CZ282924B6 - Extrakt bakteriálních makromolekul, způsob jeho přípravy a farmaceutický prostředek na jeho bázi - Google Patents

Extrakt bakteriálních makromolekul, způsob jeho přípravy a farmaceutický prostředek na jeho bázi Download PDF

Info

Publication number
CZ282924B6
CZ282924B6 CZ932064A CZ206493A CZ282924B6 CZ 282924 B6 CZ282924 B6 CZ 282924B6 CZ 932064 A CZ932064 A CZ 932064A CZ 206493 A CZ206493 A CZ 206493A CZ 282924 B6 CZ282924 B6 CZ 282924B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
extract
bacterial
extraction
amino acids
bacteria
Prior art date
Application number
CZ932064A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ206493A3 (en
Inventor
Pierre Hirt
Adrian Schulthess
Jacques Bauer
Original Assignee
Laboratoires Om S.A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Laboratoires Om S.A. filed Critical Laboratoires Om S.A.
Publication of CZ206493A3 publication Critical patent/CZ206493A3/cs
Publication of CZ282924B6 publication Critical patent/CZ282924B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/848—Escherichia
    • Y10S435/849—Escherichia coli
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/851—Haemophilus
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/852—Klebsiella
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/871—Neisseria
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/885—Streptococcus
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/886—Streptomyces

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)

Abstract

Extrakt na bázi modifikovaných bakteriálních proteinů obsahuje směs bakteriálních polyaniontů s molekulovou hmotností 10.000 až 1,000.000 a isoelektrickým bodem 2,5 až 5,5 v níž celková hmotnost stavebních aminokyselin tvoří alespoň 50 % extraktu. Příprava extraktu spočívá v kultivaci bakterií ve vodném prostředí, pak alkalické extrakci suspenze bakterií a čištění bílkovinného extraktu. Alkalická extrakce se provádí v přítomnosti zředěného vodného zdroje iontů OH.sup.- .n.a při stabilním pH mezi 11 a 13, přičemž pokles pH během extrakce není vyšší než 0,4. Takto získaný bílkovinný extrat je možno použít jako účinnou složku farmaceutického prostředku.ŕ

