CZ282199A3

CZ282199A3 - Formulace tvořená stabilizovanými částicemi obsahujícími transfekční činidlo nebo činidla a nukleovou kyselinou

Info

Publication number: CZ282199A3
Application number: CZ992821A
Authority: CZ
Inventors: Jöel Crouzet; Bruno Pitard
Original assignee: Rhone-Poulenc Rorer S. A.
Priority date: 1997-02-10
Filing date: 1998-02-06
Publication date: 1999-10-13
Also published as: ES2166146T3; SK282685B6; HUP0001720A3; AU737720B2; NO993825L; BR9807563A; EP1007097B1; PT1007097E; DE69802102D1; DE69802102T2; WO1998034648A1; AU6298798A; ATE206932T1; EP1007097A1; JP2001511171A; IL130765A0; FR2759298B1; HUP0001720A1; NO993825D0; ZA981034B

Description

177122/ΗΚ

Formulace ' tvořená stabilizovanými částicemi obsahujícími / transfekčni činidlo nebo činidla a nukleovou kyselinu

Oblast techniky

Vynález se týká kombinací/ tvořených transfekčním činidlem nebo činidly a DNA, jejichž velikost částic je . stabilizována pomocí neionogenhího povrchově aktivního - činidla, a použití těchto kombinací v genové terapii.

Dosavadní stav techniky

Četná genetická onemocnění jsou způsobena chybnou expresí nebo/a abnormální expresí, tj. nedostatečnou nebo nadměrnou expresí . jedné nebo několika nukleových kyselin.. Základním úkolem genové terapie je napravit tento typ genetické abnormality expresí in vivo nebo in vitro klonovaných genů v buňce. ..

V současné době je navrženo, několik způsobu pro nitrobuněčnou dodávku· uvedeného typu genetické informace. Jedním z těchto způsobů je způsob založený na použití chemických nebo biologických vektorů. Syntetické vektory mají dvě hlavní funkce: uvedení do komplexu DNA, která má být transfekována, a podpoření jejího uchycení v buňce, jakož i jejího průchodu skrze plazmovou membránu a případně skrze obě jádrové membrány. ' Z vyvinutých syntetických vektorů jsou nejvýhodnější kationtové polymery typu polylysinu . a DEAE-dextranu nebo alternativně lipofekční činidla.

Při uyedeném typu transfekce bylo podstatného pokroku dosaženo vyvinutím technologie založené na použití kationtových transfekčních ‘činidel typu lipofekčních činidel a _; přesněji kationtových lipidů. Takto bylo prokázáno, že positivně nabitý • · ·· · katicntový \ lipid, ¹ kterým je

N-[ i-(2,3-dioleyloxy)propyl] -N,N,M-trimethylamoniumchlorid (DOTMA), spontáně interferuje ve formě liposomů nebo malých měchýřkú s DNA, která je negativně nabita, za vzniku komplexů lipid/DNA, které jsou schopné spojit se s buněčnými membránami a takto umožnit nitrobuněčnou dodávku DNA.

Na základě uvedené struktury byly později vedle produktu DOTMA vyvinuty i další kstiontové lipidy, obsahující lipofilní skupinu kombinovanou s amino-skupinou přes distanční rameno (spacer”). Jakožto příklady takových strukturuje možné zejména uvést struktury obsahující jako lipofilní 'skupinu dvě mastné kyseliny nebo cholesterolový derivát a obsahující kromě toho v případě,, že je' to žádoucí, jako amino-skupinu kvartérní amoniovóu skupinu. Jakožto zástupci této kategorie kationtových lipidů mohou-být -zejména uvedeny DOTAP, DOST nebo ChOTB. -Další sloučeniny, jakonapříklad DOSC a ChOSC, jsou charakterizovány přítomností cholinové skupiny namísto kvartérní amoniové skupiny. . . .· '

Rovněž .byla popsána další skupina lipofekčních činidel-, která, zahrnuje lipopolyaminy. Obecně se jedná o amíiřilný molekulu obsahující alespoň jednu hydrofilní polyaminovou' oblast, která je.kombinována prostřednictvím tak zv. distanční oblasti (spacer) s lipofilní oblastí. Polyaminová oblast lipopolyaminů, která je kationtově nabita, je schopna reversibilní kombinace s nukleovou. kyselinou, která je negativně nabita. Tato interakce výrazně zkompaktňuje.nukleovou kyselinu. Lipofilní oblast činí tuto' iontovou interakci necitlivou vůči vnějšímu prostředí ' 'potažením vytvořené nukleolipi-dové částice lipidovým .filmem. V tomto typu sloučenin může ' být kationtová skupina ' reprezentována

L-5-karboxysperminovým radikálem, který obsahuje čtyři amoniové skupiny, z nichž dvě jsou primárními amoníovými skupinami a dvě zbývající jsou sekundárními amoníovými skupinami., Mezi tyto sloučeniny patří DOGS a DPPESTyto lipopolyaminy .. jsou nejúčinnější pro transfekci primárních endokrinních buněk.

* · • .· • ·· • · · ··♦ '··· • · • 4 ·· .Jakožto příklady sloučenin náležejících k této posledně uvedené skupině lze zejména uvést lipopolyaminy popsané v patentových přihláškách.WO 96/17823 a WO 97/18185.

Nicméně je žádoucí zlepšit 'kvalitu těchto syntetických· vektorů· a' to zejména pokud jde o' tvorbu komplexu s nukleovou kyselinou a- stabilitu ' částic uvedených nukleolipidov.ých komplexu. Ve skutečnosti při použití konvenčních, formulací., tvořených nukleovou kyselinou a kationtovým transfekčni . činidlem, lze pozorovat častou a rychlou tvorbu agregátů; částic nukleolipidového komplexu; Re-zultující agregáty mají potom velikost, která je jen stěží .slučitelná s terapeutickou transfekcí. Jedno z řešení,. která byla až' dosud navržena za účelem eliminace' uvedeného'agregačního jevu, spočívá v tom,· že' se do formulace zavede·'kationtové'transfekčni činidlo, jakým je . například Lipofekční činidlo, .v nadměrném· množství,' t.j. v nábojovém poměru lipofekční činidlo/nukleová kyselina asi ΙΟ nebo .ještě vyšším. Kromě skutečnosti, Že takové' řešení není vždy účinné, není ..toto řešení zcela . uspokojivé . z hlediska bezpečnosti. Kationtová transfekčni činidla-,· jakými jsou lipofekční činidla · a .kationtové polymery,-' jsou totiž - sama o, sobě sloučeninami, u kterých je v případě jejich použití ve velkém .množství ·riziko, že budou relativně toxické pro buňky, dg kterých jsou tyto sloučeniny inkorporovány.

Bylo by protovelmi výhodné mít z terapeutického hlediska k dispozici formulace na bázi kationtového transfekčního činidla i a nukleové kyseliny, které by měly redukovaný nábojový poměr, a které by í přesto byly stabililní v průběhu času ve formě neagregovaných částic. Jak, již však bylo uvedeno výše,' jsou koncentrační zóny nukleová kyselína/lipofekční činidlo, . odpovídající takovým 'nábojovým, poměrům, sdruženy s nestabilním fyzikálním stavem. Velmi- rychle takto-· dochází k agregaci nukleolipidových' částic. Kromě . toho- je rovněž známo, že přítomnost soli typu NaCl, která -se konvenčně- používá ve formulacích obsahujících kationtové transfekčni činidlo a nukleovou.. kyselinu, . může indukovat při určitých koncentracích t 0· • 0 . · '·** ··:

• ·· .·· precipitaci nukleolipidových částic. Čím vyšší je takto koncentrace soli, tím větší bude koncentrační rozmezí transfekčního činidla, ve .kterém dochází k uvedené precipitaci.

.Cílem vynálezu je zlepšit hodnotu uvedených koncentračních zón komplexů kationtové transfekční činidlo/nukleová kyselina, . které jsou · výhodné z bezpečnostního hlediska vzhledem k redukovaným množstvím vektoru a také z hlediska interference .-s ostatními proteiny berouce v úvahu· jejich redukovaný náboj. Je totiž známo, že v případě, že komplexy mají relativně nízký náboj, je významně snížena i jejich interference se sérovými proteiny >in vivo. To je samozřejmě obzvláště 'výhodné v případě přenosu nukleových . kyselin in vivo (Remy/

J.S.Proč.Nati.Acad.Sci. USA 1995; 92, 1744-1748) . 0 interakci tohoto 'typu interakce . mezi sérovými- proteiny a liposomy pojednávají četné články '(Senior, J.H. a kol.., Biochim. Biophys. Acta. 1991, 1070,, 173-179;, Hernandez-Caselles, T. a kol., Molecular and cellular Biochemistry 1993, 120, 119-126;

Oku,. -N./a kol. Biochim. Biophys.· Acta 1996, 1280, ^: 149-154).

Rovněž byly publikovány údaje o aktivaci- systému komplementu komplexy na bázi DNA používanými v genové terapii. Stupeň aktivace komplementu závisí no nábojovém poměru kationt/DNA. Posledně uvedený jev se zejména uplatňuje u ' polykationtú, jakými jsou polylvsíny a liposperminy ' (například DOGS). Uvedená aktivace komplementu je méně .citlivá na nábojový poměr· v případě kvartérních amoniových sloučenin/ jakými jsou DOTAP, DC-Chol nebo DOTMA (Plank, C. a kol., Human Gene Therapy 1996,

7, 1437-1446).

Vzhledem k ' výše uvedenému by tedy bylo výhodné z terapeutického hlediska mít k dispozici formulace obsahující komplexy kationtového transfekčního činidla a nukleové kyseliny .s -vysokou koncentrací nukleových kyselin' nebo/a redukovanými'' nebo dokonce téměř neutrálním nábojovým poměrem, které jsou navíc stabilizované v’tekuté ' formě koloidního typu, tj.· kteréjsou v neagregované formě, přičemž tyto dva znaky jsou zjevně přirozeně neslučitelně.

