CZ280904B6 - Diagnostické činidlo pro detekci zvýšené hladiny fibrinolytického enzymu - Google Patents

Abstract

Diagnostické činidlo pro detekci zvýšené hladiny fibrinolytického enzymu nebo zvýšené fibinolytické aktivity in vivo v lidském nebo zvířecím těle obsahuje protilátku reagující a aktivátorem tkáňového plasminogenu t-PA nebo její fragment, značenou radioaktivním isotopem, umožňujícím detekci vazby protilátky na t-PA in vivo. V jednom z výhodných provedení se dosahuje rychlejšího odstranění protilátky z oběhu následným podáním příslušného fibrinolytického enzymu, jímž je t-PA.ŕ

Description

Vynález se týká diagnostického činidla pro detekci zvýšené hladiny fibrinolytického enzymu nebo zvýšené fibrinolytické aktivity a také postupů pro detekci tohoto enzymu nebo jeho aktivity in vivo.

Dosavadní stav techniky

Vznik thrombů je velmi komplexní pochod. Celý postup začíná připojením destiček na povrch cévy a případné již vede ke shlukování destiček, pokrytých fibrinem. Ukládání fibrinu patrně ustává za 24 až 48 hodin od začátku tohoto pochodu, načež se thrombus buď organizuje, to znamená, že je postupné nahrazován fibrózní tkání z buněk hladkých svalů nebo fibroplastů, nebo dojde k fibrinolýze. V tomto druhém případě se z endothelu vylučuje aktivátor tkáňového plasminogenu, který váže fibrin na thrombus, čímž dojde ke katalýze přeměny plasminogenu na plasmin. Thrombus se pak může rozpadnout v důsledku fibrinolýzy.

Při vývoji nových thrombolytických látek, například aktivátoru tkáňového plasminogenu nebo streptokinázy, je zapotřebí rychlých, snadno proveditelných postupů pro diagnózu trombózy vzhledem k tomu, že uvedené látky jsou nejúčinnější do 4 až 6 hodin od počátku tvorby thrombů, jak to bylo popsáno v publikaci TIMI study group, N.Engl.J.Med. 312, 932-936 (1985). Až dosud nebylo možno vyřešit problém biochemickými testy, G.E.Austin, Arch.Path.Lab.Med. 111, 1158-62 (1987).

Scintigrafické postupy pro diagnózu trombózy byly rovněž navrhovány. Byly založeny na použití složek krve, například fibrinogenu nebo destiček s radioaktivním označením tak, aby bylo možno zjistit tvorbu thrombů s jejich obsahem, postup byl popsán v K. A. Krohn a L. C. Knight, Radiopharmaceuticals for Thrombosis Detection, Selection, Preparation and Critical Evaluation, Seminars in Nuclear Medicine, sv. VII, č. 3, červenec 1977, str. 219 až 228. Byly podány i zprávy o nevýhodách při použití značeného fibrinogenu nebo destiček, například v publikaci A. M. Peters a další, British Medical Journal 293, 13. prosince 1986, str. 1525 se krátce uvádí, že získání značených destiček je nákladné na čas a vyžaduje odborné provedení, takže nemůže mít široké použití. Jedna z dalších vážných nevýhod je skutečnost, že nahromadění těchto látek v thrombech starších než 24 hodin pravděpodobně nebude stačit pro scintigrafickou detekci, jak bylo krátce uvedeno v J. H. Paulsma-De Waal a další, NucCompakt 18, 1987, str. 284-286.

V poslední době byly provedeny pokusy použít radioaktivně značených protilátek proti různým složkám krve pro diagnózu trombózy. Řada publikací popisuje použití monoklonálních nebo polyklonálních protilátek proti fibrinu, značených různými radioaktivními izotopy, jako In-111, 1-131 nebo Tc-99m pro diagnózu hluboké žilní trombózy.

-1CZ 280904 B6

Například v publikaci S. F. Rosebrough a další, Radiology 156, 1985, str. 515 až 517, se popisuje použití monoklonálních protilátek proti fibrinu, značených 1-131 pro detekci žilních thrombů, vyvolaných u psů. Publikace S. F. Rosebrough a další, Radiology 162, 1987, str. 575 až 577 popisuje použití stejným způsobem značených monoklonálních protilátek, specifických pro fibrin člověka a psa pro zobrazení zralých thrombů, popisuje se úspěšná detekce hlubokých žilních thrombů u psa po 1, 3a 5 dnech. Podobně publikace L. C. Knight a další, J. Nucl. Med. 29, 1988, str. 949 až 502 popisuje použití monoklonálních protilátek proti fibrinu, značených In-111 pro detekci cévních thrombů u králíka a psa, úspěšné detekce bylo dosaženo až po 4 dnech u pěti z osmi králíků a po 0,5 až 24 hodinách u šesti z osmi psů. Z těchto publikací je zřejmé, že i u lidí by mohlo být užitečné použit k tomuto účelu značené monoklonální látky proti fibrinu.

trombózy u lidí s použitím fibrinu Jung a další, Eur. J. Nucl. Med., 283; H. J. Aronen a další, tamtéž 290 a F. De Geeter a další tamtéž Jung a další docházejí k závěru, užitečná pro diagnózu hluboké žilní poplitea a u stehenní žíly než 10 dnů.

Snahy o radioaktivně byly popsány 14(5-6), 14(5-6) ,

280 až

288 až

284 až 287.

diagnózu hluboké žilní značených monoklonálních protilátek proti například v M.

1988, str. 1988, str.

14(5-6), 1988, str. že scintigrafická analýza je trombózy u některých žil, například v.

v případě, že thromby nejsou starší než 10 dnů. Aronen a další popisuje falešné pozitivní výsledky této analýzy a uvádí, že je nutno je potvrdit flebograficky. De Geeter a další považují scintigraf ii jako metodu, která může nahradit kontrastní venografii. Protilátky proti fibrinu mají tu výhodu, že jejich antigen je uložen v oblasti thrombů. Mají však dlouhý poločas v oběhu a z tohoto důvodu vysokou aktivitu, přispívající k vysokému pozadí, což omezuje jejich použití na situace, v nichž nehrozí bezprostřední nebezpečí, jak uvádí také Z. Oster a P. Journal of Radiology 152, únor 1989, popisuje vhodnost značených protilátek proti fibrinu zralých thrombů hlubokých žil.