Description

(57) Anotace:
Extrakt na bázi modifikovaných bakteriálních proteinů obsahuje směs bakteriálních polyaniontů s molekulovou hmotností 10 000 až 1 000 000 a izoelektrickým bodem 2,5 až 5,5, v níž celková hmotnost stavebních aminokyselin tvoří alespoň 50 % extraktu. Příprava extraktu spočívá v kultivaci bakterií ve vodném prostředí, pak alkalické extrakci suspenze bakterií a čištění bílkovinného extraktu. Alkalická extrakce se provádí v přítomnosti zředěného vodného zdroje iontů OH' a při stabilním pH mezi 11 a 13. přičemž pokles pH během extrakce není vyšší než 0,4. Takto získaný bílkovinný extrát Je možno použít Jako účinnou složku farmaceutického prostředku.
Extrakt bakteriálních makromolekul na bázi modifikovaných bakteriálních proteinů, způsob jeho přípravy a farmaceutický prostředek tento extrakt obsahující
Oblast techniky
Vynález se týká extraktu bakteriálních makromolekul na bázi modifikovaných bakteriálních proteinů, způsobu jeho přípravy a farmaceutického prostředku, který uvedený extrakt obsahuje jako účinnou látku.
Dosavadní stav techniky
Jsou známy bakteriální produkty s terapeutickou účinností, které se získávají alkalickou hydrolýzou. Například v patentovém dokumentu CH 633 188 se popisuje koncentrát bakteriálního lyzátu s antiinfekčními vlastnostmi. Lyzáty jednotlivých bakteriálních kmenů se získávají progresivní alkalickou hydrolýzou (při hodnotě pH 9 až 10), která vede k destrukci viditelné bakteriální struktury.
Podstata vynálezu
V rámci vynálezu bylo nyní nově zjištěno, že je možné získat bakteriální extrakty s různými imunofarmakologickými účinky, například s výrazným imunomodulačním účinkem, specifickým alkalickým zpracováním, které umožňuje ponechat viditelnou bakteriální strukturu zpracovaných bakterií neporušenou. Toto zpracování spočívá v alkalické extrakci za podmínek vyššího a zejména stabilního pH.
Předmětem vynálezu je extrakt bakteriálních makromolekul na bázi modifikovaných bakteriálních proteinů, jehož podstata spočívá v tom, že sestává ze směsi kyselých bakteriálních polyaniontů o molekulové hmotnosti 10 000 až 1 000 000 a s izoelektrickým bodem v rozmezí
2,5 až 5,5, v němž celková hmotnost stavebních aminokyselin představuje alespoň 50 % hmotnosti extraktu.
Výhodně celková hmotnost aminokyselin činí 55 až 85 % a obsah liposacharidů je nižší než 2.10'3 %, přičemž extrakt dále obsahuje nejvýše 2 % volných aminokyselin, nejvýše 8 % glycidů, nejvýše 4 % aminocukrů a nejvýše 15 % kyseliny desoxyribonukleové.
Výhodně extrakt zahrnuje, racemizované aminokyseliny kterými jsou alespoň serin s 25 až 45 % konfigurace D, kyselina asparagová s 10 až 30 % a arginin s 3 až 20 %.
Předmětem vynálezu je rovněž způsob přípravy výše uvedeného extraktu, jehož podstata spočívá v kultivaci bakterií v kapalném kultivačním prostředí, v suspendování těchto bakterií ve vodném prostředí, v alkalické extrakci této suspenze bakterií a v čistění získaného bílkovinového extraktu, přičemž alkalická extrakce se provádí v přítomnosti zředěného vodného zdroje iontů OH’ a při stabilním pH v rozmezí 11 až 13, přičemž pokles hodnoty pH v průběhu extrakce není vyšší než 0,4.
Výhodně se ke kultivaci použijí bakterie Escherichia coli, například kmen 1-1147, uložený u Pasteurova institutu, zdrojem iontů OH'je roztok hydroxidu sodného o koncentraci 0,01 až 1 %, pH je v rozmezí 12,0 až 12,5, teplota se během extrakce udržuje mezi 30 a 45 °C a doba extrakce se pohybuje od řádově hodin do jednoho týdne.
Výhodně se bílkovinný extrakt, získaný alkalickou extrakcí, podrobí čištění, zahrnujícímu alespoň jednostupňovou ultrafiltraci, zpracování neionogenním detergentem, chromatografii nebo/a sterilní filtraci a lyofilizaci.
Předmětem vynálezu je také farmaceutický prostředek s imunomodulačními vlastnostmi, jehož podstata spočívá v tom, že jako účinnou složku obsahuje terapeuticky přijatelné množství výše uvedeného extraktu bakteriálních makromolekul na bázi modifikovaných bakteriálních proteinů.
Předmětem vynálezu je konečně farmaceutický prostředek pro léčbu rakoviny, jehož podstata spočívá v tom, že jako účinnou složku obsahuje terapeuticky účinné množství výše uvedeného extraktu bakteriálních makromolekul na bázi modifikovaných bakteriálních proteinů.
Použití termínu modifikované proteiny je mimo jiné spojeno s přítomností aminokyselin v konfiguraci D v bílkovinném extraktu podle vynálezu, neboť konfigurace L je přítomna v přírodních proteinech.
