JPH0698791A - 酵素的分解によるタンパク質の切断方法およびその利用方法 - Google Patents
酵素的分解によるタンパク質の切断方法およびその利用方法Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
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- C12N9/6429—Thrombin (3.4.21.5)
-
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21005—Thrombin (3.4.21.5)
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 タンパク質断片を高純度で得る時間を要しな
い精製容易な方法を提供する。 【構成】 界面活性剤または凝固活性のある塩以外のカ
オトロピック物質の存在下でプロテアーゼ処理する酵素
的分解によって、制御または制限された態様でタンパク
質を切断する。この方法によって酵素またはタンパク質
断片が得られる。この方法はプロ酵素から酵素を回収す
るのに有用で、特にプロトロンビンを切断してトロンビ
ンを容易に回収するのに有用である。
い精製容易な方法を提供する。 【構成】 界面活性剤または凝固活性のある塩以外のカ
オトロピック物質の存在下でプロテアーゼ処理する酵素
的分解によって、制御または制限された態様でタンパク
質を切断する。この方法によって酵素またはタンパク質
断片が得られる。この方法はプロ酵素から酵素を回収す
るのに有用で、特にプロトロンビンを切断してトロンビ
ンを容易に回収するのに有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、酵素およびタンパク質
断片をそれぞれ回収するため、タンパク質をプロテアー
ゼで処理するタンパク質（特にプロ酵素）の制御され、
制限された酵素分解的切断方法に関する。特に本発明は
プロトロンビンからトロンビンを回収する方法に関す
る。
断片をそれぞれ回収するため、タンパク質をプロテアー
ゼで処理するタンパク質（特にプロ酵素）の制御され、
制限された酵素分解的切断方法に関する。特に本発明は
プロトロンビンからトロンビンを回収する方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】そのような方法はヨーロッパ特許公開第
０３７８７９８号に報告された。この特許方法では、血
漿または血漿画分から誘導されたプロトロンビンを固体
担体上へ吸着させ（固定化）、吸着物をＣａ2+イオンで
処理する。Ｃａ2+イオンは３０mMまでの濃度で、同じく
血漿から誘導し、担体上へ吸着させたプロテアーゼとと
もに使用し、生じたトロンビンを吸着物から切断する。
固体担体として、メタクリル酸およびアクリル酸系コポ
リマーを使用する。
０３７８７９８号に報告された。この特許方法では、血
漿または血漿画分から誘導されたプロトロンビンを固体
担体上へ吸着させ（固定化）、吸着物をＣａ2+イオンで
処理する。Ｃａ2+イオンは３０mMまでの濃度で、同じく
血漿から誘導し、担体上へ吸着させたプロテアーゼとと
もに使用し、生じたトロンビンを吸着物から切断する。
固体担体として、メタクリル酸およびアクリル酸系コポ
リマーを使用する。
【０００３】またトリプシンは溶解したプロトロンビン
を低分子量の断片へ分解し、その際にトロンビン活性の
完全な喪失を生じることが報告された［バイオキミカ・
エ・バイフィジカ・アクタ(Biochim. Biophys. Acta)、
３２９巻、２２１〜２３２頁（１９７３年）］。即ち、
プロトロンビンの酵素的分解はトロンビンで止まらず、
従ってこの方法はトロンビンの回収に適合しない。
を低分子量の断片へ分解し、その際にトロンビン活性の
完全な喪失を生じることが報告された［バイオキミカ・
エ・バイフィジカ・アクタ(Biochim. Biophys. Acta)、
３２９巻、２２１〜２３２頁（１９７３年）］。即ち、
プロトロンビンの酵素的分解はトロンビンで止まらず、
従ってこの方法はトロンビンの回収に適合しない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】最初に示したようなす
べての方法は、使用したプロテアーゼおよび処理条件に
よってさまざまなプロトロンビン切断生産物を生じる
が、この切断生産物は、一部は治療的に（例えばトロン
ビン）、一部は診断的、および特異的抗体の回収に使用
し得る。これらの適用では、タンパク質断片はすべて高
い純度を必要とするが、既知の切断方法では何れも複数
の断片を生じるから、必然的に多大な作業を要する。さ
らにこれらの多段階の多くの時間を要する精製方法の不
利な点は、必然的に収量の甚だしい損失を伴なうことで
ある。
べての方法は、使用したプロテアーゼおよび処理条件に
よってさまざまなプロトロンビン切断生産物を生じる
が、この切断生産物は、一部は治療的に（例えばトロン
ビン）、一部は診断的、および特異的抗体の回収に使用
し得る。これらの適用では、タンパク質断片はすべて高
い純度を必要とするが、既知の切断方法では何れも複数
の断片を生じるから、必然的に多大な作業を要する。さ
らにこれらの多段階の多くの時間を要する精製方法の不
利な点は、必然的に収量の甚だしい損失を伴なうことで
ある。
【０００５】本発明はこれらの不都合な点を取り除くこ
とを目的とし、タンパク質から酵素またはタンパク質断
片を回収する改良方法を提供する目的をもつ。この方法
はトロンビンの単純な回収に特に好適である。
とを目的とし、タンパク質から酵素またはタンパク質断
片を回収する改良方法を提供する目的をもつ。この方法
はトロンビンの単純な回収に特に好適である。
【０００６】
【課題を解決するための手段】最初に示した方法で、こ
の目的は、プロテアーゼによる処理を界面活性剤の存
在、または凝固活性を有する塩以外のカオトロピック物
質の存在で実施することにより達成される。
の目的は、プロテアーゼによる処理を界面活性剤の存
在、または凝固活性を有する塩以外のカオトロピック物
質の存在で実施することにより達成される。
【０００７】本発明は、タンパク質、特にプロトロンビ
ンのようなプロ酵素の酵素的分解による切断を界面活性
