CZ282519B6 - Způsob získávání enzymů z proenzymů - Google Patents
Způsob získávání enzymů z proenzymů Download PDFInfo
- Publication number
- CZ282519B6 CZ282519B6 CZ93538A CZ53893A CZ282519B6 CZ 282519 B6 CZ282519 B6 CZ 282519B6 CZ 93538 A CZ93538 A CZ 93538A CZ 53893 A CZ53893 A CZ 53893A CZ 282519 B6 CZ282519 B6 CZ 282519B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- prothrombin
- thrombin
- sodium
- immobilized
- proteins
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 22
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 title claims abstract description 7
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 claims abstract description 54
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 claims abstract description 54
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 claims abstract description 54
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 claims abstract description 40
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 claims abstract description 40
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 37
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims abstract description 19
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims abstract description 17
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 12
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- -1 polyoxyethylene chains Polymers 0.000 claims description 15
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 14
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 14
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 14
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 9
- 229940009976 deoxycholate Drugs 0.000 claims description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 6
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 6
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 claims description 5
- 108060005987 Kallikrein Proteins 0.000 claims description 4
- 102000001399 Kallikrein Human genes 0.000 claims description 4
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 150000001342 alkaline earth metals Chemical class 0.000 claims description 4
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 claims description 4
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 claims description 4
- 108010003914 endoproteinase Asp-N Proteins 0.000 claims description 4
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N hydrogen thiocyanate Natural products SC#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108010051815 Glutamyl endopeptidase Proteins 0.000 claims description 3
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M Thiocyanate anion Chemical compound [S-]C#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 3
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 claims description 3
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 claims description 3
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 claims description 3
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 claims description 3
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 3
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 claims description 3
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 claims description 2
- 108010030544 Peptidyl-Lys metalloendopeptidase Proteins 0.000 claims description 2
- 229940006612 barium citrate Drugs 0.000 claims description 2
- PAVWOHWZXOQYDB-UHFFFAOYSA-H barium(2+);2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylate Chemical compound [Ba+2].[Ba+2].[Ba+2].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O.[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O PAVWOHWZXOQYDB-UHFFFAOYSA-H 0.000 claims description 2
- 239000003093 cationic surfactant Substances 0.000 claims description 2
- 239000013522 chelant Substances 0.000 claims description 2
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 claims description 2
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 claims description 2
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims 4
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims 3
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims 2
- AYJRCSIUFZENHW-UHFFFAOYSA-L barium carbonate Chemical compound [Ba+2].[O-]C([O-])=O AYJRCSIUFZENHW-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims 2
- TZCXTZWJZNENPQ-UHFFFAOYSA-L barium sulfate Chemical compound [Ba+2].[O-]S([O-])(=O)=O TZCXTZWJZNENPQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims 2
- OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L calcium sulfate Chemical compound [Ca+2].[O-]S([O-])(=O)=O OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims 2
- XBJWXHZULDTRGC-UHFFFAOYSA-N 1-(dodecylamino)ethanesulfonic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCNC(C)S(O)(=O)=O XBJWXHZULDTRGC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- SFCVVDTZXSZBHB-UHFFFAOYSA-M 1-dodecylpyrimidin-1-ium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCCCC[N+]1=CC=CN=C1 SFCVVDTZXSZBHB-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- DHNWFKDQGWAXQE-KTKRTIGZSA-N 2-[(z)-octadec-9-enoyl]oxyethanesulfonic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCCS(O)(=O)=O DHNWFKDQGWAXQE-KTKRTIGZSA-N 0.000 claims 1
- POAOYUHQDCAZBD-UHFFFAOYSA-N 2-butoxyethanol Chemical compound CCCCOCCO POAOYUHQDCAZBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- AEDQNOLIADXSBB-UHFFFAOYSA-N 3-(dodecylazaniumyl)propanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCNCCC(O)=O AEDQNOLIADXSBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N Dodecane Natural products CCCCCCCCCCCC SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims 1
- JBIROUFYLSSYDX-UHFFFAOYSA-M benzododecinium chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CC1=CC=CC=C1 JBIROUFYLSSYDX-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 claims 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 claims 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 claims 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 claims 1
- WOWHHFRSBJGXCM-UHFFFAOYSA-M cetyltrimethylammonium chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C WOWHHFRSBJGXCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 229940099352 cholate Drugs 0.000 claims 1
- BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N cholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N 0.000 claims 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 claims 1
- GVGUFUZHNYFZLC-UHFFFAOYSA-N dodecyl benzenesulfonate;sodium Chemical compound [Na].CCCCCCCCCCCCOS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 GVGUFUZHNYFZLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000002563 ionic surfactant Substances 0.000 claims 1
- 239000000463 material Substances 0.000 claims 1
- 229940083575 sodium dodecyl sulfate Drugs 0.000 claims 1
- 229940080264 sodium dodecylbenzenesulfonate Drugs 0.000 claims 1
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 claims 1
- DAJSVUQLFFJUSX-UHFFFAOYSA-M sodium;dodecane-1-sulfonate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCS([O-])(=O)=O DAJSVUQLFFJUSX-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims 1
- CUXKZYSCZCNPNX-UHFFFAOYSA-N tetradecan-1-amine;hydrobromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCC[NH3+] CUXKZYSCZCNPNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 claims 1
- HNJXPTMEWIVQQM-UHFFFAOYSA-M triethyl(hexadecyl)azanium;bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](CC)(CC)CC HNJXPTMEWIVQQM-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 abstract description 15
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 abstract description 12