V podstatě je možné jako výchozí produkt způsobu podle vynálezu použít jakýkoliv grampozitivní nebo gramnegativní bakteriální kmen, jakým je kmen Escherichia coli nebo některý z kmenů, popsaných v již zmíněném patentovém dokumentu CH 633 188. Tak například dále popsané příkladné provedení způsobu podle vynálezu se provádí za použití kmene Escherichia coli 1-1147, který je uložen v rámci Budapešťské smlouvy v Národní sbírce mikroorganismů v Pasteurově ústavu v Paříži.
Příklady provedení vynálezu
A. Předběžné stupně
Primární inokulum se připraví ze zmrazených bakterií, které se oživí střídavou kultivací v kapalném prostředí, na bázi sójové živné půdy, a na pevné kultivační půdě. Objem kultivačního inokula se postupně zvyšuje až na 1 litr, přičemž se k inokulaci používá běžné kapalné kultivační prostředí a inkubace se provádí za třepání při teplotě 37 °C.
Takto připravené sekundární inokulum se zavede do fermentoru, majícího objem 20 1 a obsahujícího 5 1 vhodného běžného živného média. Hodnota pH se nastaví a udržuje na 7,0, například 5 % amoniakem, a teplota se reguluje na 37 °C. Kultivace bakterií se provádí za provzdušňování (vzduch) a míchání, za kontrolovaných podmínek, vedoucích k získání pO2 vyššího než 90 % nasycení. Provede se měření optické hustoty při 700 nm. Na konci kultivace se bakterie inaktivují teplem autoklávováním (30 min při 120 °C) nebo mžikovou pasterizací (90 s při 105 °C) a odebere se vzorek k ověření absence životaschopných zárodků.
Bakteriální suspenze se zahustí a nespotřebované zbytky kultivačního prostředí se odstraní odstředěním nebo výhodně tangenciální ultrafiltraci, například ultrafiltračním systémem FILTRON na polysulfonových patronách. Tato ultrafiltrace se provádí ve dvou stupních; nejprve se provede 5 až lOnásobná koncentrace (membrány 30 kD až 0,3 pm) a pak promývání diafiltrací fyziologickým roztokem (3 až 15 promývacích objemů).
Stanoví se sušina bakteriální suspenze, což umožňuje adjustovat biomasu přípravku před alkalickou extrakcí. Konečná suspenze bakterií se zředí fyziologickým roztokem a konečná sušina bakterií se upraví na 2 až 20 g/1.
-2CZ 282924 B6
B. Alkalická extrakce
Pro vlastní alkalickou extrakci se koncentrace NaOH v bakteriální suspenzi upraví na 0,01 až
I %, zde na 0,1 %.
Extrakce se provádí za míchání mezi 30 a 45 °C, zde při asi 37 °C. V průběhu doby se odebírají vzorky pro analytické účely. Analýza zahrnuje měření pH, stanovení proteinů a lipopolysacharidů. Bakterie, použité k získání dávek I a II, byly zahuštěny apromyty (stupeň A) na patroně 30 kD a v případě dávky III na patrone 1000 kD. V těchto příkladech byla doba trvání io procesu alkalické extrakce mírně kratší než dva dny. Výsledky, vztahující se ke třem dávkám (I,
II a III), získaným z uvedeného kmene Escherichia coli, jsou shrnuty v tabulce 1.
Tabulka 1. Monitorování alkalické extrakce
Dávka sušina (g/D doba PH proteiny* (mg/1) LPS** (mg/1)
I 7,4 0 min 7,0 220 >100
5 min 12,3 910 100
22 h 12,3 1530 8,0
46 h 12,3 1850 1,0
II 7,4 0 min 7,0 250 >100
5 min 12,4 870 100
22 h 12,4 1580 10
46 h 12,3 1990 3,3
III 7,0 0 min 7,0 60 >100
5 min 12,4 710 100
22 h 12,4 1260 10
46 h 12,4 1640 1,0
* stanovení proteinů Bradfordovou metodou, reference: hovězí sérový albumin (BSA), ** stanovení LPS metodou LAL, reference: LPS Escherichia coli 0111:B4.
Toto monitorování dále umožňuje odborníkovi stanovit přibližnou dobu procesu alkalické extrakce v závislosti na zamýšleném použití s ohledem na typ použitých bakterií a podmínky pH 25 a teploty. Tato doba se obecně pohybuje mezi několika hodinami a asi jedním týdnem.
Pokud se týká pH, je nutno připomenout, že jedna z charakteristik vynálezu spočívá ve stabilním pH, které se udržuje mezi 11 a 13, například mezi 12,0 a 12,5, s poklesem v průběhu extrakčního procesu nanejvýš 0,4. V tomto příkladu bylo pH 12,3 až 12,4 s maximální výchylkou v průběhu 30 extrakce 0,1.
Další významná výhoda způsobu podle vynálezu je zřejmá z výsledků, uvedených v tabulce 1. Je možno konstatovat, že obsah lipopolysacharidů v získaném bílkovinném extraktu je značně redukován.
Na konci extrakce a před čištěním bílkovinného extraktu se provede mikroskopická kontrola bakterií po zbarvení gram k ověření, že viditelné struktury bakterií jsou neporušené.
C. Čištění bílkovinného extraktu