剤の存在、またはカオトロピック物質の存在で実施する
と、切断が目的通りに起こり、または制御できるという
知見に基づいている。タンパク質の切断様式は、存在す
るこれらの物質の種類および濃度によって異なることが
判明した。この知見から、少数の正確に選ばれたタンパ
ク質断片だけが生成するように、反応環境を選ぶ可能性
が開かれた。
ンのようなプロ酵素の酵素的分解による切断を界面活性
剤の存在、またはカオトロピック物質の存在で実施する
と、切断が目的通りに起こり、または制御できるという
知見に基づいている。タンパク質の切断様式は、存在す
るこれらの物質の種類および濃度によって異なることが
判明した。この知見から、少数の正確に選ばれたタンパ
ク質断片だけが生成するように、反応環境を選ぶ可能性
が開かれた。
【０００８】本発明方法の好ましい変更は、固体担体物
質、特に難溶性塩、または２価金属のキレート、好まし
くはアルカリ土類金属のキレート上に固定化したプロ酵
素を使用することにある。この変更によって、担体へ吸
着させたプロ酵素の部分を、簡単に反応溶液から担体と
分離し得るから、吸着させたプロ酵素から切断したタン
パク質断片を一層容易に回収することができる。
質、特に難溶性塩、または２価金属のキレート、好まし
くはアルカリ土類金属のキレート上に固定化したプロ酵
素を使用することにある。この変更によって、担体へ吸
着させたプロ酵素の部分を、簡単に反応溶液から担体と
分離し得るから、吸着させたプロ酵素から切断したタン
パク質断片を一層容易に回収することができる。
【０００９】ヨーロッパ特許公開第０３７８７９８号に
記載されている方法ではコポリマーを担体として使用し
ているが、この方法は、アクリル酸およびメタクリル酸
モノマーをトロンビン含有溶液へ遊離する難点があり、
これを再び除去することは難しく、従って製造すべき医
薬製剤を汚染する。そのような漏出はすべての型の有機
ポリマー担体について知られていた。然し本発明のプロ
酵素（特にプロトロンビン）の制御された切断では、コ
ポリマー上だけでなく、その他の担体上、例えばＣａ
3(ＰＯ4)2、ＣａＳＯ4、ＣａＣＯ3、ＢａＳＯ4、ＢａＣ
Ｏ3、またはクエン酸バリウムのような難溶性塩でもう
まくいく。これらの塩類はプロトロンビン含有溶液へ添
加してもよく、あるいはプロトロンビン含有溶液の沈殿
によって新たに生成させることもできる。
記載されている方法ではコポリマーを担体として使用し
ているが、この方法は、アクリル酸およびメタクリル酸
モノマーをトロンビン含有溶液へ遊離する難点があり、
これを再び除去することは難しく、従って製造すべき医
薬製剤を汚染する。そのような漏出はすべての型の有機
ポリマー担体について知られていた。然し本発明のプロ
酵素（特にプロトロンビン）の制御された切断では、コ
ポリマー上だけでなく、その他の担体上、例えばＣａ
3(ＰＯ4)2、ＣａＳＯ4、ＣａＣＯ3、ＢａＳＯ4、ＢａＣ
Ｏ3、またはクエン酸バリウムのような難溶性塩でもう
まくいく。これらの塩類はプロトロンビン含有溶液へ添
加してもよく、あるいはプロトロンビン含有溶液の沈殿
によって新たに生成させることもできる。
【００１０】さらに担体の２価イオンの特に好都合な点
は、プロトロンビンのγ−カルボキシグルタミン酸末端
を介してこれを選択的に結合することである。プロトロ
ンビンの酵素分解処理の間に生成するタンパク質断片
は、γ−カルボキシグルタミン酸末端を失うため、２価
イオン、即ち担体に対する親和性をもたない。それ以外
の担体として、ヒドロキシルアパタイト、ヒドロキシル
アパタイトゲル、または２価カチオンを負荷した金属キ
レート親和性クロマトグラフィー［例えばファーマシア
・キレーティング・セファロース(Pharmacia Chelating
Sepharose)、商標］は好適である。
は、プロトロンビンのγ−カルボキシグルタミン酸末端
を介してこれを選択的に結合することである。プロトロ
ンビンの酵素分解処理の間に生成するタンパク質断片
は、γ−カルボキシグルタミン酸末端を失うため、２価
イオン、即ち担体に対する親和性をもたない。それ以外
の担体として、ヒドロキシルアパタイト、ヒドロキシル
アパタイトゲル、または２価カチオンを負荷した金属キ
レート親和性クロマトグラフィー［例えばファーマシア
・キレーティング・セファロース(Pharmacia Chelating
Sepharose)、商標］は好適である。
【００１１】複数のプロテアーゼ［例えばキモトリプシ
ン、ジスパーゼ、エンドペプチダーゼＡｒｇ−Ｃ、エン
ドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＧ
ｌｕ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ、第Ｘａ因
子、カリクレイン、パパイン、ペプシン、プラスミン、
プロナーゼ、プロテイナーゼＫ、スタフィロコアグラー
ゼ、ズブチリシン、トロンビン、トリプシン（特にヒ
ト、ウシ、ブタ）、節足動物または微生物由来のトリプ
シン様プロテアーゼ（例えばストレプトマイセス・グリ
セウス(Streptomyces griseus)のトリプシンのよう
な）、アンキストロドン・ロドストーマ(Angkistrodon
rhodostoma)、ボトロプス・アトロクス(Bothrops atro
x)、ジスフォリズス・チプス(Dispholidus typus)、エ
キス・カリナツス(Echis carinatus)、ナジャ・ニグロ
コリス(Naja nigrocollis)、オキシウラヌス・スクテラ
ツス・スクテラツス(Oxyuranus scutellatus scutellat
us)等のようなヘビ毒からのセリンプロテアーゼ）］は
プロ酵素の酵素的分解による切断に役立つ。トリプシ
ン、キモトリプシン、カリクレイン、ジスパーゼ、また
はエンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ、Ｌｙｓ−Ｃ、Ａｓ
ｐ−Ｎはプロテアーゼとして好ましく使用し得る。組換
え体プロテアーゼも同様に使用し得る。
ン、ジスパーゼ、エンドペプチダーゼＡｒｇ−Ｃ、エン
ドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＧ
ｌｕ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ、第Ｘａ因
子、カリクレイン、パパイン、ペプシン、プラスミン、
プロナーゼ、プロテイナーゼＫ、スタフィロコアグラー
ゼ、ズブチリシン、トロンビン、トリプシン（特にヒ
ト、ウシ、ブタ）、節足動物または微生物由来のトリプ
シン様プロテアーゼ（例えばストレプトマイセス・グリ
セウス(Streptomyces griseus)のトリプシンのよう
な）、アンキストロドン・ロドストーマ(Angkistrodon
rhodostoma)、ボトロプス・アトロクス(Bothrops atro
x)、ジスフォリズス・チプス(Dispholidus typus)、エ
キス・カリナツス(Echis carinatus)、ナジャ・ニグロ
コリス(Naja nigrocollis)、オキシウラヌス・スクテラ
ツス・スクテラツス(Oxyuranus scutellatus scutellat
us)等のようなヘビ毒からのセリンプロテアーゼ）］は
プロ酵素の酵素的分解による切断に役立つ。トリプシ
ン、キモトリプシン、カリクレイン、ジスパーゼ、また
はエンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ、Ｌｙｓ−Ｃ、Ａｓ
ｐ−Ｎはプロテアーゼとして好ましく使用し得る。組換
え体プロテアーゼも同様に使用し得る。
【００１２】プロ酵素は、界面活性剤の存在で極めて選
択的に切断され得るので、回収される酵素は断片混合物
の主要部分を形成することが判明した。好ましく使用さ
れるデオキシコール酸塩（ＤＯＣ）は界面活性剤として
好適であり、またドデシル硫酸塩（ＳＤＳ）、ＣＨＡＰ
Ｓ、ポリオキシエチレン誘導体［例えばＢｒｉｊ（商
標）、トゥイーン(Tween)（商標）、トリトン(Triton)
（商標）、プルロニック(Pluronic)（商標）］のような
その他の物質も好適である。界面活性剤の存在は、生成
したタンパク質断片が担体から脱離するのをさらに促進
する。
択的に切断され得るので、回収される酵素は断片混合物
の主要部分を形成することが判明した。好ましく使用さ
れるデオキシコール酸塩（ＤＯＣ）は界面活性剤として
好適であり、またドデシル硫酸塩（ＳＤＳ）、ＣＨＡＰ
Ｓ、ポリオキシエチレン誘導体［例えばＢｒｉｊ（商
標）、トゥイーン(Tween)（商標）、トリトン(Triton)
（商標）、プルロニック(Pluronic)（商標）］のような
その他の物質も好適である。界面活性剤の存在は、生成
したタンパク質断片が担体から脱離するのをさらに促進
する。
【００１３】本発明の方法に適用する代表的なカオトロ
ピック物質は、例えば尿素、塩酸グアニジニウム、およ
びチオシアナートであるが、同様にカオトロピックに作
用するカルシウム塩のような凝固的活性塩は適さない。
ピック物質は、例えば尿素、塩酸グアニジニウム、およ
びチオシアナートであるが、同様にカオトロピックに作
用するカルシウム塩のような凝固的活性塩は適さない。
【００１４】得られた上清は所望の酵素を含有してお
り、さらにこれを精製段階へ掛ける。都合よくはゲル浸
透クロマトグラフィー、またはアフィニティークロマト
グラフィーを用い得る。できるだけ濃縮した試料を得る
にはアフィニティークロマトグラフィー法の利用が推奨
される。チバクロン(Cibacron)（商標）−ブルーＦ３Ｇ
Ａ型（チバ・ガイギー(Ciba Geigy)社）、またはプロシ
オンProcion（商標）−レッドＨＥ−３Ｂ（ＩＣＩ
社）、またはこれに関連する色素による色素リガンド・
アフィニティークロマトグラフィー担体が好適であるこ
とが分かった。タンパク質断片を、バッチ式、または固
相活性化が起こったのち脱離上清から直接充填したカラ
ムで、それぞれアフィニティー・マトリックス［例えば
フラクトジェル(Fractogel)（商標）ＴＳＫ ＡＦ−ブル
ー（メルク(Merck)社）、ブルー・セファロース(Blue-S
epharose)（商標）ＣＬ−６Ｂ（ファーマシア(Pharmaci
a)社）］に吸着させる。ついでタンパク質断片を緩衝液
で洗浄し、最後に高モル量（例えば１Ｍ）のカオトロピ
ック物質（例えばＫＳＣＮまたはＮＨ4ＳＣＮ）で溶出
することにより界面活性剤から分離する。
り、さらにこれを精製段階へ掛ける。都合よくはゲル浸
透クロマトグラフィー、またはアフィニティークロマト
グラフィーを用い得る。できるだけ濃縮した試料を得る
にはアフィニティークロマトグラフィー法の利用が推奨
される。チバクロン(Cibacron)（商標）−ブルーＦ３Ｇ
Ａ型（チバ・ガイギー(Ciba Geigy)社）、またはプロシ
オンProcion（商標）−レッドＨＥ−３Ｂ（ＩＣＩ
社）、またはこれに関連する色素による色素リガンド・
アフィニティークロマトグラフィー担体が好適であるこ
とが分かった。タンパク質断片を、バッチ式、または固
相活性化が起こったのち脱離上清から直接充填したカラ
ムで、それぞれアフィニティー・マトリックス［例えば
フラクトジェル(Fractogel)（商標）ＴＳＫ ＡＦ−ブル
ー（メルク(Merck)社）、ブルー・セファロース(Blue-S
epharose)（商標）ＣＬ−６Ｂ（ファーマシア(Pharmaci
a)社）］に吸着させる。ついでタンパク質断片を緩衝液
で洗浄し、最後に高モル量（例えば１Ｍ）のカオトロピ
ック物質（例えばＫＳＣＮまたはＮＨ4ＳＣＮ）で溶出
することにより界面活性剤から分離する。
【００１５】溶出液をゲル浸透クロマトグラフィー（例
えばセファデックス(Cephadex)（商標）Ｇ２５によ
り）、ダイアフィルトレーション、または透析によりカ
オトロピック物質から分離し、好適な緩衝液または塩溶
液の状態にする。さらに精製して均一にするには、逆相
クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
ー、またはゲル浸透クロマトグラフィーによる既知の方
法によって実施する。
えばセファデックス(Cephadex)（商標）Ｇ２５によ
り）、ダイアフィルトレーション、または透析によりカ
オトロピック物質から分離し、好適な緩衝液または塩溶
液の状態にする。さらに精製して均一にするには、逆相
クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