Z. Oster a P. Som, Američan str. 253 až 260, publikace pro detekci

Další publikace, týkající se použití značených monoklonálních protilátek proti destičkám k diagnóze trombózy, jsou například A. M. Peters a další, British Medical Journal, 293, 1986, str. 1525 až 1527, kde se popisuje použití takové protilátky, značené In-111 k zobrazení hlubokých žilních thrombů u nemocných, publikace uvádí, že tato protilátka je vhodná u čerstvých thrombů, méně již u zralých thrombů vzhledem k tomu, že přilnutí destiček na povrch thrombů je nutné k získání pozitivního výsledku. Tato publikace také navrhuje použití protilátek tohoto typu k průkazu odmítnutí cizí ledviny, usazování destiček na povrch cévních protéz a pro průkaz thrombů v tepnách a v srdci.

V publikaci A. W. J. Stuttle a další, Eur. J. Nucl. Med., 14(5-6), 1988, str. 122 až 125, se popisuje použití fragmentu mnohoklonální protilátky proti destičkám pro zobrazení hlubokých žilních thrombů. Podobně publikace P. Som a další, J. Nucl. Med., 27, 1986, str. 1315 až 1320, popisuje použití fragmentů monoklonálních protilátek proti destičkám, značených Tc-99m pro průkaz pokusně vyvolaných thrombů u psů. Autoři uzavírají, že tyto fragmenty je možno užít k zjištění thrombů v dutině hrudní a intrakoronárních thrombů. Uvádějí také, že značení fragmentů protilátky

-2CZ 280904 B6 je jednodušší než značení destiček.

Z. H. Oster a P. Som, Američan Journal of Radiology 152, únor 1989, str. 253 až 260, popisují vlastnosti značených protilátek proti destičkám ve srovnání se značenými protilátkami proti fibrinu při zobrazování thrombů. Ve srovnání s protilátkami proti fibrinu, které, jak již bylo uvedeno, mají dlouhý poločas, mají protilátky proti destičkám tu výhodu, že jsou rychle odstraňovány z oběhu, jejich clearance je vysoký. Jejich antigen je uložen na obíhajících destičkách a tím je příležitost ke včlenění do vyvíjejícího se thrombu v časném stadiu, čímž se zvyšuje poměr mezi účinnosti v místě thrombu a pozadím v krvi. Na druhé straně spojení protilátek s obíhajícími destičkami velmi znesnadňuje detekci thrombů, které jsou starší než 24 hodin.

Využití radioaktivně značených fibrinolytických enzymů, například aktivátoru tkáňového plasminogenu (t-PA) urokinázy nebo streptokinázy nebo použití jejich prokurzorů, například plasminogenu, pro detekci thrombů a také pro umístění zhoubných nádorů v případě t-PA, bylo rovněž studováno vzhledem k aktivitě těchto enzymů k fibrinu a dalším složkám thrombů. Například publikace J. H. Paulsma-De Waal a další, tak, jak byla svrchu uvedena, popisuje zkoušky s t-PA, značeným Tc pro detekci trombózy. Autoři uzavírají, že při systemickém podání značeného t-PA nelze dosáhnout dostatečného příjmu v thrombu pravděpodobně pro rychlé vychytání látky v játrech, kdežto při místním injekčním podání této látky je možno prokázat její zřetelné hromadění v thrombu. Na druhé straně se z publikací D. J. Hnatowich a další, Eur. J. Nucl. Med. 13, 1987, str. 467 až 473 popisuje pozitivní zobrazení pokusně vyvolaných thrombů u psů po podání rekombinantního t-PA, vázaného na kyselinu diethylentriaminpentaoctovou, značenou In-111, injekčním způsobem, i když se rovněž popisuje rychlý úbytek látky z oběhu zachycením v játrech.

V publikaci S. L. Karonen a další, J. Nucl. Med. 29., 1988, str. 1194 až 1199 se popisuje lokalizace zhoubných nádorů radioaktivně značeným rekombinantním t-PA, přičemž nahromadění této látky ve zhoubné tkáni je takové, že by mohlo umožnit její použití ke zjištění polohy nádoru. Avšak pozdější publikace S. L. Karonen a další, Eur. J. Nucl. Med. 14.(5-6), 1988, str. 610 až 611 rovněž potvrzuje, že převážná část značeného t-PA je rychle odstraňována z plazmy. Další nevýhoda použití této látky je její hromadění v játrech, takže riziko příliš velké místní dávky nutí snížit množství použitého činidla. Mimoto je značení t-PA v kompetici s přírodní látkou, která se rovněž ukládá do thrombu.

K zobrazení thrombů byly rovněž užity značená streptokináza a urokináza podle publikace K. A. Krohn a L. C. Knight svrchu, kde se rovněž popisují obtíže při použití těchto enzymů (str. 226), takže autoři nepovažují tyto látky za klinicky použitelné. V téže publikaci se popisuje také použití značeného plasminogenu, který je možno podle autorů potenciálně užít u starších thrombů.

Přes existenci nejrůznějších radioaktivně značených činidel pro detekci thrombů je zřejmé, že by bylo zapotřebí použít dokonalejších postupů, zvláště značených protilátek proti fibrinolytickým enzymům, které by bylo možno použít in vivo k zjištění zvýšené fibrinologické aktivity. Pokusné výsledky, které byly až

-3CZ 280904 B6 dosud získány, ukazují, že jde o dokonalejší prostředky alespoň v některých případech.