- 230000007017 scission Effects 0.000 abstract description 12
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 32
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 22
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 16
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 6
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 6
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 6
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 5
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 4
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 4
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 3
- 101001018085 Lysobacter enzymogenes Lysyl endopeptidase Proteins 0.000 description 3
- 239000002156 adsorbate Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 229940043264 dodecyl sulfate Drugs 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 241000271506 Bothrops Species 0.000 description 2
- 108010088842 Fibrinolysin Proteins 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N dodecyl hydrogen sulfate Chemical compound CCCCCCCCCCCCOS(O)(=O)=O MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 229940039715 human prothrombin Drugs 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000005395 methacrylic acid group Chemical group 0.000 description 2
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 2
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 2
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 2
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RTLULCVBFCRQKI-UHFFFAOYSA-N 1-amino-4-[3-[(4,6-dichloro-1,3,5-triazin-2-yl)amino]-4-sulfoanilino]-9,10-dioxoanthracene-2-sulfonic acid Chemical compound C1=2C(=O)C3=CC=CC=C3C(=O)C=2C(N)=C(S(O)(=O)=O)C=C1NC(C=1)=CC=C(S(O)(=O)=O)C=1NC1=NC(Cl)=NC(Cl)=N1 RTLULCVBFCRQKI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KJCVRFUGPWSIIH-UHFFFAOYSA-N 1-naphthol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=CC2=C1 KJCVRFUGPWSIIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 1
- 241000238421 Arthropoda Species 0.000 description 1
- 108010065152 Coagulase Proteins 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 101000651439 Homo sapiens Prothrombin Proteins 0.000 description 1
- OWYWGLHRNBIFJP-UHFFFAOYSA-N Ipazine Chemical compound CCN(CC)C1=NC(Cl)=NC(NC(C)C)=N1 OWYWGLHRNBIFJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100038318 Kallikrein-12 Human genes 0.000 description 1
- 101710115809 Kallikrein-12 Proteins 0.000 description 1
- 241000863030 Lysobacter enzymogenes Species 0.000 description 1
- 241000272041 Naja Species 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 241000272104 Oxyuranus scutellatus scutellatus Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000194105 Paenibacillus polymyxa Species 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 102100038124 Plasminogen Human genes 0.000 description 1
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 1
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 description 1
- 241000589538 Pseudomonas fragi Species 0.000 description 1
- 101000605527 Rattus norvegicus Kallikrein-1 Proteins 0.000 description 1
- 239000012722 SDS sample buffer Substances 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 241000270295 Serpentes Species 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 101000759013 Streptomyces griseus Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 102000057032 Tissue Kallikreins Human genes 0.000 description 1
- VYWQTJWGWLKBQA-UHFFFAOYSA-N [amino(hydroxy)methylidene]azanium;chloride Chemical compound Cl.NC(N)=O VYWQTJWGWLKBQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N acrylic acid group Chemical group C(C=C)(=O)O NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920006243 acrylic copolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 108010027597 alpha-chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 230000003024 amidolytic effect Effects 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- 239000012468 concentrated sample Substances 0.000 description 1
- 108010074164 cyclohexylglycyl-alanyl-arginine-4-nitroanilide Proteins 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M potassium thiocyanate Chemical compound [K+].[S-]C#N ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 108010059339 submandibular proteinase A Proteins 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6429—Thrombin (3.4.21.5)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21005—Thrombin (3.4.21.5)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Abstract
Pro řízené omezené proteolytické štěpení proteinů, zvláště proenzymů, se provede zpracování s proteázami za přítomnosti detergentu nebo za přítomnosti chaotropní substance, s výjimkou soli aktivní při srážení. Přitom se získají enzymové popř. fragmenty. Způsob je zvláště vysvětlen na jednoduché metodě cíleného štěpení protrombinu za získání trombinu.ŕ
Description
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu řízeného, omezeného proteolytického štěpení proteinů, zejména proenzymů, pro získání enzymů popřípadě proteinových fragmentů, při kterém se protein zpracuje proteázou. Zejména se vynález týká způsobu získávání trombinu z protrombinu.
Dosavadní stav techniky
Obdobný způsob je znám z EP-A 0378798. Podle tohoto způsobu se protrombin z plasmy nebo frakce plasmy adsorbuje na pevný nosič (imobilizuje) a adsorbát se zpracuje s Ca2+ ionty. Ca2+-ionty se používají v koncentraci až 30 mM a působí spolu rovněž z plasmy pocházejícími a na nosiči adsorbovanými proteázami - odštěpení trombinu zadsorbátu. Jako pevný nosič se používá methakrylový a akrylový kopolymer.
Je dále známo, že trypsin odbourává rozpuštěný protrombin na fragmenty s nízkou molekulovou hmotností, přičemž dochází k úplné ztrátě trombinové aktivity (Biochim. Biophys. Act. 329, 221-232 (1973)); proteolytické odbourání protrombinu nekončí u trombinu a proto není tato metoda pro získání trombinu vhodná.
Všechny uvedené postupy vedou, podle použitých proteáz a podmínek zpracování, k rozdílným štěpným produktům protrombinu, které by mohly být z části použity terapeuticky (např. trombin), z části diagnosticky a k získávání specifických protilátek. Pro všechna tato použití je však potřebné, aby byly proteinové fragmenty ve vysoké čistotě, což je závislé na charakteru pracovních podmínek, protože všechny známé metody štěpení vedou ke značnému počtu fragmentů. Další nevýhoda tohoto mnohastupňového a časově náročného čistícího postupu spočívá v tom, že je provázen značnými ztrátami, snižujícími výtěžek.
Cílem vynálezu je odstranit tyto nevýhody a navrhnout zlepšený způsob získávání enzymů, popřípadě proteinových fragmentů, zpracováním proteázami, přičemž by tento způsob měl zejména být vhodný pro jednoduché získání trombinu.
Podstata vynálezu
Tohoto cíle se dosáhne tak, že se zpracování proteázou provádí za přítomnosti detergentů, definovaných jako anionické, kationické nebo neionické povrchově aktivní látky, mající alespoň jednu hydrofilní a jednu hydrofobní skupinu, nebo za přítomnosti chaotropních substancí, definovaných jako látky, které ruší trojrozměrnou strukturu vazeb vodíkovými můstky ve vodě, s výjimkou solí, aktivních při srážení.
Vynález je založen na poznatku, že proteolytického štěpení proteinů, zejména proenzymů, jako je protrombin, se úspěšně dosáhne, popřípadě se podpoří, jestliže se provádí za přítomnosti detergentů nebo za přítomnosti chaotropní substance. Ukázalo se, že způsob štěpení proteinů se liší podle druhu a koncentrace těchto látek. Tento poznatek otevírá možnost volit reakční podmínky tak, aby se tvořilo jen málo a zcela určitých proteinových fragmentů.
