CZ283467B6 - Lidské IL-4 mutantní proteiny - Google Patents
Lidské IL-4 mutantní proteiny Download PDFInfo
- Publication number
- CZ283467B6 CZ283467B6 CZ941185A CZ118594A CZ283467B6 CZ 283467 B6 CZ283467 B6 CZ 283467B6 CZ 941185 A CZ941185 A CZ 941185A CZ 118594 A CZ118594 A CZ 118594A CZ 283467 B6 CZ283467 B6 CZ 283467B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- hil
- amino acid
- protein
- replaced
- mutant
- Prior art date
Links
- 101100069857 Caenorhabditis elegans hil-4 gene Proteins 0.000 title claims abstract 23
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 title description 3
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 title 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 title 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 12
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims abstract description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 7
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 36
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 31
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 16
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 12
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 12
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 7
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 claims description 4
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 claims description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 3
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 3
- -1 arginine amino acid Chemical class 0.000 claims 4
- 101001002709 Homo sapiens Interleukin-4 Proteins 0.000 abstract description 52
- 102000055229 human IL4 Human genes 0.000 abstract description 52
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 abstract description 11
- 239000004031 partial agonist Substances 0.000 abstract description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 18
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 14
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 14
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 14
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 8
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 8
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 8
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 8
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 6
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 6
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 6
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 6
- NZWOPGCLSHLLPA-UHFFFAOYSA-N methacholine Chemical compound C[N+](C)(C)CC(C)OC(C)=O NZWOPGCLSHLLPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229960002329 methacholine Drugs 0.000 description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 5
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 5
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 5
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 102100021943 C-C motif chemokine 2 Human genes 0.000 description 4
- 101710155857 C-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 208000037883 airway inflammation Diseases 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 4
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000244188 Ascaris suum Species 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 3
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 3
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 3
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 3
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UPXRTVAIJMUAQR-UHFFFAOYSA-N 4-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-1-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound C1C(C(O)=O)N(C(=O)OC(C)(C)C)CC1NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21 UPXRTVAIJMUAQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 2
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 2
- 206010014950 Eosinophilia Diseases 0.000 description 2
- 101000878605 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Proteins 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 241000239218 Limulus Species 0.000 description 2
- 102100038007 Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Human genes 0.000 description 2
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010000134 Vascular Cell Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 2
- 102100023543 Vascular cell adhesion protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 210000005058 airway cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 2
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 108010072542 endotoxin binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 230000008676 import Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 229960004184 ketamine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CPKVUHPKYQGHMW-UHFFFAOYSA-N 1-ethenylpyrrolidin-2-one;molecular iodine Chemical compound II.C=CN1CCCC1=O CPKVUHPKYQGHMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OXEUETBFKVCRNP-UHFFFAOYSA-N 9-ethyl-3-carbazolamine Chemical compound NC1=CC=C2N(CC)C3=CC=CC=C3C2=C1 OXEUETBFKVCRNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 101001046686 Homo sapiens Integrin alpha-M Proteins 0.000 description 1
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 1
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 1
- 101000934346 Homo sapiens T-cell surface antigen CD2 Proteins 0.000 description 1
- 101000716102 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD4 Proteins 0.000 description 1
- 101000946843 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Proteins 0.000 description 1
- 101000622304 Homo sapiens Vascular cell adhesion protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102100022338 Integrin alpha-M Human genes 0.000 description 1
- 102100027268 Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Human genes 0.000 description 1
- 102000010787 Interleukin-4 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038486 Interleukin-4 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 1
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000002200 Respiratory Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 206010040914 Skin reaction Diseases 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100025237 T-cell surface antigen CD2 Human genes 0.000 description 1
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 1
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003915 air pollution Methods 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940064804 betadine Drugs 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000012520 frozen sample Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000005534 hematocrit Methods 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000036046 immunoreaction Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 1
- 229940015418 ketaset Drugs 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000037311 normal skin Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 239000013643 reference control Substances 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 229940069575 rompun Drugs 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000035483 skin reaction Effects 0.000 description 1
- 231100000430 skin reaction Toxicity 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001562 sternum Anatomy 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229960001005 tuberculin Drugs 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000012762 unpaired Student’s t-test Methods 0.000 description 1
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 1
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- QYEFBJRXKKSABU-UHFFFAOYSA-N xylazine hydrochloride Chemical compound Cl.CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 QYEFBJRXKKSABU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5406—IL-4
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Terapeutická činidla, která jsou antagonisty nebo parciálními antagonisty lidského interleukinu-4, nebo je obsahují, hIL-4mutantní proteiny a způsob jejich přípravy.ŕ
Description
Oblast techniky
Předložený vynález se týká hIL-4 mutantních proteinů a terapeutických činidel, které jsou antagonisty nebo částečnými antagonisty lidského interleukinu-4 nebo jej obsahují.
Dosavadní stav techniky
V současné době trpí široké vrstvy obyvatelstva alergiemi. Je možno očekávat stoupající znečištění vzduchu a stoupající počet do prostředí difundujících, alergie vyvolávajících substancí, díky nimž bude v budoucnosti počet onemocnění ještě dále stoupat. Proto je nezbytné vyvinout léčiva, která mohou zasáhnout do průběhu alergického procesu.
Lidský interleukin-4 (hIL-4) je jedním z mnoha cytokinů, které indukují a koordinují proliferaci, zrání, přežívání a diferenciaci lymfoidních a myeloidních buněk1'3’, Zejména se hIL-4 podílí na IgE- zprostředkovaných imunoreakcích a přímo urychluje proliferaci thymocytů a aktivovaných T-buněk. Bylo možno identifikovat vysoce afinitní IL-4- receptorový protein s Mr 140 000, který je podle své cDNA sekvence tvořen 800 aminokyselinovými zbytky 4’. Patří do skupiny receptorů popsaných v poslední době, které jsou označovány jako superrodina hematopoietin receptorů5’.
Aminokyselinová sekvence IL-4 je tvořena 129 zbytky, vzhledem ke klonované cDNA6’. cDNA je exprimována v E.coli7,8) a kvasinkách9). Z těchto zdrojů může být získán rekombinantní IL-4 s vysokou biologickou aktivitou.
V publikaci Febs. Letters, Bd. 286, Nr. 1,2, Juli 1991, Amsterdam NL, 58 - 60 je popsán mutantní hIL-4 protein, který má v aminokyselinové sekvenci aminokyselinu tyrosin, která se přirozeně vyskytuje v poloze 124, nahrazenou kyselinou asparagovou. Žádné farmakologické účinky však u tohoto proteinu nejsou popsány.