......

• · ·· ·· ι

Podstata vynálezu

Nyní přihlašovatel s překvapením prokázal, ze přídavek neionogenního povrchově aktivního činidla k částicím komplexů ' kationto.vého transfekčního činidla nebd činidel a -nukleové kyseliny, které jsou přirozeně nestabilní,, tj.. které mají sklon, k ..rychlé tvorbě agregátů, umožňuje účinně blokovat uvedený agregační jev a tudíž stabilizovat částice 'komplexu tak, že jejich velikost jé menší nebo rovná asi '160 nm.

I .Prvním předmětem· vynálezu je 'kompozice -použitelná' pro genovou, terapií á obsahující částice komplexu kationtového transfekčního 'činidla.nebo činidel a nukleové kyseliny, jejíž podstata' spočívá v tom, že navíc obsahuje .alespoň jedno neionogenní . povrchově aktivní činidlo· v· množství,které je dostatečné ke stabilizaci veliko-stí částic menší nebo rovné 15.0 nm.

V „rámci. ' „vynálezu se stabilizovanými částicemi nebo částicemi se stabilizovanou velikostí rozumí částice, jejichž 'velikost není náchylná ke změně v průběhu času, zejména když jsou tyto částice udržovány v disperzi nebo v roztoku. Oproti konvenčním formulacím, . tj·. formulacím neobsahujícím,neionogenní povrchově aktivní činidlo,... mohou být nárokované kompozice skladovány po’ dlouhou dobu, aniž by u nich docházelo v uvedené disperzí - k jakékoliv modifikaci, _ zejména k modifikací agragačního' typu. Velikost takto stabilizovaných částic se obecně pohybuje mezi 50 a 160 nm, výhodně mezí 75 a 150 nm.

V nepřítomnosti nárokovaného neionogenního povrchově aktivního činidla' dochází' u Částic komplexu 'přítomných v •nárokované’ kompozici ké spontánní tvorbě agregátů, jejichž velikost je větší, než 160 nm. ,

Kromě toho přihlašovatel prokázal, že kompozice podle' !

vynálezu má lamelám! strukturu mající alternativně dvouvrstvy lipidů s mezilehlými vrstvami DNA.

«·· ··· ♦ ··

Neionogenní, povrchově aktivní činidlo, podle vynálezu má výhodně alespoň jeden hydrofobní segment ' a alespoň jeden . hydrofilní segment. Hydrofobní částí může být alifatický řetěz, poiyoxyalkylen, - alkylidenpolyester, polyethylenglykol s dentrítovou benzylpolyetherovou hlavou nebo cholesterol. Pokud jde o hydrofilní .část, může být touto částí poiyoxyalkylen, poíyvinylalkohol, polyvinylpyrrolidon nebo sacharid.

.Výhodně -'je povrchově aktivní' činidlo, použité v rámci vynálezu, tvořeno nebo odvozeno od neionogenního polyolu a zejména od polyoxyalkyíenu s alkylenovýmí skupinami odlišné nebo neodlišné délky nebo/a struktury v polymerů.

Výhodněji toto neionogenní povrchově aktivní činidlo odpovídá následujícímu obecnému vzorci:

HO(CH.CH.O) (CH(CH } (CE,0), (CH.CH.O) H , ve kterém a, b a c znamenají nezávisle jeden na druhém celé číslo 20.až 100. · - ‘ uvedené neionogenní povrchově aktivní činidlo je výhodně přítomné v kompozicích podle vynálezu v koncentraci mezi 0,01 a 10 % hmotn./obj., výhodně mezi 0,02 a 5 % hmotn./úbj., vztaženo na hmotnost uvedené kompozice.

Přítomnost takového neionogenního povrchově aktivního, činidla v kombinaci s uvedenými komplexy je výhodná z několika důvodů: , , V rámci vynálezu jsou kationtové transfekční činidlo nebo činidla a nukleové kyseliny přítomné v kompozici v nábojovém, poměru, který je samozřejmě příznivý pro rozvoj uvedeného agragačního jevu. To vede k tomu, ze pozitivní náboje nesené kationtóvým transfekčním činidlem nebo činidly jsou pouze v mírném přebytku vzhledem k negativním nábojům neseným nukleovou l

kyselinou v komplexu nebo nejlépe jsou s uvedenými negativními náboji v rovnováze. Takový nábojový poměř:je obzvláště výhodný ··· ··· i

z hlediska in vivo, pomněvadž je méně škodlivý pokud jde o interakci se sérovými nebo jinými proteiny, jakým je například albumin, a výhodnější z hlediska bezpečnosti. Pro ilustraci lze uvést, že tento nábojový poměr se výhodně pohybuje mezi 1 a 6 a je výhodně nižší než'4.

Navíc je- uvedené neionogenní povrchově aktivní činidlo zcela .kompatibilní s podáním in vivo. V případě formulace podle vynálezu není ve skutečnosti nezbytné odstranit toto neionogenní povrchově aktivní činidlo z ' kompozice ještě před injekcí kompozice do buněk určených k ošetření.

Konečně lze uvést, že kompozice podle vynálezu mohou ,být výhodně skladovány. Přítomnost neionogenního povrchově aktivního činidla.účinně blokuje jakýkoliv precipitační jev v uvedené kompozici. ,

Jakožto výhodné neionogenní povrchově aktivní činidlo,podle vynálezu lze obzvláště uvést sloučeninu obecného vzorce:

. HO (CH₂CH₂O) _a (CH (CH.) (CH.O)_b (CH_ŽCH_;O),_;H ·, _s ve kterém a je rovno 75, b je rovno. 30 a c je rovno 75.

Dalšími výhodnými neionogennimi povrchově aktivními činidly .jsou polyethylenglykol s dentritovou benzylpolyetherovou hlavou, polyoxyethylenalkoholv nebo polyoxyethylennonvlfenylether.

Kationtové transfekční činidlo výhodně v rámci vynálezu zahrnuje kationtové polymery a lipofekční činidla.

Pokud jde zejména o lipofekční činidla, rozumí se pod tímto označením v rámci vynálezu libovolná sloučenina nebo ' směs, mající lipidový charakter a jsoucí pozitivně nabita,· která již byla navržena jako aktivní činidlo v souvislosti, s buněčnou transfekcí nukleových kyselin.

Obecně jde o amfifilní molekuly obsahující alespoň jednu lipofilní oblast kombinovanou nebo nekombinovanou s hydrofílní oblastí.

♦ ·· ’ 8

Jakožto zástupce první -skupiny sloučenin je možné zejména navrhnout lipidové směsi schopné tvořit kationtové liposomy. Tyto formulace mohou takto obsahovat POFC, fosfatidyiserin, fosfatidylcholin, · cholesterol, lipofektamid ; ' nebo maleinimidofenvlbutyrylfosfatidylethanolámin kombinovaný s kationtovým lipidem, který byl definován výše.

V ·rámci specifického provedení vynálezu má použité lipofekční činidlo.kationtovou oblast.

Jakožto příklad tohoto typu .kationtových lipidů konstruovaných . na základě strukturního modelu: lipofilní skupina kombinovaná s amino-skupinou přes tak zvané distanční rameno (· spacer) lze zejména uvést . produkt^ DOTMA a rovněž kationtové lipidy, které jako lipofilní skupinu obsahují dvě mastné kyseliny nebo cholesterolové deriváty, a které navíc obsahují v případě, · že je 'to žádoucí,'· jako. amino-skupínu kvartérní -amoniovou skupinu. Jakožto zástupci této kategorie kationtových lipidů lze zejména uvést lipidy DOTAP, DOBT. nebo ChQTB. Jiné sloučeniny, jakými jsou například DOSC a ChuSC·, jsou·¹ charakterizovány přítomností cholinové skupiny·, namísto .kvartérní amoniové skupiny. Výhodně mohou být 'také lipofekční .činidla vhodná pro použití v rámci vynálezu zvolena ž lipopolyaminů, jejichž polyaminová oblast odpovídá obecnému vzorci:

*

H₂N-(-(CH)_ra-NK-)_n-H ve kterém m znamená celé číslo větší nebo rovné 2 a n znamená celé číslo větší nebo rovné 1, přičemž je možné, že se m mění v případě různých ¹ uhlíkatých skupin mezi dvěma aminovými skupinami, přičemž tato’polyaminová oblast je kovalentně vázána s lipofilní.oblastí nasyceného nebo nenasyceného uhlovodíkového řetězce cholesterolového typu nebo s přírodním nebo syntetickým lipidem schopným tvořit lámelární nebo hexagonální fáze. Tato polyaminová oblast je výhodněji reprezentována šperminem nebo • * ··· některým z jeho analogů, který si zachoval schopnost vázat nukleovou kyselinu. ,

Patentová přihláška EP 394 111 popisuje lipopolyaminy této skupiny, které jsou schopné použití v rámci vynálezu. Jakožto zástupce' těchto lipopolycminů lze zejména uvést díoktadecylamidpglycylspermin (DOGS) a palmitoylřosfatidylethanolamin-5-karboxyspermylamid (DPPES).

V rámci vynálezu, mohou být rovněž použity, lipopolyaminy popsané v patentové přihlášce WO 96/17323. Tyto lipopolyaminy mají obecný vzorec:

f ve kterénrR. znamená skupinu

přičemž X a X' znamenají nezávisle jeden na druhém atom kyslíku, methylenovou skupinu -GH_z)_q, kde q^: znamená 0,1, 2 nebo 3, nebo araino-skupinu -ΝΉ- nebo -NR'-, kde R' znamená alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, Y a Ύ' znamenají nezávisle jeden na- druhém methylenovou skupinu, karbonylovou skupinu nebo skupinu C=S, R,, R, a R₅, znamenají nezávisle jeden na. druhém atom vodíku- nebo substituovanou nebo nesubstituovanou alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové' atomy, p se může .měnit mezi 0 a 5, Ř₆ znamená cholesterolový ·«· ··*··’ · · • * * * *· ·· ♦ · ·· kde R, a R_z.

i nenasvcenóu, ··♦ *·· ¹⁰

Ί derivát nebo dialkylamino-skupinu vzorce -NR_:R_Z, znamenají nezávisle jeden na druhém nasycenou neb přímou nebo rozvětvenou alifatickou skupinu obsahující 12 až 22 uhlíkových atomu. , ‘ z

Jakožto zástupci těchto lipopolyaminů zde mohou být zejména uvedeny 2,5-bís(3-aminopropylamino)pentyí(dioktadecylkarbamoylmethoxy)acetát a 1,3-bis(3-aminopropylamino)-2propyl(dioktadecylkarbamoylmethoxy)acetát.