ー、またはゲル浸透クロマトグラフィーによる既知の方
法によって実施する。
【００１６】本発明の方法は純粋なトロンビンを得るの
に特に好適である。従って本発明はまた、トロンビン含
有医薬製剤の製造に関する。ここで好ましい実施態様
は、プロトロンビン含有溶液を固体担体、特に難溶性
塩、または２価金属のキレート、好ましくはアルカリ土
類金属のキレートと接触させて、担体上に固定化したプ
ロトロンビンを得、固定化したプロトロンビンを界面活
性剤、好ましくはデオキシコール酸塩の存在でプロテア
ーゼ、特にトリプシンで処理してトロンビン含有溶液を
得、これを分離し、精製し、そして医薬製剤に加工する
ことからなる。
に特に好適である。従って本発明はまた、トロンビン含
有医薬製剤の製造に関する。ここで好ましい実施態様
は、プロトロンビン含有溶液を固体担体、特に難溶性
塩、または２価金属のキレート、好ましくはアルカリ土
類金属のキレートと接触させて、担体上に固定化したプ
ロトロンビンを得、固定化したプロトロンビンを界面活
性剤、好ましくはデオキシコール酸塩の存在でプロテア
ーゼ、特にトリプシンで処理してトロンビン含有溶液を
得、これを分離し、精製し、そして医薬製剤に加工する
ことからなる。
【００１７】ウイルスで汚染されたプールから得られた
出発生産物を使用した場合、界面活性剤処理によってウ
イルス活性の著しい低下が達成されることが判明した。
１例を示せば、出発物質（発酵上清）がワクシニア・ウ
イルスを含有していたが、本発明の方法によって生産し
たトロンビン製剤には、ワクシニア・ウイルスを全く検
出されないことが判明した。当然のことながら、存在の
可能性のある感染因子を不活性化する例えば凍結乾燥品
の蒸気加熱処理のような追加的な手段を本発明の範囲内
で行なうことができる。
出発生産物を使用した場合、界面活性剤処理によってウ
イルス活性の著しい低下が達成されることが判明した。
１例を示せば、出発物質（発酵上清）がワクシニア・ウ
イルスを含有していたが、本発明の方法によって生産し
たトロンビン製剤には、ワクシニア・ウイルスを全く検
出されないことが判明した。当然のことながら、存在の
可能性のある感染因子を不活性化する例えば凍結乾燥品
の蒸気加熱処理のような追加的な手段を本発明の範囲内
で行なうことができる。
【００１８】トロンビンを好適に回収する本発明の方法
は、最初にプロトロンビンを吸着させるため、プロトロ
ンビン含有溶液を固体担体へ接触させる。プロトロンビ
ン含有溶液は、血漿または血漿画分だけでなく、組換え
体プロトロンビン含有細胞培養の上清も使用し得る。固
定化を行なったのち、目的生産物を汚染するかもしれな
い非特異的に結合したタンパク質を除去するため、担体
へ結合しているプロトロンビンを好適な方法で溶液から
分離し、洗浄する。ついでトロンビンをプロトロンビン
から切断するため、固定化したプロトロンビンをデオキ
シコール酸塩の存在でプロテアーゼで処理して、トロン
ビン含有溶液と固体物質を得、固体物質を溶液から分離
する。この分離は沈降または濾過によって行なう。
は、最初にプロトロンビンを吸着させるため、プロトロ
ンビン含有溶液を固体担体へ接触させる。プロトロンビ
ン含有溶液は、血漿または血漿画分だけでなく、組換え
体プロトロンビン含有細胞培養の上清も使用し得る。固
定化を行なったのち、目的生産物を汚染するかもしれな
い非特異的に結合したタンパク質を除去するため、担体
へ結合しているプロトロンビンを好適な方法で溶液から
分離し、洗浄する。ついでトロンビンをプロトロンビン
から切断するため、固定化したプロトロンビンをデオキ
シコール酸塩の存在でプロテアーゼで処理して、トロン
ビン含有溶液と固体物質を得、固体物質を溶液から分離
する。この分離は沈降または濾過によって行なう。
【００１９】トロンビン含有上清を上記の精製段階へ掛
け得る。精製段階はフラクトジェル（商標）ＴＳＫ−Ａ
Ｆブルー（メルク社）を用いるアフィニティークロマト
グラフィー、続いてセファデックス（商標）−Ｇ２５を
用いるクロマトグラフィーが好ましい。得られた純粋な
トロンビン含有溶液を、ついで所望により限外濾過、ま
たは凍結乾燥によって濃縮し、医薬製剤に加工する。
け得る。精製段階はフラクトジェル（商標）ＴＳＫ−Ａ
Ｆブルー（メルク社）を用いるアフィニティークロマト
グラフィー、続いてセファデックス（商標）−Ｇ２５を
用いるクロマトグラフィーが好ましい。得られた純粋な
トロンビン含有溶液を、ついで所望により限外濾過、ま
たは凍結乾燥によって濃縮し、医薬製剤に加工する。
【００２０】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に
説明する。製造例 ：固定化したプロトロンビンの調製 ＰＣＴ特許出願ＷＯ９１／１１５１９号に記載された細
胞培養上清培地は組換え体ヒトプロトロンビンを含有し
ているが、この培地を、プロトロンビン１００ＩＵ当た
り粉末化したＣａ3(ＰＯ4)2５ｇと混合して、４℃で１
時間僅かに撹拌する。続いて固相を５０００ｇで遠心し
て、得られたペレットを２０mMトリス／ＨＣｌ緩衝液
（ｐＨ７.４）４０mlに再懸濁し、１０分間撹拌後、も
う一度５０００ｇで遠心する。この操作を５％（ｗ／
ｖ）硫酸アンモニウムの上記の緩衝液溶液４０ml、およ
び最後に純粋な緩衝液４０ml中で反復する。これと同一
の態様で、固定化したプロトロンビンを調製するプロト
ロンビン含有出発物質として、例えば第II因子、第IX因
子、および第Ｘ因子の混合物のような部分プロトロンビ
ン複合体を使用し得る。
説明する。製造例 ：固定化したプロトロンビンの調製 ＰＣＴ特許出願ＷＯ９１／１１５１９号に記載された細
胞培養上清培地は組換え体ヒトプロトロンビンを含有し
ているが、この培地を、プロトロンビン１００ＩＵ当た
り粉末化したＣａ3(ＰＯ4)2５ｇと混合して、４℃で１
時間僅かに撹拌する。続いて固相を５０００ｇで遠心し
て、得られたペレットを２０mMトリス／ＨＣｌ緩衝液
（ｐＨ７.４）４０mlに再懸濁し、１０分間撹拌後、も
う一度５０００ｇで遠心する。この操作を５％（ｗ／
ｖ）硫酸アンモニウムの上記の緩衝液溶液４０ml、およ
び最後に純粋な緩衝液４０ml中で反復する。これと同一
の態様で、固定化したプロトロンビンを調製するプロト
ロンビン含有出発物質として、例えば第II因子、第IX因