Výhodná varianta způsobu podle vynálezu spočívá v tom, že se zpracovává proenzym, který je imobilizován na pevném nosičovém materiálu ze skupiny zahrnující anorganické nosiče, zejména těžko rozpustné soli nebo cheláty dvojmocných kovů, výhodně kovů alkalických zemin. Tato varianta umožňuje snadnější získání odštěpených proteinových fragmentů z adsorbovaného
- 1 CZ 282519 B6 proenzyoxyethylovaný alkyfenol, parciální estery mastných kyselin C12-22 a hexitol anhydridů, polyoxyethylované deriváty parciálních esterů, získaných adicí polyoxyethylenových řetězců na neesterifikované hydroxyly, polyoxyethylenové parciální estery mastných kyselin a polyoxyethylenové ethery mastných alkoholů, nebo za přítomnosti močoviny, guanidinhydrochloridu, thiokyanátu nebo látky se stejnými chaotropními vlastnostmi s výjimkou solí aktivních při srážení, přičemž tyto látky jsou definované jako látky, které ruší trojrozměrnou strukturu vazeb vodíkovými můstky ve vodě.
Vynález je založen na poznatku, že proteolytického štěpení proteinů, zejména proenzymů, jako je protrombin, se úspěšně dosáhne, popřípadě se podpoří, jestliže se provádí za přítomnosti detergentu nebo za přítomnosti chaotropní substance. Ukázalo se, že způsob štěpení proteinů se liší podle druhu a koncentrace těchto látek. Tento poznatek otevírá možnost volit reakční podmínky tak, aby se tvořilo jen málo a zcela určitých proteinových fragmentů.
Výhodná varianta způsobu podle vynálezu spočívá v tom, že se zpracovává proenzym, který je imobilizován na pevném nosičovém materiálu ze skupiny zahrnující anorganické nosiče, zejména těžko rozpustné soli nebo cheláty dvojmocných kovů, výhodně kovů alkalických zemin. Tato varianta umožňuje snadnější získání odštěpených proteinových fragmentů z adsorbovaného proenzymů, neboť zbylá část - adsorbovaná na nosiči - může být jednoduše oddělena s nosičem od reakčniho roztoku.
Podle postupu popsaného v EP-A-0378798 se jako nosiče používají kopolymery, které však mají tu nevýhodu, že uvolňují do roztoku, obsahujícího trombin, akrylový a methakrylový monomer, které je jen obtížně možno odstranit, a tím znečišťují vyrobený farmaceutický přípravek. Takové uvolňování („leakage”) je známo pro všechny druhy organických polymemích nosičů. Ukázalo se však, že podle vynálezu provedené, cílené štěpení proenzymů, obzvláště protrombinu, se daří nejen na kopolymerech, ale i na jiných nosičích, například na těžko rozpustných solích jako je Ca3(PO4)2, CsSO.», CaCO3, BaSO4, BaCO3 nebo citrát bamatý. Soli mohou být přidány do roztoku, obsahujícího protrombin nebo také být teprve připraveny vyloučením v roztoku, obsahujícím protrombin.
Zvláštní předností dvojmocných iontů nosiče dále je, že vážou selektivně protrombin přes jeho gama-karboxylové zakončení. Protrombinové fragmenty, vznikající při proteolytickém zpracování protrombinu, nemají vzhledem k chybějícímu gama-karboxylovému zakončení, žádnou afinitu ke dvojmocným iontům, a tím k nosiči.
Jako další nosič jsou vhodné také hydroxyapatit, hydroxyapatitový gel nebo nosič pro afinitní chromatografii pro cheláty kovu v cyklu dvojmocného kationtu (např. Pharmacia Chelating SepharoseR).
Pro proteolytické štěpení proenzymů je vhodný velký počet proteáz (například chymotripsin, dispáza, endopeptidáza Arg-C, endoproteináza Lys-C, endoproteináza glu-C, endoproteináza Asp-N, faktor Xa, kallikrein, papain, pepsin, plasmin, pronasa, proteináza K, staphylokoaguláza, subtilisin, trombin, trypsin (zejména lidský, hovězí, prasečí), proteázy trypsinového typu z Arthropodů nebo mikroorganismů jako je např. Streptomyces griseus-trypsin, serin-proteázy zjedovatých hadů jako je Angkistrodon rhodostoma, Bothrops atrox, Dispholidus, Echis carinatus, Naja nigrocollis, Oxyuranus scutellatus scutellatus - mezi jinými). Výhodně používanými proteázami jsou trypsin, chymotrypsin, kallikrein, dispáza nebo endoproteinázy Glu-C, Lys-C, nebo Asp-N. Mohou být také použity rekombinantní proteázy.
Ukázalo se, že proenzym může být za přítomnosti detergentu tak cíleně štěpen, aby získávaný enzym tvořil hlavní podíl fragmentové směsi. Jako detergent je vhodný desoxycholát (DOC), který se výhodně používá a také jiné látky jako dodecylsulfát (SDS), CHAPS, deriváty
-2CZ 282519 B6 polyoxyethylenu jako Brij, Tween, Triton a Pluronic. Přítomnost detergentu usnadňuje další desorpci vzniklých proteinových fragmentů z nosiče.
Typické chaotropní substance, které se užívají ve způsobu podle vynálezu, jsou močovina, hydrochlorid guanidinu a jeho thiokyanát, avšak nejsou vhodné sole aktivní pri srážení jako například sole vápníku, které současně působí chaotropně.
Získaný supematant, který obsahuje požadovaný enzym, může být podroben dalšímu čištění. Výhodně lze pro tento účel použít gelovou permeační chromatografii nebo afinitní chromatografii. Pro získání koncentrovaných vzorků se doporučuje použití metod afinitní chromatografie. Vhodné jsou triazinafinitní chromatografícké nosiče s ligandy typu CibacronR-Blue F3GA (výrobek firmy Ciba Geigy) nebo ProcionR-Red HE-3B (výrobek firmy ICI) nebo používající barviva. Proteinové fragmenty mohou být adsorbovány přímo z desorpčního média po provedení aktivace pevnou fází na afinitní matrici (např. FractogelR TSK AF-Blue (vyrobeno firmou Měrek), Blue-SepharoseR CL-6B (vyrobeno firmou Pharmacia) vsádkově nebo ve formě balené kolony. Potom se proteinové fragmenty eluují promýváním pufrem detergentu a nakonec vysocemolámím (např. 1M) chaotropem (např. KSCN neboNEfiSCN).
Eluát může být gelovou permeační chromatografii (např. přes Sephadex G25), diafiltrací nebo dialýzou zbaven chaotropu a uveden do vhodného pufru nebo roztoku soli. Další čištění pro dosažení homogenity se může provádět známým způsobem chromatografii s reverzní fází, afinitní chromatografii nebo gelovou permeační chromatografii.
