CZ264398A3 - Antipatogenní peptidy a farmaceutické prostředky obsahující tyto peptidy - Google Patents

Description

Vynález v jeho dalším celku poskytují? nehemo 1 yt i ekoii cytolytickou piujííhiusk ze 2 nebo víra? nehemoJytických cytolytických peptidů svázaných dohromady, např. použitím nebo matricové molekuly ková lentně vázané na každý Svazek může být složen ze 2 nebo více, výhodně 'á, stejného peptidu nebo různých peptidů.

Spo jnunreiii/matri c í může být peptid vynálezu nebo běžně používané spojovače, např. polymery, takové jako polyestery, polyamidy, polypept.idy, po IyaminokyseI iuy (např. polylysin) nesoucí aktivní s k ii p i ny , takové jako 1IH, Sil, Hltili, ΝΗ?? , LHzBr.

V dalším výhodném celku vynález poskytuje nehemo I y t. i cki ni cybnly1.ickou směs hydíiií i Inícli d i asti-reoiiiorů uvedených ve vynálezu vynálezu spojených nebo spo jovae í z peptidů molekuI < « získanou dodáním směsi tvořené z 1 ekvivalentu každé z požadovaných hydrofobních, pozitivně nabitých a D-amino kyselin v každém .ézy peptidů. Tímto zpilsn?ptidfl promícháním lysinu, co í rekvenčním) štěpenί,

erakee pevné	íázové metody s
získána směs	Zí?	312	různých
a b-Ieuri nu	řl	po	lil·’ (vy
vodou a lyof i	1 i zař	i by 1 a

f i ]η í směs

V dalším celku vynález poskytuje nehemo1ytirké rytoJytické náhodní’ kopolymery obsahující různé? poměry hydrofobní, pozitivně nabiti’ a I) amino kyše I i ny, např. 111, 2-11 _tl j.- j j (mol) kopoJyinery pus 1 oupnostj tys : Leu ^: l)-Len

Přednost.in·, nehemo 1 yt i cký c ytu IyLic ký peptid v souladu s vynálezem nemá žádnou «-lielixovou strukturu nebo má «líc] ixovou strukturu, které délka není dostatečná pro překlenutí šířky buněčné membrány. Peptid podle vynálezu tedy neobsahuje nepřerušený úsek buď všech I)- nebo všech L- amino kyselinových zbytku délky schopné tvořil, část Lransmembráriového póru. Jaková délka je běžně přibližně 20 až 22 amino kyselin, pokud tento lísek není v konečné' části peptjdu a přibližně polovinu, tj. 10 až 11 amino kyselin, pokud je lísek konečnou částí peptidii, protože v takovém případě dva peptidy mohou spojit jejich konečné část.i dohromady a překlenout buněčnou membránu.

Přerušení úseku 0- nebo L- amino kyselinových zbytků může být. piOverfenu zaměněním jedné nebo více amirio kyselin v úseku ani i no kyselinou opačného optického izomeru nebo umístěním «-helíxové přerušovací části do spojitého úseku, takové jako prolin, qlyein, kyselina «-methyl «--amino nebo kyselina ne-«-am i no.

Peptidy podle vynálezu mají čistý pozitivní náboj vyšší než +1 Čistý pozitivní náboj může být přítomen díky složení přírodních am i no kysej i n vyná Iezu , neutra I i zac i vo 1 ných CflCJIJ skupí η , uapř. amidaci, nebo vzhledem k dodání pozitivně nabitých amino kyselin nebo chemických skupin. Bylo shledáno, že selektivní cyl.o I y t. i cké účinky mohou být občas zvýšeny přírůstkem čistého pozitivního náboje, např. připojením molekuly pozitivně nabité amino kyseliny a/nebo poz.itivně nabité skupiny na jakoukoliv pozici. Např. pólyaminová skupina, aJky)ami no skupina nebo aminoaJky1ami no skupina, atd. mohou být připojeny k joím· z jeho koncových částí, běžně k jeho karboxylové koncové části. Výhodné skupiny zahrnují aniinoethylamino skupinu -NII-CU?-NH₂ , která

i.iko '/71 dále v textu u/iiíičnváiia • ♦ * • · · · • * ·

•

Peptidy vynálezu, které jsou odvozeny z neselektivních cytolytických přírodních peptidů, např. pardaxinu a mel litinu, jsou amfipatické, což znamená, že tyto mají jednu povrchovou vrstvu, která je tvořena hlavně hydrofobními amino kyselinovými zbytky a opačnou povrchovou vrstvu, která je tvořena hlavně hydrofilníml amino kyselinovými zbytky. Amfipatická přirozenost peptidů, které jsou zařazeny v rámci tohoto vynálezu, se může měnit podle metod známých ze současného stavu techniky. Příkladem takové metody je použití Shiffer-Edmondsonova kruhové projekce, ve které jsou amino kyselinové zbytky zapsány podle jejich posloupnosti v kruhu tak, že každá amino kyselina v posloupnosti je úhlově posunuta o 100 ⁰ od jejich sousedících amino kyselinových zbytků (3,6 amino kyselin na jeden kruh). Pokud je na jedné straně kruhu nejvyšší koncentrace hydrofilních amino kyselin a nejvyšší koncentrace hydrof obriích amino kyselin je na opačné straně kruhu, potom peptid může být považován za amfipatický.

Peptidy vynálezu, které nejsou odvozeny z neselektivních cytolytických přirozených peptidů, např. syntetické diastereomery tvořené hydrofobní, pozitivně nabitou a D-amino kyselinami nejsou amfipatické. Tyto mají čistý pozitivní náboj vyšší než +1 a vhodný poměr hydrofobní k pozitivně nabité amino kyselině takový, aby výsledný peptid byl cytolytický k patogenním buňkám, ale né hemolytický. Tyto peptidy mohou být podle vynálezu zkoumány velmi jednoduše použitím antibakteriálních a hemolytických testů popsaných v dále tomto textu. Podle jednoho celku vynálezu mflže být vhodný poměr peptidu složeného z leucinu a lysinu Leu:Lys 64 % : 36 % pro diastereomer ze 6 amino kyselinových zbytků a 66 % 34 % pro diastereomer ze 12 amino kyselinových zbytkfl.

Je domněnkou, bez teoretického omezení, že cytolýtické účinky mohou být vyvolány nahromaděním řady peptidů na povrchové vrstvě membrány, které společně mohou být příčinou poškození buněčné membrány. V souladu s tím a podle popisu uvedeném výše je také zvažováno použití plurálnosti peptidů vynálezu spojených (nébo svázaných) dohromady, např. použitím spojovací molekuly kovalentně vázané ke každému z peptidů.

Jednotlivý peptid vynálezu běžně obsahuje alespoň 6 a výhodně 10 nebo více amino kyselinových zbytků. Podle vynálezů může každý jednotlivý peptid mít běžně délku přibližně 5 amino kyselinových zbytků.

Nehemolytický cytolytický peptid je podle výhodného celku ♦ · ** ··« ♦ · • · ♦ ·· ·· ♦

• ♦ · • · ·* « · • · · • « · ·· » • 9 ··« · nestejnorodým peptidem obsahujícím jak D- tak i L- amino kyselinové zbytky, tj- diastereomer mající selektivní cytolytické účinky k patogenním buňkám, selektivita se projevuje tak, že peptid vyvolává cytolýzu patogenní buňky v mnohem nižší koncentraci než je koncentrace, která je nutná pro vyvolání hernolýzy, tj- cytolýzý červených krevních buněk.

Předložený vynález také poskytuje farmaceutický prostředek obsahující nehemolytický cytolytický peptid vynálezu jako aktivní činidlo a farmaceuticky akceptovatel riý nosič. Prostředky jsou určeny pro použití při ošetření chorob a nemocí způsobených různými patogenními organismy, takovými jako gřampozitivní a gramnegativní bakterie, viry, houby, mykoplasma a parazítičtí prvoci, např. druhu Leishmania, které jsou příčinou leischmaniózy a druhu Plasmodium, které jsou příčinou malárie. Ve výhodném celku je antipatogenní prostředek antimikrobiálním, především antibakteriálním prostředkem. V dodatku, prostředky vynálezu jsou použitelné proti zhoubným buňkám a mohou být použity při ošetření rakoviny.

Předložený vynález také popisuje metodu ošetření zahrnující podávání uvedeného hemolytického necytolytického peptidu ošetřovanému subjektu. Metoda vynálezu stejně jako výše zmíněný prostředek jsou aplikovatelné jak v lékařství tak i veterinární mědícíně.

V souladu s vynálezem je poskytnuto také použití uvedeného nehemolytickěho cytolytického peptidu v přípravě farmaceutického prostředku určeného pro ošetření chorob nebo nemocí v lidském nebo zvířecím těle, detailněji antibakteriálních prostředkfi.

V dalším celku mohou být selektivní peptIdy vynálezu použity jako dezinfekční prostředek pro ničení mikroorganismů, tj- peptid může být použit jako ochranný prostředek v roztoku pro smáčení kontaktních čoček, dále v kosmetickém nebo. potravinářském průmyslu a také jako pesticid, např. fungicid, baktericid v zemědělství nebo pro ochranu zemědělských produktů, např. ovoce a zeleniny.

V souladu s předloženým vynálezem bylo* překvapivě shledáno, že nestejnorodé L-základní peptidy mají selektivní cytolytické účinky projevující se selektivním ničením patogenních buněk, např- bakterií, s malým nebo žádným vlivem na nepatogenní buňky, tj. červené krevní buňky. Tento objev je velmi překvapující z pohledu dosavadní domněnky vyplývající ze současném stavu techniky. že cytolytické působení cytolytických peptidů

I > 0· ·· 0 · t • · 4 • 0 0 0 • · · *

0 0 ·♦·

- 12 v buňkách, tj. patogenních buňkách takových jako bakterie nebe normálních savčích buňkách, vyplývá z jednoduchého skrytého mechanismu spojeného s «-helixovou koní ignrarí Tyto objevy předloženého vynalezu se bez teoretického omezení zdají ukazující, že peptiderri vyvolaná cytolýza je výsledkem několika cytolyI. ických mechanismů působících v různých buňkách v závislosti na přesných vlastnostech membrány cíloví'- buňky; Ledy přerušením «-boiixnvé struktury peptidu, např zaměněním některých amino kysel lnových zbyl.kii ve stejnorodém puptidu opačným optickým izonierem, je možné získat, eytu I yt i cký peptid, který je cytolytícky akt ivní v určitém cy t.o 1 y L i ckém mechanismu, zatímco je v jiném cyLolytickéiu mechanismu neaktivní, je tedy získán cytolytícky peptid specií ický pro určité cílové patogenní buňky Studie funkcí a struktury íi-amino kyselin i nkorporovaiiýr h analogii ( d i astereomerií) pai daxiím a mel litinu, dvou známých buněčně neseJektivnícli cytolysjníí, byly provedeny s cílem objasnit molekulární mechanismus skrývající se za buněčnou selektivitou. Udají? ukazují. že výsledné d i astereomer y nemají zachovanou jejich a-lie I i ká 1 π í strukturu, což je příčinou potlačení jejich cytotox ických účinků k savčím buňkám.

Avšak, d i as Lei eoinery si zachovávají vysoké ant, i hakter i á 1 η í účinky, které se projevily ucelenou lýzou jak grampozitivnich tak i gi ainnegat. i vn í cti bakterií. «-hel i ká i η í struktura pardaxinu a mel litinu byla ukázána jako důležitá podmínka pro cyLotoxi o i tu k savčím buňkám, ale ne jako nezbytná podmínka aktihakteriáIního působení. Avšak, samostatná D-amino kyselina inkorporovaná do neliemo I yt i ckého ant i baktei'i á 1 n ího peptidu magaininu eliminovala pudle dalších studií téměř zcela jeho antíhakteriáJní účinky 1988) Výsledky získané ua tomto místě s diasl.emel liti nu podot.ýka j ί , že hydrof obnosí, a čistý pozitivní náboj dává neseIektivním cytoJytickým peptidům selektivní ant i hakter i á I ii í účinky, a ži? amf i pat i cká «-hel i kál ní struktura není nutně požadována. Avšak, diastereomery pardaxinu a mel litinu obsahovaly dlouhé úseky t-amíno kyselin (14 až. 17 amino kyselin dlouhé), které? zvyšovaly možnost, vzniku membránové vazby a destal·»i I izace přítomností malé, ale možně dostatečné, zbytkové hel i c i ty

Hro zkoušku modulace hydrof obnos t i a čistého poz i L i vn ího náboj»?

i neárn ί i li rytotoxirkýrh peptidů, která dostatečně ověří jejich si 1 ekt i vii í ant i hakter i a 1 η í účinky, byly prověřeny di asLereumery ((hen a spuI reomery pardaxinu a • 0 «Μ a ·«· • 0 * ι

0« ·

• « • « «

00

- 13 peptidů krátkého modelu (12 amino kyselin dlouhé) tvořené různými poměry leucinu a lysinu s tvořenou D ami no kyselinami jednou třetinou jejich posloupností Délka peptidu a pozírá? D-amino kyselin byly takové, aby byly vytvořeny krátké peptidy s velmi krátkými posioupnými úseky 1 až. 3 I,-amine kyselin, které nebyly schopné tvořit. <z-he I i ká 1 n í strukturu Di astereomery byly hodnoceny z pohledu na (1) jejich eytntoxicibu proti bakteriím a lidským orytrncylíím, (2) jejich strukturu a (3) je j ich schopnost, vzájemně působit a rozrušovat morfolegi i bakteriální hradby a modelové fosfolipidy membrán. llda je ukazuji, Že modulace hydrof obnosí, i a pozitivního náboje je dostatečná pro ověření antibakteriá1 ηích účinků a ryLulytieké selektivity. Dále, výsledné antibakteriáI πí peptidy působí synergicky v rie-smr tel ných koncentracích s dostupnými ant i bakter i á I u i ni i léky, takovými jako tet racy k 1 i η , dále jsou zcnla odolné prot,i iiiakt.ivaoi lidským sérem, klen'· drasticky snižuje aktivitu př í nulu ích ant i bakter i á J u ích peptidů. Dále by Iy připraveny a zkoušeny krátké diastereomery (G am ino kyselin a 8 amino kyselin dlouhé), které byly shledány jako nehemo 1 y t. i cké cy to 1 y t i eké.

(Ibjev jistých cy to 1 y t. i ckých nebe 1 i ká 1 n ích peptidů majících ant.ipatogeinií účinky zahrnu je způsob přípravy aut. i-patogenn ích činidel obsahujících Lakové nehol ikální polypeptídy. Pokud jsou uehelikální peptidy nesourodými peptidy složenými jak z. t.-amino kyselin t.ak i D-amino kyselin, arit i-patogenní činidla mají na jedné straně dodatečnou výhodu tu, že jsou více odolné proti rozkladu, např proteázou, než stejnorodé I,-peptidy, a 1e na druhé straně nejsou zcela odolné proti rozkladu jako [dně stejnorodé D-pepl.idy. Odolnost proti rozkladu může být nevýhodou z pohledu pomalého vylučování z. těla s možnými přidruženými následnými toxickými postranními vlivy. Ne-«-he I i ká 1 π í antipatogenní pept.idy mohou být použil.y v různých terapeutických procedurách

Protože je známé, že stejnorodí⁴ D-peptidy mají především shodné jako stejnorodé I.-peptidy (Itessal le a spol , v souladu s t. ím jasné?. že nestejnorodé

D-založené peptidy mají stejné aut i-patogenní vlastnosti jaké neste jnerodě 1.-za ložené peptidy.

liti jev před1oženého vynálezu, t j skutečnost, že určité ne-rt-he I i ká 1 η í peptidy mají cy te 1 y t, i cké účinky proti bakteriím bez i-y Lo 1 y t, ukým účinkům proti červeným krevním buňkám, je zalocy to 1y tické úči nky 1990), potom je žen na skutečnost.

že bakteriální buňky se liči od červených • · ·· « · » * 1 • · · · • · « ·* *«

- 14 krevních buněk ve složení je jich buněčných membrán. Rozdíly ve složení buněčné membrány mohou být také shledány mezi radou patogenních buněk, takových jako rakovinné buňky a normální buňky Podlí? objevu předloženého vynálezu, že jisté ne-«-he I i ká 1 n í peptidy maií specifické cytolytlcké účinky proti jednomu typu buněk, tj. bakteriálním buňkám, byl připraven zpíísob vývoje řady lékií majících selektivní cytolytlcké účinky proti jedné třídě buněk uvnitř těla, takových jako bakteriální buňky, buňky parazitů, buňky hulí, buňky prvokíí nebo rakovinové biiříky, s malými nebo žádnými účinky proti m -pa togeiin i m buňkám normálního těla

Ne-heim 11 y 11 ckč* cytolytické peptidy podle vynálezu mající selektivní cytolytické účinky proti patogenním buňkám a mající umo hem nižší nebo žádné cytolytické účinky proti normálním, ne-paLoqeun íni buňkám, mohou být použity pro různé terapeutické aplikaci» bez nebo s malým toxickým postranním vliveiii.

Jednou skupinou peptidíi v souladu s vynálezem jsou ne-«-hel i ká 1 η í nestejnorodé peptidy odvozem* ze stejnorodých pept idíi s «-helikální strukturou ma j ící široké rozmezí oytolyt. ických účíukťi- Předložený vynález tímto poskytuje v souladu s jedním celkem nestejnorodé peptidy obsahující IJ- a I. amino kyše 1 i nové zbytky mající posloupnost takovou, že stejnorodý peptid obsahující pouzí.* 1,- nebo pouze* I)- amino kyselinové zbytky a mající stejnou posloupnost, amino kyselin jako uvedený nestejnnrodý peptid, má «-helikální strukturu a má široké spektrum cytolytickýf li účinkii projevujících se na řadě buněk: uvedený nestejnorodý peptid projevuje cytolytické účinky pouze k některým buňkám, ke kterým je uvedený stejnorodý peptid cytolyticky akt,ivní. Např cytolytické účinky nestejnorodého peptidíi se projevují pouze k patogenním buňkám, zatímco teut-o peptid zňstává k normálním buňkám, takovým jako červeni? krevní buňky, necytolyt. i cký .