Konečně nové .lipopolyaminy, jejichž hodnota' může být zlepšena v’ rámci vynálezu,· byly nedávno popsány .v patentové přihlášce WO 97/18185. Tyto sloučeniny mají obecný vzorec:

RI

R2

R4 ve kterém R., R,,a R, znamenají nezávisle jeden na druhém atom vodíku nebo skupinu . - (CH,)--NRR', kde q se může měnit mezi 1, 2, 3, '4,. 5 a 6' a to nezávisle mezi různými skupinami R,, R₂ a R,, a R a R' znamenají,- nezávisle jeden na druhém atom vodíku nebo skupinu - (CH_Z) _q.-NH₂, .'kde q'se může měnit mezi 1, 2, 3, 4, 5. a 6 a to nezávisle mezi různými skupinami R a R', m, nap znamenají nezávisle jeden na druhém celé číslo, které se může měnit mezi Q,a 6,-' přičemž když n je větší než 1, m může mít různé hodnoty a R₃ může mít různé významy v rámci uvedeného obecného vzorce, á R, znamená skupinu obecného vzorce

444 * ·♦ η

• ♦ · « · • 4 ·· «· ·· ve kterém R, a R₇ znamenají 'nezávisle jeden na druhém atom vodíku nebe nasycenou nebo nenasycenou alifatickou skupinu obsahující 10 až 22 uhlíkových atomů, přičemž alespoň- jeden z uvedených dvou obecných symbolů má význam jiný .než atom vodíku, u znamená celé číslo .mezi 0 a 10, přičemž když je u větší než 1, mohou mít R₅,. X, Y a r různé významy v rámci různých jednotek [ X- (CKR_) ,-Y] , X znamená atom kyslíku nebo atom síry nebo aminovou skupinu, která je nebo není monoalkylována, Y znamená karbonylovou skupinu nebo methylenovou skupinu, R₅znamená atom vodíku nebo boční řetězec přírodní aminokyseliny, který je případně substituován, a r znamená celé číslo 1 až 10, přičemž když r je rovné’ 1, R- znamená substituovaný nebo nesubstituovaný boční řetězec přírodní aminokyseliny a když r je větší než 1, R₅ znamená atom vodíku.

Jakožto- .-příklady těchto lipopolyaminů lze zejména uvést následující lipopolyamiriy:

{HjN (CH;) 3} ₂N {CH,) .M [ (CH,) ,NH,} (CH₂) ₃ttKCH₂COGlyN [ (CH,) ₁₇CK₃ ]ý H,N (CH₂j ₃NH (CH₃) ₄NH (CH,) ₃NH.CH₂COGlyN'[-(CH₂) _L7CK₃],

H,N GCH₂). ,NH {CH₂) ₄NH (CH₂) ₃NHCH₂COArgN ( (CH₂), ₇CH₃ ] ₂.

Obzvláště výhodně lze v rámci vynálezu použít lipofektamin, dioktadecylamidoglycylspermin , (DOGS), palmitoylfosfatidylethanolamin-5-karboxyspermylamid (DPPES), ,2,5-bis (3-áminopropylamino) pentyl- (dioktadecylkarbamoylmethoxy)acetát, 1, 3-bis (3-aminopropylaminq)..-2-propýl (dioktadecylkarbamoylmethoxy)ačetát a ' ’ .

' {H₂N(CH₂)₃},N(CH,)<N{ (CH₂)₃NH,} (CH,)₃NHCH₂COGlyN[ (CH₂) ₁₇CH₃J₂,

H₂N(CH₂)₃NH(CH₂).NH(CH₃)₃NHCHjCOGlyN[ (CH₂)₁₇CH₃]₂,

-H₂N(CH₂)₃NH(CH₂)_ťNH{CH₂),NHCH₂COArgN[ (CH₂)₁₇CH₃]₂.

··♦ »· * * * ♦ · »

»» ··* , · * ^β• · ·· ··· «

• 4

Rovněž mohou být takto použity kationtové lipidy obsahující

I jednu nebo několik guanidiniových nebo/a amídíniových skupin, jakými jsou zejména kationtové lipidy popsané J.M. Lehn-ěm a kol. (Proč.Nati.Acad.Sci.USA, 1996,93,9682-9'685) . ''·

Katíontovým polymerem, který může být v . rámci vynálezu použit ' jako- kationtové tra.nsfekční činidlo, je výhodně sloučenina' následujícího obecného vzorce I.

—N-(CH₇) ^ί

I ^á n . R (I) ve kterém R znamená atom vodíku nebo skupinu obecného vzorce

ve kterém n. je celé číslo 2 až- 10 a p a q· jsou· celá čísla, přičemž součet p+q má takovou hodnotu, že střední molekulová hmotnost polymeru se pohybuje mezi 100 a 10' Da.' •Je třeba- uvést, že hodnota n . se v obecném, vzorci I může měnit v rámci různých jednotek p. Takto', obecný vzorec I zahrnuje jak homopolymery, tak i heteropolymery.

'* · ’ v

Výhodněji v obecném vzorci n znamená 2 až. 5. Velmi, výhodné vlastnosti vykazují zejména polymery, polýethyleniminu (PEI) a polypropyleniminu (PPI).' Výhodnými polymery > pro provádění vynálezu jsou polymery, jejichž molekulová hmotnost se pohybuje mezi 10³ a 5 x 10\ Jakožto příklady takových polymerů'je možné uvést polyethylenimin se střední molekulovou hmotností 50 000 Da (PEI5QK), polyethylenimin se střední molekulovou hmotností 22 000 Da (PEI22K) nebo polyethylenimin se střední molekulovou hmotností 800 000 Da (PEI800K)-.

··· 4 4 • 4 4

4 ·

4 · · · 4 • · ·· 44 4 4 ·

Polymery ΡΞΙ50Κ, ΡΞΙ22Κ a PEI800K jsou komerčně dostupné. Pokud jde o .ostatní polymery obecného vzorce I, mohou být tyto polymery připraveny způsobem popsaným v patentové přihlášce. FR· 94/08735. '

V kompozicích podle.vynálezu může být nukleovou kyselinou, která je v komplexu s kationtovým transřekčním. činidlem, jak deoxyribonukleová kyselina tak i ribonukleová kyselina. ,Tyto kyseliny mohou být tvořeny sékvenc.emi přírodního nebo umělého původu, přičemž se zejména jedná o genomovou DNÁ, cDNA, mRNA, tRNA, rRNA a o modifikované nebo nemodifikované hybridní .sekvence nebo syntetické nebo sémisyntetické sekvence olígonukleotidů·. Uvedené'nukleové kyseliny mohou být lidského, zvířecího, rostlinného, bakteriálního, nebo virálního původu. Mohou. být získány libovolnou 'o .sobě známou technkou a zejména vytříděním z bank.

chemickou syntézou nebo 'alternativně . směsnými postupy zahrnujícími .chemickou a enzymatickou' modifikaci sekvencí získanýchvytříděním z bank. Tyto sekvence mohou být chemicky modifikované. ' :

Pokud jde jmenovitě o deoxyribonukleová kyseliny, mohou být tyto kyseliny jedno- nebo dvouvláknové nebo se může jednat o krátké olígonukleotidy nebo o delší sekvence. . Tyto deoxyribonukleové kyseliny mohou nést ‘terapeutické geny, sekvence pro regulaci přepisu nebo replikace, modifíkováné nebo .nemodifikované antimediátorové sekvence, oblasti pro vázání' k jiným buněčným složkám 'a podobně.

V rámci vynálezu se pod pojmem terapeutický gen rozumí zejména, libovolný gen kódující proteinový produkt mající terapeutický účinek. Takto kódovaným proteinovým produktem může být protein, peptid a podobně. Tento proteinový produkt může být homologní ' s cílovou buňkou (což znamená, že se jedná o produkt,, který je normálně exprimován v cílové buňce v případě, kdy tato cílová buňka nevykazuje žádnou patologii). V tomto případě umožňuje exprese proteinu kompenzovat v cílové buňce nedostatečnou expresi proteinu, který .je inakt.ivní nebo omezeně

4

-- v · « « ♦ * · 4 4 4 * 4 »4444 44 • 4 4 4 4 4 « 4 « · • 4 4

444 44 aktivní v důsledku modifikace, nebo nadměrnou expresi uvedeného proteinu, uvedený terapeuticky gen může rovněž kódovat mutant buněčného proteinu mající zvýšenou stabilitu, modifikovanou aktivitu a podobně. Uvedený proteinový produkt může být rovněž heteroiogní s cílovou buňkou: V_Mtomto případě múze exprimovaný protein například posilovat nebo poskytovat aktivitu, která je v cílové . buňce nedostatečná, čímž jí umožňuje bojovat s patologií nebo stimulovat imunitní,·odezvu.