Způsob podle vynálezu je zejména vhodný pro získání čistého trombinu. Předložený vynález se proto také týká výroby farmaceutických přípravků, obsahujících trombin, přičemž se výhodná forma provedení vyznačuje tím, že
- se uvede do kontaktu roztok, obsahující protrombin, s pevným nosičem, zejména těžko rozpustnou solí nebo chelátem dvojmocného kovu, výhodně kovu alkalické zeminy, pro imobilizaci protrombinu na nosič,
- imobilizovaný protrombin se zpracuje s proteázou, zejména s trypsinem, za přítomnosti detergentu, výhodně deoxycholátu, přičemž se získá roztok, obsahující trombin, který se oddělí, přečistí a
- zpracuje na farmaceutický přípravek.
Bylo zjištěno, že se zpracováním sdetergentem dosáhne výrazného snížení virové aktivity v případě, že se použije výchozí produkt, kterým byla virem kontaminovaná plasma více dárců. Bylo v jednom případě zjištěno, že v jednom trombinovém přípravku vyrobeném podle vynálezu, nebyl prokázán žádný Vaccinia virus, i když výchozí materiál (fermentační supematant) Vaccinia virus obsahoval. Samozřejmě je možné v rámci způsobu podle vynálezu použít i přídavná opatření pro inaktivaci popřípadě přítomných infekčních agens, například zpracováním lyofilizovaného produktu zahříváním parou.
Způsob podle vynálezu pro získání trombinu se výhodně provádí následovně:
Nejprve se roztok, obsahující protrombin uvede do kontaktu s pevným nosičem, pro adsorbci protrombinu. Jako roztok, obsahující protrombin se mohou použít nejen plasma nebo frakce plasmy, ale také buněčné kultivační médium, obsahující rekombinantní protrombin. Po provedené imobilizaci se protrombin navázaný na nosič vhodně oddělí a promyje, aby se odstranily nespecificky navázané proteiny, které by mohly znečišťovat pozdější konečný produkt. Potom se imobilizovaný protrombin zpracuje za přítomnosti desoxycholátu s proteázou,
-3 CZ 282519 B6 aby se odštěpil trombin z protrombinu, přičemž se získá roztok, obsahující trombin a pevná látka, která se oddělí od roztoku. Toto se provede sedimentací nebo filtrací.
Trombin obsahující médium se může podrobit výše popsaným stupňům čištění. Výhodně se provádí afinitní chromatografie s FractogelR TSK-AF Blue (Měrek) následovaná chromatografii na Sephadexu-G25.
Potom se získaný čistý trombin obsahující roztok popřípadě zahustí ultraodstředěním nebo lyofilizací a zpracuje na farmaceutický přípravek.
Následujícími příklady je vynález blíže vysvětlen.
Příklady provedení vynálezu
Příprava imobilizovaného protrombinu.
Buněčné kultivační médium podle PCT-přihlášky WO 91/11519, které obsahuje rekombinantní lidský protrombin, se smísí s 5 g práškovaného Ca3(PO4)2 na 100 j protrombinu a lehce se míchá jednu hodinu při 4 °C. Potom se pevná fáze odstředí při 5000 g, získaná peleta se resuspenduje ve 40 ml 2 mM tris/HCl-pufru (pH 7,4), 10 min. se míchá a znovu se odstředí při 5000 g. Tento postup se opakuje se 40 ml 5 % (hmotn./obj.) síranu amonného v uvedeném pufru a nakonec znovu se 40 ml čistého pufru .
Stejným způsobem se může zpracovat jako výchozí materiál, obsahující protrombin např. částečný protrombinový komplex, také směs faktorů II, IX a X, pro přípravu imobilizovaného protrombinu.
Příklad 1
Vliv reakčního prostředí na tryptické štěpení imobilizovaného protrombinu.
Pro stanovení vlivu chaotropních substancí a detergentů na tryptické štěpení protrombinu, se nejprve připraví čtyři roztoky (A - D) tris/HCl-pufru (20 mM, pH 8,3) s následujícími přísadami (čtvrtý roztok (D) slouží jako srovnávací):
roztok A: močovina (0,5 M) roztok B: Na-desoxycholát (0,05 M) roztok C: Na-dodecylsulfát (0,05 M) roztok D: žádná přísada ml roztoků A - D se potom přidají ke 200 mg, pufrem zvlhčené, promyté peletě (vyrobena jak je popsáno výše) a třepe se s 20 μΐ 20 mM tris/HCl pufru, obsahujícího 1 mg trypsinu/ml při teplotě místnosti. Po 1, 2 a 3 hodinách se odeberou vzorky suspenzí, pevná fáze se odstředí a supematant se analyzuje pomocí Immun-Westem-Blot na složení fragmentů.
V tabulce 1 jsou integrály plochy píků pruhů fragmentů při 12, 19, 23, 25,5, 33, 35 a 44 kD po densitometrickém měření Immun-Wester-Blot. Je zřejmé, že v závislosti na zvoleném reakčním prostředí je možno prokázat různé velké tryptické fragmenty v rozdílných množstvích. Na rozdíl ke 3-hodinové inkubaci v čistém tris-pufru (roztok D), zůstávají ve všech ostatních roztocích (A-C) fragmenty v rozsahu molekulové hmotnosti nad 30 kD. Fragmenty 33 kD a 35 kD odpovídají trombinu, přičemž 33 kD je přiřazen aktivní formě.
-4CZ 282519 B6
Za přítomnosti desoxycholátu (roztok B) se aktivní trombin tvoří jako hlavní fragment, který také po 3hodinovém zpracování trypsinem není odbouráván na menší oligopeptidy.
Tabulka 1
| Molekulová hmotnost (kD) | 12 | 19 | 23 integi | 25,5 ál plochy | 33 píků | 35 | 44 | |
| roztok | reakční čas (h) | |||||||
| 1 | 26 | 19 | 22 | 14 | 94 | 95 | ||
| A | 2 | 22 | 20 | 13 | 54 | 20 | ||
| 3 | 24 | 27 | 14 | 51 | 17 | |||
| 1 | 31 | 165 | 90 | |||||
| B | 2 | 15 | 175 | 25 | ||||
| 3 | 18 | 170 | ||||||
| C | 1 | 53 | 11 | |||||
| 2 | 35 | 2 | ||||||
| 3 | 9 | |||||||
| 1 | 25 | 132 | 117 | 22 | ||||
| D | 2 | 25 | 120 | 34 | ||||
| 3 | 42 | 129 |
Příklad 2
Štěpení imobilizovaného protrombinu pomocí různých proteáz (za přítomnosti detergentu).