Úloha interleukinu-4 v alergických procesech umožňuje se domnívat, že substance, které inhibují procesy zprostředkované interleukinem-4 nebo konkurují s hIL-4, přeruší reakční řetězec, způsobující chorobu.
Úlohou vynálezu proto je nalezení terapeutického prostředku, jehož aktivní podstatnou částí jsou antagonisté nebo parciální agonisté lidského interleukinu-4.
V poslední době je již známa monoklonální protilátka, která vykazuje proti lidskému interleukinu-4 antagonistické vlastnosti10’. Tato protilátka obsahuje Fab-fragment a je produkována hybridomovou buněčnou linií člověk-člověk. Také hybridomová linie ze slezinných buněk proti (ne-)glykosylovanému lidskému IL-4 imunizované krysy produkuje monoklonální protilátky hIL-411’.
Podstata vynálezu
Uvedená úloha je podle předloženého vynálezu vyřešena nalezením mutantního hIL-4 proteinu, který má aminokyselinovou sekvenci divokého typu hIL-4 proteinu, ale kde jedna až tři aminokyseliny, vyskytující se vněm v polohách 121, 124 nebo 125 je nahrazena jinou přirozenou aminokyselinou, neboje aminokyselivová sekvence ukončena v jedné z těchto poloh, s výjimkou muteinu kde je tyrosin v poloze 124 nahrazen kyselinou asparagovou.
-1 CZ 283467 B6
Výhodný je mutantní hIL-4 protein, který má aminokyselinovou sekvenci divokého typu hIL-4 proteinu, ale kde aminokyselina tyrosin, která se přirozeně vyskytuje v poloze 124 je nahrazena jinou přirozenou aminokyselinou s výjimkou kyseliny asparagové, výhodně glycinem.
Dále je výhodný mutantní hIL-4 protein, který má aminokyselinovou sekvenci divokého typu hIL-4 proteinu, ale kde aminokyselina arginin, která se přirozeně vyskytuje v poloze 121 je nahrazena jinou přirozenou aminokyselinou, výhodně kyselinou asparagovou.
io Rovněž je výhodný mutantní hIL-4 protein, který má aminokyselinovou sekvenci divokého typu hIL-4 proteinu, ale kde aminokyselina serin, která se přirozeně vyskytuje v poloze 125, je nahrazena jinou přirozenou aminokyselinou, výhodně kyselinou asparagovou.
Dále je předmětem předloženého vynálezu terapeutické činidlo pro ošetření alergických procesů, 15 které obsahuje
a) mutantní hIL-4 protein, který má aminokyselinovou sekvenci divokého typu hIL-4 proteinu, ale kde jedna až tři aminokyseliny, vyskytující se v polohách 121, 124 nebo 125 je nahrazena jinou přirozenou aminokyselinou, neboje aminokyselinová sekvence ukončena v jedné z těchto poloh a
b) fyziologicky přijatelný nosič.
Takto jsou poskytnuty terapeutické prostředky, které jsou antagonisty nebo parciálními agonisty 25 hIL-4 nebo tyto obsahují a vyznačují se tím, že antagonisté nebo částeční agonisté jsou hIL-4 mutantní proteiny. Volba terapeutických prostředků má tu výhodu, že genetickým inženýrstvím je možno vyrobit cílené proteiny, které díky své podobnosti s divokým typem hIL-4 mohou soupeřit v obsazení hIL-4 receptorů.
Dále je úlohou vynálezu připravit hIL-4 mutantní proteiny a nalézt způsob jejich přípravy.
hIL-4 je možno vyrobit jako rekombinantní protein (rhIL-4) genovou technologií, např. vE.coli. Takto vytvořený protein je možno solubilizovat, renaturovat a izolovat, rHL-4 potom vykazuje vysokou specifickou biologickou aktivitu, kterou je možno stanovit např. měřením DNA35 syntézy/proliferace aktivovaných T-buněk nebo CD23 exprese v aktivovaných B-buňkách (viz např. Kruše N. aspol. (1991) FEBS Lett. 286, 58-60; Kikutani H. a spol. (1986) Cell 47, 657-665).
V souladu s vynálezem byl nyní navržen způsob, kterým je možno produkovat mutantní proteiny 40 hIL-4-divokého typu, které mají vlastnosti hIL-4 antagonistů nebo parciálních hIL-4 agonistů.
Zejména antagonisté hIL-4 poskynutí možnost specificky potlačovat účinek hIL-4.
Pro tento účel se
- cDNA, obsahující DNA-oblast, které kóduje maturovanou oblast hIL-4, podrobí cílené oligonukleotidové mutagenezi (místně řízená mutagenese) tak, že se v požadované poloze (polohách) exprimuje zvolená jiná zmožných přirozených aminokyselin, nebo se přeruší stopkodonem polypeptidový řetězec,
- DNA-oblast, kódující mutovanou maturovanou oblast hIL-4, se integruje do expresního vektoru,
- vytvořený hybridní vektor se inzertuje do E.coli a
-2 CZ 283467 B6
- hIL-4-mutantní protein se exprimuje a popřípadě izoluje.
Pro pořízení cDNA, která obsahuje DNA-oblast, kódující maturovanou oblast hIL-4, nebo maturované oblasti hIL-4, je možno se obrátit na práci6) a tam uvedenou literaturu. V uvedených souvislostech je pod výrazem cDNA, která kóduje maturovanou oblast hIL-4 také zahrnuta cDNA, která při téměř stejném počtu párů bází představuje konkrétně v uvedeném stavu techniky mutanty uvedené cDNA, pokud jsou tyto mutanty hIL-4 antagonisty nebo parciálními agonisty hIL-4.
Číslování maturované oblasti hIL-4 kódujících DNA-oblastí je provedeno podle Garra C. a spol., (Biochemistry (1991) 3 0, 1515-1523).
cDNA, která kóduje maturovanou oblast hIL-4, může být získána vyříznutím EcORV/BamHIfragmentu z genovou technologií vyrobených cDNA (např. od British Bio-Technology Ltd., Oxford, Anglie). DNA-fragment se intergruje po přídavku syntetických oligonukleotidů, např. 5'-CATGCACAAGTGCGAT a 5-ATCGCACTTGTG, které obsahují první 4 aminokyselinové kodony interleukinu-4 a dále kodon pro start methioninu, mezi expresní vektor, například mezi Ncil- a BamHI- místo štěpení expresního vektoru RT3 pRC 10912).