Bílkovinný extrakt, získaný postupem podle stupně B, se frakcionuje ultrafiltrací; konkrétně se provede 5 až ÍOnásobná koncentrace ultrafiltrací (1000 kD), a účinná složka se extrahuje diafíltrací například s vodou. Nakonec se bílkovinný extrakt zahustí ultrafiltrací (10 kD).
to Za účelem eliminace větší části endotoxinů, konkrétně LPS, se bílkovinný extrakt podrobí procesu fázového přenosu s neiongenním detergentem. Tento proces je možno například provést v přítomnosti 7% Tritonu X-114 zahříváním za míchání po dobu asi 20 min na asi 60 °C. Po oddělení fází se spodní fáze (Triton + LPS) odstraní. Horní vodná fáze, obsahující bílkovinný extrakt, se shromáždí a pH se upraví na 7.
Tato vodná fáze se podrobí iontovýměnné chromatografii k dalšímu snížení obsahu LPS a odstranění neionogenního detergentu. K této chromatografii je možno použít například gel DEAE-Sepharose. Konkrétně se vodná fáze, obsahující bílkovinný extrakt, nejprve adsorbuje na měnič iontů, pak se odstraní molekuly, které nebyly zachyceny, a promytím při nízkém pH se 20 odstraní nečistoty. Po ekvilibraci gelu při neutrálním pH se bílkovinný extrakt eluuje zvyšováním iontové síly a pak se eluát zahustí ultrafiltrací a promyje diafíltrací s vodou. Takto vyčištěný bílkovinný extrakt se sterilně přefiltruje a popřípadě lyofilizuje obvyklým o sobě známým způsobem.
Lyofilizát byl podroben biochemickým analýzám a imunofarmakologickým testům. Stanovení aminokyselin, racemizovaných během alkalické extrakce, bylo provedeno podle Nimury N. aKinoshity T., J. Chromatography, 352, 169-177, 1986. Různé racemizace, detekované v bílkovinných extraktech (loty I, II a III), jsou jako příklady uvedeny v tabulce 2 a vyjádřeny v % konfigurace D.
Tabulka 2. Racemizované aminokyseliny
parametry: lot I % konfigurace D II III
racemizované aminokyseliny:
kyselina asparagová 18 18 20
serin 33 35 39
arginin 8 10 12
Neracemizované: alanin, tyrosin, valin, fenylalanin a leucin.
Nedetekovatelné: kyselina glutamová, threonin, prolin, methionin, isoleucin, cystein, lysin, histidin a tryptofan.
Analytické výsledky jsou uvedeny v tabulce 3.
-4CZ 282924 B6
Tabulka 3. Složky lyofilizátu
parametry: lot I % lyofilizátu II III
obsah proteinů:
proteiny (Bradford) 69,2 70,4 63,1
bílkovinné aminokyseliny:
asparagin a kys. asparagová 7,3 7,3 7,1
glutamin a kys. glutamová 9,6 9,5 8,9
serin 2,6 2,4 2,2
threonin 2,9 3,2 2,3
glycin 3,8 3,9 3,3
alanin 5,9 5,6 5,6
arginin 4,8 4,6 5,3
prolin 2,5 2,4 2,5
valin 4,9 5,0 4,4
methionin 3,1 4,0 3,4
isoleucin 4,1 4,0 3,5
leucin 6,3 6,3 5,9
fenylalanin 3,3 3,3 3,3
cystin nd nd nd
lysin 5,0 4,9 4,7
histidin 1,6 1,9 1,9
tyrosin 3,9 4,0 3,9
celkem 71,7 72,6 68,1
frakce vázané na proteiny:
mastné kyseliny 0,9 0,9 1,0
glycidy 3,9 3,6 4,7
aminocukry 1,8 1,5 2,8
jiné:
lipopolysacharidy (LPS) 6,1.10-4 8,4.10-4 2,5.10'
desoxyribonukleové kys. (DNA) 9,5 6,1 4,5
volné aminokyseliny nd nd nd
voda 4,8 4,9 8 4,8
elementární analýza:
popel 6,0 7,5 7,2
uhlík 47,1 47,0 46,3
vodík 6,7 6,7 6,6
dusík 13,6 14,0 13,6
síra 1,3 1,4 1,8
nd = nedetekováno
Imunofarmakologické vlastnosti
Bylo jasně demonstrováno, zejména testy in vitro a in vivo na pokusných zvířatech, že bílkovinný extrakt podle vynálezu má imunomodulační vlastnosti a protinádorovou účinnost.
1. Imunologické testy in vitro
Imunologické testy in vitro byly prováděny na makrofágách, derivovaných z kostní dřeně, a na lymfocytech ze sleziny, Peyerových plátů nebo mesenterických ganglií, odebraných myším 5 C57BL/6.
Makrofágové modely: Bílkovinný extrakt stimuluje makrofágy v jejich schopnosti aktivovat oxidační metabolismus glukózy v dráze pentózofosfátů a aktivuje produkci metabolitů dusíku (nitritový test). Sekrece TNF, stejně jako produkce prostaglandinů (PGE2) u makrofágů je io stimulována bílkovinným extraktem.
Nitritový test, uvedený jako příklad, byl proveden podle M. A. Marletty, Biochemistry, 27, 87068711, 1988. Makrofágy, odvozené od kostní dřeně, se kultivují na mikroplotnách (70.000 makrofágů na jamku) v přítomnosti různých koncentrací bílkovinného extraktu (0,1 až 50 pg 15 extraktu/ml) nebo lipopolysacharidů E. coli jako pozitivní kontroly (0,0004 až 0,2 pg LPS/ml).
Produkce NO2‘ v supematantech makrofágových kultur se stanoví pomocí Griessova činidla podle J. Mauěla et al., Int. J. Immunopharmac., 11, 637-645, 1989.
Tabulka 4. Výsledky nitritového testu
pg extraktu/ml nmol NO27ml pg LPS/ml nmol NO2 /ml
0 <0,02 0 <0,02
0,1 0,9 ±0,1 0,0004 0,1 ±0,1
0,39 4,1 ±0,1 0,0016 0,3 ±0,1
1,56 7,7 ± 0,2 0,0063 4,2 ±0,1
6,25 10,8 ±0,2 0,025 6,5 ± 0,4
25,0 13,1 ±0,8 0,1 7,1 ±1,0
