CZ284861B6 - Složená bílkovina a rekombinantní molekula DNA - Google Patents

Abstract

Složená bíkovina, tvořená první doménou, sestávající z polypeptidu se sekvencí aminokyselin alespoň jedné z bílkovin Epi B nebo Epi C nebo Epi D nebo Epi P nebo Epi Q z obr. 9 a druhou doménou, tvořenou pomocnou bílkovinou. Součást řešení tvoří rovněž rekombinantní molekula DNA, obsahující kódovou sekvenci pro složenou bílkovinu.ŕ

Description

Složená bílkovina a rekombinantní molekula DNA

Oblast techniky

Vynález se týká složené bílkoviny, obsahující část aminokyselinové sekvence epiderminu a druhou bílkovinu, která může usnadnit sekreci nebo čištění složené bílkoviny. Vynález se rovněž týká příslušné rekombinantní molekuly DNA.

Dosavadní stav techniky

Některé polypeptidové protilátky, například nisin, subtilin, duramycin, cinnamycin, ancovenin, Ro 09-0198 a epidermin obsahují dehydroaminokyseliny a lanthioninové můstky. Tyto polypeptidy jsou produkovány různými kmeny mikroorganismů. Například nisin je možno získat kultivací kmenů Streptococcus lactis a subtilin kultivací Bacillus subtilis.

Genetický podklad pro biosyntézu těchto antibiotik až dosud nebyl osvětlen. Není tedy například známo, zda k biosyntéze těchto antibiotik a zvláště ke tvorbě neobvyklých aminokyselin v těchto látkách dochází přes ribosomální syntézu nebo přes multienzymatické komplexy.

Mimoto až dosud není známo, zda prekurzorové bílkoviny takových antibiotik jsou zakódovány ve strukturních genech nebo zda běží o degradační produkty bílkovin s větší molekulou.

V průběhu studií, prováděných k průkazu strukturního genu epiderminu bylo neočekávaně prokázáno, že pro svrchu uvedená antibiotika, zvláště pak pro epidermin, existují zcela určité strukturální geny a že ke zpracování polypeptidového prekursoru dochází působením enzymatického komplexu, který vyvolá tvorbu zbytků dehydroaminokyselin a/nebo thioéterových můstků.

Mimoto se uvedený multienzymatický komplex může účastnit také sekrece bílkoviny buněčnou membránou do supematantu kultury a zpracování prepolypeptidu. V této souvislosti může být taková účinnost spojena se signálním řetězcem prepolypeptidu, tak jako tomu je například v případě řetězce -30 až -1 preepiderminu, jak bude dále popsáno.

Podstata vynálezu

Podstata vynálezu tvoří složená bílkovina, tvořená první doménou, sestávající z polypeptidu se sekvencí aminokyselin alespoň jedné z bílkovin Epi B nebo Epi C nebo Epi D nebo Epi P nebo Epi Q z obr. 9 a druhou doménou, tvořenou pomocnou bílkovinou. Podstatu vynálezu tvoří rovněž rekombinantní molekula DNA, obsahující kódovou sekvenci pro složenou bílkovinu.

Ve výhodném provedení usnadňuje druhá doména sekreci složené bílkoviny z hostitele nebo její čištění. Výhodnou druhou doménou je bílkovina, schopná vázat maltózu z E. coli. Mezi první a druhou doménou je s výhodou uloženo místo štěpení proteázou.

Popis výkresů

Na obr. 1 je znázorněn nukleotidový řetězec strukturního genu epiderminu (epi A) a odvozený řetězec aminokyselin preepiderminu. Shine-Dalgamův řetězec je uzavřen do obdélníku a místo proteolytického štěpení, v němž je propeptid zpracováván je označeno šipkou. Opakování s obrá

-1 CZ 284861 B6 ceným řetězcem jsou podtržena a potenciální stop kodony jsou označeny jako an (amber) a oc (ochre).

Na obr. 2A je znázorněna předpověď struktury preepiderminu při použití Hyronova programu, v jednotlivých úsecích je znázorněna: a) flexibilita; b) hydropathie; c) hydrofilnost; d) sklon k obrácení; e) beta-struktura a f) tvorba alfahelixu.

Na obr. 2B je znázorněna struktura helixu pro preepidermin, z níž je zřejmé, že N-terminální zakončení může vytvářet v příslušném prostředí amphofilní alfa-helikální útvar.

Na obr. 3 je znázorněna předpokládaná tvorba epiderminu. Polypeptid po translaci (preepidermin) je tvořen 52 zbytky aminokyselin. Předpověď struktury uvádí částečně alfa-helikální N-terminální zakončení, v němž zbytky -30 až -10 mohou tvořit amphifilní alfa-helikální útvar. K odštěpení vody dochází v místě označených zbytků Ser a Thr (a). S výjimkou zbytku Thr⁺¹⁴ je odštěpení vody následováno tvorbou sulfidového kruhu (b) a na C-terminálním zakončení dekarboxylací (c) a tvorbou dvojné vazby (d) za vzniku proepiderminu. Za struktury preepiderminu pak vzniká proteolytickým štěpením epidermin.

Na obr. 4 je znázorněna struktura epiderminu. Kruhové struktury jsou označeny A, B, C, D a E. Jsou vyznačeny také struktury mesolanthionu a threo-methyllanthionu.

Na obr. 5 jsou znázorněny příklady neobvyklých aminokyselin, které je možno nalézt v lanthionových antibioticích a které se mohou vytvořit v peptidových produktech při použití způsobu podle vynálezu.

Na obr. 6 je schematicky znázorněn způsob výroby plasmidu pCUI zplasmidu pCLPIOO a plasmidu pCU18.

Na obr. 7 je znázorněna eluce izolovaného živného prostředí, připraveného způsobem podle příkladu 2.

Na obr. 7B je znázorněna eluce standardu, obsahujícího gallidermin. Gallidermin se vymývá v době 7,54 minut.

Obr. 8 uvádí genetickou analýzu episomu pTů32 plasmidu pTíi32 Staphylococcus epidermis, včetně

8A: mapa restrikčních míst episomu pTů32 a

8B: mapa restrikčních míst fragmentu BglII o 13,5 kb zpTů32. Vyplněná šipka odpovídá strukturnímu genu epiA. Otevřená šipka představuje čtecí rámec epiB, C, D, P a Q.

8C: Southemova hybridizace plu32 po rozštěpení různými restrikčními enzymy (EcoRI, EcoRV, BglIII, Sphl) při použití oligonukleotidu (15-meru), specifického pro epiA s řetězcem 5’CACATCCAGGAGTAC 3’.

Na obr. 9 je znázorněn nukleotidový řetězec BglII/HalI plasmidu pTů32, obsahující čtecí rámce epiA, B, C, d, P, Q, Y’ a Y” a odvozené řetězce aminokyselin odpovídajících bílkovin. Řetězce S/D a terminační struktury jsou označeny čarou nad řetězcem. IR znamená obrácené opakování. Počátky otevřených čtecích rámců epiY, epiA, epiB, epiC, epiD, epiQ a epiP jsou označeny velkými písmeny. N-terminální aminokyselina (jejich zbytky, které jsou pravděpodobnými počátky translace) jsou uvedeny v obdélnících.

Na obr. 10 jsou uvedeny výsledky analyzy Northem blot pro epiA (10A) a epiB (10B) po expresi v S. epidermidis, celková RNA byla dělena na 1,2% agarosovém gelu (40 mikrogramů, dráhy 1, 3 a 5 nebo 20 mikrogramů, dráhy 2, 4 a 6), hybridizace byla prováděna při použití antimediá

-2CZ 284861 B6 torové sondy RNA (SP6 transkript, filtry byly promyty za zvyšujícího se omezení podmínek: dráha 1 a 2:lx SSC, 0,1% SDS, doba exposice 4 h, dráhy 3 a 4 : 0,5 x SSC, 0,1% SDS, doba exposice 16 h, dráhy 5 a 6: 0,1 x SSC, 0,1% SDS, doba exposice 3 dny). Polohy 235 a 165 RNA byly užity jako standard pro délku řetězce.

Na obr. 11 je znázorněna homologie řetězců mezi EpiP a různými proteázami šeřinu na účinných místech: SUBSI, prekursor subtilisinu 1168 zB. subtilis (Terzaghi a další, Appl. Microbiol. 29:807-813, 1975), hlavní intracelulámí proteáza šeřinu z B. subtilis (Maniatis a další, Molecular cloning, A Laboratory Manual, 2. vyd. Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1990, SUMYTV, thermitáza Z Thermoactinomyces vulgaris (Stáhl a další, J. Bacteriol. 158:411-418, 1984). Silně konservované zbytky asparaginu (aps), histidinu (his) a šeřinu (ser) jsou označeny hvězdičkami. Podobné zbytky aminokyselin jsou označeny puntíkem a totožné zbytky aminokyselin dvěma puntíky nad sebou.

Na obr. 12 jsou znázorněny homologie řetězce mezi epiQ a pHoB (Makino a další, J. Mol. Biol. 190:37-44, 1986). Podobné zbytky aminokyselin jsou označeny puntíkem a totožné zbytky dvěma puntíky nad sebou.

Na obr. 13 je znázorněna eluce epiderminu, produkovaného S. camosus TM 300 při HPLC.

13A: eluce standardu epiderminu, doba 6,75 minut, při níž epidermin je vymyt, je označena šipkou.

13B: eluce epiderminu, izolovaného z filtrátu kultury S. camosus TM300 pTepil4, doba 6,75 minut je opět označena šipkou. Filtráty kultury byly adsorbovány na XAD 1180, keluci byl užit methanol, frakce byly koncentrovány odpařováním.

13C: eluce filtrátu kultury netransformovaného S. camosus TM300, zpracování bylo stejné jako na obr. 13B. Plná čára označuje oblast eluce epiderminu.

Na obr. 14 je znázorněna konstrukce pT181mcs. Fragment PvuII³⁰⁹ - PvuIII⁶³¹ plasmidu pUC19, část lacZ a místo pro mnohonásobné klonování (mcs) byly uloženy do jediného místa působení Ndel vpre oblasti pT181 (Gennaro a další, J. Bactoriol. 169:2601-2610, 1987, Kahn a další, Plasmid 10: 251-259, 1983 vazbou zarovnaných konců. Uložení lacZ je v opačné orientaci vzhledem k pre. Plná část označuje přerušené konce pre, prázdná část vložený fragment pUC19.

Na obr. 15 je znázorněna konstrukce plasmidu pCUl. Plasmid pCLPIOO je derivát plasmidu pC194 (Horinouchi a další, J. Bacteriol. 150: 815-825, 1982), který obsahuje jediné místo působení Pstl, které vzniklo otevřením pC194 v místě HindlII s následnou změnou zakončení působením Bal31 (přibližně 950 bp) a včleněním vazného řetězce Pstl s vazbou zarovnaných konců. Plasmid pCUl byl pak vytvořen navázáním pCPLIOO a pUC19 Vieira a další, Gene 19: 259-268, 1982) přes jediná místa působení enzymů Pstl a Ndel. Místo pro mnohonásobné klonování (mcs) v přední části lacZ bylo užito ke klonování různých fragmentů s obsahem epi genu. K aplikaci tohoto vektoru dochází jak u čeledi Staphylococcus, tak u E. coli.

