JPS608226A - 低分子蛋白質を有効成分とする制ガン剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規な低分子蛋白質に関する。

カースウェル（Ｃａｒｓｗｅｌｌ　）らは、バチルスカ
ルメツティ　グエリン（Ｂ　ａｃｉｌｌｕｓ　Ｃａｌ１
６ｔｔｅＧｕ６ｒｉｎ　、　ＢＣＧ＞で感作したマウス
に、１４日目にエンドトキシンを投与すると、２時間後
にその血清中に、Ｌ−細胞に対して細胞毒性を有する因
子が産生されることを見い出し、これをツーモアネクロ
シスファクタ−（Ｔ　ｕｎ＋ｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓｆ
ａｃｔｏｒ、　Ｔ　Ｎ　Ｆ　）と名付けた（　Ｐ　ｒｏ
ｃ、Ｎ　ａｔ。

Ａｃａｄ　、Ｓｅｔ、、ＵＳＡ、７２巻、３６６６頁。

１９７５年〕。グリーン（Ｇ　ｒｅｅｎ）らは、上記物
質を硫酸アンモニウムによる分画沈澱、ゲル濾過などに
より部分精製し、上記ＴＮＦの分子量が約１５００００
であると報告した（　Ｐ　ｒｏｅ、　Ｎ　ａｔ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ、７３巻、３８１頁。

１９７６年）。その後マテイウース（Ｍ　ａｔｔｈｅｗ
ｓ　）らは、ウサギにＢＣＧを投与し、２週間後にエン
ドトキシンを投与して、ＴＮＦを産生じ、精製して、ゲ
ルが適法による分子量が３９０００で、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法（Ｐ　ｏｌｙａｃｒｙｌ−ａｍｉｄ
ｅ　ｇｅｌ　ｅｒｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｔｓ、ｐへＧ
Ｅ）によって６７０００であると報告した（Ｂｒ、Ｊ　
、　Ｃａｎｃｅｒ　。

４２巻、４１６頁、１９８０年〕。更に原中らは、プロ
ピオンバクテリウム　アクネス（Ｐ　ｒｏｐｉｏｎｉ−
ｂａＣｔｅｒｉＵｌ　ａｃｎｅｓ　）とエンドトキシン
を用いて、マウス及びウサギでＴＮＦを産生じ、その分
子量はゲル濾過法及びＰＡＧＥにより３９０００である
と報告した（日本臨床、４０巻、１８７２頁、１９８２
年〕。

以上の他にも、Ｌ−細胞に対して細胞術性を有する生理
活性物質（ＴＮＦ）の存在は、多数報告されているが、
その分子量をとってみても、カル（Ｋｕｌｌ　）らの２
２５０００　［Ｊ、１ｍｍｕｎｏｌ、　。

１２６巻、１２７９頁、１９８０年］からマテイウース
ら及び原中らの３９０００の範囲に分布しており、未だ
充分に単１１１１Ｍ製されているとは云えず、その性状
を調べるに足る充分な量は得られていないのが現状であ
る。

本発明者らも上記り一細胞に対して細胞毒性を有する物
質の本体を究めるべく鋭意研究を重ねてきた。その結果
、従来報告された例のない低分子蛋白質を単１１１ｔｉ
＠することに成功し、これが制ガン作用を有することを
見い出し、本発明に到達した。

本発明の新規な低分子蛋白質は、以下の特性を有するこ
とにより特徴付けられる。

（１）　分子量 Ａ６　バイオゲルＡ１．５Ｉ１１を用いたゲル枦″ｉｆ
４法による分子量 バイオゲル（３ｉｏｇｅｌ　）　Ａ１．５１＋　（バイ
オ・ラド社製、アメリカ）をカラム（１６Ｘ１０００１
１ファルマシア社製、スエーデン）に充填し、０．０４
Ｍｌ１ス一塩ｍ　／　０　、１　％　Ｆ　Ｔ’　シ）Ｌ
ｔ硫ｎ２ナトリウム（ＳＯ８）／４Ｍ尿素１０．ＩＭＮ
ａ　ＣＱ　（ｐ　Ｈ７，８）の緩衝液を用い、本発明物
質試料２００μｇ　（蛋白量）を添加し、ゲル濾過を行
ない、試料の溶出位置より標準分子量キット（ファルマ
シア社製、スエーデン）からめた標準曲線を用いて分子
量を算出した。尚上記蛋白量は、ブラッドフォード（Ｂ
　ｒａｄｆｏｒｄ　）の方法（Ａ　ｎａｌ、８　ｉｏｃ
ｈｅｍ、、　７２巻、２４８頁、１９７６年〕に準じて
クーマジーブリリアントブルー　Ｇ−２５０による色素
結合法によりめたものであり、以下同様である。

得られた結果は、第１図に示す通りである。図中（１）
は牛血清アルブミン（分子ｆｆ１６７０００）を、（２
）Ｇｔ卵白７）ｔｔｌミ＞　＜分子ｍ４３０００　）を
、（３）はキモトリプシノーゲンＡ（分子量２５０００
）を、（４）はりボヌクレアーゼ（分子量１３７００）
を示し、（ａ）が本発明物質である。第１図より本発明
物質（ａ）は、キモトリプシノーゲンＡ（３）の後に溶
出し、その分子量は約１７２００であると認められる。

Ｂ、ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷを用いたゲル濾過法によ
る分子ｍ ファルマシアＦＰＬＣシステム（ファルマシア社製、ス
エーデン）にＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷ（東洋曹達社製
）カラムを接続し、０．１％５ＤＳ１０．１Ｍリン酸ナ
トリウム（Ｄ　Ｈ７，０）の緩衝液を用いて、本発明物
質試料１００μｇ（蛋白量）を付加してゲル濾過を行な
い、高速液体クロマト用標準分子房キット（オリエンタ
ル酵母社製）を用い、これらの溶出パターンより、本発
明物質試料の分子量を算出した。高速液体クロマトグラ
フィーによる溶出パターンを第２図に、また該りＯマド
グラフィーの溶出時間からめた分子量分布を第３図にそ
れぞれ示す。各図において（５）はグルタミン酸脱水素
酵素（分子ｍ２９００００、尚第２図には示されていな
い）を、（６）はエノラゼ（分子量６７０００）を、（
７）はアデニル酸キナーゼ（分子１２１３２０００）を
、（８）はチトクロームＣ（分子量１２３００）を、（
ａ）は本発明物質をそれぞれ示す。各図より本発明物質
＜ａ　＞は、チトクロームＣ（８）の前に溶出し、その
分子量は約１５３００と算出される。

Ｃ’、ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳
動法による分子量 遅蒔らの方法〔生化学、４４巻、３０４頁、１９７２年
〕に従い、リン酸ナトリウム／５ＤＳ（ｐＨ７，２）で
、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに、本発明物質試料
５μｇ　（蛋白量）を付与し、４０１１Ａで７時間電気
泳動を行ない、標準分子量キット（オリエンタル酵母社
製）を用いて、電気泳動パターン（２４図）を記録し、
これより分子量曲線（第５図）を作成し、該図より試料
の分子量を算出した。第４図及び第５図において（ａ）
はチトクロームＣ７ｆｆ１体（分子量８６１００）　を
、（ｂ　）Ｇｔチトク０−ムＣ６１１体（分子量７３８
００）を、（Ｃ）はチトクロームＣ５量体（分子１１６
１５００）を、（ｄ）はチトクローム０４１１体（分子
８１４９２００）を、（ｅ）はチトクロームＣ３ｆｆ１
体（分子量３６９００）を、（ｆ）はチトクロームＣ２
ｆｆ１体（分子量２４６００）を、＜ａ　）はチトクロ
ームＣ５量ｌ量体（分子ｆｆ１ｌ　２３００＞を、それ
ぞれ示す。また（Ｓ）は本発明物質である。第５図より
本発明物質（Ｓ）の、分子量は約１６７００と算出され
る。

（２）　等電点 等電点測定装置（バイオ・ラド社製、アメリカ）とアン
ホライン（Ａｍｌ）ｈｏｌｉｎｅ＞ポリアクリルアミド
プレー１−（ｐＨ３，５〜９．５）（ＬＫＢ社製、アメ
リカ）を使用し、標準等電点測定マーカーキット（ファ
ルマシア社製、スエーデン）を使用し、本発明物質の等
電点を測定した。すなわち、濾紙片に本発明物質試料的
５μｇ　（蛋白量）を吸収させ、ゲル上にのせ、１０Ｗ
定電力にて、約２時間泳動させ、電流が一定となった時
点で泳動を終了した。ゲルは１　ｍｍｔ１１隔で切り取
り、緩衝液トて溶出し、し−細胞に対する活性の測定に
供した。等電点は等電点マーカーを基準に算出した。そ
の結果、本発明物質の等電点はｐＨ３，８±０．３と算
出された。

（３）　紫外部吸収の測定 ダブルビーム分光光度計ＵＶ−３００（島津製製所＠）
を使用し、０．０２Ｍ　トリス−塩酸１０、ＩＭ　Ｎａ
　ＣＧ　（１）８７．８）に溶解した本発明物質試料の
紫外部吸収を測定した。その結果を第６図に示す。該図
より極大値は２７７　ｎ１ｌｌ、極小値は２５０ｎｌｌ
であった。

（４）　溶解性、色及び性状 本発明物質試料を３１１０蛋白Ｉｔ／ＩＩ　Ｑ濃度に０
．０２Ｍ　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，８）に溶解し
た溶液は、無色透明である。

該溶液にアセトン又はエタノールを７０Ｖ／Ｖ％以上加
えると沈澱を生ずる。

また本発明物質の３ｎ＋ｇ蛋白ｆｆｌ／ＩＩＩ　Ｑ水溶
液は、弱酸性を示す。

（５）　呈色反応 ビュウレット反応、フォリンローリ−反応法、ならびに
塩酸加水分解後のニンヒドリン反応についてペプチド結
合ならびにアミノ酸の９色反応は、いずれも陽性である
。

（６）　アミノ酸組成比 本発明物質試料を６Ｎ塩酸で１１０℃、２４時間加水分
解（減圧下）後、アミノ酸アナライザー（タイオネツク
（ｄｉｏｎｅｘ）　５００、ダイオネツクス社）により
分析した。その結果本発明物質はグリシン（Ｇ　ｌｙ）
を基準として、以下の比率で各アミノ酸を含有すること
が確認された。

梧成アミノ酸　比率（モル比） Ｇｌｙ　１．００（基準） ＡＳ＋１及び／又はＡＳｎｌ、１０±０．０６Ｔｈｒ　
０．４５±０．０２ ３ｅｒ　Ｏ，９０±０．０５ ＱＩＬＩ及び／又はＱｌｎｌ、８２±０．０９Ｐｒｏ　
０．８４±０．０４ Ａｌａ　１．１１±０．０６ Ｃｙｓ　Ｏ，２０±０．０２ Ｖａｔ　Ｏ，８６±０．０４ Ｍｅｔ　Ｏ，１８±０．０１ ）Ｉｃ　Ｏ，３８±０．０２ Ｌｌ　１．７３＋０．０９ ＴＶｒ　Ｏ，６４±０．０３ Ｐｈｅ　Ｏ，３４±０，０２ Ｈｉｓ　Ｏ，２８±０．０１ Ｌｙｓ　Ｏ，４４±０．０２ ＡｒｔＪ　０．４６±０．０２ （７）　アミノ酸配列 本発明物質試料のアミノ酸配列を、アミノ酸シークエン
サー（Ｂ　ｅｃｋｍａｎ　Ｓ　ｅａｕｅｎｃｅｒ　ｍｏ
ｄｅ１８９（Ｍ、ベックマン社製；各アミノ酸は逆相高
速液体クロマトグラフィーにより同定した）を用いて分
析した。その結果アミノ末端側より１７個のアミノ酸が
以下の通り配列していることが確かめられた。

Ｈ−Ａ　ｌａ　−Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ　−
Ｐｒｏ−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　Ｉａ　−Ｈｉｓ　−Ｖ　ａｌ
　−Ｖ　ａｔ　−Ａ　ｌａ　−Ａ　ｓｎ　−Ｐ　ｒｏ　
−Ｇ　Ｉｎ　−Ｖ　ａｌ　−Ｇ　ｌｕ　−また、本発明
の低分子蛋白質は、以下の生理活性を有する点において
特徴付けられる。

（ａ）Ｌ−細胞に対する細胞毒性作用 前記カースウェル（Ｃａｓｅｗｃ！ｌ　）らの方法及び
クロスターガード（Ｋｌｏｓｔｅｒ　ｏａａｒｄ　）の
方法（Ｍｏ１．、　Ｉ　ｍｍ、、１７巻、６１３頁、１
９８０年）に準じて、本発明物質のＬ−細胞膜ｍ胞効果
を評価した。すなわち、し−細胞を２５０単位／ｍ　Ｑ
のペニシリンと１２５μ（Ｊ／ｍＱのストレプトマイシ
ンとを含むイーグルス　ミニマル　エッセンシャルメデ
イウム（ＭＥＭ）培地に２ｘ１０５細胞／ｍ　Ｑとなる
湿度で熱間させ、このＬ−細胞懸濁液各０．１１ＩＩＱ
及び適当霞度に希釈した本発明物質試料名０．１１１１
Ｑを、９６穴マイクロプレート（コースタ−社製、アメ
リカ）の各ウェルに入れ、これを５％炭酸ガス含有空気
中、３７℃で４８時間培養する。培養細胞をニュートラ
ル　レッド（ｎｅｕｔｒａｌ　ｒｅｄ　）で染色し、生
細胞数をタイターチックマルチスキャン（フローラボラ
トリーズ社製、アメリカ）により比色定すする。活性は
し、−細胞を５０％殺す力を１単位とし、これに試料の
希釈倍数を乗する。

その結果、本発明物質のＬ−細胞に対する細胞毒性は、
８．９９ｘ１０７単位／ｍｇ蛋白質以上であった。

（ｂ）メスＡ−ザ／Ｌｌ−１−ｖ　（ｌｙｌｅｔｈ　Ａ
−ｓａｒｃｏｍａ　）担ガンマウスによる抗腫瘍作用 ２Ｘ１０５個メスΔ−ザルコーマ細胞を、Ｂ△ＬＢ／ｃ
マウス腹部皮肉に移植し、７８後腫瘍の大きさが直径７
〜８ＩＩ１ｍとなったマウスの尾静脈より、上記り一細
胞に対するＩ胞毒性作用測定法（ａ）で２．５Ｘ１０’
〜２．５Ｘ１０５単位／ｍＱに希釈した本発明物質試料
の０．２１を注射し、４８時間後、前記カールウェルら
の方法に準じて、以下の判定基準により抗腫瘍作用を判
定した。

（−）：変化なし く＋）：かすかな出血性壊死 （→＋）：中程度の出血性壊死（移植脳表面の真ん中か
ら５０％以上にわたって壊死） （（１４）：顕著な出血性壊死（移植癌の中央部が重度
に壊死し、周囲の癌組織がわずか に残った状態） 得られた結果を下記第１表に示す。

第　１　表 投　与　量　評　価 （ｒ＋ｏ蛋白岱／マウス）−十−１＋’１−（生理食塩
水）　６０００ ５５．６　１　３　２　０ １１１．２　０　２　３　１ ２７８．０　０　１　３　２ ５５６．０ 一−−−−−−−−−ニー　１２−一１次に本発明の新
規低分子蛋白質を得る方法について記述する。

本発明物質は、基本的には公知の方法に従い、免疫賦活
作用を有する物質を吐乳動物に投与し、次いでグラム跳
性菌由来のエンドトキシン又は植物由来のレクチンを投
与することにより、該吐乳動物体内に産生される。より
詳細には、例えばカースウェルらの方法（Ｐ　ｒｏｃ、
Ｎ　ａｔ、Δｃａｄ、３　ｃｉ、。

ＬＪＳＡ、、７２巻、３１３６　ｅ頁、１９７５年〕に
準じて、まず吐乳動物に免疫賦活作用を有する物質を投
与する。ここで吐乳動物としては、例えばマウス、ラッ
ト、モルモット、ウサギ等を例示でき、特にこれらに限
定されない。免疫賦活作用を有する物質としては、公知
の各種物質を用いることができる。その具体例としては
例えばバチルス　カルメツティ　グエリン（ＢＣＧ）　
、コリネバクテリウムハルバム（Ｇ　ｏｒｙｎｅｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ　ｇａｒｖａｉ）、プロピオンバクテリウ
ム　アクネス（Ｐ　ｒｏｐｉｏｎｉ−ｂａｃｔｅｒｔｕ
ｍ　ａｃｎｅｓ　）　、ミコバクテリウム　ブチリカム
（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ　
）　、］リネバクテリウム　グー７　ｍ　、ｍＬ　ロサ
ム（ＣＯｒｙｎＱｂａＯｔｅｒｉｕｍｇｒａｎｕｌｏｓ
ｕｍ）　、ストレプトコッカス　ビロジネス（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ　）　、プラ
スモデイウム（Ｐ　ｌａｓｍｏｄｉｕｍ　）等のほか、
ザイモザン（Ｚ　ｙｍｏｓａｎ）　、ノカルディア　ア
ストロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ　ａｓｔｅｒｏｉｄｅ
ｓ）　、リステリア　モノサイトジェネス（Ｌ　ｙｓｔ
ｅｒｉａ　ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ　）、グルカン
（ａｌｕｃａｎ）　、１ｔＢＢ１膜骨格（ｃｅｌｌｌｌ
ｌａｌｌｓｋｅｌｔｏｎ　）　、デキストラン硫酸（ｄ
ｅｘｔｒａｎｓｕｌｆａｔｅ　）　、ムラミルジベプタ
イド（ｍｕｒａｍｙｌ−ｄｉｐｅｐＨｄｅ　）　、クレ
スチン（県別工業社製）等を例示できる。これら免疫賦
活作用を右する物質の投与は、一般に静脈内又は腹腔内
注射により行なわれる。投与量は適宜に決定されるが、
通常１〜１０００＋ｎｏ／ｋｇ程度の範囲とするのが好
ましい。

水沫では次いで上記免疫賦活作用を有する物質の投与後
７〜１４日目に口重ム陰性菌由来のエンドトキシン又は
植物由来のレクチンを供試動物に投与する。上記エンド
トキシン及びレクチンとしては、公知の各種のものをい
ずれも使用できる。

その代表例としては、例えば大鵬菌、緑膿菌、チフス菌
等に由来づるリポポリサッカライドやタチナタマメレク
チン（コンカナバリンＡ、ＣｏｎＡ）、ダイズマメレク
チン（ＳＢＡ）、アカインゲンマメレクチン（ＰＨ八）
等を例示することができる。

これらの投与は通常静脈内注射によるのが望ましい。投
与量は特に限定はないが、通常的１０μｇ〜１１０ｌｌ
１／ｋｇの範囲から選択されるのが一般的である。上記
エンドトキシン又はレクチンの投与後約１．５〜３時間
で目的とする制ガン作用を有する本発明の低分子蛋白質
が供試動物の血清もしくは血漿中に産生される。