50,0 15,1 ±0,3 0,2 8,3 ± 0,2
Výsledky při různých koncentracích testovaných produktů jsou uvedeny v tabulce 4 v nmol NO2’ /ml buněčného supematantu v závislosti na koncentraci extraktu nebo LPS. Bílkovinný extrakt 25 vyvolává silnou produkci NO2'.
Lymfocytámi modely: Lymfocyty, pocházející ze sleziny, Peyerových plátů nebo mesenterických ganglií, se kultivují na mikroplotnách (5.1Ο5 buněk na jamku) za standardizovaných kultivačních podmínek v přítomnosti různých koncentrací bílkovinného extraktu (1 až 100 pg 30 extraktu/ml) nebo lipopolysacharidů E. coli jako pozitivní kontroly (1 až 100 LPS pg/ml).
Proliferace buněk, vyvolaná produkty, je stanovována mírou inkorporace tritiovaného thymidinu do DNA buněk podle J. Louise et al., Eur. J. Immunol., 9, 841-847, 1979. Amplituda stimulace lymfocytů bílkovinným extraktem je za stejné koncentrace u všech tří zdrojů lymfocytů srovnatelná s pozitivní kontrolou. Bílkovinný extrakt je aktivní od 1 pg extraktu/ml a vykazuje 35 maximum aktivity mezi 30 a 100 pg extraktu/ml.
2. Imunologický test in vivo
Protinádorová účinnost bílkovinného extraktu byla prokázána in vivo na modelu vyvolaného 40 peritoneálního karcinomu u myší BD IX.
-6CZ 282924 B6
Použité buňky: Buňky Pro b byly klonovány z kultury buněk K12, izolovaných z nádoru DHD, vyvolaného dimethylhydrazinem u polorodé myši BD IX, podle F. Martina et al., Int. J. Cancer, 32, 623-627, 1983.
Indukce peritoneálních karcinomů: Buňky Pro b, vstříknuté intraperitoneální cestou syngenním myším (106 buněk/myš), vyvolávají po asi deseti dnech četné pevné noduly, které se objevují v epiploonu nebo mesenteriu na úrovni mléčných skvrn (milky spots) a pak progresivně pronikají do peritoneální dutiny, podle P. Lagadaca et al., Invasion and Metastasis, 7, 83-95, 1987. Po dalších 4 až 5 týdnech se objevuje krvácivá vodnatelnost a všechny myši umírají po 8 až 12 týdnech.
Indukce pulmonálních metastáz: Vstříknutí 7.106 buněk Pro b do femorální žíly vyvolává pulmonální metastázy, které napadají laloky, a všechny myši umírají po 6 až 10 týdnech.
Léčba peritoneálních a pulmonálních karcinomů: Imunoterapie se zahajuje 14 dní po injekci nádorových buněk, když jsou karcinomy makroskopické. Léčba spočívá v intraperitoneálních injekcích bílkovinného extraktu v množství 10 mg na kg tělesné hmotnosti. Myši dostávají celkem 5 injekcí v odstupu 3 až 5 dní. Každý pokus zahrnuje kontrolní a ošetřovanou skupinu o 10 (nebo 12) myších, které jsou očíslovány.
Výsledky: Myši se usmrtí 6 týdnů po vstříknutí buněk a provede se autopsie. Objem peritoneálních karcinomů se zhodnotí naslepo a myši se seřadí podle vzrůstající velikosti karcinomů. Sestaví se stupnice karcinomatózy podle počtu a velikosti pozorovaných nodulů. Objem hemorrhagických ascitů se měří dvojím vážením. Klasifikace pulmonálních metastáz se provede po mikroskopickém pozorování plic a myši se rozdělí do dvou skupin: s metastázami a bez nich.
Získané výsledky ukazují, že v osmi pokusech na 82 ošetřených myších nevykazovala 41 myš při autopsii žádný nodulus (40 až 60 % myší na pokus); u ostatních myší byl růst nodulů významně inhibován. Kromě toho 78 z 82 myší nevykazovalo ascites. Všechny neošetřené myši měly nádory a hemorrhagické ascity. Tyto výsledky potvrzuje rovněž test přežití: z 10 myší, ošetřených bílkovinným extraktem, přežily 3 myši do 10., 18. a 27. měsíce po injekci rakovinných buněk a při autopsii neměly nádor. Všechny myši z kontrolní skupiny zemřely na nádor 3 měsíce po injekci buněk.
Výsledky, získané během dvou pokusů s růstem pulmonálních metastáz, dále umožnily prokázat, že bílkovinný extrakt má systemický účinek. Z 20 myší, léčených intraperitoneální injekcí, totiž 13 myší vykazuje úplnou inhibici růstu pulmonálních metastáz. Protinádorový účinek bílkovinného extraktu se dosahuje u metastáz, vyvolaných rakovinnými buňkami tračníku a rovněž disociovanými nádory. Během léčby nebyly pozorovány známky toxicity.
3. Akutní toxicita
Bílkovinný extrakt má slabou toxicitu. Jednotkové dávky, dosahující 300 mg na kg, aplikované intraperitoneálně, jsou myšmi dobře tolerovány.
4. Aplikace
Aplikace bílkovinného extraktu se provádí injekčně, výhodně intraperitoneálně, ve formě lyofilizátu, rozpuštěného například ve fyziologickém roztoku. Stejně je možno použít další galenické formy, například aplikované orální, rektální nebo topickou cestou.
Všechna procenta, uváděná v textu, jsou procenty hmotnostními.

Claims (8)

1. Extrakt bakteriálních makromolekul na bázi modifikovaných bakteriálních proteinů, vyznačený tím, že sestává ze směsi kyselých bakteriálních polyaniontů o molekulové hmotnosti 10 000 až 1 000 000 a s izoelektrickým bodem v rozmezí 2,5 až 5,5, v němž celková hmotnost stavebních aminokyselin představuje alespoň 50 % hmotnosti extraktu.
2. Extrakt podle nároku 1, vyznačený tím, že celková hmotnost aminokyselin činí 55 až 85 % a obsah liposacharidů je nižší než 2.10'3 %, přičemž extrakt dále obsahuje nejvýše 2% volných aminokyselin, nejvýše 8 % glycidů, nejvýše 4 % aminocukrů a nejvýše 15 % kyseliny desoxyribonukleové, přičemž všechna uvedená % jsou hmotnostní.
3. Extrakt podle nároku 1, vyznačený tím, že zahrnuje racemizované aminokyseliny, kterými jsou alespoň serin s 25 až 45 % konfigurace D, kyselina asparagová s 10 až 30 % a arginin s 3 až 20 %, přičemž všechna uvedená % jsou hmotnostní.
4. Způsob přípravy extraktu podle nároku 1, vyznačený tím, že spočívá v kultivaci bakterií v kapalném kultivačním prostředí, v suspendování těchto bakterií ve vodném prostředí, v alkalické extrakci této suspenze bakterií a v čištění bílkovinného extraktu, přičemž alkalická extrakce se provádí v přítomnosti zředěného vodného zdroje iontů OH' a při stabilním pH v rozmezí 11 až 13, přičemž pokles hodnoty pH v průběhu extrakce není vyšší než 0,4.
5. Způsob podle nároku 4, vyznačený tím, že se ke kultivaci použijí bakterie Escherichia coli, zejména kmen 1-1147, uložený u Pasterova institutu, zdrojem iontů OH je roztok hydroxidu sodného o koncentraci 0,01 až 1 %, pH je v rozmezí 12,0 až 12,5, teplota se během extrakce udržuje mezi 30 a 45 °C a doba extrakce se pohybuje od řádově hodin do jednoho týdne.
6. Způsob podle nároku 4 nebo 5, vyznačený tím, že bílkovinný extrakt, získaný alkalickou extrakcí, se podrobí čištění, zahrnujícímu alespoň jednostupňovou ultrafiltraci, zpracování neionogenním detergentem, chromatografii nebo/a sterilní filtraci a lyofilizaci.
7. Farmaceutický prostředek s imunomodulačními vlastnostmi, vyznačený tím, že jako účinnou složku obsahuje terapeuticky přijatelné množství extraktu podle nároků 1 až 3.
8. Farmaceutický prostředek pro léčbu rakoviny, vyznačený tím, že jako účinnou složku obsahuje terapeuticky přijatelné množství extraktu podle nároku 1 až 3.
CZ932064A 1992-02-14 1993-02-03 Extrakt bakteriálních makromolekul, způsob jeho přípravy a farmaceutický prostředek na jeho bázi CZ282924B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CH450/92A CH685498A5 (fr) 1992-02-14 1992-02-14 Extrait de macromolécules bactériennes, procédé pour sa préparation et composition pharmaceutique contenant cet extrait.
PCT/CH1993/000029 WO1993016190A1 (fr) 1992-02-14 1993-02-03 Extrait de macromolecules bacteriennes, procede pour sa preparation et composition pharmaceutique contenant cet extrait