Obr. 16 znázorňuje:

A) vznik plasmidu pTepil4 klonováním fragmentu BglII o 14 kb plasmidu pTú32 v pT181mcs. Tento fragment obsahuje úplnou genetickou informaci, nutnou k produkci epiderminu v S. camosus. Znázorněné úseky ORF a směry jejich transkripce, označené šipkami jsou odvozeny od řetězce DNA. Strukturní gen epiA je znázorněn černou šipkou.

B) různé fragmenty pTepil4 DNA, subklonované vpT181mcs (pT...) nebo pCUl pCU...). K doplnění epi mutant S. epidermidis byly užity odpovídající plasmidy. Je znázorněna úplná část ORF, přítomná v plasmidu.

-3CZ 284861 B6

Na obr. 17 je znázorněna konstrukce pPS4epiA a pPA4epiB. Plasmid pPS4 je derivát pLipPSl (Liebl a další, Ml. Gen. Genet. 204: 166-173, 1986). Jediné místo působení enzymu BamHI bylo uloženo za silný promotor z čeledi Staphylococcus. Klonování genů v místě BamHI pod řízením promotoru ORF2 obvykle vede k dobré expresi u této čeledi. Usek epiA byl amlifikován pomocí PCR a obsahoval části řetězce v blízkosti místa BamHI. Do místa BamHI byl uložen fragment BstNI o 3,2 kb, obsahující epiB při použití vazby zarovnaných konců. Příslušné mutanty EMS byly komplementovány pouze v případě, že epiA a epiB byly pod řízením promotoru ORF2.

Lip = gen pro lipázu, cat = gen pro chloramfenicolacetyltransferázu, ORF2 = specificky zkrácený ORF S: camosus.

Na obr. 18 je znázorněna komplementace produkce epiderminu u S. camosus (pTepiABCDQ) při použití lemovacích řetězců DNA. K subklonování fragmentů byl použit kompatibilní plasmid.

Popis výhodných provedení

V obecnějším smyslu se vynález týká bakteriálního hostitele, nesoucího plasmid, s kódem pro polypeptid, který hostitelem obvykle není produkován, přičemž v průběhu kultivace hostitel produkuje multienzymatický komplex, jehož působením dochází k produktu polypeptidu, obsahujícího alespoň jednu dehydroaminokyselinu a/nebo jeden lanthioninový můstek, přičemž běží o polypeptid pro hostitele cizorodý.

Vhodným multienzymatickým komplexem je takový komplex, který je schopen uskutečnit alespoň jednu z následujících operací: odštěpení vody a/nebo tvorbu sulfidových můstků. Může rovněž provádět dekartoxylaci a tvorbu dvojných vazeb.

Vhodným hostitelem k provádění způsobu podle vynálezu je hostitel, který bez modifikace svého genetického materiálu je schopen produkovat polypeptidy, obsahující zbytky dehydroaminokyselin a/nebo lanthioninové můstky a/nebo methyllanthioninové můstky. Příkladem takových hostitelů mohou být mikroorganismy Streptococcus lactis, Bacillus subtilis, Streptomyces cinnamoneus, Streptomyces sp., Streptoverticullum greseoverticullum, Stahylococcus epidermidis, Staphylococcus epidermin kmen 5, Staphylococcus gallinarum a jeho mutantní kmeny, například mutantní kmen S. epidermin DSM 3095, který je schopen produkovat epidermin.

Jako zvláště zajímavé kmeny v tomto smyslu je možno uvést Staphylococcus gallinarum (F16/P57) Tu 3928, který byl uložen ve sbírce Deutsche Sammlung von Microorganismen podle budapešťské úmluvy 18. května 1988 a pod číslem uložení Tu 3928 v DSM 4616 a Staphylococcus epidermidis DSM 3095, který byl uložen rovněž ve sbírce Deutsche Sammlung von Mikroorganismen podle budapešťské úmluvy 26. října 1984.

Pro transformaci vhodného hostitele je možno příslušný plasmid modifikovat známými postupy genetického inženýrství.

S výhodou se postupuje tak, že se plasmid z hostitele, produkujícího polypeptid s obsahem alespoň jednoho zbytku dehydroaminokyselin a/nebo alespoň jednoho sulfidového můstku modifikuje tak, že dochází k náhradě genu, který je kódem pro prepolypeptid za vzniku plasmidu, který je kódem pro polypeptid, cizorodých pro hostitele, načež se tento plasmid užije pro transformaci hostitele.

K náhradě nebo modifikaci genu, který je kódem pro prepolypeptit je možno užít jakéhokoliv postupu nebo kombinace postupů.

-4CZ 284861 B6

Kódovou DNA pro prepolypeptid požadované sloučeniny je možno připravit chemickou syntézou. Vhodné chemické postupy byly popsány vAnal Biochem. 121, 365, 1982. Známé postupy dovolují přípravu polynukleotidů například až do délky řetězce 60 až 100 bází.

Vhodné chráněné nukleotidy je možno vázat fosfodiesterovou metodou podle publikace Agarwal a další, Angew. Chem. 84, 489, 1972, fosfotriesterovou metodou (Reesem, Tetrahedron 39, 3, 1983) nebo fosfittriesterovou metodou (Letsinger a další J. Am. Chem. Soc. 98, 3655, 1976) nebo také fosforamiditovou metodou. Metoda na pevné fázi umožňuje zjednodušení syntézy polynukleotidů.

DNA s dvojitým řetězcem je možno připravit enzymaticky z chemicky připravených krátkých, avšak překrývajících se segmentů řetězce.

Je například možno použít překrývající se polynukleotidové řetězce zobou částí dvojitého řetězce DNA, tyto řetězce jsou současně udržovány ve správné vzájemné poloze párováním bází a pak chemicky vázány působením enzymu DNA-ligázy podle publikace Khorana a další, J. Biol. Chem. 251,565, 1976:

Další možností je postup, při němž se vždy inkubuje jeden polynukleotidový řetězec ze dvou řetězců DNA s krátkým překrývajícím se segmentem v přítomnosti čtyř deoxynukleosidtrifosfátů a DNA-polymerázy, například DNA-polymerázy I, Klenowova fragmentu polymerázy I nebo T4 DNA-polymerázy nebo v přítomnosti reversní transktriptázy. Oba polynukleotidové řetězce jsou udržovány ve správné vzájemné poloze párováním bází a jsou doplněny působením enzymu požadovanými nukleotidy za vzniku úplného dvojitého řetězce DNA (Narany a další, Anal. Biochem. 121,365, 1982).

Další vhodný postup pro získání kódové DNA pro polypeptid spočívá v to, že se izoluje DNA z DNA genou tkáně nebo tkáňové kultury nebo mikroorganismy, buňky se rozruší například působením SDS nebo proteinázy K, popřípadě mechanicky a DNA se podrobí deproteinizaci opakovanou extrakcí fenolem.

RNA se s výhodou štěpí pomocí Rnázy. Získaná surová DNA se částečně rozštěpí vhodným restrikčním enzymem, například HAelII a Alul a fragmenty se izolují a množí ve vhodném fágu nebo cosmidu, například Charon 4A nebo EMBL-3 a pak se sleduje obsah požadovaných řetězců například s použitím radioaktivně značené sondy DNA.

Kódovou DNA pro požadovaný polypeptid je možno rovněž získat reversní transkripcí izolované mRNA v cDNA. Může jíž o výhodný postup v případě, že struktura DNA není známa. Při provádění tohoto postupu se DNA získává z DAN genomu v bance cDNA přes mRNA. Banka cDNA obsahuje genetickou informaci, která je komplementární k mRNA, izolované z buněk.

K získání banky cDNA se izoluje mRNA z buněk, u nichž dochází k expresi požadovaného základního (pokud možno nemodifikovaného) proteinu. Tato mRNA se pak převede na cDNA s dvojitým řetězcem.

Při přípravě mRNA se užijí standardní postupy, které jsou v oboru známy. Buněčná membrána se rozruší a buněčný obsah se uvolní, z tohoto materiálu se pak izoluje mRNA. Buněčná membrána se s výhodou rozruší fyzikálními postupy nebo působením smáčedel, například SDS, guanidinthiokyanátu, změnou koncentrace solí nebo homogenizací, s výhodou v mísícím zařízení, pak se mRNA izoluje standardními postupy, a to extrakcí fenolem, vysrážením pomocí ethanolu, odstředěním a chromatografíí, s výhodou kombinací několika metod. Odstředění se obvykle provádí při použití gradientu, například CsCl. Chromatografie se s výhodou provádí na sloupci, zejména oligo-dT.

-5CZ 284861 B6

Celková mRNA může být přímo převedena na Ds-cDNA známými postupy. S výhodou se mRNA, která je kódem pro požadovaný polypeptid dále obohatí při použití několika různých postupů, například elektroforézy, chromatografie a odstřeďování, s výhodou odstředěním při použití sacharózového gradientu.

Frakce s obsahem mRNA, která je kódem pro požadovaný polypeptid může být zjištěna různými postupy, například translací in vivo i in vitro s následnou detekcí relevantní aktivity nebo v případě, že nukleotidový řetězec je znám, hybridizací při použití oligonukleotidové sondy.

Použitý in vivo translační systém může být prokaryotický nebo eukaryotický systém. Výhodným systémem pro translaci in vivo je systém oocytů Xenopus laevis (Maniatis a další, Molecular Cloning, A. Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Vhodnými systémy in vitro jsou například pšeničný klíček a lysát retikulocytů králíka, běžně dodávané.

Z jakékoliv směs mRNA, odvozené od nefrakcionované nebo frakcionované mRNA je možno získat ds-cDNA známými postupy (s xýhodou obecnými postupy, které byly popsány ve svrchu uvedené publikaci Maniatise a dalších, dále Okayam a Berg, Moleular and Cell Biology, 2, 161170, 1982 a Heidecker, Nucleic Acid Research 11, 4891-4906, 1983. Obecně je možno uvést, že mRNA se nejprve převádí na ss-cDNA při použití reversní transkriptázy nebo DNA-polymerázy 20 I (Klenowův fragment). Pro zahájení syntézy ds-cDNA je možno použít dvou postupů. První postup sočívá ve tvorbě přirozené smyčky ss-cDAN, druhý v prodlužování ss-cDNA homopolymemím zakončením, například poly-dC nebo poly-dT.

Frakce mRNA, z níž odpovídající polypeptid má nejvyšší účinnost je transkribována do komple25 mentámí cDNA známým způsobem. Pak se smísí mRNA a oligo-AT jako primem, přidá se DTP jako výchozí materiál a syntéza hybridní molekuly cDNA-mRNA se provádí působením enzymu reversní transkriptázy. Molekuly RNA jsou degradovány přidáním Namoh. Přidá se DNA-polymeráza, s výhodou Klenowůr fragment DNA polymerázy 1 a směs se inkubuje při vhodné teplotě, s výhodou 12-15 °C. Pak se směs inkubuje snukleázou S1 a tak se získá ds-cDNA, odpovídající mRNA, která je kódem pro požadovaný polypeptid.

K dosažení amplifikace je možno získanou ds-cDNA po úpravě sestřihem uložit do vhodného vektoru, například do plasmidu pUC-KO a získaný hybridní vektor pak pomnožit při použití vhodného hostitele, například E. coli HB101. Reizolace hybridních vektorů a opětná izolace 35 cDNA z těchto vektorů pak umožní stanovení struktury kódové DNA pro požadovaný polypeptid.