Místě řízená mutageneze může být provedena podle Kramera a spol. (Nucleic Acids Research (1984) 12, 9441-9455; Cell (1984) 38, 879-887 a Boehringer-Mannheim-Prospekt, Biohemicals for molecular Biology (1987) 35 etc., viz takél2). K mutagenezi použitý oligopeptid může obsahovat asi 6 až 10 bází a asi 6 až 10 bází pod ní (němi) může být změněno.
Pro odborníka je také zřejmé, jak vyříznout mutovanou maturovanou oblast hIL-4 kódující DNAoblast z vektoru, převést ji do expresního vektoru, potom inzertovat do E.coli, jakož i exprimovat hIL-4 mutantní proteiny a jak provést jejich fakultativní izolaci (McCarthy a spol.: Gene (1986)41, 201-206; Kato a spol.; Biochem. Biophys, Res. Commun(1985)130, 692-699), přičemž jsou možné modifikace125.
Podle speciálního provedení způsobu podle vynálezu se do cDNA, která obsahuje DNA-oblast, která kóduje maturovanou oblast hIL-4, inkorporuje DNA pro iniciátor-methionin, před tím, než se provede cílená oligonukleotidová mutageneze.
Podle další speciální formy provedení se může DNA-oblast, která kóduje mutovanou maturovanou oblast hIL-4, vystřihne z cDNA-mutantu jako nCol-BamHI-fragment.
Výhodně se pro expresi použije teplotou regulovaný expresní vektor, například pILA502 (bez nalevo se nacházejícího lambda-promotoru a polylinkeru) a/nebo obvyklý kmen E.coli jako hostitel, například JMI03 (recA ). U pILA502 srovnej s prací Schaudera a spol., (Gene(1987) 52, 279283). Další vhodné expresní systémy je možno získat od Pharmacia (Prokaryotic Gene Fusion Vectors). Kmen E.coli JM103 je možno také popřípadě získat od fy Pharmacia.
Podle dalšího způsobu provedení se vynález také týká hIL-4-mutantu divokého typu, ve kterém je v oblasti v poloze 124 Tyr vyměněn za Asp.
Dále je vynález blíže vysvětlen dvěma příklady.
-3CZ 283467 B6
Příklady provedeni vynálezu
Příklad 1 cDNA, která kóduje maturovanou oblast hIL-4 a počátek methioninu, se podrobí cílené oligonukleotidové mutagenezi podle Kramera a spol. Syntetický olinukleotid obsahuje 6 bází před a po vyměňovaném nukleotidu a byl vyroben pomocí DNA-syntetizátoru (Applied Biosystems. Modell 380).
Vyměňovaným místem byla poloha 124 v C-terminální, pravděpodobně α-helikální oblasti (polohy 110 až 129). Přitom byl Tyr zaměněn za Gly-. Získaná mutace byla ověřena sekvenční analýzou jednořetězcové bakteriofágové DNA. Mutovaná cDNA byla vyříznuta jako NcoI/BamHl-fragmet ze dvojřetězcové virové DNA a kombinována s teplotně regulovaným 15 expresním vektorem, který odpovídal pILA502 s tou výjimkou, že nalevo se nacházející lambdapromotor apolylinker chyběly. Jako hostitel byl použit recA- derivát kmenu E.coli JMI03. Integrovaná hIL-4-cDNA byla sekvenována za účelem ověření mutace. Potom byl kmen použit pro expresi muteinu.
Po expresi a izolaci se ukázalo, že mutein (Y124G) se váže s nezměněnou afinitou na receptor hIL-4. Nicméně maximální indukovaná proliferace aktivovaných periferních T-buněk činí jen 10 až 20 % proliferací indukovaných hIL-4-divokého typu. Toto ukazuje, že mutein Y124G vykazuje vlastnosti parciálního agonisty.
Příklad 2
Opakuje se příklad 1, ale v poloze 124 se exprimuje Asp místo Tyr. Izolovaný mutein Y124D nevykazuje ani při koncentraci 1 μΜ žádnou aktivitu proti aktivovaným periferním T-buňkám. 30 Potlačuje však aktivitu hIL-4-divokého typu s konstantou inhibitoru asi 600 pM. Toto ukazuje, že mutein Y124D má vlastnosti antagonisty. Mutein Y124D má malou zbytkovou aktivitu při indukci CD23 na aktivované B-buňky. Maximálně dosažitelná indukce však činí jen asi 5 % indukce dosahované hIL-4-divokého typu. Aktivita hIL-4-divokého typu se v tomto systému potlačuje muteinem Y124D s konstantou inhibitoru Ki asi 800 pM. Mutein Y124D měl v B35 buněčném systému také vlastnosti velmi slabého agonisty.
Příklad 3
Opakuje se příklad 1 stím rozdílem, že se v poloze 121 exprimuje Asp místo Arg. Izolovaný mutein vykazuje nezměněnou vazbu na hIL-4 receptor. Maximálně indukovatelná proliferace aktivovaných T-buněk však činí jen asi 30 % proliferace indukovatelné hIL-4-divokého typu. Toto ukazuje, že mutein R 121 D má vlastnosti parciálního agonisty.
Příklad 4
Opakuje se příklad 1 s tím rozdílem, že se v poloze 125 exprimuje Asp místo Ser. Izolovaný mutein S 125 D se váže s nezměněnou afinitou na receptor pro hIL-4. Maximálně indukovatelná 50 proliferace aktivovaných periferních T-buněk však činí jen asi 35 % proliferace indukovatelné hIL-4-divokého typu.
-4 CZ 283467 B6
Testy účinku hIL-4-mutantního proteinu
Pokusy k hodnocení patologického modelu vyvolaného IL-4 se provádí následujícím způsobem:
Zvířata:
Pro tento výzkum se použijí dospělé samičky opice cynomolgus (Macaca fasicularis, Charles River Primáte Imports, Boston, Mass.), vážící přibližně 4 až 6 kg. Všechna zvířata, použitá v tomto výzkumu, mají obvyklou kůži arespirační citlivost k proteinovému extraktu Ascaris suum. Všechna zvířata jsou ve výborném zdravotním stavu, v krevním oběhu mají obvyklý počet leukocytů a mají obvyklý chemismus krve. Zvířata jsou umístěna jednotlivě v prostorech s řízeným prostředím v otevřených klecích a dostávají jídlo dvakrát denně a vodu ad libitum. Všechna zvířata byla držena bez stravy po dobu přibližně 12 hodin před prvním dnem započetím výzkumu.