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ206493A3 CZ206493A3 (en) 1994-04-13
CZ282924B6 true CZ282924B6 (cs) 1997-11-12

Family

ID=4187312

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ932064A CZ282924B6 (cs) 1992-02-14 1993-02-03 Extrakt bakteriálních makromolekul, způsob jeho přípravy a farmaceutický prostředek na jeho bázi

Country Status (17)

Country Link
US (1) US5424287A (cs)
EP (1) EP0580829B1 (cs)
JP (1) JPH06507077A (cs)
AT (1) ATE160588T1 (cs)
BR (1) BR9304205A (cs)
CA (1) CA2106854A1 (cs)
CH (1) CH685498A5 (cs)
CZ (1) CZ282924B6 (cs)
DE (1) DE69315388T2 (cs)
DK (1) DK0580829T3 (cs)
ES (1) ES2111149T3 (cs)
GR (1) GR3025882T3 (cs)
HU (1) HU215262B (cs)
PL (1) PL175058B1 (cs)
RO (1) RO117621B1 (cs)
SK (1) SK279877B6 (cs)
WO (1) WO1993016190A1 (cs)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2703587B1 (fr) 1993-04-06 1995-06-16 Oreal Composition cosmetique coloree.
DK0775150T3 (da) 1994-02-07 1999-11-08 Qiagen Gmbh Fremgangsmåde til reduktion eller fjernelse af endotoksiner
DE19710255A1 (de) * 1997-03-13 1998-09-17 Henkel Ecolab Gmbh & Co Ohg Verwendung einer Lösung zur Desaktivierung von Endotoxinen
FR2842208B1 (fr) * 2002-07-10 2004-10-22 Lco Sante Extraits membranaires de klebsiella presentant des proprietes avantageuses, et procede de production de ces extraits
AR062711A1 (es) * 2006-09-08 2008-11-26 Wyeth Corp Lavado de arginina en l a purificacion de proteinas usando cromatografia de afinidad
PL2117587T3 (pl) * 2007-03-05 2018-07-31 Om Pharma Ekstrakt bakteryjny przeznaczony do stosowania względem zaburzeń układu pokarmowego lub moczowego i sposób jego wytwarzania
AU2013200193B2 (en) * 2007-03-05 2015-04-23 Om Pharma Bacterial extract for digestive or urinary tract disorders and process for its preparation
PL2114421T3 (pl) * 2007-03-05 2018-07-31 Om Pharma Ekstrakt bakteryjny do stosowania względem zaburzeń oddechowych i sposób jego wytwarzania
AU2013202504B2 (en) * 2007-03-05 2014-09-11 Om Pharma Bacterial extract for respiratory disorders and process for its preparation
US20100055082A1 (en) * 2008-09-04 2010-03-04 Jacques Alain Bauer Immunomodulatory extracts from lactobacillus bacteria and methods of manufacturing and use thereof
CN102617703A (zh) * 2012-04-14 2012-08-01 拜明(苏州)生物技术有限公司 一种无需裂解高效提取发酵细菌中外源表达蛋白的方法
JP2014200194A (ja) * 2013-04-04 2014-10-27 浜松ホトニクス株式会社 細胞から細胞小器官又はタンパク質を回収する方法
SG11202109937UA (en) 2019-03-14 2021-10-28 Om Pharma Sa Stable bacterial extracts as pharmaceuticals