Příprava hybridního vektoru

Hybridní vektor podle vynálezu je možno připravit tak, že se po úpravě sestřihem uloží kódová DNA pro polypeptid s požadovaným řetězcem do vhodného vektoru.

Vhodné vektory jsou vektory, které jsou nosiči integrované cizorové DNA a je možno je použít 45 k transformaci hostitelského mikroorganismu.

Vhodnými vektory jsou plasmidy, odvozené od mikroorganismů, které v netransformovaném stavu produkují polypeptidy s obsahem dehydroaminoskupin a/nebo sulfidových skupin. Vhodné vektory obsahují vloženou DNA v definované poloze.

Obecně mohou takové vektory obsahovat replikon a řídicí řetězec, tj. promotor, odvozený od hostitelské buňky nebo od jiné buňky, která je kompatibilní s hostitelskou buňkou, v níž jsou tyto části použity. Vektor obvykle obsahuje replikon a může obsahovat signální řetězce (značící geny), které umožňují fenotypovou selekci v transformované buňce. Vhodnými geny pro toto

-6CZ 284861 B6 použití jsou geny pro odolnost proti působení antibiotik nebo pro odolnost proti těžkým kovům nebo geny, které doplňují genetický defekt hostitele. Dalšími vhodnými řetězci, které mohou být ve vektoru obsaženy jsou zesilovací řetězce a aktivační řetězce.

Jedním z vhodných vektorů pro toto použití je plasmid pEpi32 o 54 kbp z kmene Staphylococcus epidermis DSM 3095. Tento plasmid, který bude dále podrobněji charakterizován, obsahuje gen epiA, který je kódem pro 52-prepeptid, kteiý je dále zpracováván na 21-peptidamid s antibiotickým účinkem. Vektor, obsahující cizorodou DNA je označován jako hybridní vektor.

Požadovaná DNA se po sestřihu uloží do vektoru obvyklými postupy.

Výchozí plasmid je například možno nejprve linearizovat působením vhodných restrikčních enzymů, například v případě plasmidu pEpi32 je možno použít enzymy HindlII, BamHI a EcoRI, pak se naváží zakončení d/G v přítomnosti dGTP a terminální deoxynukleotidyltransferázy. Uložená cDNA s dvojitým řetězcem se opatří zakončením dC v přítomnosti dCTP a terminální deoxynukleotidyltransferázy. Po vazbě cDNA a vektoru se získá hybridní vektor. Bakteriofágy, například lambda jsou velmi vhodné pro konstrukci genomových bank. Klonovací systém na bázi lambda byl popsán ve svrchu uvedené publikaci Maniatise a dalších. Vhodná DNA vektoru se úplně rozštěpí příslušným restrikčním enzymem a levá a pravá zakončení se oddělí od středních fragmentů odstředěním pří použití gradientu nebo elektroforézou na gelu. Další postup spočívá v tom, že se středové části řetězce odštěpí působením restrikčních enzymů, pro něž již pravý a levý fragment neobsahuje místo štěpení. Izolovanou DNA genomu je možno částečně rozštěpit na fragmenty o délce 13 až 20 kb. Pak se zakončení spojí s fragmenty cizorodé DNA, jejíž zakončení jsou kompatibilní s odštěpenými postranními řetězci.

Uložená DNA se pak reklonuje z původního vektoru, použitého pro počáteční klonování, do vhodného vektoru pro expresi. K tomuto účelu se použití vhodné restrikční enzymy, popřípadě v kombinaci s oxonukleony, čímž je možno získat požadované fragmenty DNA.

Uloženou DNA je pak možno subklonovat v místě pro vícenásobné klonování vhodného plasmidového vektoru, například je možno použít deriváty pC194, pTl 81 a pUBl 10 v restrikčním místě HindlII/BamHI/EcoRI.

Způsob podle vynálezu je tedy možno použít k získání derivátů známých peptidů a hormonů, v nichž je cysteinový zbytek v nemodifikovaném peptidu nahrazen aminokyselinami se sulfidovým můstkem a serin a thiamin jsou nahrazeny odpovídajícími zbytky dehydroaminokyselin.

Tyto fragmenty jsou integrovány do příslušného vektoru pro expresi při použití kohesivních zakončení přímo nebo po navázání příslušně chemicky synthetizovaných oligonukleotidových můstků. Pro modifikaci zakončení je možno užít například enzymy HindUI a BglII. Postup však není omezen na žádné specifické restrikční enzymy. Mezi vektorem pro expresi a uloženou DNA je možno vytvořit jakoukoliv požadovanou vazbu při použití vhodných restrikčních enzymů v kombinaci s chemicky synthetizovanými oligonukleotidy.

Je možno připravit také příslušné uložené DNA, které jsou kódem pro polypeptid s cílenou mutagenezí.

K indukci mutací uvedené DNA je možno použít celou řadou metod a tak získat požadované mutanty.

Jeden z možných postupů spočívá v tom, že se nejprve uloží fragment nativního nebo bazického genu s obsahem kódového řetězce pro oblast, která má být podrobena mutaci, do replikativní formy fágu, například fágu M13mp8 za vzniku M13mp8PA. Pak se synthetický oligonukleotid, komplementární k uloženému řetězci, avšak obsahující jeden nebo větší počet tripletů nukleo

-7 CZ 284861 B6 tidů, které jsou kódem pro aminokyselinu, která má být nahrazena, naváže na formu M13mp8A s jednoduchým řetězcem za vzniku oblasti s dvojitým řetězcem. Tato oblast slouží jako primem pro syntézu zbývající části komplementárního řetězce působením DNA polymerázy I. Po replikaci a identifikaci je možno mutovaný řetězec dále modifikovat nebo použít ke konstrukci vhodného vektoru pro expresi mutovaného polypeptidu.

V průběhu prací, prováděných na epiderminu byla připravena DNA sonda s kolísavým párováním bází, se vzorcem 5’-GTG(A)CAT(G/A)ATG(A)AAT(C)TT-3’, odvozená od vhodného pentapeptidového segmentu předpokládaného předběžného řetězce epiderminu LysPhelleCylThr. Tato sonda DNA byla hybridizována proti DNA plasmidu ze S. epidermis DSM 3095.

Restrikční analýza izolovaného plasmidu prokazuje sedm fragmentů DNA při použití EcoRI (16, 11, 10, 6,5, 5,5, 3,5 a 2,5 kbp) 9 fragmentů DNA při použití HindlII (17, 14, 10, 5,3, 2,8 1,8, 0,8, 0,6 a 0,5 kbp) a 5 fragmentů DNA při použití BAmHI (20, 19, 10, 3 a 1 kbp).

Fragment o 5,4 kbp po štěpení enzymem HindlII byl subklonován a podroben rehybridizaci, přičemž struktura genu epiA byla uložena do fragmentu o 2,2 kbp po štěpení enzymy EcoRI/BglII.

Jako hybridizační sonda byla užita směs 24 různých 14-merů. Tato sonda byla užita ve 30násobném přebytku jako primem při analýze řetězce způsobem podle publikace Novick a další Ann. N.Y. Acad. Aci 1982, 279-294 (1971), Southem, J. Molec. Biol. 98, 503-517, 1975 a Heinrich a další, Molecul. Gen Genet. 209, 563-569, 1987. Peptidový řetězec epiderminu dovolil identifikaci otevřeného čtecího rámce. Jediný kodon pro methionin se nachází v příslušné vzdálenosti od Shine-Dalgamova řetězce. Strukturní gen pro epidermin končí na stop kodonu TAA, preepidermin je tedy tvořen 52 aminokyselinami (obr. 1) a je zpracován na epidermin mezi zbytky aminokyselin Arg’¹ alle⁺¹. Je tedy zcela zřejmé, že preepidermin není degradačním produktem větší bílkoviny, nýbrž je zakódován v určitém strukturálním genu.

Kombinace předpovědí pro sekundární struktury (alfa, beta, apod.) flexibilita, hydropathie, hydrofilnost (obr. 2A) a šroubovicový závit byly provedeny při použití programu Hycon (obr. 2B). Vysoká pravděpodobnost alfa-helixu je předpovídána pro preepidermin -30 až -8, kdežto v případě C-terminální část 1 až 22, která odpovídá preepiderminu je vysoká pravděpodobnost otočení. Mimoto je z předpovědi zřejmé, že N-terminální zakončení -30 až -1 je vysoce hydrofílní, kdežto C-terminální část je lipifilnější- N-terminální část -30 až -8 je patrně stočena do amphofílního alfa-helixu.

N-terminální segment preepiderminu -30 až -1 neobsahuje žádné cysteinové zbytky, kdežto Cterminální segment 1-22 obsahuje čtyři cysterinové zbytky, které tvoří sulfidové můstky.

V řetězci -30 až -1 se nachází řada míst štěpení pro endoproteázy, zatímco i ve formě preepiderminu je řetězec 1 až 22 vysoce odolný proti proteolytické degradaci.

Úplné antibiotikum může být rozrušeno pouze trypsinem v místě Lys v poloze 13. Místo zpracování Arg’¹Ile^+I je hydrofílní a snadno přístupné vzhledem k ohybu, který je vytvořen zbytkem Pro’².

Různé enzymatické reakce, k nimž dochází při tvorbě antibiotik, například epiderminu zahrnují modifikace propolypeptidové části 1 až 22, štěpení N-terminálního propeptidového fragmentu -30 až -1 a sekreci výsledného antibiotika (obr. 3 a 4).

K enzymatickým modifikacím dochází před odštěpením prepeptidového fragmentu. Enzymatická modifikace zahrnuje odštěpení vody ze zbytků Ser a Thr v polohách 5, 16, 19 a 8,14 za vzniku dehydroalaninových a dehydrobutyrinových zbytků. Dochází rovněž k adici thiolových skupin zbytků Cys v polohách 2, 11,21 a 22 na dvojné vazby C=C, čímž vzniká meso-lathionin nebo

-8CZ 284861 B6 (2S, 3S, 6R)-3-methyllanthÍQninový můstek. Mimoto dochází při dekarboxylaci zbytku 22 a tvorbě dvojné vazby ke vzniku C-terminálního S—(2-aminovinyl)-D-cysteinu. K reakci C— terminálně uložených thiolových skupin cysteinu s N-terminálně uloženými dehydroaminokyselinami dochází s vysokou stereospecifičností u epiderminu, nisinu a subtilinu. Tomu odpovídá, že v průběhu modifikace těchto eliminačních a adiěních reakcí dochází k obrácení konfigurace na uhlíkovém atomu v poloze alfa na preepiderminových zbytcích L-Ser a L—Thr za vzniku D-konfigurace uhlíkových atomů v poloze alfa. Na druhé straně je konfigurace L na cysteinové části zachována.

Vytváří se také čtyři sulfidové kruhy, postupně na tomtéž katalytickém místě, které vzniká interakcí s N-terminálním amphofilním alfa.helixem. Pouze k dehydraci Thr⁺¹⁴ dochází bez přítomnosti cysteinového zbytku. Tato poloha (Lys⁺¹³Dhb⁺¹⁴) tvoří místo enzymatického štěpení, v němž dochází k inaktivaci antibiotika epiderminu působením trypsinu. Tvorbou sulfidových kruhů dochází k C-terminální rigiditě a ke zvýšení hydrofobnosti, což může příznivě ovlivnit interakci proepiderminu s lipidovou dvojvrstvou a indukovat translokaci.