子、および第Ｘ因子の混合物のような部分プロトロンビ
ン複合体を使用し得る。
【００２１】実施例１：固定化したプロトロンビンのト
リプシン切断に対する反応環境の影響 プロトロンビンのトリプシン切断に対するカオトロピッ
ク物質および界面活性剤の影響を立証するため、まず下
記の物質の添加によってトリス／ＨＣｌ緩衝液（２０m
M；ｐＨ８.３）の４種類の溶液（Ａ〜Ｄ）を調製した
［４番目の緩衝液溶液（Ｄ）は対照］。 溶液Ａ：尿素（０.５Ｍ） 溶液Ｂ：デオキシコール酸Ｎａ（０.０５Ｍ） 溶液Ｃ：ドデシル硫酸Ｎａ（０.０５Ｍ） 溶液Ｄ：無添加
リプシン切断に対する反応環境の影響 プロトロンビンのトリプシン切断に対するカオトロピッ
ク物質および界面活性剤の影響を立証するため、まず下
記の物質の添加によってトリス／ＨＣｌ緩衝液（２０m
M；ｐＨ８.３）の４種類の溶液（Ａ〜Ｄ）を調製した
［４番目の緩衝液溶液（Ｄ）は対照］。 溶液Ａ：尿素（０.５Ｍ） 溶液Ｂ：デオキシコール酸Ｎａ（０.０５Ｍ） 溶液Ｃ：ドデシル硫酸Ｎａ（０.０５Ｍ） 溶液Ｄ：無添加
【００２２】続いて溶液Ａ〜Ｄの各１mlへ、緩衝液で湿
潤した洗浄ペレット（上記のようにして製造）２００mg
をそれぞれ添加し、緩衝液１ml当たりトリプシン１mgを
含有する２０mMトリス／ＨＣｌ緩衝液２０μlとともに
室温で振とうした。１、２、３時間後、各懸濁液のアリ
コートを採り、固相を遠心し、上清のそれぞれの断片組
成についてウエスタンブロット分析を用いて検討した。
潤した洗浄ペレット（上記のようにして製造）２００mg
をそれぞれ添加し、緩衝液１ml当たりトリプシン１mgを
含有する２０mMトリス／ＨＣｌ緩衝液２０μlとともに
室温で振とうした。１、２、３時間後、各懸濁液のアリ
コートを採り、固相を遠心し、上清のそれぞれの断片組
成についてウエスタンブロット分析を用いて検討した。
【００２３】デンシトメトリーによって実施したウエス
タンブロット分析後の１２、１９、２３、２５.５、３
３、３５、４４kDの断片バンドのピーク面積積分を表１
に示す。選ばれた反応環境によって、異なったサイズの
トリプシン分解断片が種々の量で検出できることは明ら
かである。純粋なトリス緩衝液（溶液Ｄ）の３時間イン
キュベーションとは反対に、それ以外のすべての溶液
（Ａ〜Ｃ）では、断片が３０kD以上の分子質量で残存し
ていた。トロンビンに対応する３３kDおよび３５kDの断
片のうち、３３kDは活性形を伴なっていた。デオキシコ
ール酸塩の存在（溶液Ｂ）では、活性トロンビンが主断
片として生成し、トリプシンで３時間処理後でも、それ
以上小さいオリゴペプチドに分解しなかった。
タンブロット分析後の１２、１９、２３、２５.５、３
３、３５、４４kDの断片バンドのピーク面積積分を表１
に示す。選ばれた反応環境によって、異なったサイズの
トリプシン分解断片が種々の量で検出できることは明ら
かである。純粋なトリス緩衝液（溶液Ｄ）の３時間イン
キュベーションとは反対に、それ以外のすべての溶液
（Ａ〜Ｃ）では、断片が３０kD以上の分子質量で残存し
ていた。トロンビンに対応する３３kDおよび３５kDの断
片のうち、３３kDは活性形を伴なっていた。デオキシコ
ール酸塩の存在（溶液Ｂ）では、活性トロンビンが主断
片として生成し、トリプシンで３時間処理後でも、それ
以上小さいオリゴペプチドに分解しなかった。
【００２４】
【表１】 分子質量（kＤ） 12 19 23 25,5 33 35 44 溶液 反応時間(h) ピーク面積積分 1 26 19 22 14 94 95 Ａ 2 22 20 13 54 20 3 24 27 14 51 17 1 13 165 90 Ｂ 2 15 175 25 3 18 170 1 53 11 Ｃ 2 35 2 3 9 1 25 132 117 22 Ｄ 2 25 120 34 3 42 129
【００２５】実施例２：固定化したプロトロンビンの種
々のプロテアーゼ（界面活性剤の存在で）による切断 プロトロンビン含有細胞培養の上清培地からプロトロン
ビンをＣａ3(ＰＯ4)2へ吸着させ、洗浄した。緩衝液で
湿潤した吸着物２５０mgからなる８試料を、それぞれ２
０mMトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８.３）緩衝液（デオキシコ
ール酸Ｎａ ２００mM含有）1ｍｌへ懸濁し、下記の８種
類の酵素溶液５０mlをこれに添加した。 ブタ膵臓のカリクレイン（２０mM ＴＢＳ溶液、ｐＨ８.
３）、２５０Ｕ／ml、 バシラス・ポリミキサ(Bacillus polymixa)のジスパー
ゼＩ（２０mM ＴＢＳ溶液、ｐＨ８.３）、１mg／ml、 ウシ膵臓のα−キモトリプシン（２０mM ＴＢＳ溶液、
ｐＨ８.３）、３５０Ｕ／ml、 ブタ膵臓のトリプシン（２０mM ＴＢＳ溶液、ｐＨ８.
３）、０.７６mg／ml、 スタフィロコッカス・アウレウスＶ８からのエンドプロ
テイナーゼＧｌｕ−Ｃ（２０mM ＴＢＳ溶液、ｐＨ８.
３）、１mg／ml、 ライソバクター・エンザイモゲネス(Lysobacter enzymo
genes)のエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ（２０mM Ｔ
ＢＳ溶液、ｐＨ８.３）、０.１mg／ml、 シュードモナス・フラジ(Pseudomonas fragi)のエンド
プロテイナーゼＡｓｐ −Ｎ（２０mM ＴＢＳ溶液、ｐＨ
８.３）、０.０４mg／ml、 第Ｘａ因子（ヒト）、２０Ｕ／ml。 ２０mM ＴＢＳ（ＴＢＳ：トリス緩衝液で緩衝化した食
塩水）とは０.９％ＮａＣｌを含有する２０mMトリス／
ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８.３）を表わす。
々のプロテアーゼ（界面活性剤の存在で）による切断 プロトロンビン含有細胞培養の上清培地からプロトロン
ビンをＣａ3(ＰＯ4)2へ吸着させ、洗浄した。緩衝液で
湿潤した吸着物２５０mgからなる８試料を、それぞれ２
０mMトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８.３）緩衝液（デオキシコ
ール酸Ｎａ ２００mM含有）1ｍｌへ懸濁し、下記の８種
類の酵素溶液５０mlをこれに添加した。 ブタ膵臓のカリクレイン（２０mM ＴＢＳ溶液、ｐＨ８.