Podstata vynálezu • Vynález se tedy týká diagnostického činidla pro detekci zvýšeného uvolňování fibrinolytického enzymu nebo zvýšené fibrinolytické účinnosti in vivo u člověka nebo jiných živočichů. Toto činidlo je tvořeno protilátkou, reagující s fibrinolytickým enzymem nebo fragmentem této protilátky, značené látkou, která umožňuje in vivo zjistit vazbu protilátky na fibrinolytický enzym.

Pod pojmem fibrinolytický enzym se rozumí enzym, který přímo katalýzuje rozpad fibrinu, například plasmin nebo jeho prekurzor, například plasminogen nebo enzym, který katalýzuje štěpení prekurzoru enzymu na fibrinolytický aktivní formu, jako je t-PA nebo urokináza. Výhodnými enzymy jsou ty, které mají afinitu k fibrinu, t.j. lnou k fibrinu nebo k složce, která rovněž lne k fibrinu, t-PA, plasmin, plasminogen nebo jejich analogy nebo enzym, který byl modifikován tak, aby měl afinitu fibrinu, jako modifikovaná urokináza. Pod pojmem analog se rozumí derivát enzymu, získaný modifikací řetězce DNA, který je kódem pro tento enzym tak, že v přírodním řetězci dochází k přidání, vypuštění, náhradě nebo včlenění jedné nebo většího počtu aminokyselin, nebo může jít o homologni enzym, nebo o enzym, který reaguje s protilátkou proti přírodnímu enzymu. Je nutno uvést, že alespoň v případě t-PA již bylo popsáno několik takových analogů. Modifikaci, která je nutná k získání fibrinolytického enzymu s afinitou k fibrinu z enzymu s nízkou afinitou fibrinu, například z nativní urokinázy, je možno vyvolat rekombinantní technikou DNA známým způsobem. Tyto analogy nebo modifikované enzymy se ovšem přírodně nevyskytují, mohou však tvořit část některého z provedení diagnostického postupu, v němž se analog nebo modifikovaný enzym podá nemocnému před nebo po podání značené protilátky. Jednou z výhod tohoto postupu by mohlo být to, že je možno zvýšit úroveň tohoto enzymu v místě thrombu nebo jiného fibrinového útvaru, což bude mít za následek také zvýšenou koncentraci protilátky, což zlepší přesnost stanovení.

Pod pojmem zvýšená fibrinolytická účinnost se rozumí vyšší než obvyklá úroveň rozpadu fibrinu. Pod pojmem zvýšené uvolňování fibrinolytického enzymu se rozumí zvýšená sekrece jednoho nebo většího počtu enzymů, které tvoří část fibrinolytického systému, například ve spojení s mírnou ischemií, při níž nedochází k ukládání fibrinu a tedy ani k fibrinolýze.

Pod pojmem protilátka se rozumí jakákoliv látka, která se vytváří v lidském nebo živočišném organismu nebo v lidské nebo živočišné buňce jako odpověď na působení fibrinolytického enzymu nebo jeho analogu. Podle běžné praxe může být fragmentem protilátky fragment Fab', F(ab')₂ nebo Fv fragment protilátky, nebo protilátka s jedinou oblastí reaktivity.

Za fyziologických podmínek je množství fibrinolytických enzymů v oběhu malé, kdežto místní koncentrace těchto látek v případě trombózy je vysoce zvýšena, což znamená, že antigenní místa pro protilátky proti některému z fibrinolytických enzymů se

-4CZ 280904 B6 nacházejí téměř výlučně k oblasti thrombu, což znamená výhodný poměr cílového objektu v pozadí v krvi. Tento stav je možno dále zlepšit tak, že se fibrinolytický enzym podá před nebo po podání protilátky. Tímto způsobem je možno zvýšit hladinu fibrinolytického enzymu ve starších thrombech a odstranit nenavázané protilátky, čímž se snižuje pozadí. Ve zvláště výhodném provedení je fibrinolytickým enzymem t-PA, který je po podání rychle odstraňován z oběhu, protože se váže v játrech. Bylo neočekávaně zjištěno, že v případě, že se podá t-PA nebo jeho analog v určité době po podáni protilátky proti t-PA (anti-t-PA). má výsledný komplex t-PA/anti-t-PA daleko kratší poločas v plazmě než protilátka, která není vázaná na komplex vzhledem k vazbě komplexu na tentýž receptor v jádrech, jako volný t-PA.

Vynález se tedy týká rovněž diagnostického balíčku, který obsahuje v oddělených nádobách

a) protilátku, reagující s fibrinolytickým enzymem, zvláště t-Pa, nebo její fragment, značený látkou, umožňující detekci vazby protilátky na fibrinolytický enzym in vivo a

b) fibrinolytický enzym, s nímž protilátka reaguje, zejména t-PA nebo analog.

Vynález se rovněž týká použiti protilátky, reagující s fibrinolytickým enzymem, nebo fragmentu této protilátky, značené látkou, dovolující detekci vazby protilátky nebo jejího fragmentu na fibrinolytický enzym in vivo. Vynález se také týká způsobu výroby diagnostického činidla pro průkaz zvýšeného uvolňováni fibrinolytického enzymu nebo zvýšené fibrinolytické aktivity u člověka nebo jiného živočicha in vivo. Jak již bylo uvedeno, volí se fibrinolytický enzym s výhodou ze skupiny t-PA, plasmin, plasminogen nebo jejich analogy, nebo může jit o modifikovaný fibrinolytický enzym s afinitou k fibrinu.

Zvláště výhodným fibrinolytickým enzymem k získáni antibiotik pro uvedený účel je t-PA nebo jeho analog, zvláště nativní t-Pa vzhledem k tomu, že tento enzym má vysokou afinitu k fibrinu. Množství tohoto enzymu v krvi je také obvykle velmi malé, kdežto při patologických pochodech naopak velmi vysoké.

Protilátky, užívané při způsobu podle vynálezu, jsou s výhodou monospecifické protilátky proti jediné specifické složce, v tomto případě určitému fibrinolytickému enzymu. Monospecifické protilátky mohou být polyklonální a monoklonální.