Reakce kůže na 11-4
Pro každý pokus se zvířata anestetikují intramuskulámí injekcí hydrochloridu ketaminu (Ketast, lOmg/kg). Hřbetní část každého zvířete se vystříhá a vyčistí 70% alkoholickým roztokem betadinu. 11-4 nebo mutantní 11-4 (10 pg) nebo vehikulum (0,2% lidské albuminové sérum. HSA) se injikuje podkožně do hřbetu zvířat v objemu 0,1 ml s použitím 1 ml tuberkulinové stříkačky. Místa vpichu jsou od sebe ve vzdálenosti nejméně 10 cm a označena nesmazatelným značkovačem. Vzorky tkáně pro biopsii se získají s použitím 6 mm odběrového nástroje pro biopsii a vzorky se umístí v (OTC) a zmrazí v kapalném dusíku. Biopsie se provádí v inervalu 0,4, 8 a 24 hodin po injekci.
Systémová reakce na 11-4 nebo mutantní 11-4
11-4 nebo mutantní 11-4 se podává subkutánně dvakrát denně (přibližně po 10 - 12 hodinách) po čtyři po sobě následující dny v objemu 0,1 ml/kg a dávce 0, 2,5, 25 nebo 250 pg/kg v celkové denní dávce 0, 5, 50 a 500 pg/kg v daném pořadí. Periferní krevní vzorek se každému zvířeti odebírá před první injekcí vehikula nebo IL-4 nebo mutatního 11-4 na začátku každého dne výzkumu au alikvotů se analyzuje na celkový počet krevních buněk a jejich diference, cytometrií se analyzují periferální mononukleámí krevní buňky se značeným povrchem. Zbytek krevních vzorků se odstředí aalikvoty plazmy se skladují při -70 °C pro následné analyzy hladiny chemokinu.
Příprava 11-4
Lyofilizovaný rekombinantní lidský 11-4 (E.Coli) se rekonstituuje ve sterilním lidském albuminovém seru o koncentraci 0,2 % (Baxter Healthcare Corp., Glendale, CA) při skladovací koncentraci 2,5 mg/ml. Přípravek 11-4 neobsahuje endotoxiny, jak bylo zjištěno pomocí testu lyzátu Limulus amoebocyte, který prokázal, že hladina endotoxinu je méně než 0,2 endotoxinových jednotek/ml, což je limitní citlivost testu.
Chemismus imunohistologie
Připravené zmrazené vzorky se ponechají do vyrovnání s teplotou místnosti, vysuší se na vzduchu a stabilizují v acetonu při 4 °C po dobu 5 min. Řezy se umístí na 5 min, do 10 mM PBS s0,l% BSA. Lokalizace VCAM-1 se provádí s použitím C313.3, monoklonovanou protilátkou lidského VCAM-1, která byla získána od M. E.Gerritsena zBayer Corporation. Irelevantní, vhodný imunoglobulin, který byl rovněž získán od M. E.Gerritsena z Bayer Corporation, se ve vhodné koncentraci použije jako látka pro srovnávací kontrolu. Endogenní biotin se blokuje za
-5CZ 283467 B6 použití blokovací soupravy Vector Biotin (Vector Laboratories. Burlingame, CA). Jednotlivé sekce se inkubují 1,5 hodiny při teplotě místnosti ve vlhké komoře s indikovanými antisery rozpuštěnými v PBS o koncentraci 0,1% BSA al% normálního králičího sera. Po trojím promytí PBS se řezy vybarví pomocí soupravy Vector ABC Elitě v souladu s pokyny k použití 5 akonjugát protilátky se detekuje inkubací řezů v 3-amino-9-ethylkarbazolu/peroxid vodíku (souprava AEC substrát, Vector). Řezy se pečlivě promyjí 0,1 M acetátovým pufrem, promyjí se destilovanou vodou a upevní v Lemerově AQUQ-MOUNT (Lemer Laboratories, Pittsburgh, PA).
ίο Vyhodnocení
Vzorky jsou vyhodnoceny dvěma nezávislými pozorovateli s použitím slepého pokusu stupnicí mezi 0 a 3+, umožňující odhad jak intensity, tak i distribuce vybarvení. Systém vyhodnocení pro expresi VCAM-1, který je založen na systému původně popsaném autory Brisco aost., (13) je 15 následující: 0 absence nebo slabé vybarvení nečetných cév, 1+ slabé zbarvení několika cév, 2+ vybarvení střední intensity většiny cév, 3+ intensivní vybarvení většiny cév. Krevní cesty byly identifikovány v sérii sekcí vybarvených pro stanovení von Willebrandova faktoru (polyklonovaný králičí antihumání VWF:, Dakoplatts, Carpinteria, CA)
Hematologie
Analýzy počtu erythrocytů, hematokritů, počtu leukocytů a počtu destiček se provádějí na heparizovaném krevním vzorku za použití krevního analyzeru Serono 9000 (Baker Diagnostics, Allentown, PA). Rozdíly v leukocytech byly hodnoceny rychlým stanovením (Diff-Quick) 25 vybarvených krevních skvrn, kde je spočteno celkové množství dvou set buněk a procenta každého typu buněk jsou zaznamenány.
Průtoková cytometrie
Analýza povrchového značení periferních mononukleámích krevních buněk (PBMC) se provádí následujícím způsobem. Vzorek 4 ml heparinizované krve se rozpustí vHankově rovnovážném solném roztoku (HBSS, bez Mg++ nebo Ca++) a přenese se do 4 ml Percollu (o hustotě 1070 gm/ml). Zkumavky se centrifugují při 1800 otáčkách za minutu (Beckman GS-6R) po dobu 20 minut při teplotě 24 °C. Vrstva obsahující lymfocyty se odsaje a centrifuguje při 1100 otáčkách za minutu po dobu 10 minut. Výsledný buněčný koláč se opět suspenduje v 6 ml fyziologického roztoku pufrovaného fosforečnany (PBS), obsahujícím 0,1 % azidu a 5 % kozího sera. Alikvoty 1 ml se použijí pro analýzu povrchového značení buněk, jak se popisuje níže.
Protilátky proti CD 2, CD 4, CD 8, CD 1 lb, CD 16, CD 25, CD 49 a HLA-DR (R&D Systems, 40 Minneapolis, MN) se použijí pro analýzy průtokovou cytometrií. Alikvoty 20 μΐ značených protilátek se inkubují s 1 ml alikvoty buněčné suspenze v temnu po dobu 60 minut při teplotě 4 °C a vzorky se centrifugují (1000 otáček za minutu, 10 minut při teplotě 4 °C). Koláče se promyjí třikrát 1 ml PBS obsahujícím 0,1 % azidu a 5 % kozího sera, potom se provádí analýza FAC.
Chemokinový test (MCP-1)
Na vzorcích plasmy, získaných během každé studie, se analyzuje hladina MCP-1 specifickou ELIS A, jak bylo dříve popsáno (19,20). Na 96 vzorkovacích destiček (Nunc, Kamstrup, Dánsko) 50 se nanese 50 μΐ/vzorek králičí anti-MCP-1 na dobu 16 hodin při teplotě 4 °C a potom se promyje
PBS, pH 7,5, 0,05 % Tween-20 (promývací pufr). Nespecifická spojovací místa se blokují 2 % BSA v PBS (200 μΐ) a destičky se inkubují po dobu 90 minut při teplotě 37 °C. Destičky se promyjí třikrát pufrem, přidá se rozpuštěný stejný (čistý, 1:5 a 1:10) testovací vzorek (50 μΐ),
-6 CZ 283467 B6 následuje inkubace po dobu 1 hodiny při teplotě 37 °C. Destičky se čtyřikrát promyjí a přidává se 50 μΐ/vzorku biotinylovaného králičího anti-MCP-1 po dobu 45 minut při teplotě 37 °C. Destičky se promyjí čtyřikrát, přidá se konjugát straptavidin-peroxidáza (100 μΐ/ml) (Dakopatts, Carpintería, CA) a destičky se inkubují po dobu 30 minut při teplotě 37 °C. Destičky se třikrát 5 promyjí a přidá se 100 μΐ chromogenního substrátu (0,67 mg/ml dichloridu ortofenylendiaminu) (Dakopatts, Carpintería, CA). Destičky se inkubují při teplotě 25 °C po dobu 6 minut a reakce se ukončí roztokem 50 μΐ/vzorek 3 M H2SO4 v promývacím pufru s 2 % FCS. Destičky se vyhodnotí při 490 nm v přístroji ELISA. Standardem je 0,5 log roztok rekombinantní MCP-1 od 100 ng/ml do 1 pg/ml (50 μΐ/vzorek). ELISA detekuje spolehlivě koncentrace MCP-1 > 10 50 pg/ml.
Statistická analýza
Data ze všech pokusů se statisticky vyhodnocují s použitím nepárového Studentova t-testu, kde 15 p hodnota < 0,05 se považuje za statisticky významnou.
Model astmatu u primátů - 10-denní experiment
Methody:
Zvířata
Pro tyto studie se použijí dospělé samičky opice cynomolus (Macaca fasicularis, Charles River Primáte Imports, Boston, MA), o váze 4 - 6 kg. Všechna zvířata, použitá v této studii, mají kůži, 25 která se běžně vyskytuje a respirační citlivost k proteinovému extraktu Ascaris suum. Všechna zvířata byla ve výborném zdravotním stavu, v krevním oběhu měla obvyklý výskyt leukocytů a obvyklý chemismus krve. Zvířata byla umístěna jednotlivě v prostorech s řízeným prostředím v otevřených klecích a dostávala jídlo dvakrát denně a vodu ad libitum. Všechna zvířata byla držena bez stravy po dobu přibližně 12 hodin před prvním dnem experimentu. Všechny 30 protokoly prověřil a schválil Bayer Corporation Intemal Animal Care and Use Committee.
Zvířata byla podrobena vyšetřování po anestezi hydrochloridem ketaminu (4 mg/kg, i.m.; Ketaset; Bristol Laboratories, Syracuse, N.Y.), axylazinem (1 mg/kg, i.m.; Rompun; Miles Laboratories, lne., Elkhart, Ind.), intubovány pomocí zavedené endotracheální trubičky (5,5 mm 35 ID, Mallinckrodt Critical Care, St. Louis, Mo.) a byly umístěny ve vzpřímené pozici ve specielně navržené podpůrné židli. Ketamin (4 mg/kg, i.m.) se používal samostatně podle potřeby k podpoře anesteze.
Protokol o studii
Citlivost dýchacích cest (metacholin PC100), sledovaná podle složení buněk dýchacích cest (bronchoalveolar lavage, BAL) byla stanovována 3 dny před (den 0) a 3 dny po (den 10) inhalaci extraktu Ascaris suum třikrát obden (dny 3, 5, 7). Zvířatům byl poskytnut čas k relaxaci po dobu 4 až 6 týdnů mezi výzkumy, aby se citlivost dýchacích cest a záněty mohly vrátit k původní (pre45 antigen) hodnotě. Zpracování výzkumu bylo prováděno ve srovnání s kontrolní studií s vehikulem, aby se zajistilo, že nedošlo k žádným změnám v citlivosti k antigenu v závislosti na čase.
Při experimentálním provádění pokusů (R121D/Y124D IL-4 mutein nebo dexametazon) byla 50 zvířata dávkována druhého dne studie (podkožní injekce) a každý následující den až do devátého dne studie. Lyofilizovaný rekombinantní lidský R121D/Y124D IL-4 byl rekonstituován ve sterilním 0,2 % lidském séru albuminu HSA, Baxter Healthcarea Corp., Glendale, CA) má užívanou koncentraci 2,5 mg/1. Přípravek R121D/Y124D IL-4 neobsahoval endotoxiny, jak bylo
-7 CZ 283467 B6 zjištěno pomocí testu lyzátu Limulus amoebocyte, který prokázal, že hladina endotoxinu byla méně než 0,2 endotoxinových jednotek/ml, což je limitní citlivost testu. Dexamethason je obchodně dodávaný a prodávají jej externí prodejci.