Jakožto příklady terapeutických produktů použitelných v rámci vynálezu lze uvést zejména enzymy, krevní deriváty, hormony, lymfokiny: interleukiny, interferony, TNF a podobně {FR 9.2/03-120), růstové, faktory, neurotransmitory nebo jejich prekurzor-y nebo syntézní enzymy, trofinové faktory: BDNF, CNTF, NC-F, IGF, GMF,. aFC-F, bFGF, NT33, NT5, HARP/pleiotrofin a podobně, dvstrofin nebo minidystrofin (FR 91/11947)/ protein CFTR sdružený s dystickou fibrosou, 'nádorové ' supresní geny: p53,Rb, RaplA, DCC, k-rěv a podobně (FR 93/Ό4745), geny kódující faktory, uplatňující- se .při koagulaci: faktory VII, vili _a ix, geny uplatňující se při nápravě DNA, .sebevražedné geny (thymidin-kináza, citosin-deamináza), geny pro hemoglobin nebo jiné nosičové proteiny, .geny odpovídající proteinům uplatňujícím se při metabolismu lipidů apoliproteinovéhó typu zvolené z množiny, zahrnující apolipoproteiny A-I, A-II, A-IV, 3, C-I, C-II, C-III,. D, E, F, G, H, J a apo(a), metabolické enzymy, jakými, jsou například lipoprotein-lipáza, hepatičká lipáza, lecitincholesteroiacyl-transferáza, 7-alfa-cholesterolhydrqxyláza, kyselina řosfatiddvá-fosfatáza, nebo alternativně proteiny pro přenos lipidů, jako například protein pro přenos cholestetolesterů a protein pro přenos fosfolipidú,. protein pro vázání HDD 'nebo alternativně receptor zvolený například z množiny zahrnující receptory LDL, receptory pro remnantní chylomikrony, skavenžerové receptory a podobně.

Terapeutickou nukleovou kyselinou může být rovněž gen nebo antimediátorová sekvence, . jejichž exprese v cílové buňce umožňuje regulovat expresi genů nebo přepis buněčných mRNÁ.

• • 0 *

Takové sekvence mohou být například přepsány v cílové buňce do RNA komplementárních k buněčným mRNÁ a tím blokovat jejich translaci na protein a to- v souladu s technikou popsanou v patentu E? 140 308. Terapeutické geny rovněž obsahují sekvence kódující ribozomy, které jsou schopné selektivně rozrušit cílové RNA (EP 321 201).'Jak již byío uvedeno výše, muže nukleová kyselina rovněž obsahovat jeden nebo několik genů kódujících antigenní peptid schopný generovat u člověka nebo u zvířat imunitní odezvu. V rámci tohoto specifického provedení vynález proto umožňuje buď výrobu vakcín nebo imunoterapeutické ošetření lidí nebo zvířat, namířené zejména proti mikroorganismům, virům nebo rakovině. Může se zejména jednat o antigenní peptidv, které jsou specifické pro vir Epstein-Barrové, vir HIV, vir hepatitidy B (EP .185 573), vir· pseudovztekliny, syncytiuro-tvorný vir nebo jiné viry nebo alternativně specíc.fické pro nádory (EP 259 212) .

v-Výhodně nukleová· kyselina rovněž obsahuje sekvence •umožňující expresi terapeutického genu nebo/a’ genu kódujícího antigenní peptid v buňce, nebo v požadovaném .orgánu. Může se jednat o sekvence, které jsou přirozeně zodpovědné za expresi uvažovaného genu v případě, kdy jsou takové sekvence schopné funkce v infikované buňce. Může se rovněž· jednat o sekvence různého původu (zodpovědné za 'expresi jiných proteinů nebo dokonce o syntetické sekvence). Zejména se může jednat o promotorové sekvence eukaryotických nebo- vírálních genů. Může jít například o promotorové sekvence odvozené z genomu buňky, která má být infikována. Podobně se může jednat o promotorové sekvence Odvozené z genomu viru·. V tomto Ohledu lze například uvést promotory genů E1A, MLP, CMV a RSV a podobně. Kromě toho mohou být tyto· expresní sekvence ' modifikovány přidáním aktivačních nebo regulačních sekvencí a - podobně. Uvedený promotor může být indukovatelný nebo potlačitelný.

Navíc může nukleová.kyselina rovněž obsahovat, zejména před terapeutickým, genem, 'signální sekvencí vedoucí syntetizovaný • · · · · · ·· 4 · · · * · ··· * * · ♦ « · ··· «»« · * · ···· · « ' 16 terapeutický. produkt do sekrečních cest cílové buňky. Tato signální sekveňce může být přirozenou ' signální sekvencí terapeutického produktu, i když ss může jednat i o jiné funkční signální sekvence nebo o umělé signální sekvence. Uvedená nukleová kyselina může rovněž obsahovat signální sekvenci vedoucí syntetizovaný terapeutický produkt do určité specifické oblasti buňky.

V rámci jiného provedení může nárokovaná· kompozice navíc obsahovat -přísadu . typu ' . zahrnujícího dioleylfosfatidylethanolamin. (DOPE), oleoylpalmitoylfosfa- ₍tidylethanolamin (POPE),. di-stearoyl, -palmitoyl a -myristovl-fosfatidylethanolaminy, jakož i jejich derivátykteré’ jsou 1 až . 3 krát N-methylované, fosfatidylglyceroly, di.acylglycéroly, glykosyidiacylglycerolv, cerebrosidy (zejména galaktocerebrosidy), sfingolípidy (zejména sfingomyěliny) nebo alternativně asialogangliosidy (zejména asialoGMl· a GM2j .

V 'nedávné době přihlašovatel prokázal, še je obzvláště výhodné 'použít jako .přísadu v . trahsfekčnícn kompozicích sloučeninu uplatňující se přímo nebo nepřímo při kondenzaci nukleových' kyselin. Tato sloučenina' je zcela nebo částečně tvořena' peptidovými jednotkami (KTPKKAKKP) nebo/a- (ATPAKKAA), přičemž se počet jednotek· může měnit, od-2 do 10. Takové činidlo může'být rovněž odvozeno z části histonu, nukleolinu, protaminu nebo/a některého ' z jejich derivátů (WO 96/25508). Takové sloučenina může být výhodně zabudována do nárokované kompozice.

Kompozice podle vynálezu mohou rovněž využívat jeden nebo několik usměrňovačích prvků, které umožňují zacílit núkleóvé komplexy doreceptorů nebo ligandů'nacházejících se na- povrchu buňky. -Jakožto příklad lze uvést, že kompozice podle vynálezu může obsahovat jednu nebo .několik protilátek řízených proti · molekulám na buněčném povrchu nebo alternativně jeden nebo několik .ligandů membránových .receptorů, jako například insulin, tranferrin, kyselina -listová nebo libovolný další, růstový faktor, cytokiny nebo vitaminy. Výhodně může kompozice využívat modifikované nebo nemodifikované- lektiny k zacílení

9 9

9

9 • ·

9 · • · 9 • 9 9 9 9 9

9« specifických polysacharidů na povrchu buňky nebo na sousední excracelulérní matrici. Rovněž mohou být použity proteiny s* -jednotkou RGD, cyklické nebo necyklické peptidy obsahující tandemové seskupení jednotek RGD, jakož i polylysinóvé·peptidy. Nedávno byly rovněž popsány přírodní nebo syntetické ligandové peptidy, které jsou výhodné zejména pro jejich selektivitu ke specifickým buňkám a které jsou·' schopné účinně podpořit internalizaci .v těchto buňkách (Bary a kolNátuře Medicine, 2, 1996, 299-305).·' Tato usměrňující, činidla j.sou obecně konjugována s uvažovaným kationtovým transfekčním činidlem.

Vynález se rovněž týká , způsobu přípravy nárokovaných' kompozic. Blíže specifikováno, týká se vynález způsobu'přípravy kompozice · obsahující částice komplexu kationtového transfekčního činidla nebo-činidel a -nukleové kyseliny, jejichž velikost’je stabilizována, jehož podstata spočívá v tom, že se kationťové transfekční činidlo a. nukleová kyselina uvedou do styku v přítomnosti neionogenního povrchově aktivního činidla použitého v. množství dostatečném...ke stabilizaci velikosti takto vytvořených částic nukleového komplexu rovné nebo menší než 160 nm. .

Blíže specifikováno, nejdříve se smísí jedna ze složek,' tj . nukleové kyselina nebo . kationtové' lipofekční činidlo, s neionogenním povrchově aktivním činidlem, načež se získaná směs r

uvede do styku s druhou z uvedených dvou .složek. Takto se zabrání agregačnímu jevu, ke kterému by jinak spontánně došlo v případě, kdy by nebylo přítomno neionogenná povrchově aktivní činidlo . ' . ,

Kompozice podle vynálezu mohou, být formulovány pro topičké,· dermální, perorální, rektální, vaginální, parenterální, intranasální, intravenózní, intramuskulární, subkutánní, iňtraokulární nebo transdermální anebo í jiné podání, výhodně .farmaceutické kompozice podl.e vynálezu obsahují farmaceuticky přijatelné vehikulum pro injikovatelnou formulaci, zejména pro přímou injekci„v úrovni požadovaného orgánu, nebo pro podání topickou cestou (na pokožku nebo/a' na sliznicovou· membránu).

• * · · 4 44 4 · 4 » · ··· · 4 4 4 4 4 444 *44 • ♦ 4 4 4 4 4 · » •· ·· 4· 44 44 44 ryto kompozice, mohou mít zejména formu isotonických sterilních roztoku nebo mohou,mít formu suchých Íyofilizovaných kompozic, které po přidání sterilizované vody nebo fyziologického roztoku umožňuji opětovné vytvoření injikovatelných roztoků. Dávky použité nukleové kyseliny pro injekční podání, jakož i počet podání mohou být stanoveny v závislosti na různých faktorech, mezi které zejména patří použitý způsob, podání, relevantní patologie, gen, který má být exprimován nebo požadovaná doba léčení. Dokud jde o způsob podání, může se jednat buď'o přímou 'injekci do tkání 'nebo oběhových- cest anebo' o ošetření buněk v buněčné kultuře a následnou reimplantaci: ošetřených buněk in vivo buď injekcí nebo transplantací.