Polyklonální protilátky je možno získat tak, že se vhodnému živočichu injekčně podá v podstatě čistý fibrinolytický enzym, aby byla zajištěna specifičnost protilátek, a pak se podá ještě jedna nebo větší počet dalších dávek ve vhodných intervalech, například 2 týdny až měsíc, v období až 6 měsíců ke zvýšení množství protilátky, načež se poprvé odebere krev. Pak se v imunizaci pokračuje a zvířeti se odebírá krev obvykle vždy 1 týden po další injekci a protilátky se izolují ze séra známým způsobem, například podle publikace Harboe a Ingild, Scad. J. Immun., £, suppl· 1, 1973, Str. 161 až 164.

-5CZ 280904 B6

Je však výhodné použít monoklonální protilátky nebo jejich fragmenty jako Fab', F(ab')₂ nebo Fv, protože tím je možno zajistit vysokou specifičnost a přesnost diagnózy. Monoklonální protilátky je možno získat známým způsobem, například podle publikace L. C. Peterson a další, Thrombosis and Haemostasis 57 (2), 1987 str. 205 až 211. Je nutno uvést, že monoklonální protilátky mohou být jakéhokoliv původu, může jít například o protilátky člověka nebo myši.

Protilátku je možno rovněž získat tak, že se klonuje řetězec DNA, který je kódem pro protilátku nebo její fragment ve vhodné buňce, například mikrobiální, rostlinné, živočišné nebo lidské buňce, a tato buňka se pak pěstuje za podmínek, které vedou k produkci protilátky nebo jejího fragmentu, načež se protilátka nebo její fragment z kultury izoluje. Tyto postupy byly uvedeny například v publikaci L. Riechmann a další, Nátuře 332, 24. března 1988, str. 323 ff., kde se popisuje úprava chimérních protilátek pro variabilní oblasti krysy a stálé oblasti u člověka, v publikaci M. Better a další, Science 240, 20. května 1988, str. 1041 ff., se popisuje příprava chimérních fragmentů Fab myš-člověk, v publikaci A. Sharra a A. Plúckthun, Science 240, 20. května 1988, str. 1038 až 1040, se popisuje klonování fragmentu Fv imunoglobulinu s obsahem míst pro vazbu antigenů a v publikaci E. S. Ward a další, Nátuře 341, 12. října 1989, str. 544 až 546 se popisuje klonování izolovaných variabilních oblasti pro vazbu antigenů single domain antibodies.

Zvláště výhodnou protilátkou pro použití v diagnostickém činidle podle vynálezu je monoklonální protilátka nebo její fragment , reaguj ící s nativním t-PA nebo analogem ve svrchu uvedeném významu. Monoklonální proti látky proti t-PA již byly dříve popsány pro jiné účely, například v publikacích L. C. Peterson a další svrchu, EP 298 783, K. Kaltoft a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 79., 1982, str. 3720 až 3723 , L. S. Nielsen a další, The EMBO Journal, 2, 1983, str. 115 až 119, L. S. Nielsen a další, Biochemistry, 21, 1982, str. 6410 až 6415, K. Dan0 a další; J.

Histochem. Cytochem. 30, 1982, str. 1165 až 1170.

Protilátky se užívají s výhodou v podstatě čisté formě, aby bylo možno zvýšit přesnost diagnózy.

Látkou, užitou k označení protilátky, je s výhodou radioaktivní izotop, s výhodou takový, který má krátký poločas, tak, aby nemocný neobdržel příliš velkou dávku. Dávku je možno snížit také tak, že se zvolí protilátka, která je zcela odstraňována za poměrné krátkou dobu. Izotopem může být jeden ze svrchu uvedených izotopů, například In-111, Tc-99m, 1-131, 1-123 nebo 1-125. Protilátku je možno značit známým způsobem, například podle publikace D. J. Hnatowich a další, Science 220, 1983, str. 613 až 615, kde se protilátka váže na kyselinu diethylentriaminpentaoctovou před označením k usnadnění stálé vazby radioaktivního izotopu, nebo podle publikace S. W. Burchiel a B. A. Rhodes, Tumor Imaging, New York, Mason Publishing str. 111 až 123, kde se protilátka přímo inkubuje s izotopem. Značení pomocí Tc-99m je možno provádět podle EP 169 232, EP 271 806 nebo EP 304 780. Radioaktivitu je možno měřit obvyklým způsobem počítačem nebo scinatilačním počítačem.

-6CZ 280904 B6

Je možno také k označení užít látku, která vyvolává zobrazení při magnetické rezonanci. Může jít například o částice magnetitu, které mohou být povlečeny protilátkou a užity v podstatě podle publikace S. Cerdan a další, Magnetic Resonance in Medicíně 12, 1989, str. 151 až 163, nebo je možno užít paramagnetické atomy, například C⁴·-’ nebo gadolinium, například podle publikace J. C. Saccavini a další, Invest. Radiol. Sppl. 1, 1988, str. S292 až S293.

Diagnostické činidlo podle vynálezu je možno zpracovat na jakoukoliv lékovou formu, která se podává například v injekční formě, ve formě aerosolu, suspenze, roztoku, střevního nálevu a podobně. Při zpracování je možno užít obvyklé pomocné látky nebo nosná prostředí, jako isotonický roztok chloridu sodného, obvyklým způsobem.

Dávka reakčního činidla se bude obvykle pohybovat v rozmezí 0,1 až 10 mg, s výhodou 0,5 až 5, například 1 mg značené protilátky.

Diagnostické činidlo podle vynálezu je možno použít pro diagnózu jakéhokoliv stavu, při němž dochází k místnímu nahromadění fibrinu a tím i k místnímu zvýšení fibrinolitické aktivity. Jde o trombózu včetně trombózy hlubokých žil, koronárních cév, mozkových cév, srdeční trombózu, nástěnné trombózy, trombózy v oblasti žaludku a střev, nebo o arteriální trombózy, dále může jit o embolie, včetně plicních, dále o krvácení, včetně krvácení do mozku, pooperační krvácení, krvácení do žaludku a střev, herna turii nebo hemoptýzu, dále může jít o žaludeční a dvanáctníkové vředy, oběhovou nedostatečnost, nádory, jako nádor mléčné žlázy, vaječníků, maligní melonom nebo nádory mozku a kostí, dále jde o vasculitis, místní infekce, místní záněty, včetně kloubních, a o zlomeniny.