Citlivost dýchacích cest
Citlivost dýchacích cest byla stanovena určením koncentrace rozprášeného a inhalovaného metacholinu, který způsobuje 100 % zvýšení rezistence dýchacích cest při průchodu vzduchu do plic a z plic. Toto se ukončí podáním zvýšené koncentrace metacholinu (rozpuštěný v solném fosfátovém pufru) v polovičních logaritmických krocích, dokud se nedosáhne > 100 % zvýšení rezistence dýchacích cest. PC 100 se pak vyčíslí lineární regresní analýzou posledních 2 nebo 3 bodů na logaritmické závislosti koncentrace metacholinu oproti procentnímu zvýšení v diagramu rezistence dýchacích cest.
Bronchoalveolámí výplach (BAL)
Složení buněk dýchacích cest se určuje pomocí BAL. Pediatrický fiberoptický bronchoskop (model BF-3C4, Olympus Corp., Lake Success, N.Y.) se zavede podél prsní kosti, dokud nedosáhne páté až sedmé generace bronchů. Potom se zavede a jemně se aspiruje kanálkem bronchoskopu jeden alikvot 15 ml bikarbonátu pufrovaného normální solí (pH 7,4). Celkový počet leukocytů v mililitru kapaliny BAL se stanoví počítáním hemocytometrem. Počítání odlišných buněk (bylo spočteno celkem 200 buněk) se provádí na barevných Wright-Giemsa cytocentrifugálních přípravcích. K zamezení vlivů primárních BAL na následné BAL, se provádějí BALy před a po testování antigenů na opačných stranách plic.
Statistická analýza
Data ze všech pokusů se statisticky vyhodnocují s použitím nepárového Studentova testu, kde p hodnota < 0, 05 se považuje za statisticky významnou.
Výsledky
Vlivy na eosinophilie dýchacích cest vyvolané antigenem
Opakované inhalace antigenů vyvolávají záněty dýchacích cest, jak indikuje velký počet regenerovaných eosinofilů v kapalině BAL. Aplikace R121D/Y124D IL-4 muteinu v dávce 500 pg/kg, b.i.d, výrazně inhibuje průnik eosinofilů do plic.
V další sérii studií byl zkoumán vliv dexametazonu. Podávání dexametazonu v dávce 200 pg/kg výrazně inhibuje eosinofilii dýchacích cest, vyvolanou antigenem podobně jako při podávání 11-4 dvojitého muteinu.
Vliv na přeitlivělost dýchacích cest způsobenou antigenem
Během srovnávací studie (bez podávání přípravků) se citlivost dýchacích cest zvýší více než pětkrát. Podávání R121D/Y124D IL-4 muteinu (500 pg/kg, b.i.d.) výrazně inhibuje zvýšení přecitlivělosti dýchacích cest vůči inhalovanému metacholinu. Během druhého srovnávacího pokusu se citlivost vůči inhalovanému metacholinu opět zvýší více jak pětkrát.
V další sérii studií podávání dexametazonu (200 pg/kg) výrazně inhibuje zvýšení citlivosti dýchacích cest k inhalovanému metacholinu způsobené antigenem.
-8CZ 283467 B6
Diskuze
Některé charakteristiky astmatických dýchacích cest se vyznačují přítomností zánětů dýchacích cest, poškozením epitelu dýchacích cest a přecitlivělostí dýchacích cest. Přecitlivělost dýchacích 5 cest je důležitou složkou patologie astmatu a může se definovat jako nepřiměřené stažení bronchů v důsledku reakce na počet inhalovaných látek ve srovnání s reakcí normálních subjektů. Přestože přesný patologický mechanismus (mechanismy) zůstává neznámý, přecitlivělost dýchacích cest se považuje za důsledek chronického zánětu dýchacích cest a jeho zhoubného vlivu na dýchací cesty.
Výsledky studie s R121D/Y124D IL-4 muteinu ukazují, že podávání inhibuje jak záněty dýchacích cest, vyvolané antigenem, tak i přecitlivělost dýchacích cest. Podle výsledků se dá předpokládat, že R121D/Y124D IL-4 mutein by mohl být pro pacienty trpící astmatem a alergií přínosný.
Claims (14)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Mutantní hIL-4 protein, který má aminokyselinovou sekvenci divokého typu hIL-4 proteinu, ale kde jedna až tři aminokyseliny, vyskytující se vněm v polohách 121, 124 nebo 125 je nahrazena jinou přirozenou aminokyselinou, nebo je aminokyselinová sekvence ukončena25 v jedné z těchto poloh, s výjimkou muteinu kde je tyrosin v poloze 124 nahrazen kyselinou asparagovou.
- 2. Mutantní hIL-4 protein podle nároku 1, kde uvedený mutantní hIL-4 protein má aminokyselinovou sekvenci divokého typu hIL-4 proteinu, ale kde aminokyselina tyrosin, která30 se přirozeně vyskytuje v poloze 124 je nahrazena jinou přirozenou aminokyselinou s výjimkou kyseliny asparagové.
- 3. Mutantní hIL-
- 4 protein podle nároku 2, kde uvedený tyrosin je nahrazen glycinem.35 4. Mutantní hIL-4 protein podle nároku 1, kde uvedený mutantní hIL-4 protein má aminokyselinovou sekvenci divokého typu hIL-4 proteinu, ale kde aminokyselina arginin, která se přirozeně vyskytuje v poloze 121 je nahrazena jinou přirozenou aminokyselinou.
- 5. Mutantní hIL-4 protein podle nároku 4, kde uvedený arginin je nahrazen kyselinou 40 asparagovou.
- 6. Mutantní hIL-4 protein podle nároku 1, kde uvedený mutantní hIL-4 protein má aminokyselinovou sekvenci divokého typu hIL-4 proteinu, ale kde aminokyselina serin, která se přirozeně vyskytuje v poloze 125, je nahrazena jinou přirozenou aminokyselinou.
- 7. Mutantní hIL-4 protein podle nároku 6, kde uvedený serin je nahrazen kyselinou asparagovou.-9CZ 283467 B6
- 8. Terapeutické činidlo pro ošetření alergických procesů vyznačující se tím, že obsahujea) mutantní hIL-4 protein, který má aminokyselinovou sekvenci divokého typu hIL-4 proteinu, ale kde jedna až tři aminokyseliny, vyskytující se v polohách 121, 124 nebo 125 je nahrazena jinou přirozenou aminokyselinou, nebo je aminokyselinová sekvence ukončena v jedné z těchto poloh ab) fyziologicky přijatelný nosič.