Nakonec dochází k odštěpení hydrofilního alfa-helikálního N-terminálního zakončení -30 až -1 působením specifické proteázy na charakteristickém místě štěpení, jak již bylo uvedeno svrchu.

Při použití svrchu uvedeného postupu je možno modifikovat plasmidy, které obsahují kód pro lantibiotika buď mutací genového kódu pro odpovídající polypeptid, nebo náhradou tohoto genu genem, který je kódem pro odlišný polypeptid s následnou transformací působením hostitele na odlišného hostitele za předpokladu, že tento hostitel je v netransformované formě rovněž schopen exprese lantibiotika.

Obecně řečeno: v případě, že původní funkční gen je kódem pro předběžný řetězec, jak bylo svrchu uvedeno v případě epidermu, je možno zachovat řetězec DNA, který je kódem pro tento předběžný řetězec i v modifikovaném plasmidu. V tomto případě bude řetězec DNA pro nový, mutovaný propolypeptid uložen těsně za předběžným řetězcem DNA tak, jak tomu je v případě původního propolypeptidového řetězce.

Kultivaci bakteriálního hostitele podle vynálezu je možno uskutečnit za obvykle užívaných podmínek tak, jak byly popsány například v britské patentové přihlášce č. 8811760.1, podané 18. května 1988 a ve zveřejněné evropské patentové přihlášce č. 181 578. Čištění a izolace požadované bílkoviny se rovněž provádí způsobem podle svrchu uvedených patentových přihlášek pro epidermin a gallidermin s případnými modifikacemi pokud jde o použití adsorpčních činidel, iontoměničových pryskyřic a popřípadě HPLC.

Způsob podle vynálezu je možno vy užít pro získání nových sloučenin pro experimentální účely nebo ke tvorbě známých sloučenin nebo derivátů známých sloučenin v nových hostitelích. Je například možno použít plasmid, obsahující gen, který je kódem pro epidermin k transformaci Straptococcus lactis k získání epiderminu pomocí tohoto hostitele, nebo je možno gen pro gallidermin užít k náhradě genu pro propolypeptid epiderminu například v plasmidu pEpi32 a pak plasmid použít k transformaci Staphylococcus epidermis DSM 3095 k získání gelliderminu z tohoto hostitele. Obdobným způsobem je také možno připravit další biologicky účinné peptidové deriváty, obsahující zbytky dehydroaminokyselin a/nebo lanthioninové můstky a/nebo methyllanthioninové můstky, například deriváty hormonů jako jsou lidský insulin, oxytocin, vasopressin, peptidová antibiotika, inhibitory hormonů, jako inhibitor elastázy a fibrinolyticky účinné látky jako lidský tkáňový aktivátor plasminogenu. Takové deriváty si mohou podržet biologickou účinnost původní látky při vyšší stálosti a delší biologickém poločasu. V ideálním případě by měl kód DNA pro požadovaný propolypeptid obsahovat kodony pro cystein a serin a/nebo pro cystein a threonin pro tvorbu thioéterových můstků.

-9CZ 284861 B6

V případě poměrně krátkých řetězců polypeptidů by uvedené kodony měly být od sebe uloženy ve vzdálenosti ne více než šest kodonů včetně, ačkoliv v závislosti na sterickém uspořádání molekuly výsledného polypeptidů by zásadně mohly být zbytky uloženy dále od sebe.

Pokud jde o tvorbu dehydroaminokyselin, jsou tyto aminokyseliny obvykle odvozeny od šeřinu a threoninu, a proto kódové DNA pro požadované propolypeptidy budou zahrnovat kodony pro tyto aminokyseliny.

Z neobvyklých aminokyselin, které mohou být přítomny v polypeptidů, získaném způsobem podle vynálezu je možno uvést dehydroalanin, 2,3-dehydro-2-aminomáselnou kyselinu, mesolanthionin, (2S,3S,6R)-3-methyllanthionin, S-(2-(Z)-aminovinyl)D-cystein, lysinoalanin a kyselinu beta-hydroxyasparagovou. Struktura zbytků těchto kyselin je znázorněna obr. 5.

Bylo neočekávaně prokázáno, že multienzymatický komplex, který je zodpovědný za posttranslační modifikaci preepiderminu je uložen v plasmidu pTů2 o 54 kb ze Staphylococcus epidermis Tu 3298/DSM 3095.

Šest genů (ORF), zodpovědných za produkci epiderminu se označuje epiA, B, C, D, Q a P, tyto geny jsou uloženy v oblasti o 8 kb a bílkoviny, pro něž jsou tyto geny kódem se označují Epi A, B, C, D, Q a P; epi A je kódem pro preepidermin s délkou 52 zbytků aminokyselin. Jak bude dále podrobněji popsáno, epiB, C a D se účastní čtyř enzymatických modifíkačních reakcí, a to i) odštěpení vody působením serin/threonin dehydratázy, ii) adice síry působením lanthioninsynthetázy, iii) C-terminální dekarboxylace působením cysteindekarboxylázy a iv) tvorba dvojné vazby. Má se za to, že bílkovina EpiP je zodpovědná za odštěpení epiderminu od N-terminálního vedoucího řetězce peptidu vzhledem ke své překvapující homologii se základní oblastí serinproteáz (Koide a další, J. Bacteriol. 167: 110-116, 1986, Meloun a další, FEBS Lett. 183: 195-200, 1985, a Stáhl a další, J. Bacteriol. 158, 411-418, 1984), EpiQ je patrně bílkovina, která řídí biosyntézu epiderminu vzhledem ke své zřetelné homologii s genem phoB z E. coli (Makino a další, J. Mol. Biol., 190: 37-44, 1986), obě bílkoviny mají podobnou délku řetězce, 205 (epiQ) a 229 (phoB), pozorovaná homologie 24,2 % zasahuje 153 C-terminálních zbytků aminokyselin a obdobná je i hydrofilnost obou bílkovin.

V důsledku neočekávaného zjištění úplné genetické informace pro biosyntézu epiderminu a vzhledem k osvětlení genů pro bílkoviny epi B, C, D, Q a P je nyní možno získat izolovanou kódovou DNA pro tyto bílkoviny a zkonstruovat plasmidy, obsahující jeden nebo větší počet těchto genů, takže při kultivaci hostitele, obsahujícího takové plasmidy může docházet k expresi jedné z těchto bílkovin nebo předem určených kombinací těchto bílkovin a tyto bílkoviny je pak možno izolovat.

Podstatu vynálezu tedy tvoří rovněž řetězce DNA, které jsou kódovými řetězci pro bílkoviny EpiB nebo EpiC, EpiD, EpiP nebo EpiQ. Těmito řetězci mohou být izolované řetězce DNA s jednoduchým nebo dvojitým řetězcem, získané štěpením a izolací zpTů32 známým způsobem nebo získané chemickou syntézou nebo jakýmkoliv jiným obvyklým způsobem. DNA může rovněž být integrována v plasmidu, s výhodou v plasmidu pro expresi a pod řízením promotoru. Při použití těchto konstrukcí k transformaci vhodného hostitele, který se pak kultivuje dochází k expresi bílkovin EpiB, EpiC, EpiD, EpiP nebo EpiQ nebo kombinací těchto bílkovin, jejichž DNA byla uložena do plasmidu. Je také možno postupovat tak, že se na plasmid pTů32 působí vhodnými restrikčními endonukleázami k vyjmutí jednoho nebo druhého řetězce DNA, načež se po jakékoliv nezbytné úpravě volných zakončení rozštěpeného plasmidu řetězce opět naváží za vzniku modifikovaného plasmidu, obsahujícího řetězce DNA, které jsou kódovými řetězci pro některou z bílkovin epi B, C, D, P nebo Q.

Další možné provedení spočívá v tom, že se gen, který je kódem pro epidermin v plasmidu pTů32 nahradí řetězcem DNA, který je kódem pro předem určený řetězec aminokyselin a pak se

-10CZ 284861 B6 hostitel s modifikovaným plasmidem pěstuje, čímž dojde k expresi bílkoviny, odlišné od epiderminu.

Je tedy možné nahradit v plasmidu pTů32 řetězec, který je kódem pro epidermin řetězcem DNA, kteiý je kódovým řetězcem pro gallidermin, mutovaný epidermin, jiné lantibiotikum nebo jinou bílkovinu a výsledný plasmid užít k transformaci vhodného hostitele, přičemž může jít o hostitele, který za obvyklých podmínek není schopen produkovat lantibiotikum nebo některou z bílkovin Epi B, C, D, P nebo Q. Tento hostitel se pak pěstuje za podmínek, při nichž dochází k expresi nahrazeného řetězce DNA a genů epi B, C, D, P a Q za získání bílkoviny, kterou je gellidermin, mutovaný epidermin nebo jiná bílkovina, obsahující alespoň jeden strukturní znak lantibiotika.

Je také možno postupovat tak, že se geny, které jsou kódem pro bílkoviny Epi B, C, D, P nebo Q uloží do vhodného vektoru spolu s řetězcem DNA, který je kódem pro předem určený řetězec aminokyselin, přičemž kódové geny pro bílkoviny Epi a pro předem určený řetězec aminokyselin jsou operativně spojeny s vhodným funkčním promotore, výsledný plasmid se užije k transformaci vhodného hostitele, kterým může být hostitel, který za běžných podmínek není schopen produkce lantibiotika ani žádné bílkoviny ze skupiny Epi B, C, D, P nebo Q a hostitel se pak pěstuje za podmínek, při nichž dochází k expresi bílkoviny, odvozené od předem určeného řetězce aminokyselin, avšak se strukturními vlastnostmi lantibiotika, touto bílkovinou může být gallidermin, epidermin, mutovaný epidermin nebo jiná bílkovina.

Podstatu vynálezu tedy tvoří také řetězce DNA, schopné hydridizace, s výhodou za přísně vymezených podmínek, s řetězci DNA, které byly svrchu popsány a jsou kódem pro bílkoviny s účinností Epi B, C, D, P nebo Q. Za přísně vymezených hybridizačních podmínek dochází k selekci řetězců DNA s homologií vyšší než 85 % nebo s výhodou vyšší než 90 %. Analýza banky cDNA může být prováděna za přísně vymezených podmínek způsobem podle evropské patentové přihlášky č. 88 119 602.9 a podle publikace Kashima a další, Nátuře 313: 402-404, 1985. Řetězce DNA, které jsou za přísně vymezených podmínek schopny hybridizace se svrchu uvedenými řetězci DNA mohou například být alelové varianty nových řetězců DNA, které mohou být přirozeně přítomny v určitých mikroorganismech a jsou příbuzné novým řetězcům DNA, nebo mohou být odvozeny zjiných zdrojů. Obecné postupy při hybridizaci nukleových kyselin jsou popsány v publikaci Maniatis T. a další, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1982 a Haymes B.D. a další, Nucleic Acid Hybridization, a Practical Approach, IRE Press, Washington, DC, 1985. Bílkoviny EPI B, C, D, P a Q jsou cenné a zajímavé látky, jichž je možno využít k přípravě nových bílkovin a dalších látek se strukturními vlastnostmi podobnými lantibiotikům, jako jsou dehydroalanin, dehydrobutynin, meso-lanthionin, 3-methyllanthion a S-(2-aminovinyl)-D-cystein.