Kompozice 'podle vynálezu jsou obzvláště výhodné z terapeutického’ hlediska. Pomocí těchto kompozic. bude napříště možné účinně podávat komplexy nukleových kyselin mající vhodnou velikost a redukovaný nábojový poměr, což je obzvláště prospěšné z hlediska aplikace in vivo. Při použití kompozic podle vynálezu dochází 'k výraznému omezení interakce mezi šerem a nukleovým komplexem.

V následující části popisu' bude vynález blíže 'objasněn pomocí konkrétních· příkladu jeho provedení, přičemž tyto příklady mají pouze ilustrační charakter a nikterak neomezují .vlastní rozsah vynálezu, který 'je jednoznačně'vymezen definicí patentových nároků. - ,

Stručný popis obrázků

Na připojených výkresech obr.l znázorňuje vliv -poloxalkolu na' změnu velikosti komplexů RPR -120535/DNA při -nábojovém poměřu (+/-) 2,5 v závislosti na čase, obr.2 znázorňuje .vliv poloxalkolu komplexů RPR 120531/DNA .při nábojovém závislosti na čase, na změnu velikostí poměru (+/-) 2,5 v • A A · · A A A Á • A · A · A A AA· Α·Α • · · · A A *

AA AA AA AA obr.3 znázorňuje vliv poloxalkolu na kombinace RPR 120535, obr.4 znázorňuje vliv poloxalkolu 'na aktivitu luciferázy (RLU/5pl lyzátu) komplexů RPR 120535/DNA pří nábojovém poměru ( + /-) 2,5 a ' , obr.5 v části A schematicky znázorňuje strukturu komplexů -RPR 120535/DŇA v nepřítomnosti nebo v přítomnosti poloxalkolu a v- části'S schematicky znázorňuje strukturu 'komplexů BGTC/DMA v nepřítomnosti a přítomnosti poloxalkolu.

Příklady provedeni vynálezu

Materiálv

Povrchově aktivním činidlem použitými příkladech je poloxalkol vzorce následujících

On (CH₂CH₂O).. (CH (CH.) CH,O) ,₀ (CH-CHý?) x₅’H Tato sloučenina 'je uváděna pod obchodním označením Pluronic F68 . Zásobní roztok poloxalkolu, který byl použit v následujících- příkladech, je 10% (hmoťn.'/obj .') vodným roztokem poloxalkolu.

Nukleovou kyselinou použitou k přípravě vzorků je plasmid OXL2774 popsaný v mezinárodní patentové přihlášce PCT/FR 96/01414. Tento plasmid je použit v koncentraci 0,7, mg/ml v pufru Tris/EDTA (10 mM/0,,1 raM) s pH 7,5.. ^: ,

V příkladech byly použity následující kationtové lipidy:

H₂N(CH₂) ₃NH (CH₂)₄NH(CH₂),NHCH₂CÓGlyN[ (CH,) ,-CHJ , (RPR 120535) (acetátová sůl) a

H,N(CH₂).NH(CH₂)₄NH(CH₂)₃NHCH₂COArgNÍ (CH,)'₁₇CH,] (RPR 120531) (sůl .kyse-liny trifluoroctové), přičemž oba tyto kationtové lipidy jsou popsané v mezinárodní patentové přihlášce PCT/FR 96/01774 a jsou. použity .ve formě vodného roztoku v koncentraci 5 mM po jejich solubilízaci zahříváním na teplotu 50^cC .po dobu 25 minut a následném ochlazeni'na okolní teplotu. _%

Metody .

Měření hydrodynamického, průměru se provádí z.a použití zařízení Coulter N4Pius s komůrkou z plastické hmoty (čtyři . transparentní stěny) naplněnou 800 μΐ různých roztoků, přičemž měření se provádí při teplotě 9Ό ^cC v monomodálním modu.

Měření, fluorescence se provádí v. zařízení Perkin Elmer LS50B za použití excitační a emisní vlnové délky 260 nm resp. 590 nm. Šířky štěrbiny při excitaci a emisi jsou nastavěny na 5 nm. Hodnota ' fluorescence se - zaznamená po přidání ethidiumbromidu k ' dosažení finální koncentrace 5 μς ethidiumbromidu/ml. · _κ

Experimenty metodou kryotransmisní elektronové mikroskopie (cryó-TEM) byly provedeny za použití? μΐ vzorků- obsahujících· 0,5 mg DNA/ml,· .které jsou umístěny na uhlíkem povlečené měděné 'mřížce pokryté membránou s otvory. Tyto mřížky -jsou potom ponořeny do. kapalného ethanu za účelem převedení kapalné vody do stavu sklovité vody.. Mřížka, se potom uloží do držáku vzorků .chlazeného kapalným dusíkem a vloží do- mikroskopu (Philips CM12) za účelem vizuálního pozorování.

Rentgenografické experimenty při malých úhlech 'se provádí v synchrotronu (LURE) v Orsay (Francie) na čáře D43. Připraví se vzorky mající'koncentraci 0,5 mg DNA/ml, načež se tyto vzorky odstředí. Získané pelety se uloží ' do komůrky, ve které jsouvytvořena, dvě okénka z kaptonu. Germanium-obsahující monocnromátor (reflexe 111). umožňuje selekci vlnové délky 0,138 nm. ,

Transfekce in vivo se provádí injekcí 200 μΐ roztoku obsahujícího 0,2 mg DNA/ml kombinované s kationtovým lipidovým vektorem do ocasní žíly 30-dnů starých myší. 24 hodin po „této ,

• 9 · · • * 99 · * • · 9 · 9 9 • 99 · ♦ · • · ·· ··♦ « injekcí se šetrným způsobem utratí, načež se jim vyjmou jednotlivé orgány (plíce, játra, srdce, ledviny, slezina) Tyto organy se potom desintegrují v pufru používaném pro Ivzi za použití zařízení (Jltraturax. . Takto ' získané desintegrované produkty se potom odstředí a ze supernatantu se odebere 10μ1 vzorek pro stanovení aktivity íuciferázy.

Příklad 1

Vliv poloxalkolu. na velikost komplexů RPR 120535/DNA

Plasmid .(10 pg/ml) ·. se zavede do roztoku obsahujícího .150 mM . chloridu' sodného a různé koncentrace poloxalkolu. Potom se.

.přidá •lipofekční činidlo RPR 120535 k dosažení nábojového poměru (t/-) 2,5. Následně se měří velikost komplexů fotonovou korelační spektroskopií popsanou výše v odstavci . věnovanému použitým metodám,. Výsledky jsou znázorněny ha obr.l.

Z výsledků je zřejmé, -že při nepřítomnosti poloxalkolu (□) se velikost částic mění v. průběhu několika hodin z 274 nm na nejvýše lOOOýnm. Po několika, hodinách inkubace' lze pozorovat . vznik sraženiny.' A · ’ a .,

Naopak v přítomnosti 0,1- % .poloxalkolu (+) lze pozorovat 'zmenšení velikosti částic komplexu, přičemž tato velikost 'zůstává stabilní při koncentraci 0,8 % . (O) a 1 '% .'(Δ) poloxalkolu a nemění· se .za hranici 150 nm. .

Při 'inkubaci samotného, lipofékčního činidla s 1,%·· (hmotn./obj.) poloxalkolu nedochází k vytvoření ičástic, které by byly · detekovatelné metodou kvasi-eíastické diffuse světla (Quasi-Elastic Diffusion) .· Stejně tak při inkubaci 'DNA s 1% poloxalkolu nelze detekovat tvorbu částic.

• φ

Φ a ► Φ Φ Φ > Φ Φ a φφφ φ·»

Příklad 2 .

Vliv poloxalkolu na velikost kumplexú RPR 120531/DNA

V rámci tohoto příkladu se opakuje postup popsaný v příkladu 1 s, výjimkou spočívající v tom, že se použije kationtový lipid RPR 120531. ,

Plasmid (10 μΐ) se zavede do roztoku obsahujícího 150 mM chloridu sodného s'Tužnými koncentracemi poloxalkolu. Potom se přidá RPR 120531 k dosažená nábojového poměru. (ť/-) 2,5.

Následně se měří velikost komplexů za použití fotonové korelační spektroskopie (Coulter N4Plus) .- Získané výsledky jsou znázorněny’ na obr.-2. ·,

Ze získaných výsledků je ' zřejmé, že v nepřítomnosti poloxalkolu se velikost, komplexů RPR 120531/DNA mění .v průběhu,

několika hodin z	234 nm na 590	nm,	zatímco tato velikost
zůstává stabilní poloxalkolu.	v přítomnosti	0,5	% (Δ) a	'0,9 % (0)
Příklad 3
Ko-ntroia ' stupně'	kondenzace DNA	s	lipofekčním	činidlem v

přítomnosti a nepřítomnosti poloxalkolu

V rámci tohoto příkladu se. určuje, -zda. částice získané v přítomnosti poloxalkolu jsou skutečně částice odvozené z » kombinace (kondenzace) DNA s kationtovým lipidem. Ža tímto účelem byly provedeny experimenty, při kterých byla- zavedena * sonda, která fluoreskuje v případě,· že se nachází v přítomnosti volné DNA. Míra, uvedené fluorescence 'je vysoká v případě, kdy je DNA k dispozici ve volném stavu, ale ,naopak nízká, kdy je DNA nedostupná vzhledem k tomu, že je kondenzována s kationtovým lipidem. Získané výsledky j.sou znázorněny na obr. 3.

’ - W » · 0 0 « * *0 0 0 0 0· ' · • 0 00000 00 « * ·· 000·· >

• · 0 • · 0

0·0 000

Jsou pozorovány míry fluorescence získané po kombinaci DNA s kationtovým lipidem v přítomnosti a v nepřítomnosti poloxalkolu. Především je zřejmé, že fluorescence ethidiumbromidu zavedeného do DNA není modifikována přítomností nebo nepřítomností 1 % poloxalkolu. Míry fluorescence komplexů 'kationtový lipid/DNA (nábojový poměr (+/-) 2,5) v přítomnosti nebo nepřítomnosti 1 % poloxalkolu jsou ve skutečnosti stejného : řádu.' Reziduální hodnota fluorescence ukazuje, že DNA není pro uvedenou fluorescenční sondu dostupná.

Závěrem lze tedy konstatovat, že poloxaíkohol takto nebrání tomu, .abv kombinace DNA s kationtovým lipidem proběhla normální způsobem ’

Příklad 4'

Transfekce in vitro za použití DNA nebo- RPR 120555 obsahujících 1 % poloxalkolu

V rámci tohoto příkladu je snaha určit vliv poloxalkolu v případě, že je smíšen se- samotnou DNA 'nebo se samotným kationtovým lipidem. Za tím účelem byly připraveny následující vzorky: , /

Vzorek 1; 10 pg^DNA/ml v prostředí obsahujícím 300 nM NaCl a 1 % (hmotn./obj .) poloxalkolu.. Vzorek 2: 60 μΜ RPR 120535 v prostředí obsahujícím 300 rtiM NaCl a'· .1. % poloxalkolu.

, Tyto vzorky se připravítak, že se smísí v uvedeném pořadí ' v případě vzorku 1: voda,. NaCl, DNA a poloxalkol a v .případě vzorku 2: voda, NaCl, poloxalkol. a RPR 120535 a to v množstvích uvedených v následující tabulce I.

♦ · 4 • * ♦· • · 4 • ·· 4 » « _φ • * * 4 · 4 4 4 4·« · · · · Λ

Tabulka ί

rp _Λ 4— ICOL	Η,Ο	NaCl(5 M)	DNA (0,7 mg/ml)	Poloxalkol (10 %')	RPR120535 (5 mmol)
1 (μ1>	413	³⁰	'Λ	50	0
2 (μΐ).	414	30	0	.50	, 6 ·

Biologická aktivita těchto dvou vzorků se testuje na buňkách NIH 4T'3.. Do jamek 24 jamkové plotny, se zavede vždy objem 50 μΐ vzorku..

Transfekce, se provádí v nepřítomnosti řetáiního telecího séra. Fatální telecí sérum se přidá' 2 hodiny po. .přidání komplexů.

Získané výsledky ukazují, že k přenosu genů nedochází u nekomplexované DNA v přítomnosti 1 % pol-oxalkolu a v nepřítomnosti'10% fatálního telecího séra.

Kromě toho stanovení celkových proteinů ukazuje, že zde neexistuje' zjevná toxicita.

Příklad 5

Transfekce in vitro- za , použití 120535-lipofekčního činidla s DNA koncentracemi poloxalkolu .

V rámci tohoto příkladu· je stabilizace částic poloxalkolem na roztoků komplexů RPR' stabilizovaných různými snaha vyhodnotit vliv účinnost transfekce za použití uvedených částic v přítomnosti poloxalkolu. Za tímto účelem byly připraveny vzorky obsahující různé koncentrace poloxalkolu'.

♦ · · 4 « * 444 · • 4 · » · · · 4 4 » •4* 4 · 4 » · · 444 4·« ·4 4 » . 3yly připraveríy čtyři vzorky s nábojovým poměrem. (+/-) 2,5 v prostředí obsahujícím 300 nM NaCI' a. různé koncentrace poioxalkolu (0, 0,5 %, 0,8 % a· 1 % hmotn./obj.):

vzorek 1: nábojový poměr (+/-) 2,5, 300 mM NaCI, vzorek 2: nábojový poměr (+/-) 2,5, 300 mM. NaCI a 0,5 % poioxalkolu, vzorek 3: nábojový poměr '(+/-) 2,5, 300 mM NaCI a 0,8 % poioxalkolu. a vzorek 4: nábojový poměr (+/.-) 2,5, 300 ' mM NaCI a' 1 % poioxalkolu.. .

Tyto vzorky byly připraveny míšením v následujícím pořadí: voda, NaCI, .DNA, poloxalkol'a RPR 120535 a za použití množství uvedených v následující tabulce II:'·.'

Tabulka II

Test	Η,Ο £,	NaCI (5 Μ)	DNA (0,7 mg/ml	Poloxalkol (10 %)· -	RPR120535 (5 .mmbl)
1 .(μΐ)	737	' 48	11,4'	o	4
2 (μΐ)	697 ,	48	11,4	40 .	4
3. ίμΐ)	672	48	11,4	⁶⁴	4
4 (μΐ) .	657	48	11,4	30	' '4 -

* Vzorek 1 náleží do koncentračního ' rozmezí kationtového lipidu, kde nedochází ke stabilizaci částic v-roztoku, t. zn . že částice vzájemně' vytváří agregáty a velké shluky agregátů, které mají velký hydrodynamický průměr (větší než 1000 nm), * Vzorek 2 má stejný nábojový poměr kationtový lipid/DNA jako .vzorek 1, přičemž se však tato směs připraví v přítomnosti' 0,5 % (hmotn./obj.) ' poioxalkolu; nicméně. tato koncentrace poioxalkolu je nedostatečná pro zajištění úplné stabilizace částic, (vis příklad 1: vliv neionogenního polymeru na velikost komplexů RPR 120535/DNA), * vzorky 3 a 4 jsou stabilní přičemž hydrodynamický průměr částic zůstává v. tomto případě rovný asi-150. nm.

Biologická aktivita, jednotlivých formulací se testuje na buňkách NIH 3T3. Do jamek plotny se zavede objem 50 μΐ jednotlivých vzorků (obsahujících 10 ug DNA/ml). Transfekce se provádí v nepřítomnosti fetálního telecího séra. Telecí fetální sérum se přidá 2 hodiny po přidání komplexů. 'Získaní výsledky jsou uvedeny na· obr. 4. ,

Z výsledků uvedených na obr.4 je zřejmé, že poloxalkol a to bez ohledu na jeho koncentraci nezhoršuje in vitro transfekci v buňkách NIH 3T3. Poloxalkol nemodifikuje transfekční vlastnosti komplexů RPR 120535/DNA pří nábojovém poměru '(+/-) 2,5 v nepřítomnosti fetálního telecího séra.·

Příklad 6 . ' '

Stanovení struktury komplexů RPR 120535/DNA, , BGTC/DNA ' a BGTC/DOPE/DNA stabilizovaných poloxalkolem

V rámci tohoto .pří kladu byla stanovena struktura komplexů kationtového lipidového transfekčního činidla za použití rentgenoskopie . 's malými úhly a .transmisní elektronové míkroskpie.

Obr. 5A se vztahuje ké komplexům RPR 120535/DNA. Strukturou získanou v nepřítomnosti a přítomnosti poloxalkolu je lámelární struktura,. ve které je DNA uložena mezi lipidovými dvouvrstvami, jejichž -periodičnost je ' 8 nm. Přítomnost poloxalkolu. umožňuje získat'knmpl exy s malou velikostí, zatímco· v nepřítomnosti poloxalkolu se vytvoří 'sraženinové částice, jejichž velikost je větší než 1000 nm.

Obr.5B znázorňuje struktury Získané pro kationtový lipid BGTC (popsaný v mezinárodní patentové přihlášce WO 97/31935). V tomto případě se rovněž získá v přítomnosti nebo nepřítomnosti

00 0 0 000 0

0 000 0 0 · 0 0 0 000 '00· • 0 00000 0 0 z 27 >

poioxalkoiu lamelami struktura, jejíž periodičnost je 6,5 nm. Přítomnost .poioxalkoiu rovněž umožňuje v tomto případě získat komplexy s malou .velikostí. Stejné výsledky se získají pro komplexy obsahující nebo neobsahující jako přísadu produkt COPE. '

Závěrem lze tedy uvést, že přídavek poioxalkoiu nebrání normálnímu vytvoření kombinace DNA s. kationtovým lipidem, nýbrž pouze modifikuje koloidnl stav tohoto komplexu.

Příklad 7' · ’ . ' ' I ' '

Transfekce in vivo za použití systemické. injekce komplexů kationtového lipidu s DNA stabilizovaných· poloxalkolem.

1)' RPR- 120535/DNA/F68' . ' ”, • V rámci tohoto příkladu byly srovnány·účinnosti přenosu genů po- sysíemických injekcích precipítovaných komplexů ŘPR 120535/DNA a*, stejných takových 'komplexů · stabilizovaných přidáním produktu·Plúronic F68, Níže uvedená tabulka ukazuje, že když jsou komplexy vytvořeny v nepřítomnosti produktu F68, lze pozorovat expresi pouze v plících. Naopak· v případě, kdy jsou částice komplexů koloídně stabilizovány přidáním· produktů F·' 68, zvýší , se aktivita luciferázy . σ’, jeden řád v ' plicích, přičemž expresi .lze pozorovat i v ostatních .tkáních (játra, srdce) ' ' í

φ φ φ φ • · 9 « · · · · · · * · ·«· Φ « · · · · ·** ··· • · · Φ « Φ · · * «· ·· ·· Φ* ·· ·· .

Tabulka III	28·
Lipid	R?R 120535 .
Formulace	0 % F68	10 % FS8
myši	baíbc ·'	balbc
plíce	2 ± 0,9· ⁷	14+0,9-
játra	⁰ '	2 + 3
ledviny	0 '	0
srdce	0 '	1 ±0,4

”2) BGTC/DOPE./DNA/F68 .