３）、２５０Ｕ／ml、 バシラス・ポリミキサ(Bacillus polymixa)のジスパー
ゼＩ（２０mM ＴＢＳ溶液、ｐＨ８.３）、１mg／ml、 ウシ膵臓のα−キモトリプシン（２０mM ＴＢＳ溶液、
ｐＨ８.３）、３５０Ｕ／ml、 ブタ膵臓のトリプシン（２０mM ＴＢＳ溶液、ｐＨ８.
３）、０.７６mg／ml、 スタフィロコッカス・アウレウスＶ８からのエンドプロ
テイナーゼＧｌｕ−Ｃ（２０mM ＴＢＳ溶液、ｐＨ８.
３）、１mg／ml、 ライソバクター・エンザイモゲネス(Lysobacter enzymo
genes)のエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ（２０mM Ｔ
ＢＳ溶液、ｐＨ８.３）、０.１mg／ml、 シュードモナス・フラジ(Pseudomonas fragi)のエンド
プロテイナーゼＡｓｐ −Ｎ（２０mM ＴＢＳ溶液、ｐＨ
８.３）、０.０４mg／ml、 第Ｘａ因子（ヒト）、２０Ｕ／ml。 ２０mM ＴＢＳ（ＴＢＳ：トリス緩衝液で緩衝化した食
塩水）とは０.９％ＮａＣｌを含有する２０mMトリス／
ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８.３）を表わす。
【００２６】製剤を室温で振とうしながら２時間インキ
ュベートした（カリクレインの場合は２０時間）。つい
で製剤のアリコートをＳＤＳ試料緩衝液と混合し（１：
１）、ウエスタンブロット分析によってその断片組成を
検討した。デンシトメトリーによるウエスタンブロット
分析後の１２、１８、１９、２０、２３、３３、３４、
３５、４４、４７、５０、５２、５４、５５、７１、お
よび７５kDの断片バンドのピーク面積積分を表２に示
す。
ュベートした（カリクレインの場合は２０時間）。つい
で製剤のアリコートをＳＤＳ試料緩衝液と混合し（１：
１）、ウエスタンブロット分析によってその断片組成を
検討した。デンシトメトリーによるウエスタンブロット
分析後の１２、１８、１９、２０、２３、３３、３４、
３５、４４、４７、５０、５２、５４、５５、７１、お
よび７５kDの断片バンドのピーク面積積分を表２に示
す。
【００２７】１２〜７１kDの分子質量範囲で、一連の断
片が上記のプロテアーゼにより生産できることは明らか
である。活性トロンビンに対応する断片（３３kD）はプ
ロトロンビンのトリプシン分解によって特に高収量で得
ることができる。
片が上記のプロテアーゼにより生産できることは明らか
である。活性トロンビンに対応する断片（３３kD）はプ
ロトロンビンのトリプシン分解によって特に高収量で得
ることができる。
【００２８】
【表２】
【００２９】実施例３：種々の濃度のデオキシコール酸
塩の存在による固定化したプロトロンビンの切断 前記のように、まず組換え体プロトロンビンを発酵上清
からＣａ3(ＰＯ4)2へ吸着させた。緩衝液１ml当たりト
リプシン（０.７６mg／ml）６０μlをそれぞれ添加した
湿潤吸着物の５試料（それぞれ０.６ｇ）溶液を、５０m
M、１００mM、２５０mM、３５０mM、および５００mMの
濃度でデオキシコール酸Ｎａを含有する２０mMトリス／
ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８.３）３mlとともに室温で振とう
しながら３時間インキュベートした。ここで培地の緩衝
液を０.９％ＮａＣｌと交換した。ついで試料のトロン
ビン活性を検討した。即ち、凝固試験では、正常血漿と
トロンビン時間を測定し、アミド分解活性は色素原性基
質ＴＨ−１（２ＡｃＯＨ.−Ｄ−ＣＨＧ−ａｌａ−ａｒ
ｇ−ｐ−ニトロアニリド）でそれぞれ測光的に、国際ト
ロンビン標準に対して測定した（図１）。図１から、活
性トロンビン（３３kDの断片）の収量はデオキシコール
酸塩３５０mMで最大を示すことが分かる。さらにトリプ
シンの存在にもかかわらず、生成したトロンビンは、少
なくとも２０時間経過してもそれ以上分解しないことが
判明した。
塩の存在による固定化したプロトロンビンの切断 前記のように、まず組換え体プロトロンビンを発酵上清
からＣａ3(ＰＯ4)2へ吸着させた。緩衝液１ml当たりト
リプシン（０.７６mg／ml）６０μlをそれぞれ添加した
湿潤吸着物の５試料（それぞれ０.６ｇ）溶液を、５０m
M、１００mM、２５０mM、３５０mM、および５００mMの
濃度でデオキシコール酸Ｎａを含有する２０mMトリス／
ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８.３）３mlとともに室温で振とう
しながら３時間インキュベートした。ここで培地の緩衝
液を０.９％ＮａＣｌと交換した。ついで試料のトロン
ビン活性を検討した。即ち、凝固試験では、正常血漿と
トロンビン時間を測定し、アミド分解活性は色素原性基
質ＴＨ−１（２ＡｃＯＨ.−Ｄ−ＣＨＧ−ａｌａ−ａｒ
ｇ−ｐ−ニトロアニリド）でそれぞれ測光的に、国際ト
ロンビン標準に対して測定した（図１）。図１から、活
性トロンビン（３３kDの断片）の収量はデオキシコール
酸塩３５０mMで最大を示すことが分かる。さらにトリプ
シンの存在にもかかわらず、生成したトロンビンは、少
なくとも２０時間経過してもそれ以上分解しないことが
判明した。
【００３０】切断したプロトロンビンのタンパク質断片
の精製 実施例３で誘導したプロトロンビン断片（３５０mM Ｄ
ＯＣ）を含有する溶液１.５mlを０.１％トリフルオロ酢
酸／Ｈ2Ｏ溶液（溶媒Ａ）で逆相ＨＰＬＣカラム（ヌク
レオシル(Nucleosil)１００−５Ｃ１８、１２５×４m
m）（流速：１.７ml／分）に吸着させた。ついでこれを
０.１％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル溶液（溶媒
Ｂ）の３０−７０％（Ｂ）直線濃度勾配で３０分間溶出
した（流速：１.７ml／分）。２２０nmで検出すること
により、６つの主ピーク（保持時間：１０.０１分、１
１.９６分、１２.６８分、１３.４７分、１３.９４分、
１４.４７分）を同定することができた。これらを別々
に採取し、凍結乾燥した。分別した断片を、クーマシー
(Coomassie)染色で検出するＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および