本発明物質の採取及び分離精製は、通常の方法に従い実
施される。すなわち供試動物から常法に従い採血し、得
られる血清もしくは血漿中に含有される当該物質の性質
を利用して、物理化学的又は生化学的手段に従い、例え
ば塩析、クロマトグラフィー、電気泳動法、抽出法、遠
心分離法、透析法答を単独で又は適宜組合せることによ
り行なわれる。より具体的には、上記血精又は血漿（以
下これらを粗製溶液と記す）を次の工程に付すことによ
り実施される。

（１）　硫酸アンモニウム塩析 （２）　ゲルｉ濾過 （３）　ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー （４）　ファルマシアＦＰＬＣモノＱカラムクＬ」マド
グラフィー （５）　硫酸アンモニウム塩析溶解り０マドグラフイー （６）　グル濾過 以下に、これら工程の詳細を説明する。

精製工程１ 粗製溶液に硫酸アンモニウム（以下「硫安」と記す）を
添加し、５０〜８０％飽和溶液をｍＰｓする。この溶液
を２時間〜−夜低温室（４℃）に放置し、生理活性低分
子蛋白質を充分沈澱させる。

次いで冷却遠心力１１ｆｆｌ（日立製作所載）を使用し
、１００００回転／分で１０〜３０分間遠心分離を行な
い生理活性を有する沈澱を集める。この段階での活性回
収率（前記Ｌ　−ｍ　ｌｔａに対する細胞毒性活性測定
法による）は８０〜１００％であり、精製度は１０〜２
０倍である。

精製工程２ 工程１で得られた沈澱を０．０２Ｍ　ｌ−リス−塩酸（
ｐ　Ｈ７，８）１０．ＩＭ　Ｎａ　ＣＱの緩衝液に懸濁
させる。この懸濁液に２〜８Ｍの尿素を加え、不溶性物
質を１００００回転／分で１０〜３０分間冷却遠心分離
を行ない、清澄な生理活性を有する上清液を得、これを
ゲル濾過に付す。ゲル濾過用担体としてはウルトロゲル
ＡＯＡ４４゜５４　（ＬＫＢ社製、アメリカ）、あるい
はバイオゲルＡ１．５ｍ　（バイオ・ラド社製、アメリ
カ）等が用いられる。

ゲル濾過分画物につき、前記し一細胞に対する細胞毒性
活性測定を行ない、活性画分を集めて、限外濾過１１Ｙ
Ｍ１０（アミコン社製・アメリカ）を装着した限外濾過
装置ＴＣＰ−１０（アミコン社製・アメリカ）により限
外濾過濃縮を行なう。

但し、濃縮は５０〜８０％飽和硫安沈澱法によってもよ
い。この方法による活性回収率は８０〜１００％であり
、精製度は２０〜５０倍である。

精製工程３ 工程２で得られた生理活性画分の溌給液を透析用チュー
ブ（半井化学薬品社１ＩｌＩ）を用い、５０〜１００倍
量の０．０２Ｍ　リン酸Ｉ！衝液（ｐＨ６，８）に対し
て４℃で、数回外液を交換しながら、−夜透析する。透
析液を冷却遠心分離機（４℃）で１００００回転／分、
２０〜３０分間遠心分離を行ない、ｍ澄な上清を得る。

次いでこの上清液をハイドロキシアパタイト（日本ケミ
カル社製）に吸着させ、０．０２Ｍ〜０．５Ｍ　リン酸
級衝液＜ｏ　１−ｔ６．８＞で連続的霞度勾配法に従い
、もしくは段階的に濃度を上昇させて生理活性区分を溶
離する。得られた生理活性区分を限外濾過濃縮、又は硫
安塩析により濃縮する。この方法による生理活性区分の
回収率は４０〜８０％であり、Ｎ製度は約４〜１０倍で
ある。

精製工程４ 精製工程３で得られた生理活性区分のａ給液を透析用チ
ューブに入れ、５０〜１００倍量の希薄なリン酸、ある
いはトリス緩衝液（ｐＨ７，０〜８．０）に対して、４
℃で一夜透析する。この透析液をファルマシアＦＰＬＣ
モノＱカラム（ファルマシア社製、スエーデン）に吸着
させ、緩衝液濃度、あるいはＮａＣ＋ｌＫ１度を連続的
に上昇させて生理活性物質の溶離を行なう。この工程で
の活性回収率は７０〜９０％であり、ｔｉ製度は約３〜
６倍上昇する。

精製工程５ 精製工程４における活性区分につき限外濾過濃縮を行な
い、硫安塩析溶解カラムクロマトグラフィーに付する。

トーヨーバール５Ｗ５０，５５、または６０（いずれも
東洋曹達社製）をカラムに充填し、ファルマシアＦＰＬ
Ｃシステム（ファルマシア社製・スエーデン）を用い、
カラム中で生理活性区分を硫安塩析、次いで連続的に硫
安濃度を下げて活性区分を溶解分別する。この段階での
活性回収率は３０〜７０％であり、Ｎ製度は約３〜４倍
である。

精製工程６ 精製工程５で得られた活性区分を濃縮し、バイオ・ゲル
Ａ１．５１あるいはウルトロゲルＡＯＡ４４又は５４を
充填したカラム（１６Ｘｉ０００ｍｍ）に付し、ゲル濾
過を行なう。あるいはトーヨーソーダ高速液体り０マド
用カラムＧ２０００ＳＷ又はＧ３０００ＳＷ　（東洋曹
達社製）を用いてグル濾過を行なう。この工程における
活性回収率は２５〜７５％であり、精製度は約３〜６倍
である。

精製工程１〜６を通しての活性回収率は、５〜３０％で
あり、精製度は約２．７Ｘ１０’〜７．８×１０５倍で
ある。

この様にして得られた生理活性を有する低分子蛋白質の
特性を測定した結果は、前記した通りである。

かくして本発明の低分子蛋白質を得る。得られる本発明
物質は前述した通り、し＝細胞に対してインビトロで直
接細胞毒作用を有し、またインビボで抗腫瘍作用を有す
るに加え、以下の薬理試験例に示す通りヒ１〜ガン細胞
乃至メツラーマ細胞に対しても細胞毒作用乃至殺細胞作
用を示し、しかも低毒性である。

薬”理試験例工　細胞毒乃至殺ｉｌｌ胞作用（ａ）　ヒ
トガン細胞殺細胞作用 ヒトバーキットリンパ腫由来株Ｒａｊｉ　（Ｊ。

Ｎａｔ、　Ｃａｎｃｅｒ　ｌ　ｎｓｔ　、、３７巻、５
４７頁、１９６６年）、ヒト胃癌（小環ｍ胞癌）由来株
ＫａｔＯ−Ｉ［１（Ｊｌ）ｎ、　Ｊ　、　ＥＸ＄１．　
Ｍｅｄ、、４８巻、６１頁、１９７８年）及びヒト０咽
詐癌由来株Ｋ　Ｂ　（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　１８
巻、１０１７頁、１９５８年〕の各細胞に対する本発明
物質の殺細胞効果を評価した。すなわち、ヒトバーキッ
トリンパ腫由来細胞株及びヒト胃癌由来細胞株を、２５
０単位／Ｉ　Ｑのペニシリン、１２５μＱ／ｍＱのスト
レプトマイシン及び１０％非働化生胎児血清を含むＲＰ
Ｍ１１６４０培地で２Ｘ１０”細胞／ｍ　Ｑに調整した
。また、ヒト寿咽腔癌由来細胞株を、２５０単位／Ｉ　
Ｑのペニシリン、１２５μＱ　／ｍ　Ｑのストレプトマ
イシン及び１０％非働化牛血清を含むイーグルス　ミニ
マル　エッセンシャル　メディウム培地を用いて２×１
０５ＩＷｌ胞／ｍ　Ｑに調整した。

上記各細胞調整液ｏ−ｉ＋ｎＱと各ｆ！濃度に希釈した
本発明物質０．１１１９とを９６穴マイク【」プレート
の各ウェルに入れ、これを５％炭酸ガス含有空気中、３
７℃で４８時間培養した。

培養４８時間後に細胞をトリバンブルーで染色し、顕微
鏡下でビルケルチュルク計Ｆ［盤（エルマオブテイ力ル
ワークス社製、日本）を使用して生細胞数を算出した。

この結果、本発明物質の各種細胞の増殖を５０％抑制す
る濃度は、ヒトバーキットリンパ腫由来細胞に対しては
８．Ｏｒ＋ｏ蛋白量／ｍ　９以上、ヒト胃癌由来細胞株
対しては２７、Ｏｎｇ？Ｊ白ｆＡ／ｒＡＱＪＸ上、ヒト
ｎ咽腔癌由来細胞に対しては１１．０ｎｏ蛋白ｆｆｉ／
ｍ　Ｑ以上であった。

（ｂ）　メツラーマ細胞に対する細胞毒性作用へルソン
（）ｌｅｌｓＯｎ　）らの方法（Ｎ　ａｔｕｒｃ。

２５８巻、７３１頁、１９７５年〕に準じて、本発明物
質のメツラーマＡ−３７５（Ｊ、Ｎａｔｌ。

Ｃａｎｃｅｒ　Ｉ　ｎｓｔ　、、５１巻、１４１７頁、
１９７３年〕細胞に対する細胞毒性作用を評価した。即
ち、グルタミン、非必須アミノ酸、ペニシリン、ストレ
プトマイシン及び１０％非働化牛脂児血清を含むイーグ
ルス培地を用いてメツラーマＡ−３７５細胞５Ｘ１０４
細胞／ＩＩ　Ｑの懸潤液を調整した。

この細胞懸渇液各１１１ＩＱ及び本発明物質を適当に希
釈Ｊｕｌた試料ｆｆｉ液１１ｎＱを３．５ｃｍ径のシＶ
−レに入れ、５％炭酸ガス含有空気中下３７℃で培養し
た。

培養３日日に上記（ａ）と同様にして細胞をトリバンプ
ルーで染色し、顕微鏡下でビルケルチュルクＨ１算盤を
使用して生細胞数を算出した。この結果、本発明物質の
メツラーマＡ−３７５ｉ１１１胞の増殖を５０％抑制す
るのに必要な岳は１４０ｑ蛋白量／Ｉ　Ｑ以上であった
。

薬理試験例■　急性毒性 ８週令のｄｄＹ系雌雄マウスを各々１０匹用い、本発明
物質を３．７ｍＱ蛋白１／ｋａの割合で静脈内投与し、
急性毒性を調べた。

その結果死亡例は認められず、ＬＤｏは３．７ｍｇ／ｋ
ｏ以上であることが確認された。また、ｉ察期間中、本
発明物質に起因すると考えられる明らかな中毒症状は認
められなかった。

以上の通り本発明物質は各種１胞に対し細胞毒作用乃至
殺細胞作用を奏し、また低毒性であるところから抗腫瘍
剤として有用である。

本発明物質はこれを抗腫瘍剤として利用するに当っては
、その有効量を含有する各種形態に調整され、該形態に
応じた各種投与経路により投与される。その製剤形態と
しては通常液状溶液、懸濁液、乳渇液等を例示でき、こ
れらは一般に静脈、皮下又は筋肉内に投与される。これ
らはまた使用前に適当な担体の添加によって液状になし
得る乾燥品として提供することもできる。該抗腫瘍剤の
投与量は、疾患の程度、患者の年齢、性別等によって具
なるが、通常、蛋白量として約１．８５〜１８．５μ０
／ｋＭ日を１〜数回に分けて投与するのが好ましい。

以下に実施例を示し、本発明をより具体的に述べるが、
本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例１ ニュージランドホワイト又は日本白色系雌ウサギ（休ｍ
２．０〜３．０Ｊｌ）にホルマリン死菌コリネバクテリ
ウム　パルバム（Ｃｏｒｙｎａｂａｃｔｅｒｉｕｍｐａ
ｒｕｖａｍ　、ウェルカム社製、イギリス）７０ＩＩｌ
ａを■静脈より注射した。注射９日後に１００μＱのリ
ボポリｉナツカライド（大腸菌Ｏ５５：８５、ディフコ
社製、アメリカ）を耳静脈より注射し、２時間後心臓よ
り全採血した。採血した血液を５０００回転／分で２０
分間遠心分離し、血清を分離した。該操作により１００
羽のウサギから１５９００単位／Ｉ　Ｑの力価を有する
血清７５３０１Ｑが得られた。

なお、ニュージランドホワイトと日本白色系の本生理活
性物質の産生ｎは第２表に示すように、日本白色系ウサ
ギの方が高かった。

第　２　表 り一細胞に対する細胞毒性 活性測定法による活性 （単位／ラビット） ニュージランド ホワイト　１．０７Ｘ１０８ 日本白色系　１．３１Ｘ１０θ 該血清１０００ＩＩＩＱに４７２ｇの硫安を添加溶解後
、４℃で一夜放置し、活性物質を沈澱させた。

沈澱をｉ　ｏｏｏｏ回転／分で３０分間遠心分離（４℃
）し、沈澱を集め、約１００ｍＱの０．０２Ｍ　トリス
−塩酸緩衝液１０．１ＭＮａ　ＣＱ　（ＥＩ　Ｈ７，８
）に懸濁さゼた。この段階での活性回収率は９８％で精
製度は１８倍であった。

次いで、該沈澱懸濁液１００＋１１９に対し３６．０４
（］の尿素を加え溶解さ住た。これをｉ　ｏｏｏｏ回＠
／分で３０分間冷却遠心分離（４℃）し、不溶物質を除
去した。この上清液５０ｍＱをとり、０．０２Ｍ　トリ
ス−塩酸１０．５ＭＮａＣ；Ｑ緩衝液で平衡化したウル
トロゲルΔＣΔ５４を用いゲルオ濾過（カラムサイズ５
０×１０００１００Ｏ，、溶出区分につきＬ−細胞に対
する活性測定法により、活性を調べ活性区分を集めた。

該方法による活性回収率は９２％で、精製度は３３倍で
あった。全段階を通しての活性回収率は９０．２％で精
製度は約６００倍であった。

次いでアミコン限外濾過膜ＹＭＩＯを装着した限外濾過
濃縮器ＴＣＦ−１０を用いて活性区分を濃縮した。この
潟給液を透析用チューブにいれ、５０倍量のＯ−０２Ｍ
　リン酸緩衝液（ｐＨ６，８）に対して４℃透析を行な
った。外液を３時間毎に３回交換した後、同緩衝液中で
、４℃、−夜装置した。この透析活性区分をあらかじめ
０．０２Ｍ　リン酸緩衝液（１））１６．８）で平衡化
したハイドロキシアパタイトゲルのカラム（ナイス２６
ｘ４００ｍｉ）に付した。流速５．０ｆｆｌ　９７時、
３ＩＩＩＱ／分画の条件下に同緩衝液で充分洗浄した後
、０．０２Ｍ　リン酸緩衝液（ｐＨ６，８）５００ｍ　
Ｑ及び０．５Ｍ　リン酸緩衝液（ｐ　Ｈ６，８）５００
ｍ　Ｑを使用し、連続的に濃度勾配を上昇させ、吸着物
質を溶離した。この方法では非吸着区分に活性は認めら
れず、すべての活性は吸着され、吸着された活性区分は
リン酸緩衝液濃度０．１５Ｍ〜０．３Ｍの間に溶出され
た。

活性区分を集め、アミコン限外濾過濃縮装置ＴＣＰ−１
０を用い、４℃で限外濾過濃縮を行なった。この方法に
よる活性回収率は４８％であり、精製度は４．５倍であ
った。全工程を通しての活性回収率は４３．３％、精製
度は２．７Ｘ１０３倍であった。

次いで、上記方法で得られた活性区分の濃縮液を透析用
チューブにいれ、５０倍量の０．０２Ｍトリス−塩酸（
１）Ｈ７，８）１０．ＩＭＮａ　ＣＱ緩衝液に対して、
４℃で一夜透析を行なった。同緩衝液で緩衝化したファ
ルマシアモノＱカラムに透析内液を付し、１ｍ＋１／分
、ｉｌｎ　Ｑ１分画の条件で活性物質を吸着さＵた。次
いで同緩衝液で充分洗浄後、０．０２Ｍトリス−塩酸（
ｐＨ７，８）／１．ＯＭ　Ｎａ　（ｌを用い連続的にＩ
’ＪａＣＱｍ度を上昇させ、吸着した活性区分を溶離さ
せた。

活性区分をアミコン限外濾過膜ＹＭＩＯを装着した限外
濾過装置を用い濃縮した。この方法による活性回収率は
８０％であり、精製度は４倍上昇した。全工程を通して
の活性回収率は３４．６％であり、精製度は１．ｌＸ１
０’倍であった。

次いで、上記日１１１Ｍを０．１Ｍ　トリス−塩酸（Ｄ
　Ｈ７，８）／７０％飽和硫安で平衡化したトーヨーパ
ール５Ｗ６０（カラムサイズ１０Ｘ１０Ｘ５００に、流
速１１１１　Ｑ／分、２ＩＩＩＱＺ分画で付与し、カラ
ム中で塩析した。ついでＯ，１Ｍトリス−塩酸（１）Ｈ
７，８）の緩衝液を用い、連続的に硫安濃度を低下させ
て溶出ＦＢ離を行なった。

活性区分を集め、アミコン限外濾過膜ＹＭＩＯを装着し
た限外濾過濃縮装置により濃縮した。この方法による活
性回収率は６２％であり、精製度は４倍であった。全工
程を通しての活性回収率は２１．５％、精製度は４．４
０Ｘ１０’倍であった。

次いで、上記濃縮液を０．１Ｍリン酸ナトリウム（Ｄ　
Ｈ７，０）１０．２Ｍ　Ｎａ　ＣＱ１０．１％ＳＤＳ！
ｌ！ｔｉ液で平衡化したトーヨーソーダーＧ３０００Ｓ
Ｗカラム（７，５Ｘ６００ｍｍ＞を用い、流速１ｍＱ／
分、１ｍ　Ｑ１分画でグル濾過を行なった。この方法で
活性回収率は２６％であり、精製度は５．３倍上昇した
。全工程を通じての活性回収率は５．６％であり、精製
度は２．３３Ｘ１０５倍であった。

なお、本生理活性を有する低分子蛋白質の比活性は９．
２４Ｘ１０７単位／ｍ（Ｊ蛋白質であった。

実施例２ ニュージランドホワイト系雌ウサギ（体重２．０〜３．
０ｋｏ）にホルマリン死菌ミコバクテリウム　ブチリカ
ム（ディフコ社製、アメリカ）１５０ｍｇを耳静脈より
注射した。注射９日後に１００μｇのりボボリサツカラ
イド（大胆菌０５５：８５、ディフコ社製、アメリカ）
を耳静脈より注射し、２時間後心臓より全採血した。採
血した血液を５０００回転／分で２０分間遠心分熟し、
血清を分離した。該操作により、１００羽のウサギから
５１６０単位／ｍ　Ｑの力価を有する血清７４１０ｍ９
が得られた。

該血清１０００１１１Ｑに４７２ｇの硫安を添加後、よ
く溶解し、４℃で一夜放置した。硫安塩析液を１０００
０回転／分、３０分間冷却遠心分１１１（４℃）し、沈
澱を集め、この沈澱を約１００１１１Ｑの０．０２Ｍ　
トリス−塩酸１０．ＩＭ　Ｎａ　ＣＱ緩緩衝（ＤＨ７，
８＞に懸濁させた。この段階での活性回収率は９７％で
、ｖＸ製度は２０倍であった。

次いで、該沈澱懸濁液１００ｍ（ｌに対し３６、ｏ４ａ
の割合で尿素を加え溶解後、１００００回転／分で３０
分間冷却遠心分１１！（４℃）を行ない、不溶物を除去
した。この上清５０ＩＱをとり、０．０２Ｍ　トリス−
塩酸（ｐＨ７，８）１０．５Ｍ　Ｎａ　ＣＱ緩衝液で平
衡化したウルトロゲルＡｃＡ３４（カラムサイズ５０Ｘ
１０００ｍｍ）を用い流速４０ｍＱ／時、７ｍＱ／分画
でゲル濾過し、活性区分を集めた。該方法による活性回
収率は９２％で、精製度は２８倍であった。全段階を通
しての活性回収率は８９．２％で、ｆｉｔ製度は約５６
０倍であった。

次いでアミコン限外濾過膜ＹＭＩＯを装着した限外濾過
濃縮器ＴＣＰ−１０を用いて活性区分を濃縮した。この
濃縮液を透析用チューブにいれ、５０ｇ！Ｉ量の０．０
２Ｍ　リン酸緩衝液（ＥＩＨ６，８）に対して４℃で透
析を行なった。外液を３時間毎に３回交換した後、同Ｍ
Ｗｆｉ液中で、−夜透析した。この透析活性区分をあら
かじめ０．０２Ｍ　リンｌｌ１１１衝液（ｐ　Ｈ６，８
）で平衡化したハイドロキシアパタイトゲルのカラム（
サイズ２６Ｘ４００＋ａｍ）に流速５．０１１１９１時
、３ｍＱ／２分画で吸着させた。吸着させた活性区分を
０．０２Ｍ　リン酸緩衝Ｍ　（ｐ　Ｈ６，８）と０．５
Ｍ　リン１Ｍ１ｉｉ　（Ｄ　Ｈ６，８）　と’ｉｒ：使
用し、連続的に濃度勾配を上昇させることにより溶離し
た。この方法での活性回収率は６８％であり、精製度は
１０倍であった。全工程を通しての活性回収率は６０．
７％、精製度は５．６×１０３倍であった。

次いで、上記活性区分を限外濾過器で濃縮し、透析用チ
ューブにいれ、５０倍ｍの０．０２Ｍトリス−塩酸（ｐ
　Ｈ７，８）１０．１ＭＮａＣＱＷｉ’Ｗｉ液に対して
、４℃で一夜透析を行なった。この透析した活性区分を
、同ｔｉａ衝液でＭ衝止したファルマシアモノＱカラム
に１１１１Ｑ／分、１１１１Ｑ／分画の条件で吸着させ
た。次いで同緩衝液で充分洗浄後、０．０２Ｍ　Ｉ−リ
ス−塩酸（ｐ　Ｈ７，８＞／１．ＯＭ　Ｎａ　Ｃｙ緩％
液を用い連続的にＮ８０９８度を上昇さ往、吸着された
活性区分を溶出さゼた。活性区分をアミコン限外枦″ｉ
Ｅｉ溌縮器により濃縮した。この方法による活性回収率
は６２％であり、精製度は４倍上昇した。

全工程を通しての活性回収率は３７．６％、で精製度は
２．２４Ｘ１０’倍であった。

次いで、上記濃縮液を０．１Ｍ　トリス−塩酸（ｐ　Ｈ
７，８＞／７０％飽和硫安緩衝液で平衡化したトーヨー
バール５Ｗ６０　（カラムサイズ１０Ｘ５００＋ｍ）に
、流速１１１１Ｔ！／分、２ｍＱ１分両で付与し、カラ
ム中で塩析した。ついで０．１Ｍトリス−塩酸（ｐ　Ｈ
７，８）の緩衝液を用い、連続的に硫安濃度を低下させ
て溶解分画を行なった。活性区分を集め、限外濾過濃縮
器により酒縮した。この段階での活性回収率は３４％で
あり、精製度は４．７倍であった。全工程を通じての活
性回収率は１２．８％であり、精製度は１．０５×１０
５倍であった。

次いで、上記濃縮液を０．１Ｍリン酸すｌ−リウム（ｐ
Ｈ７，０）１０−２Ｍ　Ｎａ　ＣＱ１０．１％ＳＤＳ緩
衝液で平衡化したトーヨーソーダーＧ３０００ＳＷカラ
ム（７，５×６００ｍｍ）を用い、流速１ｍ　Ｑ／分、
ｉｌ　Ｑ１分画でゲル濾過を行なつた。この段階での活
性回収率は６２％であり、精製度は６．３倍であった。

全工程を通じての活性回収率は７．９％であり、精製度
は６．６２Ｘ１０５倍であった。

なお、本生１！ｌ！活性を有する低分子蛋白質の比活性
は９．１９Ｘ１０’単位／ｌｌ１ｇ蛋白質であった。

実施例３ ニュージランドホワイト系ロウＶギ（体重２．０〜３．
０ｋａ）にクレスチン（呉羽化学工業株式会社製）１０
０ＩＩ１ｇを耳静脈より注射した。注射９日後に１ｏｏ
ｔｔａのリポポリサッカライド（大腸菌０５５：Ｂ５、
ディフコ社製、アメリカ）を耳静脈より注射し、２時間
後心臓より全採血した。採血した白波を５０００回転／
分で２０分間遠心分離し、血清を分離した。該操作によ
り、１００羽のウサギから６２００単位／ｍ　Ｑの力価
を右する血清７０００ＩＩＩＱが得られた。

該血清１０００１１１！に４７２ｇの硫安を添加溶解後
４℃で一夜放四し、活性物質を沈澱させた。

沈澱を１００００回転／分、３０分間、４℃で遠心分離
し、再度沈澱を集め、約ｉｏｏｍＱの０．０２Ｍ　トリ
ス−塩酸緩衝液１０．ＩＭＮａ　ＣＱ　（Ｄ　Ｈ７，８
）に懸濁させた。この段階での活性回収率は９８％で精
製度は１８倍であった。

次いで、該沈澱懸濁１１００ｍＱに対し３６．０４ａの
割合で尿素を加え溶解さ往た。これを１００００回転／
分で３０分間、４℃で遠心分離し、不溶物を除去した。

この上清液５０１１１！をとり、０．０２Ｍ　トリス−
塩酸１０．５ＭＮａ　ＣＱ　（ｐ　Ｈ７，８）緩衝液で
平衡化したウルトロゲルＡｃＡ３４を用いゲルｔ濾過（
カラムクイズ５０Ｘ１０００ｍｍ）Ｌ、Ｌ−細胞ニ対ス
ル活性測定法により、活性を調べ、活性区分を集めた。

該方法による活性回収率は９５％で、精製度は３０倍で
あった。全段階を通しての活性回収率は９３．１％でＩ
Ｉ製度は約５４０倍であった。

次いでアミコン限外濾過膜ＹＭ１０を装着しｌ〔限外濾
過濃縮器ＴＣＰ−１０を用いて活性区分を濃縮した。こ
の濃縮液を透析用チューブにいれ、５０倍ｆｆ１（７）
０．０２Ｍ　’）＞ｍ緩衝液（ｐＨ６，８）に対して透
析を行なった。外液を３時間毎に３回交換した後、同緩
衝液中で４℃、−夜装置した。この透析活性区分をあら
かじめ０．０２Ｍ　リン酸Ｍ衝液（ｐｌ−１６，８）で
平衡化したハイドロキシアパタイトゲルのカラム（サイ
ズ２６Ｘ４００ｍｍ）に付した。流速５．０１１１１１
／時、３ｍＱ１分画の条件下に同緩衝液で充分洗浄した
後、０．０２Ｍ　リン酸緩衝液（ｐ　Ｈ６，８）５００
ｍＱと０．５Ｍ　リン酸緩衝液（ｐ　Ｈ６，８）５００
ｍＱとを使用し、連続的に濃度勾配を上昇させることに
より吸着物質を溶離した。この方法では非吸着区分に活
性は認められず、すべての活性は吸着され、吸着された
活性区分はリン酸緩衝液８度０．１５Ｍ〜０．３Ｍの間
に溶出された。

活性区分を集め、アミコン限外濾過濃縮装置ＴＣＰ−ｊ
　Ｏを用い、４℃で限外濾過濃縮を行なった。この方法
での活性回収率は５６％であり、精製度は１０倍であっ
た。全工程を通しての活性回収率は５２．１％、Ｎ製度
は５．４Ｘ１０’倍であった。

次いで、上記活性区分の濃縮液を透析用チューブにいれ
、５０倍最の０．０２Ｍ　トリス−塩酸（ｐ　Ｈ７，８
）１０．１Ｍ　Ｎａ　ＣＱ緩緩衝に対して、４℃で一夜
透析を行なった。同ｍｗ液で緩衝化したファルマシアモ
ノＱカラムに透析内液を付し、１１９７分、１１１　Ｑ
／分画の条件で活性区分を吸着させた。次いで同緩衝液
で充分洗浄後、０．０２Ｍ　トリス−塩酸／１．ＯＭ　
Ｎａ　Ｃ（！緩衝液（１）８７．８）を用い連続的にＮ
ａＣ９！度を上昇さｕ１吸着した活性区分を溶離させた
。

活性区分をアミコン限外濾過ＩＰＪＹＭＩＯを装着した
限外濾過装置を用い濃縮した。この方法による活性回収
率は８０％であり、精製度は５．５倍上昇した。全工程
を通しての活性回収率は４１．７％、精製度は２．９７
Ｘ１０Ａ倍であった。

次いで、上記濃縮液を０．１Ｍ　トリス−塩酸／７０％
飽和硫安ＣＤ　Ｈ７，８）緩衝液で平衡化したトーヨー
バール５Ｗ６０　（カラムサイズ１０Ｘ１０Ｘ５００に
、流速ｌＲ１９／分、２ａｌＱ／分両で付与し、カラム
中で塩析した。ついで０．１Ｍトリス−塩酸（ｐＨ７，
８）のＭ衝液を用い、連続的に硫安濃度を低下させて溶
出溶離を行なった。活性区分を集め、アミコン限外濾過
膜ＹＭＩＯを装着した限外濾過濃縮装置により濃縮した
。この段階での活性回収率は６４％であり、精製度は３
．９倍であった。全工程を通しての活性回収率は２６．
７％であり、精製度は１．１６×１０５倍であった。

次いで、上記濃縮液を０．１Ｍ　リン酸ナトリウム１０
．２Ｍ　Ｎａ　ＣＱ１０．１％ＳＯ８緩衝液（ｐ　Ｈ７
，０）で平衡化したトーヨーソーダーＧ３０００ＳＷ　
（カラムサイズ７．５Ｘ６００ｍｍ）を用い、流速１ｍ
　９７分、１ｍ　Ｑ／分画でゲル濾過を行なった。この
段階での活性回収率は２８％であり、精製度は５．０倍
上昇した。全工程を通じての活性回収率は７．５％であ
り、精製度は５．８Ｘ１０５倍であった。

なお、本生理活性を有する低分子蛋白質の比活性は８．
９９Ｘ１０’　ｍ位／ｍｇ蛋白質テあツタ。

実施例４ ニュージランドホワイト系雌性つＶギ（体重２．０〜３
．０ｋｏ）にホルマリン死菌コリネバクテリウム・バル
バム（ウェルカム社製、イギリス）１００ｏを耳静脈よ
り注射した。注射９日後に１０ａ＋ｏのフンカナバリン
Ａ（和光ｉｉ工渠社製）を耳静脈より注射し、２時間後
心臓より全採血した。採血した血液を５０００回転／分
で２０分間、４℃で遠心分離し、血清を分離した。該操
作により、１００羽のウサギから３７８０単位／ｍ　Ｑ
の力価を有する血清７６４０ＩＱが得られた。

該血清１０００ＩＩＩＱに４７２Ｑの硫安を添加後、よ
く溶解し、４℃で一夜放置した。硫安塩析液を１０００
０回転／分で３０分間冷却遠心分１ｍ（４℃）し、沈澱
を集め、約１００ｍＱの０．０２Ｍトリス−塩酸１０．
ＩＭ　Ｎａ　ＧＱＭ箭液Ｃ１）Ｈ７，８）に懸濁させた
。この段階での活性回収率は９９％で、精製度は２０倍
であった。

次いで、該沈澱懸濁液１００＋ｚ＋に対し３６．０４ｇ
の尿素を加え溶解後、１００００回転／分で３０分間冷
却遠心分子ｌ（４℃）し、不溶物を除去した。この上清
５０ｍＱをとり、０．０２Ｍトリス−塩酸（ｐ　Ｈ７，
８）１０．５ＭＮａＣｌ２緩暫液で平衡化したウルトロ
ゲル△ＣΔ５４を用いグル濾過（カラムサイズ５０Ｘ１
０００ｎ＋ｍ、流速４０ＩＩＩＱ／時、７［ｌＱ／分画
）し、溶出区分を集めた。該方法による活性回収率は９
５％で、ｆｉ’Ｊ１度は４１倍であった。全段階を通し
ての活性回収率は９４．１％で精製度は約８２０倍であ
った。

次いでアミコン限外濾過膜ＹＭ１０を装着した限外か過
濃縮器ＴＣＦ−１０を用いて活性区分を濃縮した。この
濃縮液を透析用チューブにいれ、５０倍量の０．０２Ｍ
　リン酸緩衝液（ｔｌＨ６，８）に対して４℃で透析を
行なった。外液を３時間毎に３回交換した後、同緩衝液
中で、４℃、−夜装置した。この透析活性区分をあらか
じめ０．０２Ｍ　リン酸緩衝液（ｐ　Ｈ６，８＞で平衡
化したハイドロキシアパタイトゲルのカラム（サイズ２
６ｘ４００ｍｍ）に流速５．０ｍ９１時、３ｍＱ１分画
で吸着させた。吸着させた活性区分は０．０２Ｍ　リン
酸Ｍ衝液（ｐ　Ｈ６，８）と０．５Ｍ　リン酸緩衝液（
ｐＨ６，８）とを使用し、連続的に濃度を上昇させる事
により吸着物質をｍａｉｌだ。この方法による活性回収
率は６５％であり、精製度は９．８倍であった。全工程
を通しての活性回収率は６１．１％、精製度は８．０×
１０３倍であった。

次いで、上記活性区分を限外濾過器で濃縮し、透析用チ
ューブにいれ、５０倍ｍの０．０２Ｍトリス−塩酸（ｐ
　Ｈ７，８）１０．ＩＭ　Ｎａ　ＣＱ緩衝液を用い、４
℃で一夜透析を行なった。この透析した活性区分を同緩
衝液で平衡化したファルマシアモノＱカラムに１１１１
９７分、１１１１Ｑ／分両の条件で吸着させた。次いで
同緩衝液で充分洗浄後、０．０２Ｍ　トリス−塩酸（ｐ
Ｈ７，８）／１、ＯＭ　Ｎａ　ＣＱ緩緩衝を用い連続的
にＮａＣＱ溌度を上昇させ、吸着した活性区分を溶出し
た。活性区分をアミコン限外濾過濃縮器により濃縮した
。この方法による活性回収率は７４％であり、精製度は
５．３倍であった。全工程を通しての活性回収率は４５
．２％であり、精製度は４．２Ｘ１０’倍であった。

次いで、上記濃縮液を０．ＩＭｔ−リス−塩酸（ｐ　Ｈ
７，８＞／７０％飽和硫安緩衝液で平衡化したトーヨー
バール５Ｗ６０　（カラムサイズ１０Ｘ５００１１１１
１１）に、流速１＋１１Ｑ／分、２ｍＱ１分画で付与し
、カラム中で塩析した。ついで０．１Ｍトリス−塩酸（
ｐＨ７，８）緩衝液を用い、連続的に硫安濃度を下げて
、溶解分画を行なった。

活性区分を集め、限外濾過ｎ縮器により濃縮した。

この方法による活性回収率は５８％であり、精製度は３
．２倍であった。全工程を通しての活性回収率は２６．
２％で、Ｖｉ製度は１．４×１０５倍であった。

次いで、上記濃縮液を０．１Ｍ　リン酸す１−リウム（
ｐ　Ｈ７，０）１０．２Ｍ　Ｎａ　ＣＱ１０．１％ＳＤ
Ｓ緩暫液で緩衝液したトーヨーソーダーＧ３０００ＳＷ
カラム（７，５×６００ｍｍ＞を用い、流速１ｒｎ　９
７分、１ｍ　Ｑ／分画でゲル濾過を行なった。この方法
で活性回収率は４４％であり、精製度は５．７倍であっ
た。全工程を通しての活性回収率は１１．５％で、精製
度は７．８×１０５倍であった。

なお、本生理活性を有する低分子蛋白質の比活性は９．
３×１０７単位／ｌｌ１ｇ蛋白質であった。

実施例５ ｄｄＹｌ性マウス（体重２５〜３００　）にホルマリン
死菌コリネバクテリウム　バルバム（ウェルカム社製、
イギリス）Ｉｎ＋ｏを腹腔内投与し、注射９日後にリボ
ポリ号ツカライド（緑膿菌；ディフコ社製、アメリカ）
１０μｇを尾静脈内注射し、２時間後眼球を摘出して眼
窩静脈虫より血液を採取した。採取した血液を５０００
回転／分で２０分間遠心分離し、血清を分離した。該操
作により、１００匹のマウスから５６１００単位／ｍ　
Ｑの力価を有する血清９０．５ｍ　Ｑが得られた。

該血清１００１１１９に４７．２（＋の硫安を添加溶解
後、４℃で一夜放置し、活性物質を沈澱させた。

沈澱を１００００回転／分で３０分間遠心分離（４℃）
し、沈澱を集め、約２０ｍＱの０．０２Ｍ　トリス−塩
酸緩衝液１０．ＩＭ　Ｎａ　ＣＱ（ｐＨ７，８）に懸回
させた。この段階での活性回収率は９８％で、精製度は
２１倍であった。

次いで、該沈Ｆ！懸濁液２０ｒｎＱに対し７．２ｇの尿
素を加え溶解させた。これを１００００回転／分で３０
分間冷却遠心分離（４℃）し、不溶物質を除去した。こ
の上ｆｆｉ？ｆ２１０＋１１Ｑをとり、０．０２Ｍトリ
ス−ｍ？！１０．５Ｍ　Ｎａ　Ｃａ緩衝液で平衡化した
ウルトロゲルΔｃ　Ａ５４を用いてゲル３濾過（カラム
ザイズ２６Ｘ１０００ｍｍ）Ｌ、溶出分画した。該方法
による活性回収率は９０％で、精製度は３２倍であった
。全段階を通しての活性回収率は８８．２％で、ｖＸ’
Ｓ度は約６７２倍であった。

次いでアミコン限外濾過淵縮器ＴＣＦ−１０を用いて活
性区分を濃縮した。この濃縮液を０．０２Ｍ　リン酸Ｍ
衝液（ｐ　Ｈ６−８）に対して、４℃で一夜透析をした
。この透析活性区分を０．０２Ｍ　リン酸緩衝液（ｐＨ
６，８）で平衡化したハイドロキシアバタイ１〜ゲルの
カラム（ｇイズ　２６Ｘ４０００１１１１）に付した。

流速５．０＋ｎＱＺ時、３ｍＱ／分画の条件下に同緩衝
液で充分洗浄した後、０．０２Ｍ　リン酸緩衝液（ｐｌ
−１６，８）５００ｍ　Ｑ及び０．５Ｍ　リン酸緩衝液
（ｐ　１−１６．８）５００ｍ　Ｑを使用し、連続的ニ
ａ度勾配を上昇させ、吸着物質を溶離した。活性区分を
集め、アミコン限外濾過濃縮装置ＴＣＰ−１０を用い、
４℃で限外濾過濃縮を行なった。この方法による活性回
収率は４０％であり、精製度は６倍であった。全工程を
通しての活性回収率は３５．３％であり、精製度は４．
０３Ｘ１０３倍であった。

次いで、上記方法で得られた活性区分を０．０２Ｍトリ
ス−塩酸（ｐＨ７，８）１０．ＩＭ　ＮａＣＱＷｉ衝液
に対して、４℃で一夜透析を行なった。同緩衝液で緩衝
化したファルマシアモノＱカラムに透析内液を付し、１
ｍ　Ｑ／分、１ｍＱ／分画の条件で当該物質を吸着さ往
た。次いで同緩衝液で充分洗浄後、０．０２Ｍ＋−リス
−塩Ｍ　（ｐ　Ｈ７，８）／１．ＯＭ　Ｎａ　ＣＱｔｌ
ｉ衝液を用い連続的にＮａ０９８度を上界させ、吸着し
た活性区分を溶離させた。活性区分は限外濾過濃縮した
。この方法による活性回収率は７５％であり、精製度は
５倍上竹した。全工程を通しての活性回収率は２６．５
％であり、精製度は２．０２×１０Ｌ倍であった。

次いで、上記濃縮液を０．１Ｍ　トリス−塩酸（ｐ　Ｈ
７，８）／７０％飽和硫安で平衡化したトーヨーパール
５Ｗ６０　（カラムナイズ１０Ｘ１０Ｘ５００に、流速
１１１Ｑ／分、２ｍ（１／分画で付与し、カラム中で塩
析した。ついで０．１Ｍトリス−塩酸（ｐ）１７．８）
の緩衝液を用い、連続的に硫安淵度を低下さ往て溶出溶
離を行なった。

活性区分を限外ｉＰ　Ａ　日縮装回を用い濃縮した。こ
の方法による活性回収率は４７％であり、精製度は４倍
であつｌ〔。全工程を通しての活性回収率は１２．４％
であり、ｔｉｌｊ製度は８．０８Ｘ１０’倍であった。

次いで、上記ａｍ液を０．１Ｍリン酸ナトリウム（１）
　Ｈ７，０）１０．２Ｍ　Ｎａ　Ｃ（＋１０．１％５Ｄ
ＳＩ衝液で平衡化したトーヨーソーダーＧ３０００ＳＷ
　（カラムザイズ７．５Ｘ６００ｍｍ）を用い、流速１
１１１　Ｑ／分、１ｍ　Ｑ／分画でゲル濾過を行なった
。この方法での活性回収率は３１％であり、精製度は４
倍上昇した。全工程を通じての活性回収率は３．８％で
あり、精製度は３．２３Ｘ１０５倍であった。

なお、本生理活性を有する低分子蛋白質の比活性は９．
０４Ｘ１０７単位／ＩＩＩ（Ｊ蛋白質であった。

実施例６ ｄｄＹＩ性マウス（体重２５〜３０ｇ）にザイモザンＡ
（シグマ社製、アメリカ）２．０ａａを腹腔内投与し、
注射９日後にエンドトキシン（大腸菌リボボリサツーカ
ライド）１０Ｍｇを尾静脈内注射し、２時間後眼球を摘
出して眼窩静脈叢より血液を採取した。採取した血液を
５０００回転／分で２０分間遠心分離し、血清を分離し
た。該操作により、１００匹のマウスから４８００単位
／ｍ　Ｑの力価を有する血清９６ＩＩＩＱが得られた。

該血清１００ｍＱに４７．２ｇの硫安を添加溶解後、４
℃で一夜放置し、活性物質を沈澱させた。

沈澱を１００００回＠／分で３０分間遠心分離（４℃）
し、沈澱を集め、約２０ｍＱの０．０２Ｍ　トリス−塩
酸級丙液１０．ＩＭ　Ｎａ　ＣＱ（１１Ｈ７，８）に懸
渇さ「た。この段階での活性回収率は９７％で、精製度
は１７倍であった。

次イテ、該沈ＩＦＪ濁液２０ｗ１Ｑに対し７．２ｇの尿
素を加え溶解させた。これを１００００回転／分で３０
分間冷却遠心分離（４℃）し、不溶物質を除去した。こ
の上滑液１０ＩＩＩＱをとり、０．０２Ｍ　トリス−５
ａ１０．５Ｍ　Ｎａ　ＣＱ緩緩衝で平衡化したウルトロ
ゲルＡｃＡ３４を用いてゲル濾過（カラムサイズ２６Ｘ
１０００ｍｍ）し、溶出分画した。該方法による活性回
収率は９２％で、精製度は３８倍であった。全段階を通
しての活性回収率は８９．２％で精製度は約６４６倍で
あった。

次いでアミコン限外濾過濃縮器ＴＣＰ−１０を用いて活
性区分を濃縮した。この濃縮液を０．０２Ｍ　リン＠緩
衝液（ｐ　Ｈ６，８）に対して、４℃で一夜透析をした
。この透析活性区分を０．０２Ｍ　リン酸ｌｉ函液（Ｔ
）Ｈ６，８）で平衡化したハイドロキシアパタイトゲル
のカラム（サイズ２６Ｘ４００ｍｍ）に付した。流速５
．　Ｏｍ　９７時、３ｍＱ／分画の条件下に同緩衝液で
充分洗浄した後、０．０２Ｍリン酸Ｍ衝液（ｐ　Ｈ６，
８）５００ｍＱ及び０．５Ｍ　リン酸緩衝液（ｐＨ６，
８）５００ｍ　ａを使用し、連続的に濃度勾配を上昇さ
せ、吸着物質を溶離した。活性区分を集め、アミコン限
外ｉ濾過濃縮装置ＴＣＰ−１０を用い、４℃で限外濾過
濃縮を行なった。この方法による活性回収率は４３％で
あり、精製度は６．８倍であった。全工程を通しての活
性回収率は３８．３％、精製度は４．３９ｘｌＯ’倍で
あった。

次いで、上記方法で得られた活性区分を０．０２Ｍトリ
ス−塩酸（１）８７．８）１０．ＩＭＮａＣＱ緩暫液に
対緩衝、４℃で一夜透析を行なった。同緩衝液で緩衝化
したファルマシアモノＱカラムに透析内液を付し、１１
ＩＩＱ／分、１ｍＱ／分画の条件で当該物質を吸着させ
た。次いで同緩衝液で充分洗浄後、０．０２Ｍ　トリス
−１ＭＭ　（ｐ　１−１７．８）／１．ＯＭ　Ｎａ　Ｃ
ＱＦｌｉ暫液を用い連続的にＮａＣＱｆｆｉ度を上臂さ
せ、吸着した活性区分を溶離させた。活性区分は限外濾
過濃縮した。この方法による活性回収率は７７％であり
、精製度は４．４倍上昇した。全工程を通しての活性回
収率は２９．５％であり、精製度は１．９３Ｘ１０’倍
であった。

次いで、上記濃縮液を０．１Ｍ！−リスー塩酸（ｐ　Ｈ
７，８）／７０％飽和硫安で平衡化したトーヨーバール
５Ｗ６０　（カラムサイズ１０×５００ｍｍ）に、流速
１ｍ　９１分、２１１１Ｑ／分画で付与し、カラム中で
塩析した。ついで０．１Ｍトリス−塩酸（ＤＨ７，８）
の緩衝液を用い、連続的に硫安濃度を低下させて溶出溶
離を行なった。

活性区分を限外濾過濃縮装置を用い口線した。この方法
による活性回収率は４３％であり、精製度は３．２倍で
あった。全工程を通しての活性回収率は１２．７％、ｍ
製度は６．２Ｘ１０’倍であった。

次いで、上記囮給液を０．１Ｍリン酸ナトリウム（ＩＴ
　Ｈ７，０）１０．２Ｍ　Ｎａ　Ｃ１ｉ！１０．１％Ｓ
ＤＳ緩衝液で平衡化したトーヨーソーダ−Ｇ３０００Ｓ
Ｗ　（カラムサイズ７．５Ｘ６００ｍｍ）を用い、流速
１１１Ｑ／分、１１ＩＩＱ／分画でグル濾過を行なった
。この方法での活性回収率は２８％であり、精ｌｉｊ度
は５．４倍上昇した。全工程を通じての活性回収率は３
．６％であり、精製度は３．３５Ｘ１０５倍であった。

なお、本生理活性を有する低分子蛋白質の比活性は９．
４４Ｘ１０’単位／ｍａ蛋白質であった。

実施例７ ウィスター系雌性ラット（体重２００〜２５０ｇ）にホ
ルマリン死菌コリネバクテリウム　パルバム（ウェルカ
ム社製、イギリス）１０＋１１（］を腹腔内投与し、注
射９日後にエンドトキシン（大胆菌リポポリサッカライ
ド）２５０μｇを尾静脈内注射した。エンドトキシン投
与２時間接にエーテル・麻酔下で腹部工大静脈より血液
を採取した。採取した血液を５０００回転／分で２０分
間遠心分離し、血清を分離した。該操作により、１００
匹のラットから１５００単位／ＩＩＩ　Ｑの力価を有す
る血清ａｏｅ＋ｎＱが得られた。

該血清１００＋１１（１！に４７．２＋＋の硫安を添加
溶解後、４℃で一夜放置し、活性物質を沈澱させた。

沈澱を１００００回転／分で３０分間遠心分岨（４℃）
し、沈澱を集め、約２０ｍＱの０．０２Ｍ　トＩＪスー
塩ＩＦ［衝液１０．ＩＭ　Ｎａ　ＧＱ（ｐＨ７，８）に
熱温させた。この段階での活性回収率は９４％で、精製
度は２１倍であった。

次いで、該沈澱懸澗液２０ｍＱに対し７．２ｇの尿素を
加え溶解させた。これを１００００回転／分で３０分間
冷却遠心分離（４℃）し、不溶物質を除去した。この上
清１１０ａｌｌをとり、０．０２Ｍトリス−塩Ｍ１０．
５Ｍ　Ｎａ　ＣＱｔｌｉ衝液で平衡化したウルトロゲル
ＡｃＡ３４を用いてゲルｉ濾過（カラムサイズ２６Ｘ１
０００ｍｍ）Ｌ、溶出分画した。該方法による活性回収
率は９０％で、精製度は４７倍であった。全段階を通し
ての活性回収率は８４．６％で、精製度は約９８７倍で
あった。

次いでアミコン限外濾過濃縮器ＴＣＰ−１０を用いて活
性区分を濃縮した。この濃縮液を０．０２Ｍ　リン酸緩
衝液（１）８６．８）に対して、４℃で一夜透析した。

この透析活性区分を０．０２Ｍ　リン酸緩衝液（Ｄ　Ｈ
６，８）で平衡化したハイドロキシアパタイトゲルカラ
ム（サイズ２６Ｘ４００１１１１）に付した。流速５．
０１１１！／時、３１１２／分画の条件下に同緩衝液で
充分洗浄した後、０．０２Ｍ　リン酸＊Ｗ液（ｐＨ６，
８＞５００ＩＱ及び０．５Ｍ　リン酸緩衝液（ｐＨ６，
８）５００ｍ　ａを使用し、連続的に濃度勾配を上昇さ
せ、吸着物質を溶離した。活性区分を集め、アミコン限
外濾過濃縮器［ＴＣＦ−１０を用い、４℃で限外濾過濃
縮を行なった。この方法による活性回収率は６４％であ
り、精製度は７．３倍であった。全工程を通しての活性
回収率は５４．１％であり、精製度は７．２Ｘ１０３倍
であった。

次いで、上記方法で得られた活性区分を０．０２Ｍ　ト
’Ｊ・スー塩ｒ１２（ｐＨ７，８）１０、ＩＭ　ＮａＣ
Ｑ緩衝液に対して、４℃で一夜透析を行なった。同Ｍ衝
液で緩暫化したファルマシアモノＱカラムに透析内液を
付し、１ｆｆｌＱ／分、１ｆｉｌ　Ｑ／分画の条件で当
該物質を吸着させた。次いで同緩衝液で充分洗浄後、０
．０２Ｍ　１〜リス−塩酸（ｐ　Ｈ７，８）／１．ＯＭ
　Ｎａ　ＣＱ緩衝液を用い連続的にＮａ　Ｃ（！濃度を
上昇させ、吸着した活性区分を溶離させた。活性区分は
限外濾過濃縮した。この方法による活性回収率は８１％
であり、精製度は８．１倍上昇した。全工程を通しての
活性回収率は４３．９％であり、ｖｉ製度は５．８３Ｘ
１０’倍であった。

次いで、上記濃縮液を０．１Ｍ　トリス−塩酸（ＥＩ　
Ｈ７，８）／７０％飽和硫安で平衡化したトーヨーパー
ル５Ｗ６０　（カラムサイズ１０×５００ｍｇ＋）に、
流速１ｍ　Ｑ／分、２ｍＱ／分画で付与し、カラム中で
塩析した。ついで０．１Ｍトリス−塩酸（ｐＨ７，８）
の緩衝液を用い、連続的に硫安濃度を低下させて溶出溶
離を行なった。

活性区分を限外濾過濃縮装置を用い濃縮した。この方法
による活性回収率は３８％であり、ｆ！製度は５．１倍
であった。全工程を通しての活性回収率は１６．７％で
、Ｎ製度は２．９７Ｘ１０’倍であった。

次いで、上記濃縮液を０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐ　
Ｈ７，０）１０．２Ｍ　Ｎａ　ＣＱ１０．１％５ＤＳｉ
ｌ函液で平衡化したトーヨーソーダーＧ３０００ＳＷ（
カラムサイズ７．５Ｘ６００ｍｍ＞を用い、流速４１Ｑ
／分、１１１１　Ｑ／分画でゲルｉ濾過を行なった。こ
の方法での活性回収率は３９％であり、精製度は６．１
倍上昇した。全工程を通しての活性回収率は６．５％で
あり、精製度は１．８１Ｘ１０”倍であった。

なお、本生理活性を有する低分子蛋白質の比活性は９．
０５Ｘ１０’単位／＋１１１１１蛋白質であった。

【図面の簡単な説明】

第１図はバイオゲルＡ１．５ｎ＋を用いたゲル枦適法に
よる本発明物質の分子量を測定した分子量分布図である
。第２図はトーヨーソーダーＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷ
を用いたゲル濾過法による本発明物質の溶出パターンで
ある。第３図は第２図の各標準蛋白質の溶出時間からめ
た本発明物質の分子量分布図である。第４図はポリアク
リルアミドゲル電気泳動による本発明物質の泳動図であ
る。第５図は第４図からめた本発明物質の分子Ｍ分布図
である。第６図は本発明物質の紫外線吸収スペクトル分
析図である。 （以　上） −−１“Ｉ′ 第３図 イ元　Ｔ当−吟　ｔｊＡ　ｃづ〉） ’ｉｔｓ　ｌト　１２１ 第５図 和ス“）゛均勤度 第　６１２１ ５良　夜（ｒ’＋＋η）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ■　下記の理化学的性質及びｍ造的特徴を有する低分子
   蛋白質。 ａ）分子口：　１６０００±１５００ ｂ）等電点：ｐ　Ｈ３，８±０．３ ０　）０．ＩＭ　Ｎａ　ＣＱ加０．０２Ｍトリス−塩酸
   緩衝液（ｐ　Ｈ７，８）中での紫外部吸収極大値が２７
   ７ｎＩ１１．極小値が２５００１であるｄ）３ｍａ蛋白
   ｆｊｋ／、ｍＱの０．０２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
   ７，８）Ｉ液において無色透明であり、アセトン又はエ
   タノールを該溶液に７０Ｖ／Ｖ％以上加えると沈澱を生
   ずる ｅ）水溶液は弱酸性を示す ｆ）ビュウレット反応、フォリンローリ−反応法ならび
   に塩酸加水分解後のニンヒドリン反応についてペプチド
   結合ならびにアミノ酸の呈色反応を示す ｇ）アミノ酸組成比： ６Ｎ塩酸で１１０℃、２４時間減圧下に加水分解後、ア
   ミノ酸アナライザーにより分析したアミノ酸組成比（モ
   ル比）は、Ｇｌｙを１．００として以下の通りである Ｇｌｙ　１．００ ＡＳ＋）及び／又はＡＳｒｌｌ、１０±０．０６Ｔｈｒ
   　０．４５±０．０２ Ｓｅｒ　Ｏ，９０±０．０５ Ｇｌｕ及び／又はＱｌｎｌ、８２±０．０９Ｐｒｏ　０
   ．８４±０．０４ Ａｌａ　１．１１±０．０６ Ｃｙｓ　Ｏ，２０±０．０２ Ｖａｌ　Ｏ，８６±０．０４ Ｍｅｔ　Ｏ，１８±０．０１ １１ｅ　Ｏ，３８±０．０２ Ｌｅｕ　１．７３±０．０９ Ｔｙｒ　Ｏ，６４±０．０３ Ｐｈｅ　Ｏ，３４±０．０２ Ｈｉｓ　Ｏ，２８±０．０１ ＬＩＳ　Ｏ，４４±０．０２ Ａｒｃ　０．４６±０．０２ ｈ）アミノ酸配列 アミノ酸シークエンサーによるアミノ末端側より１７個
   のアミノ酸が以下の配列を有している。 Ｈ−八Ｉａ　−Ｌ　ｅｕ−Ｓ　ｅｒ−Ａ　ｓＤ　−Ｌ　
   ｙｓ−Ｐ　ｒｏ・−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　ｌａ−Ｈｉｓ　−
   Ｖ　ａｌ　−Ｖ　ａｔ−ΔＩａ−ＡＳｎ−Ｐ　ｒｏ　−
   Ｇ　Ｉｎ　−Ｖ　ａｔ　−Ｇ　Ｉｕ−