Z protrombin obsahujícího buněčného kultivačního média byl, jak je dříve popsáno, adsorbován protrombin na Ca3(PO4)2 a promyt.
vzorků po 250 mg pufrem zvlhčeného adsorbátu se suspenduje v 1 ml 20 mM tris/HCl pufru, pH 8,3, kteiý obsahuje 200 mM Na-desoxycholátu a smísí se s 50 ml následujících osmi roztoků enzymu:
* kallikrein z pankreatu vepře, 250 j/ml ve 20 mM TBS, pH 8,3 * dispáza I z Bacillus polymyxa, 1 mg/ml ve 20 mM TBS, pH 8,3 * -chymotrypsin z hovězího pankreatu, 350 j/ml ve 20 mM TBS, pH 8,3 * trypsin z vepřového pankreatu, 0,76 mg/ml ve 20 mM TBS, pH 8,3 * endoproteináza Glu-C ze Staphylococcus aureus V8,1 mg/ml ve 20 mM TBS, pH 8,3 * endoproteináza Lys-C z Lysobacter enzymogenes, 0,1 mg/ml ve 20 mM TBS, pH 8,3 * endoproteináza Asp-N z Pseudomonas fragi, 0,04 mg/ml ve 20 mM TBS, pH 8,3 * faktor Xa, lidský, 20 j/ml
-5CZ 282519 B6
Označení 20 mM TBS (TBS = tri pufrovaný salinický roztok) se vztahuje na 20 mM tris-HClpufr (pH 8,3), který obsahuje 0,9 % NaCl.
Pokusy se inkubují dvě hodiny, v případě kallikreinu 20 hodin, při teplotě místnosti za třepání. 5 Potom se smísí vzorky zjednotlivých pokusů se SDS-pufrem pro vzorky (1 : 1) a pomocí Immun-Wester-Blot analýzy se zkoumá složení fragmentů.
Integrály plochy píků fragmentových pruhů 12, 18, 19, 20, 23, 33, 34, 35, 44, 47, 50, 52, 54, 55, 71 a 75 kD jsou po měření denzitometrické Immun-Westem-Blot uvedeny v tabulce 2.
Je zřejmé, že pomocí uvedených proteáz je možno získat řadu fragmentů v oblasti molekulové hmotnosti 12 až 71 kD. Fragment (33 kD), odpovídající aktivnímu trombinu se získá tryptickým odbouráním protrombinu ve zvláště vysokém výtěžku.
Molekulová hmotnost 12 18 19 20 23 33 34 35 44 47 50 52 54 55 71 75 ((kD)
Proteáza integrál plochy píků:
| kallikrein | 12 31 | 15 16 | 16 | 59 | ||||
| dispáza | 36 | 27 | 8 39 | |||||
| a-chymotrypsin | 7 | 57 | 9 | 18 44 | ||||
| tripsin | 20 | 14 56 | ||||||
| endoproteináza Glu-C | 13 28 | 39 | 17 | 13 | 17 | 78 | ||
| endoproteináza Lys-C | 6 | 51 | 21 | |||||
| endoproteináza Asp-N | 21 | 83 | 11 | 11 | 19 | |||
| faktor Xa | 12 10 | 31 | 98 |
Příklad 3
Štěpení imobilizovaného protrombinu za přítomnosti desoxycholátu v různých koncentracích.
Jak bylo popsáno dříve, nejprve se adsorbuje rekombinantní protrombin z fermentačního média na Ca3(PO4)2.
5 vzorků vždy 0,6 g vlhkého adsorbátu se za třepání při teplotě místnosti inkubuje vždy se 3 ml mM tris/HCl-pufru, pH 8,3, který obsahuje Na-desoxycholát v koncentracích 50 mM, 100 mM, 250 mM, 350 mM a 500 mM, po přídavku 60 μΐ roztoku o koncentraci 0,76 mg/ml trypsinu. Potom se zkouší jeho trombinová aktivita proti 0,9 % NaCl přepufrovaným vzorkům. Stanoví se přitom trombinový čas ve srážecím testu s normální plasmou jakož i amidolytická aktivita s chromogenním substrátem TH-1 (2 AcOH.H-D-CHG-Ala-Arg-p-nitroanilid) fotometricky proti mezinárodnímu trombinovému standardu (obr. 1) - Obr. ukazuje, že výtěžek aktivního trombinu (33 kd-fragment) při 350 mM desoxycholátu vykazuje maximum.
Dále bylo zjištěno, že se vytvořený trombin přes přítomnost trypsinu dále neodbourává po dobu 35 nejméně 20 hodin.
Čištění proteinových fragmentů štěpeného protrombinu.
1,5 ml protrombinové fragmenty obsahujícího, z příkladu 3 odebraného roztoku (350 mM DOC) se adsorbuje s 0,1% kyselinou trifluoroctovou vH2O (eluční činidlo A) na HPLC-sloupec s reverzní fází (Nucleosil 100-5C18, 125 x 4 mm (průtoková rychlost 1,7 ml/min.). Potom se eluuje 0,1% kyselinou trifluoroctovou v acetonitrilu (eluční činidlo B) s lineárním gradientem 30
-6II až 70% B za 30 min. při průtokové rychlosti 1,7 ml/min. Detekcí při 220 nm je možno identifikovat 6 hlavních píků (retenční časy: 10,01 min., 11,96 min., 12,68 min., 13,47 min., 13,94 min., 14,47 min.), tyto frakce byly odděleně shromážděny a lyofilizovány. Další analýza jednotlivých fragmentů se prováděla pomocí SDS-PAGE s detekcí vybarvení Coomassie, jakož i prostřednictvím Immun-Westem-Blot s polyklonálním králičí—anti—lidský protrombin antisérem. Molekulové hmotnosti fragmentů byly stanoveny pro šest hlavních píků 9 kD, 16 kD, 21 kD,23kD, 12kDa33kD.