ポリクローナル家兎抗ヒト・プロトロンビン抗血清によ
るウエスタンブロット分析を用いてさらに分析した。断
片の分子質量を９kD、１６kD、２１kD、２３kD、１２k
D、および３３kDの６つの主ピークについて測定した。
の精製 実施例３で誘導したプロトロンビン断片（３５０mM Ｄ
ＯＣ）を含有する溶液１.５mlを０.１％トリフルオロ酢
酸／Ｈ2Ｏ溶液（溶媒Ａ）で逆相ＨＰＬＣカラム（ヌク
レオシル(Nucleosil)１００−５Ｃ１８、１２５×４m
m）（流速：１.７ml／分）に吸着させた。ついでこれを
０.１％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル溶液（溶媒
Ｂ）の３０−７０％（Ｂ）直線濃度勾配で３０分間溶出
した（流速：１.７ml／分）。２２０nmで検出すること
により、６つの主ピーク（保持時間：１０.０１分、１
１.９６分、１２.６８分、１３.４７分、１３.９４分、
１４.４７分）を同定することができた。これらを別々
に採取し、凍結乾燥した。分別した断片を、クーマシー
(Coomassie)染色で検出するＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および
ポリクローナル家兎抗ヒト・プロトロンビン抗血清によ
るウエスタンブロット分析を用いてさらに分析した。断
片の分子質量を９kD、１６kD、２１kD、２３kD、１２k
D、および３３kDの６つの主ピークについて測定した。
【００３１】実施例４：トロンビンの回収 緩衝液湿潤ペレット（約１０ｇ）を、デオキシコール酸
Ｎａ ２００mMを含有し、緩衝液１ml当たりブタ・トリ
プシン（シグマ(Sigma)Ｔ−０１３４）０.７６mgを含有
する２０mMトリス／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８.３）溶液５
０mlと室温でわずかに撹拌しながら１時間インキュベー
トした。そのあとリン酸カルシウムを遠心により分離し
た。上清は主としてトロンビンを含有し、そのほかに少
量のプロトロンビンのその他の断片を含有していた。
Ｎａ ２００mMを含有し、緩衝液１ml当たりブタ・トリ
プシン（シグマ(Sigma)Ｔ−０１３４）０.７６mgを含有
する２０mMトリス／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８.３）溶液５
０mlと室温でわずかに撹拌しながら１時間インキュベー
トした。そのあとリン酸カルシウムを遠心により分離し
た。上清は主としてトロンビンを含有し、そのほかに少
量のプロトロンビンのその他の断片を含有していた。
【００３２】上清を精製するため、２０mMトリス／ＨＣ
ｌ緩衝液（ｐＨ８.３）中で、カラム（断面積８cm2）を
フラクトジェル（商標）ＴＳＫ−ＡＦブルー（メルク
社）とともに１２mmの高さに充填し（ゲル容積：９.６m
l）、これと同じ緩衝液で洗浄した。これらの操作およ
びその後のすべての段階は４℃で行なった。トロンビン
を含有する上清（約５０ml）をゲルへ圧入し（流速：２
ml／分）、吸着を行なった。そのあと非特異的に結合し
たプロトロンビン断片を０.５Ｍ ＮａＣｌ溶液２０ml、
１.０Ｍ ＮａＣｌ溶液４０ml、および２０mMトリス／Ｈ
Ｃｌ緩衝液（ｐＨ７.４）２０mlで溶出した（流速：６m
l／分）。ついでＫＳＣＮ １Ｍを含有する２０mMトリス
／ＨＣｌ緩衝液を逆方向フロー（流速：１ml／分）で溶
出した。溶出液を流通セル（２８０nm）により分光測光
的に測定し、合計１５mlを採取した。
ｌ緩衝液（ｐＨ８.３）中で、カラム（断面積８cm2）を
フラクトジェル（商標）ＴＳＫ−ＡＦブルー（メルク
社）とともに１２mmの高さに充填し（ゲル容積：９.６m
l）、これと同じ緩衝液で洗浄した。これらの操作およ
びその後のすべての段階は４℃で行なった。トロンビン
を含有する上清（約５０ml）をゲルへ圧入し（流速：２
ml／分）、吸着を行なった。そのあと非特異的に結合し
たプロトロンビン断片を０.５Ｍ ＮａＣｌ溶液２０ml、
１.０Ｍ ＮａＣｌ溶液４０ml、および２０mMトリス／Ｈ
Ｃｌ緩衝液（ｐＨ７.４）２０mlで溶出した（流速：６m
l／分）。ついでＫＳＣＮ １Ｍを含有する２０mMトリス
／ＨＣｌ緩衝液を逆方向フロー（流速：１ml／分）で溶
出した。溶出液を流通セル（２８０nm）により分光測光
的に測定し、合計１５mlを採取した。
【００３３】溶出液のタンパク質含量はブラッドフォー
ド(Bradford)法により１８８mg／mlであった。図２に明
瞭な３３kD断片（活性トロンビン）を有する断片組成
（ウエスタンブロットのデンシトメトリー・スキャンに
よる）を示す。タンパク質含量に基づき、その約３０％
はトロンビンである。トロンビン時間の測定により、ト
ロンビンで、タンパク質の約２２００ＩＵ／mgの比活性
が測定できた。即ちトリプシン固相活性化によって、プ
ロトロンビン１ＩＵからトロンビン約１００ＩＵを得る
ことができた。得られたトロンビン含有溶液を既知の態
様でさらに精製し、濃縮し、さらに医薬製剤へ加工する
ことができる。
ド(Bradford)法により１８８mg／mlであった。図２に明
瞭な３３kD断片（活性トロンビン）を有する断片組成
（ウエスタンブロットのデンシトメトリー・スキャンに
よる）を示す。タンパク質含量に基づき、その約３０％
はトロンビンである。トロンビン時間の測定により、ト
ロンビンで、タンパク質の約２２００ＩＵ／mgの比活性
が測定できた。即ちトリプシン固相活性化によって、プ
ロトロンビン１ＩＵからトロンビン約１００ＩＵを得る
ことができた。得られたトロンビン含有溶液を既知の態
様でさらに精製し、濃縮し、さらに医薬製剤へ加工する
ことができる。
【００３４】実施例５：溶解したプロトロンビンの切断 プロトロンビン含有発酵上清１mlずつの２種の試料を、
４０mMトリス／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８.３）溶液と混合
した。溶液中の界面活性剤量がそれぞれ０.０５Ｍとな
るように、０.１Ｍデオキシコール酸Ｎａおよび０.１Ｍ
ドデシル硫酸Ｎａを緩衝液に含有させた。比較のため、
プロトロンビン含有発酵上清１mlを界面活性剤無添加の