Získané látky mohou být užity jako izolované bílkoviny nebo jako chemická katalytická reakční činidla při výzkumu extracelulámího zpracování bílkovin působením enzymů.

Vynález se rovněž týká bílkovin Epi B, C, D, P a Q ve v podstatě čisté formě. Pod pojmem „v podstatě čistý“ se rozumí bílkovina, která je prostá nečistot, obvykle s ní spojených. Podstatnou čistotu je možno prokázat přítomností jediného pruhu při elektroforéze.

Polypeptidy podle vynálezu je možno izolovat a čistit ze svrchu popsaných rekombinantních molekul obvyklými postupy, například extrakcí, srážením, chromatografií, afinitní chromatografií, elektroforézou a podobně. Peptidy jsou s výhodou produkovány jako část složené bílkoviny, která mimoto obsahuje pomocnou bílkovinu. Tato pomocná bílkovina má usnadnit izolaci a čištění požadovaného polypeptidu. Pomocná bílkovina například obsahuje typické sekreční signály, bílkoviny pro vazbu maltózy z E. coli nebo bílkovinu A. Způsob výroby složené bílkoviny zahrnuje získání bílkoviny A, její čištění imunoafinitní chromatografií a její štěpení

-11 CZ 284861 B6 k uvolnění požadované bílkoviny, tak jak bylo popsáno například ve zveřejněné PCT patentové přihlášce č. WO 84/03103, 1984.

Nutnou podmínkou pro štěpení složené bílkoviny je přítomnost jediného místa štěpení které může být rozpoznáno a rozštěpeno vhodným prostředkem. Tímto místem štěpení může být určitý řetězec aminokyselin, rozpoznávaný chemickou látkou nebo enzymem a uložený mezi požadovanou bílkovinou a pomocnou bílkovinou. Tento specifický řetězec aminokyselin se však nesmí nacházet v požadované bílkovině nebo v pomocné bílkovině. Příkladem vhodných enzymů pro toto štěpení mohou být proteázy, například kolagenázy, schopné rozpoznávat řetězec aminokyselin NH₂-Pro-X-Gly-Pro-COOH, kde X znamená zbytek aminokyseliny, například leucinu, dále chymosin (renin), štěpící vazbu Met-Phe, kallikrein B, štěpící karboxylovou část Arg v řetězci X-Phe-Arg-Y, enterokináza, štěpící řetězec X-(Asp)„-Lys-Y, kde n = 2 až 4, přičemž ke štěpení dochází na karboxylové straně Lys, thrombin, štěpící specifickou arginylovou vazbu. Příkladem chemických látek, které je možno použít ke štěpení složených bílkovin mohou být bromkyan, který řetězec štěpí za zbytkem Met, hydroxylamin, štěpící vazbu Asn-Z, kde Z znamená Gly, Leu nebo Ala a kyselina mravenčí, která ve vysoké koncentraci přibližně 70 % specificky štěpí vazbu Asp-Pro.

Podle svrchu uvedeného návodu může každý odborník využít maximálně podstatu vynálezu. Dále uvedená specifická provedení jsou proto uváděna pouze k ilustrativním účelům a nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

1. Nadprodukce galliderminu

Fragment DNA, obsahující otevřený čtecí rámec galliderminu může být klonován ve Staphylococcus epidermidis DSM 3095, tj. v kmeni, produkujícím epidermin při použití plasmidu se středním počtem kopií, například pC194, pE194, pBUl 10, pT181 nebo pMK148 gallidermin. Při vzestupu množství genu obvykle dochází ke zvýšení produkce požadované látky, korelace však nemusí být lineární. Jako prostředek pro klonování je možno užít také deriváty plasmidů pC194 nebo pTl 81 s vysokým počtem kopií.

2. Výměna vedoucího řetězce

Vedoucí řetězec epiderminu, odpovídající aminokyselinám -1 až -30 se účastní sekrece epiderminu. Tento řetězec může být použit i pro sekreci jiných peptidů v S. epidermidis, například pro sekreci galliderminu.

Vedoucí řetězec DNA je možno učinit přenosným tak, že se uloží odpovídající vazné řetězce na začátek a konec tohoto řetězce. Tímto způsobem je možno izolovat vedoucí řetězec DNA s plasmidu ve velkém množství a uložit jej do odpovídající polohy v jiných peptidech a bílkovinách. Vedoucí řetězec DNA je také možno vyrobit chemickou cestou.

Příklad 2

Produkce galliderminu při použití S. epidermis jako hostitele

1. Příprava plasmidu (Obr. 6)

- 12CZ 284861 B6

a) Plasmid pCUI byl připraven navázáním plasmidu pCLPIOO po rozštěpení Pstl a plasmidu pUC18 po rozštěpení pUC18, rozštěpeného Ndel při použití Klenowova fragmentu způsobem, popsaným v „Molecular genetische Untersuchungen zur plasmidkodierten Arsenit und Arsenatresistent bei Staphyloccoccen“, Dr. Ralf Rosenstein (možno získat od Technische Universitat, Mnichov, SRN). Výsledný plasmid byl pak rozštěpen enzymem EcoRI.

b) Chromosomální DNA byla izolována ze S. gallinarum (DMA 4616) a byla rozštěpena enzymem EcoRI. Byl izolován fragment o 4,7 kb s obsahem strukturního genu pro gallidermin v řetězci o délce 2,4 kb mezi místy štěpení restrikčními enzymy HindlU a EcoRI, jako primem byl užit řetězec

5’CAC ATC CAG GAG TAC 3’

c) Fragment o 4,7 kb byl pak navázán do místa působení enzymu EcoRI v rozštěpeném plasmidu pCUI ze stupně a) za vzniku plasmidu, který byl označen pCUgdml.

2. Příprava hostitele S. epidermis

V tomto příkladu byla izolován mutovaný kmen S. epidermis DSM 3095, který není schopen produkovat epidermin.

Mutagenze byla prováděna na kmenu, který byl charakterizován chromosomálně zakódovanou resistencí proti Rifampicinu v koncentraci 20 mikrogramů/ml.

S. epidermis, pěstovaný na agarových plotnách byl užit (kmen DSM 3095) k naočkování 30 ml základního kapalného prostředí, které bylo kultivováno přes noc. 0,5 ml prostředí v němž byl mikroorganismus přes noc kultivován pak bylo užito k naočkování 50 ml produkčního živného prostředí, které bylo kultivováno na třepacím zařízení tři hodiny při 37 °C.

Pak byly buňky od kultivačního prostředí odděleny a uvedeny do suspenze ve 4,5 ml předem zahřátého prostředí, kterým byl pufr TM (30 mM tris-maleátu o pH 6,5, výsledný roztok byl označen jako roztok A).

Roztok A byl zkontrolován, zda v něm nedochází ke spontánním mutacím a buňky byly upraveny na množství buněk 1,25 x 10¹⁰ buněk/ml.

ml roztoku A byly důkladně protřepávány s 1 ml ethylmethylsulfonátu (konečná koncentrace 47 mikrogramů/ml) a pak udržovány za protřepávání hodinu při 37 °C.

Pak byly buňky od živného prostředí odděleny, dvakrát promyty pufrem TM a znovu uvedeny do suspenze v 5 ml pufru TM (výsledný roztok byl označen jako roztok B a obsahoval mutované buňky).

Bylo prokázáno, že roztok B obsahuje 2 x 10⁸ buněk/ml, což odpovídá přežití 1,6 %.

ml roztoku B bylo přidáno do 5 ml produkčního prostředí a kultura byla pěstována přes noc při teplotě 37 °C (fenotypická exprese). Výsledný roztok byl označen jako roztok C. Obsahoval 7,3 x 10⁸ buněk/ml.

Roztok byl nanesen na plotny agaru BM a byly odebírány jednotlivé kolonie. Tyto kolonie byly použity k naočkování zkušebních ploten, obsahujících agar BM, na jehož povrch byly uloženy buňky Micrococcus luteus. Tyto kolonie, které neměly žádný inhibiční účinek na Micrococcus luteus byly vybrány jako kolonie buněk, neprodukujících epidermin.

- 13 CZ 284861 B6

Agar BM obsahuje v 1 litru následující složky:

lOgpeptonuč. 140 g extraktu z kvasnic mg glukózy mg chloridu sodného mg hydrogenfosforečnanu draselného pH prostředí je 7,5.

Bylo možno prokázat výskyt mutací v množství přibližně 3 %. Ze 45 kolonií, neprodukujících epidermin, které byly nalezeny byly všechny kolonie subklonovány 20krát, čímž bylo získáno 16 typů buněk, u nichž stabilně nedokázalo k produkci epiderminu.

Všechny buňky, stabilně neprodukující epidermin obsahovaly plasmid divokého typu pEpi32. Podle mapy restrikčních míst je možno tento plasmid považovat za totožný s plasmidem z divokého kmene.

Transformace neprodukčního S. epidermis

750 ml prostředí BM se naočkuje přidáním 5 ml prostředí, získaného kultivací stálého neprodukujícího kmene přes noc a naočkované prostředí bylo pak uloženo ve 2-litrové baňce na třepací zařízení s počtem otáček 120 za minutu při teplotě 37 °C.

Počáteční optická hustota naočkovaného prostředí BM byla 0,03 - 0,04. Jakmile dosáhla optická hustota hodnoty 0,45 až 0,55, byly buňky odstraněny odstředěním při použití rotoru GS-3 15 minut při 8500 otáčkách za minutu při teplotě 4 °C. Pak byly izolované buňky postupně promyty 750, 350, 40 a 10 ml 10% glycerolu, načež byly uvedeny do suspenze ve 2 až 3 ml 10% glycerolu a zmrazený po podílech 110 ml v ERG při teplotě -70 °C. Počet buněk byl 1 až 5 x 10^l0/ml.

Zmrazené buňky byly rozmrazovány 5 minut při teplotě místnosti, pak bylo inkubováno 50 μΐ suspenze buněk v ERG s 2 μΐ plasmidu pCUgdml v pufru TE 30 minut při teplotě místnosti.

Pak byla směs přenesena do kyvety pro otevření póru pomocí elektrického proudu se štěrbinou mezi elektrodami 0,2 cm a okamžitě se provede otevření pórů. Pak se buňky rychle uvedou opět do suspenze v 950 μΐ prostředí SMMP50, přenesou do ERG o 2,5 ml se protřepávají 90 minut při teplotě 37 °C. ERG se uloží pod úhlem 45 °C, aby bylo možno zajistit dobré provzdušnění prostředí.

Prostředí SMMP50 obsahuje ve 100 ml celkem 55 ml 2SMM, 40 ml 4 PAB a 5 ml 5% BSA. 2SMM obsahuje 1 mol sacharózy, 0,04 mol kyseliny maleinové, 0,04 mol chloridu hořečnatého a NaOH do pH 6,5. 4 PAB je roztok 7 g/100 ml Gibco antibiotického prostředí 3.

Suspenze buněk se zředí a nanese na agar BM, obsahující gallidermin a živné prostředí se inkubuje 20 hodin při teplotě 37 °C.