- 9. Terapeutické činidlo podle nároku 8, vyznačující se tím, že uvedený mutantní hIL-4 protein má aminokyselinovou sekvenci divokého typu hIL-4 proteinu, ale kde aminokyselina tyrosin, která se přirozeně vyskytuje v poloze 124, je nahrazena jinou přirozenou aminokyselinou.
- 10. Terapeutické činidlo podle nároku 9, vyznačující se tím, že uvedený tyrosin je nahrazen aminokyselinou vybranou ze skupiny, zahrnující kyselinu asparagovou a glycin.
- 11. Terapeutické činidlo podle nároku 8, vyznačující se tím, že uvedený mutantní hIL-4 protein má aminokyselinovou sekvenci divokého typu hIL-4 proteinu, ale kde aminokyselina arginin, která se objevuje přirozeně v poloze 121 je nahrazena jinou přirozenou aminokyselinou.
- 12. Terapeutické činidlo podle nároku 11, vyznačující se tím, že uvedený arginin je nahrazen kyselinou asparagovou.
- 13. Terapeutické činidlo podle nároku 8, vyznačující se tím, že uvedený mutantní hIL-4 protein má aminokyselinovou sekvenci divokého typu hIL-4 proteinu, ale kde aminokyselina serin, která se přirozeně objevuje v poloze 125 je nahrazena jinou přirozenou aminokyselinou.
- 14. Terapeutické činidlo podle nároku 13, vyznačující se tím, že uvedený serin je nahrazen kyselinou asparagovou.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4137333A DE4137333A1 (de) | 1991-11-13 | 1991-11-13 | Therapeutische mittel, die antagonisten oder partielle agonisten des humanen interleukin 4 sind oder diese enthalten, hil-4-mutantenproteine sowie vefahren zu deren herstellung |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ118594A3 CZ118594A3 (en) | 1994-12-15 |
| CZ283467B6 true CZ283467B6 (cs) | 1998-04-15 |
Family
ID=6444719
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ941185A CZ283467B6 (cs) | 1991-11-13 | 1992-11-13 | Lidské IL-4 mutantní proteiny |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5723118A (cs) |
| EP (1) | EP0613499B2 (cs) |
| JP (2) | JP3470970B2 (cs) |
| KR (1) | KR100276410B1 (cs) |
| AT (1) | ATE163196T1 (cs) |
| AU (1) | AU671960B2 (cs) |
| CA (1) | CA2123315C (cs) |
| CZ (1) | CZ283467B6 (cs) |
| DE (2) | DE4137333A1 (cs) |
| DK (1) | DK0613499T4 (cs) |
| ES (1) | ES2112340T5 (cs) |
| GR (1) | GR3026600T3 (cs) |
| HU (1) | HU217326B (cs) |
| NO (1) | NO312707B1 (cs) |
| SK (1) | SK280114B6 (cs) |
| WO (1) | WO1993010235A1 (cs) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4423131A1 (de) * | 1994-07-01 | 1996-01-04 | Bayer Ag | Neue hIL-4-Mutantenproteine als Antagonisten oder partielle Agonisten des humanen Interleukin 4 |
| HUT76369A (en) * | 1994-07-29 | 1997-08-28 | Smithkline Beecham Corp | Novel soluble protein compounds |
| GB9415379D0 (en) * | 1994-07-29 | 1994-09-21 | Smithkline Beecham Plc | Novel compounds |
| RU2235728C2 (ru) * | 1996-06-14 | 2004-09-10 | Байер Корпорэйшн | Мутеин человеческого il-4, полинуклеотидная молекула, вектор, линия sf9, трансформированная вектором, способ выбора мутеина, фармацевтическая композиция для активирования т-клеток, способ лечения пациента, страдающего заболеванием, поддающимся лечению il-4 |
| US5986059A (en) * | 1996-06-14 | 1999-11-16 | Bayer Corporation | T-cell selective interleukin-4 agonists |
| US6335426B1 (en) | 1996-06-14 | 2002-01-01 | Bayer Corporation | T-cell selective interleukin-4 agonists |
| MY124565A (en) * | 1996-07-19 | 2006-06-30 | Bayer Corp | High-affinity interleukin-4-muteins |
| US6180108B1 (en) * | 1998-12-10 | 2001-01-30 | Bayer Corporation | Vectors having terminal repeat sequence of Epstein-Barr virus |
| DE10022258A1 (de) | 2000-05-08 | 2001-11-15 | Bayer Ag | Reinigung von Proteineinschlusskörpern durch Querstrom-Mikrofiltration |
| WO2001092340A2 (en) | 2000-05-26 | 2001-12-06 | Immunex Corporation | Use of interleukin-4 antagonists and compositions thereof |
| GB0105360D0 (en) * | 2001-03-03 | 2001-04-18 | Glaxo Group Ltd | Chimaeric immunogens |
| EP1314739A1 (en) | 2001-11-22 | 2003-05-28 | Bayer Ag | Process for renaturation of recombinant, disulfide containing proteins at high protein concentrations in the presence of amines |
| EP1382614A1 (en) * | 2002-07-15 | 2004-01-21 | Bayer HealthCare AG | Process for the purification of interleukin-4 and its muteins |
| US7635754B2 (en) * | 2004-09-22 | 2009-12-22 | Aerovance, Inc. | Interleukin-9 and interleukin-4 chimeric antagonist muteins and methods of using same |
| US20070009479A1 (en) * | 2005-06-17 | 2007-01-11 | Aerovance, Inc. | Methods for treating dermatitis using mutant human IL-4 compositions |
| EP2041576B1 (en) * | 2006-06-21 | 2011-08-10 | Apogenix GmbH | Differential cytokine expression in human cancer |
| AU2007271349A1 (en) * | 2006-07-06 | 2008-01-10 | Apogenix Gmbh | Human IL-4 muteins in combination with chemotherapeutics or pro-apoptotic agents in cancer therapy |
| EP2596802A1 (en) | 2011-11-23 | 2013-05-29 | PLS-Design GmbH | Pharmaceutical composition for treatment of allergic reactions |
| EP2674168A1 (en) | 2012-06-14 | 2013-12-18 | PLS-Design GmbH | Modulation of effector T cell responses by local depletion of complement component C3 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5017691A (en) * | 1986-07-03 | 1991-05-21 | Schering Corporation | Mammalian interleukin-4 |
| US5041381A (en) * | 1986-07-03 | 1991-08-20 | Schering Corporation | Monoclonal antibodies against human interleukin-4 and hybridomas producing the same |
| AU629536B2 (en) * | 1988-02-02 | 1992-10-08 | Schering Biotech Corporation | Method of reducing immunoglobulin e responses |
| US5188827A (en) * | 1989-12-18 | 1993-02-23 | Schering Corporation | Use of interleukin-4- for lowering blood-cholesterol levels |