Např- cytolytické peptidy v souladu s vynálezem jsou odvozeny z přírodních peptidíi, které mají «-helikální strukturu a mají cytolytirké účinky. Ne-«-he1 iká1uí pept, idy podle vynálezu mají posloupnost, především odpovídající celé nebo částečné posloupnosti přírodního peptidíi, ve kterém D-amino kyseliny jsou inkorporovány podél N- a ť- helixQ molekuly a čistý pozitivní náboj ji* získán buď dodáním pozitivně nabitého amino kyselinového zbytku, např. lysinu, argininu, histidiím, např. na N- koncovou jednot.ku a/nebo pozitivně nabitě? skupiny, např aminoaIkyIami no • ·

49* 9 9 · · * I • « · <

• 9 ·· Μ skupiny, takové jako aninoethylamino, např. na jednotku molekuly nebo neutralizací volných karboxylových skupin, např. přeměnou těchto skupin na amidové? skupiny Příklady takových přirozených peptidů jsou mel litin a pardaxin a jejich f ragmenty.

Např ne—«-heI iká1ní peptid může býl. odvozen z pardaxinu, kti?rý je 33-iner pept. i<l, nebo z mel litinu, který je 26-mer peptid, ne -a-he 1 i káI u í peptid může být 33-mer w-lio 26-mej’ peptid obsahující posloupnost odpovídající celí· posloupnosti pardaxinu nebo me1 1 iti nu, jednot Ijvě, nebo může být nehe1 iká1 ηí peptid mající posloupnost odpovídající' ěást.eěné posloupnosti pardaxinu nebo mel litinu, např. B až. 23 mor me 1 1 i t i novou posloupnost. V případě nestejnorodého peptidu odvozeného z pardaxinu, nestejnorodý peptid v souladu s vynálezem může obsahoval, částečnou posloupnost odpovídající posloupnosti pardaxinu obsahující ne jméně 10 amino kysel lnových zbytků a mající rozmezí mezi 10 a 24 amino kyselinovými zbytky.

Další skupinou peptidů v souladu s vynálezem jsou nehe1 ikái ηí peptidy, které mají posloupnost obsahující nepřirození? homology a které jsou tvořeny alespoň jednou hydrofobní a alespoň jednou pozitivně nabitou amino kyselinou, a ve kterých posloupnost alespoň jednoho amino kyše 1 i novéhí) zbytku ie D- amino kysel i na. Předešlá .studia modelů peptidu vysvětlovaly strukturální ti funkční studie au I. i bakter i á 1 u ích peptidů zaměřené na tří parametry; helikální strukturu, hydrofobnost a náboj (ňuzai a spol., 1991; ňgawa a spol., 1991). Každá změna jednoho z. těchto parametrů má současně za následek změny dalších dvou, ničit jednoznačný podíl každého parametru na celkových ant.i bakteria] nich iíč i licích je tedy velmi složitá·?. V souladu s před loženým vynálezem byl vliv helikální struktury vyloučen, studie by I y tedy zaměřeny pouzí? iiíi dva parametry, jmenovitě hydrof obnost a čistý pozitivu] náboj, ovlivnitelné změnou poměru leucinu a lysinu. Ι’ιό účely výzkumy byly vybrány modely d i aster eomej ů krátkých peptidů (12 amino kyselin dloubej obsahující úseky pouze 1 až 3 návazných 1,- amine kyselin, které jsou pro vytvoření «-helikální struktury př ί 1 i š krá tke?

CD spektroskopie ukázala, že tyto Leu/bys <1 i astereomery samozřejmě zcela pi istrádají «-helikální strukturu (údaje nejsou uvedeny ) , nepodobně k d i as terei imerům mel li línu a pardaxinu podle vynálezu. ve kterých zůstává malá část «-helikální struktury.

koncovou * * • · • · 1 » » « < · · φ ·* · • · « 4 • · · ««<

« · 4 ·· «·

Nejvíce účinné peptidy (peptid 33 a 24,

- 16 Nicméně, l.eu/Lys diastereomery projevují silné anti bakteria!ní účinky, které jsou podobné neluj větší než účinky přirozených nutí bakteri á I ii ích peptidů, takových jako dermasepl. ί π 5 nebo arit, ibintícký 1ěk tetiaeykI in l Dl-U-O’-^1f»-KgL» íi 11)1 I.³ - ⁸ - ^{1 0}-KhI.v jednotlivě, příklad 3 uvedený v text.u) byly zbaveny herno l y L i ckých účinků proti vysoce cytolyt i cky-náchy I ným lidským ery trocy tůni. Mělo by být zmíněno, že I lil-l ^{1 8} - ^{1 ϋ}-Cj Ly (peptid 22) je zbaven a-lie l i ká l η í struktury, ale projevuje značné herno l y t i cké účinky, které jsou srovnatelné s účinky přírodního ryto 1 yt i ckého peptidu, pardaxinu. Tato skutečnost by mohla znamenat, že rovnováha mezi hydrof Obnos I. í íi pozitivním nábojem vyvažuje ami i pat ickon «-bel i kalní sf.rukl.iiru Zvyšující sc drasticky snižuje herno Iytické účinky, účinky zůstávají zachovány, což pozitivní náboj však I)ř i čemž ant. i bakt.er i á 1 n í znamená, že ami i pat i cká e-he I i ká 1 n í struktura není pro an i. í bak t.eri á J n í účinky nezbytná Vnitřní působení l.eu/Lys di astereomerů s negativně nabitými i zviLLerjonLuvými f osf o 1 í p i dnvým i membránami bylo zkoušeno s cíí em objasnit, podstatu jejích selektivní' cyl.otox i c i ty prot. i bakteriím. Negativně nabité PC/PC vezikuly byly použity pro simulaci lipídového prostředku /’. cn/í (Shaw, 1974) a zv i t.t, i s i ord ové PC vezikuly I iy1y použity pro simulaci vnějšího obalu lidských (Verk lei j a spol . 1973) erytrocyty (obrázek 12) a koreluje ve vztahu s jejich schopností pronikat, modelovou membránou. Pept.id, který pronikl PC vezikuly, byl pept. idem majícím značné hemolytické účinky. Tyto výsledky ukazují, že íosíolipidové složení bakteriálních membrán je funkcí důležitou pro píopustnost této skupinu antibakteriálních peptidů. Schopnost, antibakteriálních a nc-iiemolyt ických peptidů vázat. a pronikat negativně nabité, ne však zv iLLeriontové, í osf o I i p i ilové vezikuly, je charakteristikou přírodních antibakteriálních peptidů (Cazil. a spol., 1994) přisuzovanou obsahu 1 i pope Iysacharidň (I.PS, u gramnegatí vil ích bakteriích) a polysacharidů (kyselina teichoová erytrocytu pept.jdu na biologické účinky l.eu/Lys ť. coli (taliu lká 9) dobře ve vnějších vrstvách bakterií vnitřuích membránách bakteríí, všechny tyto jsou negativně nabity, zatímco normální enkaryontní buňky, takové· jako ery trucy Ly , převážně obsahují z.v i LLer i on Lový fusfoiipid PC na jejich vnějším obalu

Aut i baktei i á I η í pept.id magaininu u granipozi t. i vii ích bakteriích) a i osl ati dy i g 1 ycero i n ( PO ve je nehemo I yt. i cký peptidem, φ · φφ • •· · • φ • φ • Φ ·· φφφ φ · φ φφ φφ nábo j i přírodního i z ex i s (.11 je mez j

- 17 zatímco me]litin, pardaxin a modelový peptid s posloupností podobnou jako u íDl-L^J-^{4 fl 10}-Kate, ale tvořený pouze L-amino kyselinami, jsou homolytické především díky jejich vysoké liydrofobnosti. Pakliže «-helikáliií struktura maqaini nu byla přerušena i nkorpoi ac í tří D-amiiio kyselin, výsledný d i as tereomer neměl žádné antibakteriální účinky (Lheii a spol., 19HB) , přestože jeho pozitivní náboj byl podobný pozitivnímu magaininu Optimální rovnováha, která <í-he i i ká I ii í strukturou , hydrof obnosí. í a čistým pozitivním uáliojem přírodního uaijři i ii i nu , takto umožnil je selektivní an L i bakter i á 1 η í účinky a jakákoliv změna jedí»· z těchto tří vlastností by mohla být příčinou ztráty antibakteriálních éičinkfl maqa i u i nu V protikladu, hydrof obnos t pravděpodobně hraje díl leží tou rolí při ztrátě α-helikální struktury v mel litinu, pardaxiuu a l.eu/l.ys .1 i astereomeríi vyná 1 ezu Výsledky v souladu s vynálezem navrhují novou strategii vývoje nového rozsahu krátkých, jednoduchých a snadno manipulovatelných ant i bakter i á 1 n ích peptidů. Každý d i as tereomer i cký model Leu/Lys peptidů má jednoznačné spektrum účinků (tabulka 5). Existence ucelené rady d i ast.oreomer i ckýeh antibakLeriá1ních peptidů bude umožňovat výběr nejvíce efektivního peptidu s ohledem ua cílovou buúkii. Dále, souběžná aplikace složených (ořem diastereomerů peptidů, působících odděleně nebo společně, má také selektivní zbytkovou hodnotu a zabezpečil je lepší ochranu proti široké škále infekčních mikrobů- Všechny Leu/Lys diasteieomery projevovaly zvýšené antibakteriální účinky proti grampozítivním bakteri ím v porovnání s granniegat i vn líni bakteriemi. tyto výsledky jsou důležité uvážíme-li zvyšující se odolnost grampozitivních bakterií, takových jako SLaphy Itxtoccu;; aureu:,'. entarwocc i a p/icihwmxy: i na běžná antibiotika (Rnssell a spol., 1995). V dodatku oproti přírodnímu aut i bakter i á I ii ímu peptidu - dermasept i nu 5,

Dl -I.³ ' - ⁸ - ^{1 0} - KsLy (peptid 24) si zachovává své ant i bakteria 1 ní účinky i při přítomnosti usazeného lidského séra.

1) j as tereomer i e ké peptidy by měly mít oproti známým antibaktei iá 1 πíiii peptidům několik výliod^; (1) peptidy by neměly mít různé patologické' a ( armako 1 og i cké vlivy vyvolané α-lie 1 i ká 1 li ím i lyt i c kým i cyto I ys i ny . Např s Lapliy 1 ococcus fi-toxín, antibakteriální peptid a I ametli i c i η , ochranný usměrněný lyt i cký laktor a pardaxin vyvolávají několik hisLopato1ogickýeh vlivů na různé· buňky pros t řei ln 11 f.v ím vytváření pórů a aktivace kaskády kyseliny • 4 • 4 4 4

- 18 arachidonové Avšak, diastereomery pardaxinu nevyvolávají tyto účinky. V dodal, ku, mnoho amf i pat irkýeh rr-he 1 i ká I n ích peptidíi se váži? na ka 1 modu 1 i n a vyvolávají několik buněčných reakcí, stejně jako všechny D-amino kyselinové « helixy zahrnující mel litin mají podobné účinky (Eisho!· a spol., 1 *)94) Diastereomery s přerušenou «-helikální strukturou se pravděpodobně neváží na ka 1 modu 1 i n ; (2) místní substituce D-amiiui kyselinou by vedla ke kontrolovanému čištění aut i bakter i á 1 ri ích peptidíi proteo I y f, i r kým i enzymy na rozdíl rul celkovř’ ochrany požadované úplnou substitucí D-amino kyselin (Vadě a spol , 1990). Kolková odolnost lytickýeh peptidíi proti rozpadu jt? výhodná pro terapeut i eké použití. Dále, anf.igenita krátkých fragmentů obsahujících D, I, amino kyseliny je dramaticky pozměněna v porovnání s jejich plně 1,- nebo D- amino kyselinovými výchozími molekulami (Henkirane a spol., 1993); (3) celkový útlum i listu bakterií vyvolaný diastereomery je spojován s celkovou lýzou bakteriální stěny, což je ukázáno díky elektronové mikroskopii (obrázek 14)- Ι’ιόΙ,ο bakterie nemohou snadno vyvinout odolnost proti lékům a vyvolat ničivý mechanismus; (4)

I Dl-I ^{3 4} - ⁸ - ^{1 0} -Ks ty (pept.id 24) má schopnost proniknout buněčnou stěnu bakterie v koneentr ae íeh nižších než je jejich MJť, eož vidět pomocí elektronové mikroskopie (obrázek 14). Souběžná aplikace klinicky používaných antibiotik, které nemají účinky vzhledem k jejich neschopnosti proniknout buněčnou stěnou bakterie, společně s peptidem 34 může dávat řešení tohoto mechanismu odolnosti bakter i e.

Může být. souhrnně uvedeno, že výsledky získané v tomto vynálezu s pardaxinein, mel 1 itinom a modelovými peptidovými diastereomery ukazují, že ani specifická posloupnost, délka nebo pozice D-amino kyselin nejsou požadovány u poJypeptidu, aby tento měl antibakteriá1 ηí účinky Tyto faktory se však zdají být klíčové u savčích buněk.

Výsledky ukazují, že modulace pouze hydrof obnosí, i a čistého pozitivního nábo ie lineárních cytotox i ekýcli polypeptídij ie postačující pro vývoj široké rady účinných ant i bakter i á 1 η í cli d i as tereome i ických polypeptidů určených pru ošetření infekčních chorobVynález bude dále v textu doplněn poznámkami k některým nákresům a příkladům, které však nejsou nikterak omezeny.

Přehled obrázků_na výkresech

Obrázek 1 znázornil je cyklický <1 i r hro i sinus (OD) spektra aminoet hy I am i nopardax inu ( TApar ) - odvoz» mého poptidu. Speklaa byla zachycena při knncenl.raci peptidu 0,8 až 2,0 x 10^_!3 M v 40 %

TApar ( );

[ P] I’⁷!.^{1 8} l ^{1 9}ky, TApar; [DII,^{1 8} I.¹⁹-TApar d iS-Oz-S 10 až 20

2,2,2- lu if l uoroethano l ii (ITT')/vodě Symboly;

IDII’⁷ TApar ( ..); I D l I?⁸1,¹⁹ -TAparC )

-TApar(- ),

Obrázek 2 znázornil le reakční křivky hernolytických účinků podle dávkování Tňpar odvozených peptidu v lidských červených krevních buňkách (hRHO) Příloha znázorňuje výsledky testů pří nízkých koncentracích. Symboly; plně čtverce, mel lil iu; jslné trojúhe1niplné knihy, I D l l*⁷-TApa r ; prázdné kruhy, prázdné čtverce, I I) I P⁷!.^{1 8}1^{1 9}-TApar; prázdné trn júhe I ii íky , deimasept i ii

Obrázek 3Λ-Κ znázornil je maximální rozptyl di fúzního potenciálu ve vez i kule vyvolaný ΊApar-odvozenými peptidy Peptidy byly dodány do i zoton iekého K' volného tlumivélio roztoku obsahujícího malé· jed nutné lamel árn í vezjkuly (Τ'. (IV) složené z vaječného f osf at i dy I cho I i u/í osf at i ily 1 ser i nu (PO/PS) (oblázek 8A ) nebn PO (oblázek SB). předem vyvážené í 1uoresrončním barvivém a va I i noniyc i nem . Normalizace 1 hnireKceiice by 1 a měřena minut po promíchání peptidu s vezikidami. Symboly; plné trojúhelníky, TApar; plné kruhy. 1D]P⁷-TApaj ; prázdné kruhy,

I DJ L^{1 8}1,^{1 9}-TApar > prázdné čtverce, I Dl P⁷!,¹⁸ I,¹⁹-TApar;

Obi ázek 4A-C znázornil je elektronové m i krogjaf y negativně zbarvených E. co li buněk neošetřených (obráx.ek 4A) nebo ošetřených I PJ í*⁷!,^{1 8} L¹⁹-TApar v koncentracích nižších než minimální útlumová koncentivice (MIC) (411) nebo v MIC končentrar ích (40);

Obrázek S znázorňuje OP spektra mel litinu a meJ 1 it1n-odvozených diasteieomerů. Spektra byla zachycena při koncentraci peptidu θ.8

Symbo1y me11 i t i u, ( );

) ; I Dl -V·’-⁸ , ]^{1 7} , K²¹ -mel 1 i až 2,0 x 10 ^b M 40 TITVvoda IDI-V^-», |^1y,K^?1-mel Iitin, (. .

tin-OOOH, ( - - - -);

Obrázek 6 znázornil je reakční křivky herno i yt i ckých účinků podle dávkování mel litin odvozených di asLereomeiů v hRHO. Symboly; plné kruhy, mellit.il), prázdné kruhy, ( I) I-V⁵ - ⁸ , 1^{1 7} , K^{7 1} -me l l i t. i ji-OOOH '· plně· tro j lilie 1 η í ky , I D l - V^ři - ⁸ , 1^{1 7} , K^{2 1} ine I I j t i n ;

Obrázek /Ať znázorňuje elektnmnvé mikroqrafy negativně » » · ·

- 20 zbarvených L. coli neušetřených (obrázek 7A) nebo ošetřených [ Ρ ]-V·⁵ - ⁸ , 1^{1 7} . K^{2 1} -me l I 11 i n v koncentraci nižší než MIC ( 7 B ) nebo MI O koncentrac i (70);

Obrázek Jiň - B znázornil je maximální' rozptyl difuzního potenciálu ve vez i kul ách vyvolaný me l ] i t i nem a me l ) i t. i n-odvozeným i diastereomery. Pepkidy byly dodány do i zi itoii i ckélm L¹ tlnmivého roztoku obsahujícího SilV složené z PO (8Λ) nebo PO/PS (8B), předem vyvážené f liinrescenčním barvivém diS O?-’) a va 1 i nomyc i nem . Normalizace f 1 uoresrence byla měřena 10 až 20 minut po prolil íclián í peptidů s vez i ku 1 am i . Bymbo I y plné knihy , mel I i Ι,ίιι; ρ l né kro j lilie I n i ky ,

I I)J ,Ί ^{1 7} , K^{2 1} me) I i ti n .