Testování rostoucích kmenů produkujících gallidermin bylo prováděno selekcí kolonií ze zkušební plotny M. luteus a kultivací vybraných kolonií při stanovení přítomnosti galliderminu pomocí HPLC.

Tímto způsobem byly získány tři mutanty, transformované plasmidem pCUgdml, schopné produkovat gallidermin.

- 14CZ 284861 B6

Stanovení přítomnosti galliderminu, produkovaného kmenem S. epidermin, transformovaným plasmidem pCUgdml

a) Biologická zkouška

Agar FP byl naočkován M. luteus ATCC 9341 a inkubován 18 hodin při teplotě 37 °C. Polovina produkované kultury byla odstraněna kličkou a uvedena do suspenze ve 100 ml prostředí FP a pěstována 8 hodin při teplotě 36 °C. Kultivace byla zastavena při dosažení optické hustoty 1,0. Agar FP byl naočkován 0,5 % této suspenze, vždy 10 ml bylo vlito do Petriho misky a skladováno 3 týdny při 4 °C.

Test na difusi na plotnách byl prováděn způsobem podle publikace Záhner a Maas, „Biology of Antibiotics“, Springer Verlag, Berlin 1972. 10 μΐ filtrátu kultury z kultivace transformovaného S. epidermin bylo naneseno na filtrační papír a usušeno. Pak byl papír uložen na zkušební plotnu a plotna pak byla inkubována 24 hodin při teplotě 37 °C.

b) HPLC

Transformovaný kmen byl po selekci pěstován 26 hodin v produkčním prostředí. Pak bylo produkční prostředí odstředěno celkem 10 minut pří 13 000 otáčkách za minutu.

Izolované živné prostředí pak bylo podrobeno HPLC v zařízení pro kapalinovou chromatografii (SP 8.700, Spectra Physics, Darmstadt, SRN), jako mobilní fáze A byla užita voda s 0,5 % 70% kyseliny chloristé a jako fáze B acetonitril. Bylo užito náplně sloupce Nucleosil-100C-18 se střední velikostí částic 7 mikrometrů při rozměrech sloupce 125 mm x 4,6 mm vnitřního průměru a 20 mm x 4,6 mm vnitřního průměru pro předřazený sloupec.

Bylo užito následujících gradientů:

doba (min.)	A (%)	B (%)
0	77,5	22,5
8	63,0	37,0
8,5	0	100
9,5	0	100
10	77,5	22,5
14	77.5	22.5

Výsledný chromatogram je znázorněn na obr. 7A. Standardní křivka je znázorněna na obr. 7B. Je zřejmé, že se gallidermin vymývá po době 7,54 minut.

Dále bude uvedeno složení jednotlivých živných prostředí, užitých při pěstování.

1. Agar FP

Extrakt z masa4 g

Pepton10 g

Chlorid sodný3 g

Hydrogenfosforečnan sodný5 g

Glukóza10 g

Komplexní agar 15litrů

Voda 1 litr pH7,2

- 15CZ 284861 B6

2. Prostředí FP

Extrakt z masa

Pepton

Chlorid sodný

Hydrogenfosforečnan sodný

Glukóza

Voda pH

4g

10g g

5g

10g litr

7,2

3. Produkční prostředí

Extrakt z masa

Extrakt ze sladu

Chlorid sodný

Hydroxid vápenatý Voda pH g

g g

3,8 g litr

6,5

Příklad 3

Izolace plasmidu

Plasmidová DNA ze S. epidermis Tu 3298 byla izolována modifikovaným způsobem podle publikace Norick a další, Ann. NY Acad. SCI. 1982: 279-294, 1971. S. epidermis byl pěstován na prostředí BM (1 % peptonu 140, Gibco, Neu-Isenburg, SRN, 0,5 % extraktu z kvasnic, Difco, Detroit, USA, 0,1 % glukózy, 0,5 % NaCl a 0,1 % K2HPO4 x 2 H₂O) až do stacionární fáze. Pak byly buňky odstředěny a dvakrát promyty 0,5 M EDTA. Usazenina byla znovu uvedena do suspenze v 80 ml NaCl-pufru (50 mM tris/JCl o pH 7, 50 mM EDTA, 2,5 M NaCl) s 1,5 ml roztoku Lysostaphinu (0,5 mg/ml, Sigma. Heidlberg, SRN) a suspenze byla 20 minut inkubována při teplotě 37 °C. Pak byly buňky rozrušeny přidáním 80 ml pufru pro rozrušení buněk (50 mM tris/HCl o pH 8, 300 mM EDTA, 500 mM Brij., 40 mM deoxycholátu sodného, směs byla udržována v ledu 1 hodinu. Pak byl lysát odstředěn 30 minut při 13 000 otáčkách za minutu a teplotě 4 °C a supematant byl smísen s 1/4 svého objemu 50% roztoku PEG-6000. DNA plasmidu pak byla vysrážena přes noc při teplotě 4 °C. Suspenze DNA pak byla odstředěna 20 minut při 13 000 otáčkách za minutu a teplotě 4 °C, materiál byl znovu uveden do suspenze v 8 ml pufru TE a 50 μΐ roztoku proteinázy K (20 mg/ml). Po inkubaci směsi 15 minut při teplotě 37 °C byla DNA vysrážena ethanolem a pak dále čištěna odstředěním sCsCl (1 g CsCI/ml, 40 hodin, 40 000 otáček/min., 20 °C).

Izolace RNA a elektroforéza

S. epidermin byl pěstován na minimálním prostředí SMS (Terzaghi a další, Appl. Microbiol. 29: 807-813, 1975) a byla izolována RNA při použití modifikovaného postupu, podobného tomu, který byl popsán pro RNA Bacillus subtilis (Ulmanen a další, J. Bacteriol 162: 176-182, 1985). Buňky byly rozrušeny lysostaphinem (0,1 mg/ml) v pufru pro rozrušení buněk a inkubace byla prováděna při teplotě 37 °C. Celková RNA pak byla glyoxylována (McMaster a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 74: 4835-4839, 1977) a oddělena na 1,2% agarozovém gelu při použití 10 mM fosforečnanu sodného o pH 7 jako pufru pro elektroforézu. RNA byla barvena ethidiumbromidem a blotována na nitrocelulózovou membránu (Schneider a Schuell, Dassel, SRN),

-16CZ 284861 B6 kapilárním přenosem při použití 20 x SSC-pufru (0,15 M NaCl, 0,015 M citronanu sodného o pH 9). Jako standardy pro velikost molekuly byly užity 23 SrRNA a 16SrRNA.

Transkripce in vitro

Sondy RNA s jednoduchým řetězcem byly získány klonováním odpovídajících fragmentů ve vektorovém systému pSPT18/19 (Boehringer Mannheim, Mannheim, SRN). Plasmidy byly linearizovány EcoRO’ nebo HindlII, čímž byla získána lineární matrice DNA. Při transkripci bylo užito modifikovaného způsobu podle publikace Melton a další, Nucl. Acid Res. 12: 70357056, 1984, postup byl prováděn podle instrukcí výrobce. Byla užita T7-RNA-poIymeráza nebo SP6-RNA-polymeráza v přítomnosti alfa³²P-CTP (800 ci/mmol). Neinkorporované ribonukleotidy byly odděleny od značené RNA chromatografii na Sephadexu G-50.

Northemová hybridizace

Přenos RNA byl uskutečněn po elektroforéze podle publikace Tjomas P.C., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77: 5201-5205, 1980. Po 2 hodinách inkubace při teplotě 80 °C byl filtr krátkou dobu inkubován ve 20Tris/HCl o pH 8 při teplotě 100 °C ke zvratu glyoxylace. Pak byly filtry podrobeny předběžné hybridizaci při teplotě 42 °C v 50% formamidu, 5 x SSC (0,15 M NaCl, 0,015 M citronanu sodného, pH 9), 50 mM NAPO₄ o pH 6,5, 0,1 % Ficoll 400 (pharmazia, Freiburg, SRN), 0,1 % polyvinylpyrrolidonu, 0,1 % sérového albuminu skotu a 0,25 mg/ml DNA z denaturovaného spermatu lososa, inkubace trvala 2 hodiny. Po přidání sondy byla hybridizace prováděna v tomtéž pufru 12 hodin při teplotě 42 °C. Pak byly filtry promyty lxSSC, 0,1% SDS 15 minut při teplotě 42 °C a exponovány při použití filmu Kodak-X Omat 4 hodiny při teplotě -70 °C. Pak byly filtry dvakrát promyty 0,5 x SSC, 0,1 % SDS 15 minut při teplotě 70 °C a autoradiogramy byly exponovány 16 hodin při teplotě -70 °C. Následujícího dne promývání pokračovalo při použití 0,1 x SSC, 0,1% SDS při teplotě 70 °C celkem 30 až 60 minut a pak byly filtry znovu užity pro expozici filmu Kodak-X Omat 3 dny při teplotě -70 °C.

Southemova hybridizace

Pro tento typ hybridizace (Southem E.M., J. Mol. Biol. 98: 503-517, 1975) byly jako sondy užity 5’-značené oligonukleotidy při teplotě 23 °C. Oligonukleotidy byly značeny pomocí gamma³²PATP a 4T-polynukleotidkinázy (Boehringer Mannheim, Mannheim, SRN). Oligonukleotidy a primery byly synthetizovány na synthetizátoru DNA 391 (Applied Biosystems, Weiterstadt, SRN) a užity bez dalšího čištění.

Stanovení řetězce DNA

Řetězec DNA byl analyzován radioaktivním a neradioaktivním způsobem terminační metodou (Sanger a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467, 1977) při použití T7-DNApolymerázy (Pharmazia, Freiburg, SRN). Stanovení řetězce plasmidu radioaktivním způsobem bylo provedeno podle publikace Hattori a další, Anal., Biochem. 152: 232-238, 1984 při použití příslušných primerů. Analýza řetězce BamHI (Pstl o 3,6 kb byla provedena neradioaktivně na automatickém analyzátoru Applied 373A DNA seuenator, Applied Biosystems, Weiterstadt, SRN). Odpovídající fragment byl klonován ve fagemidu pBSK-/+. Konstrukce byla rozštěpena působením BamHI a Sací a linearizovaná DNA byla jednosměrně štěpena od zakončení 5’ působením exonukleázy III (Boehringer Mannheim, Mannheim, SRN za vzniku serie delecí, pak byl materiál zpracován nukleázou z bobů (Boehringer Mannheim, Mannheim, SRN) k získání zarovnaných zakončení. Po elektroforéze na 1% agarozovém gelu, opětném navázání a transformaci kmene E. coli XL-1 Blue byla DNA s jednoduchým řetězcem izolována při použití pomocného fágu CSM 13 a byla provedena analýza řetězce při použití Taq—Polymerázy/ Promega, Freiburg, SRN), postup byl prováděn podle pokynů výrobce.

-17CZ 284861 B6

Analýza genu

Analýza řetězce oblasti DNA, sousedící se strukturním genem pro epidermin, epi A, prokázala pět dalších úplných otevřených čtecích rámců epi B, C, D, P a Q uvnitř BglII-fragmentu plasmidu plu32 o 13,5 kbp.