Příklad 4
Získání trombinu
K. pufrem zvlhčené peletě (asi 10 g) se přidá 50 ml roztoku 0,76 mg vepřového trypsinu (Sigma T—0134) na ml ve 20 mM tris/HCl-pufru (pH 8,3), který obsahuje 200 mM Na-desoxycholát a 1 hodinu se inkubuje při teplotě místnosti za lehkého míchání. Potom se Ca-fosfát oddělí odstředěním. Supematant obsahuje v první řadě trombin, vedle některých malých jiných fragmentů protrombinu.
Pro čištění supematantu se připraví kolona o průměru 8 cm2 naplněná FractogelemR TSKAF Blue (Měrek) do výše 12 mm (objem gelu asi 9,6 ml) ve 20 mM tris/HCl-pufru a promyje se tímtéž pufrem. Tento a všechny následující kroky se provádějí při 4 °C.
Supematant, obsahující trombin (asi 50 ml) se čerpá kadsorbci průtokovou rychlostí 2 ml/min přes gel. Potom se eluují nespecificky vázané protrombinové fragmenty pomocí 20 ml 0,5 M roztoku NaCl, 40 ml 1,0 M roztoku NaCl a 20 ml tris/HCl-pufru (pH 7,4) při průtokové rychlosti 6 ml/min. Při obráceném průtoku 1 ml/min. se eluují jen protrombinové fragmenty 20 mM tris/HCl-pufrem, který obsahuje 1 M K.SCN. Eluát se měří průtokovou buňkou při 280 nm fotometricky, celkem se shromáždí 15 ml.
Obsah proteinu v eluátu činí podle Bradforda 188 mg/ml. Obr. 2 představuje složení fragmentů (denzitometrická Immun-Westem-Blot-analýza) s dominantním 33 kD-fragmentem (aktivní trombin). Na trombin připadá asi 30 %, vztaženo na obsah proteinů. Podle stanovení trombinového času by mohl trombin mít specifickou aktivitu asi 2200 m.j./mg proteinu. Tryptickou aktivací pevné fáze by mohlo být z 1 m.j. protrombinu získáno asi 100 m.j. trombinu.
Získaný roztok, obsahující trombin může být známým způsobem dále přečištěn, koncentrován a dále zpracováván na farmaceutický přípravek.
Příklad 5
Štěpení rozpuštěného protrombinu.
Dva vzorky vždy po 1 ml protrombin obsahujícího fermentačního média se smísí vždy s 1 ml 40 mM tris/HCl-pufru, pH 8,3, který obsahuje 0,1 M Na-desoxycholátu tak, aby koncentrace detergentu v roztoku činidla 0,05 M. Pro srovnání se smísí třetí vzorek 1 ml protrombinobsahujícího fermentačního média se 40 mM tris/HCl-pufru bez detergentu. Po přídavku vždy 15 ml roztoku l mg trypsinu/ml ve 20 mM tris/HCl-pufru, pH 8,3, který obsahuje 0,9 % NaCl, se provede inkubace za třepání při teplotě místnosti 4 hodiny.
Příklad 6
Štěpení rozpuštěného protrombinu
Dva vzorky, obsahující vždy 1 ml protrombin obsahujícího fermentačního média se smísí vždy s 1 ml 40 mM tris/HCl-pufru, pH 8,3, který obsahuje 0,1 M Na-desoxycholátu popř. 0,1 M Nadodecylsulfátu tak, aby koncentrace detergentu v roztoku činila 0,05 M. Pro srovnání se připraví třetí vzorek 1 ml protrombin obsahujícího fermentačního média se 40 mM tris/HCl-pufru bez detergentu. Po přídavku vždy 15 ml roztoku 1 mg trypsinu/ml ve 20 mM tris/HCl-pufru, pH 8,3, který obsahuje 0,9 % NaCl se provede inkubace za třepání při teplotě místnosti po 4 hodiny.
Po 1, 2, 3, a 4 hodinách se vždy alikvotní podíl vzorku zředí 50 μΐ Laemmli-pufru (1 : 1), povaří a elektroforeticky analyzuje. Immun-Westem-Blot 12% SDS-polyakrylamidového gelu (1. protilátka: anti-lidský-faktor II-králičí-sérum, 2. protilátka: kozí-anti-králičí-IgG-peroxidáza-konjugát, vyvíjení pomocí 4-chlor-l-naftolu) se denzitometricky zkoumá pro kvantifikaci fragmentů. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 3.
Tabulka 3
| Molekulová hmotnost (kD) | 19 | 25,5 | 33 | 35 | |
| přídavek | reakční čas(h) | integrál plochy píku | |||
| 1 | 10 | ||||
| desoxycholát | 2 | 9 | |||
| 3 | 7 | ||||
| 4 | 6 | ||||
| dodecylsulfát | 1 | 8 | 68 | ||
| 2 | 6 | 67 | |||
| 3 | 5 | 69 | |||
| 4 | 4 | 67 | |||
| žádný | 1 | 4 | 9 | 4 | |
| 2 | 3 | 1 | 0 | ||
| 3 | 0 | 0 | 0 | ||
| Ačkoliv způsob | podle vynálezu | je popsán | na jednotlivých | příkladech | získání trombinu |
z protrombinu, je odborníkovi zřejmé, že by bylo možno provést podobné štěpení jiných proenzymů než je protrombin analogickým způsobem. Například by bylo možno tímto způsobem získat plasmin z plasminogenu popř. aktivované faktory srážení krve z jejich proenzymů.
