処理血液が必要であろう。 患者５は初回 HSV 感染の疑いがあった。しかしながら、実験室ではウイルス が単離されず、かつ血清抗体は検出されなかった。Plasmacute アッセイでは、H SV に対する IgG または IgM を産生する細胞は検出されなかった。検討 Plasmacute アッセイは、初回および回帰ヘルペスウイルス感染の両方に対し て有効であることが実証された。全ての場合に、Plasmacute アッセイは、ここ で用いた伝統的な ELISA 手法と少なくとも同等によい性能を示した。特に、患 者１については、臨床サンプルからウイルスが単離されず、病院のルーチンアッ セイでボーダーライン陽性（すなわち、決定的でない）を記録したにすぎなかっ たけれども、Plasmacute アッセイ（Bioelisa IgG および Behringer IgG）は、 それぞれ約 100,000 個の細胞および 200,000 個の細胞が疑いのない陽性結果を 与えたことを示した。この患者は二重感染（HSV1 および HSV2）の可能性があり 、そのうち HSV1 だけが、ウイルス単離によりその場から回収された。しかしな がら、陽性 HSV2 結果(Bioelisa IgG)が血清学的交叉反応により生じたことを無 視することはできない。ウイルスが単離されなかった患者４からの、二つの時間 的間隔を開けたサンプルについては、Plasmacute アッセイは、ヘルペス特異的 IgM-および IgG-産生リンパ球の数が、感染の早期相から後期相にかけてシフト したことを示し、これは、初回感染後に起こる公知の動力学とよく調和し、能動 免疫応答の明らかな確証であった。Bioelisa IgM Plasmacute 試験は、二つのサ ンプルのうち最初のサンプル中で陽性シグナルを与えるのに 8,000 個未満のリ ンパ球を必要としたので、特に高感度であった。 我々は、この実験において、Plasmacute 方法が男性のウイルス感染の臨 床ケースに対して有効であることを示した。実験５ ：複数のディスク - IgA、IgG および IgM 抗体に特異的な捕獲抗体での ニトロセルロースディスクの塗布 この実験は、複数のディスクシステムを Plasmacute アッセイに使用して特異 性の異なる抗体を検出できるかどうかを証明するために行われた。一般的手順 ２人の健康な成人被験者から、ヘパリン処理全血液サンプルを採取した。これ らの被験者はどの感染についても急性相になかったので、IgA、IgG および IgM 自発的抗体産生を、それらの（未知の）抗原特異性とは無関係に分析することを めざした。 患者１は、三つの異なる抗原で塗布されたディスクを用いたシステムを、Plas macute アッセイにおいて単一ウェル中で使用できるかどうかを証明するために 用いられた。一つのウェル（No．１）。 患者２は、同じ抗原で塗布された多数のディスクの存在下において、シグナル が弱まるかどうかを証明するために用いられた。Plasmacute アッセイにおける 三つの別個のウェル（ウェル No．２、３および４）。リンパ球の分離 ヘパリン処理血液を lymphoprep（Nycomed）密度勾配遠心分離することにより 、リンパ球を単離した。細胞を PBS 中で３回洗浄し、20% の FCS、1mM の L-グ ルタミン、50 IU/ml のペニシリンおよび 50 μg/ml のストレプトマイシンを含 有する DMEM の培養培地（DMEM/FCS）中に再懸濁させた。 生育可能な細胞を、トリパンブルー排除（0.2%）により計数した。固体相としてのディスクを用いた Plasmacute アッセイ ８μM の孔径を有するセルロースの混合エステルのディスク（Millipore SCWP 013 00）を、PBS アジド中に希釈された（0.001%）、ヤギ抗-ヒトクラス特異的 抗体（Sigma，anti-IgG I-3382; anti-IgA I-0884; anti-IgM I-0759）を用いて 、室温にて一夜塗布した。DMEM/FCSを用い、5 % CO₂中で37 ℃にて１時間、ディ スクをブロックした。0.4μM の孔径を有する 12mm の透明な移動ウェル（Costa r 3460）にリンパ球を添加し、その下にディスクを置き、5 % CO₂中で37℃にて ３時間インキュベートした。個々のディスクを 24 ウェルプレート（Costar）の 別個のウェルに移し、PBS で３回および PBS Tween（0.05%）で３回洗浄した。D MEM/FCS 中に希釈された200μl/ウェルのヤギ抗-ヒトクラス特異的パーオキシダ ーゼ接合抗体(Sigma IgG A-6029，IgA A-4165，IgM A-4290)を用いて、結合した 抗体を検出し、室温で２時間インキュベートした。前記のようにディスクを洗浄 して結合しなかった抗体を除去し、0.05M の燐酸クエン酸緩衝液（pH 5.0）中の o-フェニレンジアミン二塩酸塩（OPD）（Sigma P-7288）を 200μl/ウェルで用 いて展開した。基質添加の 30 分後に、1M H₂SO₄を 100μl/ウェルで用いて展開 を停止させた。ウェル当たり 100μl を 96 ウェルELISA プレート（Greiner EI A プレート 655001 F-形）に移し、Titertek Multiskan MCC/340 プレートリー ダー（Flow Laboratories）を用いて 492 nm でOD を読み取った。 実験結果を表３に示す。表中、各捕獲抗体についての読み取り値は、吸光度× 1000 としての三重ウェルの平均である。 ウェル１は２百万個のリンパ球を含有し、ウェル２〜４は百万個のリンパ球を 含有していた。「細胞」という表示は、どのディスク番号が細胞レイヤーの最も 近くに位置していたかを示すためである。結果 ： 被験者１を用いた試験は、リンパ球を含有するウェルにおいて９個ものディス クを容易に使用できたことを示した。三つの IgG ディスク、三つのIgA ディス クおよび三つの IgM ディスクに対する応答は、全ての実際的な目的のために各 試験について同一であり、従って、抗体分泌リンパ球に対するディスクの実際の 位置は臨界的でないことを示した。患者２からのリンパ球を用いた試験は、少な くとも８個の同じく塗布されたウェルを一つのリンパ球含有ウェル中に置いて、 実際上同一の読み取り値を得ることができたことを示した。従って、本発明は、 一つのウェル中で同じリンパ球調製物について複数回アッセイすることを可能に する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ， ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ａ）タンパク質合成阻害剤の存在下および非存在下において、血液サンプ ルのアリコート、または所望により該サンプルから直接単離されたリンパ球のア リコートを、リンパ球による抗体の産生および分泌を許容する条件下で固体相と 接触させ、 ｂ）固体相上での該抗原（１以上）への抗体結合を溶液中で検出し、そし て ｃ）タンパク質合成阻害剤の存在下または非存在下における該抗体結合を 比較し、これにより上記抗原（１以上）に応答した能動抗体分泌の量の測定値を 得ることからなる、 血液サンプル中で標的抗原に応答した能動抗体産生を検出する方法。 ２． 前記固体相が、検出すべき１以上の抗体により認識される１以上の抗原を 担持している、請求項１に記載の方法。 ３． 前記固体相が、検出すべき１以上の抗体を認識する１以上の抗体を担持し ている、請求項１に記載の方法。 ４． 前記方法に用いらる前記血液サンプルまたはリンパ球調製物が、１ml未満 の体積を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。 ５． 前記方法が、新たに合成された抗体と受動移入した母性抗体とを区別する ために新生児または乳児において行われる、請求項１〜４のいずれかに記載の方 法。 ６． 前記血液サンプルが、患者から直接採取した血液の精製または濃化手 法により得られる、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。 ７． 前記サンプルから直接単離したリンパ球が、前記方法に用いられる、請求 項１〜６のいずれかに記載の方法。 ８． 請求項１の接触工程の前に、固体相がブロックされる、請求項１〜７のい ずれかに記載の方法。 ９． タンパク質合成阻害剤が、50〜500μg/ml の濃度で用いられるシクロヘキ シミドである、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。 10． タンパク質合成阻害剤と組み合わせて、アデノシントリホスファターゼ（ ATPase）阻害剤が用いられる、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。 11． 請求項１の検出工程が、免疫アッセイにより行われる、請求項１〜10 の いずれかに記載の方法。 12． 免疫アッセイが ELISA である、請求項 11 に記載の方法。 13． 前記固体相上に固定化された、検出すべき１以上の抗体により認識される １以上の抗原が、前記固体相と接触させられる、請求項３〜 12 のいずれかに記 載の方法。 14． 前記固体相上に固定化された１以上の抗体を認識する１以上の抗体が、前 記固体相と接触させられる、請求項２および４〜 12 のいずれかに記載の方法。 15． 請求項１の検出工程のために可溶性基質が用いられ、分光光度法により検 出可能なシグナルを生じさせる、請求項１〜 14 のいずれかに記載の方法。 16． 陰性コントロール抗原が用いられる、請求項１〜 15 のいずれかに記載の 方法。 17． ヘルペスウイルスに対する能動抗体産生が検出される、請求項１〜 16 の いずれかに記載の方法。 18． 各々が異なった標的抗原を担持している複数の固体相が用いられる、請求 項２および４〜 17 のいずれかに記載の方法。 19． 抗原で塗布され、かつ適切にブロックされた少なくとも一つの固体相を含 む、請求項２および４〜 18 のいずれかに記載の方法を行うためのキット。 20． 抗体で塗布され、かつ適切にブロックされた少なくとも一つの固体相を含 む、請求項３〜 18 のいずれかに記載の方法を行うためのキット。 21． 細胞インキュベーション（接触）工程および抗体結合検出工程のために必 要な材料および手段に加えて、下記の成分の少なくとも一つ： ａ）タンパク質合成阻害剤； ｂ）ATPase 阻害剤； ｃ）抗体を検出するために接合された酵素-抗体； ｄ）抗体を検出するために接合された酵素-抗原； ｅ）ｃ）またはｄ）の酵素のための可溶性基質；および ｆ）陰性コントロール抗原 を含む、請求項 19 または 20 に記載のキット。 22． タンパク質合成阻害剤の存在下および非存在下において、血液サンプルの アリコート、または所望により該サンプルから直接単離されたリンパ球のアリコ ートを、リンパ球による感染インディケーターの産生および分泌を許容する条件 下で固体相と接触させ、 固体相上での結合パートナーへの感染インディケーターの結合を溶液中で 検出し、そして タンパク質合成阻害剤の存在下または非存在下における該感染インディケ ーター結合を比較し、これにより該サンプル中の感染インディケーターの量の量 の測定値を得ることからなる、 血液サンプル中の非特異的感染インディケーターの存在を検出する方法。 23． 前記感染インディケーターのための結合パートナーで塗布され、かつ適切 にブロックされた少なくとも一つの固体支持体を含む、請求項 22 に記載の方法 を行うためのキット。