Experimenty shodné' s experimety, které byly popsány výše, byly provedeny za použití, jiného lipidu, kterým je v tomto případě lipid BGTC. I v tomto . případě byly získány stejné ,výsledky, a to zlepšení, přenosu genu v plících a měřitelná exprese v játrech, srdci a ledvinách.· Tyto výsledky byly získány za použití různých kmenů myší (balbc, C57B16 a C57B16, které jsou nedostatečné na Apolipoprotein E) . Je pozoruhodné, že stejné transfekční úrovně bylý získány jak pro myši C57B16, které jsou normální, tak i pro myši C57-B16, které jsou nedostatečné . na .Apolipoprotein E, a které mají velmi vysokou hladinu lipidů, tj . desetkrát .vyšší než normální myši. Vzhledem k tomu, ' že se zde používají'nevirálhí lipidové vektory, dalo by še totiž očekávat, že' tyto komolexv bv mohly být /

destabilizovány přítomností velkého množství jiných endogenních lipidů. Výsledky transfekce komplexů BGTC/DOPE/DNA in vivo provedené v nepřítomnosti nebo v přítomností poloxalkolu jsou uvedeny v následující tabulce IV: \ * * * 0 000 0 00 0 • 0 00* 0 0 0 0 * 0 000 00« • 0 0 0 « 0 0 ·

00 00 00- 0« 00

Tabulka íV

Lioid . SGTC/DOPE

Formulace	0 % E68	4 F68
Myši	balbc	balbc ,	C57B16	C57B16 KoApoE
plíce	6,712,8	^J 8 6,5165,4	220199	201112 -
játra	0 '	11,4111,5	471 26	' 47123
ledviny	o'	0,3410,16	. 1,810,9- '	2,210,1
srdce'	0	0,1411,05 i	0,7310,7	0,610,0 ’

Příklad 8

Použití jiných neionogenních povrchově aktivních činidel·

V rámci tohoto příkladu byla testována i další neionogenní povrchově aktivní činidla, kterými,, jsou polyethylenglykoldendrimer, polyoxyethylenalkohol a' polyoxyethylennonylfenyle.ther. Tato neionogenní povrchově aktivní činidla, mají . stejnou schopnost· - jako produkt F68 stabilizovat komplexy kationtový lipid/DNA. Použitým kationtóvým lipidem zde byl ' lipid RPR 120535. ,

i) Polyet-hylenglykoldendrimery'

Byl použit dendrimer obsahujíčí 1 benzylpolyetherovou hlavu generace 2, na kterou je- naroubován polyethylenglykol (PEG) .š molekulovou hmotností 5000 Da (označovaný jako SASU), a jiný dendrimer stejného. typu, který , však obsahuje 2 benzylpolyetherové- hlavy naroubované na ' PEG s molekulovou hmotností 11 000 ^:Da (označovaný jako SAS9) . Z dále zařazené tabulky IV je, zřejmé, že při použití těchto dendrimerů od • * ·

koncentrace 0,02 % (hmotn./obj.) a oři koncentracích vyšších již nedochází k vytvoření sraženin mikronové velikosti transfekčních komplexů, nýbrž dochází ke vzniku částic majících průměr rovný nebo menší než 100 nm.

2) Polyoxyethylehalkohol . Tento produkt, který je rovněž označován jako 3rij a obsahující 100 oxyethylenu v hydrofiiní části, umožňuje.získat po jedné hodině -komplexy RPR 120535/DNA mající průměr menší než 100 nm. _ . ‘ ·

3) , Poiyoxyethylennonylfenylether

Tento produkt rovněž 'umožňuje koloidně stabilizovat transfekční komplexy RPR 120535/DNA. Průměr částic uvedeného komplexu- je rovněž rovný asi 100 nm.' ...

Následující tabulka . uvádí průměr v nm komplexů 'RPR 120535/DNA majících nábojový poměr 2,75 ( + /-} a obsahujících 0,25 mg DNA/ml ve 150mM NaCl,. které jsou' stabilizovány různými neionogenními povrchově aktivními činidly.

Tabulka V

Polymer (hmotn./obj.)	0,05	o, 0	0,1 %	0,2 %
Brij 7C0	114	nm	6 9 nm	7 4 nm
SASU	152	nm	• 99 nm	71 nm
SAS 9	104	nm	8 5 nm	7 5 nm
Pólyoxyethylen-
nonylfenylether	142'	nm	132 nm	111 nm

. U. všech formulací stabilizovaných ' uvedenými různými neionogenními povrchově' aktivními činidly .byla stanovena míra' £ kondenzace DNA s kationtovým lipidem za použití fluorescenčních měření. Výsledky těchto měření ukazují, že přítomnost těchto neionogenních povrchově aktivních činidel na povrchu komplexů, kationtový lipid/DNA nemodifikují míru kondenzace DNA s kationtovými. lipidy (výsledky nejsou uvedeny)','

4 • 4 *

4-44 V ·

PATENTOVÉ ' N Á R O -K Y

1. Kompozice vhodná .pro genovou , terapii a obsahující stabilizované částice komplexů kationtoveho ' transfekčního činidla nebo činidel a nukleové kyseliny, vyz-načená tím,' že· navíc obsahuje alespoň jedno, neionogenní .povrchově aktivní činidlo v množství dostatečném, kě stabilizaci velikosti uvedených částic na hodnotě menší nebo rovné 160 nm.

2. Kompozice podle nároku 1, vyzna.čená t í' m, že kationtové ' transfekční činidlo · a nukleová . kyselina jsou i . :

přítomné v nábojovém poměru 1 a,ž· 6,

3. Kompozice’podle nároku'1 nebo 2, v y z n a č e h á tím, že kationtové transfekční Činidlo a nukleová -kyselina jsou přítomné v nábojovém poměru menším· než 4.

Kompozice podle některého z předcházejících·nároků, vyznačená tím, žé neionogenní povrchově aktivní činidlo obsahuje alespoň ·'jeden hydrofobní segment a alespoň jeden hydrofilní segment. '

5. Kompozice podle nároku 4, vyznačená t í. m, že hydrofobní segment je zvolen, z množiny - zahrnující alifatické řetězce, polyoxyalkvleny, alkylidenpolyestery, polyeťhylenglykoly s benzylpolyetherovou hlavou a- cholesterol.

6. Kompozice podle· nároku 4 nebo 5, v y z n a' č e· n á tím, že' hydrofilní segment je zvolen, z množiny zahrnující *· · «

poiyoxyalkyleny, polyvinylalkoholy, poiyvinylpyrroiidony. a sacharidy. . '

1. Kompozice podle některého .z předcházejících nároků, v y značená t 1 m, že povrchově aktivním činidlem je polyoxyalkylén obecného, vzorce:

HO (CH.CřLO) _a (CH (CKJ CH₂O) _b {CH,CH₂O) ,_;H, ve. .kterém a, ,b a c znamenají nezávisle jeden na draném · celá čísla 20. až 100. . · . ,

8. Kompozice podle některého z předcházejících'nároků, vyznačená’ t.l m, že jako .povrchově aktivní činidlo obsahuje .sloučeninu obecného vzorce:, . OH(CH₂CH₂0)_í(CH.(CHJCR₂0),(CH₂CH₂0)_cH, ve kterém a znamená celé číslo' 75> t> znamená celé číslo 30 a,,c znamená celé číslo 75.

9. Kompozice podle některého z předcházejících nároků, vy r ' značená tím, že. jako povrchově a-ktivní činidlo obsahuje' sloučeninu ze skupiny· .polyeťhylengiykolů s dentřitickou·benzylpoiyetherovou hlavou. ^; '

10. Kompozice podle některého z předcházejících, nároků, vyznačená' t. i m, že' jako povrchově' aktivní' činidlo obsahuje sloučeninu ze skupiny polyoxyethyléhalkoholů.

11. Kompozice podle některého z předcházejicích nároků, v y n a. č e n á tím, že· jako povrchově aktivní činidlo obsahuje polyoxyethylennonylfenylether.

«'»·'· 4 4 4 4 4 44 * « ·♦· 4 4 4 4 4 · 4·· ·44

4*444 4 ·

4· 4 i 4« 44 «>

12. Kompozice podle některého z předcházejících nároků, v y značená t í m, že povrchově aktivní činidlo je v kompozici přítomno v koncentraci 0,01 až 10 % hmotn./obj..

13. Kompozice podle některého z předcházejich nároků, v y·značená . t í m, že povrchově aktivní činidlo je v kompozici obsaženo v‘koncentraci 0,02 až· 5 % hmotn./obj...

. ‘ ⁴ I ·

14. Kompozice podle některého z předcházejícíchnároků, vyznačená t í m, že kationtovým transfekčním činidlem je lipofekční činidlo. .

15.. Kompozice'podle nároku 14, vyznačená tím, že . I lipofekčním činidlem je amfifilní molekula obsahující alespoň jednu lipofilní oblast sdruženou nebo nesdruženou s hydrofilní oblastí.

16. Kompozice podle nároku 1.4, vy.’znače'ná tím, že se jedná o lípidovoú směs schopnou tvořit katio-ntové liposomy. '

17. Kompozice podle nároku 14 nebo 15, vyznačená t í m,. ,že se jedná o kationtový lipid.

18. Kompozice podle' nároku 14 nebo Γ5, vyznačená t í m, že se .jedná o lipofekční činidlo obsahující, alespoň jednu polyamidovou oblast obecného vzorce:

ve kterém m znamená celé číslo větší nebo rovné 2 a n, znamená celé číslo větší, nebo rovné 1, přičemž m se může měnit v různých skupinách uhlíku mezi dvěma aminy a uvedená polyaminová oblast je kovalentně sdružena- s lipof-ilní oblastí typu nasyceného nebo nenasyceného uhlovodíkového řetězce • 9

9 9

9

9 9999 « »

99 «9 «9 99 99

- ' . . ' cholesterolu nebo přírodního nebo syntetického ‘lipidu'· schopného tvořit lamelami nebo hexagonální fáze.

19. Kompozice podle nároku 18, vyznačená tím, še polyaminová oblast je reprezentována sperminem nebo některým z jeho analogu, který si zachoval schopnost'¹ vázat nukleovou kyselinu..