４０mMトリス／ＨＣｌ緩衝液と混合して第３の試料とし
た。緩衝液１ml当たりトリプシン１mgを含有している２
０mMトリス／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８.３）（０.９％Ｎａ
Ｃｌ含有）溶液１５mlをそれぞれの試料に添加したの
ち、室温で振とうしながら４時間インキュベートした。
４０mMトリス／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８.３）溶液と混合
した。溶液中の界面活性剤量がそれぞれ０.０５Ｍとな
るように、０.１Ｍデオキシコール酸Ｎａおよび０.１Ｍ
ドデシル硫酸Ｎａを緩衝液に含有させた。比較のため、
プロトロンビン含有発酵上清１mlを界面活性剤無添加の
４０mMトリス／ＨＣｌ緩衝液と混合して第３の試料とし
た。緩衝液１ml当たりトリプシン１mgを含有している２
０mMトリス／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８.３）（０.９％Ｎａ
Ｃｌ含有）溶液１５mlをそれぞれの試料に添加したの
ち、室温で振とうしながら４時間インキュベートした。
【００３５】１、２、３、４時間後に、試料のアリコー
ト（５０μg）をそれぞれラエムリ(Laemmli)緩衝液で希
釈し（１：１）、これを煮沸し、電気泳動分析を行なっ
た。１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルのウエスタン
ブロット分析（第１抗体：抗ヒト第II因子家兎血清、第
２抗体：ヤギ抗家兎ＩｇＧペルオキシダーゼ結合体。４
−クロロ−１−ナフトールで展開）は、衝撃光により断
片を定量するデンシトメトリーにより測定した。その結
果を表３に示す。
ト（５０μg）をそれぞれラエムリ(Laemmli)緩衝液で希
釈し（１：１）、これを煮沸し、電気泳動分析を行なっ
た。１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルのウエスタン
ブロット分析（第１抗体：抗ヒト第II因子家兎血清、第
２抗体：ヤギ抗家兎ＩｇＧペルオキシダーゼ結合体。４
−クロロ−１−ナフトールで展開）は、衝撃光により断
片を定量するデンシトメトリーにより測定した。その結
果を表３に示す。
【００３６】
【表３】分子質量 （kD） 19 25.5 33 35添加物 反応時間（ｈ） ピーク面積積分 デオキシコール酸塩 1 10 2 9 3 7 4 6 ドデシル硫酸塩 1 8 68 2 6 67 3 5 69 4 4 67 ブランク値 1 4 9 4 2 3 1 0 3 0 0 0
【００３７】本発明の方法をトロンビンのプロトロンビ
ンからの回収について詳細に説明したが、当業者であれ
ばプロトロンビン以外のプロ酵素についても、これと同
様の態様で類似の切断を実施し得ることは理解し得よ
う。例えばこのような方法で、プラスミンをプラスミノ
ーゲンから回収でき、あるいは活性化血液凝固因子をそ
のプロ酵素から回収できる。
ンからの回収について詳細に説明したが、当業者であれ
ばプロトロンビン以外のプロ酵素についても、これと同
様の態様で類似の切断を実施し得ることは理解し得よ
う。例えばこのような方法で、プラスミンをプラスミノ
ーゲンから回収でき、あるいは活性化血液凝固因子をそ
のプロ酵素から回収できる。
【００３８】
【図１】 試料のトロンビン活性を示すトロンビン時間
測定による凝固試験、およびアミド分解活性の測定結果
を示すグラフである。
測定による凝固試験、およびアミド分解活性の測定結果
を示すグラフである。
【図２】 活性トロンビンを含有する断片のウエスタン
ブロットのデンシトメトリーの結果を示すグラフであ
る。
ブロットのデンシトメトリーの結果を示すグラフであ
る。
Claims (15)
- 【請求項１】 界面活性剤および凝固活性のある塩以外
のカオトロピック物質のいずれかの存在下でプロテアー
ゼ処理することにより、酵素またはタンパク質断片が得
られるように制御または制限された態様で処理を実施す
ることからなる酵素的分解によってタンパク質を切断す
る改良方法。 - 【請求項２】 タンパク質がプロ酵素である請求項１に
記載の方法。 - 【請求項３】 プロ酵素を固体担体物質上に固定化する
請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 タンパク質を固体担体物質上に固定化す
る請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】 固体担体物質が難溶性塩および２価金属
のキレートのいずれかである請求項３に記載の方法。 - 【請求項６】 固体担体物質が難溶性塩および２価金属
のキレートのいずれかである請求項４に記載の方法。 - 【請求項７】 ２価金属がアルカリ土類金属である請求
項５に記載の方法。 - 【請求項８】 ２価金属がアルカリ土類金属である請求
項６に記載の方法。 - 【請求項９】 プロテアーゼがトリプシン、キモトリプ
シン、カリクレイン、ジスパーゼ、およびエンドプロテ
イナーゼＧｌｕ−Ｃ、Ｌｙｓ−Ｃ、Ａｓｐ−Ｎからなる
群から選ばれたものである請求項１に記載の方法。 - 【請求項１０】 プロ酵素がプロトロンビンであって、
酵素がトロンビンである請求項２に記載の方法。 - 【請求項１１】 プロトロンビン含有溶液を提供し、固
体担体上に固定化したプロトロンビンを得るため、プロ
トロンビン含有溶液を固体担体と接触させ、トロンビン
含有溶液を得るため、界面活性剤の存在下でプロトロン
ビンをプロテアーゼで処理し、トロンビン含有溶液を分
離し、トロンビン含有溶液を精製し、トロンビン含有溶
液を医薬製剤に加工する組合わせからなるトロンビン含
有医薬製剤の製造方法。 - 【請求項１２】 固体担体物質が難溶性塩および２価金
属のキレートのいずれかである請求項１１に記載の方
法。 - 【請求項１３】 ２価金属がアルカリ土類金属である請
求項１２に記載の方法。 - 【請求項１４】 プロテアーゼがトリプシンである請求
項１１に記載の方法。 - 【請求項１５】 界面活性剤がデオキシコール酸塩であ
る請求項１１に記載の方法。
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