Vynález bude dále popsán v souvislosti s přiloženými výkresyNa obr. 1 je znázorněn scintigram, který potvrzuje zvýšený příjem monoklonální protilátkou anti-t-PA (t-PA MoAb), značenou In-111, v místě odběru krve v loketní žíle.

Na obr. 2 a 3 jsou znázorněny scintigramy, které ukazují zvýšený příjem téže protilátky v místě arterotemie ve stehenní tepně bezprostředně po vstříknutí reakčního činidla (obr. 2) a po 24 hodinách (obr. 3).

Na obr. 4 je znázorněn scintigram, dokládající zvýšené množství téže značené protilátky při krvácení do žaludku a střev ve spodní a střední části břišní dutiny a v coeku.

Na obr. 5 je znázorněné zvýšené množství téže značené protilátky při hluboké žilní trombóze v oblasti pravého kolena.

Na obr. 6 je znázorněn scintigram, který ukazuje zvýšené množství téže značené protilátky při nástěnné trombóze v aneurysmatu břišní aorty.

-7CZ 280904 B6

Na obr. 7 je znázorněn scintigram, potvrzující zvýšené množství téže protilátky v oblasti plicní embolie.

Na obr. 8 je znázorněn scintigram zvýšeného množství téže protilátky v oblasti rozvětvení tepny proximálné na levém lýtku, a to těsně před, 1 hodinu a 40 hodin po operaci, provedené k odstranění thrombu v této oblasti.

Na obr. 9 je znázorněn scintigram, na němž je zřejmé nahromadění téže protilátky v oblasti zlomeniny pravého kotníku.

Na obr. 10 je znázorněn scintigram břišní oblasti s nahromaděním téže protilátky na thrombu levé iliakální žíly.

Na obr. 11 je znázorněn scintigram břišní oblasti se zvýšeným množstvím téže protilátky v obou vaječnících, močovém měchýři a nádorové metastáze v příčném tračníku.

Na obr. 12 je znázorněn scintigram břišní oblasti se zvýšeným nahromaděním téže látky v periapendikulárním abscesu.

Na obr. 13 jsou znázorněny tři scintigramy, prokazující zvýšené nahromadění téže protilátky při reumatoidnim zánětu kloubů zápěstí, pravého kotníku a kolena.

Na obr. 14 je znázorněn scintigram, prokazující zvýšené množství téže protilátky v nosní oblasti (nosní sliznice má obvykle zvýšenou fibriolytickou aktivitu, stejně jako prostata a pohlavní žlázy).

Na obr. 15 je znázorněn graf, uvádějící celkovou radioaktivitu v plazmatu při použití téže protilátky při a bez následujícího podáni t-PA.

Na obr. 16 je graf, který znázorňuje imunoreaktivní část téže protilátky při a bez následujícího injekčního podání t-PA.

Na obr. 17 je znázorněn scintigraf rozdělení téže protilátky v orgánu jako takové a ve formě komplexu s t-PA.

Na obr. 18 je znázorněn graf, prokazující celkovou radioaktivitu v lidské plazmě pro tutéž značenou protilátku před a po injekci t-PA.

Na obr. 19 je graf, znázorňující změnu orgánové distribuce téže protilátky u člověka po injekci t-PA.

Na obr. 20 jsou znázorněny dva scintigramy v oblasti lýtka, které znázorňují nejprve zvýšené nahromadění téže protilátky v cévách pravé nohy A a pak po injekci t-PA fokální thrombus v horní části B.

Příklady provedení vynálezu

Vynález bude osvětlen následujícími příklady, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu.

-8CZ 280904 B6

Příklad 1

Příprava monoklonální protilátky proti t-PA

Čistění antigenů t-PA

Materiál pro použití k imunizaci myší byl čištěn podle publikace: Rijken D.C. a Collen D., J.Ciol.Chem. 256. 7035-41 (1981). Čištěný materiál obsahoval objemově více než 95 % čistého t-PA, jak to bylo stanoveno elektroforézou na SDS-polyakrylamidovém gelu, přibarveném stříbrem.

Imunizace myší AKR pomocí t-PA

Čištěný materiál, získaný výše uvedeným postupem, byl dialyzován proti 0,15 M roztoku chloridu sodného s objemovým obsahem 0,01 % monooleylpolyoxyethylensorbitanu (75 % kyseliny olejové, zbytek hlavně kyselina linolová, palmitová a stearová; látka označována též jako Tween 80); koncentrace byla upravena na 10 ^g/ml.

Myši AKR se imunizují celkem třikrát vždy po dvou týdnech. Při prvních dvou imunizacích bylo každé myši podáno podkožně 50 μΐ t-PA spolu s 50 μΐ Freundova neúplného pomocného prostředku, což odpovídá dávce 5 μΐ na myš. Poslední imunizace byla totožná, avšak byla podána intraperitoneálné. Po dvou měsících byla myším podána ještě jedna injekce s obsahem 90 μΐ t-PA bez pomocného prostředku.

Fúze buněk a pěstováni buněk

Tři dny po poslední nitrožilní injekci byla slezina odebrána a byla připravena suspenze slezinných buněk opatrným rozrušením sleziny. Výsledné buňky byly použity pro fúzi podle publikace Petersen L. C. a další, Thrombosis and Haemostasis 27., (2), 1987, str. 205 až 211. Fúze byla uskutečněna s myelomovými buňkami X63-Ag8-6.5.3 za přítomnosti polyethylenglykolu. Pak byly buňky užity k naočkování deseti mikrotitračních desek s 96 vyhloubeními. Supernatanty hybridomů byly sledovány po dvou týdnech růstu imunologickou zkouškou s vázaným enzymem při použití t-PA jako antigen. Pozitivní klon byl několikrát reklonován pomocí omezeného ředidla, aby byla zajištěna jednotnost klonu. Pak byla buněčná linie pěstována ve velkém množství v zařízení k tomuto účelu (NUNC) v živném prostředí, které bylo složeno z prostředí RPMI 1640 (Gibco, Britanie) a 2 % BMS (takto), vždy objemově.