20. Kompozice podle, nároku 1'4 nebo 15, · vyznačená t i m, že obsahuje lipofekční činidlo obecného vzorce:

'· ·.. .^R ·. ' vě kterém R uvádějící lipofilní oblast znamená skupinu obecného· vzorce': , '

ve kterém X a X' znamenají, nezávisle jeden na druhém atom kyslíku, methylenovou skupinu -(C'H,)_q-, kde q znamená 0, 1,. 2 nebo 3, nebo aminovou 'skupinu -NH- nebo -NR'-, kde R'znamená alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, Y a Y' znamenají nezávisle ' jeden na -druhém methylenovou skupinu, karbonylovou skupinu nebo skupinu C=S, ' R., R, a R_; Znamenají nezávisle jeden na druhém atom vodíkunebo substituovanou nebo nesubstituovano.u alkylovou skupinu obsahující 1 až .4 uhlíkové atomy, . přičemž význam p se pohybuje od 0 do -5, R_s znamená cholesterolový derivát nebo alkylamino-skupinu vzorce .-NRjR., kde Rj a R₂ znamenají, nezávisle ..jeden na druhém přímou) nebo rozvětvenou alifatickou „skupinu obsahující 12 až 22 uhlíkových φφ φ · · φ φ φφφ*

Φ φ·· a · φφ φφ φφφ φφφ

Φ ΦΦΦΦ * φ * a tomu,

Claims

21. Kompozice podle nároku 14· nebo' 15, vyznačená t í m, že obsahuje lipofekční činidlo obecného vzorce:

Rl

R3 r í í CHj)

R2

{.CHJ n ’p

R4 ve kterém R,_t, R_; a R₃ znamenají nezávisle jeden na druhém atom vodíku n-ebo skupinu - (CH_Z) _q-NRR', kde qse může'měnit od 1 do 6a t,o vzájemně'nezávisle v jednotlivých skupinách R_n, - R_z a R, a. R a R' 'znamenají ·· nezávisle jeden na druhém atom' vodíku nebo skupinu. - (CH_Z) _q.-NH_z, 'přičemž q'se může· měnit od 1 do 6 a to vzájemně nezávisle v jednotlivých skupinách R. a R', m, _n a p znamenají nezávisle .jeden na druhém celé číslo; které se může měnit od. 0 do 6, přičemž v případě,, že n je větší než 1, potom m může mít různé hodnoty a R₃ může mít různé 'významy v rámci předcházejícího obecného vzorce, a R,, znamená skupinu obecného vzorce: ' .

R5 '

I —x—r CH)— ve kterém R₆ a R. znamenají nezávisle jeden na druhém atom vodíku nebo nasycenou nebo nenasycenou alifatickou skupinu' obsahující 10 až 22 uhlíkových atomů, přičemž alespoň jedna ze skupin' R^ nebo R₇ neznamená atom' vodíku, u ^znamená celé číslo 0 až IQ, přičemž v případě, že u znamená celé -číslo větší nez 1,* potom R₅, -X, Y a r mohou mít , odlišné významy v různých • · · · «·· « · · • · *♦» · · · » . · · ··· · · · · · · « « jednotkách [ X- (CKR.) _γ-Ύ] , X znamená atom kyslíku nebo atom síry nebo aminovou skupinu, která je nebo není monoalkylována, Y znamená karbonylovou skupinu nebo methylenovou skupinu, R= znamená, atom vodíku nebo boční řetězec přírodní aminokyseliny, který je případně substituován, a r znamená celé číslo od 1 do

10, přičemž . v případě, že r je rovno 1, Λ znamená substituovaný nebo nesubstituovaný boční řetě zec přírodní aminokyseliny, a v případě, ž e r je větší než .1 . potom R₅ znamená atom vodíku. · 22., Kompozice podle některého z nároků' 14 nebo 15, v y z n a -

č e n á ' t i m, že obsahuje kationtový lipid nesoucí jednu nebo více guanídiniových nebo/a amidiniových skupin.

23. Kompozice podle některého z nároků 1 áž 13, vyznačená . tím, že katio.ntovým transfekčním činidlem je kationtový polymer. - ' '

24'. Kompozice podle nároku -23, vyznačená 'tím, že katio.ntovým polymerem je sloučenina obecného vzorce I: (I) ve- kterém' R může znamenat atom vodíku nebo skupinu obecného vzorce: , · ' f^(CH2’n-^Nl· ^Jq.

.37 *«· ♦ · ·* « · * to • Φ ·*· · * · · * φφ· «φ· « · · · · Φ ΦκΦ «φ - * ·* ·* · · toto ve kterém η znamená celé číslo 1 až 10 a p a q jsou celá čísla, přičemž platí, že součet p+q má takovou .hodnotu, že střední molekulová hmotnost polymeru se pohybuje mezi 100 a 10',.Da.

25. Kompozice podle nároku 23 nebo 24, v y z n a ,č e n á tím, že obsahuje polyethyienimin mající střední molekulovou hmotnost 50 000 Da (ΡΞΙ50Κ), polyethyienimin. mající střední molekulovou hmotnost 22 000 Da (PEI22K) nebo polyethyienimin mající střédní molekulovou hmotnost 800 000 Da (PÉI800K). .

25. Kompozice podle některého z nároků' i ažl4, vyznačená, tím, že. kationtové transfekční .činidlo je výhodně zvolenoz množiny zahrnující lipofektamin, dioktadecylaminospermin- (DOGS) , palmitoyifosfatidyethanolamin-5^k.arhoxyspermylamid . '. ' (DPPES),
2,5-bis'(3-aminopropylamino) pentyl (dioktadecylk.arbamoyimethqxy) acetát. nebo 1,3-bis (3-aminopropylamino) -2-propyl ídiokta.decylkarbamoylmethoxý) acetát, ‘ ,, { ří₂Ň (GH₂) ₃) ₂N (CH-) ₄N{{CK,) ₃NH₂} (CH,) ₃NHCH₂COG.lyN [ (CH₂) ₁₇CK₃ ],, H₂N(CH₂)₃NH(CK₂)₍NH(Cíi₂)₃NHCH₂CÓGlyN[ (CH₂)₁₇CH₃]₂·,

H₂N (CK₂) ₃NH (CHj ) ₄NH,(CH₂) ₃WHCH₂COArgN [ (CH₂}.₇CH₃ ] ₂.' r ^r ... 27. Kompozice podle,některého z předcházejících nároků, vyzná č e . n á ť .í m, . že nukleovou kyselinou 'je deoxyribonukleová kyselina.

28i Kompozice podle některého z předcházejících nároků, v y značená tím, že·nukleovpu kyselinou je ribonukleová kyselina. ...

2.9. Kompozice podle nároku 27 nebo 28, vyznačená t í m, že nukleová- kyselina je chemicky modifikována.

« 44

4 4 «

4 4 1 » »4 • 4 · >

• 444 • «4 4 ··· 444 • 4

44 ··

30. Kompozice podle některého z nároků laž 26, vyznačená t í ík, že nukleovou kyselinou je antimedíátorová nukleová kyselina . ..

31,. Kompozice podle některého z předcházejících nároků, vyznačená ti m, že nukleová 'kyselina obsahuje ' terapeutický gen.

32. Kompozice podle některého z· předcházejících nároků, vyznačená. tím, že 'navíc obsahuje přísadu· typu zahrnujícího diol.eoýlfosfatidylethanolamin (DO?E), oleoylpalmitoylfosfatidylethanolamín ‘ (POPE),; di-stearoyl-, -paimitoyl- a -myristOylřosfatidylethanolamín, jakož i jejich deriváty,'.které js-ou 1 až· 3 krát N-meťhyl'ovány, řosfatidylglycerolý, diačylglyceroly, _:glykosyldiacylglyčeroly, cerebrosidy -(jakými jsou' zejména galaktooerebrosidyj', sfingoiipidy (jakými jsou zejména sfingomyelinv) '.nebo alternativně asialog.angliósidy.

33. Kompozice podle některého z předcházejících nároků, Vyznačená tí m, že. navíc 'je v ;.ní ke kationtovému transfekčnímu činidlu.přidružen usměrňující prvek. ' .

34. Kompozice podle nároku 33, vyznačená tím, že usměrňující prvek, je zvolen z množiny zahrnující protilátky řízené proti molekulám buněčného povrchu, ligandy membránových' receptorů, jakými jsou insulin, transferrin, kyselina listová nebo jakýkoliv další růstový faktor, cytokiny. nebo vitaminy, modifikované, nebo nemodifikované lektiriy, proteiny s jednotkou'

RGD, '.cyklické nebo necvklické peptidy obsahující tandemové / . .

uspořádání jednotek . RGD, polylysinpeptidy, jakož i přírodní nebo syntetické ligandové peptidy.··

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 • 000 · 0 0* · · 0 · • 0 000 * · 0 0 * 0 000 000

00 0*0«· 0 0 • 0 00 .00 00 00 00 .39

35.,Způsob přípravy kompozice obsahující částice komplexů kationtového tranfekčního činidla nebo činidel s nukleovou kyselinou, vyznačený tím, že transfekční činidlo a nukleové kyselina -se uvedou do styku y přítomnosti množství neionogenního povrchově; aktivního- činidla, které je dostatečné ke stabilizaci velikosti takto vytvořených částic komplexů na hodnotě menší než asi 160 nm. '

. . /

35. Způsob podle nároků. 35, vyznačeny t í. m', že jedna ze složek, zvolená z množiny, zahrnující nukleovou kyselinu a lipofekční činidlo, se předběžně smísí s neionogenním povrchově aktivním činidlem, načež se k získané' směsi přidá druhá ze. složek z uvedené množiny. '

37. Způsob podle nároku 35 nebo 36, v y z n a č, e- n.ý t í m, že se jako povrchově aktivní činidlo pouzíje..povrchově, aktivní činidlo podle nároků 4 až 13.

Zastupuje:

lř.

1/5

TV ??

* 9 · • · · • · · · 9 9

Velikost komplexů (nm)

OBR • · • ·· * · ··· « ·« · • · · · · « · · «

2/5

Velikost komplexu (nm)

Čas (h)

OBR

999 · 9
3/5 '1?

Λ, t, • 99

9 9 9 9 β· 99