Jak je zřejmé z obr. 9, bezprostředně v blízkosti řetězce, který ke kódem pro Epi A, oddělený pouze 50 nukleotidy od kodonu epia ochre se nachází velký otevřený čtecí rámec, před nímž je uložen řetězec S/D o 2 970 bp. Kodon TTG pro leucin, který je také funkčním kodonem pro počátek translace u stafylokoků je v příslušné vzdálenosti (86 p) od řetězce S/D. Tento otevřený čtecí rámec je označen epiB a jak bude dále popsáno, může být úspěšně použit pro doplnění mutant pro biosyntézu epiderminu, hraje podstatnou úlohu při biosyntéze této sloučeniny.

Bílkovina, pro niž je kódem epiB, počínaje od kodonu TTG (Leu) má molekulová hmotnost přibližně 115 000 a náboj -3 při pH 7, je mírně hydrofobní (41% hydrofobních zbytků) a její struktura může být předpovězena z křivky pro hydrofilnost podle publikace Kyte a další, J. Mol. Biol. 157: 105-132, 1982.

Na 3’-zakončení epiB není možno pozorovat žádnou strukturu, charakteristickou pro terminaci transkripce. Je však možno prokázat překrývající se část (112 bp) s dalším čtecím rámcem epiC, posunutým o -1 bp je možno tento rámec pozorovat také na obr. 9.

Tento útvar není možno považovat za ertefakt, jak bylo prokázáno nezávislým klonováním a analýzou řetězce odpovídajícího fragmentu HindlII o 47 kbp dvakrát ze dvou nezávisle izolovaných plasmidů. Totéž bylo potvrzeno i komplementací mutanty fragmentem s obsahem epiC, jak bude dále popsáno.

Uvnitř překrývající se oblasti čtecích rámců epiB a epiC slouží první kodon TTG (leu), který je uložen ve vzdálenosti pouze 36 bp směrem 3’ od prvku AGGA, jako kodon pro počátek translace, což prokazuje, že se oba čtecí rámce překrývají v šířce přibližně 40 kodonů. Aminoterminální zakončení bílkoviny EpiC bylo stanoveno analýzou N-terminálního řetězce. Čtecí rámec epiC je kódem pro bílkovinu se 445 zbytky aminokyselin, počínaje od kodonu TTG (leu) pro počátek translace. Čtecí rámec epiD přímo následuje 3’ od epiC, začátkem je kodon ATG 86 bp 3’ směrem k řetězci AGGAGG S/D. 3’ k epiD je uložena klasická rho-závislá struktura terminátoru translace; epiD je kódem pro bílkovinu, obsahující 181 zbytků aminokyselin, počátečním kodonem je ATG (Met).

Ani jedna z bílkovin EpiC, D, P a Q nemá žádnou podobnost s řetězci bílkovin, uvedeným i v databázi bílkovin Swiss Prot a Gene Bank a jde tedy o dosud neznámé typy enzymů a řídicích bílkovin.

Transkripce biosynthetických genů

Sondy RNA s jednoduchým řetězcem byly získány klonováním požadovaného fragmetu ve vektorovém systému pSPT 18/19 (Boehringer Mannheim, Mannheim, SRN), jak již bylo svrchu popsáno.

Byly získány dva transkripty, které se od sebe velikostí podstatně lišily, jak je zřejmé z obr. 10. Hybridizační sonda, specifická pro epiA identifikovala malý transkript o přibližně 300 bp. Pro lantibiotikum nisin (Buchmann a další, J. Biol. Chem. 263: 16260-16266, 1988) a subtilin (Banerjee a další, J. Biol. Chem. 263: 9508-9514, 1988) byla nalezeny transkripty podobné velikosti. Mimoto je možno identifikovat pomocí specifické hybridizační sondy pro epiB ještě velký transkript o přibližně 5 kb. Vzhledem k tomu, že před epiB nebyly uloženy žádné promo

-18CZ 284861 B6 torové řetězce, obdobné řetězcům z E. coli a příslušné řetězce byly uloženy 5’ vzhledem k epiA je možno uzavřít, že promotor epiA působí jako promotor pro polycistronicko mRNA.

Otevřené čtecí rámce po směru exprese genu

Otevřené čtecí rámce epiP a epiQ jsou uloženy v DNA na opačné straně než epiB, epiC a epiD, přičemž epiQ má společnou terminační strukturu s epiD, úplnou vlásenku se smyčkou o 6 bp.

Přesně v oblasti této smyčky mají stop kodony TAA pro oba čtecí rámce epiD a epiQ společné dva ze tří nukleotidů.

Čtecí rámec epiP začíná kodonem ATG, který je uložen v příslušné vzdálenosti 6 bp od řetězce S/D. V případě, že se považuje kodon ATG za kodon pro počátek translace bílkoviny epiP, obsahující 461 zbytků aminokyselin s molekulovou hmotností 51 800, vykazuje epiP charakteristické homologie a konservovanými motivy aminokyselin v serinproteázách (Obr. 11), což ukazuje, že epiP se patrně účastní odštěpení úplné formy lantibiotika od modifikovaného prepeptidu.

Čtecí rámec epiQ rovněž začíná kodonem ATG a je kódem pro 205 zbytků aminokyselin (Obr. 9). Řetězec S/D je přítomen ve vzdálenosti 6 bp od kordonu ATG, molekulovou hmotnost 243 000 je možno odvodit od řetězce DNA. Bílkovina epiQ má charakteristickou homologii s PhoB (Obr. 12), což je positivní řídicí faktor pro fosfáty v E. coli, takže epiQ je patrně řídicím faktorem syntézy lantibiotik.

Před epiP se nachází oblast -10, (5’-TATAAA) o 12 bp před řetězcem S/D, podobná obdobné oblasti v E. coli, která může sloužit jako promotor u stafylokoků. Vzdálenost mezi epiP stop kodonem a kodonem ATG pro počátek translace v epiQ je pouze 10 nukleotidů a řetězec S/D epiQ se překrývá s terminačním kodonem epiP, jak je zřejmé z obr. 9.

5’ vzhledem k epiA, B, C, D je další čtecí rámec s opačnou orientací, který je potenciálně kódem pro maximálně 148 aminokyselin. Charakteristický řetězec S/D je přítomen, avšak schází kodon pro počátek, dříve popsaný pro stafylokoky (ATG, TTG, GTG). S posunem -1 následuje další čtecí rámec, který přesahuje izolovaný BglII-fragment, znázorněný na obr. 9.

Oba uvedené čtecí rámce jsou homologní k jedinému otevřenému čtecímu rámci, gdmY, který byl identifikován v blízkosti strukturálního genu pro gallidermin (Schnell N., Biosynthese der Peptid-Antibiotika Epidermin und Gallidermin, Doctor Thesis, University of Tubingen, SRN, 1989. Homologní čtení rámce v plasmidu S. epidermis byly označeny epiY’ a epiY”.

Příklad 4

S. camosus byl transformován při použití plasmidu pTepil4, který byl připraven svrchu uvedeným způsobem při použití standardních postupů. Pak byl transformovaný kmen pěstován na prostředí BM, které bylo popsáno svrchu.

Bylo zjištěno, že výsledné transformanty byly schopné způsobit inhibici zkušebního kmene Micrococcus luteus ATCC 9341, citlivého na epidermin. Při tomto pokusu byla přidána kultura M. luteus, pěstovaná přes noc, a to 1 ml kultury, upravené na optickou hustotu OD_57g 1,0 ke 500 ml roztaveného agaru BM. Petriho misky obvykle obsahovaly 10 ml tohoto agaru. Na povrch agaru pak byly v různém ředění naneseny kultury S. epidermis. Kolonie, positivní na epidermin byly detekovány tak, že kolem těchto kolonií nedošlo k inhibici růstu M. luteus.

-19CZ 284861 B6

Buňky byly pěstovány na prostředí, které obsahovalo 3 % extraktu z masa, 3,8 % sladového extraktu, 0,6 % CaCl₂ x 2 H2O a 4,6 % NaCl o pH 6,5. V závislosti na použitém způsobu transformace byl přidán tetracyklin nebo chloramfenikol. Po inkubaci 24 hodin při teplotě 37 °C a 160ot./min. v Erlenmeyerových baňkách s objemem 500 ml bylo živné prostředí odstředěno při 10 000 otáčkách za minutu celkem 10 minut (odstředivka Servali).

Supematanty a kapalné kultury transformantů byly čištěny chromatografií, bylo užito adsorpční chromatografie na XAD1180, nečistoty byly vymyty směsí vody a methynolu 1:1 a eluce epiderminu byla prováděna směsí methanolu a 0,1 N HC1 9:1. Po odpaření bylo pH eluátu upraveno přidáním 3N NaOH na 3,5 a objem byl doplněn vodou na 10 ml, načež byla provedena detekce pomocí HPLC. Materiál s inhibičním účinkem postupoval společně s úplným epiderminem při 6,75 až 6,75 min., jak je zřejmé z obr. 13A a 13B. Podobným způsobem zpracované živné prostředí netransformovaného kmene S. camosus nemělo v této eluční oblasti 6,72 až 6,79 min. žádný vrchol (Obr. 13C). Tyto výsledky jasně potvrzují heterologní biosyntézu epiderminu u S. camosus a prokazují, že pTepil4 obsahuje veškerou informaci, nutnou pro biosyntézu epiderminu.

Vzhledem ktomu, že pTepil4 obsahuje fragment BglII o 13,5 kbp, je zřejmé, že čtecí rámce epiY’ a epiY” nejsou nezbytné pro produkci epiderminu v tomto systému, protože epiY’ nebosahuje kodon pro počátek translace a epiY” je v tomto fragmentu neúplný.

Příklad 5

Byla připravena celá řada mutant S. epidermin Til 3298 mutagenezou pomocí ethylmethansulfonátu (EMS). Tento postup byl proveden podle publikace Miller J.H., Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1972. Mutanty byly sledovány na produkci epiderminu, nepřítomnost této produkce byly prokazována pomocí M. luteus jako svrchu. Mutanty Epi byly několikrát přeneseny do nového prostředí k ověření stálosti. Ze 40 izolovaných mutant bylo pouze 10 stálých. Nestálé mutanty produkovaly epidermin znovu po dalším několikanásobném přenesení. Všechny stálé mutanty obsahovaly plasmid pTu32 bez delecí nebo změn v uspořádání, jak bylo prokázáno analýzou pomocí restrikčních enzymů. Uvedených 10 mutant bylo použito pro komplementační studie.

Různé restrikční fragmenty plasmidu pTů32 byly klonovány v S. camosus za účelem testování heterologní produkce epiderminu. Fragmenty byly uloženy do vektorů T181msc a pCUl tak, jak byly svrchu popsány a subklonování různých úseků bylo prováděno tak, jak je znázorněno na obr. 16B.

Klonování bylo prováděno nejprve v S. camosus transformací protoplastů podle Gotz a další, FEMS Microbiol. Lett. 40: 285-288, 1987 nebo v E. coli při použití CaCh podle Cohen a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 69: 2110-2114, 1972 a pak byly izolovány rekombinantní plasmidy a převedeny do různých epi mutant S. epidermis elektroporací podle Augustin a další, FEMS Microbiol.Lett. 66: 203-208, 1990. Použité enzymy byly získány od Boehringer Mannheim, BRL (Eggenstein, SRN) nebo Pharmacia (Švédsko). Tato nepřímá transformace byla nutná vzhledem k tomu, že transformace S. epidermin byla úspěšná pouze u cirkulámě kovalentně uzavřených plasmidů (ccc), při použití navázaných látek bylo možno izolovat transformanty jen náhodně. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 1.