Claims (4)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob řízeného, omezeného proteolytického štěpení proteinů, zejména proenzymů, pro získání enzymů, popřípadě proteinových fragmentů, obzvláště trombinu, zpracováním proteázami, vyznačující se tím, že se zpracování proteinů proteázami provádí za přítomnosti detergentu, zvoleného ze skupiny zahrnující zanionických tenzidů sulfatovaný oxyethylovaný alkylfenol, sulfatovaný Iauryletheralkohol, dodecylbenzensulfonát sodný, 2-sulfoethyloleát sodný, N-methyl-N-oleylethanolsulfonát sodný, dodecylsulfát sodný, cholát-8II sodný, deoxycholát sodný, dodecylsulfonát sodný a dodecyl-N-sarconisát sodný; z kationických tenzidů dodecyldimethylbenzylamoniumchlorid, oxyethylované aminy, cetyltriethylamoniumbromid, tetradecylamoniumbromid, dodecylpyrimidiniumchlorid a hexadecyltrimethylamoniumchlorid; z amfolytických tenzidů dodecyl-p-alanin, kyselinu N-dodecylaminoethansulfonovou, palmitoyllysolecitin a dodecyl-N-betain a z neionických tenzidů kondensáty ethylenoxidu a propylenoxidu, oxyethylovaný alkylfenol, parciální estery mastných kyselin C12.22 a hexitol anhydridů, polyoxyethylované deriváty parciálních esterů, získaných adicí polyoxyethylenových řetězců na neesterifikované hydroxyly, polyoxyethylenové parciální estery mastných kyselin a polyoxyethylenové ethery mastných alkoholů, nebo za přítomnosti chaotropních látek, vybraných ze skupiny zahrnující například močovinu, guanidinhydrochlorid a thiokyanát, s výjimkou solí aktivních při srážení.
- 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že proteiny, obzvláště proenzymy, jsou při proteolytickém zpracování imobilizovány na pevném nosičovém materiálu, vybraném ze skupiny zahrnující kopolymery a těžko rozpustné soli nebo cheláty dvojmocných kovů, obzvláště fosforečnan vápenatý, síran vápenatý, uhličitan vápenatý, síran bamatý, uhličitan bamatý a citrát bamatý.
- 3. Způsob podle jednoho z nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se proteolytické zpracování provádí trypsinem, chymotrypsinem, kallikreinem, dispázou nebo endoproteinázou Glu-C, Lys-C nebo Asp-N.
- 4. Způsob podle nároku 2 pro výrobu trombinu, vyznačující se tím, že se- protrombin obsahující roztok uvede do kontaktu s těžko rozpustnou solí nebo chelátem dvojmocného kovu, výhodně kovu alkalické zeminy jako pevným nosičem a protrombin se imobilisuje na nosič,- imobilizovaný protrombin se zpracuje s proteázou, zejména trypsinem, za přítomnosti výše uvedeného detergentu, výhodně desoxycholátu, čímž se získá roztok, obsahující trombin, který se oddělí a přečistí.2 výkresy-9CZ 282519 B6Obr. 1 xt/rážecí test ^amidolit. test «stanovení (integrál plochy)- 10IE (546 pm)Konec dokumentu
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AT0071292A AT397390B (de) | 1992-04-06 | 1992-04-06 | Verfahren zur spaltung von proteinen |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ53893A3 CZ53893A3 (en) | 1994-01-19 |
| CZ282519B6 true CZ282519B6 (cs) | 1997-07-16 |
Family
ID=3497819
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ93538A CZ282519B6 (cs) | 1992-04-06 | 1993-03-30 | Způsob získávání enzymů z proenzymů |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5432062A (cs) |
| EP (1) | EP0565511B1 (cs) |
| JP (1) | JP2832129B2 (cs) |
| AT (2) | AT397390B (cs) |
| AU (1) | AU670571B2 (cs) |
| CA (1) | CA2092776A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ282519B6 (cs) |
| DE (1) | DE59309646D1 (cs) |
| DK (1) | DK0565511T3 (cs) |
| ES (1) | ES2134834T3 (cs) |
| FI (1) | FI107166B (cs) |
| HU (1) | HU217579B (cs) |
| NO (1) | NO307384B1 (cs) |
| PL (1) | PL298390A1 (cs) |
| SK (1) | SK280854B6 (cs) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4137996A1 (de) * | 1991-11-19 | 1993-05-27 | Behringwerke Ag | Verfahren zur herstellung eines virussicheren thrombinkonzentrates |
| US5792623A (en) * | 1992-04-06 | 1998-08-11 | Immuno Aktiengesellschaft | Method for producing activated blood factors with a protease and a detergent |
| US5559000A (en) * | 1995-01-18 | 1996-09-24 | The Scripps Research Institute | Encoded reaction cassette |
| AT404597B (de) | 1995-11-24 | 1998-12-28 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung von proteinen |
| AT404838B (de) * | 1995-11-24 | 1999-03-25 | Immuno Ag | Herstellung von proteinen aus pro-proteinen durch fusionsproteine abgeleitet von furin oder furinanalogen |
| US6849398B1 (en) | 1996-01-18 | 2005-02-01 | The Scripps Research Institute | Use of encoded reaction cassette |
| DE19710190A1 (de) * | 1997-03-12 | 1998-09-17 | Immuno Ag | Aktivierter Vitamin K-abhängiger Blutfaktor und Verfahren zu dessen Herstellung |
| CA2339360C (en) * | 1998-08-07 | 2008-07-29 | Sekisui Chemical Co., Ltd. | Method for determination of hemoglobins |
| GB0216002D0 (en) * | 2002-07-10 | 2002-08-21 | Nat Blood Authority | Process and composition |
| US9238104B2 (en) | 2011-02-28 | 2016-01-19 | Injectimed, Inc. | Needle guard |
| US12115356B2 (en) * | 2019-03-06 | 2024-10-15 | Gambro Lundia Ab | Device and method for the delivery of a thrombin activated fibrin sealant |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2495298A (en) * | 1945-12-28 | 1950-01-24 | Szent-Gyorgyi Albert | Process for the preparation of thrombin |
| US4210580A (en) * | 1979-06-19 | 1980-07-01 | David Amrani | Process for separation and isolation of AHF and fibronectin from blood plasma |
| US4380511A (en) * | 1981-08-12 | 1983-04-19 | Miles Laboratories, Inc. | Purification of bovine thrombin |
| US4703001A (en) * | 1985-10-23 | 1987-10-27 | Synbiotics, Corporation | Immunoassay for the detection of serum analytes using pH dependent chastropic acids |
| US5200340A (en) * | 1987-05-22 | 1993-04-06 | Zymogenetics, Inc. | Thrombin-activated tissue plasminogen activators |