Čistění monoklonální protilátky

Kapalné podíly s hybridomem nad sedlinou byly koncentrovány a po úpravě pH na hodnotu 8,3 byla monoklonální protilátka čištěna za teploty 4 ’C adsorpci na gelu proteinu A. Eluování bylo prováděno citrátovým pufrem o pH 4,5.

Produkce fragmentů F(ab)₂

Čištěná monoklonální protilátka, podskupina IgG, byla čištěna rozštěpením pepsinu za poměru enzym/substrát 1 : 100 (hmotnostně) za pH 4,0 po dobu celkem 16 hodin. Prováděno za teploty

-9CZ 280904 B6 °C, reakce byla pak zastavena úpravou pH reakční směsi na 8,5 přidáním pevného tris-pufru, tedy tris-(hydroxymethyl)-aminomethanu. Fragmenty F(ab)₂ byly odděleny od nerozštěpené protilátky a od produktů s nízkou molekulární hmotností na sloupci s obsahem Ultrogel-u AcA 44. Čistění protilátky, štěpení pepsinem a čistění fragmentů F(ab)₂ bylo sledováno na gelech SDS za barvení stříbrem.

Značení F/ab/₂ indiem

Čištěné fragmenty byly značeny indiem podle publikace Hnatowich, J. Immun. Methods, 65, 147 až 157 /1983/. Imunoreaktivita konjugátů byla potvrzena zkouškou ELISA a imunosorpční technikou při použití t-PA jako antigenů. Radiochemická čistota byla potvrzena vysokotlakou kapalinovou chromatografií.

Značení F/ab/₂ techneciem-99m

Čištěný F/ab/₂ byl značen techneciem-99m podle metody Schwarze/Nucl-Med-Commun 1989; 10:345-52/. Imunoreaktivita konjugátů byla potvrzena zkouškou ELISA a imunosorpční technikou při použiti t-PA jako antigenů. Radiochemická čistota byla potvrzena pomocí HPLC.

Příklad 2

Historie jednotlivých případů

Všem nemocným byl injekčně podán 1 mg protilátky anti-t-PA MoAb, značené In-111, připravené podle příkladu 1 v dávce radioaktivity 100 MBq, až na případ B, kdy byla podána poloviční dávka. Scintigrafické vyšetřeni bylo prováděno pomocí scintigrafické kamery /GE StarCam/, která byla napojena na počítač /Star Systém 2/, napojení bylo provedeno ihned po injekci protilátky. V průběhu celého vyšetření nebyly pozorovány žádné komplikace.

A. Krevní vzorek byl odebrán padesátiletému muži z pravé loketní žíly 3 hodiny před injekcí značené protilátky. Na prvních 8 hodin scintigrafického vyšetření byl uložen malý žilní katetr distálněji do pravé loketní žíly pro odběr krve. 24 hodin po podání protilátky bylo možno pozorovat v místě odběru zvýšené množství protilátky, jak je zřejmé z obr. 1, což znamená, že protilátku je možno použít k průkazu cévního poranění.

B. Na levé a. femoralis communis padesátiletého muže s těžkou arteriosklerózou byla provedena thrombendarterecromie, řez tepnou byl dlouhý 5 cm. Po 20 hodinách byla vstříknuta značená protilátka. Jak je zřejmé z obr. 2, bylo okamžitě možno pozorovat zvýšené množství protilátky podél řezu. Po 24 hodinách po injekci bylo možno pozorovat zvýšené množství protilátky v celé operační oblasti, což odpovídá mikrotrombózám krevních cév v celém okolí, jak je zřejmé z obr. 3.

C. Muž ve stáří šedesát jedna let byl v posledních dvou letech přijat do nemocnice pro žaludeční a střevní krvácení. Nebylo však možno nalézt místo, z něhož krvácel. Po pěti dnech krvá-10CZ 280904 B6 cení byl nemocný opět přijat, krvácení však pokračovalo. Byla podána značená protilátka a po 2,5 hodinách bylo možno prokázat její zvýšené množství ve spodní střední části břicha, jak je zřejmé z obr. 4. Toto hromadění pokračovalo, po 6 hodinách vyšetřování již bylo možno pozorovat aktivitu také v koncové části tlustého střeva (coeku). Místně zvýšenou aktivitu však bylo možno stále pozorovat v oblasti, kde byla aktivita zvýšena na začátku pozorování. Při operaci byl v této oblasti zjištěn karcinoidní polyp, nacházející se 50 cm od oblasti, kde byla zjištěna zvýšená aktivita. Od té doby již nebylo možno pozorovat žádné krvácení.

D. Muž ve stáří sedmdesát osm let byl účastníkem dopravní nehody dva týdny před vyšetřením. Vzhledem k bolesti v zádech celé dva týdny ležel. Den před scintigrafickým vyšetřením byla provedena kontrastní flebografie. 20 hodin po podání značené protilátky bylo možno prokázat zvýšenou fibrinolytickou aktivitu v pravé noze (obr. 5), přesně odpovídající uzavřené oblasti, která byla pozorována také při flebografii, šlo o laterální žíly pod kolenem a spodní část stehenní žíly těsně nad kolenem.

E. Muži ve stáří 81 let s aneurismatem břišní aorty s nástěnným thrombem byla podána značená protilátka injekčním způsobem a scintigrafické pozorování bylo prováděno 20 hodin před operací pro tento stav. Bylo možné pozorovat zvýšenou fibrinolytickou aktivitu v oblasti nástěnného thrombu, jak je zřejmé z obr. 6. Vzorky cévy, odebrané v této oblasti v průběhu operace prokázaly o 60 % vyšší příjem značené protilátky v této oblasti ve srovnání s oblastmi s vysokou arteriosklerózou, avšak bez thrombu.