-
1991
- 1991-11-13 DE DE4137333A patent/DE4137333A1/de not_active Withdrawn
-
1992
- 1992-11-13 DK DK92923502T patent/DK0613499T4/da active
- 1992-11-13 KR KR1019940701592A patent/KR100276410B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1992-11-13 WO PCT/EP1992/002614 patent/WO1993010235A1/de not_active Ceased
- 1992-11-13 HU HU9401369A patent/HU217326B/hu unknown
- 1992-11-13 JP JP50897393A patent/JP3470970B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1992-11-13 AU AU29282/92A patent/AU671960B2/en not_active Expired
- 1992-11-13 CA CA002123315A patent/CA2123315C/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-11-13 CZ CZ941185A patent/CZ283467B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1992-11-13 SK SK554-94A patent/SK280114B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1992-11-13 EP EP92923502A patent/EP0613499B2/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-11-13 ES ES92923502T patent/ES2112340T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-11-13 US US08/232,289 patent/US5723118A/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-11-13 AT AT92923502T patent/ATE163196T1/de active
- 1992-11-13 DE DE59209196T patent/DE59209196D1/de not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-05-06 NO NO19941681A patent/NO312707B1/no not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-04-10 GR GR980400796T patent/GR3026600T3/el unknown
-
2002
- 2002-09-30 JP JP2002287074A patent/JP2003174894A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO941681L (no) | 1994-05-06 |
| HUT66826A (en) | 1995-01-30 |
| DK0613499T4 (da) | 2005-04-18 |
| NO941681D0 (no) | 1994-05-06 |
| DK0613499T3 (da) | 1998-09-23 |
| AU671960B2 (en) | 1996-09-19 |
| NO312707B1 (no) | 2002-06-24 |
| CA2123315A1 (en) | 1993-05-27 |
| ES2112340T3 (es) | 1998-04-01 |
| JP2003174894A (ja) | 2003-06-24 |
| CA2123315C (en) | 2003-06-17 |
| KR100276410B1 (ko) | 2000-12-15 |
| ATE163196T1 (de) | 1998-02-15 |
| AU2928292A (en) | 1993-06-15 |
| SK55494A3 (en) | 1994-12-07 |
| HU9401369D0 (en) | 1994-08-29 |
| ES2112340T5 (es) | 2005-10-16 |
| DE59209196D1 (de) | 1998-03-19 |
| EP0613499A1 (de) | 1994-09-07 |
| EP0613499B2 (de) | 2005-03-30 |
| WO1993010235A1 (de) | 1993-05-27 |
| HU217326B (hu) | 1999-12-28 |
| SK280114B6 (sk) | 1999-08-06 |
| DE4137333A1 (de) | 1993-05-19 |
| EP0613499B1 (de) | 1998-02-11 |
| CZ118594A3 (en) | 1994-12-15 |
| GR3026600T3 (en) | 1998-07-31 |
| JP3470970B2 (ja) | 2003-11-25 |
| US5723118A (en) | 1998-03-03 |
| JPH07501522A (ja) | 1995-02-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ackerman et al. | Detection of cytokines and their cell sources in bronchial biopsy specimens from asthmatic patients: relationship to atopic status, symptoms, and level of airway hyperresponsiveness | |
| Mølvig et al. | Endotoxin‐stimulated human monocyte secretion of interleukin 1, tumour necrosis factor alpha, and prostaglandin E2 shows stable interindividual differences | |
| Lammers et al. | Identification of a novel immunomodulatory gliadin peptide that causes interleukin‐8 release in a chemokine receptor CXCR3‐dependent manner only in patients with coeliac disease | |
| Taktak et al. | Assay of pyrogens by interleukin‐6 release from monocytic cell lines | |
| Müller et al. | 5-hydroxytryptamine modulates migration, cytokine and chemokine release and T-cell priming capacity of dendritic cells in vitro and in vivo | |
| Holgate et al. | Release of RANTES, MIP-1 α, and MCP-1 into asthmatic airways following endobronchial allergen challenge | |
| Rougier et al. | Human complement factor H deficiency associated with hemolytic uremic syndrome. | |
| Giri et al. | Elevated levels of shed type II IL-1 receptor in sepsis. Potential role for type II receptor in regulation of IL-1 responses. | |
| Nardelli et al. | Regulatory effect of IFN-κ, a novel type I IFN, on cytokine production by cells of the innate immune system | |
| US8075886B2 (en) | Method of treatment using an anti-IL-B50 antibody | |
| Michel et al. | Healthy subjects express differences in clinical responses to inhaled lipopolysaccharide that are related with inflammation and with atopy | |
| Stepaniak et al. | Production and in vitro characterization of recombinant chicken interleukin-2 | |
| SK280114B6 (sk) | Mutantný hil-4 proteín a terapeutické činidlo túto | |
| Virchow Jr et al. | CD14 expression and soluble CD14 after segmental allergen provocation in atopic asthma | |
| US20090041787A1 (en) | Chemokine receptor antagonists as therapeutic agents | |
| JP3119483B2 (ja) | 喘息の処置における細胞間付着分子とその結合性リガンド | |
| TWI363091B (en) | Uses of mammalian cytokine; related reagents | |
| JPH10185899A (ja) | 炎症性サイトカインの発生及び／または活性を刺激する薬品の能力を試験する方法 | |
| NZ537331A (en) | Diagnostics methods by determining T cell response to a protein and its epitope | |
| JP4411073B2 (ja) | ホルミルペプチドレセプター様１レセプターに対するリガンドとして有用な組成物およびその使用法 | |
| Foucras et al. | Alloantibodies against MHC class I: a novel mechanism of neonatal pancytopenia linked to vaccination | |
| JP2003533538A (ja) | 新規ハチ毒液ポリペプチドおよびその使用の方法 | |
| Mándi et al. | Cytokine production and antibodies against heat shock protein 60 in cardiomyopathies of different origins | |
| EP4046658A1 (en) | Application of non-igf1r-binding substance in prevention and/or treatment of inflammatory diseases | |
| US20020137107A1 (en) | Method for identifying agents which modulate chemokine "MEC"-induced functions of CCR3 and/or CCR10 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20121113 |