-20CZ 284861 B6

Produkce epiderminu neprodukčními mutantami S. epidermidis po transformaci různými fragmenta DNA pTepi I

Místo mutace

< ‘5 δΐ

Έ 21

Q ‘5 21

1

epiC I

epiB I

epiC I

CQ '5 δΐ

O ’S Ul

CQ '2 21

1, pT: fragmenty, klonované v pT181mcs lerminu; - bez kompletace)

1 Komplementace

pCUepi B

•

1

i

1

i

1

t

1

1

pCUepi Q

1

i

1

1

I

r

1

>

pCUepi DQ

1

1

+

»

1

•

•

1

1

pCUepi CDQ

1

1

+

+

+

1

+

•

+

1

pCUepi A2

1

1

1

1

1

1

i

1

pCUepi AI

+

+

1

1

1

1

1

t

1

pTepi AB

+

+

1

1

+

1

+

-1-

pCUepi ABC

+

+

1

+

+

+

+

+

+

+

pTep ABCDQ

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

pCU: fragmenty, klonované v pCUl + komplementace (tj, produkce epic

pTepi 14

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

Mutanta

1 EMS 5 1

1 EMS 6 1

| EMS 11 1

1 EMS 12 1

& s w

| EMS 18 1

| EMS 19 1

1 EMS 33 1

1 EMS 39 1

| EMS 45 |

Byla zkonstruována řada plasmidů, nesoucích různé geny ze skupiny epi (A, B, C, D, P a Q), jak je znázorněno na obr. 16B. Dva plasmidy, pTePil4 a pTepiABCDQ byly schopny doplnit všechny mutanty epi. Ostatní zkonstruované plasmidy, pCUepiABC, pTepiAB, pCUepiCDQ, pCUepiB, pCUepiA, pCUepiA], pCUepiA₂, pCUepiDQ a pCUepiQ obsahovaly geny, uvedené v názvu plasmidu.

Různé plasmidy byly schopny komlementace pouze některých skupin mutant, jak je dále uvedeno:

EMS 5 a 6 - mutanty epiA,

EMS 18, 33 a 45 - mutanty epiB,

EMS 12, 13, 19 a 39 - mutanty epiC,

EMS 11 - mutanta epiD.

Výsledky, které jsou dále uvedeny prokazují, že pro syntézu epiderminu je zapotřebí alespoň čtyř ORF epiA, epiB, epiC a epiD.

Plasmid pCUepiAi nese strukturní gen epiA jako jedinou úplnou strukturu ORF a mimoto dalších 1400 bp proti směru exprese genu a 602 bp ve směru exprese genu, druhý z uvedených úseků je kódem pro 190 aminokyselin na N-terminálním konci epiB. Transformací při použití plasmidu pCUepiA došlo ke komplementaci mutant epiderminu EMS 5 a 6, které tak byly identifikovány jako mutanty epiA. Při klonování menšího z obou fragmentů Scal s obsahem epiA v obou orientacích v plasmidu pCUepiA₂ nedošlo ke komplementaci mutant epi vzhledem k tomu, že promotor epiA byl tímto enzymem odštěpen.

Plasmid pCUepiB obsahuje fragment BstNl, obsahující úplný epiB a proti směru exprese oblast o 100 bp včetně 75 bp 3-terminálního zakončení epiA, promotor epiA schází. Při pokusu o transformaci při použití pCUepiB nedošlo ke komplementaci žádné z mutant S. epidermis tak, aby došlo k produkci epiderminu, což prokazuje, že epiB neobsahuje vlastní promotor a k jeho transkripci pravděpodobně dochází současně s epiA pod působením jeho promotoru.

Tento předpoklad je v souladu s výsledky, jichž bylo dosaženo při použití pTepiAB, jak je zřejmé z obr. 16B a z Tabulky 1. Uvedený plasmid obsahuje promotor epiA a úplné geny epiA a B a při jeho použití dochází ke komplementaci mutant epiA i epiB.

Plasmid PcCUepiCDQ je schopen komplementace mutant epiC i epiD, plasmid pCUepiDQ je schopen pouze komplementace mutanty epiD (Tabulka 1). Komplementace byla nezávislá na orientaci klonovaného fragmentu DNA. Tyto výsledky ukazují, že oba geny epiC a epiD mají své vlastní promotory.

Příklad 6

Deriváty pTii32, mutované epiA byly izolovány z EMS 5 a 6 a byl stanoven řetězec odpovídajícího ORF epiA. Oba plasmidy obsahovaly bodové mutace v oblasti epiA. V EMS 5 byl kodon AGT (Ser³) změněn na AAT (Asn³) a v plasmidu EMS 6 byl kodon GGA (Gly¹⁰) změněn na GAA (Gin¹⁰). Obě tyto mutace byly uloženy v kruciální oblasti nemodifikovaného epiderminu.

Příklad 7

Gen epiB (ve fragmentu BstNl) byl uložen pod řízením promotoru do plasmidu pPS4 (obr. 17). Výsledný plasmid pPSepiB byl schopen komplementace mutant epiB plasmidů EMS 18, 33 a 45.

-22CZ 284861 B6

Plasmid, obsahující epiB v opačné orientaci nebyl schopen komlementace mutací. Z toho lze usoudit, že také plasmid pCUepiB nebude schopen komplementace mutant EMS vzhledem k tomu, že chybí promotor epiA.

Příklad 8

Jak již bylo svrchu uvedeno, přítomnost pTepil4 (obr. 16A) má za následek biosyntézu epiderminu v S. camosus, zatímco přítomnost plasmidu pTepiABCDQ tento jev nevyvolá. Nejmenší velikost DNA, která vede k heterologní expresi epiderminu v S. camosus byla stanovena komplementací S. camosus (pTepiABCDQ) s distálně uloženými fragmenty DNA (obr. 18). Transformace S. camosus (pTepiABCDQ) plasmidy pCA44-90, pCA44-91 a pCA4492 vedla k produkci epiderminu, přičemž pCA44-92 obsahující úplné ORF epiQ a epiP je nejmenším fragmentem DNA, schopným komplementace produkce epiderminu. Tyto výsledky ukazují, že geny pro biosyntézu epiderminu jsou uzavřeny do fragmentu DNA o 8 kb s obsahem 6 ORF: epiA, B, C, D, Q a P a žádné další geny se produkce epiderminu neúčastní.

V těchto příkladech byla DNA plasmidu stafylokoků připravena štěpením lysátu (Makino a další, J. Mol. Biol. 190: 37-44, 1986). Buňky byly rozrušeny přidáním lysostaphinu (8 pg/ml) a DNA byla izolována odstředěním v přítomnosti CsCl. Nadšroubovicová DNA plasmidu E. coli byla připravena modifikovanou metodou lyže v alkalickém prostředí (Bimboim a další, Nucl. Acid Res. 7: 1513-1518, 1979).

Řetězce DNA z PCR-amplifikováného fragmentu, obsahujícího epiA a dvou mutovaných oblastí epiA ze S. epidermis, EMS 5 a 6 byly stanovena analýzou řetězce DNA s dvojitým řetězcem při použití deoxymetody (McMaster a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 74: 4835-4839, 1977), seznamu „řetězců“ (Pharmacia) a (alfa-³³S)-dATP (Amersham). Primery, použité pro analýzu řetězce DNA a pro PCR-amplifikaci byly synthetizovány při použití DNA-synthetizátoru (Applied Biosystems). Dále jsou uvedeny řetězce dvou primerů pro PCR-amplifikaci epiA:

a) 5 ’-GGGTTTTAGG(TA)ATCCTTTTTAATAAATTTTTAGGAG-3 ’

b) 5 ’-CCTCAAAATTAAGACG(A)GAT(G)CCTCTATTGAAGCCC-3 ’

Primer a) se váže před RBS epiA a primem b) za epiA stop kodonem. Tyto báze, uvedené velkými písmeny v závorách byly užity k tvorbě míst působení enzymu BamHI před a za zakončením epiA. Promotor epiA v amplifikovaném fragmentu DNA chybí.

Pro stanovení řetězce DNA mutovaného epiA v mutantách EMS 5 a 6 byl izolován plasmid pTů32 a oblast DNA byla amplifikována pomocí PCR při použití jiné skupiny primerů DNA, vážících se po směru předpokládané oblasti promotoru epiA (5’-GGTTTGGTTATTTTCC-3’) a směrem od stop kodonu (5’-CCTCAAAATTAAGACAGAGCCTC-3’), řetězec DNA pro epiA byl rovněž uveden v publikaci Schnell a další, Nátuře (Lond.), 333: 276-278 (1988).

Příklad 9

Gen epiD byl izolován z plasmidu pTepi, množen PCR-amplifikaci a klonován v místě působení Stul vektoru pIH902 (New England, Biolabs) vazbou zarovnaných konců s tím výsledkem, že gen peiD byl spojen bez vložených bází přímo s místem vektoru pIH902 pro štěpení faktorem Xa s následnou transformací E. coli.

-23 CZ 284861 B6

Při kultivaci E. coli pak došlo k expresi enzymu EpiD vázáno na bílkovinu pro vazbu maltózy v E. coli. Výsledná složená bílkovina byla čištěna afinitní chromatografií na sloupci s obsahem amylózy.

Bylo zjištěno, že enzym epiD může být ze složené bílkoviny odštěpen v nízkém výtěžku působením faktoru Xa. Zavedením modifikace řetězce aminokyselin v oblasti štěpení je možno zlepšit výtěžek.

Řetězec složené bílkoviny byl analyzován na úrovni DNA od místa spojení obou bílkovin směrem ke 3’-zakončení epiD. Řetězec epiD odpovídal řetězci divokého typu ze S. epidermis.

Ze svrchu uvedeného popisu vynálezu může snadno každý odborník poznat podstatné vlastnosti vynálezu a provést ještě další modifikace a změny, aniž by se od smyslu vynálezu odchýlil, pouze přizpůsobením vynálezu pro různé použití a různé podmínky.

Claims (6)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Složená bílkovina, tvořená první doménou, sestávající zpolypeptidu se sekvencí aminokyselin alespoň jedné z bílkovin Epi B nebo Epi C nebo Epi D nebo Epi P nebo Epi Q z obr. 9 a druhou doménou, tvořenou pomocnou bílkovinou.
2. 2. Složená bílkovina podle vynálezu 1, v níž spojení mezi první a druhou doménou obsahuje místo štěpení proteázou.
3. 3. Složená bílkovina podle nároku 1 nebo 2, jejíž druhá doména usnadňuje sekreci složené bílkoviny ze zvoleného hostitele.
4. 4. Složená bílkovina podle nároku 1 nebo 2, v níž druhá doména usnadňuje čištění afinitní chromatografií.
5. 5. Složená bílkovina podle nároku 1 nebo 2, v níž druhou doménou je bílkovina schopná vázat maltózu z E. coli.
6. 6. Rekombinantní molekula DNA, obsahující kódovou sekvenci pro složenou bílkovinu podle některého z nároků 1 až 5.