F. Muž ve stáří 69 let byl přijat pro dýchací obtíže. Scintigram odhalil malé plicní embolie, kombinované s chronickou obstruktivní plicní chorobou. Scintigrafické vyšetření 24 hodin po injekci značené protilátky prokázalo nahromadění této protilátky v oblastech pravé plíce s embolií (obr. 7).

G. Žena ve stáří 81 let pociťovala slabou bolest v levé noze pět dnů, pak se bolest zhoršila a žena byla přijata, v této době již ztrácela citlivost na horní ploše nohy. Byla diagnostikována embolie v oblasti lýtka a byla provedena náprava operací. Předoperativní scintigrafické vyšetření injekcí značené protilátky prokázalo nepravidelné zvýšení množství protilátky v oblasti rozvětvení tepny v levém lýtku (obr. 8). Bylo možno pozorovat také zvýšenou aktivitu na horní ploše nohy, což prokazovalo zvýšené místní uvolňování t-PA. Ve scintigrafickém vyšetření bylo pokračováno i po operaci, k normalizaci došlo 48 hodin po operaci. Nemocná se zotavila, embolie neměla žádné další následky.

H. Muž ve stáří 81 let byl přijat se zlomeninou pravého kotníku předchozího dne. Po injekčním podání značené protilátky bylo možno pozorovat nahromadění této protilátky v oblasti zlomeniny (obr. 9).

I. Žena ve stáří 32 let byla přijata pro otok levé dolní končetiny. Při akutní kontrastní flebografii byla prokázána trombóza

-11CZ 280904 B6 levé iliakální žíly. Po 24 hodinách bylo možno pozorovat vysoké nahromadění v celé oblasti levé iliakální žíly (obr. 10).

J. Žena ve stáří 72 let byla přijata pro podezření na zhoubný nádor vaječníkú. Při ultrazvukovém vyšetření bylo zesíleno podezření na změny pravého vaječníkú a byla zjištěna nádorová hmota v břišní dutině o rozměru 2x2x2 cm. Při scintigrafii 24 hodin po injekci bylo možno pozorovat hromadění protilátky v močovém měchýři, obou vaječnících a v horní části břišní dutiny, jak je zřejmé z obr. 11. V průběhu operace byl potvrzen zhoubný nádor obou vaječníkú, prorůstající do močového měchýře s metastázou do příčného tračníku.

K. Muž ve stáří 38 let byl přijat pro horečky a bolest v pravé horní části břicha. Při ultrazvukovém vyšetření byla zjištěna homogenní hmota v pravé spodní části břicha, šlo o periapendikulární absces. Scintigram po 27 hodinách po injekci značené protilátky prokázal její nahromadění v téže oblasti, což ukazuje na místní infekci, vyšetření tedy potvrdilo nález při vyšetřeni ultrazvukem (obr. 12).

L. Muž ve stáří 60 let s těžkým rheumatoidním zánětem kloubů, trvajícím několik let, byl přijat pro opakované ataky onemocnění. Scintigrafie po 24 hodinách po injekci značené protilátky prokázala její zvýšené nahromaděni v kloubech s akutním zánětem (obr. 13 ) .

Tyto výsledky prokazují, že radioaktivně značenou protilátku proti t-PA je možno použít k diagnóze nejrůznějších stavů, spojených se zvýšenou fibrinolytickou aktivitou v různých částech těla, pravděpodobně s výjimkou tkání, které samy mají zvýšenou fibrinolytickou aktivitu, jako jsou prostata, pohlavní žlázy a nosní sliznice, jak je zřejmé z obr. 14. Protilátka má vysokou imunologickou specifičnost a citlivost. Její příjem v játrech je první 4 hodiny nízký, což znamená, že na rozdíl od použití radioaktivně značeného t-PA nepůsobí problém zachycení v játrech a tím i vysoká koncentrace radioaktivity v játrech. Prvních několik minut po injekci se protilátka ve zvýšené míře hromadí v oblasti trombózy, pak se několik hodin poněkud zvyšuje pozadí. Poměr nahromadění v cílové tkáni a v krvi se pak zlepšuje, takže je možno získat jasný scintigrafický obraz v oblasti se zvýšenou fibrinolytickou aktivitou.

Příklad 3

Odečteni biologického pozadí - sledování na zvířeti

Monoklonální protilátka

Monoklonální protilátka byla připravena způsobem podle přikladu 1. Fragment F(ab)₂ byl radioaktivně značen In-111 stejně jako v příkladu 1.

Radiochemická čistota značené protilátky byla při stanovení vysokotlakou kapalinovou chromatografií 93 %.

-12CZ 280904 B6

Imunochemická čistota značené protilátky byla stanovena jako procento radioaktivity protilátky, schopné vazby na sloupec Sepharosy (Pharmacia AB, Švédsko) s navázaným t-PA. Imunochemická čistota konjugátu byla nižší než radiochemická čistota, protože určitá část značené protilátky byla imunologicky nereaktivní. Imunologická čistota byla 91 %.

t-Pa

Při pokusu bylo užito t-PA, tak jak se běžné dodává, šlo o prostředek Actilyse (Boehringer Ingelheim).

Provedení pokusu

Dvěma králíkům bylo nitrožilně podáno určité množství protilátky na kg a pak byla měřena specifická radioaktivita, podobně jako u lidí v příkladu 2.

Králíkovi 1 byla protilátka podána v čase t = 0 minut. Nebyl podán žádný t-PA. Králíkovi 2 byla podána protilátka v čase t = 0 minut. V čase t = 120 minut byla podána králíkovi 2 nitrožilní injekce t-PA v průběhu 1 minuty. Injekční množství t-PA převyšovalo třikrát molární koncentraci podané protilátky.