Obrázek 9A-B znázorňuje zvýšení f]uoroscenco

I Ρ]-V⁵ * ⁸ , I^{1 7} , K²¹ -me l ] i t i nu (0,5 j.iM celkové koncentrace) po titraci s PO/PS vez i ku I am i (plné trojúhelníky) nebo PO vozikiilami (prázdné Lro j lilie J η í ky ) , s excitační vlnovou délkou sestavenou na 280 nm a vyzařováním při 340 nm. Pokus byl proveden při 25’ °0 v 50 mM NazSOa, 25 mM HLTLS-SOa ² , pil 6,8 (obrázek 9Λ) ; a návaznou isotermu odvozenou z. obrázku 9Λ nákresem Xi/ (molární poměr vázaného peptidu na 60 % lipidu) oproti Ct (rovnovážná končentrace volného peptidu v roztoku) (obrázek 9B);

Dlnázek 10Λ-Β znázornil je rychlé ochlazení tiyptoí ann senzitivního na prostředí hromovanými fosfolipidy. Mel litin (obrázek 10Λ) a 1 I) I-V^b * ⁸ , ]^{1 7} , L^{2 1} -me 1 1 i 1. i π (10B) byl dodán do útlumového roztoku obsahujícího PO/PS (Bl v/v) SUV. SUV obsahovalo 25 % buď 6,7-Br-Pc ( ) nebo 9,10-Br-Pc (----) _nebo 11,12-Br-PO

(. ) Po 2 minutách inkubace bylo zaznamenáno spektrum vyzařování tryptofanu použitím spekt.rof 1 iioromekru s vymezením excitace při 280 nm. Pxo porovnání bylo použito PO/PS (1 1 v/v) SUV bez Bi-PO (-).

Oblázek 11 znázorňuje vliv hydroíobnosti Leu/Lys diastereomerů na RP-HPLO retenční dobuObrázok 12 znázorňuji? reakční' křivku herno 1 ykickýcli účinků podle dávkování Leu/Lys d i astereomerů v JiRBO. Příloha znázorňuje výsledky testu v nízkých koncentracích. Symboly; prázdné čtverce, mel litin; ρ 1 tió čtverce, [ l)J -I,³ - ^{3 8} - ^{1 0}-Lj Ly . plné kruhy,

11) J -l.³ · ³ · ⁸ - ¹ ° Latii > prázdné trn j úhel n íky, [ Dl L³ - ^Λ - ⁸ - ¹ ° -Ks ty ; plutí trojúhelníky, l I) l -L³ - ⁴ - ⁸ - ^{1 0}-Ky , Ls .

Obrázek 13A-B znázorňuje maximální rozptyl difuzního potenciálu ve vezikulách vyvolaný Leu/Lys d i asl.i?retnrn*iy. Pepi,idy byly dodány de i zutou i ckélio L* volného Lluinivélio roztoku obsahujícího SUV • · · · • * · ·

- 21 složené z PC (obrázek 1 3A) nebo PL/PC (138), předem vyvážené fluorescenčním barvivém diS-Cz-S a valinomycincm. Normalizace f 1 íioresceriee byla měřena 3 až 10 minul. po promíebání peptidii s vczi ku lamí . Sym bo 1 y p J né č tvorce, [ 1) 1 -L³ ' ^A < ^H < ¹ ° Kg Cg . μ 1 né [» 1 rit?

ti'o i úbe i η í ky , krutly, [ Dl-I³-⁴·⁸- ¹⁰-KgL,g ;

I i.) I -1 ³ - ⁴ - ⁸ - ^{1 0}-Ks Ly ; křížkované kruhy, I D I - L³ - ^{Λ 8 1} °-KyLs ni irázek 14Λ-ΙΙ znázornil je elektronové mikrografy negativně zbarvi? ných coli neušetřených a ošetřených různými Leu/Lys diastereoiuei y v 80 % jejich Μ 11. flbrázek 14Λ, li. rol i ošetřené ošt ?Lři ?né

I Dl -I.³ - ⁴-⁸ - ¹⁰-K.jLg :

s [ I) J-L³ - ⁴ - ⁸ - ¹ °-Ks Ly ; s I Dl-L³ - ⁴'⁸ - ^1o-KyLs >

obráží ?k

C, konin11 η í obrázek 14D, /·;.

obrázek 148, 14c, c<>ii li. coli ošetřené ctil i ošetřené

I [,] _| i.a.8. W-KgLg i ibrázek obrázek 141 er> 1 i oši ? t řené s I D I - L³ - ^Λ - ^{8 1} ° -Kg Lg ; | Pl - : ^{- ⁴ -^í{ - 1 o-K.sLy .

kontrolní; obrázek 14C, li. obrázek 14H, li. ctili ošetřeno

PříkIady provoděn i vynáIezu ( i ) Mater i á I y . buty 1 oxy ka rbuny 1 - (am i no kyselí na ) - ( feny I ai el.

ami do)-methylová pryskyřice byla získána od Applied Bioszstems (Postel City, CA) a blity 1 oxykarbony J (Boc) amino kyseliny byly získány od Peninsula Laboratories (Be linou t, Ca). Další činidla použitá pro syntézu peptidů zahrnovala kyselinu trií hiorooctnvou (TI A, Sigma), N , N-d i isopropy J ef.by 1 am i ii (DÍLA, Aldrieb, rlestilovaný přes ninhydrin), dicyk1ohexyIkarbodiimid (DCC, Fluka), 1-liydroxybenzotriazol ClltlBT, Pierce) a dimethylformamid (peptid syntézní značka, Biolab). Vaječný fosíatidyIcholin (PC) a íosfatídyJserin (PS) z míchy hovězího dobytka (sodná stíJ - úroveň I) byIy získány od Lipid Products (South Nutfield, D.K.). Vaječný í ostat ifíy I gl ycerol (PC) a f osí at i dy 1 ctliaun I am i n (PC) (typ V, z llcchc/ · ich íji ctili) byly získány ze Sigmy. Cholesterol (extra čistý) by I dodán od Merck (Darmstadt, Německo) a dvakrát překrystal izován z ethanolu. 3,3' -d iethyl tliiodi karboeyanin jodid IdiS-Cz -S| by I získán od Molecular Probes (Fugene, Ok) Přírodní mel litin hy1 získán ze Sigmy Obchodně dostupný mol litin obvykle obsahu je stopy losiolipázy A?, která vyvolává rychlou hydrolýzu fosíolipídtí. Proto byla věnována zvláštní pozornost odstranění celkově’ I osf ol ipázy A₂ z mel litinu prolži tím KP-HPI.C. Všechna další činidla měla analytickou kvalitu. Tlumivé roztoky byly připraveny v sodno-draselněm destilovaném vodním sklo « 9 · 9 · •99 9999 4

9 9 4

9 9 9 • 9 *· (ii) Syntéza a čištění peptidfi. Peptidy byly syntetizovány použitím pevné fázové metody aplikované kysel i na)-(f enyI ar et.am i do)met.by 1 ovou pro buty1oxykarbony1-(amino pryskyřici (0,05 meg)

1082). Peptidy vázané· na pryskyřici byly (Merriíield a spol

odštěpeny	od pr	yskyř i c	použ i t. ím	f Inorovodíkn	(lil·) a	po 11
ní podrobeny	extrake i	suchým	etherem Tyto sur	•ovi-
př í pravý	obsahovály	jeden	hlavní pík,	jak	ji;
prosPředu i	i c I.v ím	KP HPÍ	,C, pík	ř.»y 1 50 % až	70 %	hrnut.
pept i ilom.	Syn l.e	1.1 zovanř	peptidy	by 1 y dá 1 e i; i	i stěny pomne

odhíi I eno chráněných pept i díl, s etherem na Ci 8 zpětné: í áz ι 8 i o Rad po 1 o-preparat i νιι í koloně (300 Λ velikost pórů). Kolonii byla cínována po dubu 40 iiuiiut pouzí tím přímého spádu 10%' až 60 % acetonitrilu vp vodě, obě směsi obsahovaly

0,0’ϊ % 1ΊΛ (v/v), při rychlosti 1,8 m I/m i n . Čištěné peptidy, kleri· se prostřednictvím analytické IIPCC ukázaly jako stejnorodé ( ' 95 %9 byly podrobeny analýze amino kyselin a hmotnostní spektrometr i i pro ověření jejich posloupností.

(iii) Transami nace peptidfi. Peptidy vázané na pryskyřice jako v případě (i i) výše byly transaminovány 30 % ethyIendiaminem v DMC po dobu 3 dnů, následovala filtrace pryskyřici*, vysrážení jmeiiov i tě' am i noethy 1 am i no (Tň ) pept. i dfi , a odst.ranění clmánicích skupin prostřednictvím 111·’. Syntetické ΤΛ-peptidy byly čištěny O 95 % stejnorodost) zpětnou táží HPLC na tm koloně použitím přímého spádu 25 % až 80 % ace ti ni i f.r i 1 ii v 0,1 % ΓΙΑ po dobu 40 minul, a mís 1 cílně podrobeny amino kyše I i nové ana 1 ýze ověřil j í c í je j i cli s 1 ožen í (iv) Amidace peptidfi. Peptid vázaný na pryskyřici (20 mg) byl upravován po dobu 3 dufi směsí složenou z nasyceného roztoku čpavku (30 %) v methanolu v poměru 1^:1 v/v a DMSO (14 v/v), což vedlo k amíuacj karboxyIátové skupiny g]utam i nového zbytku umístěného na ť-konečné jednotce (I)I-V^b-⁸, 1¹⁷ ,K²¹ - meI I iti nu. Takto byly peptidy získány, ve kterých všechny chrámci skupiny zfist.aly připojené, ale jejichž C konečné zbytky hy l y přeměněny jednou amidovou skupinou. Methanol a čpavek byly odpařeny pod proudem dusíku a chráněné peptidy by l y podrobeny extrakci z pryskyřici· prostředí! i ctv ím DMSO

Produkty byly následně podrobeny ΙΙΓ použitím KP HPLC podle popisu uvedeného výše.

(v) Příprava lipidových vezikul Malé jednotně lamelami vezikuly vysjáženy suchým etherem. štěpení a dalšímu čištění (SUV) byly připraveny sou i kar í PC/cho I es Lem i u (10-1 v/v) nebo

PC/PS (11 v/v) disperzí. Suchý lipid cholesterol (10-1 v/v)

I ftft* • · · ft 1 • · 1 •« ftft • · ft · v sonikáturu Jázííového typu Supplies Kumpány lni:., NY)

- 23 byly rychle rozpuštěny v KIIKl 3/MeOH směsi (2=1 v/v). Roztoky byly následně odpařeny pod piOiiilem dusíku a lipidy (v koncentraci 7,2 mg/m1) by Iy upravovány ve vakuu po dobu 1 hodiny a následně opět suspendovány ve vhodném tlumivém roztoku vířením. Výsledné 1 ipi dové disperze byly následně sóji i kovány po dobu 5 až 15 minut.

(61125SP1 sou ikátor, Laboratory až do okamžiku je i jeli vyčištění.

Koncentrace lipidu výsledných příprav byla určena analýzou fosforem (Harlett, 1959). Vezikuly byly zobrazeny použitím JKOK J KM 100B elektronového mikroskopu IJapan Kleci, run llptics Laboratory Co. ( japonská elektronová optická laboratoř), Tokyo, Japanl následovně Kapka vezikul Byl umístěna na mřížku upravenou uhlíkem «ι negativně zbarvena u raný I acet.á tem . Zkouška mříží ukázala, že vezikuly byly jednotně lamelami s průměrným průměrem 20 až 50 nm (PapahadjopouIns a Mil lei’, 1967).

(vi) Příprava séra. Krev by i a získána od pěti dobrovolných dárců a ponechána se srážel, při pokojové teplotě po dolní 4 hodin Krev byléi následně centr i f ugována po dobu 15 minul, v 1500 g, sérum bylo odstraněno íi spojeno. Sérový komplement byl inaktivován zahříváním př i teplotě 56 °C po dolní 30 minut..

(vií) Kl) spektroskopie Kl) spektra pept.idů byla měřena Jasen J-500A spekl.ropu I ar i metl em po rozdělen) stupnice přístroje ( + )-1 0-kaí rsu 1 í liliovou kyselinou. Spektra byla zkoumána při l.cplii tě 23 °K ve cloněných krystalových optických buňkách s optickou délkou 0,5 mm. Spektra byla získána při vlnových délkách 250 až 190 nm. Pro každý peptid bylo provedeno osm zkoušek s rychlostí snímání 20 nm/inin. Peptidy byly prohlíženy v koncentraci 1,5 x 10'⁵ až 2,0 x 10'-’ M v 40 % triί1uoroethano1u (TIK), rozpouštědle silně podporujícím 6-lie 1 i ká I ιι r strukturu. Ki akční hei ici ty (breeiif ield a Kasman, 1969; Wua spol . , 1981 ) byly propočteny nás I erJovně^;

I í)l°2.22 í li =

LHj100₂₂₂ kde ΠΐΙζ?ζ e i i pt i čin ist je experimentálně pozorovaná střední zbytková l’l'

222 nm a hodnoty (Nl^o?zz a Utl

100

222 , které· odpovídají 0 % a 100 % obsahu helixů při 222 lim, jsou odhadnuty φφφ hodnotám i 2000 a 32000 deg.cm²/dmo1 (s tupňfl- cm²/dec i mo1), jednotlivě (Wu a spol., 1981).

(viii) AntihakteriáI ηí účinky peptidů AntihakteriáI ηí účinky d i ashereoiiterů byly zkoušeny ve stoji I n idi deskách s 96 otvory (Nunc F96 in i krot i tračn í desky) v konečných objemech 100 pí. následovně: AJíkvotní část.i (50 jíl) suspenzi: obsahující bakterie v koncentraci 1 O⁶ jednotek tvorby kolonií (to I ony-Korní i ng Un i t.s I .'III) /ni I 1.8 (l.anria broth) média byly dodány do 50 jd. vody nebo 66 % spojeného normálního lidského séra v P85 obsahujícího peptid ve 2-s 1 čížkovém postupném ředění. Utlum i ústil byl určen měřením absorbanee při 492 nm automatickým čtecím přístrojem m i k rodesek E1309 (Bío-tek Instruments) následovně po inkubaci trvající lil až 20 hodin př i teplotě 37 °C. Ant i baktei i á 1 n í účinek byl vyjádřen jako minimální útlumová koncentrace (MIC), koncentrace při které byl pozorován 100 % útlum růstu po 18 až 20 hodinách inkubaci.·. Byly použity následující' bakterie; Esciuar bii i,t col i 021. P&eudontonás denujiuor.a ATCC 27853. Tleinet.ehxcter calcoacetiru:; Acl 1 , S-almonol l<i t.yph imurium LT2, linei llns mcqalcriiiiii Bmll, Nii:r<x:occus luteus ATCC 9341. Bncillus snbtilis ATCC 6051 .

(ix) Uemolýza lidských červených krevních buněk Byly testovány hemoJyl.ické účinky peptidů vůči lidským červeným krevním buňkám (liRBC). Čerstvá liRBC s KOTA byla 3 král. promyta s 8115 (35 mM fosfátového 11 um i vélio roztoku/0.1 5 M NaCl, pil 7.3) centrifuqaeí trvající' 10 ιιι i nut v 800 g a opět suspendována v PBS. Peptidy rozpuštěné v PBS byly následně dodány do 50 pí, roztoku uskladněni: hRBC v PUS, čímž se získal konečný objem 100 pt (konečná koncentrace erytrorytů, 5 % v/v). Výsledná suspenze byla po dobu 30 minut podrobena inkubaci při promíchávání a teplotě 37 °C. Vzorky byly následně po dobu 10 minut podrobeny centriíugaci v množství 800 g. Uvolnění hemoglobinu hýlu mou i horováno měřením absorbanee povrchově aktivní látky při 540 nm. Kontrolní hodnoty pro 0 % hemolýzy (prázdná) a 100 % hemolýzy byly získány z hRBC suspendované v PUS a Tritonu 1 jednotíivě.

(x) Zviditelnění vl ivíi peptidů na bakterie použitím elektronové mikroskopii? Vzorky obsahující /·.'. tnti i (10⁶ CllI/ml) v I.B médiu byly po dobu 16 hodin podrobeny inkubaci s různými peptidy v jejich MIC, jedno zředění bylo nižší než MIC. a následně eeritri f ugovány po dobu 10 minut v 3000 g. Peletky IiyIy opět suspendovány a kapka obsahující bakterie byla umístěna na mříž povrchově uplavením uhlíkem, která byla následně negal.ívně zbarvena 2 % • · · φ φ φ • · » ΦΦΦΦ ·· · · * . φ · · φ φ

- 25 kyselinou fosíovo1frámovou (ΡΤΛ), pH 6.8. použitím JENI. JEM 1008 elektronového mikroskopu.