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2405298A1 (fr) * 1977-01-27 1979-05-04 Cassenne Lab Sa Nouvelles glycoproteines isolees d'escherichia coli, procede de preparation et application de medicaments
FR2396018A1 (fr) * 1977-07-01 1979-01-26 Cassenne Lab Sa Nouveaux glycopeptides acetyles hydrosolubles extraits de corps microbiens lyses d'escherichia coli, procede de preparation et application a titre de medicaments de ces produits
CH633188A5 (fr) * 1978-05-26 1982-11-30 Om Laboratoires Sa Medicament contre des maladies infectieuses des voies respiratoires.

Also Published As

Publication number Publication date
HU215262B (hu) 1998-11-30
HU9302893D0 (en) 1994-01-28
BR9304205A (pt) 1994-08-02
CA2106854A1 (en) 1993-08-15
HUT70268A (en) 1995-09-28
EP0580829B1 (fr) 1997-11-26
EP0580829A1 (fr) 1994-02-02
ATE160588T1 (de) 1997-12-15
CZ206493A3 (en) 1994-04-13
PL175058B1 (pl) 1998-10-30
JPH06507077A (ja) 1994-08-11
RO117621B1 (ro) 2002-05-30
SK111193A3 (en) 1994-03-09
GR3025882T3 (en) 1998-04-30
DE69315388D1 (de) 1998-01-08
CH685498A5 (fr) 1995-07-31
WO1993016190A1 (fr) 1993-08-19
ES2111149T3 (es) 1998-03-01
PL301012A1 (en) 1994-04-05
US5424287A (en) 1995-06-13
DK0580829T3 (da) 1998-08-10
DE69315388T2 (de) 1998-05-14
SK279877B6 (sk) 1999-05-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Stirm et al. Episome-carried surface antigen K88 of Escherichia coli II. Isolation and chemical analysis
SU1297712A3 (ru) Способ получени анатоксина @ @
CN101663041B (zh) 用于呼吸病症的细菌提取物及其制备方法
CZ206493A3 (en) Extract of bacterial macro-molecules, process of its preparation and pharmaceutical preparation based thereon
Gmeiner The isolation of two different lipopolysaccharide fractions from various Proteus mirabilis strains
Vaheri et al. Mitogenic effect by lipopolysaccharide and pokeweed lectin on density-inhibited chick embryo fibroblasts
JPS6123167B2 (cs)
IT8922693A1 (it) Derivati semisintetici ad attivita&#39; immunomodulante atti alla somminitrazione parenterale ed orale
EP0132125B1 (en) A protein having antitumor activity
CN117843718A (zh) 一种蛋源双功能生物活性肽及其制备方法和应用
HU191746B (en) Process for producing new proteins for diminishing level of cholesterol in the blood and pharmaceutical compositions containing them
Okuda et al. An envelope-specific glycoprotein from Escherichia coli B
EP0027710B1 (en) Antibiotic substances, a process for the preparation and compositions thereof; a new strain of staphylococcus epidermidis which produces the said antibiotic substance and compositions thereof
Smith et al. The chemical basis of the virulence of Bacillus anthracis. VI: an extracellular immunising aggressin isolated from exudates of infected guinea-pigs
Opekarová et al. Isolation and Properties of an Arginine‐Binding Protein from Saccharomyces cerevisiae
CA1105863A (en) Biologically active substance
Payne et al. The relationship between soil bacteria with simple nutritional requirements and those requiring amino acids
WO1991018104A1 (en) Indh enzyme compositions and their methods of use
Lenfant et al. The purification of an immunosuppressive factor extracted from bovine spleen—III: Purification process
KITAGAWA et al. Chemical Studies on Cellular Components of Hemophilus pertussis II. Isolation of Toxic Lipopolysaccharide
GB2042558A (en) Interferon inducers, methods for their preparation, pharmaceutical compositions containing them and their use as medicaments
IT8348851A1 (it) Procedimento per preparare una sostanza avente attivita&#39; carcinostatica ed immunostimolante
CN119060135A (zh) 一种鸽蛋清功能肽及其制备方法与应用
JPS608226A (ja) 低分子蛋白質を有効成分とする制ガン剤
SU1167198A1 (ru) Питательна среда дл культивировани бифидобактерий штамма @ @ N 1

Legal Events

Date Code Title Description
IF00 In force as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20000203