Aktivita v plazmě

Krevní vzorky byly odebrány v čase t = 0, 10, 20, 40, 60 minut a 2, 4, 6, 12 a 24 hodin po podáni protilátky. U králíka 2 byly odebrány ještě další vzorky po 5, 10, 20, 40 a 60 minutách po injekci t-PA.

Pro každý vzorek byla zjištěna celková plazmatická účinnost, pak byla provedena analýza regrese (Freelance Plus ver 3.01^^R^ a údaje byly zpracovány v exponenciální křivce a byl vypočítán biologický poločas. Všechny křivky byly opraveny v závislosti na fyzikálním rozpadu. Výsledky jsou uvedeny na obr. 15. Tl/2 protilátky byl 10,3 hodin.

V případě, že po 2 hodinách byl podán t-PA, došlo k dramatickému snížení aktivity v plazmě. Do 10 minut došlo k 92% snížení .

Biologický poločas radioaktivně značené imunologicky reaktivní protilátky v plazmě byl stanoven jako poločas vazné aktivity t-PA. Výsledky jsou znázorněny na obr. 16.

Po 10 minutách po injekčním podání t-PA v čase t = 2 hodiny bylo více než 99 % imunoreaktivní protilátky v plazmě odstraněno. Poločas tohoto odstraňování je tedy 1 minuta. Pak dojde k malému vzestupu až o 1,6 % v několika hodinách po tomto odstranění. Jde pravděpodobné o redistribuci protilátky, nacházející se mimo cévy.

Aktivita v celém těle

Po 24 hodinách byli králíci usmrceni a byl proveden scintigram celého jejich těla. Výsledky jsou znázorněny na obr. 17.

-13CZ 280904 B6

Protilátka, tvořící komplex s t-PA, byla uložena převážně v ledvinách, kdežto komplex protilátky s t-PA se ukládal převážně v játrech.

Z těchto pokusů vyplývá, že komplex t-PA a protilátka má podstatně kratší poločas v organismu než samotná protilátka. Mimoto pokusy ukazují, že je možné využít rychlého odstranění komplexu z krve in vivo. Výsledky těchto pokusů ukazují, že zodpovědnou látkou za toto rychlé odstranění je receptor v játrech.

Snížení celkové adioaktivity je hlavním parametrem tohoto zobrazení, rozhodující je poměr radioaktivity v cílové tkáni a v krvi. Snížení vazby t-PA je mírou účinnosti receptoru in vivo. Snížení celkové radioaktivity bude nižší než snížení radioaktivity vázaného t-PA, pokud konjugát nebude imunochemicky aktivní na 100 %.

Příklad 4

Odečtení biologického pozadí u lidí

Žena ve stáří 77 let byla přijata pro velký otok pravé dolní končetiny. Při akutní kontrastní flebografii bylo možno pozorovat trombózu v jedné z laterálních žil pravého lýtka. Scintigrafie byla provedena při použití radioaktivně značené monoklonální protilátky, připravené způsobem podle příkladu 1. Radiochemická čistota byla pouze 67 %.

hodinu po injekci protilátky bylo injekčně podáno 5 mg t-PA (Actilyse, Boehringer Ingelheim).

Aktivita v plazmě

Krevní vzorky byly odebírány v pravidelných intervalech po injekci t-PA. Pro každý vzorek byla stanovena celková radioaktivita plazmy počítačem gamma s vyhloubeními a byla srovnávána v průběhu času, jak je zřejmé z obr. 18. Pak byla provedena exponenciální analýza regrese (Freelance Plus ver 3,01^^R^). Poločas byl 4,8 hodin. Po injekci t-PA došlo k podstatnému poklesu aktivity v plazmě, v průběhu 17 minut bylo dosaženo poklesu na 50 %.

Scintigrafie

Biologická distribuce

V průběhu injekce t-PA bylo prováděno dynamické sledování oblasti jater a srdce pomocí kamery se 60 obrázky, každá expozice trvala 15 sekund. Pak byla vypočítána aktivita v krvi v oblasti srdce a jater v čase. Posun v distribuci z oběhové krve do jater po injekci je jasně zřejmý z obr. 19.

Detekce thrombu

Jak je zřejmé z obr. 20, nebylo možno po injekci protilátky objevit přesné umístění thrombu přesto, že v levé dolní končetině byly otoky. Po injekci t-PA bylo možno jasně prokázat přesnou

-14CZ 280904 B6 oblast, v níž se krevní sraženina nacházela.

Snížení biologického pozadí tedy zřejmě postižených tkání a umožňuje prokázat místo, nachází, v průběhu několika hodin.

zlepšuje zobrazení v němž se trombóza

Claims (3)

1. Diagnostické činidlo pro detekci zvýšené hladiny fibrinolytického enzymu nebo zvýšené fibrinolytické aktivity in vivo v lidském těle nebo v těle živočicha, vyznačuj ící se tím, že obsahuje monoklonální protilátku, reagující s aktivátorem tkáňového plasminogenu t-PA, nebo její fragment, značenou radioaktivním izotopem ze skupiny In-111, Tc-99m, 1-131, 1-125 a 1-123, umožňujícím detekci vazby monoklonální protilátky na T-PA in vivo.

2. Diagnostické se tím, tivní t-PA.

Diagnostické se tím, tilátku nebo činidlo podle nároku 1, vyznačující že obsahuje jako fibrinolytický enzym t-PA na činidlo podle nároku 1, vyznačující že obsahuje jako protilátku monospecifickou projejí fragment.

4. Diagnostický přípravek podle nároků 1-3, vyznačující se tím, že obsahuje v oddělených zásobníčcích

a) monoklonální protilátku, reagující s aktivátorem tkáňového plasminogenu t-PA, nebo její fragment, značenou radioaktivním izotopem ze skupiny In-111, Tc-99m, 1-131, 1-123 a 1-125, umožňujícím detekci vazby monoklonální protilátky na T-PA in vivo,

b) aktivátor tkáňového plasminogenu t-PA, s nímž protilátka reaguje.