(xi) Průchod membrány vyvolaný peptidy- Prostupnost, membrány byla odhadnuta prostřednictvím analýzy diíuzního potenciálu (I.oew a spol , 1983; Sims a spol-, 1974) podle popisu uvedeného výše (Shai a spol., 1991) Pro běžnou zkoušku ve skleněné trubici byly 4 pl suspenze ί i posomů (konečná f osí o 1 i p i dová končeni i ace 33 pM) v K' tlnmivém roztoku (50 mM KzSOu, 25 mM IIEPESSfh-i ², pH 6,8) zředěny v 1 ml i zutou iekého K⁴ volného tlumivého i-oztoku <50 iíiM NaxSlIa, 25 mM HEIT.S-Sl la ² , půl 6.8), následně bylo dodáno fluorescenční potem; i á 1 ově-senz i 11 vn í barvivo diS-l-z-5. Valinomyein (1 pí 10 ⁷ M) byl dodán do suspenze tak, aby uvnitř vez i kul pomalu vznikal negativní dlí užni potenciál, který způsobuj·' prudké ochlazování barvivové I I uoresei -m a . Jakmile byla f luoreseence stabilizován;!, což trvalo 3 až 10 minut, byly dodány peptidy Následný rozptyI diíuzního potenciálu odražený zvýšením f luoreseence byl monitorován na Perkin Elmer 1.8-508 spektro1 I iioiOinel.ru s excitačním zařízením upraveným na 620 nm, vyzařováním při 670 mu a přírůstkem upraveným na 100 Procentický podíl normalizaci; i 1 uorencence l't byl definován takto;

Mřížky byly zkoušeny

Et = <11

Jo / I f - I o ) x 100 kde Jo = původní pozorovaná před dodáním val inomyei nu a pozorovaná po dodání peptidů v čase t.

(xii) Vazby peptidů k [Dl __V5,o ,ρ'/,κζι -_mel litinu s f Inorescenre, Ji = celková fluorescence lt - fluorescence vez i ku 1ám.

vězí ku 1am i

Vzá jemné působení obsahuj í c ím i zvi tteriont.ové (PC) nebo negativně nabité fosíolipídy CPC/1’5) bylo charakter i zováno měřen í iii tryptoíanu peptidů při změn intenzity vyzařování intrinsiekého SOV 1. i tr ačuícli zkouškách St,ručně, SIJV byly při teplotě 24 °C dodány do stálého množství peptidů (0,5 jiM) rozpuštěného v tlnmivém roztoku obsahujícím 50 mM NazSOa, 25 mM HEPES-Sfbi ² , pil 6,8. 1 em optické délky křemenné kyvety, která obsahovala konečný reakční objem 2 ml, byty použily ve všech zkouškách. intenzit;· fluorescence byla měřena láinílin poměru 1 i pi du/pept i dli (4 ako funkce mooddělené zkoušky) n;

Perkin-Elmer LS-5 Spek tn d 1 uoroiiief.ru s excitací upravenou na 780 nm použitím 5 nm zářezu a vyzařováním upraveným ria 340 nm použitím 2,5 [im zářezu. Izotermy vazeb byly analyzovány jako částečná » τ · • · · « ft · » · · ·· · • · « 9 v * ·♦* ··

- 26 rovnováha použitím následujícího vzorec:

Xb = Kpld kde Xi, je det i novám > jako mulární pniiičr vázaného peptidů (l'b ) k celkovému lipidu ((,'[.), Kp odpovídá rozdě1ovaeímu kord icicnl.u a l.g představu je rovnovážnou koncentraci volného peptidů v roztoku. Praktickým účelovým předpokladem bylo, že peptidy byly pír viidné rozdělovány pouze na vnější vrstvě (60 %9 i.»UV _ Odtud tedy rozdě 11 ivar í rovu i ci · Xb = Kp la kde Xh' je did inováuo jako molární poměr vázaného peptidíi na 60 % celkového 1 ipidii a Kp” je odhadnut.;) povrchově rozdělovači konstanta Křivka vychází z nákresu Xo opřeli volnému peptidíi, Ij je označeno jako běžná izoterma vazby.

(xi i i ) Zkoušky útlumu (rychlého chlazení) tryptoíanu. Tryptoían, který je citlivý na svr· prostředí, byl použit, v přecházejících metodách v kombinaci s hromovaným i fosfolipidy (Br-PP) s cílem ziisíít rozmístění peptidíi v membráně (Bulen a Hollriway, 1990; l)e Kroeu a spol., 1990) Br-PP použila? jako tlumicí (ocli 1 azovac í ) bitka f 1 unresrence t.ryptuf anu jsou vhodili'· pro zkoušku absorpci: peptidň v membráně, jelikož tyto působí při krátké vzdáleností a drasticky neporušují membránu. Mel titán a jeho d i as tereomer, jednotlivě obsahující jeden tryptoí áriový zbytek, byly dodány (konečná koncentrace 0,6 jjM) do 2 ml tluinivého roztoku (60 mM Nazblbi, 26 mM HEPPS-Sfki ² , pil 6,8) obsahujícího 20 pl (60 pM) Br-PP/PS (11 w/v) SIJV, t.akto upravující poměr I i pi du/pept i du na 100^:1 Po 2 minutách inkubace při pokojové teplotě bylo zaznamenáno emisní spektrum tryptoí anu použit,ím Porkin-eImer I.S-60B Spekt.rol 1 uorome1.ru s excitací stabilizovanou na 280 run (8 nm zářez) Byty použity SIIV tvořené Pl.'/166 (1^;1 v/w), které obsahovaly 26 £ buď 6,7-Br-PP nebo 9,10-BrPP nebo 11,12-Br-PP. Pro každý pvpkid byly provedeny tři oddělené zkoušky. V kontrolních zkouškách byly použity 1’P/PS (1 :1 v/v) SIJV bez. Br-PP« · • · ♦ ·

Příklad 1 - Syntéza a biologické účinky d i as tcreoni *rfl odvozených z pardaxinu

1-1 Syntéza. Pro zkoušku funkce «- he I i ká 1 n í struktury polykationtovčho cyl.olysinu při jeho cytotoxicitě na savčí buňky a bakterie byla syntetizování! rada peptidíi odvozených od pardaxiiiii podle popisu odstavců (i i) a (iii) metod zkoušek, byla charakterizována jejich struktura, herno 1 yt j cké účinky na hkfIG. aiitibakteriální účinky a vliv na morfologií bakterie

Pardíix i n (par) je 33-mer pe| >t i dem s následující posloupností;

GJ y-Phe- Phe-Λ 1 a-Leu -1 1 e- Pro-tys - I I e I I e-Ser-Ser Pro - l.eu-Phe-Lys - Thr-I .eu -1 .< .'ii - Ser-Λ 1 a - Va 1 -G I y -Sei -A 1 a -1 .eu-Sei -Ser-Ser 1»I y-Gly-GI n-G I u

Modií i kare molekuly pardaxinu s cílem zavést požit.ivní náboj byla provedena buď zrušením kyselé Ičkiiuoivó jednotky pardaxinu nebo přeměnou kyselé C-koricové jednotky pardaxinu nebo jeho fragmentu na pozitivní reakrí obou karboxylových skupin Glu zbytku G-koncové jednotky s ethy 1 endi ami něm (TA) a/nebo doiláním pozitivně nabitých aminu kyselinových zbytků, takových jako Lys, k N-koucové jednot, ce di asLereomei ů pardaxinu. ve kterých N-hel ix a/nebo G-helix byly přeměněny buď záměnou zbytku Pro na 7 pozici TApar nelni 1 i agiueritn pardaxinu za 1)- Pro (zde označované jako IDJP⁷) nebo dvou Leu zbytků na pozicích 18 a 19 TApar nebo fragmentu pardaxinu Zet D-Leu (zde označované jako [D]L^1íít¹⁹), nebo společnou záměnou těchto dvou (zde označované I I) I P⁷!.^{1 8}t¹⁹ ) . D-amino kyseliny byly zavedeny do středu N- a G helixů.

Následující diastereomery odvozené z pardaxinu byly shledány jako neliemo I yt i cké , projevující' selektivní cytolytické účinky (tučné a podtržené uvedené zbytky jsou D-amino kyseliny). Peptidy byly označeny v textu tučnými číslicemi.

1. (DIP⁷ I,¹⁸L¹⁹-TApar s pos1onpnost í

Gly-Phe-Phe-A1 a Leu-I 1 e-Pro-l.ys-1 le- 1 le-Ser-Sor-Pro-Leu-Pfie-Lys-Thr-Leu-Leu-Ger-A 1a-Va1-Gly-Ser-A1 a-Lon-Ser-Ger Ser-Gly-Gly-G1 n -G1 η - ( NH-díz Cite - NH? )?

2. L I) 1I’⁷ L^{1 8} ť* ⁹ ll až 22J -TApar s posloupností;

GJy-Phe-Phe-Λ Ja-Leu-1 le-Pro-Lys I le-I Je-Ser-Ger 1'ro-l.eu-Phe-I ys

-Thí -Leu-Leu-Sei -Λ 1 a-Va I - ( NH - Cil? GI1? -NH? )?

• 9 9 9 » 9 » **« • · * 944· 9 9 9 4 • 9 4 9 · · 9**4 *944 * *4* 4 4 * 9*4 * 9* 49 «4 44

- 28 3- I Dl P⁷L^{1 8} L¹⁹ t 1 až. 221-par s posloupností;

G1 y-Phe -Phe-Λ I a-Leu - 1 1 e-Pro-Lys -11e-I I e-5er-Ber-Pro-Leu-Phe-Lys -Thr-Leu_rLeii-5er-A 1 a-Va1

4. K¹ [ D | Ρ⁷1,^{1 8} L¹⁹ I 1 až 22 J -TApar s posloupností;

Lys-Gly-Phe-Flie-Ala-Leu I Ie Pro-Lys- 1 i o- 1 1 e-Ser-Sei Pru-Leu-Phe -l.ys-Thr-Leii-Lt?u-Ger-ň 1 a-Va 1 - (NH-CH? -CH? - NH? )?

5. Κ¹ t^? ( Dl P⁷l2⁸l2 ⁹ II až 221-Tňpar s posloupností;

I .ys I .ys-G1 y-Plie-Phe ň I a-1 ,eu- I 1 e-Pro-Lys (]<?-! 11?-Ser-Ser-Prn-lj·ιι -Phe-I.ys-Thr-Leu-Uni-Bei-A I a-Va 1 -(NH-CH? -CH?-NH? )?

6. K¹ K² [ 1) J P⁷ L¹⁸ I,^{1 9} I 1 až 22|-par s posloupností;

I .ys-I.y s -G 1 y-Phe-Pho-Λ 1 a - Leu - I 1 e-Pro~Lys- T I e- 1 1 e-Ger-Se) -Pr< i-I,hii- Phe -1 .ys - Th r- Leu-Leu-Ser - A I a - Va I

I D]Ρ⁷-I 1 až 111-TApar s posloupnost í:

G I y-Phe-Phe-A I a-l.eu- 1 1 e-Pro-Lys- I I e- I le Ser-NJI-l '11? -CH? NH?

Ryly syntetizovány následující deriváty pardaxinu, které byly shledány jako hemolytirky aktivní, což je ukázáno v tabulce 1 uvedené dále v textu.

8. Tflpar

9- I Dl i·'^{1 3}-TApaιΙΟ I DI L^fjJ ⁹-TApar

II IDJP⁷L¹⁹-TApar

I Dl P'⁷-TA par

13- I Díl·’⁷-par

14- I D l L¹⁸ I ,¹⁹-TApar

15. I DJ l.¹⁸ L¹⁹-par

16. I DJ Ρ⁷1.^{1 8} L^{1 9}-par

17. ID]P⁷ |1 až 221 TApar

1-2 Určení sekundární (odvozené) strukLmy peptidu. Sekundární struktury peptidů 1, 8, 12, 14 byly ohodnoceny z jejich CD spekter v 40 % ΤΙΈ, rozpouštědle které silně podporovalo a - li e I i k á 11 í strukturu, podle popisu metod zkoušek, odstavec (vii), a v PBS (35 mM fosfátového tlumivého rozLoku/0,15 M NaCl, pH 7,0).

CD spektra diastereomerň odvozených z pardaxinu jsou znázorněny na obrázku 1, na kterém IŘI (” ), 1121 (....), 114 1 (-----) a 111 (-. .-.-). Diamatický pokles α-hel ixovélio obsahu peptidů je podle očekávání pozorován u peptidů s vyšším obsahem D-amino kyselin, což se odráží minimálním] hodnotami v 208 a 222 nm v 40 % rt i:

Ryl pozorován víra.· jak 90 % pokles a-he í i xového obsahu mez: i > 9 · 9 9 9 9 * » 9 9944 ·« 4 « fl » 4 4 4 9 4

99 >4 99 na ροζ ί»: ι vytvářenί

- 29 peptidy 8 (TApar) <50 % α-helix) a 1 ( I I)] P⁷!,^{1 8} I.^{1 9}-TApai ) <4 %) .

Obsahy «-heJixů peptidů 12 (ΓDlP⁷-TApar) a 14 < I Dl L¹⁰ I.^{1 9}-TApar ) byly 25 % a 15 %, jednotlivě. Mělo by být poznamenáno, že prnlin 7 nezavádí do struktury ohyb, ale spise se [Midi Jí na N-helixii, což jo zře jiné podle NMR spektroskopie (Zagorski a spol., 1991). Pardaxin v PBS dal nízkou hodnotil 12 % «-he 1 ixového obsahu, zatímco všechny analogy s D-amino kyselinovými zbytky projevovaly velmi malé znaky, které nemohly být přisuzovány speciiíckým strukturám (údaje nejsou uvedeny).

1.3 Heirio J yt i eké a autibakteriálui účinky. Peptidy 1 až 17 odvozené od pardaxinu byly nás ledně zkoušeny pro jejich herno I y t i cké účinky proti vysoce senzitivním lidským orytrocy tůni a pro jejich vysoké účinky potlačení růstu rozdílných druhů bakterií podle popisu metod zkoušek, odstavec (ix) a (xviii), jednotlivě- V dodatku, cytotoxický včelý jed nit ? 1 litin, antibakteriá1ni peptid dermasopt i n 5 a antibiotický Let.raeyk I i n byly použity jako kontrolní látky.

Na obrázku 2 je znázorněna křivka herno 1 yt. i ckých účinku peptidů 1, 8, 12, 14 IJkazu je se, že D-amino kyseliny inkorporované do

TApar dramaticky snižují jeho henio I yt i eké účinky, které koreluji se ztrátou «-heJixového obsahu odpovídajících analogů Peptid 8 TApar s iieivyšším obsahem «-helixů je nejvíce herno I y t. i cký , zatímco peptid 1 I D1 P⁷1Ž ⁸ 1.^{1 9}-TApar s ne jiiižšíin obsahem «-liolixů je prakticky zbaven herno 1ytických účinků až do maximální testované koncentrace (50 pM). Neschopnost lýzovat. RBť je charakteristická pro většinu přirozeně vznikajících antibakteriá1níeh peptidů, takových jako dermasepti π (podívejte se na obrázek 2), magoinin a eekropin.

Tabu 1 kíi 1 ukazuje hodnoty MIC (v pM) peptidů 1 až 17 pro předložené druhy testovaných bakterií, které zahrnují dva gramnegat. i vn í druhy, Euduu-ichiá coli a Ar inrtobartrr ca lcoacct. n:us a dva grampozitivuí druhy, Hadi lun mmtater i um a Dar i litin nubt.ilin, a také % hemolýzy pro 50 pM peptidů. Tabulka 2 ukazuje hodnoty MIL 8, 12, 14 a me 1 I i 11 rui, dermaseptínu S a Let cacyklinu pro některé druhy bakterií. Údaje ukazují, že, i přes snížený obsah «-helixů a pokles herno 1 yt i ckých účinků diastereomeriekých analogů 1 až 7, si tyto analogy ponechávají většinu silných ant i bakteria 1 ii íeh účinků původního peptidů pardaxinu, který i·· porovnatelný se známými přírodními ant i bakter i á 1 n ím i pept i dy (v pM ) peptidů 1 • « o

o o —

CA

CO rs co

Minimální útlumová koncentrace CjjM) a íiemolytické účinky analogu diastereomerů pardaxinu > tl N 2.

- Γ o ti t o d LG;

<í Λ tn σί 0 LO ''t θ' N □ t u G)

H <

d r r\ £· H .a d >

ti

M GT 3 ω o o

U

- u • H ε o t

o

4J Λ—I <3 O 0 31 •ρΊ Z\ —< vS

N υ o u </

Cl

CL o

VA

Ω	Ω	0 CA	Ω	Ω		0 OJ		Ω
Z	Z	A	Z	Ž	0 P)	Λ	CO	Z

Q

Z

Ω	Ω	0 CA	Ω	Ω	0	0 rs
Ž	Z	Λ	Z	Z	rs	Λ

CA o

va

CS

Ω	Ω	Ω	Ω	Ω	Ω		Ω	Ω
Z	Z	Ž	Z	Z	Z	va	Z	Z

VA

C-j o

ca

VA r<0 o

CA οο ó

	VA rs	O CA	VA	VA		O rs		Ω	Ω
to		Λ	f'-	CA	NO	A	CA	Z	Ž

VA c-í

SA —

O ro

VA rVA

CA

O

CS

Λ rs

VA

Γ00

N.D i.5 N.D N.D N.D * · v · · · · · · · • · · · · · ftftftft » « ft ftft « ftftft· ftftftft ftftft ·· · «·· • ft · ·· «· ftft ftft

- 31 o« 'T •tj-'úC2

O

A o

\o

Tabulka 1 - pokračování

Γ4 tn ei tn m

no o

o tn in <n m

LQ c

GJ >0

P c

• 0 · umová koncert trace (ijM?*¹

• · · 0 * 0 · • 0

0 a

• 0 . _ · a • · a

0· »0

- 33 1.4 DcstabiIízace membrány vyvolaná peptidy odvozenými z pardaxinu. Běžné doposud studované vlastnosti všech α-he1 ikáIních, pozitivně nabitých, přírodně vzniklých antibakteriá]πích peptidů vyjadřují jejich schopnosti vzájemně působit na a pronikat negativně nabita'· fosfolipidy lépe než zw i tt eri ont.ové fosfolipidy. Význam těchto objevů pro jejich biologické cílové membrány byl přisuzován skutečnosti, že povrch bakterií obsahu je lipopolysarliaridy (Ll’5, v grauiiiegat. i vil íc h bakteriích) a po 1ysacharidy (kyseliny t.eichoové, v grampoz 11. i vil ích bakteriích), oba tyto jsou kyselí', zatímco normální savci lumky (např- urytroryl.y) obsahují převážně ri<a jejich vnitřních vrstvách zwitterinntové fosfol ipjdové í’t. Rozptyl dif lizu ího potenciálu určujícího schopnost i peptidu pronikat membránami obou l’t a 1’ÍVl’B fosfo 1 ipidových vezikul (připravených podle met.od zkoušek, odstavec v) byl zkoušen podle popisu v met.od zkoušek, odstavec xi. Na obrázku 3 jsou znázorněny výsledky získané z peptidů 1, ff, 12, 14, které ukazují, že D-amino kyseliny jnkorporované do pardaxinii nijak podstatně neovlivňují schopnost, peptidů pronikat íosfo I ipidovými membránami- Avšak, peptid 1, d i astereomor, který jediný je zbaven licwilyt-ických účinků a který sí zachována svoje ant, i bak Lei i á 1 η í účinky, proniká negativně nabit.é fosfol i jody podstat.ně 1 éj>e než zwitterioiitové fosfolipidy. Tento d i astereomor působí podobně jako př í rodní aut. i bakter i á 1 ιι í peptidy i přesto, že je zbaven α bel ikální struktury. Ztrát.a podstatných přechodných účinků peptidů 12 a 14 Iry mohla být vysvětlení! skutečností, že oba tyto peptidy mají jak hydrofobní N-hel ixovon tak i amíi pat i ckon t-he 1 i xovou celistvost., která je dostatečná pro podporu silné vazby na oba typy vezikul prostřednictvím hydrof obního vzájemného působení

1.5 Zviditelnění lýzy bakterií použitím elektronoví? mikroskopieVJi v peptidů odvozených od pajdaxinn na morfologii neošetřených a ošetřených bakterií byl zviditelněn použitím negativní barevné elektronové mikroskopie podle popisu metod zkoušek, odstavec xx. 1*01)1.idy byly aplikovány na bakterie v hodnotách jejich Mít nebo nižších při stejných podmínkách, které byly použity pro antibakteriáI πí zkoušku (podívejte se na příklad 1.3 výše) Vzorky byly vyjmuty po 18 hodinách inkubace, ihned byly ustáleny a testovány přechodovou elektronovou míkroskopi zuje snímám· grafy získané’ s l I)] l·*⁷1,^{1 8} I,^{1 9}-TApar jako příklad. Bylo 1 lýzuval bakt.erie

Obrázek 4 ukaneheino I y t. i i kým analogem 1 shledáno, že při Mít peptid zce 1 a pozorovány mohly být pouze malí· fragmenty (oblázek 4G) Avšak při koncentraci nižší než Mlfi byly pozorovány stopy na bakteriální hradbě (obrázek 4B). Tyto stopy by mohly indikovat, píívodrií krok zahrnutý v pp)i:esy lýzy.

Příklad 'Λ - Syntéza od me 1 I i I.

biologické účinky djasLereomerů odvozených nu

2-1 Synt.éza. Čtyři il i astru eomory mel I ít.iiin byly syn tet. i zovány s cílem provést další zkoušky funkce «-helikáluí struktury ryto lysiníi při icmli cytotoxické reakci prul.i savčím buňkám a bakter i ím a také pro větší porozumění mechanismu skrývá j í c ím se pml těm i ti) reakcem i .

Mel litin ji- 2G-mer peptidu s posloupností (ί 1 y - J Ie G1y-Λ 1a-Va1 -1 ,eu - Lys-Va I -I.eu-Thr-Thi -G I y-Lon-lT o-A 1 a-Leu - 1 1 e-Ser Τι ρ - 1 1 e-Lys A rg- tys -Arg-I >' J n-G1n-NHz

Modifikace molekuly mel li Linii s cílem upravit pozitivní náboj byla provedena přeměnou G koncové jednotky me1I iti nu nebo jeho fragmentů na pozitivní reakcí karboxylové skupiny G-koncové jednotky s ethyIendiaminem v d i as Lei eoniereeh mcII i Li nu, ve kterých N-liel ix a G-helix byly přeměněny zaměněním dvou Val zbytkň na pozici 5 a lí mel litinu, Ile zbytku na pozici 1/ a tys zbytku na pozici dl za B-Va1 , 11-1 Ic a l)-|,ys zbytky, jednotlivě (na tomto m i stě v textu I ΒI -V-’V« 1^{1 1} 1

Nás 1 edu i ír f diastereumery odvozené z mel liti mi byly shledány jako neholilo I y t i cké , projevující selektivní cytolytieké účinky (tučná <1 podtržená označení zbytků jsou B-amino kyseliny).

18- [D1-V⁵V⁸1^{1 7}K^?1-mel s pos 1 oupnost í lily- I le-Gl y-A I a-Va 1 -ten-tys-Va 1 -Leu-Thr-Tli ι -G 1 y-Lnn-Pru-fl 1 a-Leu- 1 le-Ser-Trp-J 1 e-Lys-Arg-Lys-Ar g-íiJ n-Gl ri-NHz

19. I I) I-V·’ V⁸ 1¹ '⁷K^¹ -me I -(?l lilii s posloupnosti;

(i J y - ] 1 e-G 1 y-A 1 a-Val -l.eu-Lys-Val Leu-Thr-Tli r-G 1 y- Leu 1T u-A 1 a-Len - J_le-Ser-Trp-1 1 e-Lys-Arg-Lys-Arg-G) n G 1 n-G(IDU

20. I 1) J -V^SV⁸ 1^{1 1} -1 1 až 22 I -TAme 1 s pos 1 oupnost. í

Gly- I 1 e lil y-A 1 a Va 1 -1 .eu-l.ys-Val -Leu Jhr-Thi-G ly-Leu-Pro-A I a - Gen - J_1 e-Ser-Trp-] 1 e-Lys-Arg-NH-CHz Cil?-Nil?

21- ί Dl-V->V⁸ - 14 až 221 TAmel s posloupností:

Λ 1 a-Va 1 -1 ,eu- Lys-Va 1 I.en-Thr-Tli r G I y-1 ,eu-Pn >-Λ 1 a - Gen - I 1 e-Si r Tip- 1 1 e-Lys-Λι g-NH-GHz -GIL· -NH?

Pepfidy 18 až 21 byly následně eharakGer izovány s ohledem iw jejich strukturu, biologickou funkci a vzájemné působení prul.i • · * fl • fl ««fl flfl· • flfl • · · flfl « flfl ·· · flfl ·· flfl flfl

- 35 bakteriím a membránové modely složené buď ze zwitteriontových nebo negativně nabitých fosfolipídŮ.

2.2 CD spektroskopie. Rozsah α-helikální struktury peptidů 18 a 19 byl určen z jejich CD spekter v 40 Λ TFE, rozpouštědle silně podporujícím <x-he li kalní strukturu. ar-helikální obsah diastereomerů byl podle očekávání mnohem nižší (80 % pokles) než u měli itinú, určeno podle odrazu minimálních hodnot v 208 nm a 222 nm (obrázek 5). Obsah ot-heiixů mel litinu byl 73 % v porovnání s 15 % a 7 % obsahem v jeho diastereomerech 18 a 19, jednotíivě.

2.3 Antibaktériální a hemolytické účinky diastereomerú mel litinu 18 až 21. Byly zkoumány hemolytické účinky peptidů 18 až 21 proti hRBC a jejich útlumové účinky proti růstu různých druhů bakterií. Antlbiotický tetracyklin sloužil v antibaktériální zkoušce jako kontrolní látka. Byla získána reakční křivka hemolytických účinků v závislosti na dávkování peptidů (obrázek 6). Tabulka 3 znázorňuje hodnoty MIC pro předložené dřuhy testovaných bakterií. MOže být pozorováno, že inkorporace D-am i no kyselin do mell-itinu dramaticky snižuje jeho hemolytické účinky, což odpovídá ztrátě «-helikálního obsahu u odpovídajících analogů. Mel litin s nejvýšším <ř-hel ikálním obsahem byl nejvíce hemolytieký aš do maximální testované koncentrace (50 μΜ), zatímco peptidy 18 a 19 s nejnižším «-helikálním obsahem byly prakticky zbaveny hémolytických účinků. Avšak, navzdory drastickému snížení hemolytických účinků u diastereomerú mellitinu 18 a 19, oba tyto diastereomeřy si uchovávaly většinu silných antibakteriálních účinků původního peptidu. Dále, antibaktériální účinky peptidu 19 byly pouze mírně nižší než peptidu 18, což ukazovalo, žě amidová skupina na C-koncové jednotce mellitinu nepřispívá nikterak významně k antibakteriálním účinkům. Opačně je známo, že eekropin s volnou karboxylovou C-koncovou jednotkou měl výrazně nižší antibakteriální účinky než přírodního eekropin s amidovanou C-koncovou jednotkou (Li a spol., 1988)fl · fl· • flfl fl •Μ ··· · * · fefe 4 \· ‘J a

— ο λ’ '' •τ ε ο ,Ώ

L*

C ο

U Ο λ) τΗ

C 0 ο <

•Μ ’σ

Ο cd

Ο

Ο

CS

VA

ΓΑ ΐ/Α

Ρ·]

ΟΟ

Ο

Γ·4

Γ-1

Ο>

fS va

NO οο rs

CO CH

Ó —

Γ- — cs va

O

VA

NO G • · · · • · · • · 4 ·· ·«

- 37 2.4 Studie bakteriální lýzy elektronovou mikroskopií- Vliv peptidu IR na morfologii neošetřeiiých a ošetřených bakteriích byl zviditelněn použitím přechodově elektronové mikroskopie Podle ukázek na obrázku 7 způsobí 1 peptid IR v MIC celkovou iýzu bakterií (obrázek 70 Avšak, při kciriceritrac ích nižších než MIC by 1 y pozorovány stopy bakteriální stěny (obrázek 7B) . Tyto stopy by mohly představovat původní krok lyl. ického procesu

2'i Způsob vzájemného působení s f osf o I i p i dovým ι membránami. Protože biologické líc i nky peptidů 1R a 19 byly podobné, byla porovnávána pouze forma vzájemného působení peptidu 1R a modelových fosfo 1 ipidovýrh membrán s formou působení mel l itinu s cílem objasnit. podstatu pozorované membránové selektivity. Za tímto účelem byla měřena schopnost. peptidů rozptýlit dif uzní potenciál vytvořený jak v PC a PC/PS vezikulách, dále byly určeny rozdělovači koef ieienty peptidů u obou typů vezikul a rozšíření peptidů, pokud jsou tyto vázány k mcmbjánám.

2-’>- 1 Průchod ineiubi ánou vyvolaný peptidy. Různé koncentrace mel I i Linu a peptidu 1R byly promíchávány s vez i ku I am i , které byly nejdříve ošetřeny fluorescenčním barvivém diS-Cz-S a valiiiomyciuem. Ki netiká obnovy í IuoresoMicc byla zachycena časem a dále byla stanovena maximální úroveň dosažená jako funkce koncentrace peptidu Podle ukázky na obrázku IR, jak mel litin tak i peptid IR měly podobný vliv na propustnost membrán PC/PS vezikul ukazující, že i nkorporaee D-amirio kyselin do mel litinu nikterak neovlivňuje schopnost výsledného diastercomern pronikat negativně nabité fosfolipidové (PS/PC) membrány Avšak, zatímco mel litin byl vysoce aktivní s PC vezikulami, diastereomer byl zcela zbaven schopnosti picni i kat membrány PC vez i kul (až do maximální zkoušené koncentrace).

2.5.2 Studie vazeb. Neschopnost diastereomeru IR proniknout PC vezikuly se může projevoval, vzhledem k jeho neschopnost i si; vázat na PC vezikuly, nebo alternativně se tento může vázat na PC vezikuly, ale jakmi le je jednou vázán nemůže se dále vpravit, do struktury a tím vyvolat, proniknutí membránou. Studie vazeb byty pu ivedeny mns Lat.uý cílem rozlišit, mezi těm i to dvěma možnostmi. Šalup zbytek na pozici 19 peptidu 1tí byl použit pro vnitřní fluorescenční zkoušku sledující jeho vazby na PC a PC/PS vezikuly Ustálená končen trace (+ 0,5 jiM) peptidu by i a l.it.rovaná s požadovanými vezikulami (PC nebo PC/PS) a v případě vzniku vazby bylo pozorováno zvýšení v intenzity ί I uoresroure . Nákresem • · • · • · · ·

- 38 výsledných zvýšení intenzit í ] uorescenrií Trp jako funkce nelamího poměru 1 i pí dir pept i du vznikly běžné vazebné křivky (obrázek 9A ) . Vazebná křivka peptidu 18 na Pť/PS odhaluje, že téměř všechny molekuly peptidu byly vázány na vez i kuly v inolárním poměru 1 ipidn; peptidu 100-1. Avšak, při zkoušce s Pť vez i ku lamí nebylo pozorováno žádné čisté zvýšení ί1uoreseenee Trp, a to ani v případě maximálnílio testovaného molárního poměru

I i pídil^: pept i du . což ukazovalo, že peptid se na Pť vezikuly neváže Isotermy vazeb byly vyt.vořeny nákresem X^mb (moláruí poměr vázaného peptidu na 60 % reJkovélio lipidu) oproti Lá (rovnovážná koncentrace volného pept, idu v roztoku) (obrázek 5B). Povrchové rozdělovači koeficienty byly tušeny extrapulací původních směrnic křivky |>ru nulové (á hodnoty. Hodnot;» odhadu povidlového rozdělovač ího koeficientu Kp^x peptidu 18 byla 1, 1*0,2 x 10^d M ¹ (získáno ze čtyř měření) Tato hodnot.a je podobná hodnotě uvedené pro vazby mel litinu k f osf at i dy I g J ycero l/f osf at i dy l cho i i nu (4,5*0,b x I θ'¹ M ¹ ) ( Bescln aschv i l i a Seelig, 1990).

Tvřir vazební? jsotermy pept.idu může poskytovat, informace o uspořádaní peptidů v membránách (Schwarz a spol., 1987). Isotermna vazeb peptidu 18 má ohyb směrem dolu naznačující negativní součinnost. Možné vysvětlení této negativní součinnosti je, že při nízké’ koncentraci je peptid 18 vázaný na PS/Pť obohacen negativním nábojem fosfolipidových hlavních skupin, porovnáno s částečnou rovnováhou bez vlivu iiábuju. V dodatku, peptid, podlí? vazby na membránu, částečně neutralizuje negativní náboj povrchu membrány. Avšak, jakmile je náboj povrchu membrány neutralizován, další vazba peptidu 18 není snadná, protože dominantním faktorem se stává odpudivost podobných nábojů. Podobné výsledky byly získány při studiích vazby mel litinu k negativně nabitým í osf o 1 i p i dovým membránám ( Batenbiirg a spol., 1987; Beschiaschvi 1 i a Ser? lig, 1990) Zajímavostí je, nepodobně u mel litinu, který se silně váže také k Pť vezi kulám (Kuchinka a Seelig. 1989), že peptid lít se na Pť vezikuly neváže.

b Zkoušky iít,l umu (ochlazeni) tryptof ann. Iryptofanový zbytek, přírodně se vyskytující v posloupnosti proteinu nebo peptidu, může .sloužit. jako i n tr i iis i cká sonda pro lokalizaci peptidu uvnitř membrány Mel litin obsahuje tryptofanový zbytek na pozici 19 N-koncnvé strany ť-fielixu. II me 1 1 i I, i nu i peptidu 18 by 1 o pozorováno největší lit I uměn í tryptofanové I 1 uoresn ?nee s b , 7-Hr-Pť/Pí> voz i ku I am i (obrázek 10). Nižší lilium byl pí izon iván úl. I um • · · » » » » V · « « • * φ · · · · φφφφ

Φ φ Φ· * · · ♦ Φ ΦφΒφ ·

Φ·φ ΦΦ Φ ΦφΦ

Φ· · ΦΦ ·« ΦΦ φφ

- 39 s 9, 10-Br-PL/BS a nejnižší s 11 , 12-lír-PC/l’S. Tyto výsledky podle vazby na vězí kuly ukazuji, že pept. idy byly rozmístěny v blízkosti hlavních skupin fosfolipidů.

Příklad 3 - Syntéza a biologické účinky modelových tys/tou dias t eieomeiíí

3.1 Specifikám Lys/Leu d i as Lei eomi u n . Byly synl-et i zováuo šest d i astereomeríi krátkých lineárních modelových 12-mer peptidů tvořených různými poměry lysinu a Jene i nu s cílem (I) prověřil, dostatečnost kriteria rovnováhy mezi liydrof obnos L í a čistým pozitivním nábojem nezbytného pro selektivní bakteriální lýz.u a (2) získat, přehled o mechanismu, který se skrývá pod těm i to účinky.

V první řadě modelových Lys/I.eu 12-mer peptidíi 22 až 25, byla jedna třetina jejich posloupnosti tvořena I)-amine kyselinovými zbytky. Rozmístění I) amino kyselin vytvořené pro maximální' rozrušení «-he li kál llí .struktury zůstávalo ve všech pept i dech konstantní. I)-amino kyseliny byly rozmístěny v peptidu tak, aby ponechávaly pouze velmi krátké úseky 1 až 3 pos I oupnýcti L-amiiio kyše lín. By Iy syntet i zovány nás 1ednj í c í pepti dy

22. I D] -l,³ - ⁴ - ⁸ - ^{1 0} ta Ly s pos l oupnost í :

I ,y s t e u - Leu ^Leu -1 .e 11 -1 ,e 11 - ty s - Leu -Leu- Leu - i .e u - Ly s - N11?

23. [ |)J-I,³ Lb . 10 ,,_os loupnosLí :

Lys l en-Leu-Leu-Í.ys-Í.eu-Leu-Ley Lys-Leu-Leu-I.ys-NJl?

24. i Dl-I.³ · ⁴-⁸-¹⁰ -K5L-7 s posloupnosti':

Lys - Leu - Len Leu-I ,y s -1,011- Lys -Leu-1 ,y s - Leu - Lys - Len- Len -1 ,ys - NH?

25. 11)1 I ³ - ^A - ⁸ - ¹⁰ -Ky I s pos 1 oupnos t í :

.y s -1 ,y s - Leu - 1eu-Lys- Leu Lys- Leu -1 ,ys- Leu- Lys - Lys - N11?

V druhé řadě modelových I.ys/Leu 12-iuer peptidíi 2b až 27 byly dvě třetiny jejich posloupnosti tvořeny D-amino kyselinovými zbytky umístěnými na přesných pozicích L ami no kyše1jnových zbytků pept i díl 23 a 2d následovně:

26. 11) 1 K¹ · ⁵ - ⁹ - ^{1 2} L² - ⁶ · ^{7 11} -Kal o s posloupností :

Lys - Leu - Le 11 - Le 11 - Lys-Len-Leu - Lei 1 -1 s - L e u Len-Lys -NU?

- I I) I - K¹ - - ’ - ⁷ - ⁹ - ^{1 2} L² - ^{6 11} -Kb Ly s pos l oupnost í :

Lys-Leu-1 ,eu I on-Lys-Leu-Lys-Leu-Lys-1 ,eu - Leu-Lys-NH?

Ve třetí řadě modelových l.ys/l.en peptidů byly syntetizovány b-iiier a B-mej· tliasíereomery (peptid 23 a 29, jednotlivě)'

28. [ III-I.¹ - ³-K? I.n s posloupností:

tys Leu -1.eu-Leu l.<ni I.ys • « « • flfl • ·

- , - · 4 • « fe • fl · fl

- 40 29- L² - ⁶-K;j Lí> s posloupností:

Lys - Leu -Leu- Leu -1 .y s - Letí -Leu-Ly s

Podle vynálezu byly syntetizovány další d i asLereoiiiery:

30. I .y s Leu - Lei j - L»?u - Ly s - Len - Ly s - Leii -Ly s-Le u-Leu-Ly s

31.. I ,y s Leu Leu - Leu - Ly s - Le 11 - lys - Ixjii -tys- Len-Len -Lys

32. I ,y s -1 ,i.? 11 -Leu- Leu - Lys -1 ,e u -Lys- Len-Lys I .ei j - Ley I V>

3.2 Syntéza Lys/Leu diastereomerú. Pept. i dy byly syn l.et i zovány podle popisu metod zkoušek. odstavec (íi). Peptidy byly následně charakterizovány s ohledem iui jejich strukturu, biologickou funkci a vzájemné působen i s bakt.ei iemi a modelovými membránami tvořenými buď xw i t.Ler i oriLuvýni i nebo negativně nabitými f Osf o 1 i p i dy.

3.3 Hydrof obnosí.. Hydrof obnosí. a čistý pozitivní náboj peptidů 22 až 25 jsou uvedeny v tabulce A. Střední hodnoty hydrofobnosLi by I y prepdcteny použitím dohodnul,»? hodnoty stupnic»? hydrof obriost. i (Lisenberg íi spol., 1934). Přímá korelace byla podlí· ukázky na oblázku 11 shledána mezi hydrofobností a časem retence peptidů, tat.o naznačil je, že struktura se nikterak významně nepodílí na celkový»:|j hydrof Obil ích vzá jtaiinýrli vlivech s»? stacionární fází.

Tabulka A

Hydr» if ob i c i ba a čistý náboj Leu/tys di asLereomerú

Označen i pept. i du

Li st ý náboj

Hydrof obi c i ta

22-	+	4	0,12
23 .	4-	5	- 0,01
24 .	4-	G	- 0,15
25 .	4	3	- 0,42

4 LI) spektroskopie Rozsah α-lie 1 i ká I n í struktury diastereomerú 22 až 25 byl určen z jejich LI) sp»?kter v 40 % TLE. Pudle očekává ní, následné po inkorporaci D-amino kyselin, n»?by 1 ani u jednoho z diastereomerú pozorov.án žádný znak, který by prokazoval ztrátu jakékoliv specií ické sekundární struktury (údaj»¹ nejsíiu uvedeny). Podle s<uicasuýrh výzkumných prací by mělo být uvedeno, že pept.id s posloupností totožním s posloupností pept.idu 23, který je však * · 44 ··· 4 * • 4 4 «4 4t • 44 • 4

4 př i bli žně 40 %

l.vnřeii pouze L-amíno kyselinami, obsahuje «-helikáfní struktury v metlianolii a v Í)MPC vezikulách (Cornut a spol . 1994).

3.5 Ani J bakter ] á 1 ri i a herno 1 yt i eké účinky peptidíi 22 až 29. Byly testovány hemolytické účinky peptidíi 22 až 29 proti hKBf. Reakční krivkři hernolyLických účinků podle dávkování peptidíi 22 až 25 je znázorněna na obrázku 12, ve kterém liemol y t1 rké účinky mel litinu sloužily jako kontrolní údaje. 1‘římý vzájemný vztah by 1 zjištěn mezi Iiydroí obnosí. í (tabulka 4) a herno 1 yt i ekým i účinky diaste reomerů. Peptid 22, I i) J 1.³ - '¹ -^!i - ^{1 0}-K j 1.9 , který má nejvyšsí hydroíobnosí., byl nejvíce herno 1 y t i ekým peptidem- Jeho herno 1 y t j eké účinky jsou však v porovnání s me 1 I 1 11 něm velmi nízké- 060 klát nižší účinky) Všechny další peptidy až do maximální testované koncentrace (100 jiM> nepru jevová 1 y výrazné henio 1 y t i eké účinky, lháno I yt 1 eké účinky peptidíi 22 až 29 jsou znázorněny v tabulce 5. Mělo by být uvedeno, že ačkoliv peptid 23, I D] -1,³ - ^Λ - ^H - ^{1 f)} -Ka Ls , není při koncentracích rovnajících se >100 násobku koncentrace požadovaní- pro výraznou hemolýzu vyvolanou me 1 1 i t i nem herno lyLický, jeho ucelená I,-amino kyselinová forma projevila v nedávných výzkumech hemolytické účinky podobné liemolytíekým účinkům mel ittinu ( 'i krát nižší) (toniut a spol . 1994).

Byly také? provedeny testy aut i bakter i á 111 ích účinků pepři dů 22 až 29 proti předloženým druhům bakterií, ve kterých tetracyk1 i η, dermasepf. i 11 5 a uielittin sloužily jako kontrolní látky. Výsledné MIC jsou uvedeny v tabulce 5. lídaji- ukazují, že arit i bakteiiál ní účinky diastereomerů 22 až 29 byly modulovány rovnováhou mezi hydrof obnosí. í a pozitivně nabitými amino kyselinami. Jak nejvíce hydrof obli í pept.id 22 tak i nejvíce hydrofilní peptid 25 projevují ne i 11 i žš í úroveň aut i bakter i á 1 n ích účinků (tabulka 5) Avšak, peptidy 23 či 24 projevovaly vysoké arit i bakteri ál ní účinky prot i většině testovaných bakterií, dříve uvedený projevoval mírně silnější účinky Bále, každý peptid měl jednoznačné spektrum ant i bakter i á 111 ích účinků a všechny byly účinnější proti qrampozifivtiím bakteriím ve srovnání s účinky proti graimiegat i vn ím bakteri ím.

3.6 Syneigické vl i vy mezi tatracy k I i nem a Lys/Leu diastereomery v séru. Pro zkoušky možného sy nerg i ckého vztahu mez 1 aut. ibiotirkým let, racyk 1 i neiri a diastereomery byl tetraeykliii testován při 2-násobném sérioví? ředění proti Psc-uiío/zřo/ce; /?/·/v/gitu>-,o (ATCC 2/H5J) za pří tomnost-i konstantní ekv i 111111 árn í koncentrace (1 jjM ) • * · · ftft· · peptidu 24 [ I) 1 -L ·* - ^{4 8} - ^{1 0} -Ks Ly . Antibakteriá1 ní účinky směsi byly určeny podle popisu mel.od zkoušek, odstavec (xii).

Synergický vliv byl pozorován mezi tetracyk1 inem a di astereomerem 24. Tetracyk 1 i n projevoval malé účinky proti aeruginusa.

Avšak, jestliže je t.el.raeykl in smíchán s 1 ,iM roztokem peptidu 24, bylo pozorováno, že koncentrace, která je 10 krát nižší než kom entrare jtožadovaná pro lytické účinky prot, i aertfi/i/KAsa, krát zvyšuje účinky tetracyklínu (tabulka 6). Možné vysvětlení synergický vlivů je, že peptid lehce narušuje bakteriální hradbu, což zvyšuj·¹ rozložení tetracyk I i nu do bakterií loto vysvětlení je podpiiřenn studiemi elektronové mikroskopie, kteiá ukazuje, že peptid 24, při koncentrací nižší než je jeho Mlť, vyvolá moríologícké změny v bakteriální hradbě (oblázek 14) V dodatku, vliv spojeného lidského séra na antibakteriáI πí účinky peptidu 24 a Jiří rodního antibakterjá1 ηího peptidu dermasept i nu proti é. nerug i no:;.i a K. coli byl shledán značně rozdílným (tabulka 6). Zatímco dermasept, i n byl za přítomnosti séra 8 až. 10 krát méně aktivní, peptid 24 si uchoval jeho antibakteriá1 ηí účinky.

Tabulka 6

Minimální útlumová koncentrace (jiM)^a za přítomnosti lidského séra a synerg i cké¹ účinky peptidu 24

Minimální útlumová koncentrace (jiM)

	P.	ciorioi i nosa	(ATCC-27853)	/;	. co! i	(1)21 )
□značení poptidu		0 % séra	33 % séra 0	% séi	a 3 3	% séra
2.4		1 0	10	7		7
Dermaseptin S		25	200	6		50
Trb		SO
Tc+24 (1 jiM)		b
a Výsledky isou	stři	du imi hodnotami 2 nezávis	1 ýeh	pokusů	, každý
proveden dvakrát	SH '	-itaiidardu í	odchylkou 20 %

^b Te TetracykI i n

CC υ-i O O c\°

VY ίο _ O Ω Q Q O ύ — cl oj — Z 2 2. 2

O r

xo vy o vj

Z c*·' CL CJ L· _ O o

'T.

f.

Vy

CJ o

o

C3

CJ>

Vy

VY ί’Ί rvi Γ’) O O — o

“O

TJ oV

O

N nbu1ka

Γ''

O	o
, \ in	co	Q	n	O	O
' CJ o	O CJ		z	Z
O - -	— Λ	Z.	Z

V νγ o ΓΝ íN vy

O z-\

\_y

FC

Cj

O CN <

o o o	Q	Q	Ω	Q
CM o	Z	Ž	r -	Z m ’ ΓΊ

VY

CS V

O cc

O

O

O CN νγ m 'O vi .— r-4 rc r-4 r-J c-4 bC TJ r-4 cJ ( oo C4 r-4

CS

C-4 >

2/ >

z υ > ·τ v;

v)

L>

27 >

L? - >

• 9 »·

9 9 9 9

999 9 9 • 9 9

3.7 Peptidem vyvolané proniknutí membránou. Různé koncentrace peptidů bylý smíchány s vezikulami, které byly nejdříve upraveny fluorescenčním barvivém diS-C2-5 a valinomycinem. Byla zaznamenána kinetika obnovy fluorescence, maximální úroveň fluorescence byla určena jako funkce koncentrace peptidu (obrázek 13). PC/cholesterol vezikuly (10=1) sloužily jako modelové fosfolipidové prostředky vnější vrstvy erytrocytů (Verkleij a spol.. 1973) a PE/PG vezikuly (7^3) byly použity jako modely fosfolipidového prostředku £. coli (Shaw, 1974). Přímý vzájemný vztah byl zjištěn mezi účinky peptidů, které pronikají modelovými fpsfolipidovými membránami, a jejich lytickými účinky proti erytrocytům a E. coli. Žwitteriontovými fosfolipidovými vezikulami pronikl pouze hemolytický peptid 22. Dále, schopnost peptidů pronikat PE/PG vezikulami byla ve vzájemném vztahu s antibakteriálními účinky peptidů proti E. coli (tabulka 5). Peptid 25, který má nejnižŠí antibakteríální účinky, měl v porovnání s dalšími třemi peptídy 22 až 24 výrazně sníženou schopnost pronikat PE/PG vézikulami.

3.8 Studie elektronové mikroskopie bakteriální lýzy. Vliv diastéreomerů 22 až 25 na morfologii ošetřených E. coli byl zviditelněn použitím přechodové elektronové mikroskopie- Všechny peptidy vyvolaly při jejich MIC celkovou lýzu bakterií (údaje nejsou uvedeny). Avšak, jestliže peptidy byly použity v koncentracích odpovídajících 80 % jejich MIC, byly pozorovány některé rozdíly v morfologii ošetřených bakterií podle použitého peptidu- Nejvíce hydrofobní peptid 22 vyvolal nejvyšší poškození buněčné stěny a membrány, zatímco nejméně hydrofobní peptid 25 vyvolal pouze lokální poruchy (obrázek 14).

Príklad 4. - Syntéza a biologické účinky modelových Lys/Ala a

Lys/Val diastereomerů.

4.1 Specifikace diastereomerů. Pro další zkoušky dostatečnosti modulace hydrofobicity a čistého pozitivního náboje lineárních cytotoxických peptidů vyvolávajících selektivní antibakteríální účinky, byly syntetizovány dva další modelové 12-iner peptidy 33 a 34 až 37 tvořené Lys/Ala nebo Lys/Val zbytky, jednotlivě, které měly alespoň jednu třetinu jejich posloupnosti, tvořenou D-Ala nebo D-Val zbytky^: • » * · · · φ · · φ φ • φ * φ φ φ · · φ · φ φ · ·Φ ΦΟΦΦ φφφ φ · φφφ φφ φ φ φ · φφ φ φφ φφ φφ φφ

- 45 33- [D]-Α³-⁸ -¹⁰-Κ^Αβ s posloupností¹

Lys-A1a-Ala-Ala-Lys-A Ia-A1a-Ala-Lys-Ala-fl]a-Lys-NH2

34. [Dl -V³ - ⁸ - ¹⁰ -K4Vq s posloupnostíLys-Val-Val-Val-Lys-Val-Val-Val-Lys-Val-Va1-Lys-NHs

35. Lys-Val-Val-Val-Lys-Val-Lvs-Val-Lys-Va1-Val-Lys

36- Lys-Val-Val-Val-Lys-Val-Lys-Val-Lys-Val-Val-Lys

37. Lys-Va1-Val-Va1 Lys-Va1-Lys-Val-Lys-Va1-Val-Lys

4-2 Antibakteriá1 ηí a hemolytické účinky. Peptidy 33 a 34 byly testovány proti £?. coli, B. megáterium a hRBC- Výsledky v tabulce 7 ukazují, že oba modely diastereomerů jsou antlbakteriální a nehemolytické¹

Tabulka 7

Minimální útlumová koncentrace (pM) a hemolytické účinky peptidů 28 a 29

Minimální útlumová koncentrace CpM)

Označení peptidů	£7- coli (D 21)	B. mega ter i um CBmll)	% hemolýzy při 100 pM
33	12	1	0
34	3,5	0,8	0

Příklad 5 - Syntéza dalších modelových diastereomerů

Byly syntetizovány následující modelové diastereomery podle vynálezu tvořené posloupností 6, 8, 12, 14, 16, 19, 25, 26 a 30 zbytků dvou, tří nebo více různých amino kyselin;

38. Lys-Leu-Ile-Leu-Lys-Leu

39- Lys-Val-Leu-His-Leu-Leu

40- Leu-Lys-Leu-Arg-Leu-Leu

41- Lys-Pro-Leu-Hís-Leu-Leu

42- Lys-Leu-Ile-Leu-Lys-Leu-Val-Arg

43. Lys-Val-Phe-H1.s-Leu-Leii-His-Leu

44- His-Lys-Phe-Arg-I1e-Leu-Lys-Leu

45. Lys-Pro-Phe-His-Ile-Leu-His-Leu * · · · * · ··· · »·· φ ·

Φ Φ Φ « · · · Φ ·

ΦΦ Φ φφ ·· Φ· · ·

- 46 46. Lys-Ile-Ile-lie-Lys-Ile-Lys-Ile-Lys-Ile-Ile-Lys

47. Lys-IIe-Ile-Ile-Lys-I1e-Lys-Ile-Lys-Ile-Ile-Lys

48. Lys-Ile-Ile-I1e-Lys-Ile-Lys-IIe-Lys-Ile-IIe-Lys

49. Lyš-Ile-Pro-I1e-Lys-Ile-Lys-I1e-Lys-Ile-Pro-Lys

50. Lys-Ile-Pro-I1e-Lys-Ile-Lys-Iíe-Lys-Ile-Val-Lys

51. Arg-Ile-I1e-Ile-Arg-Ile-Arg-Ile-Arg-Ile-Ile-Arg

52. Arg-Ile-Ile-Ile-Arg-Ile-Arg-Ile-Arg-Ile-Ile-Arg

53. Arg-Ile-Ile-Ile-Arg-Ile-Arg-Ile-Arg-Ile-Ile-Arg 54- Arg-Ile-Va1-1le-Arg-Ile-Arg-Ile-Arg-Leu-Ile-Arg

55. Arg-Ile-Ile-Val-Arg-IÍe-Arg-Leu-Arg-IIe-Ile-Arg

56. Arg-Ile-Gly-Ile-Arg-Leu-Arg-Val-Arg-I1e-Ile-Arg

57. Lys-Ile-Val-Ile-Arg-IIe-Arg-Ile-Arg-Leu-Ile-Arg

58. Arg-Ile-Ála-Val-Lys-Trp-Arg-Leu-Arq-Phe-Ile-Lys

59. Lys-Ile-Gly-Trp-Lys-Léu-Arg-Val-Arg-IIe-Ile-Arg

60. Lys-Lys-I1e-Gly-Trp-Leu-Ile-I1e-Arg-Val-Arg-Arg

61. Arg-Ile-Val-Ile-Arg-Ile-Arg-Ile-Arg-Leu-Ile-Arg-Ile-Arg

62. Arg-Ile-Ile-Val-Arg-Ile-Arg-Leu-Arg-Ile-lle^-Arg-Val-Arg

63. Arg-Ile-Gly-ί1e-Arg-Leu-Arg-Val-Arg-I1e-Ile-Arg-Arg-Val

64. Lys-Ile-Va1-Ile-Arg-Ilé-Arg-Ala-Arg-Leu-Ile-Arg-Ile-Arg-Ile-Arg .65. Arg-Ile-Ile-Val-Lys-I1e-Arg-Len-Arg-Ile-Ile-Lys-Lys-Ile-Arg-Leu

66- Lys-I1e-Gly-I1e-Lys-A1á-Arg-Val-Arg-I1e-Ile-Arg-Val-Lys-I1e-Ile

67. Arg-Ile-Ile-Val-Ηi s-11e-Arg-Leu-Arg-Ile-Ile-Hi s-Hiš-Ile-Arg-Leu

- His-11e-Gly-11e-Lys-A1a-H i s-Val-Arg-11e-Ile-Arg-Val-His-11e-Ile

69. Arg-Ile-Tyr-Val-Lys-Ilé-His-Leu-Arg-Tyr-Ile-Lys-Lys-Ile-Arg-Leu

70. Lys-Ile-GIy-fíís-Lys-Ala-Arg-Val-His-Ile-Ile-Ářg-Tyr-Lys-IIe-Ile

71. Arg-Ile-Tyr-Val-Lys-Pro-His-Pro-Arg—Tyr-Ile-Lys-Lys-Ile-Arg-Leu

72. Lys-Pro-Gly-Hi s-Lys-Ala-Arg-Pro-His-Ile-Ile-Arg-Tyr-Lys-Ile-Ile

73. Lys-Ile-Val-Ile-Arg-Ile-Arg-Iie-Arg-Leu-1le-Arg-Ile-Arg-IIe-Arg-Lys-Ilě-Va1

74. Arg-Ile-Ile-Val-Lys-Ile-Arg-Len-Arg-Ile-Ile-Lys-Lys-Ile-Arg-Leu-Ile-Lys-Lys • « φ · φ

- 47 75. Lys-Ile-Gly-Trp-Lys-Leu-Arg-Val-Arg-Ile-Ile-Arg-Val-Lys-11 e-Gly-Arg-Leu-Arg

76- Lys-Ile-Val-Ile-Arg-IIe-Arg-Ile-Arg-Leu-Ile-Arg-lIe-Arg-Ile-Arg-Lys-Ile-Va1-Lys-Va1-Lys-Arg-Ile-Arg

77. Arg-Ptie-Ala-Val-Lys-Ile-Arg-Leu-Arg-Ile-Ile-Lys-Lys-Ile-Arg-Leu-Ile-Lys-Lys-IIe-Arg-Lys-Arg-Val-Tle--Lys

78- Lys-Ala-Gly-Trp-Lys-Leu-Arg-Val-Arg-Ile-Ile-Arg-Val-Lys-Ile-^Gly-Arg-Leu-Arg-Lys-I1e-Gly-Trp-Lys-Lys-Arg-Val-Arg-I1e-Lys

79- Arg-Ile-Tyr-Val-Lys-Pro-His-Pro-Arg-Tyr-Ile-Lys-Lys-Ile-A rg -Leu

80. Lys-Pro-Gly-Hi s-Lys-A1a-Arg-Pro-His-Ile-Ile-Arg-Tyr-Lyš-11 e-Ile

81. Lys-Ile-Va1-Ile-Árg-Ile-Ařg-Ile-Arg-Leu-Ile-Arg-Ile-Arg-Ile-Arg-Lys-Ile-Va1

2 - Arg-Ile-Ile-Val-Lys-11e-Arg-Leu-Arg-I1e-11e-Lys-Lys-Ile-Arg-Leu-Ile-Lys-Lys

83. Arg-Ile-Tyr-Val-Ser-Lys-Ile-Ser-I1e-Tyr-Ile-Lys-Lys-Ile-Arg-Leu

84. Lys-Ile-Val - Ile-Plie-Tlir-Arg-I le-Arg-Leu-Thr-Ser-Ile-Arg-Ile-Arg-Ser-Ile-Va1

85. Lýs-Pro-IIe-His-Lys-Ala-Arg-Pro-Thr-Ile-Ile-Arg-Tyr-Lys-Met-Ile

Přiklad 6 - Syntéza a biologické účinky cyklických diastereomerů

6.1 Specifikace- Bylý syntetizovány následující cyklické deriváty diastereomerů fragmentů pardaxínu s cysteinovými zbytky jak na Ntak i C- koncových jednotkách;

86. Cyklický K¹CD]P⁷L¹⁸L¹⁹[1 až 22]-par s posloupností:

Cys-Lys-Gly-Phe-Phe-Ala-Leu-Ile-Prg-Lys-Ile-Ile-Ser-Ser-Pro-Leu-Phe-Lys-Thr-Leu-Leu-Ser-A1a-Va1-Cys

- Cyklický K¹^²[D]P⁷L¹⁸L¹⁹[1 až 22J-par s posloupností:

Cys-Lys-Lys-Gly-Phě-Phe-Ala-Leu-Ile-^Pro-Lyš-Ile-Ile-Ser-Ser-Pro-Leu-Phe-Lys-Thr-LeirTLeu-Ser-Ala-Val-Cys

0« · 4 4 9 * f · · · • 4 4 9 9 9 · 9 4 44

4 * « 0 0 000 · ·** » «

0 0 00 · 00«

0 0 00 00 00 00

- 48 88. Cyklický KTř^K^{* i * 3 * * *} [D] P^{7 8}L¹⁸L¹⁹ [ 1 aš 221-par s posloupností:

Cys-Lys-Lys-Lys-Gly-Phe-Phe-Ala-Leu-Ile-Prg-Lys-Ile-rie-Ser-Ser-Pro-Leu-Phe-Lys-Thr-Leu-Leu-Ser-A1a-Va1-Cys

Byly syntetizovány následující deriváty diastereomerů různých amino kyselinových zbytků s cysteinovým i zbytky jak na N- tak i na C- koncových jednotkách:

89- Cyklický Cvs-Arg-Ile-Va1-1le-Arq-He-AΓg-Ile-Arg-Leu-Ile-AΓg-^le-AΓg-Cys

90. Cyklický Cys-Lys-Pro-Gly~His-Lys-Ala-flrq-Pro-His-Ile-Ile-Arg-Tyr-Lys-I1e-Ile-Cys

- Cyk í i cký Cys-Arg-Phe-flla-Val-Lys-Ile-Arg-Leu-Arg-1le-Ile~ -Lys-LysIle-Atg-Leu-lle-lvs-Lys-Ilě-flrg-Lys-Arg-Val-Ile-Lys-Cys

6.2 Syntéza cyklických diastereomerů. Cyklické peptidy s cystěinovými zbytky jak na N- tak i na C- koncových jednotkách peptidů byly syntetizovány pevnou fázovou metodou podle popisu metod zkoušek, odstavec (ii). Po HF štěpení a RP-HPLC čištění byly peptidy rozpuštěny v malé koncentraci PBS (pH 7,3) a cyklizace byla dokončena po 12 hodinách. Cyklické peptidy byly dále čištěny na RP-HPLC a podrobeny analýze amino kyselin ověřující jejich složení'a SDS-PAGE ověřující jejich monomerický stav.

6.3 Antibakteriální a hemólytické účinky- Peptidy 86 až 88 byly testovány proti £?. Coli, B. megaterium a hRBC. Výsledky v tabulce ukazuji, že všechny tří cyklické diastereomery odvozené z pardaxinu jsou antibakteriálhi a nehemolytieké^: • 9

9

9

9 • *9*9 99 ·· • 9 9 999 9 999 9 9

9 9 9 9 * ·· 9 99 ·· · * *9

- 49 Tabulka 8

Minimální útlumová koncentrace (μΜ) a hemolytické účinky cyklických diastereomerů odvozených od pardaxinu

Minimální útlumová koncentrace (μΜ)

Označení peptidu	E. coli (D21)	B. megaterium (Bmll)	% hernolýzy v 100 μΜ
86	30	10	0
87	15	6	0
88	7,5	2	0

Příklad 7 - Syntéza a biologické účinky “svázaných Lys/Leu diastereomerů peptidu

7-1 Specifikace. Použitím peptidu 23 jako vzoru a peptidu 23 nebo 24 obsahujícího dodatečné cýsteinové zbytky na C-koncové jednotce Í23C a 240 jako monomeru, jednotlivě, byly připraveny následující svázané posloupnosti:

92. <[D]-L³-⁴-⁸-¹⁰-K4L8O5 tD]-L³-⁴-⁸'^1o-K^L8 s posloupností:

CLys-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Lys-Cys-Nífajs-Lys-Leu-Leu^-Leu-Lys-Leu-Leu-Leu-Lys-Lěu-Leu-Lys-NHa

93. C[D]-L³-⁴-⁸-¹⁰-lC5L7O5-[D]-L³-'³-⁸'¹⁰-K4L9 s posloupností:

(Lys-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Lvs-Leu-Lys-Leu-Leu-Lys-Cys-NHz>5

- Ly s - Leu - Leu-Leu- Ly s - Leu - Leu - Leu-Lys - Leu- Leu - Ly s-ŇH2

7.2 Syntéza. DCC a kyselina bromooctová v molárním poměru 1=1 byly ponechány reagovat v DMSO při teplotě 25 °C po dobu 1 hodiny s cílem připravit diastereomer vázaný na vzoru. Do reakční směsi byl dodán vzor (peptid 23) a směs byla ponechána promíchávat po dobu 12 hodin, DMSO bylo následně lyofi 1izováno. Zůstávající kyselina bromooctová byla podrobena extrakci se suchým etheremReakční směs byla následně ponechána reagovat po dobu 1 hodiny s přebytkem diastereomerů 23C a 24C obsahujících cýsteinové zbytky na jejich C-koncových jednotkách v PBS pH 7,3 při teplotě • · φ φ · · · φφφφ

4> Λ φφ>»φφ·φΦφ·

Μι· Φ Φ φ « φ Φ ΦΦΦ · ΦΦΦ φ Φ

ΦΦΦ ΦΦ · ΦφΦ ·* · ·Φ Φ* ΦΦ ΦΦ

- 50 25 °C- Diastereomery 92 a 93 vázané na vzoru byly dále čištěny použitím RP-HPLC a posouzeny prostřednictvím SDS-PAGE ověřující jejich soudržné stavy.

7.3 Antibakteriální a hemolytické účinky. Diastereomery 92 a 93 vázané na vzoru byly testovány proti E. coli. B. megaterium a hRBC. Výsledky v tabulce 9 ukazují, že obě svázané posloupnosti * jsou antibakteriální a nehemolytické.

Tabulka 9

Minimální útlumová koncentrace CpM) a hemolytické působení d íastereomerů

Minimální útlumová koncentrace (pM)

Označení peptidu	£7. coli (D21)	B. megaterium (Bmll)	% hernolýza ve 100 pM
92	0,2	0,05	0
93	0,1	0,02	0
Příklad 8 - Syntéza	a biologické	účinky směsi	hydrof ilních

Lys/Leu 12-mer peptid-diastereomerů

Peptidy byly syntetizovány pevnou fázovou metodou podle popisu metod zkoušek, odstavec Cii), uvedeném výše v textu- V každém kroku interakce byla do reakce dodána směs tvořená ž 1 ekvivaI . v lentu lysinu, leucinu a D-leucinu. Byla syntetizována směs ze 3¹² různých peptidů. Po HF štěpení byly hydrofilní peptidy podrobeny extrakci s dvakrát destilovanou vodou (ddw) a lyof i 1 izo.vány. Hydrofilní směs Lys/Leu 12-mer peptid-diastereomerů byla testována proti E. coli D21 (MIC^: 15 pg/ml), B. luegateriuiu Bmll D21 (MIC^; 3 pg/ml) a hRBC CO % hemolýzy ve 100 pM). Podle očekávání měla hydrofilní směs antibakteriální účinky, ale byla nehemolytická.

» · * * ITT · ♦ · · · • · · · f · · ( A r*· • · · » · · ♦·· · ·♦» · » » · ♦ · · · »·· ·· · ·« ·· ·· ··

Příklad 9 - Syntéza a biologické účinky Lys/Leu/D-Leu nahodilých kopolymerů.

Přebytky N-karboxyanhydridových zbytků proti inicializačním volným amino kyselinám byly ponechány polymerizovat v DMF při teplotě 25 9C po dobu 4 hodin (Katchalski a Sela, 1958) s cílem připravit diastereomery polymerů různých velikostí. Polymery obsahující různé poměry lysinu, leucinu a D-leucinu byly připraveny použitím různých poměrů lysin-N-karboxyanhydridu, leucin-N-karboxyanhydridu a p-leucin-N-karboxyanhydridU. Tři takové polymery a jejich antibakteriální a hemolytické účinky jsou uvedeny v tabulce 10Tabulka 10

Minimální útlumová koncentrace CpM) a hemolytické účinky Lys/Leu/D-Leu kopolymerůMinimální útlumová koncentrace (pg/ml)

Mo1árn í poměr amino kyselin Lys = Leu:[Dl-Leu	£?. coli (D21)	B. megater i um (Bmll)	% hernolýza ve 100 pM
1:1 = 1	90	15	0
2:1-1	35	8	0
3:1 = 1	80	20	0

Příklad 10 - Účinky diastereomerů proti houbám

Účinky pardaxin-odvozeným peptidů 1 a 16 proti houbám (podívejte se na příklad 1 výše) byly prověřeny ve strerilňích deskách s 96-komůrkámi (Nunc F96 mikrotitrační desky) při konečném objemu 100 pL následovně: 50 pL suspenze obsahující houby v koncentrací 1 χ 10⁶ jednotek tvořících kolonie (CFU)/ml v kultivačním médiu (Sabouraúd glukózové médium) bylo dodáno do 50 pL vody obsahující peptid v sériovém 2-násobném ředění ve vodě. Útlum růstu byl ♦ « * • ·· ·< /· * · ·' ··· » « · ·· ·♦ » * * • · · • ·' · • · · «· « • · · · ♦ · ·· • ·*· φ. · • * · ·’· «· určen měřením absorbance v 492 nm využitím automatického čtecího zařízení mikrodesek E1309 (Bio-ter Instruments) následně po inkubaci trvající 48 hodin při teplotě 30 °C. Účinky proti houbám byly vyjádřeny jako minimální útlumová koncentrace (MIC), koncentrace při které byl pozorován 100 % útlum rSstu po 48 hodinách inkubace. Byly použity následující houby³ Candida albicans (IP886-65) a Cryptococcus neoformans (IP960-67). Jak je ukázáno v tabulce 11, oba peptidy 1 a 16 projevovaly antifugální účinky.

Tabulka 11

Minimální útlumová koncentrace (pM) diastereomerú 1 a 16 proti houbám

Minimální útlumová koncentrace (pM)

Označení peptidů	Candida albicans (IP886-65)	Cryp tococcusneof oritians (IP960-67>
1	35	50
16	120	150

Příklad 11 - Protirakovinné účinky diastereomerú

Protirakovinné účinky Lys/Leu diastereomerú 23 a 24 (podívejte se do příkladu 3 výše) byly prověřeny zkouškou proti adenokarcinorou u myší. Buňky byly uchovány v množství 5 až 10.000/komůrka mikrotitračních desek s 96 komůrkami v Dulbecco's modifikovaném Eagle*s médiu. Po uchycení buněk bylo do komůrek přeneseno 20 juL ředěného roztoku peptidů v normálním solném roztoku, čímž se získala celková koncentrace v rozmezí 20 až 150 pM. Následovala inkubace s peptidy po dobu 1 hodiny, životaschopnost rakovinných buněk byla měřena zkouškou zbarvení živých tryptanovou modří (0,1 % w/v). V kontrolních pokusech byl do buněk dodán samotný roztok peptidů. Protirakovinné účinky byly vyjádřeny jako minimální útlumová koncentrace (MIC), koncentrace při které byl pozorován 100 % útlum růstu po 1 hodině inkubace. Výsledky v tabulce 12 ukazují, že oba zvolené peptidy jsou aktivní proti savčím * 11

Φ · · • · · • ♦ ·· «

»·· · <v, buňkámί

Tabulka 12

V’ • » · • · ·· ··· ·, • · ·· ··

-i

Minimální útlumová koncentrace (pM) diastereoiiiěrfi proti adenokarčinomu u myší

Minimální útlumová koncentrace (pM)

Označení peptidu	Adenokarčinom u myší
23	50
24	80

Příklad 12 - Účinky diastereomerů proti Leishmanxa mexicana

D.i ástereomer peptid 20 odvozený z mel ittinu (podívejte se na příklad 2 výše) a Leu/Lys diastereomer peptidu 23 (podívejte se na příklad 3 výše) byly testovány proti Lpishiaan ia. Promastigoty Leishman ia mexicana NR kmenu vybrané pro zkoušku byly kultivovány při teplotě 27 °C v RPMI 1640 médiu doplněném 10 % fetálním hovězím sérem. Parazity byly získány centrifugací v 1200 x g trvající 10 minut při teplotě 4 °C a dvakrát promyty s PBS (50 mM fosfátu sodného, 150 mM NaCl, pH 7). Promyté promastigoty byly spočteny hemocytometrem a upraveny na koncentraci 1 x 10^ parazitfl/m1 Alikvotni části této suspenze byly analyzovány v konečném objemu 100 pl propočtením živých (pohyblivých) buněk po 24 hodinách inkubace při teplotě 26 °C bez nebo za přítomnosti různých koncentrací diastereomerů. Účinky proti Ledshmania byly vyjádřeny jako minimální útlumová koncentrace (MIC), koncentrace při které bylo pozorováno 100 % mrtvých buněk po 24 hodinách inkubace. Bylo shledáno, že pro peptid 23 je hodnota MIC 17 pM a pro peptid 20 je hodnota MIC 32 pM.

Příklad 13 - Účinky diastereomerů 23 proti virům

Sendai virus (Z kmen) byl pěstován v alantoickém vřecku 10 aš 11 dní starých slepičích vejcí se zárodky, viry byly získány · 0 » • · ♦ ·· · ·<

♦ · · * . * ·· • · · · · ·· • · · ·· ·· hodin po injikování a čištěny. Virus byl opět suspendován v útlumovém roztoku složeném z 160 mM NaCl, 20 mM tricinu, pH

7,4 a skladován při -70 °C. Vírové hemaglutinační účinky byly měřeny v hemaglutinačních jednotkách (HAN). Jeden mikrolitr obsahoval ~ 60.000 HAN. Čerstvá lidská krev byla získána z krevní banky a skladována až 1 měsíc při teplotě 4 °C. Před použitím byly erytrocyty dvakrát promyty s PBS, pH 7,2 a ředěny na požadovanou koncentraci (% v/v) stejným tlumívým roztokem. Viriony, erytrocyty a peptidy byly promíchány v různých pořadích á různých množstvích- Konečná inkubace byla provedena vždy při 37 °C po dobu 60 minut, následovala centrifugace v 5700 g po dobu 10 minut pro odstranění nedotčených buněk. Ve všech případech byly použity duplikátní vzorky a dva alikvotní díly byly odebrány ze supernatantu každého vzorku do dvou komůrek desky s 96-komůrkami. Množství uvolněného hemoglobinu bylo zaznamenáno měřením absorbance komůrek použitím ELISA čtecího zařízení desek v 540 nm. Účinky proti virům býly vyjádřeny jako minimální útlumová koncentrace (MIC), koncentrace při které nebylo pozorováno žádné uvolnění hemoglobinu po inkubaci- Bylo určeno, že hodnota MIC pro Lys/Leu diastereomer peptidu 23 je 80 pM-

: : .· : :: : :

• 00 0 0 · 0 k 0 · i·* • 0 00 »· 00

Ρ Λ Τ Ε Μ Τ Ο V Ε

Claims (1)

1. NÁROKY

   Au I, i pa 1.( uje π n í peptidy matici selektivní cy to 1 y I, i cké účinky projevující se v tom, že (a) peptidy mají rytolytické účinky na patogenní buňky, které nevznikají v těle přirozené, tyl.o buňky zahrnují patogenní orga ni srny a savčí lumky; a (b) peptidy jsou neliemo J yt i cké, jmenovitě nemají cykolytieký úč i nek na červené krevní buňky nebo mají cy t.o 1 yt, i cké? úč i uky ua červené krevní' brníky v končen l.rar írh, které jsou podstatně vyšší' než končen I,race, ve kterých projevují uvedené cy to J y L i cké účinky.

   2. Neliemo 1 y t i cký cytolyt.i cký peptid pudle nároku 1 mající nás 1 edu j i c í charakteri st i ky (a) peptid je odvozen z nese 1 ekt. i vn ího cyto I yl. i ckého přírodního peptidu, který;

   (aa) obsahuje jak t-amino kyselinové zbytky tak i l)-am i no kysel i nové zbytky, nebo (ab) obsahu je buď t-amíno kysel inové zbytky nebo I)-ainino kyselinové zbytky, nebo obíi tyto typy a obsahuje «-hel ixovou přerušovací část.;

   (b) peptid má čistý pozitivní nabo ι , který je vyšší než »1 ; a (c) peptid je ami jpat ický.

   2. Peptid podle nároku 2, který má buď;

   (i ) ne-a-holixovou strukturu, (ii) «-helixovou strukturu, která není umístěn;! ua koncové· jednotce, délky, která je pro překlenutí šířky buněčné? membrány nedos ta tečná , nebo (iii) koncovou «-heI ixovon strukturu délky, která je menší než polovina délky « helixové struktury di;í i iiované? v (i i).

   4. Peptid podle kteréhokoliv z nároku 1 až 2 mající selektivní cy to I y I. i cké· účinky na patogenn í buňky, selektivita pept idu se pjOjovují? tak, že peptid vyvolává cytolýzu patogenních buněk v mnohem nižší konceuti aci , než. ve které vyvolává cytolýzu norma I n i cli ni?pal.o<ii?iin ích buněk .

   b. Peptid podle kteréhokoliv z nároku 1 až 4 mající cy tul yt i cké éiě i nky proti patogenním buňkám bakterií, v i τ íi, hub, prvokfi a mykoplasmy.

   (> Peptid podle nároku ’> mající rytolytické účinky proti

   b.ikti ‘i i í ni * t

   - Sb - 7. Pept. i d podle kteréhokoliv z nároků 1 až b obsahující amiím ky seijnové zbytky ma i í c pos 1 Diipuost takovou , že s te- pept.jrl o bsalnijíoí penze 1.- no lio pouzí; IJ- am ino ky se 1 i nové a ma i i o i stejnou amine kys ul i novou pos 1 oupm ist. jako pept, i d , má rf-Iiel ixoveu s trukt uril a má široké· s pekl-rum L1 ckých íic inků pro jevu j ic ích * na různých buňkách H. Pepi. i d pod 1 e k l.eréln ik< i ) I v z náu >ků 1 až 7, k t erým je

   reomer odvezený z imrilax i im uchu z je-ho fragmentu a jeho cyklické· iii -1' i vát y .

   9. Pept.id podle nároku íi , ve kterém ί i.-► ( v pozitivní náboj vyšší než +1 ji- díky přírodnímu amino kyselinovému složení nebo je získán neutralizací volných karboxylových skupin nebo dodáním pozitivně nabitých amino kyselinových zbytku (ΐ/ιιι·Ι>ιι ροζ i i. i vně nabit.ých i hem i« kých skupin.

   10. Popi.ol podle nároku 9, který jo volený z d i ast.ei eomerů parda x i nn nebo jeho fragmentů, do kterých byly dodány tys zbytky na N-koncovon část a/nebo am i noethy I am i no skupiny na C-koncovou část..

   Peptid pod I o· nároku 10, kl.erý je volený z peptidů odvozených z pardaxinu, v t.exi.u označovaných jako peptidy 1 až 7 S POS I I III pil OS t. i :

   I i I y - Plie- Plie-A 1 a - Leu - I I e-l’ro-1 .ys- 1 1 o - I i o-;'.o r Se i Pro I .eu · Phe- Lys - Th r Leu-Leu-Sor-A Ia-Va1-Cl y - Ser-Λ I a-Len-Sei-Sei Si ?r- (ΐ 1 y-Cly-I; 1 n Cl u-CNN-Cil? -i líz: - NIL )?

   Cl y-Phe-Phe-Λ 1 a - 1 Ie-Pro-Lys- I lei 1 e Sei - Sei -Pu i-Leu-Plh —Lys TI)τ -Leu-Leu-Ser-Λ I a - Va I ( Nil CH? I Ί1? -Nil? )?

   3. Gly-Plie-Phe-A 1 a-Leu-I le-Pro Lys I lei leSi-r-Sei -Pro-Leu-Pln— -Lys-Tlu -Leu-Lou-Ser-AI a-VaI . Lys lil y -Phe- Phe Λ I a-Leu- I 11 — Pro- Lys - 1 1 e- I 11 — Se i -Ser - Pro -1 ,eu- Pln -Lys. Tin Leu-Leu- Ser-A la-Val - (Nil-Pily -CH? - NIC? )?

   I .ys Lys Cly Plie Pln — AI a-Len - 1 Jo - Pro-Lys - I I o- 1 I o Ser Ser Pro

   - Len -1 ’lie- Lys-Thr-Leu-Leu-Ser-Λ la-Val -(NH-CH? ('11? NH? )?

   b . I ,ys - Lys -C 1 y-Phe - Pln —Λ 1 a-Leu - 1 1 e Pro I .ys - I le-I I e-Ser-Si -r-Pn i- Leu - Pln — Lys-TI ii —Leu-Leu-Ser-A 1 a-Va I

   Gly-Plie-Pho—A I a-tou- 1 I o-Pro-Lys I le -1 I e-Sei -NII-CII? -CH?NH?

   12. Pept.id podle kteréhokoliv z nároků 1 již 7, kterým je diastereomer odvozený z mol litinu nebo jeho fragmentů a jeho rykl ické der i váty .

   13. Peptid poille nároku 12, který jo volený z. peptidů odvozených z me i i I.

   nu , textu označíivaných iako pept i dy lil až 21 • 0 0 0 »000 • 0« 0 0 0 00

   0 0 0· 0 000 0 0

   0 0 .0 0 *

   0 0 00 00 υ·’ • 9 • · /

   s pos1oupnost í18. Gly-Ile-GIy-Ala-VaI_-Leu-Lys-Val_-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Arg-Lys-Arq-Gln-Gln-NHz

   19. Gly-1 le-Gly-A la-V<rl-Leu-Lys-VaJ-Leu-Thr-Thr-Gl y-Leu-Pro-Ala-Leu-IIe-Ser-Trp-IIe-Lys-Arq-Lys-Arg-Gln-Gín-CQOH

   20. Gly-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Glv-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-firg-NH-CHa-CHa-ΝΉ2

   21. Ala-VaJ,-Leu-LyS-yaJ_-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-NH-CHz-CHa-NH2

   14. Nehemolytický cytolytický peptid podle nároku 1 obsahující jak L-amino kyselinové zbytky tak i D-amino kyselinové zbytky mající posloupnost amino kyselin takovou, že odpovídající posloupnost amino kyselin tvořená pouze L-amino kyselinovými zbytky se přírodně nevyskytuje.

   15. Peptid podle nároku 14, který má čistý pozitivní náboj a nemá žádnou oc-helixovou strukturu.

   16. Nehemolytický cytolytický peptid podle nároku 14 nebo 15 mající následující charakteristiky:

   (a) peptid je uměle syntetizovaným peptidem tvořeným různými poměry alespoň jedné hydrofobní amino kyseliny a alespoň jedné pozitivně nabité amino kyseliny, ve kterém posloupnost alespoň jednoho z amino kyselinových zbytků je D-amino kyselina;

   Cb) peptid má čistý pozitivní náboj, který je vyšší než +1: a Cc) poměr hydrofobních k pozitivně nabitým amino kyselinám je takový, aby peptid vyvolával cytolytické účinky k patogenním buňkám, ale nevyvolával cytolýzu červených krevních buněk.

   17. Peptid podle nároku 16, ve kterém pozitivně nabitá amino kyselina je volena ze skupiny zahrnující lysin, árginin a hístidin a hydrofobní amino kyselina je volena ze skupiny zahrnující leucin, isoleucin, glycin, alanin, valin, fenyíalanin, prolin, tyrosin a tryptofan.

   18. Peptid podle nároku 17. ve kterém čistý pozitivní náboj vyšší než +1 je díky amino kyselinovému složení nebo je získán dodáním pozitivně nabitých chemických skupin, nebo kterého hydrofobnost může být snížena dodáním polárních amino kyselin, takových jako šeřin, threonin, methionin, asparagin, glutamin a cystein.

   19. Peptid podle nároku 18 tvořený alespoň 6 amino kyselinovými zbytky, ve kterém hydrofobní amino kyselina představuje leucin, alanin nebo valin a pozitivně nabitá amino kyselina představuje lysin.

   * fl • ♦ *

   - 68 20. Peptid podle nároku 19, kterým je diastereumei odvozený ze 6-mer, B-mer nebo 12-mer peptidu tvořeného leurinem a 1ysinem, ve kterém alespoň jedna třetina posloupnosti je tvořena Pani i ne kyše i i nani i .

   21. teu/tys iliasl.ereoiner pudle nároku 20 volený z peptidů, v textu označovaných 23 až 29 s posloupností;

   tys Leu-Leu-l.eu-Lys Leu-Leii-Leu-Lys-ljeii- Leu-Lys-NII?

   tys -1.< mi- Leu-Leu-tys -ten- l.y?; Leu- tys - Leu- ten -1 .ys - Nll?

   I y s -1 ,ys -1 .eu Leu -1 .ys -1 jmi -1 .y s - Leu- Lys - Leu- ty s - ty s - NH?

   21' tys- Leu I .e u - Le 11 - Lys-Leu-I.eu -Leu- Lys -1 e u - Le u 4 ,y s -Nll?

   Lys-Leu- ten-ti·ιι-Lys-Leu -Lys-Leu-Lys Leu-Leu- -Lys-Nll?

   28. Lys-Leu- Leu-Leu-Li Mi-l.ys

   29. 1 ,ys Leu -1 ,en - Leu - Lys - Len Li mi -1 .y s

   22. Neliemo 1 yt. i cký peptid podle nároku 1, kterým je cyklický d i astei eonicr peptidu odvozený z nese 1ektivního r ytu 1 y 1. j ckélio přírodního peptidu nebo umělého syntetického peptidu.

   23. Neliemo 1 yl. i cký rytolytirký komplex vyznačující se tím, že obsahuje pluralitu 2 nebo víre neheiiiolyt i ckýcli cy t.o I y t i rkýrh peptidíí podle kteréhokoliv z nároků 1 až 22, uvedené peptidy jsou svázány dohromady použitím vazebné molekuly kovalentně vázané na každý pept i <1.

   24. komplex podle nároku 23 vyznačující se tím, že spojovací část” je l.viiřrua 2 nebo více, výhodně 5, molekulami stejného peptidu nebo různých peptidů a touto spojovací částí je peptid podle kteréhokoliv z předcházejících nároků nebo běžně používaná spujovací část.

   25. Neliemo I yt i cká cy to 1 y t i cká směs hydrofi Iních <1 i astereomerů podle kteréhoki > I i v z iiárnkfl 1 až 2226. Neliemo I y I. i cký cyto lyti cký nahodilý kopolymer obsahující různé poměry hydrof i ihii ích , pozitivně nabitých a I) aminu kyselin.

   27. Neliemo i y t. i i ký cytnlyl.ický nahodilý kopolymer pudle nároku 26 tvořený lysinem, leurinem a IJ-1 euc j nem v poměru 3 ; 1 1 (mo1 ).

   28. Farmaceutický prostředek vyznačující se tíi herno ly I, i cký rytolytirký peptid pudle kteréhoko 22 a farmaceuticky akcept.ovate 1 ný nosič.

   29. I'ariiiaeetit i rký pri is Lředek vyznačil jící se neliemo lyt ický rytolytirký komplex podle nároků 23 až 24 hydrof iInírh peptidů podle nároku 25 nebo nahodílý ko podlí- nárnků 26 až 27 a farmaceuticky akcepti iva ti - I ný misii

   1:11 , 2 1 1 nebo , že obs silni je ne i V z lla i oku 1 až 1. í ni, Ži: obsáhli je 23 až 24, směs aliod i lý kopl 11 ymer • -1 ný Dl )S i i

   φ φ ▼ - » « ’ « V φ « • · φ « ♦ φ φ «φ • · » φφφφ φφφφ φ φφφ φφ · φ φ φ φφ · φφ · φφ φ ·

   30. Farmaceutický prostředek podle se tnu, že tento je vhodný pro vyvo 1 anýrh patogeiin ím i organ i srny .

   31. Farmařentjcký prostředek podle že patogenní organismus je volen z honby, prvoky, mykop I azmu a v i ry .

   Farmařeni, i eký prostředek podle se tím, ze tento ji? vhodný pro lč?čb nároku 20 nebo 29 vyznačující použiti při ošetření infekcí nároku 30 vyznačující se tím, ^J skupiny zahrnující bakterie, nároku 20 nebo 29 vyznačující i rakův iny.

   • · • « · • · · · · · · «

   1/14 wr ( lilii )