| US5158873A (en) * | 1987-05-28 | 1992-10-27 | Abbott Laboratories | Method and reagent for determining LD-1 isoenzyme |
| CN1056187C (zh) * | 1988-02-11 | 2000-09-06 | 金克克国际有限公司 | 新的蛋白水解酶及其在洗涤剂中的应用 |
| DE3834550A1 (de) * | 1988-10-11 | 1990-04-19 | Basf Ag | Proteolytisches enzym, seine herstellung und verwendung |
| CA2003078A1 (en) * | 1988-11-18 | 1990-05-18 | Biotechnica International, Inc. | Protease deletion |
| DE3843126C3 (de) * | 1988-12-22 | 1994-10-06 | Octapharma Ag | Verfahren zur Herstellung eines hochreinen Thrombinkonzentrates |
| IE73210B1 (en) * | 1990-01-24 | 1997-05-07 | Warner Lambert Co | Process for the production of thrombin and high purity thrombin preparation thereby obtained |
| GB9116315D0 (en) * | 1991-07-29 | 1991-09-11 | Genzyme Ltd | Assay |
| US5275945A (en) * | 1991-10-08 | 1994-01-04 | Vista Chemical Company | Alkaline proteases stable in heavy-duty detergent liquids |
-
1992
- 1992-04-06 AT AT0071292A patent/AT397390B/de not_active IP Right Cessation
-
1993
- 1993-03-19 HU HU9300788A patent/HU217579B/hu not_active IP Right Cessation
- 1993-03-19 ES ES93890046T patent/ES2134834T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-03-19 AT AT93890046T patent/ATE181358T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-03-19 DE DE59309646T patent/DE59309646D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1993-03-19 EP EP93890046A patent/EP0565511B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-03-19 DK DK93890046T patent/DK0565511T3/da active
- 1993-03-26 CA CA002092776A patent/CA2092776A1/en not_active Abandoned
- 1993-03-30 CZ CZ93538A patent/CZ282519B6/cs unknown
- 1993-03-30 US US08/040,261 patent/US5432062A/en not_active Expired - Fee Related
- 1993-03-31 AU AU35623/93A patent/AU670571B2/en not_active Ceased
- 1993-03-31 NO NO931224A patent/NO307384B1/no not_active IP Right Cessation
- 1993-04-05 PL PL29839093A patent/PL298390A1/xx unknown
- 1993-04-06 SK SK309-93A patent/SK280854B6/sk unknown
- 1993-04-06 JP JP5079491A patent/JP2832129B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1993-04-06 FI FI931553A patent/FI107166B/fi not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0565511B1 (de) | 1999-06-16 |
| ES2134834T3 (es) | 1999-10-16 |
| SK280854B6 (sk) | 2000-08-14 |
| NO931224D0 (no) | 1993-03-31 |
| US5432062A (en) | 1995-07-11 |
| FI931553L (fi) | 1993-10-07 |
| JPH0698791A (ja) | 1994-04-12 |
| SK30993A3 (en) | 1993-11-10 |
| NO307384B1 (no) | 2000-03-27 |
| HU9300788D0 (en) | 1993-06-28 |
| JP2832129B2 (ja) | 1998-12-02 |
| CA2092776A1 (en) | 1993-10-07 |
| ATA71292A (de) | 1993-08-15 |
| AT397390B (de) | 1994-03-25 |
| ATE181358T1 (de) | 1999-07-15 |
| DK0565511T3 (da) | 1999-12-06 |
| HUT69604A (en) | 1995-09-28 |
| HU217579B (hu) | 2000-02-28 |
| FI931553A0 (fi) | 1993-04-06 |
| FI107166B (fi) | 2001-06-15 |
| EP0565511A1 (de) | 1993-10-13 |
| PL298390A1 (en) | 1993-10-18 |
| NO931224L (no) | 1993-10-07 |
| DE59309646D1 (de) | 1999-07-22 |
| AU670571B2 (en) | 1996-07-25 |
| AU3562393A (en) | 1993-10-07 |
| CZ53893A3 (en) | 1994-01-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Stenflo | Structure and function of protein C | |
| CN1227025C (zh) | 改进的加工活化c蛋白的方法 | |
| Retzios et al. | A direct-acting fibrinolytic enzyme from the venom of Agkistrodon contortrix contortrix: effects on various components of the human blood coagulation and fibrinolysis systems | |
| JPH02200180A (ja) | タンパク質の精製法 | |
| Vivas-Ruiz et al. | Coagulant thrombin-like enzyme (barnettobin) from Bothrops barnetti venom: molecular sequence analysis of its cDNA and biochemical properties | |
| SK280854B6 (sk) | Spôsob riadeného, obmedzeného proteolytického štiepenia proteínov | |
| Berger et al. | Cocoonase: III. Purification, preliminary characterization, and activation of the zymogen of an insect protease | |
| Morita et al. | Calcium binding to a human factor IXa derivative lacking γ-carboxyglutamic acid: evidence for two high-affinity sites that do not involve β-hydroxyaspartic acid | |
| Huang et al. | Purification and characterization of two fibrinogen-clotting enzymes from five-pace snake (Agkistrodon acutus) venom | |
| Phillips et al. | Thrombin-like snake venom serine proteinases | |
| Zhang et al. | Characterization of a fibrinogen-clotting enzyme from Trimeresurus stejnegeri venom, and comparative study with other venom proteases | |
| Tokunaga et al. | Further studies on lipopolysaccharide-sensitive serine protease zymogen (factor C): its isolation from Limulus polyphemus hemocytes and identification as an intracellular zymogen activated by α-chymotrypsin, not by trypsin | |
| Kurtović et al. | VaSP1, catalytically active serine proteinase from Vipera ammodytes ammodytes venom with unconventional active site triad | |
| CZ279602B6 (cs) | Způsob získávání enzymů z proenzymů | |
| US5792623A (en) | Method for producing activated blood factors with a protease and a detergent | |
| Meier et al. | Snake venom protein C activators | |
| Marcotte et al. | Characterization of the activation of pro-urokinase by thermolysin | |
| JPH0393799A (ja) | プロティンｃの活性化法 | |
| US5198534A (en) | Process for preparation of activated protein c by immobilized aprotinin chromatography | |
| JPS63119675A (ja) | 変形組織プラスミン活性化剤 | |
| JPH09183794A (ja) | タンパク質の調製および回収方法 | |
| KR100583537B1 (ko) | 활성화된 응고 인자 ｖｉｉ에 특이적인 모노클로날 항체 및 이의 용도 | |
| Sumi et al. | Immunochemical studies of high and low molecular forms of urokinase | |
| Stohnii et al. | Fibrinogenolytic activity of protease from the culture fluid of Pleurotus ostreatus | |
| Boskovic | Studies of prothrombinase-catalyzed activation of bovine prothrombin. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic |